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Publication number: DEM0021061MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 2. Dezember 1953 Bekanntgemacht am 22. März 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Zitronensäure durch submerse Gärung, insbesondere auf eine neue Quelle für Nährstickstoff, wie dieser für das gute Wachstum von zitronensäurebildenden Sporenstämmen, wie Aspergillus niger, nötig ist.

Die verschiedenen Verfahren zur Erzeugung Von Zitronensäure durch Gärung sehen ein Substrat vor, das dem lebhaften Wachstum einiger Mycelorganismen günstig ist, welche zur Überführung von Zucker in Zitronensäure fähig sind. Es wurde festgestellt, daß dieses Nährsubstrat außer dem Zucker und anderen mineralischen Nährstoffen eine Stickstoffquelle einschließen muß, die man bisher üblicherweise in Form verschiedener anorganischer Salze zugefügt hat, unter denen, wie in der USA.-Patentschrift 2 492 667 be- 1; schrieben wird, das Ammoniumcarbonat eine der geeignetsten ist. Die exakte Grundlage für die Überlegenheit von Ammoniumcarbonat gegenüber anderen stickstoffhaltigen Salzen wurde bisher nicht eindeutig festgelegt; seine Anwendung beruht auf seiner prak- 2c tischen Fähigkeit, die Ausbeute an Zitronensäure zu verbessern und das Entstehen von Oxalsäure und anderen unerwünschten Säuren zu verringern oder ganz zu verhindern. Jedoch läßt sich die Verwendung von Ammoniumcarbonat als Hauptnährstoff nicht 2; ohne gewisse dabei auftretende Schwierigkeiten verwirklichen. Obwohl es in Pulverform in den Handel kommt, geht das Ammoniumcarbonat bei der Lage-

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rung in steinartige Klumpen über, die den Eindruck machen, als ob sie durch Schmelzen von Kristallen gebildet seien. Derartige Klumpen sind nur schwierig zu zerkleinern, und es lassen sich aus ihnen nur mit Hilfe eines Preßlufthammers Stücke erhalten, die klein genug sind, um einen befriedigenden Löslichkeitsgrad aufzuweisen, wenn sie in die Gärflüssigkeit eingebracht werden. Während der Aufbereitung des Ammoniumcarbonats für seine Einführung in das

ίο Nährsubstrat entwickelt sich Ammoniakgas, was unangenehme Arbeitsbedingungen schafft. Auch wenn für beträchtliche Ventilation gesorgt wird, muß der . Arbeiter beim Umgehen mit Ammoniumcarbonat eine Gasmaske tragen. Darüber hinaus macht es ein derartiger Ammoniakverlust an die Atmosphäre und die Schwierigkeit, den Löslichkeitswert für einen' bestimmten Ansatz Ammoniumcarbonat zu bestimmen, unmöglich, durch Zufügen von Ammoniumsalz eine genaue Steuerung der Wasserstoffionenkonzentration in den Gärbehältern zu erreichen. Wenn aber kein genauer pH-Wert aufrechterhalten wird,^! ist der Wirkungsgrad des Gärungsprozesses stark herabgesetzt. In Anbetracht dieser Tatsachen ist es klar, daß mit dem Gebrauch von Ammoniumcarbonat bei der submersen Gärung eine Anzahl ernst zu nehmender Nachteile verbunden ist.

Die Erfindung bezweckt daher die Erschließung einer Stickstoffquelle, die eine genaue Steuerung des pn-Wert es des Nährsubstrates möglich macht. ^; ■

Weiterhin richtet sich die Erfindung darauf, einen stickstoffhaltigen Nährstoff zur Verfügung zu stellen, durch dessen Form die verschiedenen mit dem Aufbereiten und Einbringen von Ammoniumcarbonat in das Nährsubstrat verknüpften Probleme auf dem Gebiet der Arbeitsbedingungen ausgeschaltet werden.

Ferner hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, eine Stickstoffquelle bereitzustellen, die weder den Grad des Umsatzes von Kohlehydraten in Zitronensäure beeinträchtigt, noch zur Entstehung anderer unerwünschter Säuren, wie Oxal- und Glukonsäure, führt. Diese und andere ähnliche Ziele werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man bei der Erzeugung von Zitronensäure durch submerse Gärung von kohlehydrathaltigen Stoffen als Stickstoffquelle Ammoniakgas einleitet.

Durch ausgedehnte Versuche wurde festgestellt, daß Ammoniak besonders geeignet ist, im Nährsubstrat optimale Bedingungen zu schaffen. Der Austausch des bisher benutzten Ammoniumcarbonats durch Ammoniak führte, wie festgestellt wurde, zu keinerlei Änderungen in den morphologischen, physiologischen oder Wachstumseigenschaften der Mycelorganismen. Zum Vergleich der Ergebnisse aus diesen Versuchen seien die folgenden Beispiele angeführt:

Beispiel I

Als Stickstoffquelle in einer für die submerse Vergärung von Maiszucker zu Zitronensäure benutzten Nährlösung wurden Ammoniakgas, wie es für Kühlschranke benutzt wird, einerseits und reines Ammoniumcarbonat andererseits verglichen. Die Medien enthielten 0,065% NH₃ bzw. 0,2% (NHJ₂CO₃, 0,014% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄, 0,5 Promille Morpholin, 0,006 Promille CaCl₂ (als Ca), 0,018 Promille MoO₃, 0,018 Promille H₂O₂, 0,0005 Ms 0,005 Promille Zn++ und ungefähr 13% entkationisierte Kohlehydrate; sie wurden mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,6 eingestellt und im Autoklav bei etwa 1 Atmospäre Überdruck 10 Minuten sterilisiert. Sie wurden dann in Teilmengen von 4 Litern in sterile, säulenförmige Glasfermentiergefäße nach derUSA.-Patentschrift 2492667 übergeführt. Bei der Zubereitung der Nährlösungen ließ man 0,068% NH₃-GaS durch die alle notwendigen Zusätze, einschließlich der für den ρκ- Endwert von 2,6 ausreichenden technischen Salzsäure enthaltende Zuckerlösung hindurchstreichen. Die Medien wurden fermentiert durch Aspergillus niger bei 30 bis 32⁰. Sämtliche Fermentationsbedingungen und Analysemethoden entsprachen den in den USA.-Patent-Schriften 2 476 159 und 2 492 667 angegebenen.

Tabelle I zeigt die Ausbeuten an Zitronensäure in Nährlösungen mit einem Gehalt an NH₃-GaS, verglichen mit solchen, die Ammoniumcarbonat enthielten.

Tabelle I

Stickstoff quelle	N	Zn++ Promille	Fermentierte Zeit Tage	Acidität 0/ /0	Ausgangs zucker*)	Umsetzung des Ausgangs zuckers in °/₀
(NHi)₂CO,	0,054 0,054	0,0005 0,005 0,0005 0,005	00 00 HH HH	10,12 10,68 10,15 10,20	12,8 . 12,8 13,5 13,5	79,06 83,44 75,19 75,56

*) Als Dextrose

Abgesehen von der etwas höheren Säureausbeute mit Ammoniakgas zeigt sich bei den beiden Stickstoffquellen keinerlei Unterschied in der Morphologie oder Physiologie der Zellen. Merkliche Mengen an Oxalsäure waren nicht zugegen.

120 Beispiel II

Es wurden zwei Gärungen, die in Gefäßen mit dem gleichen Inhalt wie im Beispiel I verliefen, bis zur Beendigung durchgeführt. In die Nährlösungen wurde 1.25 über Belüfter zusammen mit genügend Luft, um die

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Lösung in Bewegung zu halten und das Ammoniakgas zu verteilen, NH₃-GaS (o,o65°/₀) eingeleitet. Die Lösungen wurden anschließend mit technischer Salzsäure auf einen pn-Wert von 2,6 gebracht, in den Fermentiergefäßen mit Dampf sterilisiert und nach dem Kühlen mit 15 g Aspergillus-niger-Sporen geimpft. Belüftet und gerührt wurden die Nährsubstrate mit entfeuchteter Luft von einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,31 m³/min. (ii.C.F.M.). Alle anderen Gärbedingungen entsprachen den in der USA.-Patentschrift 2 476 159 angegebenen.

Nach einer Gärdauer von 9 und 10 Tagen wurden die Substrate aufgearbeitet und analysiert, wobei sich die in Tabelle II aufgeführten Werte ergaben.

	% N	Tabelle II	Zn++ Promille	Fermentierte Zeit Tage	Acidität %	Ausgangs zucker*) %	Umsetzung des Ausgangs zuckers in %
Stickstoff quelle	0,054 0,054	0,0005 0,0005	9 IO	io,5 io,35	13,00 12,45	80,77 83,13
NH₃ (NHJ₂CO₃

*) Als Dextrose

Die Morphologie der Zellen und die Säureausbeute entsprachen denen von Beispiel I.

Beispiel III

In einer Nährlösung, die der im Beispiel I und II benutzten entspricht, worin jedoch anstatt 0,0005 bis 0,005 Promille Zn++ 0,022 Promille Zn++ anwesend waren, wurden zwei Gärungen durchgeführt. Der entmineralisierten Zuckerlösung, die zur Herstellung der Nährlösungen benutzt worden war, wurden

Tabelle III

Stickstofi- quelle	% N	Zn++ Promille	Fermentierte Zeit Tage	Acidität %	Ausgangs zucker*) %	Umsetzung des Ausgangs zuckers in %
NH₃ (NHJ₂CO₃	0,054 0,054	0,022 0,022	II II	I2,o6 12,40	14,28 14,67	84,45 84,53

*) Als Dextrose

Bei dieser Gärung wurde der gleiche Verlauf beobachtet wie im Beispiel I und II. Aus dem Ersatz von Ammoniumcarbonat durch Ammoniakgas ergaben sich keine morphologischen oder physiologischen Unterschiede.

Die sich aus der Verwendung von Ammoniakgas ergebenden außerordentlichen Vorteile lassen sich am besten erklären, wenn man die Tatsache in Betracht zieht, daß Ammoniakgas stabiler ist als Ammoniumcarbonat. Wie oben erwähnt, verliert das Ammoniumcarbonat bei der Lagerung Ammoniak, was eine beträchtliche Veränderung des je Ansatz verfügbaren Stickstoffes verursacht. Das Gewicht des festen Ammoniumcarbonats ist kein genaues Maß für die. in die Nährlösung eingeführte Menge an Stickstoffnährsubstanz, während bei einem geschlossenen System, wie es beim Arbeiten mit dem Gas zu verwirklichen ist, in das Substrat genaue gewogene Mengen Ammoniakgas eingeführt werden. Außerdem wird bei Verwendung von Ammoniakgas die durch das Auflösen des festen Ammoniumcarbonats entstehende Verzögerung vermieden. Diese Faktoren

gewogene Mengen NH₈-GaS zugefügt. Dann wurden die Lösungen mit HCl auf einen p_H-Wert von 2,6 eingestellt und in den Fermentationsgefäßen 1 Stunde bei 71° sterilisiert. Nach Kühlen auf ungefähr 33⁰ wurde mit Aspergillus-niger-Sporen geimpft. Die Nährsubstrate wurden mit entfeuchteter Luft belüftet und bewegt. Die Gärtemperatur wurde während des Verlaufes der Gärungen auf 33° konstant gehalten. Aus Tabelle III gehen die Vergleichswerte für NH₃-Gas und Ammoniumcarbonat hervor.

wirken sich in einer genauen mengenmäßigen Steuerung des Ammoniaks aus, das eine basische Reaktion hat, und ermöglichen dadurch wiederum eine einfache und empfindliche Einstellung des eigentlichen p_H-Wertes, was zu den größten Ausbeuten an Zitronensäure führt. Ein weiterer Umstand, der die Anwendung no von Ammoniakgas fördert, liegt in dessen niedrigeren Kosten, wobei erwähnt sei, daß der gegenwärtige Marktpreis für Ammoniak nur etwa 13 °/₀ des Preises für Ammoniumcarbonat beträgt.

Wie ersichtlich, stellt die Erfindung ein weitestgehend verbessertes Verfahren zur Einführung und Aufrechterhaltung geeigneter Mengen an stickstoffhaltigem Nährstoff im Nährsubstrat bei der Erzeugung von Zitronensäure dar.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

I. Verfahren zur Erzeugung von Zitronensäure durch submerse ■ Vergärung eines kohlehydrathaltigen Nährsubstrates unter Zugabe stickstoffhaltiger Nährstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man einem Nährsubstrat von im übrigen bekannter

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Zusammensetzung als stickstoffhaltigen Nährstoff Ammoniak in Form von Ammoniakgas zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man im Nährsubstrat eine optimale Wasserstoffionenkonzentration mittels Ammoniakgas aufrechterhält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gasförmige Ammoniak vor seiner Einleitung in das Nährsubstrat mit Luft verdünnt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Vergärung eines kohlehydrat- und nährsalzhaltigen Nährsubstrates mit einem Zitronensäure erzeugenden Stamm von Aspergillus niger den stickstoffhaltigen Nährstoff in Form von gasförmigem Ammoniak zusetzt.

Angezogene Druckschriften:
Österreichische Patentschrift Nr. 126 576;
französische Patentschrift Nr. 801 273.