FI57599C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara fusida-13(17)-en-21-karboxylsyraderivat - Google Patents

Description

M (11)KUULUTUSJULKAISU r?r QQ Ma lj ^ ' UTLÄGGN I NGSSKRIFT ^'377 c(4S) Γ ' ' 3 v"---^ (51) Kv-ikP/inta^ C 07 J 13/00, 9/00, 31/00 SUOM I — FI N LAN D (21) P*S"ttlhsks«ue — PstsntmBknlng 763^73 (22) Hakemlspllvt—Antfknlngsdig 02.12.76 ^ ^ (23) Alkuplivft—GNtlghstsdag 02. l2. j6 (41) Tullut julklMksI — Bllvlt offwitllg 0l.06.77

PatMittl· Ja rekisteri hallitus MfcMhip· J. kuuMulksUun pvm- _n n, 8o

Patent· och registerstyrelsen ' ' Ansekan utlagd ech utUkrtftan publlcsrad 3U. up. OU

(32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 03.12*75 2O.i2.76 Englanti-England(GB) i+971^/75 16015/76 — (71) Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S (Livens Kemiske Fabrik Produktions- aktieselskab), Industriparken 55, 2750 Ballerup, Tanska-Danmark(DK) (72) Welf von Daehne, Rungsted Kyst, Poul Rflidbroe Rasmussen, Frederikssund, Tanska -Danmark (EK) (7M Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten fusida-13(l7)~eeni- 21-karboksyyli-happojohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av nya terapeutiskt användbara fusida-13(l7)-en-21-karboxylsyra-derivat Tämä keksintö koskee menetelmää uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten fusida-13(l7)-eeni-21-karboksyylihappojohdannaisten valmistamiseksi, joiden kaava _ on H30 CH3 !Ϊ25

jU

x .COORj^ 1 ]20 H0 x il7 CH3 CH3 J3_| 1 H GH3

HO

V

57599 jossa C-2U:n ja C-25:n välinen sidos on yksinkertainen sidos tai kaksois-sidos, ja tähti C-20:n kohdalla osoittaa, että yhdisteet esiintyvät kahtena diastereomeerimuotona, ja jossa merkitsee suoraa tai haarautunutta alkyyli-ryhmää, jossa on 1-6 hiiliatomia, tai 3-6 hiiliatomia sisältävää alkenyyliryh-mää, tai fenyyliryhmää, joka saattaa olla monosubstituoitu halogeeniatomilla tai C^C^-alkyyliryhmällä, tai furfuryyliryhmää, ja R^ merkitsee vetyatomia tai C^Cg-alkanoyylioksi-C^C^-alkyyliryhmää, tai näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

Ellei toisin ole mainittu termi alkyyli vastaa edellä mainittujen ryhmien yhteydessä C^-C^-alkyyliryhmää.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää sellaisinaan tai suoloinaan tai helposti hydrolysoituvina estereinä. Yhdisteiden suolat ovat erityisesti farmaseuttisesti hyväksyttäviä, myrkyttömiä suoloja kuten alkalimetallisuoloja ja maa-alkalimetallisuoloja, esimerkiksi natrium-»kalium-, magnesium- tai kalsium-suoloja, samoin kuin ammoniakin tai sopivien myrkyttömien amiinien suoloja, esimerkiksi alkyyliamiini-, esimerkiksi trietyyliamiini-, hydroksi-alkyyliamiini-, esimerkiksi 2-hydroksietyyliamiini-, bis-(2-hydroksietyyli)-amiini- tai tri-(2-hydroksietyyli)-amiini-, sykloalkyyliamiini-, esimerkiksi disykloheksyyliamiini-tai bentsyyliamiini-, esimerkiksi Ν,Ν'-dibentsyyli-etyleenidiamiini- tai dibent-syyliamiinisuoloja.

Tietyissä tapauksissa voidaan käyttää myös yhdisteiden hopeasuoloja, erityisesti paikallisesti käytettäessä.

Helposti hydrolysoituvat esterit voivat olla esim. alkanoyylioksialkyyli-, aralkanoyylioksialkyyli-, aroyylioksialkyyliestereitä, kuten asetoksimetyyli-, pivaloyylioksimetyyli-, bentsoyylioksimetyyliestereitä ja vastaavia 1’-oksietyyli-johdannaisia, tai alkoksikarbonyylioksialkyyliestereitä, kuten metoksikarbonyyli-oksimetyyli-, etoksikarbonyylioksimetyyli- ja vastaavia 1'-oksietyyli-johdannaisia, tai laktonyyliestereitä, kuten ftalidyyliestereitä, tai dialkyyliaminoalkyyli- _ estereitä, kuten dietyyliaminoetyyliestereitä.

Fusidiinihapon ja eräiden uusien fusidiinihappojohdannaisten bakteereja tuhoavat ominaisuudet useita grampositiivisia bakteereja vastaan käytettäessä ovat hyvin tunnettuja (J. Med. Chem. 9, 15 (1966) ja suom. pat.hak.n:o T61 .863).

3 57599

Lisäksi toisen tyyppisten fusidiinihappojohdannaisten tiedetään olevan tehokkaammin bakteereja tuhoavia kuin nämä, mutta rajoitetumpaa bakteerimäärää vastaan (suom. patentti n:o 1+5 171)·

Nyt on kuitenkin havaittu, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä on bakteereja tuhoavia ominaisuuksia, joissa yhdistyvät viimeksi mainittujen tyyppisten johdannaisten bakteereja tuhoava vaikutus aikaisemman tyyppisten johdannaisten avarampaa bakteerispektriä tuhoavaan vaikutukseen, ja niillä esiintyy lisäksi mielenkiintoisia mikrobeja tuhoavia ja farmakokineettisiä ominaisuuksia sekä in vivo että in vitro. Siten näitä yhdisteitä voidaan käyttää hoidettaessa ihmisillä ja eläimillä tavattavia bakteeri-infektioita sekä systee- , , · # misesti että paikallisesti.

In vitro-tutkimukset ovat esimerkiksi osoittaneet, että yhdisteet ovat erittäin tehokkaita lukuisia bakteereja, esim. stafylokokkeja, streptokokkeja, " korynebakteereja,-bakteroidi-lajeja, ja Bacillus-subtilis-lajia vastaan. Alla olevassa taulukossa A on esitetty muutamien keksinnön mukaisten yhdisteiden vaikutus in vitro eräitä patogeenisiä organismeja vastaan. Voidaan havaita, että tämän keksinnön yhdisteillä on sama voimakas vaikutus fusidiinihappoa sietävää Staph, aureus-kantaa vastaan kuin saman lajin fusidiinihapolle herkkää muunnosta vastaan. Tämä osoittaa selvästi, että fusidiinihapon ja tämän keksinnön yhdisteiden välillä ei esiinny ristikkäisresistanssia. Vaikkakin tämän keksinnön yhdisteet ovat tehottomampia fusidiinihapolle herkkiä stafylokokkeja vastaan kuin fusidiinihappo, niillä on fusidiinihappoon verrattuna sama tai jopa tehokkaampi vaikutus streptokokkeja, Bacteroides fragilis- ja Corynebacterium acnes-lajeja vastaan.

57599 vo o *-

IA O O VO

Γ_) n fi a f\ O T- o O O OJ *“ o o ro O T- 1- VO O -a· A Λ

T- ia o vo O

PQ Λ Λ Λ AM

o o o lt\ vo i- ro

CVJ -r— VO

VO

-3- O t— oo o *- o o VO »-

«T A A A AA

O O O O n* *- VO

o ΙΑ o •h a a •H O LTV Bl •H ft 00 CM 2 W Ph VO VO O VO CM W _ • 3 a « « « AA d) H Oh 2 O «- O CM VO >- o to ^ ro 2 to g Q ro ON | 3^ -h ia vo e— vo vo o vo o

CQ £\J A M A M A A W

* Q) O O y— 1— LTV r- CO

0 Ä •H · +> a o ro oo a ·Η IA IA VO VO VO O OOVO 2 awcM««««««« a p a O O *- «- -3- VO O Ph 2 a g ro oo a

t/3 ·Η CM VO O VO VO O VO O

Cfl 0J Λ r Λ Λ Λ * ^ Ο 03 Ο -3" O O C0 Μ ' a aa •o’ > ·Η rt ΙΑ ΙΑ VO VO LA 3

Cj CG CVJ * Λ Λ * ·Ρ -Ρ 03 Ο Ο 1— *- ΟΟ 2 +3 cm a •h · a t» a ro ov a Η ·Η OO VO VO VO VO 0\ t— 3 a to h ·> « « eh

+303O»-t-«- t— VO O

S S CM

a-H^rovovovo o vo _ Λ C/3 CO r—f Λ * * Λ a * f

•H fl> O T- f- 1- I

+3 a . ro I

-p Ή I VO VO VO VO σ\ IA *H

3 W H « « « « « « Hl £ 03 O t^CMO S ·η

a SP

a a o to a ·η a •H VO VO C— CM CM I Oh H — · to Os " * " " * O H Oh

OO’-’-CMOO 00 CM CM Ή 3 -H

IA +3 to p 0 ή ή -p

H a H H I

—* ·Η LA LA IA VO SO S O -

lOt^A a a * S Ph S Ph CM

aa O O CM CM O *“ Ph Ph Ph Ph « s o o a o a -

M »- P 2 P 2 CM

• Ha A ro Ρη·Η Ρη·Η « ia-HCMiAoo vo o a o a - o to (M * « « « M ·Η W rt CM ft 2 a o o vo O o oo ο·ρ·η·η·η — Ph a «- o>- ι Ό i τ3 J a . H- «L. rt H «1*2

•«.a vo^mvo»vo-H

1 Ή A VO VO vo CM IA «- 3 «- 3 >- a O w *— « « « « « « I Oh I Oh I rt

Aa o «- r- T- ro o ο·ηο·ηο·η·η CM W p M p M Ti 2 2 2 ·3 2 ·Η

W ^ I O S O S Ο W

3 a to +3 2 -P 2 -P 3 a 12 ·η a ·η a ·η a Oh <! 2 p ο ·η a H W'dtOTito^'·

•h · 3 ä a a ο ·η to aiaia-H

o a ft a h *h 2 a to a a ia a tA a w 2 WOW ·Η H a β tJCU t)CM t)2 2 ·η w w «Ota P a I «I « I o 2 aw W 3 W ·Η > W Oh a VD4 VO rt VO 2 H 3 3 O 3 a 3 w I a 3 '-CM'-CM'-a 3 bOaao a a32a w a p a Pi a oWPOnaP a 2 ·· "

Eh OO O aoo3 — ·η3 ·3 a << rt o uwa o c— a wa ·η a o a o cm η *- cm 0 cm 2 _ 20 20 so -«a · p-aae p, a ftW 20 2000 Λ ia ai-3 c&h

a 00 a ft ft c— ft ftJ· 2 ; S

po po ao a *- ft a *- a o Po· p s p a 2a 20a 22 a a 0 a CO Ph CO rt CO rt CO O 2 CO O rtrt O rt 5 57599

In vitro-tutkimukset ovat edelleen osoittaneet, että yhdisteiden bakteereja tuhoava vaikutus on erittäin hyvin bakteereja tuhoava sellaisissakin olosuhteissa, joissa fusidiinihapon vaikutus on vain bakteriostaattinen. Lisäksi on todettu, että yhdistelmillä, joissa on yhtä tai useampaa tämän keksinnön yhdistettä ja fu-sidiinihappoa tai muita fusidiinihappojohdannaisia, kuten dihydrofusidiinihappoa ja vireillä olevan suom. pat.hak.nto 761 863 yhdisteitä, on vaikutus, joka on suurempi kuin yksittäisten komponenttien additiivinen vaikutus. Käyttämällä tällaista yhdistelmää voidaan myös estää vastustuskyvyn kehittyminen kutakin yksityistä komponenttia vastaan.

Lisäksi tämän keksinnön yhdisteet ovat kemiallisesti kestävämpiä kuin fu-sidiinihappo, seikka, jolla on käytännöllistä merkitystä, esim. valmistettaessa, reseptiseoksia paikallista käyttöä varten. Fusidiinihapon lailla ne absorboituvat tehokkaasti maha-suoli-seudusta ja ovat käytännöllisesti katsoen myrkyttömiä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa saattamalla yhdiste, jonka kaava on H3C n^^CH3 C00R2 H0 '-.T/Xr^YSE,

CH Jj” _J

jTJCH3 V ' 0H3 jossa kaavassa Q1 merkitsee vetyatomia tai alkanoyyli-, aralkanoyyli- tai aroyyli-ryhmää, ja R1, ja C-2L:n ja C-25:n välinen pilkkuviiva merkitsevät samaa kuin edellä, ja R^ merkitsee bentsyyliryhmää tai substituoitua bentsyyliryhmää, reagoimaan epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen kanssa orgaanisen liuottimen läsnäollessa, jotta muodostuu kaavan I mukaista yhdistettä, joka otetaan talteen happona tai suolana, ja joka haluttaessa muutetaan helposti hydrolysoituvaksi, edellä määritellyksi esteriksi, jonka jälkeen haluttaessa kaksi mahdollista C-20-isomeeria erotetaan fraktiokiteyttämällä tai kromatografoimalla kahden puhtaan isomeerin seosta.

Kaavan II mukaista yhdistettä voidaan valmistaa jonkin seuraavan menetelmän mukaisesti: , 57599 6 A. Yleiskaavan III mukaisen yhdisteen annetaan reagoida yleiskaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa, jolloin saadaan kaavan II mukaista yhdistettä.

H3° \^CH3 i

.^/COOX

R2Y

CH3 q;

1 . III IV

Näissä kaavoissa suhstituenteilla Q1, R1, R2 ja C-2U:n ja C-25:n välisellä pilkkuviivalla on edellä määritelty merkitys, X merkitsee vetyä tai kationia, kuten ioneja Na+, K+, Ag+, ammonium- tai trialkyyliammoniumionia, ja Y on kloori-, bromi- tai jodiatomi. Reaktio suoritetaan neutraalissa orgaanisessa liuottimessa, esim. dimetyyliformamidissa, ja huoneen lämpötilassa tai hieman tätä korkeammassa lämpötilassa.

B. Yleiskaavan V mukaisen yhdisteen annetaan reagoida yleiskaavan VI mukaisen yhdisteen kanssa, jolloin muodostuu kaavan II mukaista yhdistettä.

H3° vsv''CH3 t . ^C00R2

^2 R AH

H3C CH, .. I i b,-- CH3

CH^ V VI

7 57599 Näissä kaavoissa substituenteilla , R^, Y, R^ ja C-2k:n ja C-25:n väli sellä pilkkuviivalla on edellä määritelty merkitys. Reaktio suoritetaan neutraalissa orgaanisessa liuottimessa, lähinnä etanolissa, dimetyylisulfoksidissa tai dimetyyliformamidissa, emäksen, esim. natrium- tai kaliumhydroksidin tai natrium-hydridin läsnäollessa, ja huoneen lämpötilassa tai tätä alhaisemmassa tai hieman tätä korkeammassa lämpötilassa.

C. Kaavan II mukaisia yhdisteitä, jossa kaavassa R^ on fenyyli- tai furfu-ryyliryhmä, voidaan valmistaa antamalla yleiskaavan V mukaisen yhdisteen, jossa Y vastaa hydroksyyliryhmää, reagoida fosfiinin, esim. tributyylifosfiinin tai tri-fenyylifosfiinin ja yhdisteen kanssa, jonka yleiskaava on R SSR^. Reaktio suori-tetaan joko ilmaa liuotinta tai neutraalissa orgaanisessa liuottimessa, lähinnä dimetyyliformamidissa tai pyridiinissä huoneen lämpötilassa tai tätä alhaisemmassa lämpötilassa.

Kaavojen III ja V mukaisten lähtöyhdisteiden valmistusta on selitetty suom. pat. hakemuksessa n:o 761 863, jossa on esitetty myös menetelmiä kaavan II mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi.

Kaavan II mukaiset yhdisteet muutetaan siis kaavan I mukaisiksi yhdisteiksi tai näiden suoloiksi antamalla niiden reagoida emäksen, kuten natrium- tai kaliumhydroksidin vesiliuoksen, natriumhydridin tai kalium-tert.-butylaatin kanssa, orgaanisen liuottimen läsnäollessa.

Jos tämä liuotin on dimetyylisulfoksidi, reaktio tapahtuu erityisen nopeasti ja saadaan erinomaisin saannoin puhtaita yhdisteitä. Tämä johtuu todennäköisesti kaavan mukaisen karbanionin muodostumisesta, kun tämä liuotin saatetaan kosketuksiin emäksen kanssa. Tämä ioni, toimiessaan poikkeuksellisen lievänä emäksenä, katalysoi kaksoissidoksen isomeroitumista aiheuttaen täten _ kaavan I mukaisten yhdisteiden muodostumisen (joissa kaksoissidos on C-13:n ja C-17:n välillä), sen sijaan että muodostuisi kaavan III mukaisia yhdisteitä (joissa kaksoissidos on C-17:n ja C-20:n välillä), jotka ovat päätuotteita muita liuottimia käytettäessä, kuten on selitetty suom. pat. hakemuksessa n:o 761 863.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden helposti hydrolysoituvia estereitä voidaan valmistaa tunnetulla tavalla kirjallisuudessa selostetuin menetelmin.

Näiden menetelmien mukaisesti valmistetut tämän keksinnön yhdisteet ovat kahden mahdollisen C-20-isomeerin seoksia. Nämä seokset voidaan erottaa kahdeksi puhtaaksi isomeeriksi tavanomaisin menetelmin, esim. fraktiokiteyttämällä tai kromatograafisin menetelmin.

β 57599

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavissa esimerkeissä.

Esimerkki 1 3οΛ 11o<-dihydroksi-l6^-fenyylitiofusida-13(17),24-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuola A. l6-deasetoksi-l6#-fenyylitiofusidiinihappobentsyyliesteri Jäissä jäähdytettyyn liuokseen, jossa oli 3-asetyyli-l6-epideasetyylifusi-diinihappobentsyyliesteriä (15 g; 25 mmoolia) ja difenyylidisulfidia (13,5 g» 62 mmoolia) kuivassa pyridiinissä (100 ml) lisättiin tributyylifosfiinia (30 ml; 126 mmoolia), ja seos jätettiin 5°C:een. 3 vuorokauden kuluttua lisättiin lisää difenyylidisulfidia (3,k g, 16 mmoolia) ja tributyylifosfiinia (7,5 ml; 31^5 mmoolia), ja seoksen annettiin seistä 5 vrk. 5°C:ssa. ~~ B. 3oCi 11o(-dihydroksi-1(yS-fenyylitiofusida-13( 17) ,24-dieeni-21-karboksyyli-happo, natriumsuola

Kohdassa A saatuiin seokseen lisättiin seos, jossa oli dimetyylisulfoksidia — (100 ml) ja 30-prosenttista natriumhydroksidin vesiliuosta (50 ml), ja saatua suspensiota lämmitettiin 70°C:ssa 3 tuntia. Kun seos oli jäähdytetty 20°C:een lisättiin sekoittaen eetteriä (1 litra), vettä (3 litraa) ja kyllästettyä nat-riumkloridin vesiliuosta (100 ml), jolloin haluttu tuote saostui värittöminä kiteinä. Tunnin sekoittamisen jälkeen kiteet sisältävä orgaaninen faasi suodatettiin ja kiteet pestiin vedeLlä (100 ml) ja eetterillä (200 ml), ja kuivattiin, jolloin saatiin 3*, 11oH3.ihydroksi-l£y3-fenyylitiofusida-13( 17) ,24-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa kahden C-20-isomeerin seoksena; sulamispiste 2U3-2i+7°C.

Saatu: C 63,65, H 8,62, S U,8U, HgO 10,4 % ^5^9^48^¾0 edellyttää: C 63,59, H 8,69, S 4,85, Hg0 10,9 %· 9 57599

Esimerkki 2 3<*. 11«k-dihydroksi-l6/a-(Ul-'bromifenyylitio)fusida-13( 17) ,2l+-dieenikar-boksyylihapon natriumsuola

Noudattamalla esimerkin 1 mukaista menetelmää ja korvaamalla difenyyli-disulfidi di-(U-bromifenyyli)disulfidilla saatiin kahden C-20-isomeerin seoksena 3«^» 11ot-dihydroksi-l6A-(l+'-bromifenyylitio)fusida-13( 17) ,2i+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa, sulamispiste 231-239°C.

Saatu: C 61,67 H 7.63 S 1+,83 Br 11 ,2U %

C35HU8NaBrOuS, HgO

edellyttää: C 61,30 H 7,35 S 1+,68 Br 11,66 %.

Esimerkki 3 3<*,11<X-dihydrokBi-l6/*-fenyylitiofusiaa-13( 17) .2l+-dieeni-21-karboksyyli-hapon natriumsuola A. l6-deasetoksi-l6A-fenyylitiofusidiinihappobentsyyliesteri 16-epideasetyylifusidiinihappobentsyyliesteriä (3 g, 5,3 mnoolia) ja di- fenyylidisulfidia (l+,9 g, 23 mmoolia) liuotettiin pyridiiniin (20 ml), liuos jäähdytettiin 0°C:een, ja lisättiin tributyylifosfiiniä (5,5 ml, 23 mmoolia).

Liuoksen oltua 20°C:ssa paikoillaan 3 vrk., laimennettiin eetterillä (100 ml), pestiin l+-n suolahapolla (2 x 25 ml), 2-n natriumhydroksidilla (2 x 25 ml) ja vedellä (2 x 50 ml), kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin raakaa 16-deasetoksi-16/^-fenyyli tiofusidi inihappobentsyyliesteriä öljynä.

B. 3*, 11«k-dihydroksi-l6^-fenyylitiofusida-13( 17) ,2l+-dieeni-21-karboksyyli- w hapon natriumsuola

Kohdassa A saatu jäännös liuotettiin seokseeen, jossa oli dimetyylisul-foksidia (200 ml) ja 2-n natriumhydroksidin vesiliuosta (50 ml). Kun reaktio-^ seosta oli lämmitetty 3 tuntia 70°C:ssa, lisättiin eetteriä (100 ml) ja hitaasti vettä (200 ml) halutun tuotteen saostamiseksi värittöminä kiteinä. Kiteet sisältävä eetterifaasi suodatettiin, ja kiteet pestiin vedellä ja eetterillä, ja kuivattiin, jolloin saatiin 3«*, 1 "U-dihydroksi-lö/^fenyylitiofusida-ISi 17), 2l+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa kahden C-20-isomeerin seoksena; sulamispiste 2l+3-2l+7°C.

Esimerkit U-6

Noudattamalla esimerkin 3 menetelmää ja korvaamalla difenyylidisulfidi taulukossa I luetelluilla disulfideilla, valmistettiin taulukon I 3<x,1M-di-hydroksifusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolan l6Atio- 10 57599 eettereitä kahden C-20-isomeerin seoksina.

Taulukko I

H C CH

Y

s. / C00~N a+ HO . /SR.

H.C CH.

\ ! 4^-^ TT»! ch3

Saatu yhdiste esim. disulfidi R^ Sp. (°C) k Di(o-metyylifenyyli) o-CH^CgH^ 222-238 5 Di(m-metyylifenyyli) m-CH^CgH^ 226-23b 6 Di(p-metyylifenyyli) p-CH^CgH^ 199-213 11 57599

Esimerkki 7 3d, 11*-dihydroksi-l60-fenyylitiofusida-13(17)-eeni-21-karboksyylihappo, nat-riumsuola Jäissä jäähdytettyyn seokseen, jossa oli l6-epideasetyyli-2l+,25~dihydrofu-sidiinihappobentsyyliesteriä (6,2 g, 11 mmoolia) ja difenyylidisulfidia (6,3 g, 29 mmoolia), lisättiin tributyylifosfiinia (1U ml, 59 mmoolia), ja seoksen annettiin olla 20°C:ssa U8 tuntia. Sitten lisättiin UO ml dimetyylisulfoksidia ja 20 ml 30-prosenttista natriumhydroksidin vesiliuosta, ja saatua suspensiota lämmitettiin T0°C:ssa kaksi tuntia. Kun seos oli jäähdytetty 20°C:een, lisättiin etyylieetteriä (200 ml) ja vettä (600 ml). Haluttu tuote saostui muutaman tunnin kuluttua värit-töminä kiteinä. Seoksen oltua 2k tuntia huoneen lämpötilassa, kiteet sisältänyt orgaaninen faasi suodatettiin, ja kiteet pestiin vedellä (100 ml) ja etyylieette-rillä (100 ml), ja kuivattiin, jolloin saatiin 3et,11«<-dihydroksi-l6/3-fenyylitiofu-sida-13(17)-eeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa kahden C-20-isomeerin seoksena. Tämä raaka tuote kiteytettiin uudelleen metanoli-vesi-seoksesta, jolloin saatiin analyyttisesti puhdasta yhdistettä; sulamispiste 235-2l+1°C.

Esimerkki 8 3d, 11ot-dihydroksi-l6/S-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyyli-hapon natriumsuola A. 3-asetyyli-l6-deasetoksi-l6£-isopropyylitiofusidiinihappobentsyyliesteri

Liuokseen, jossa oli kaliumhydroksidia (10 g; 150 mmoolia) ja isopropyyli- merkaptaania (30 ml; 320 mmoolia) puhtaassa etanolissa (750 ml), lisättiin 3-ase-tyyli-l6-deasetoksi-l6ot-bromifusidiinihappobentsyyliesteriä (2k g; 36 mmoolia) ja saadun liuoksen annettiin olla huoneen lämpötilassa 3 vrk. Sen jälkeen poistettiin pääosa etanolista vakuumissa, ja jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia (200 ml) ja vettä (100 ml). Orgaaninen faasi erotettiin, pestiin kahdesti vedellä, kuivat-"" tiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin raakaa 3-asetyyli-l6- deasetoksi-l6£-isopropyylitiofusidiinihappobentsyyliesteriä öljymäisenä jäännöksenä.

B. 3el, 11et.-dihydroksi-l6/3-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2^-dieeni-21-karboksyy- w lihapon natriumsuola

Kohdassa A saatu jäännös liuotettiin seokseen, jossa oli 30-prosenttista natriumhydroksidin vesiliuosta (U0 ml) ja dimetyylisulfoksidia (200 ml). Kun seosta oli lämmitetty 3 tuntia 70°C:ssa, lisättiin sekoittaen vettä (1 000 ml) ja eetteriä (200 ml). Tunnin kuluttua erotettiin halutun tuotteen värittöminä kiteinä sisältävä 12 57599 orgaaninen faasi, kiteet suodatettiin erilleen, pestiin vedellä ja eetterillä, ja kuivattiin, jolloin saatiin 3ot, 11»t-dihydroksi-l6fl-isopropyylitiofusida-13( 17) ,21+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa kahden C-20-isomeerin seoksena.

Kiteytettäessä uudelleen metanoli-vesi-seoksesta saatiin analyyttinen näyte, jonka sulamispiste oli 220-228°C.

Saatu: C 61,68, H 9,32, S 5,1** % C32H51°USNa’ kE2° edellyttää: C 61,31, H 9,**9, S 5,12 %.

Esimerkit 9~l8 3^s1Hrdihydroksi-fusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolan l6(ft-tioeettereitä ^

Noudattamalla esimerkin 8 menetelmää ja korvaamalla isopropyylimerkaptaani taulukossa II luetelluilla merkaptaaneilla valmistettiin taulukossa I mainittuja 3Λ, 11«*r-dihydroksi-fusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolan 16fi- — tioeettereitä kahden C-20-isomeerin seoksina.

13 57599

Taulukko II

h3c ch3 /

Sv^^/COO~Na+ H0'N /\^\ / SR1

CH, f j T

! H

Ch3

Saatu yhdiste

Esim. Merkaptaani Sp.(°C) 9 metyylimerkaptaani CH3 252-262 10 etyylimerkaptaani CHgC^ 201-210 11 n-butyylimerkapt aani (CH^) 3~CH3 136-11+5 12 tert.-butyylimerkaptaani C(CH3)3 222-235 13 allyylimerkaptaani CH2CH=CH2 175-200 1U n-heptyylimerkaptaani (CH2)g-CH3 196-210 15 n-dodekyylimerkaptaani (CH^)η ^ —CH3 116-136 16 tiofenoli 21+3-21+7 17 l+-tert.-butyyli-tiofenoli U—CgH^C (CH3) 3 215-225 18 furfuryylimerkaptaani 2-furfuryyli 216-221

IM

57599

Esimerkki 19 3 qk , lift -dihydroksi-16 /$ -isopropyylitiofusida-13 (17 ) ,?M-dieeni- 21-karboksyylihapon natriumsuola

Liuokseen, jossa oli 3-0-asetyyli-16-deasetoksi-16 c\-bromifu- sidiinihappobentsyyliesteriä (33,5 g, 50 mmoolia) 75 ml:ssa dime-tyyiisulfoksidia, lisättiin liuos, jossa oli natriumhydroksidia (2,M g, 60 mmoolia) ja isopropyylimerkaptaania 7 ml, 75 mmoolia 25 ml:ssa etanolia. Kun seosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 2 tuntia, lisättiin 30-prosenttista natriumhydroksidin vesiliuosta (25 ml) ja saatua seosta lämmitettiin 70°C:ssa 2 tuntia. Kun seos oli jäähdytetty 20°C:een, lisättiin vettä (500 ml), M-metyyli-2-pen-tanonia ( 500 ml), ja L-n suolahapon vesiliuosta (M00 ml). Orgaaninen faasi kerättiin talteen, pestiin vedellä ja suodatettiin. Saatua liuosta sekoitettiin lisättäessä hitaasti 2n natriumhydroksidin vesiliuosta (100 ml), mikä aiheutti halutun tuotteen saostumisen värittöminä kiteinä. Kun seosta oli jäähdytetty 2 tuntia 5°C:ssa, kiteet suodatettiin erilleen, pestiin vedellä (2 x 10 ml) ja M-metyyli-2-penta-nonilla (2 x 10 ml), ja kuivattiin, jolloin saatiin analyyttisesti puhdasta 3 o< ,110( -dihydroksi-16/# -isopropyylitiofusida-13 (17) ,2M-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa kahden C-20-isomeerin seoksena; sp. 2M3-2M8°C.

Esimerkki 20 3 a(,llo< -dihydroksi-16/£-isopropyylitiofusida-13 (17 )-eeni-21-karboksyylihapon natriumsuola

Noudattamalla esimerkin menetelmää ja korvaamalla 3-0-ase-tyyli-16-deasetoksi-2M,2 5-dihydro-16 o(-bromifusidiinihappobentsyyli- ” esterillä vastaava 2M, 2 5-tyydyttämätön yhdiste, valmistettiin 3 αι',ΙΙίγ-dihydroksi-16 /#-isopropyylitiofusida-13(17)-eeni-21-karboksyylihappoa kiteisenä natriumsuolana; sulamispiste 215-2M0°C (haj.).

Esimerkki 21 3 ,ΙΙ# -dihydroksi-16/$ -isopropyylitiofusida-13 (17 ) ,2M-dieeni-karboksyylihappo 3 o( , 11 o{ -dihydroksi-16/5 -isopropyylitiofusida-13 (17) ,2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa (10 g), valmistettu esimerkissä selostetulla tavalla, liuotettiin metanoliin(150 ml), ja lisättiin 1-n suolahapon vesiliuosta (17,5 ml). Muodostunutta liuosta sekoitettiin 20°C:ssa lisättäessä hitaasti 22,5 ml vettä, minkä ansiosta haluttu tuote kiteytyi. Kun seosta oli sekoitettu 2 tuntia kiteet suodatettiin is 57599 erilleen, pestiin metanoli/vesiseoksella (4/1), ja kuivattiin, jolloin saatiin 7,0 g 3 oC, llot-dihydroksi-16^-isopropyylit iof us ida-13 (17 ) , 24-dieeni-21-karboksyylihapon kahden C-20-isomeerin seosta, sulamispiste 130-134°C; = 92,9° (c = 1, kloroformi). Emänesteeseen lisät tiin 10 ml vettä, minkä ansiosta kiteytyi lisää ainoastaan toista kahdesta isomeeristä värittöminä kiteinä, jotka koottiin talteen ja kiteytettiin uudelleen metanoli/vesi-seoksesta, jolloin saatiin toista kahdesta C-20-isomeeri-haposta (360 mg) puhtaana, sulamispiste 109-113°C. Co(J ^ = -37,8° ( c = 1, kloroformi).

^ (Tämä tuote on identtinen esimerkin 31C tuotteen kanssa).

Esimerkki 22 3 , llof-dihydroksi-16 /S - (2 1-aminoetyylit io) f usida-13 (17 ) ,2 4- w dieeni-21-karboksyylihappo A. 3-asetyyli-16-deasetoksi-16 -(21-aminoetyylitio)fusidiini-happobentsyyliesteri 3-asetyyli-16-deasetoksi-16 « -bromifusidiinihappobentsyyliesteriä (2,68 g; 4 mmoolia) lisättiin liuokseen, jossa oli kaliumhydroksi-dia (8,64 g; 130 mmoolia) ja kysteiiniamiinihydrokloridia (9,0 g; 80 mmoolia) 150 ml:ssa puhdasta etanolia. Kun seosta oli sekoitettu 16 tuntia huoneen lämpötilassa, lisättiin hitaasti vettä (200 ml) halutun tuotteen kiteyttämiseksi.

Kiteet suodatettiin erilleen, pestiin veden (10 ml) ja etanolin (10 ml) seoksella, ja kuivattiin, jolloin saatiin 3-asetyyli-16-deaset-oksi-16 β - (-2 T -aminoetyy lit io) f us idiinihappobent syy lies teriä (2,49 g) ; sulamispiste 150-173°C.

w Kiteyttämällä uudelleen metanoli/vesi-seoksesta saatiin analyyt tinen näyte, sulamispiste 184-186°C.

Saatu: C 71,61, H 8,92, S 4,81, N 2,04 % W C40H59°5NS edellyttää: c 72,15, H 8,93, S 4,81, N 2,10 %.

B. 3p( ,11# -dihydroksi-16/ff-(2l-aminoetyylitio)fusida-13(17),24-dieeni-21-karboksyylihappo 600 mg edellä mainittua bentsyyliesteriä liuotettiin dimetyy-lisulfoksidin (50 ml) ja2-n natriumhydroksidin vesiliuoksen (10 ml) seokseen. Kun liuosta oli lämmitetty 70°C:ssa 1,5 tuntia, lisättiin vettä (250 ml). Säädettäessä pH arvoon 6,0 lisäämällä 4n suolahapon vesiliuosta, saostui amorfista tuotetta. Tämä raakatuote suodatettiin erilleen, kuivattiin ja liuotettiin kiehuvaan etyyliasetaattiin (150 ml). Kun tämän liuoksen annettiin jäähtyä sekoittaen huoneen lämpötilaan, muodostui amorfista sakkaa. Näin saatu 3c^,llo( -dihydrok- 16 57599 si-16 /3-(2 ' -aminoetyylitio)fusida-13(17 ) , 2 4-dieeni-2l-karboksyylihappo suodatettiin erilleen ja kuivattiin, jolloin saatiin kahden C-20-iso-meerin seosta.

Saatu: C 65,80, H 9,54, S 5,59, N 7,40 % C31H51N04S edellyttää: c 65,34, H 9,73, S 5,63, N 2,46 %.

NMR-spektrissä (CD^OD) ovat signaalit kohdilla cT = 0,96 (d,3H), 1,01(s, 3H), 1,21 (bs, 6H), 1,59 ja 1,65 (2bs, 6H), 2,5-3,4 (m, 4H; -SCH2CH2fH3), 3,61 (m, 1H; CH-3), 3,78 (m, 1H; CH-20), 4,31 (m, 1H; CH-11) ja 5,13 (m, 1H; CH-24) ppm. Sisäisenä referenssinä ^ käytettiin tetrametyylisilaania.

Esimerkki 23 3 o\, 11 o( -dihydroksi-16/3 - ( 2 1 -hydroksietyylitio) fusida-13 (17),24-dieeni-21-karboksyylihappo A. 3-asetyyli-16-deasetoksi-16/3-(2 *-hydroksietyylitio)fusidii-nihappobentsyyliesteri 3-asetyyli-16-deasetoksi-16 o( -bromifusidiinihappobentsyyli-esteriä (1,34 g, 2 mmoolia) lisättiin liuokseen, jossa oli kalium-hydroksidia (1,68 g, 25 mmoolia) ja 2-hydroksietyylimerkaptaania (2,1 ml, 30 mmoolia) 150 mlrssa puhdasta etanolia. Kun seosta oli sekoitettu 16 tuntia huoneen lämpötilassa, lisättiin hitaasti vettä (100 ml) halutun tuotteen kiteyttämiseksi. Kiteet suodatettiin erilleen, pestiin veden (5 ml) ja metanolin (5 ml) seoksella, ja kuivattiin, jolloin saatiin 3-asetyyli-16-deasetoksi-16 /3-(2'-hydroksietyylitio) fusidiinihappobentsyyliesteriä (1,18 g); sulamispiste 167-176°C.

Kiteytettäessä uudelleen metanolin ja veden seoksesta sulamis-piste kohosi 175-178°C:een.

B. 3 of,11 Q{ -dihydroksi-16 /3-(2 *-hydroksietyylit io )f usida-13 (17 ), 2 4-dieeni-21-karboksyylihappo ~ 700 mg edellä esitettyä bentsyyliesteriä liuotettiin dimetyyli-sulfoksidin (50 ml) ja 2-n natriumhydroksidin vesiliuoksen (10 ml) seokseen. Kun seosta oli lämmitetty 1,5 tuntia 70°C:ssa, se tehtiin happameksi 4n suolahapolla (pH = 2) ja lisättiin vettä (100 ml) ja eetteriä (100 ml). Orgaaninen faasi eroitettiin, pestiin vedellä ( 5 x 50 ml), kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin öljymäistä jäännöstä, joka sisälsi halutun tuotteen kahta isomeeriä. Tämä jäännös eroitettiin kahdeksi fraktioksi kuivakolonni-kromatografiaa käyttäen silikageelillä (sykloheksaani:kloroformi: etikkahappo, 10:80:10).

17 57599

Polaarisenpi fraktio sisälsi toista 3ol, 11oi.-dihydroksi-16(8-(21-hydroksietyyli-tio)fusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihapon kahdesta C-20-isomeerista (290 mg), ja polaarittomammassa oli 50 mg toista isomeeriä. Polaarisemman C-20-isomeerin NMR-spektrissä (CDCL^) on signaalit kohdilla 1,00 (s, 3H), 1,21 (bs, 3H), 1,25 (s, 3H), 1,61 ja 1,69 (2 bs, 6h), 2,75 (m, 2H, CHgS), 3,5-3,9 (m, 5H, CH-3, CH-16, CH-20 ja CF20H), U,U0 (m, 1H, CH-11) ja 5,06 (m, 1H, CH-2U) milj. osaa. Sisäisenä referenssinä käytettiin tetrametyylisilaania.

Polaarittomamman C-20-isomeerin NMR-spektrissä (CD^OD) ovat signaalit kohdilla 0,86 (d, J=7, 3H), 0,97 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,56 ja 1,61 (2 bs, 6H), 2,62 (m, 2H, SCH2), 3,5-3,8 (m, 5H, CH-3, CH-16, CH-20 ja CH OH), ^ ^,27 (m, CH-11) ja 5,15 (m, 2H, CR-2k) milj. osaa. Sisäisenä referenssinä käytet tiin tetrametyylisilaania.

Esimerkki 2k 3 o*, 11oC-dihydroksi-l6/S-fenyylitiofusida-13( 17).2l*-dieeni-21-karboksyylihapon kahden C-20-isomeerin erottaminen

Suspensiota, jossa oli 3el,11«t-dihydroksi-l6/3-fenyylitiofusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa (1 g isomeerien seosta, jota oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) eetterin (50 ml) ja 1-n suolahapon vesiliuoksen (10 ml) seoksessa, ravisteltiin kunnes kiteet olivat kadonneet. Orgaaninen faasi erotettiin, pestiin kahdesti vedellä, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin vakuu-missa. Jäännös liuotettiin 5 ml:aan kiehuvaa sykloheksaania. Liuoksen jäähtyessä huoneen lämpötilaan erottui kiteistä tuotetta, joka suodatettiin erilleen, pestiin 1 ml:11a sykloheksaania ja kuivattiin. Kiteytettäessä uudelleen 5 ml:sta sykloheksaania, saatiin toista kahdesta C-20-isomeerista puhtaana tuotteena, jonka sulamispiste oli 96-98°C.

Emäneste haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja jäännös kiteytettiin eetteri-petrolieetteri-seoksesta, jolloin saatiin 210 mg toista C-20-isomeeria, jonka sulamispiste eetteri-petrolieetteri-seoksesta uudelleen kiteyttämällä puhdistettuna oli 9^-99°C. Levykromatograafisen määrityksen perusteella (liuotinsysteemi : klo-^ roformi:sykloheksaani:metanoli:etikkahappo, 80:10:2,5:10; suihkereagenssi: rikki happo) jälkimmäinen tuote on näistä kahdesta isomeeristä polaarittomampi.

Esimerkki 25 3oi, 11et.-dihydroksi-l6/9-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2H-dieeni-21-karboksyyli-hapon kahden C-20-isomeerin erottaminen A. 3oU0-formyyli-11cfc-hydroksi-l6fl-isopropyylitiofusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihappo-asetoksimetyyliesterin toinen C-20-isomeeri

Esimerkin 19 mukaisesti valmistettua 3ol, 1l^-dihydroksi-I^S-isopropyylitio-fusida-13(17)»2i+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa (1,5 g, 2,5 mmoolia) 57599 18 liuotettiin dimetyyliformamidiin (15 ml), ja lisättiin kloorimetyyliasetaattia (0,3 ml, 3,3 mmoolia). Reaktioseoksen oltua paikoillaan 16 tuntia 20°C:ssa, se jäähdytettiin 0°C:een ja sitä sekoitettiin lisättäessä hitaasti tionyylikloridia (1 ml, 13,7 mmoolia). Kun seosta oli sekoitettu tunnin ajan 20°C:ssa, lisättiin etyylieetteriä (100 ml) ja saatu seos pestiin vedellä (U x 50 ml), kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 1,U g kahden C-20-isomeeriesterin seosta.

Tämä jäännös liuotettiin petrolieetteriin (15 ml) ja raaputettaessa toinen kahdesta isomeeristä kiteytyi puhtaana. Kiteet koottiin talteen, pestiin petrolieetterillä ja kuivattiin, jolloin saatiin haluttua yhdistettä, sulamispiste 126-128°C.

B. 3c<.-0-formyyli-11dtrhydroksi-l6/ä-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2^-dieeni-21-karboksyylihappo-asetoksimetyyliesterin toinen isomeeri Tämän esimerkin osan A yhdisteen kiteytyksessä jäljelle jäänyt emäliuos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, ja jäännös puhdistettiin kromatograafisesti piihappogeelillä (sykloheksaani:etyyliasetaatti, 8:2), jolloin saatiin haluttua - yhdistettä öljymäisenä jäännöksenä.

C. 3ot, 11ok-dihydroksi-l6f8-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2^-dieeni-21 -karbokyy-lihapon toinen C-20-isomeeri Tämän esimerkin osan A yhdiste (300 mg) liuotettiin metanoliin (15 ml) lisättiin kaliumkarbonaattia (300 mg) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Sen jälkeen reaktioseos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja lisättiin etyylieetteriä (50 ml) ja 1-n suolahappoa (25 ml). Orgaaninen faasi erotettiin, pestiin kahdesti vedellä ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin raakatuotetta, joka kiteytettiin metanoli/vesi-seoksesta, jolloin saatiin 3«l, 11«t-dihydroksi-l6£-isopropyylitiofusida-13(17),24-dieeni-21-karboksyylihapon toista isomeeriä, sulamispiste 110-112°C; = 37*8° (c = 1, kloroformissa).

D. 3et, 11oL-dihydroksi-l6/3-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2l4-dieeni-21-karboksyy-lihapon toinen C-20-isomeeri

Noudattamalla tämän esimerkin osan C menetelmää, mutta korvaamalla osan A tuote osan B tuotteella, valmistettiin 3ot, 11«fc-dihydroksi-l6(5-isopropyylitiofusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihapon toista isomeeriä värittöminä kiteinä, sula- ~ mispiste 1UU-1U9°C; = “158,7° (c = 1, kloroformissa).

’9 57599

Esimerkki 26 3<*. 11«<-dihydroksi-l6/^-fenyylitiofusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyylihappo-asetoksimetyyliesteri 3λ, 1U-dihydroksi-l6^-fenyylitiofusida-13(17),2l+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolaa (330 mg, 0,5 mmoolia; esimerkissä 20 erotettujen kahden isomeerin polaarisempaa isomeeriä) liuotettiin 2 ml:aan dimetyyliformamidia ja lisättiin kloorimetyyliasetaattia (50 ^il, 0,55 mmoolia). Seoksen oltua paikoillaan huoneen lämpötilassa 16 tuntia, lisättiin eetteriä (50 ml), ja saatu seos pestiin vedellä (1; x 50 ml), kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 3*, 11o<-dihydrok- ^ si-l6A-fenyylitiofusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihappo-asetoksimetyylies- teriä (toista kahdesta mahdollisesta C-20-isomeerista) värittömänä vaahtona (180 mg).

NMR-spektrissä (CDC1-) on signaalit kohdissa ci * 0,88 (d, J=6, 3H), 0,97 (s, 3H),

3 Q

— 1,16 (bs, 6h) , 1,59 ja 1,67 (2 bs, 6h), 2,02 (s, 3H, q_J_ch). 3,52 (m, CH-20), 3,63 (m, CH-3), U,16 (bd, CH-16), U,29 (m, CH-11), 5,12 (m73CH-2l+), 5,67 ja 5,81 (2d, J-6, c-ocHg-O-Cp (5H, aromaattinen CH) milj. osan. Sisäisenä refe renssinä käytettiin teträme tyylisliaania.

Esimerkki 27 3«, 11g^-dihydroksi-l6A-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2l+-dieeni-21-karbokswli-happoasetoksimetyyliesteri

Analogisesti esimerkin 26 kanssa valmistettiin otsikossa mainittu yhdiste korvaamalla 3 * , 11<k-dihydroksi-l6^-fenyylitiofusida-13( 17) ,2l+-dieeni-21-kar-boksyylihapon natriumsuolaa vastaavalla 16/^-isopropyylitiojohdannaisella. Tuote kitey tettiin metanolin ja veden seoksesta*, sp. 7^“75°C.

Esimerkki 28 3<*.11<<-dihydroksi-l6Afenyylitiofusida-13( 17) .2l+-dieeni-21-karboksyylihappo- fusidyylioksimetyyliesteri

Noudattamalla esimerkin 26 menetelmää ja korvaamalla kloorimetyyliasetaatti fusidiinihappokloorimetyyliesterillä, valmistettiin värittömänä vaahtona 3<x, 11ot- w dihydroksi-l6Afenyylitiofusida-13( 17) ,2l+-dieeni-21-karboksyylihappo-fusidyyli- oksimetyyliesteriä. NMR-spektrissä (CDC1-) on signaalit kohdissa 1,57 ja 1,67 0 3 (2 bs, 12H), 2,02 (s, 3H, Q_CJCE ), 3,U0 (m, CH-20), 3,65 (m, CH-3 ja CH-3'), 1+,10 (bd, CH-16), 1+,30 (m, CH-l73ja CH-11’), 5,05 (m, CH-2U ja CH-21+’) 5,60 ja “OP-- ~ “ 5,82 (2 d, J=6, _0.c-)» 5*78 (d» J=T» ciL"16’) 0a 7,25 (m, 5H, aromaattinen CH) milj. osaa. Sisäisiä referenssinä käytettiin tetrametyleenisilaania.

Terapeuttisten tutkimusten tulokset 3=0 1«c-dihydroksi-l6ft-fenyylitiofusida-13( 17) ,2l+-dieeni-21-karboksyylihapon bakteereja tuhoava vaikutus in vitro fusidiinihapon vastaavaan vaikutukseen verrattuna

Kokeissa käytettiin National Institute of Health'n (NIH) elatusainetta, 20 57599 jonka koostumus oli seuraava:

Difco-hiivauute 0,5 %

Kaseiinihydrolysaatti 1,5 %

Natriumkloridi 0,25 %

Dekstroosi 0,1 % L-kystiini 0,005 %

Tislattua vettä loput

Elatusaineen pH oli 7,1 (autoklaavikäsittelyn jälkeen).

Kahteen putkiloon, jotka sisälsivät NIH-elatuslientä lisättiin a. 3<*, 1 W-dihydroksi-l6/ö-fenyylitiofusida-13( 17) ,2H-dieeni*-21-karboksyyli-hapon n at riums uol aa (l0/^g/ml) b. fusidiinihapon natriumsuolaa (10/ig/ml).

Putkiloihin istutettiin Streptococcus pyogenes-bakteereja siten, että eliöitä k . .o ... .......

oli 9,2 x 10 ml:aa kohden, idätettiin 37 Ctssa, ja tietyin väliajoin määritettiin laskemalla elinkykyisten eliöiden määrät.

Kolmatta putkiloa käsiteltiin samalla tavalla lisäämättä mitään antibioottia ja tätä käytettiin kontrollina.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Viljelmä Elinkykyisten eliöiden lukumäärä, kun aikaa oli kulunut _0 tuntia 1.5 tuntia U tuntia 7 tuntia_ . h 1 h 2

Putkilo a 9,2x10 1,Ux10 5,7x10 5,0x10

Putkilo b 9,2x10** 1,2x105 1,5x105 1,3x105

Kontrolli 9,2x1ο1* 6,8x105 2,Ux10T 1,7x10®

Fusidiinihapon ja 3<><« 1 'U-dihydroksi-l6/a-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2h-dieeni-21-karboksyylihapon yhdistelmän vaikutus in vitro

Kolmeen putkiloon, joissa oli NIH-lientä lisättiin: -- a. fusidiinihapon natriumsuolaa (1 ^ug/ml), b. 3*,1 ,U-dihydroksi-l6-isopropyylitiofusida-13( 17) ,2l»-dieeni-21-karboksyyli- hapon natriumsuolaa (3^/ml), — c. fusidiinihapon natriumsuolan (l^ug/ml) ja 3«<,11<rt-dihydroksi-l6-isopropyy-litiofusida-13( 17) ,2i+-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolan (3 ^ig/ml) seosta.

Putkiloihin istutettiin Staphylococcus aureus-bakteereita siten, että niissä oli 1,1+xlO1* eliöitä ml:ssa, idätettiin 37°C:ssa 2k tuntia, ja määritettiin laskemalla elinkykyisten eliöiden määrät.

Neljättä putkiloa käsiteltiin samalla tavalla lisäämättä mitään antibiooteista ja tätä käytettiin kontrollina:

Viljelmä Elinkykyisten eliöiden lukumäärä

Putkiloa 1,8x108

Putkilo b 1,5x10°

Putkilo ,c 7,3x10°

Q

Kontrolli 6,2x10 2i 5 7599

Putkilossa a selviytyneet eliöt sietävät fusidiinihappoa, ja putkilossa b selviytyneet sietävät 3*< 11ot-dihydroksi-l6Aisopropyylitiofusida-13( 17) ,2U-dieeni~ 21-karboksyylihappoa, kun taas putkilossa c ollut kahden yhdisteen yhdistelmä estää resistanssin kehittymisen.

Dihydro-fusidiinihapon ja 3^. 1 IcC-dihydroksi-lö/^-fenyylitiofusida- läUJL. 2H-dieeni-21-karboksyylihapon yhdistelmän vaikutus in vitro

Kolmeen NIH-lientä sisältävään putkiloon lisättiin: a. dihydro-fusidiinihapon natriumsuolaa (10 jj.g/ml), b. 3«*, 1 1<*-dihydroksi-l6-fenyylitio-fusida-13( 17) ,2U-dieeni-21-karboksyyli-hapon natriumsuolaa (I0;og/ml), c. dihydro-fusidiinihapon natriumsuolan (5 jag/ml) ja 3«*, 1 1<*-dihydroksi-l6-fenyylitiofusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolan (5 ^g/ml) seosta.

Putkiloihin istutettiin Staphylococcus aureus-bakteereita siten, että eliöiden määräksi tuli 5,2 x 10^ eliötä/ml:ssa, idätettiin 37°C:ssa 96 tuntia, ja määritettiin laskemalla elinkykyisten eliöiden määrät.

Neljättä putkiloa käsiteltiin samalla tavalla lisäämättä mitään antibiooteista ja tätä käytettiin kontrollina:

Elinkykyisten eliöiden lukumäärä 0 2 6 1/2 2k 96 tuntia

Kontrolli 5,2 x 10^ 1,3 x 10^ U,6 x 10^ U,3 x 10^ täysi kasvu a U,1 x 105 3,1 x 105 6,3 x 106 " " b 5,2 x 10U 1,1 x 101* 3,1 x 106 " " c 1,5 x 105 U,1 x 101* <10

Putkilossa a selviytyneet eliöt ovat resistenttejä dihydro-fusidiinihapon ^ suhteen ja putkilossa b olleet eliöt ovat resistenttejä 3·*, 11<-dihydroksi-l6A- fenyylitio-fusida-13(17),2U-dieeni-21-karboksyylihapon suhteen, kun tans näiden kahden yhdisteen putkessa c ollut yhdistelmä estää resistenssin kehittymisen.

Fusidiinihappo-resistanssin kehittymisen ehkäistyminen seurauksena Staph, aureus-bakteerien käsittelystä 3ot 1 •Uk-dihydroksi-l6/*-isopropyylitio-fusida-13(17) t2U-dieeni-21-karboksyylihapon natriumsuolalla 1»8 tuntia sen jälkeen kun fusidiinihapolle altista Staph, aureus (Leo CC 178B)-kantaa oli käsitelty käyttämällä alle inhibitorisin konsentraatioin fusidiinihappoa tai esimerkin 9 yhdistettä, määritettiin esikäsiteltyjen viljelmien ja alkuperäisen kannan alttiutta näille kahdelle yhdisteelle. Määritykset tehtiin sarjalaimennuksina NIH-liemessä, istutuksen määrän ollessa 2 x 10^ eliötä ml:ssa, ja laskettuina IC^Q-arvoina 18 tunnin ja U8 tunnin kuluttua. Tulokset ovat nähtävissä seuraavassa taulukossa B: j · > ' 22 57599

Taulukko B

IC50> /ig/ml

Isolaatit 18 tuntia k8 tuntia

Fusidiinihappo Esimerkin 8 Fusidiini- Esimerkin 8 yhdiste happo yhdiste

Kontrolliviljelmä 0,016 2 1 5

Fusidiinihappoviljelmä 7,9 1,6 50 5

Esimerkin 8 mukaisen yhdisteen viljelmä 0,016 5 0,020 16

Kontrolliviljelmän resistanssin lisääntyminen fusidiinihapon suhteen, mikä näkyy kasvaneena IC^-arvona U8 tunnin kuluttua, lisääntyy edelleen fusidiini- — happo-esikäsittelyn vaikutuksesta.

Esimerkin 8 yhdisteen suhteen havaitaan vain lievää alttiuden pienenemistä. Esikäsittely fusidiinihapolla ei vaikuttanut tuloksiin.

Viljelmän esikäsittely esimerkin 8 yhdisteellä ehkäisi täydellisesti resistanssin kehittymisen fusidiinihapon suhteen.

11o(-dihydroksi-16/3-etyylitio-fusida-13 (17) ,2l-dieeni-21 -karboksyylihapon vaikutus in vitro Staph, aureus-bakteereja vastaan

Nestemäiseen NIH-elatusväliaineeseen tehtiin sarjalaimennuksia edellä esitetystä yhdisteestä ja sen jälkeen niihin istutettiin runsaasti joko fusidiinihapolle herkkää Staph, aureus (Leo CC17ÖB)-kantaa tai fusidiinihapon suhteen resistenttiä saman kannan muunnelmaa (Leo CC178A).

Jokaisen 72 ja 96 tunnin kuluttua suoritettiin transferointeja putkista, jotka sisälsivät suurimman määrän koeyhdisteitä, kasvun ollessa runsas. Alla olevassa taulukossa esiintyvät herkkyysarvot määritetty yön kestäneen idätyksen jälkeen.

Taulukko C

IC50 , pg/ml

Staph, aureus ennen siirrostusta siirrostuksen jälkeen _ 1. 2. 3. k. 5- 6.

Leo CC 17ÖB (herkkä fusidiinihapon suhteen) 2,7 2,0 7 ,k 7,1* 13,5 10,0 32

Leo CC 178A (resistentti fusidiinihapon suhteen) 2,7 2,3 3,8 3 U,2 U,0 h-,0

Taulukosta havaitaan, että fusidiinihapolle herkän kannan herkkyys kyseisen yhdisteen suhteen on pienentynyt 12-kertaisesti kuudennen transferoinnin jälkeen, kun taas fusidiinihapon suhteen resistentin kannan herkkyydessä ei näy mitään muutosta. Tämä on erittäin odottamaton ilmiö.

23 57599 3o<, 1 H-dihydroksi-^^-isopropyylitiofusida-IBi 17) ,2U-dieeni-21-karboksyy-lihappoasetoksimetyyliesterin aktiivisuus Määritettiin otsikossa mainitun esterin aktiivisuus ennen käsittelyä hiiren seerumilla ja tämän käsittelyn jälkeen, ja verrattiin tulos vastaavan hapon aktiivisuuteen. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa', sarakkeessa A on esitetty 50-$:iseen inhibointiin tarvittava esteripitoisuus (μζ/ml), sarakkeessa B on vastaavasti esitetty 25-#:isella hiiren seerumilla käsitellyn (90 minuuttia, 3T°C:ssa) esterin pitoisuus, ja sarakkeessa C on vastaava vapaan hapon pitoisuus.

50-$:iseen inhibointiin tarvittava Organismi pitoisuus Oug/ml)

ABC

Streptococcus pyogenes Leo EC 63 1,6 0,63

Staphylococcus aureus Leo CC17ÖB >100 6,3 1,6

Staphylococcus aureus Leo CClTÖHg (Fusidiinihapolle resistentti kanta) >100 5,0 1,6

Kokeesta ilmenee, että esteri tosin on inaktiivinen in vitro, mutta se hajoaa organismin entsyymien vaikutuksesta. Esterikin on siten hyvin aktiivinen in vivo.

Claims (1)

1. 21 57599 Patenttivaatimus : Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten fusida-13(17)-eeni-21-karboksyylihappojohdannaiSten valmistamiseksi, joiden kaava on H3C V/CH3 p L^°or^ T20 — HO ^ il7 SR1 i CH 13 j i HO ; 1 ! H ch3 jossa C-2U:n ja C-25:n välinen sidos on yksinkertainen sidos tai kaksoissidos, ja tähti C-20:n kohdalla osoittaa, että yhdisteet esiintyvät kahtena diastereomeeri-muotona, ja jossa R^ merkitsee suoraa tai haarautunutta alkyyliryhmää, jossa on 1-6 hiiliatomia, tai 3-6 hiiliatomia sisältävää alkenyyliryhmää, tai fenyyliryhmää, joka saattaa olla monosubstituoitu halogeeniatomilla tai C^-C^-alkyyliryhmällä, tai furfuryyliryhmää, ja R^ merkitsee vetyatomia tai C^-Cg-alkanoyylioksi-C^-C^-alkyyliryhmää, tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan yhdiste, jonka kaava on g ^/C00E2 II ^3___ Γ" Γ .*083 k 25 57599 jossa kaavassa merkitsee vetyatomia tai alkanoyyli-, aralkanoyyli- tai aroyyli-ryhmää ja R^ ja C-2U:n ja C-25:n välinen pilkkuviiva merkitsevät samaa kuin edellä, ja Rg merkitsee bentsyyliryhmää tai substituoitua bentsyyliryhmää, reagoimaan epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen kanssa orgaanisen liuottimen läsnäollessa, jotta muodostuu kaavan I mukaista yhdistettä, joka otetaan talteen happona tai suolana, ja joka haluttaessa muutetaan helposti hydrolysoituvaksi, edellä määritellyksi esteriksi, jonka jälkeen haluttaessa mahdolliset kaksi C-20-isomeeria erotetaan fraktiokiteyttämällä tai kromatografoimalla. 26 57599 Förfarande för framställning av nya, terapeutiskt användbara fusida-13(17)— en-21-karboxylsyraderivat med formeln |[25 j'2U \^C00R^ 20 17 H0-. I I'l H I ch3 HO'' ; h CH3 där bindningen mellan 02^4 och C-25 är en enkel eller en dubbelbindning, och stjärnan vid C-20 angiver, att föreningarna existerar i tvä diastereomera former, och där R1 betecknar en rak eller förgrenad alkylgrupp med 1-6 kolatomer eller en alkenylgrupp med 3~6 kolatomer, eller en fenylgrupp, vilken kan vara monosubsti-tuerad med en halogenatom eller en CpC^-alkylgrupp, eller en furfurylgrupp, och R^ betecknar en väteatom eller en C^Cg-alkanoyloxi-C^C^-alkylgrupp, eller farmaceutiskt godtagbara salter av dessa föreningar, kännetecknat därav, att en förening med formeln H3C ' /CH3 li C00R2 II SR1 I CH3| T _ j TT CH3 Qp' -3