DE9411010U1 - Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen - Google Patents
Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von PunktmutationenInfo
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Description
Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen
Beschreibung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Testbesteck zur analytischen Identifizierung
von Punktmutationen, z.B. an Tumorrisikogenen. Derartige Punktmutationen finden zur
Beurteilung eines Tumorrisikos bei onkologischen Patienten Verwendung.
Es ist bekannt, daß mutagene Basenveränderungen in doppelsträngigen Nucleinsäuren durch die Denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese (DGGE) erkannt werden können, sofern man Bedingungen wählt, die sich aus der Schmelzpunkttheorie doppelgängiger Nucleinsäuren ableiten (Fischer, S.G. und L.S. Lerman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA - P.N.A.S. - 80 (1983) 579- 583).
Es ist bekannt, daß mutagene Basenveränderungen in doppelsträngigen Nucleinsäuren durch die Denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese (DGGE) erkannt werden können, sofern man Bedingungen wählt, die sich aus der Schmelzpunkttheorie doppelgängiger Nucleinsäuren ableiten (Fischer, S.G. und L.S. Lerman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA - P.N.A.S. - 80 (1983) 579- 583).
Auf der Schmelzpunkttheorie doppelgängiger Nucleinsäuren beruht auch die Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese
(TGGE) nach Riesner (Riesner, D. et al., Electrophoresis 13 (1992) 632 - 636). Sie besitzt gegenüber der DGGE verfahrenstechnische Vorteile für
die Optimierung der Trennbedingungen und die Nachweisbarkeit der Analysenprodukte.
V.C. Sheffield et al. hatten gefunden, daß die TGGE bei Verwendung einer zusätzlichen
synthetischen GC(Guanin+Cytosin)-reichen Sequenz am Ende der zu unterscheidenden
natürlichen Sequenz die Identifizierbarkeit von Mutationen in der natürlichen Sequenz auf
theoretisch 100 % erhöht (P.N.A.S. 86 (1989) 232 - 236).
Prinzipiell eignet sich diese Methode für die Untersuchung medizinischer Proben. Sie ist
auf alle genetischen Regionen aller Organismen zur Mutantenidentifizierung anwendbar,
wenn eine bekannte Basensequenz vorliegt und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
möglich ist (Fodde, R. und M. Losekoot, HUMAN MUTATION 3 (1994) 83 - 94).
Ein Verfahren für die elektrophoretische Analyse von DNA-Fragmenten, die bei der DNA-Sequenzierung
entstehen, ist z.B. auch in der DE-OS 3501306 (Hood, L.E., 1985) beschrieben worden: demnach wird an DNA-Fragmente ein Set von farbgebenden oder
fluoreszierenden Substanzen gehängt; dadurch können die Fragmente charakterisiert
werden, nachdem man sie mit Hilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt hat.
Zur DNA-Basensequenzbestimmung ist vorgeschlagen worden, Proben im Gemisch simultan zu verarbeiten, indem sie mit Primern komplementär-ketten-synthetisiert und die DNA-Fragmentgruppen so gebildet werden, daß Endgruppen davon Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin werden können und die Fragmentgruppen, klassifiziert durch Endgruppen, auf Elektrophoresebahnen individuell unterschiedlich bewegt werden (Kambara, H.H., DE-OS 4011991, 1990).
Zur DNA-Basensequenzbestimmung ist vorgeschlagen worden, Proben im Gemisch simultan zu verarbeiten, indem sie mit Primern komplementär-ketten-synthetisiert und die DNA-Fragmentgruppen so gebildet werden, daß Endgruppen davon Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin werden können und die Fragmentgruppen, klassifiziert durch Endgruppen, auf Elektrophoresebahnen individuell unterschiedlich bewegt werden (Kambara, H.H., DE-OS 4011991, 1990).
Die Feststellung von Einzelbasenmutationen in DNA-Fragmenten mit Hilfe der DGGE-Methode
ist auch Gegenstand der US-PS 5190856 (Borresen, A.-L1 1993; analog WO
89/02930).
Die DGGE-Methode weist einige technische Nachteile auf, insbesondere bei der
Identifizierung niedriger Probenkonzentrationen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu schaffen, die es erlaubt,
Proben aus medizinischen oder biologischen Materialien auf die Anwesenheit von
Punktmutationen (Veränderung eines einzigen Nucleotide im Vergleich zu einer Referenzsequenz) in ausgewählten Genabschnitten zu untersuchen.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß eine TGGE-Apparatur verwendet wird und darin
solche Genabschnitte analysiert werden, die mit dem Verfahren der PCR unter Verwendung von GC-Klammer-Primern hergestellt worden sind. Die Erfindung besteht in
der Kombination der TGGE mit der Untersuchung von solchen PCR-Produkten, die mit
Hilfe von GC-Klammer-Primern hergestellt wurden. Die Besonderheit der erfinderischen
Lösung und ihre neue technische Gesamtlösung bestehen darin, daß in dem untersuchten
Genabschnitt jede einzelne Basenpaarveränderung von Nucleinsäuren erkannt werden
kann.
Die TGGE erlaubt gegenüber der DGGE technisch eine bessere Optimierung der
Trennbedingungen und eine sensitivere Quantifizierung der Anaiysenprodukte
(Silberfärbung). Durch die Verwendung von GC-Klammer-Primern ist die Identifizierbarkeit
aller theoretisch denkbaren Einzelbasenveränderungen möglich sowie solcher mutativer
Veränderungen, die mehrere Nucleotide betreffen.
Die methodischen Schritte der vorliegenden Erfindung bestehen in einer
Die methodischen Schritte der vorliegenden Erfindung bestehen in einer
1. DNA-Isolierung aus dem Untersuchungsmaterial nach bekannten Prinzipien, z.B. der
Phenolextraktion
2. PCR eines Gen-Abschnittes (100 bis 600 Basenpaare) unter Verwendung eines
Primerpaares
3. TGGE.
4. Die Mutanten-Bande wird aus der TGGE nach Silberfärbung isoliert und für die
Analyse / Kartierung der Punktmutation zugänglich durch eine Direkt-Sequenzierung
mit bekannten Verfahren (Meyer, CG. et al., J. Immunol. Meth. 142 (1991) 251 - 256).
Die Basensequenzanalyse läßt sich nach dem Verfahren der Direkt-Sequenzierung von
PCR-Produkten vornehmen (z.B. GREEN, P.M. und F. GIANELLI: Direct Sequencing of PCR-amplified DNA - Protocols in Human Molecular Genetics, ed. by CG. MATHEW;
Humana Press, Clifton, New Jersey, USA, 1991, pp. 21 -28) oder mit Fluoreszenzmarkierten Untersuchungsproben nach den Angaben von WILSON (WILSON, R.K.: Rapid
DNA Sequence Analysis using Fluorescent Labels, ebenda pp. 29 - 37 - System der Fa.
Applied Biosystems).
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß auch seltene Mutationen in solchen
Untersuchungsmaterialien festgestellt werden können, in denen mutierte Zellen in nur
geringer Anzahl unter nichtmutierten vorliegen. Diese Situation ist z.B. in jungen Tumoren
typisch.
So sind z.B. Mutationen im Tumorsuppressor-Gen p53 z.B. ursächlich beteiligt an der
Entstehung von Karzinomen. Ihr Nachweis ist ein wesentlicher Risikofaktor bei der
Beurteilung klinischer Untersuchungsmaterialien. Karzinome der Prostata waren bisher
aufgrund des komplizierten anatomischen Aufbaus dieser Drüse und aufgrund der Verteilung des Tumorgewebes nur unzulänglich für eine Mutations-Analyse zugänglich.
Überraschenderweise ergibt sich bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise eine aufschlußreiche Analyse nachweisbarer Punkt-Mutationen in den tumorbiologisch
wesentlichen Exons des Tumorsuppressor-Gens &rgr; 53.
Durchführung einer PCR und einer TGGE und zur Direktsequenzierung von PCR-Produkten.
Zur DNA-Isolierung gehören L(Lysis)-Puffer, Pronase-Lösung, äquilibriertes Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus Ingredienzien zur DNA-Isolierung, zur
Phenol und Ethanol/Acetatlösung als Zusatz zur DNA-Fällung. Zur Durchführung der PCR
wird ein PCR-Cocktail verwendet, zu dem auch die für den zu untersuchenden
Genabschnitt benötigten Primer gehören - wobei einer der beiden Primer die GC-Klammer-Sequenz
nach Sheffield zusätzlich enthält. Zur Durchführung der TGGE gehören: Gel, Puffer, De- und Renaturierung-MOPS für DNA-Gemische und Puffer / Silbernitrat zur
Silberfärbung. Die Basensequenzanalyse wird mit Hilfe von Fluores2:enz-markierten
Untersuchungsproben nach WILSON (a.a.O.) durchgeführt.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
1. Vorrichtung
Die Vorrichtung zur Identifizierung von Punktmutationen besteht aus
einer Desoxyribo-nucleinsäure(DNS)-Isolierungs-Apparatur, einem
Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Gerät, einer Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese
(TGGE) -Apparatur und einem Basensequenz-Analysator (a.a.O.).
2. Testbesteck
für a) DNA-Isolierung
b) PCR
c) TGGE
d) Sequenzanalyse
2.1. Desoxyribonukleinsäure (DNA)7 Techniken
Isolierung aus menschlichem Frischgewebe
1. Verwendung steriler Gefäße, Werkzeuge und Lösungen. RT Jede Probe wird mit neuem Gerät bearbeitet. Etwa 100 mg
Frischgewebe (Lagerung bei - 20-80 0C) werden in 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß
eingewogen und mit einem Pistill zerquetscht. Dabei Zugabe der 8-fachen Menge L-Puffer, 40C
kräftig mischen.
L-Puffer: 0,1 M EDTA
0,01 M Tris-HCl
0r02 M NaCl (pH 8,0 autoklaviert, Lagerung bei 4°C
2. Zugabe der 1-fachen Menge Pronase-Lösung, so daß die
Endkonzentration an Pronase 100 ]ig/ml beträgt und in
jedem Falle die SDS-Konzentration 0,5 %.
Pronase-Lösung: (siehe auch "Molecular Cloning": B. 16)
Pronase (DNase-frei) 1 mg/ml 0,01 M Tris-HCl (pH 7,8)
0,01 M EDTA
5 % SDS (Lagerung bei -20 0C, -nur kurzfristig auftauen)
Inkubation für 30 min bis 24 Std. bei 37-56°C
Man inkubiert, bis eine sichtbare Lyse auftritt und die
Lösung viskos wird. Zwischendurch kräftig schütteln.
3. Zugabe des gleichen Volumens einer Tris-äquilibrier- 0-40C
ten Phenol-Lösung (Unterschicht des 2-Phasen-Systems!)
Äquilibriertes Phenol: z.B. USB-Phenol, ultrapure, (pH 8)
Eventuell Phenol mit Chloroform/ Isoamylalkohol verwendbar
Kräftig mischen, 20 min. schütteln RT
5 Min. zentrifugieren bei 14000 U 4°C
4. DNA ist der Oberphase. Oberphase des 2-Phasen-Systems (mit abschnittener Spitze) sehr vorsichtig abziehen zur
Weiterverarbeitung. Dabei darf kein Anteil der grauen Zwischenschicht oder Phenolschicht (untere Phase) mit
aufgezogen werden.
5. Falls der Anteil der zurückbleibenden Zwischenschicht 10% übersteigt, wird L-Puffer zugegegeben und nach Mischen
und Zentrifugieren wird Schritt 4 wiederholt. Der entnommene tiberstand wird mit dem Überstand aus Schritt 4
vereinigt.
6. Zugabe 1/10 Volumen Acetat-Lösung, mischen
Acetat-Lösung: 3 M Na- oder
NH4-Acetat in H2O (pH -4,5),
steril filtriert
7. Zugabe 2,1-faches Volumen vorgekühlter reiner
Ethanol, kräftig mischen. 2 Std. Inkubation bei -200C
oder 30 Min. Inkubation bei -800C
8. Schütteln und 10 Min. zentrifugieren bei 14000 U - 9°C •DNA ist im Sediment.
9. Zugabe des bisherigen halben Volumens reiner 70% Ethanol. Wiederholung Schritt 8. Überstand vorsichtig
abgießen und auf Zellstoff ablaufen lassen. DNA ist im Sediment.
10. Geöffnetes Röhrchen 1 Std. im Vakuum trocknen 370C
lassen.
11. Lösen des Sediments in 2 mal 500 &mgr;&idiagr; TE , 4°C
30 Min. Kühlschrank
TE: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
1 mM EDTA (pH 8,0), autoklaviert, Lagerung bei
4°C
Lagerung der DNA-Lösung bei -2O0C
12. Zur. Photometrie 0,1 ml DNA-Lösung zu 2,9 ml 0,1 &khgr; SSC RT
(oder H2O) pipettieren, gut mischen, messen bei 220-300 nm.
Die DNA-Konzentration (pg/ml) in der Probe ergibt sich in
einer 1-cm-Küvette aus der Extinktion bei 2 60 nm multipliziert mit 50. Es kann auch in reinem Wasser photometriert werden.
SSC: 0,15 M NaCl
0,015 M Na-Citrat (pH 8,0 autoklaviert)
0,1 &khgr; SSC wird durch 1 plus 9-Verdünnung mit
sterilem Aqua dest. vorbereitet. Lagerung, bei 4°C
Vor der Verwendung zum Photometrieren muß 0,1 &khgr; SSC auf RT
gebracht werden.
2.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Systembedingungen
2.2.1. Primer (nach BANGHAM, 1991)
- Länge 18-30 b,
- Tm-Differenz beider Primer innerhalb 50C,
- GC-Gehalt ähnlich dem GC-Gehalt des Templates, ideal bei 50-60%,
- Bindungsort an Target-DNA: eine konservierte Region oder
- Sequenz, endend mit einer nichtdegenerierten Base, z.B. der
- ersten oder zweiten Base einer konservierten Aminosäure,
- Selbstkomplementarität vermeiden,
- 3'-Ende mit nicht mehr als drei G oder C,
- Mismatches mit dem Template dürfen nicht die 3'-ständigen Basen
des Primers betreffen.
- Komplementarität von zwei Basen an den Primer-Enden vermeiden; sie kann zur Dimer-Bildung führen.
2.2.2. Eigenschaften einer idealen Target-Sequenz
- Länge 150-500 bp (Amplifikation von 100-2000 bp ist möglich),
- unikale Sequenz,
&tgr; hohe Kopiezahl,
&tgr; hohe Kopiezahl,
- Anwesenheit eines diagnostischen Restriktions-Sites,
- Intron-Sequenz, zur Differenzierung zwischen einem genomischen
Amplifikat und cDNA oder kontaminierender DNA,
- Identifizierbarkeit der Sequenz durch eine Genprobe.
2.2.3. Taq-Polymerase, EC 2.7.7.7
0.1-5 U pro Reaktion, typischerweise 2,5 U pro 100 &mgr;&Igr;-Ansatz
2.2.4. Reaktions-Mischung, 100 &mgr;&idiagr;
nach BANGHAM, 1991: Tris-HCL 10 mM
KCl ' ·■ 50 mM
MgCl2 variabel oder 1,5 mM Gelatine 0,01 %
nach MELCHERS et al, 1989:
GIBCO Labs:
Fa. Promega:
nach PHILLIPS et al (1992) sowie Fa. Boehringer:
nach PELLEGATA et al (1992) Sonderdruck-Nr. 6156: im Text 10-fache Konz.!?
| dGTP | (pH S | (pH &iacgr; | 5,3) | 200 nM |
| dATP | 200 nM | |||
| dTTP | 200 nM | |||
| dCTP | 200 nM | |||
| 5'-Primer | 9,3) | (pH i | 5,4) | 1 &mgr;&Mgr; |
| 3'-Primer | 1 &mgr;&Mgr; | |||
| 1 ]ig | ||||
| 10 mM | ||||
| (pH &iacgr; | 50 mM | |||
| Ampliprimer | 2,5 mM | |||
| !,3) | Taq (Perkin-Elmer) | 0,01 % | ||
| 25 mM | ||||
| 2 mM | ||||
| 50 mM | ||||
| 1 mM | ||||
| 10 mM | ||||
| 50 mM | ||||
| 1,5 mM | ||||
| genomische Proben-DNA | 5,8-9) | 1 % | ||
| Tris-HCl | 10 mM | |||
| KCl | MgCl2 variabel oder | 50 mM | ||
| MgCl2 | Triton X-IOO | 1,5 mM | ||
| Gelatine | Tris-HCl | 0,01 % | ||
| TAPS (pH | KCl | 10 mM | ||
| MgCl2 | MgCl2 | 50 mM | ||
| KCl | Gelatine | 2,5 mM | ||
| DTT | Tris-HCl | 0,2 mM | ||
| Tris-HCl | KCl | 0,2 mg/ml | ||
| KCl | MgCl2 | 1,25 pM | ||
| dNTPs | 0,1 U/50 &mgr;&idiagr; | |||
| BSA |
2.2.5. Stammlösungen
dNTP: 10 &mgr;&idiagr; dTTP (0,1 M)
10 &mgr;&idiagr; dATP (0,1 M)
10 &mgr;&idiagr; dCTP (0,1 M)
10 &mgr;&idiagr; dGTP (0,1 M) in 460 &mgr;&idiagr; steriler TE mischen, abfüllen
in 100 &mgr;&Igr;-Portionen, Lagerung möglichst bei -80 0C1,
Zugabe 1:10 zu PCR-Cocktail.
2.2.6. Literatur
BANGHAM CRM: The polymerase chain reaction: Getting started.
in MATHEW CG (Ed.): Protocols in Molecular Genetics.
Humana Press Clifton, New Jersey, pp 1-8 (1991)
MELCHERS WIG et al: DNA detection techniques for routine diagnosis of infections, in BULLOCK G et al (Eds.) Techniques in
MELCHERS WIG et al: DNA detection techniques for routine diagnosis of infections, in BULLOCK G et al (Eds.) Techniques in
diagnostic pathology. VoI 1. Academic press, 151-172 (1989)
PELLEGATA NS et al: Detection of K-ras mutations by Denaturing . Gradient Gel Electrophoresis (DGGE): A study on pancreatic
cancer. Anticancer Res. 12, 1731-1736 (1992)
PHILLIPS DJ et al: PCR regimen for enhanced, specificity and yield
of targeted genomic DNA sequences: ras and p53. PCR Methods and Applications 2, 45-50 (1992)
2.2.7. Ansatz einer typischen Polymerase-Ketten-Reaktion Arbeiten bei 0 0C (weißer Kühl-Akku)
für 10 Proben je 50 &mgr;&idiagr; werden im ersten PCR-Gefäß angesetzt:
5 &mgr;&idiagr; Vorwärts-Primer (100 &mgr;&Mgr;; 1 &mgr;&Mgr; = 1 &rgr;&Mgr;/&mgr;&Igr;)
5 &mgr;&idiagr; Reverse-Primer (100 &mgr;&Mgr;) 50 &mgr;&idiagr; dNTP-Gemisch
50 &mgr;&idiagr; 10 &khgr; Incubation Buffer for Taq-Polymerase (Fa. Boehringer)
12,5 U Taq-Polymerase (z.B. 2,5 &mgr;&idiagr; Taq, (5 U/&mgr;&Igr;) Fa. Boehringer)
mit sterilem Aqua bidest. auf 450 &mgr;&idiagr; auffüllen
Mischen, kurz zentrifugieren, Aufteilen in 45 &mgr;&Igr;-Portionen in
10 Gefäßen.
Zugabe von 5 &mgr;&Igr;-Proben-Lösung (ca. 100 &mgr;g/ml DNA bzw. Aqua bidest
als Kontrolle).
Mischen, kurz zentrifugieren, Gefäßkappen auf Verschluß kontrollieren und sofort mit der Thermozykler-Reaktion starten.
2.2.8. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Temperaturen Zyklen Kontrollen PCR-
Programm
p53 Exon 5 94-55-72 0C
Exon 6 94-60-72 0C
Exon 7 94-60-72 0C
Exon 8 94-55-72 0C
2.2.9. Kontroll-DNA für p53-Exons
CEM: leukemia cell line with heterozygous point mutations in codons
175 and 248 (exons 5 and 7; Lit. 1).
Jurkat: leukemia cell line with hetereozygous point mutations in codons 196, 256, 259, and 260 (exons 6 and 7; Lit. 1)
BXPC-3: pancreatic tumor cell line with homozygous point mutation
in codon 220 (exon 6; Lit. 2) .
2.2.10. Literatur zur Kontroll-DNA
1. Cheng,J. and Haas,M.: Mol. Cell. Biol. 10, 5502-5509 (1990)
2. Kalthoff,H. et al: Oncogene 8, 289-298 (1993)
| 35 | CEM | 21 |
| 35 | BXPC-3 | 25 |
| 35 | Jurkat | 25 |
| 40 | A431/Capan | 21 |
2.2.11. PCR-Bedingungen für Androgenrezeptor-Exons
2.2.12. Human Androgen-Rezeptor-Primer, Exon E El 5' (GC) CAACCCGTCAGTACCCAGACTGACC
E2 5'AGCCTTCACTGTCACCCCATCACCATC = reverse
nach LUBAHN DB et al: PNAS 8J5, 1989, 9534-8
GC-clamp = (GC) = 51CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCg
2.3. Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE)
Technische Bedingungen
Verwendung nur von Chemikalien höchstmöglicher Reinheit !
2.3.1. Gel gießen (8% Acrylamid)
Verwendung eines 50 ml Meßzylinders mit Gießtülle, innen ein kleiner Magnetrührer, dessen Volumen bekannt sein muß und in die
Volumen-Bestimmung einbezogen wird. Zugabe von:
10,6 ml Acrylamid-Stammlösung
0,8 ml 50 &khgr; MOPS-Puffer
2,0 ml 40% Glycerin
Mit Aqua bidest. auf 20-25 ml bringen. Unter Rühren Zugabe von 19,2 g Harnstoff (höchste Reinheit !).
Mit Aqua bidest. auf 39,6 ml bringen. Wenn sich der Harnstoff gelöst hat und die Mischung noch eiskalt ist, Zugabe von:
300 &mgr;&idiagr; Ammoniumpersulfat-Lösung (4% in aqua dest.) 66,7 &mgr;&idiagr; TEMED (&Ngr;,&Ngr;,&Ngr;',N1-tetramethylendiamin)
Mischen und sofort vorsichtig (Blasen-frei!) in gekühlte Gieß-Küvette
füllen. Falls ein Rest übrigbleibt, wird dieser zur Beobachtung der Polymerisation aufgehoben. Die Polymersation
benötigt bei Raumtemperatur bei Tageslicht 1 Stunde. Das Gel ist danach innerhalb von 24 Stunden zu verwenden.
2.3.2. Acrylamid-Stammlösung (30/0,5) 49,18 g Acrylamid
0,82 g Bisacrylamid
127,00 ml aqua dest (Gesamtvolumen 169 ml) in einem braunen Gefäß mit wenig Volumenübermaß durch Bewegen auflösen und bei 4 0C
lagern.
oder: 122,95 ml Acrylamid-Stammlsg. (40 % w/v = Acryl-40-Solution)
41,00 ml Bisacrylamid-Stammlsg. (2 % w/v = Bis-2-Solution)
5,05 ml aqua dest (Gesamtvolumen 169 ml) in einem braunen Gefäß mit wenig Volumenübermaß bei 4 0C lagern,.
2.3.3. 50 &khgr; MOPS-Puffer
1. M MOPS
1. M MOPS
50 mM EDTA, pH 8,0 bei 4 0C lagern.
z.B.: 62,778 g Morpholinopropansulfonsäure (FG 209,26)
+ 5,584 g Chelaplex III (FG 372,24) mit NaOH einstellen und auf 300 ml Volumen bringen.
2.3.4. Denaturierungs-MOPS (2 &khgr;), muß frisch präpariert werden
400 mM MOPS (M 209,26)
8 M Harnstoff (60,06)
10 mM EDTA, pH 8,0 (EDTA III 372,24) Zum Ansatz von 5 ml einwiegen 0,419 g MOPS
10 mM EDTA, pH 8,0 (EDTA III 372,24) Zum Ansatz von 5 ml einwiegen 0,419 g MOPS
2,402 g Harnstoff 0,019 g EDTA III
2.3.5. Denaturierung / Renaturierung von DNA-Gemischen nur für Kontrollen: Exon 6: BXPC + Capl: je 2,5 &mgr;&idiagr;
Exon 8: A431 + Capl: je 2,5 &mgr;&idiagr;
Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; Denaturierungs-MOPS PCR-Programm: 5' 98 0C, 15' 50 0C, 1' 40· 0C
anschließend noch einmal 5 &mgr;&idiagr; Denaturierungs-MOPS zugeben
Verwendung von 5 &mgr;&idiagr; + 0,5 &mgr;&idiagr; in der TGGE
2.3.6. PCR-Bedingungen für p53-Exons: p53-Primer
13040 13059
Exon 5 AOGl forward 5f(GC)TTCCTCTTCCTACAGTACTC 282 b
13281 13261
MSO327 reverse 5'CTGGGCAACCAGCCCTGTCGT
13261 13280
Exon 6 AOG2 forward 5'(GC)ACGACAGGGCTGGTTGCCCA 227 b
13447 13428
MSO326 reverse 5'AGTTGCAAACCAGACCTCAG
13992 14013
Exon 7 AOG3 forward 5'(GC)TCTCCTAGGTTGGCTCTGACTg 174 b
14125 14105
AOG4 reverse 5'GCAAGTGGCTCCTGACCTGGA
14438 14459
Exon 8 AOG5 forward 5'CCTATCCTGAGTAGTGGTAATC 214 b
14612 14591
reverse 5' (GOCCGCTTCTTGTCCTGCTTGCTT
14438 14459
Exon 8-9 AOG5 forward 5' CCTATCCTGAGTAGTGGTAATC , 372 b
14769 14749
reverse 5'(GC)CCCAAGACTTAGTACCTGAAG
• ·
• · · ♦
• ·
GC-elamp = (GC) = 5'CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCg
nach METZGER AK et al. PNAS 88 (1991) 7825-7829; der Exon-8-reverse-Primer wurde von mir ausgesucht. Kartenpositionen nach
EMBL-Datei für HSP53G; Update 10.01.1992, eigene Datei p53-Gen
2.2.7. Verwendung einer TGGE-Apparatur mit zwei Heiz- und Kühl-Thermostaten
gemäß den Vorschriften der Fa. Diagen
2.2.8. Rahmenbedingungen für Temperatur-Gradienten für p53
Exon Temperatur Probeneinlauf Laufzeit
bei 20° C
| 5 | 45/75°C | 90 | Min. | 4 | h | 50· | Min. |
| 6 | 35/68°C . | 100 | Min. | 2 | h, | 30 | Min. |
| 7 | 40/750C | 30 | Min. | 2 | h, | ||
| 8 | 40/780C | 180 | Min. | 3 | h | ||
| 2.2.9. | S über-Färbung | ||||||
| Puffer | A: 10 % | Ethanol | |||||
0,5 % Essigsäure in Aqua dest. Puffer B: 0,1 % AgNO3
Die Lösung muß farblos sein, 3000 ml eignen sich zur
Färbung von 15-20 TGGE-Gelen. Puffer C: 1,5 % NaOH
0,01 % NaBH4
0,15 % Formaldehyd (Stammlösung: 37 % in Aqua dest.) Die Lösung muß unmittelbar vor Gebrauch hergestellt
werden! Für 1 TGGE-GeI mischt man 4.5 g NaOH, fest
30 mg NaBH4
1,2 ml Formaldehyd-Lösung (37 %) in ein Gesamtvolumen
von 300 ml mit Aqua dest.
Puffer D: 0,75 % Na2CO3 in Aqua dest.
Puffer D: 0,75 % Na2CO3 in Aqua dest.
Das TGGE-GeI kommt mit der Schicht nach oben in eine knapp
passende, glatte Schale auf einer langsamen Schüttelmaschine.
a) 2 mal 3 Minuten mit je 300 ml Puffer A schütteln und den Puffer verwerfen.
b) 10 Minuten in 300 ml Puffer B schütteln. In dieser Zeit wird Puffer C hergestellt.
c) Das Gel. wird aus der Schale herausgenommen und gut auf beiden Seiten mit fließendem Aqua dest.
abgespült. Die Schale wird ebenfalls ausgespült. 20 Minuten schütteln mit 300 ml Puffer C.
d) 5-10 Minuten schütteln in 300 ml Puffer D. Anschließend wird das Gel in einer glasklaren
Formularhülle eingeschweißt und ausgewertet.
3. Nachweis von Mutationen im Tumorsuppressor-Gen p53 Punkt-Mutationen in den tumorbiologisch wesentlichen Exons des
Tumorsuppressor-Gens p53 (M = Mutation, w = Normal-Typ):
Prostata-Karzinome
Patient Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8
| 14 + | W | W | M | W | 2/6 |
| 19 | W | W | W | W | 33,3. |
| 30 | W | W | W | W | |
| 31 + | M | ||||
| 112 + | W | W | M | M | |
| 113 + | W | W | W | M | |
| 126 | W | W | W | W | |
| 147 + | M | ||||
| 148 | W | W | |||
| 149 | M | ||||
| 151 | W | ||||
| 160 | W | ||||
| 164 + | M | ||||
| 165 + | M | ||||
| 176 | W | ||||
| 178 | W | ||||
| 8/16 | 1/8 | 3/9 | 3/12 | ||
| %50 | 12,5 | 33,3 | 25 |
Claims (6)
1. Vorrichtung zur Identifizierung von Punktmutationen, bestehend aus einer Desoxyribonucleinsäure(DNS)-lsolierungs-Apparatur,
einem Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Gerät, einer Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese(TGGE)-Apparatur und einem
Basensequenz-Analysator.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Kombination von DNS-Isolierungs-Apparatur,
PCR-Gerät, TGGE-Apparatur und Basensequenz-Analysator.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Geräte in der
angegebenen Reihenfolge zur Benutzung angeordnet sind.
4. Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen, dadurch gekennzeichnet, daß es
aus Ingredienzien zur DNA-Isolierung, zur Durchführung einer PCR und einer TGGE und
zur Direktsequenzierung von PCR-Produkten besteht.
zur Direktsequenzierung von PCR-Produkten besteht.
5. Testbesteck nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Kombination
von Ingredienzien zur DNA-Isolierung, zur Durchführung einer PCR und einer TGGE und
zur Direktsequenzierung von von PCR-Produkten besteht.
6. Testbesteck nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Teilen
a) L(Lysis)-Puffer, Pronase-Lösung, äquilibriertes Phenol und Ethanol/Acetatlösung für die
DNA-Isolierung,
b) PCR-Cocktail mit den für den zu untersuchenden Genabschnitt benötigten Primern,
wobei einer der beiden Primer eine GC-Klammer enthält,
wobei einer der beiden Primer eine GC-Klammer enthält,
c) Gel, Puffer, De- und Renaturierung-MOPS für DNA-Gemische und Puffer / Silbemitrat
zur Silberfärbung zur Durchführung der TGGE,
zur Silberfärbung zur Durchführung der TGGE,
d) Fluoreszenz-markierte Untersuchungsproben zur Basensequenzanalyse
besteht.
besteht.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9411010U DE9411010U1 (de) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9411010U DE9411010U1 (de) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE9411010U1 true DE9411010U1 (de) | 1994-09-08 |
Family
ID=6910845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE9411010U Expired - Lifetime DE9411010U1 (de) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | Vorrichtung und Testbesteck zur Identifizierung von Punktmutationen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE9411010U1 (de) |
-
1994
- 1994-06-20 DE DE9411010U patent/DE9411010U1/de not_active Expired - Lifetime
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