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Die
Erfindung betrifft Sulfonhydroxamsäure-diarylamine und deren Derivate.
Die offenbarten Diarylamine besitzen pharmakologische Wirksamkeit.
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TECHNISCHES GEBIET DER
ERFINDUNG
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MEK-Enzyme
stellen Kinasen mit zweifacher Spezifizität dar und sind beispielsweise
an Immunmodulation, Entzündungen
und proliferativen Krankheiten wie Krebs und Restenose beteiligt.
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Proliferative
Krankheiten werden durch einen Defekt im intrazellulären Signalsystem
oder im Signalübertragungsmechanismus
bestimmter Proteine verursacht. Diese Defekte beinhalten eine Veränderung
entweder der intrinsischen Aktivität eines oder mehrerer Signalproteine
der Signalkaskade oder eine Veränderung der
Konzentration eines oder mehrerer dieser Proteine in der Zelle.
Die Zelle kann einen Wachstumsfaktor produzieren, der an seine eigenen
Rezeptoren bindet, was zu einem autokrinen Loop führt, der
fortgesetzt die Proliferation anregt. Mutationen oder Überexpression
intrazellulärer
Signalproteine können
zu falschen mitogenen Signalen in der Zelle führen. Einige der am meisten
verbreiteten Mutationen ereignen sich in Genen, die das als Ras
bezeichnete Protein kodieren, ein G-Protein, das aktiviert ist,
wenn es an GTP gebunden ist, und inaktiviert ist, wenn es an GDP
gebunden ist. Die oben genannten Wachstumsfaktor-Rezeptoren und
viele andere mitogene Rezeptoren führen, wenn sie aktiviert sind,
dazu, dass Ras vom GDP-gebundenen
Zustand in den GTP-gebundenen Zustand überführt wird. Dieses Signal stellt
in den meisten Zelltypen eine unumgängliche Vorbedingung für Proliferation
dar. Defekte in diesem Signalsystem, insbesondere der Deaktivierung
des Ras-GTP-Komplexes,
kommen häufig
bei Krebserkrankungen vor und führen
zu chronischer Aktivierung der Signalkaskade unterhalb von Ras.
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Das
aktivierte Ras ruft seinerseits die Aktivierung einer Kaskade von
Serin/Threonin-Kinasen
hervor. Eine der Kinasegruppen, von denen bekannt ist, dass sie
zur eigenen Aktivierung aktives Ras-GTP benötigen, ist die Raf-Familie.
Diese wiederum ak tiviert MEK (z. B. MEK1 und
MEK2), das dann die MAP-Kinase und ERK (ERK1 und ERK2) aktiviert.
Die Aktivierung der MAP-Kinase durch Mitogene scheint für die Proliferation
wesentlich zu sein; konstitutive Aktivierung dieser Kinase reicht
aus, um Zelltransformation zu induzieren. Eine Blockade der stromabwärts gerichteten
Ras-Signalisierung,
beispielsweise durch Verwendung eines dominant negativen Raf-1-Proteins, kann die
Mitogenese vollständig
hemmen, wobei dies durch die Zelloberflächen-Rezeptoren oder durch
onkogene Ras-Mutanten induziert sein kann. Obwohl Ras selbst keine
Proteinkinase darstellt, ist es doch an der Aktivierung von Raf
und anderen Kinasen beteiligt, höchstwahrscheinlich
durch einen Phosphorylierungsmechanismus. Sobald sie aktiviert sind,
phosphorylieren Raf und andere Kinasen MEK an zwei nahe benachbarten
Serinresten, S218 und S222 im
Falle von MEK-1, die für
die Aktivierung der MEK als Kinase unabdingbar sind. MEK ihrerseits
phosphoryliert die MAP-Kinase sowohl an dem Tyrosinrest, Y185, als auch an dem Threoninrest, T183, die durch eine einzige Aminosäure voneinander
getrennt sind. Diese doppelte Phosporylierung aktiviert die MAP-Kinase
mindestens hundertfach. Die aktivierte MAP-Kinase kann dann die Phosphorylierung
einer großen
Zahl von Proteinen, u.a. mehrerer Transkriptionsfaktoren und anderer
Kinasen, katalysieren. Viele dieser MAP-Kinase-Phosphorylierungen
wirken für
das Zielprotein, beispielsweise eine Kinase, einen Transkriptionsfaktor
oder ein anderes Zellprotein, Mitogenese-aktivierend. Neben Raf-1
und MEKK aktivieren auch andere Kinasen MEK, und MEK selbst scheint
eine signalintegrierende Kinase darzustellen. Derzeit geht man davon
aus, dass MEK hochspezifisch für
die Phosphorylierung von MAP-Kinase ist. In der Tat ist bisher außer der
MAP-Kinase ERK kein anderes Substrat für MEK nachgewiesen worden,
und MEK phosphoryliert keine Peptide auf Basis der Phosphorylierungssequenz
der MAP-Kinase und phosphoryliert nicht einmal denaturierte MAP-Kinase.
MEK scheint auch vor der Phosphorylierung der MAP-Kinase stark mit
dieser zu assoziieren, was darauf schließen lässt, dass zur Phosphorylierung
der MAP-Kinase durch MEK eine vorhergehende starke Interaktion dieser
beiden Proteine erforderlich ist. Sowohl dieses Erfordernis als auch
die ungewöhnliche
Spezifizität
der MEK lassen hoffen, dass sich ihr Wirkungsmechanismus von dem
anderer Proteinkinasen hinreichend unterscheidet, so dass eventuell
selektive Inhibitoren von MEK, die möglicherweise über allosterische
Mechanismen statt über
die übliche
Blockade der ATP-Bindungsstelle wirken, gefunden werden können.
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Die
WO 98/37881 betrifft ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention
von septischem Schock unter Verwendung von Diarylaminen, die einen
Tetrazolyl- oder Carboxyl-Rest aufweisen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft eine Verbindung der nachstehenden Formel (I)
R
1 steht
für H,
C
1-8-Alkyl, C
3-8-Alkenyl,
C
3-8-Alkinyl, C
3-8-Cycloalkyl,
Phenyl, (Phenyl)C
1-4-alkyl, (Phenyl)C
3-4-alkenyl, (Phenyl)C
3-8-alkinyl,
(C
1-4-Cycloalkyl)-C
1-4-alkyl,
(C
3- 8-cycloalkyl)C
3-4-alkenyl,
(C
3-8-Cycloalkyl)C
3-4-alkinyl,
einen C
3-8-Heterocyclus, (C
3-8-Heterocyclus)C
1-4-alkyl, (C
3-8-Heterocyclus)-C
3-4-alkenyl, (C
3-8-Heterocyclus)C
3-8-alkinyl,
(CH
2)
2-4OR
C oder (CH
2)
2-4NR
CR
D.
R
2 steht für H, C
1-4-Alkyl,
Phenyl, C
3-6-Cycloalkyl, einen C
3-6-Heterocyclus
oder (C
3-6-Cycloalkyl)methyl. R
3 und
R
4 sind jeweils unabhängig ausgewählt aus H, F, NO
2, Br
und Cl. R
5 ist ausgewählt aus H und F. R
6 steht
für H,
F, Cl oder CH
3. R
C und
R
D sind jeweils unabhängig ausgewählt aus H, C
1-4-Alkyl,
C
3-4-Alkenyl, C
3-4-Alkinyl,
C
3-6-Cycloalkyl und Phenyl; oder NR
CR
D kann für einen Piperidino-,
Morpholino- oder N-(C
1-6-Alkyl)piperazinoring
stehen. Die genannten Kohlenwasserstoffreste sind jeweils optional
ein- bis dreifach unabhängig
substituiert durch Substituenten aus der Gruppe Halogen, Hydroxy,
Amino, (Amino)sulfonyl und NO
2. Die genannten
heterocyclischen Reste sind jeweils optional ein- bis dreifach unabhängig substituiert
durch Substituenten aus der Gruppe Halogen, C
1-4-Alkyl,
C
3-6-Cycloalkyl, C
3-4-Alkenyl,
C
3-4-Alkinyl, Phenyl, Hydroxy, Amino, (Amino)sulfonyl
und NO
2, wobei die Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl
oder Phenyl darstellenden Substituenten ihrerseits jeweils optional
unabhängig
ein- bis dreifach substituiert sind durch Substituenten aus der
Gruppe Halogen, C
1-2-Alkyl, Hydroxy, Amino
und NO
2. Die Erfindung umfasst auch die
pharmazeutisch akzeptablen Salze oder C
1-8-Ester
der erfindungsgemäßen Verbindung.
Beispielsweise können
die erfindungsgemäßen Alkoholverbindungen
Ester bilden, in deren Struktur das Wasserstoffatom einer Hydroxygruppe
durch eine -C(=O)C
1-7-Acylgruppe ersetzt ist.
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Die
Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Komposition, enthaltend
(a) eine Verbindung der Formel (I) und (b) einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger.
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Weiter
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von proliferativen
Krankheiten, wie Krebs, Restenose, Psoriasis, Autoimmunkrankheiten
und Atherosklerose. Weitere Ausführungsformen
der Erfindung beziehen sich auf Verfahren zur Behandlung von mit
MEK in Zusammenhang stehendem (einschließlich mit ras in Zusammenhang
stehendem) Krebs, und zwar festem oder hämatopoetischem Krebs. Beispiele
für Krebsarten
sind kolorektaler Krebs, Gebärmutterkrebs,
Brustkrebs, Eierstockkrebs, Hirnkrebs, akute Leukämie, Magenkrebs,
nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Pankreaskrebs und Nierenkrebs.
Weitere Ausführungsformen
der Erfindung betreffen Verfahren zur Behandlung oder Reduzierung
der Symptome der Abstoßung
körperfremder
Gewebe (Haut-, Zell-, Gliedmaßen-,
Organ- oder Knochenmarktransplantaten), von Osteoarthritis, rheumatoider
Arthritis, Mukoviszidose, Komplikationen des Diabetes (einschließlich diabetischer Retinopathie
und diabetischer Nephropathie), Hepatomegalie, Kardiomegalie, Schlaganfall
(wie beispielsweise akutem fokalen ischämischen Schlaganfall oder globaler
Hirnischämie),
Herzversagen, septischem Schock, Asthma und Alzheimer. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
sind auch als antivirale Wirkstoffe zur Behandlung von Virusinfektionen
wie HIV, Hepatitis (B)-Virus (HBV), humanem Papilloma-Virus (HPV),
Cytomegalie-Virus (CMV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) geeignet. Diese
Verfahren umfassen den Schritt der Verabreichung einer pharmazeutisch
wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder deren pharmazeutischer
Komposition an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf
oder an einer solchen Krankheit oder einem solchen Zustand leidet.
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Die
Erfindung betrifft ferner Verfahren der Kombinationstherapie, beispielsweise
ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, wobei das Verfahren weiterhin
die Anwendung von Strahlentherapie oder Chemotherapie, beispielsweise
mit Mitoseinhibitoren wie einem Taxan oder Vinca-Alkaloid umfasst.
Beispiele für
Mitoseinhibitoren sind Paclitaxel, Docetaxel, Vincristin, Vinblastin,
Vinorelbin und Vinflunin. Weitere therapeutische Kombinationen umfassen
einen erfindungsgemäßen MEK-Inhibitor
und einen Anti-Krebs-Wirkstoff wie Cisplatin, 5-Fluoruracil oder
5-Fluor-2-4(1H,3H)pyrimidindion (5FU), Flutamid und Gemcitabin.
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Die
Chemotherapie oder Strahlentherapie kann in Abhängigkeit von den Bedürfnissen
des Patienten vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung
einer erfindungsgemäßen Verbindung
erfolgen.
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Die
Erfindung umfasst auch hier offenbarte Zwischenprodukte der Synthese
und Herstellungsverfahren.
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Weitere
Merkmale der Erfindung sind der Beschreibung, den Beispielen und
den Ansprüchen
zu entnehmen.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Die
Erfindung betrifft Diarylaminverbindungen, deren pharmazeutische
Kompositionen und Verfahren zur Verwendung dieser Verbindungen und
Kompositionen.
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Nach
einer Ausführungsform
der Erfindung stellen die Verbindungen MEK-Inhibitoren dar. Die
MEK-Inhibitions-Assays umfassen den in vitro-Kaskade-Assay für Inhibitoren
des MAP-Kinase-Pathway, beschrieben im US-Patent Nr. 5,525,625,
Spalte 6, Zeile 36 bis Spalte 7, Zeile 7, und den in vitro-MEK-Assay,
beschrieben in Spalte 7, Zeilen 4–27 desselben Patents, auf
das hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird (siehe auch im Folgenden
Beispiele 1–3).
Ein Ganzzellenassay ist im Folgenden in Beispiel 4 beschrieben.
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A. Begriffe
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Bestimmte
Begriffe sind im Folgenden und durch ihren Gebrauch im vorliegenden
Dokument definiert.
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Alkylgruppen
umfassen aliphatische Gruppen (d.h. Kohlenwasserstoffreste, die
Wasserstoffatome und Kohlenstoffatome enthalten) mit einer freien
Valenz. Alkylgruppen können
geradkettige oder verzweigte Strukturen aufweisen. Beispiele sind
u.a. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Isobutyl,
t-Butyl, Pentyl, Isopentyl, 2,3-Dimethylpropyl, Hexyl, 2,3-Dimethylhexyl,
1,1-Dimethylpentyl, Heptyl und Octyl. Cycloalkylgruppen umfassen
Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und
Cyclooctyl.
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Alkylgruppen
können
1, 2, 3 oder mehr Substituenten aufweisen, die unabhängig ausgewählt sind
aus Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), Hydroxy, Amino, Alkoxy,
Alkylamino, Dialkylamino, Cycloalkyl, Aryl, Aryloxy, Aryalkyloxy,
einem Heterocyclus und (Heterocyclus)oxy. Konkrete Beispiele sind
Fluormethyl, Hydroxyethyl, 2,3-Dihydroxyethyl,
(2- oder 3-Furanyl)methyl, Cyclopropylmethyl, Benzyloxyethyl, (3-Pyridinyl)methyl,
(2- oder 3-Furanyl)methyl, (2-Thienyl)ethyl, Hydroxypropyl, Aminocyclohexyl,
2-Dimethylaminobutyl, Methoxymethyl, N-Pyridinylethyl, Diethylaminoethyl
und Cyclobutylmethyl.
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Alkenylgruppen
sind analog zu Alkylgruppen, jedoch weisen sie wenigstens eine Doppelbindung
auf (zwei benachbarte sp2-Kohlenstoffatome).
In Abhängigkeit
von der Lage der Doppelbindung und eventuell vorhandener Substituenten
kann die Geometrie der Doppelbindung entgegen (E) oder zusammen
(Z), cis oder trans sein. In ähnlicher
Weise besitzen Alkinylgruppen wenigstens eine Dreifachbindung (zwei
benachbarte sp-Kohlenstoffatome). Ungesättigte Alkenyl- oder Alkinylgruppen
können
eine oder mehrere Doppel- bzw. Dreifachbindungen oder deren Mischung
enthalten; wie Alkylgruppen können
ungesättigte
Gruppen geradkettig oder verzweigt sein, und sie können substituiert
sein sowohl wie oben für
die Alkylgruppen beschrieben als auch wie im gesamten vorliegenden
Dokument durch Beispiele angegeben. Beispiele für Alkenyle, Alkinyle und deren
substituierte Formen sind u.a. cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butinyl,
3-Phenyl-2-propinyl, 3-(2'-Fluorphenyl)-2-propinyl, 3-Methyl-(5-phenyl)-4-pentinyl,
2-Hydroxy-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Propenyl, 4-Hydroxy-3-butinyl, 3-(3-Fluorphenyl)-2-propinyl
und 2-Methyl-2-propenyl. In der Formel (I) können die Alkenyl- und Alkinylgruppen
beispielsweise 2 bis 4 bzw 2 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, bevorzugt jedoch
3 bis 4 bzw 3 bis 8.
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Allgemeinere
Formen substituierter Kohlenwasserstoffreste sind u.a. Hydroxyalkyl,
Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Hydroxycycloalkyl, Hydroxyaryl und
die entsprechenden Formen mit als Präfix angeführten Substituenten Amino-,
Halogen- (z. B. Fluor-, Chlor- oder Brom-), Nitro-, Alkyl-, Phenyl-,
Cycloalkyl- usw. oder Kombinationen von Substituenten. Entsprechend
Formel (I) umfassen somit substituierte Alkyle Hydroxyalkyl, Aminoalkyl,
Nitroalkyl, Halogenalkyl, Alkylalkyl (verzweigte Alkyle wie z. B.
Methylpentyl), (Cycloalkyl)alkyl, Phenylalkyl, Alkoxy, Alkylaminoalkyl,
Dialkylaminoalkyl, Arylalkyl, Aryloxyalkyl, Arylalkyloxyalkyl, (Heterocyclus)alkyl
und (Heterocyclus)oxyalkyl. R1 umfasst also
Hydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Hydroxycycloalkyl,
Hydroxyphenyl, Hydroxy(phenyl)alkyl, (Phenyl)hydroxyalkyl, (C3-8-Hydroxycycloalkyl)-C1-4-alkyl, (C3-8-Cycloalkyl)-C2-4-hydroxyalkenyl,
C3-8-Hydroxy-heterocyclus,
(C3-8-Heterocyclus)-C1-4-hydroxyalkyl,
Aminoalkyl, Aminoalkenyl, Aminoalkinyl, Aminocycloalkyl, Aminoaryl,
Alkylalkenyl, (Alkylaryl)alkyl, (Halogenaryl)alkyl, (Hydroxyaryl)alkinyl
und so weiter. In ähnlicher
Weise umfasst RC Hydroxyalkyl und Aminoaryl,
und RD umfasst Hydroxyalkyl, Aminoalkyl
und Hydroxyalkyl(Heterocyclus)alkyl und so weiter.
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Heterocyclische
Reste, die unter anderen Heteroaryle umfassen, sind zum Beispiel
Furyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiophenyl, Thiazolyl, Pyrrolyl, Imidazolyl,
1,3,4-Triazolyl, Tetrazolyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl,
Indolyl und deren nichtaromatische Vertreter. Weitere Beispiele
heterocyclischer Reste sind Piperidyl, Chinolyl, Isothiazolyl, Piperidinyl,
Morpholinyl, Piperazinyl, Tetrahydrofuryl, Tetrahydropyrrolyl, Pyrrolidinyl,
Octahydroindolyl, Octahydrobenzothiofuranyl und Octahydrobenzofuranyl.
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Selektive
MEK1- oder MEK2-Inhibitoren sind Verbindungen, die MEK1- bzw. MEK2-Enzyme hemmen, ohne
in nennenswerter Weise andere Enzyme wie MKK3, PKC, Cdk2A, Phosphorylasekinase,
EGF, PDGF-Rezeptor-Kinasen sowie C-src zu hemmen. Im Allgemeinen
weist ein selektiver MEK1- oder MEK2-Inhibitor einen IC50-Wert für MEK1 oder
MEK2 auf, der höchstens
ein Fünfzigstel
(1/50) seines IC50-Wertes für eines der oben genannten
anderen Enzyme beträgt.
Bevorzugt weist ein selektiver Inhibitor einen IC50-Wert von
höchstens
1/100, besonders bevorzugt 1/500, ganz besonders bevorzugt 1/1000,
1/5000 oder weniger seines IC50-Wertes für ein oder
mehrere der oben genannten Enzyme auf.
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B. Verbindungen
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der
Formel (I) im Abschnitt „Zusammenfassung".
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Ausführungsformen
der Erfindung umfassen Verbindungen, worin: (a) R3 für Brom oder
Chlor steht; (b) R4 für Fluor steht; (c) R5 für
H steht; (d) R4 und R5 jeweils
für H stehen;
(e) R4 und R5 jeweils
für Fluor
stehen; (f) R3 für Brom steht; (g) R3 für
Fluor steht; (h) R4 für eine Nitrogruppe steht; (i)
R5 für
H steht; (j) R6 für Chlor steht; (k) R6 für
Methyl steht; (l) R1 für H oder C1-4-Alkyl
und R2 für
H steht; (m) R1 für (C3-6-Cycloalkyl)methyl steht;
(n) worin R1 für H steht; (o) R1 für (CH2)2-4ORC oder
(CH2)2-4N-RCRD steht; (p) R6 für Chlor
oder Methyl steht; (q) R6 für H steht;
oder deren Kombinationen.
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Wenn
R1, RC oder RD für
Alkenyl oder Alkinyl steht, so ist die Doppel- bzw. Dreifachbindung
bevorzugt nicht benachbart zur Bindungsstelle, falls die Bindungsstelle
ein Heteroatom darstellt. Beispielsweise ist R1 bevorzugt
Prop-2-inyl oder But-2- oder -3-enyl
und weniger bevorzugt Prop-1-inyl oder But-1-enyl.
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Beispiele
für Verbindungen
der Formel (I) sind: 4-Fluor-N-hydroxy-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-benzolsulfonamid;
N-Cyclopropylmethoxy-4-fuor-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-benzolsulfonamid; 3,4-Difluor-N-hydroxy-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-benzolsulfonamid;
N-Cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-benzolsulfonamid;
3,4,5-Trifluor-N-hydroxy-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-benzolsulfonamid;
N-Cyclopropylmethoxy-3,4,5-trifluor-2-(4-jod-2-methyl-phenylamino)-benzolsulfonamid;
5-Brom-3,4-difluor-N-hydroxy-2-(4-jod-2-methyl-phenylamino)-benzolsulfonamid;
5-Brom-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-2-(4-jod-2-methyl-phenylamino)-benzolsulfonamid;
N-Hydroxy-2-(4-jod-2-methylphenylamino)-4-nitro-benzolsulfonamid
oder N-Cyclopropylmethoxy-2-(4-jod-2-methyl-phenylamino)-4-nitro-benzolsulfonamid.
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Weitere
Beispiele von Verbindungen sind: 2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-4-fluor-N-hydroxy-benzolsulfonamid;
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-4-fluor-benzolsulfonamid; 2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-3,4-difluor-N-hydroxy-benzolsulfonamid;
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzolsulfonamid;
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-3,4,5-trifluor-N-hydroxy-benzolsulfonamid;
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4,5-trifluor-benzolsulfonamid; 5-Brom-2-(2-chlor-4-jod-phenylamino)-3,4-difluor-N-hydroxy-benzolsulfonamid;
5-Brom-2-(2-chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzolsulfonamid;
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-hydroxy-4-nitro-benzolsulfonamid oder 2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-4-nitro-benzolsulfonamid.
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C. Synthese
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
gemäß dem nachstehenden
Schema hergestellt werden.
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Ein Äquivalent
eines entsprechend substituierten Sulfonylchlorids wird einer Lösung von
einem Äquivalent
eines entsprechend substituierten Hydroxyamins und einem Überschuss
Triethylamin in CH2Cl2 oder Et2O zugegeben und 30 min. gerührt. Das
ausgefallene Triethylamin-Hydrochlorid wird abfiltriert und verworfen.
Falls erforderlich, wird das Produkt durch Chromatographie an einer
Silikagelsäule
weiter gereinigt. Das reine 2-Fluor-hydroxam oder -hydroxamat wird
darauf einer Lösung
von entsprechend substituiertem Lithiumanilid zugegeben, das durch
Zugabe von LDA zu Anilin in THF bei –78°C erhalten wurde. Nach Rühren bei Raumtemperatur
im Verlauf von 16 h wird das Reaktionsgemisch in Et2O-HCl
gegossen. Ausgefallener Feststoff wird abfiltriert und verworfen.
Das Filtrat wird eingeengt, und das erhaltene Rohprodukt wird an
einer Silikagelsäule
unter Erhalt der gewünschten
Zielverbindung gereinigt.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch durch andere Herstellungsverfahren der organischen Chemie sowie
durch automatisierte oder kombinatorische Verfahren erhalten werden.
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D. Verwendung
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Die
erfindungsgemäßen Kompositionen
sind zur prophylaktischen wie auch zur therapeutischen Behandlung
von Krankheiten und Zuständen,
wie im Abschnitt „Zusammenfassung" angeführt, geeignet,
sowie von Krankheiten oder Zuständen,
die durch die MEK-Kaskade moduliert sind. Beispiele sind Schlaganfall, Herzversagen,
Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Abstoßung von Organtransplantaten
sowie verschiedene Tumore wie Tumore von Eierstock, Lunge, Pankreas,
Gehirn, Prostata und Kolon/Rektum.
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1. Dosierung
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Der
Fachmann ist in der Lage, nach bekannten Verfahren die geeignete
Dosierung für
einen Patienten festzulegen, wobei er Faktoren wie Alter, Gewicht,
allgemeinen Gesundheitszustand, Art der Behandlung erfordernden
Schmerzen und ggf. andere angewandte Arzneimittel berücksichtigt.
Im Allgemeinen wird die wirksame Menge zwischen 0,1 und 1000 mg/kg/d
liegen, bevorzugt zwischen 10 und 5000 mg für einen Erwachsenen mit normalem
Körpergewicht.
Im Handel erhältliche
Kapseln oder andere Formulierungen (wie Flüssigkeiten und Filmtabletten)
zu 100 mg, 200 mg, 300 mg oder 400 mg können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
verabreicht werden.
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2. Formulierungen
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Darreichungsformen
umfassen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, wässrige und nicht-wässrige orale
Lösungen
und Suspensionen sowie parenterale Lösungen, die in Behälter abgepackt sind,
die für
die Unterteilung in Einzeldosen vorgesehen sind. Die Darreichungsformen
können
auch für
verschiedene Verabreichungswege hergestellt sein, so z. B. Formulierungen
mit Langzeit-Freisetzung des Wirkstoffs wie subcutane Implantate.
Die Verabreichungswege umfassen die orale, rectale, parenterale
(intravenöse,
intramuskuläre,
subcutane), intrazisternale, intravaginale, intraperitoneale, intravesikale,
topische (Tropfen, Puder, Salben, Gels oder Cremes) Verabreichung
sowie die Verabreichung durch Inhalation (als Mund- oder Nasenspray).
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Parenterale
Formulierungen umfassen pharmazeutisch akzeptable wässrige oder
nicht-wässrige
Lösungen,
Dispersionen, Suspensionen, Emulsionen und sterile Pulver zu deren
Herstellung. Beispiele für
Trägerstoffe
sind u.a. Wasser, Ethanol, Polyole (Propylenglycol, Polyethylenglycol),
Pflanzenöle
und injizierbare organische Ester wie z. B. Ethyloleat. Die Fließfähigkeit
kann mit Hilfe von Überzügen wie
Lecithin oder Tensiden oder durch Einhaltung einer geeigneten Teilchengröße gewährleistet
werden. Trägerstoffe
für feste
Darreichungsformen sind (a) Füllstoffe
oder Streckmittel, (b) Bindemittel, (c) Feuchthaltemittel, (d) Sprengmittel, (e)
Lösungsverzögerer, (f)
Absorptionsbeschleuniger, (g) Adsorbentien, (h) Schmiermittel, (i)
Pufferstoffe und (j) Treibmittel.
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Die
Kompositionen können
auch Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgatoren
und Dispergiermittel; antimikrobielle Mittel wie Parabene, Chlorbutanol,
Phenol und Sorbinsäure;
isotonische Stoffe wie einen Zucker oder Natriumchlorid; absorptionsverlängernde
Stoffe wie Aluminiummonostearat und Gelatine; und absorptionsfördernde
Stoffe enthalten.
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3. Verwandte Verbindungen
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Die
Erfindung betrifft die erfindungsgemäßen Verbindungen und nahe verwandte,
pharmazeutisch akzeptable Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen
wie deren Salze, Ester, Amide, Hydrate oder Solvate; maskierte oder
geschützte
Formen; sowie racemische Mischungen oder enantiomerenreine oder
optisch reine Formen.
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Die
pharmazeutisch akzeptablen Salze, Ester und Amide umfassen Carbonsäuresalze
(z. B. C1-8-Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl
oder nicht aromatische Heterocyclen), Aminosäureadditionssalze, Ester und Amide,
die ein vernünftiges
Nutzen-Risiko-Verhältnis aufweisen,
pharmakologisch wirksam und ohne unannehmbare Toxizität und ohne
Reizung oder allergische Reaktionen hervorzurufen für den Kontakt
mit Geweben von Patienten geeignet sind.
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Beispiele
für Salze
sind u.a. das Hydrobromid, Hydrochlorid, Sulfat, Bisulfat, Nitrat,
Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Palmitat, Stearat, Laurat, Borat,
Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat,
Tartrat, Naphthylat, Mesylat, Glucoheptonat, Lactiobionat und Laurylsulfonat.
Diese können
Alkalimetall- und Erdalkalimetall-Kationen wie Natrium, Kalium,
Calcium und Magnesium enthalten sowie nichttoxische Ammonium-, quarternäre Ammonium-
und Amin-Kationen wie z. B. Tetramethylammonium, Methylamin, Trimethylamin
und Ethylamin. Siehe zum Beispiel S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.,
1977, 66: 1–19,
worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Beispiele für pharmazeutisch
akzeptable erfindungsgemäße Amide
sind die von Ammoniak, primären
C1_6-Alkylaminen
und sekundären
Di(C1-6-alkyl)aminen abgeleiteten. Sekundäre Amine
sind 5- oder 6-gliedrige
heterocyclische oder heteroaromatische Ringgruppen, die wenigstens
ein Stickstoffatom und optional 1–2 zusätzliche Heteroatome aufweisen.
Bevorzugte Amide sind die von Ammoniak, primären C1-3-Alkylaminen
und Di(C1-2-alkyl)aminen abgeleiteten. Beispiele pharmazeutisch
akzeptabler erfindungsgemäßer Ester
sind u.a. C1-7-Alkyl-, C5-7-Cycloalkyl-,
Phenyl- und Phenyl(C1-6)-Alkylester. Bevorzugte
Ester sind beispielsweise Methylester.
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Die
Erfindung umfasst auch die erfindungsgemäßen Verbindungen, die eine
oder mehrere funktionale Gruppen (z. B. Hydroxy, Amino oder Carboxy)
aufweisen, maskiert durch eine Schutzgruppe. Einiger dieser maskierten
oder geschützten
Verbindungen sind pharmazeutisch akzeptabel; andere sind als Zwischenprodukte
geeignet. Die hier beschriebenen Zwischenprodukte und Herstellungsverfahren
sowie deren leicht abgeänderte
Modifikationen sind von der Erfindung mit umfasst.
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HYDROXYSCHUTZGRUPPEN
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Hydroxyschutzgruppen
umfassen Ether, Ester und Schutzgruppen für 1,2- und 1,3-Diole. Die Etherschutzgruppen
umfassen Methyl, substituierte Methylether, substituierte Ethylether,
substituierte Benzylether, Silylether und die Überführung von Silylethern in andere
funktionelle Gruppen.
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Substituierte Methylether
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Substituierte
Methylether umfassen Methoxymethyl, Methylthiomethyl, t-Butylthiomethyl,
(Phenyldimethylsilyl)methoxymethyl, Benzyloxymethyl, p-Ethoxybenzyloxymethyl,
(4-Methoxyphenoxy)methyl, Guajakolmethyl, f-Butoxymethyl, 4-Pentenyloxymethyl,
Siloxymethyl, 2-Methoxyethoxymethyl, 2,2,2-Trichlorethoxymethyl,
Bis(2-chlor-ethoxy)methyl,
2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl, Tetrahydropyranyl, 3-Bromtetrahydro-pyranyl,
Tetrahydrothiopyranyl, 1-Methoxycyclohexyl, 4-Methoxytetrahydropyranyl,
4-Methoxytetrahydrothiopyranyl, 4-Methoxytetrahydrothiopyranyl,
S,S-Dioxido, 1-[(2-Chlor-4-methyl)phenyl]-4-methoxypiperidin-4-yl, 1,4-Dioxan-2-yl,
Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiofuranyl und 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahydro-7,8,8-trimethyl-4,7-ethanbenzofuran-2-yl.
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Substituierte Ethylether
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Substituierte
Ethylether umfassen 1-Ethoxyethyl, 1-(2-Chlorethoxy)ethyl, 1-Methyl-1-methoxyethyl, 1-Methyl-1-benzyloxyethyl,
1-Methyl-1-benzyloxy-2-fluorethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, 2-Trimethylsilylethyl, 2-(Phenylselenyl)ethyl,
t-Butyl, Allyl, p-Chlorphenyl, p-Methoxyphenyl, 2,4-Dinitrophenyl
und Benzyl.
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Substituierte Benzylether
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Substituierte
Benzylether umfassen p-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, o-Nitrobenzyl, p-Nitrobenzyl,
p-Halobenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, p-Cyanobenzyl, p-Phenylbenzyl, 2-
und 4-Picolyl, 3-Methyl-2-picolyl-N-oxido, Diphenylmethyl, p,p'-Dinitrobenzhydryl, 5-Dibenzosuberyl,
Triphenylmethyl, α-Naphthyldiphenylmethyl,
p-Methoxyphenyldiphenylmethyl,
Di(p-methoxyphenyl)phenylmethyl, Tri-(p-methoxyphenyl)methyl, 4-(4'-Bromphenacyloxy)phenyldiphenylmethyl,
4,4',4''-Tris(4,5-dichlorphthalimido-phenyl)methyl, 4,4',4''-Tris(levulinoyloxy-phenyl)methyl, 4,4',4''-Tris(benzyloxy-phenyl)methyl,
3-(Imidazol-1-ylmethyl)-bis(4',4''-dimethoxyphenyl)methyl, 1,1-Bis(4-methoxyphenyl)-1'-pyrenylmethyl, 9-Anthryl,
9-(9-Phenyl)xanthenyl, 9-(9-Phenyl-10-oxo)anthryl, 1,3-Benzodithiolan-2-yl
und Benzisothiazolyl-S,S-dioxido.
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Silylether
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Silylether
umfassen Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Triisopropylsilyl, Dimethylisopropylsilyl,
Diethylisopropylsilyl, Dimethylthexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl,
t-Butlydiphenylsilyl, Tribenzylsilyl, Tri-p-xylylsilyl, Triphenylsilyl, Diphenylmethylsilyl
und t-Butylmethoxyphenylsilyl.
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ESTER
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Esterschutzgruppen
umfassen Ester, Carbonate, Schutzgruppen für eine unterstützte Spaltung,
sonstige Ester und Sulfonate.
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Ester
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Beispiele
für Ester
als Schutzgruppen sind Formiat, Benzoylformiat, Acetat, Chloracetat,
Dichloracetat, Trichloracetat, Trifluoracetat, Methoxyacetat, Triphenylmethoxyacetat,
Phenoxyacetat, p-Chlorphenoxyacetat, p-P-Phenylacetat, 3-Phenylpropionat,
4-Oxopentanoat(Levulinat), 4,4-(Ethylendithio)pentanoat, Pivaloat,
Adamantonat, Crotonat, 4-Methoxycrotonat, Benzoat, p-Phenylbenzoat
und 2,4,6-Tirmethylbenzoat(Mesitoat).
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Carbonate
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Carbonate
umfassen Methyl, 9-Fluorenylmethyl, Ethyl, 2,2,2-Trichlorethyl,
2-(Trimethylsilyl)ethyl, 2-(Phenylsulfonyl)ethyl, 2-(Triphenylphosphino)ethyl,
Isobutyl, Vinyl, Allyl, p-Nitrophenyl, Benzyl, p-Methoxybenzyl,
3,4-Dimethoxybenzyl, o-Nitrobenzyl, p-Nitrobenzyl, S-Benzylthiocarbonat, 4-Ethoxy-1-naphthyl
und Methyldithiocarbonat.
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Schutzgruppen für eine unterstützte Spaltung
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Beispiele
von Schutzgruppen für
eine unterstützte
Spaltung sind 2-Jodbenzoat, 4-Azido-butyrat,
4-Nitro-4-methylpentanoat, o-(Dibrommethyl)benzoat, 2-Formylbenzolsulfonat,
2-(Methylthiomethoxy)ethylcarbonat, 4-(Methylthiomethoxymethyl)benzoat
und 2-(Methylthiomethoxymethyl)benzoat.
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Sonstige Ester
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Zusätzlich zu
den oben angeführten
Klassen umfassen die sonstigen Ester u.a. folgende: 2,6-Dichlor-4-methylphenoxyacetat,
2,6-Dichlor-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenoxyacetat, 2,4-Bis(1,1-dimethylpropyl)phenoxyacetat,
Chlordiphenylacetat, Isobutyrat, Monosuccinoat, (E)-2-Methyl-2-Butenoat(Tigloat),
o-(Methoxycarbonyl)benzoat, p-P-Benzoat, α-Naphthoat, Nitrat, Alkyl-N,N,N',N'-tetramethyl phosphordiamidat, N-Phenylcarbamat,
Borat, Dimethylphosphinothioyl und 2,4-Dinitrophenylsulfenat.
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Sulfonate
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Sulfonate
als Schutzgruppen umfassen Sulfat, Methansulfonat(mesylat), Benzylsulfonat
und Tosylat.
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SCHUTZ FÜR 1,2- UND
1,3-DIOLE
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Der
Schutz für
1,2- und 1,3-Diolgruppen umfasst cyclische Acetale und Ketale, Cyclische
Orthoester und Silylderivate.
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Cyclische Acetale und
Ketale
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Cyclische
Acetale und Ketale umfassen Methylen, Ethyliden, 1-t-Butylethyliden,
1-Phenylethyliden, (4-Methoxyphenyl)ethyliden,
2,2,2-Trichlorethyliden, Acetonid(Isopropyliden), Cyclopentyliden,
Cyclohexyliden, Cycloheptyliden, Benzyliden, p-Methoxybenzyliden,
2,4-Dimethoxybenzyliden, 3,4-Dimethoxybenzyliden und 2-Nitrobenzyliden.
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Cyclische Orthoester
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Cyclische
Orthoester umfassen Methoxymethylen, Ethoxymethylen, Dimethoxymethylen,
1-Methoxyethyliden, 1-Ethoxyethylidin, 1,2-Dimethoxyethyliden, α-Methoxybenzyliden,
1-(N,N-Dimethylamino)ethyliden-Derivate, α-(N,N-Dimethylamino)benzyliden-Derivate
und 2-Oxacyclopentyliden.
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SCHUTZ FÜR DIE CARBOXYLGRUPPE
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ESTER
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Esterschutzgruppen
umfassen Ester, substituierte Methylester, 2-substituierte Ethylester,
substituierte Benzylester, Silylester, aktiverte Ester, sonstige
Derivate und Stannylester.
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Substituierte Methylester
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Substituierte
Methylester umfassen 9-Fluorenylmethyl, Methoxymethyl, Methylthiomethyl,
Tetrahydropyranyl, Tetrahydrofuranyl, Methoxyethoxymethyl, 2-(Trimethyl silyl)ethoxy-methyl,
Benzyloxymethyl, Phenacyl, p-Bromphenacyl, α-Methylphenacyl, p-Methoxyphenacyl,
Carboxamidomethyl und N-Phthalimidomethyl.
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2-Substituierte Ethylester
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2-Substituerte
Ethylester umfassen 2,2,2-Trichlorethyl, 2-Haloethyl, 2-Chloralkyl,
2-(Trimethylsilyl)ethyl,
2-Methylthioethyl, 1,3-Dithianyl-2-methyl, 2-(p-Nitrophenylsulfenyl)-ethyl,
2-(p-Toluolsulfonyl)ethyl, 2-(2'-Pyridyl)ethyl,
2-(Diphenylphosphino)ethyl, 1-Methyl-1-phenylethyl,
t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Allyl, 3-Buten-1-yl, 4-(Trimethylsilyl)-2-buten-1-yl,
Cinnamyl, α-Methylcinnamyl,
Phenyl, p-(Methylmercapto)-phenyl und Benzyl.
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Substituierte Benzylester
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Substituierte
Benzylester umfassen Triphenylmethyl, Diphenylmethyl, Bis(o-nitrophenyl)methyl,
9-Anthrylmethyl, 2-(9,10-Dioxo)anthrylmethyl, 5-Dibenzo-suberyl,
1-Pyrenylmethyl,
2-(Trifluormethyl)-6-chromylmethyl, 2,4,6-Trimethyl-benzyl, p-Brombenzyl,
o-Nitrobenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Methoxybenzyl, 2,6-Dimethoxybenzyl,
4-(Methylsulfinyl)benzyl,
4-Sulfobenzyl, Piperonyl und 4-P-Benzyl.
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Silylester
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Silyleser
umfassen Trimethylsilyl, Triethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, i-Propyldimethylsilyl,
Phenyldimethylsilyl und Di-t-Butylmethylsilyl.
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Sonstige Derivate
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Sonstige
Derivate umfassen Oxazole, 2-Alkyl-1,3-Oxazoline, 4-Alkyl-5-oxo-1,3-oxazolidine, 5-Alkyl-4-oxo-1,3-dioxolane,
Orthoester, Phenyl und Pentaaminocobalt(III)-Komplex.
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Stannylester
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Beispiele
für Stannylester
sind Triethylstannyl und Tri-n-butylstannyl.
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AMIDE UND HYDRAZIDE
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Amide
umfassen N,N-Dimethyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, 5,6-Dihydrophen-anthridinyl,
o-Nitroanilide, N-7-Nitroindolyl, N-8-Nitro-1,2,3,4-tetrahydrochinolyl
und p-P-Ben zolsulfonamide. Hydrazide umfassen N-Phenyl, N,N'-Diisopropyl und
andere Dialkylhydrazide.
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SCHUTZ FÜR DIE AMINOGRUPPE
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CARBAMATE
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Carbamate
umfassen Carbamate, substituiertes Ethyl, Schuztgruppen für eine unterstützte Spaltung, photolytische
Spaltung, Derivate des Harnstofftyps und sonstige Carbamate.
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Carbamate
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Carbamate
umfassen Methyl und Ethyl, 9-Fluorenylmethyl, 9-(2-Sulfo)fluorenylmethyl,
9-(2,7-Dibrom)fluorenylmethyl, 2,7-Di-t-butyl-[9-(10,10-dioxo-10,10,10,10-tetrahydro-thioxanthyl)]methyl
und 4-Methoxyphenacyl.
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Substituiertes Ethyl
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Substituiertes
Ethyl als Schutzgruppe umfasst 2,2,2-Trichlorethyl, 2-Trimethylsilylethyl,
2-Phenylethyl, 1-(1-Adamantyl)-1-methylethyl, 1,1-Dimethyl-2-haloethyl,
1,1-Dimethyl-2,2-dibromethyl,
1,1-Dimethyl-2,2,2-trichlorethyl, 1-Methyl-1-(4-biphenylyl)ethyl,
1-(3,5-Di-t-butylphenyl)-1-methylethyl, 2-(2'- und 4'-pyridyl)ethyl, 2-(N,N-cyclohexylcarboxamido)-ethyl,
t-Butyl, 1-Adamantyl, Vinyl, Allyl, 1-Isopropylallyl, Connamyl, 4-Nitrocinnamyl,
Chinolyl, N-Hydroxypiperidinyl, Alkyldithio, Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl,
p-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, 2,4-Dichlorbenzyl, 4-Methylsulfinylbenzyl,
9-Anthrylmethyl und Diphenylmethyl.
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Schutzgruppen für eine unterstützte Spaltung
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Schutzgruppen
für eine
unterstützte
Spaltung umfassen 2-Methylthioethyl, 2-Methylsulfonylethyl, 2-(p-Toluolsulfonyl)ethyl,
[2-(1,3-Dithianyl)]methyl, 4-Methylthiophenyl,
2,4-Dimethyl-thiophenyl, 2-Phosphonioethyl, 2-Triphenylphosphonioisopropyl,
1,1-Dimethyl-2-cyanoethyl, m-Chlor-p-acyloxybenzyl, p-(Dihydroxyboryl)benzyl,
5-Benzisoxazolyl-methyl und 2-(Trifluormethyl)-6-chromonylmethyl.
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Photolytische Spaltung
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Bei
Verfahren zur photolytischen Spaltung werden u.a. folgende Gruppen
eingesetzt: m-Nitrophenyl, 3,5-Dimethoxybenzyl, o-Nitrobenzyl, 3,4-Dimethoxy-6-nitrobenzyl
und Phenyl(o-nitrophenyl)methyl.
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Derivate vom Harnstofftyp
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Beispiele
von Derivaten vom Harnstofftyp sind Phenothiazinyl-(10)-carbonyl-Derivate,
N'-p-Toluolsulfonylaminocarbonyl
und N'-Phenylaminothiocarbonyl.
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Sonstige Carbamate
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Neben
den oben genannten umfassen die sonstigen Carbamate t-Amyl, S-Benzylthiocarbamat,
p-Cyanobenzyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl, Cyclopropylmethyl,
p-Decyloxy-benzyl, Diisopropylmethyl, 2,2-Dimethoxy-carbonylvinyl,
o-(N,N-Dimethyl-carboxamido)-benzyl,
1,1-Dimethyl-3-(N,N-dimethylcarboxamido)propyl, 1,1-Dimethyl-propinyl,
Di-(2-pyridyl)methyl, 2-Furanylmethyl, 2-Jodethyl, Isobornyl, Isobutyl,
Isonicotinyl, p(p'-Methoxyphenyl-azo)benzyl,
1-Methylcyclobutyl, 1-Methylcyclohexyl,
1-Methyl-1-cyclopropyl-methyl, 1-Methyl-(3,5-dimethoxyphenyl)-ethyl, 1-Methyl-1(p-phenylazophenyl)-ethyl,
1-Methyl-1-phenylethyl, 1-Methyl-1-(4-pyridyl)ethyl, Phenyl, p-(Phenylazo)benzyl,
2,4,6-Tri-t-butylphenyl, 4-(Trimethylammonium)benzyl und 2,4,6-Trimethylbenzyl.
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AMIDE
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Amide
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Amide
umfassen N-Formyl, N-Acetyl, N-Chloracetyl, N-Trichloracetyl, N-Trifluoracetyl,
N-Phenylacetyl, N-3-Phenylpropionyl, N-Picolinoyl, N-3-Pyridyl-carboxamid,
N-Benzoylphenylalanyl-Derivat,
N-Benzoyl und N-p-Phenylbenzoyl.
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Schutzgruppen für eine unterstützte Spaltung
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Schutzgruppen
für eine
unterstützte
Spaltung umfassen N-o-Nitrophenylacetyl, N-o-Nitrophenoxyacetyl, N-Acetoacetyl, (N'-Dithiobenzyloxycarbonylamino)acetyl,
N-3-(p-Hydroxyphenyl)propionyl,
N-3-(o-Nitrophenyl)propionyl, N-2-Methyl-2-(o-nitrophenoxy)propionyl,
N-2-Methyl-2-(o-phenylazophenoxy)propionyl, N-4-Chlorbutyryl, N-3-Methyl-3-nitrobutyryl,
N-o-Nitrocinnamoyl, N-Acetylmethionin-Derivat, N-o-Nitrobenzoyl, N-o-(Benzoyloxymethyl)benzoyl
und 4,5-Diphenyl-3-oxazolin-2-on.
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Cyclische Imidderivate
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Cyclische
Imidderivate umfassen N-Phthalimid, N-Dithiasuccinoyl, N-2,3-Diphenylmaleoyl,
N-2,5-Dimethylpyrrolyl, N-1,1,4,4,-Tetramethyl-disilylazacyclopentan-Addukt,
5-substituiertes 1,3-Dimethyl-1,3,5-triazacyclohexan-2-on, 5-substituiertes
1,3-Dibenzyl-1,3,5-triazacyclohexan-2-on
und 1-substituiertes 3,5-Dinitro-4-pyridonyl.
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BESTIMMTE -NH-SCHUTZGRUPPEN
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Schutzgruppen
für-NH
umfassen: N-Alkyl- und N-Arylamine, Iminderivate, Enaminderivate
und N-Heteroatomderivate (wie N-Metall, N-N, N-P, N-Si und N-S),
N-Sulfenyl und N-Sulfonyl.
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N-Alkyl- und N-Arylamine
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N-Alkyl-
und N-Arylamine umfassen N-Methyl, N-Allyl, N-[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]methyl,
N-3-Acetoxypropyl, N-(1-Isopropyl-4-nitro-2-oxo-3-pyrrolin-3-yl),
quaternäre
Ammoniumsalze, N-Benzyl, N-Di-(4-methoxyphenyl)methyl, N-5-Dibenzosuberyl,
N-Triphenylmethyl,
N-(4-Methoxyphenyl)diphenylmethyl, N-9-Phenylfluorenyl, N-2,7-Dichlor-9-fluorenylmethylen,
N-Ferrocenylmethyl und N-2-Picolylamin-N'-oxid.
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Iminderivate
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Iminderivate
umfassen N-1,1-Dimethylthiomethylen, N-Benzyliden, N-p-Methoxybenzyliden,
N-Diphenylmethylen, N-[(2-Pyridyl)mesityl]methylen, N-(N',N'-Dimethylaminomethylen),
N',N'-Isopropyliden, N-p-Nitrobenzyliden,
N-Salicyliden, N-5-Chlorsalicyliden,
N-(5-Chlor-2-hydroxyphenyl)phenyl-methylen und N-Cyclohexyliden.
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Enaminderivate
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Ein
Beispiel eines Enaminderivats ist N-(5,5-Dimethyl-3-oxo-1-cyclohexenyl).
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N-Heteroatomderivate
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N-Metallderivate
umfassen N-Boranderivate, N-Diphenylborinsäurederivate, N-[Phenyl(pentacarbonylchrom-
oder -wolfram)]carbenyl und N-Kupfer- oder N-Zink-Chelat. Beispiele
von N-N-Derivaten sind N-Nitro, N-Nitroso und N-Oxid. Beispiele
von N-P-Derivaten
sind N-Diphenylphosphinyl, N-Dimethylthiophosphinyl, N-Diphenylthiophosphinyl,
N-Dialkylphosphoryl, N-Dibenzylphosphoryl und N-Diphenyl phosphoryl.
Beispiele von N-Sulfenylderivaten sind N-Benzolsulfenyl, N-o-Nitrobenzolsulfenyl,
N-2,4-Dinitrobenzolsulfenyl, N-Pentachlorbenzolsulfenyl, N-2-Nitro-4-methoxy-benzolsulfenyl,
N-Triphenylmethylsulfenyl und N-3-Nitropyridinsulfenyl. N-Sulfonylderivate
umfassen N-p-Toluolsulfonyl, N-Benzolsulfonyl, N-2,3,6-Trimethyl-4-methoxybenzolsulfonyl,
N-2,4,6-Trimethoxybenzolsulfonyl, N-2,6-Dimethyl-4-methoxy-benzolsulfonyl,
N-Pentamethylbenzolsulfonyl, N-2,3,5,6-Tetramethyl-4-methoxybenzol-sulfonyl,
N-4-Methoxybenzolsulfonyl, N-2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl, N-2,6-Dimethoxy-4-methylbenzolsulfonyl,
N-2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl,
N-Methansulfonyl, N-β-Trimethylsilylethansulfonyl,
N-9-Anthracensulfonyl, N-4-(4',8'-Dimethoxynaphthylmethyl)-benzolsulfonyl,
N-Benzylsulfonyl, N-Trifluormethylsulfonyl und N-Phenacylsulfonyl.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen,
die maskiert oder geschützt
sind, können
Prodrugs, metabolisierte Verbindungen oder in anderer Weise in vivo
in erfindungsgemäße Verbindungen überführte Verbindungen,
beispielsweise vorübergehend
durch Metabolismus in erfindungsgemäße Verbindungen überführte Verbindungen,
darstellen. Die Überführung kann
durch Hydrolyse oder Oxidation in Folge des Kontakts mit einer Körperflüssigkeit
wie Blut oder in Folge der Einwirkung von Säuren oder von Enzymen der Leber
oder des Darms oder anderer Enzyme erfolgen.
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Merkmale
der Erfindung sind auch in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
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E. BEISPIELE
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HERSTELLUNGSBEISPIEL
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Herstellung von 2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzolsulfonamid
(PD 0297447)
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N-Cyclopropylmethoxy-2,3,4-trifluor-benzolsulfonamid.
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Einer
gerührten
Suspension aus 5,40 g (0,0437 mol) O-Cyclopropylmethyl-hydroxyamin-Hydrochlorid in
20 ml Dichlormethan wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff 10,8
ml (0,062 mol) Diisopropylethylamin zugesetzt. Dann wurde dem Reaktionsgefäß mit der
gerührten
Suspension im Verlauf von 12 min. eine Lösung von 1,00 g (4,34 × 10–3 mol)
2,3,4-Trifluorbenzolsulfonylchlorid (Oakwood Products, Inc.) in
120 ml Dichlormethan zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde weitere
12 min. gerührt
und mit 140 ml 10% wässriger
Salzsäure
gequencht. Das Zwei-Phasen-Gemisch
wurde 16 h intensiv gerührt.
Darauf wurden die Schichten getrennt, und die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und auf ein Volumen von 6 ml
eingeengt. Die eingeengte Lösung
wurde auf eine Flash-Silikagelsäule
gegeben (Biotage, 90 g Silikagel). Elution mit Dichlormethan ergab
0,8283 g eines weißen
amorphen Feststoffs; 68% Ausbeute.
1H-NMR(400
MHz, CDCl3-Signal eingestellt auf δ 7,03; angegebene
Werte sind unkorrigiert) δ 7,50(m,
1H), 7,10(s, 1H), 6,95(m, 1H), 3,59(d, 2H, J = 7,2 Hz), 0,80(m,
1H), 0,31(m, 2H), 0,02(m, 2H).
19F-NMR(376
MHz, CDCl3) δ –122,65(m, 1F), –129,37(m,
1F), –156,20(m,
1F). MS(APCl-) 280(M-1, 100), 210(55), 195(45).
-
2-(2-Chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzolsulfonamid
(PD 0297447).
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Einer
gerührten
Lösung
von 10 ml 2-Chlor-4-jodanilin in Tetrahydrofuran wurden bei –78°C unter Stickstoff
6,2 ml (6,2 × 10
–3 mol)
einer 1,0M Lösung
von Lithium-bis-trimethylsilylamid
in Tetrahydrofuran zugegeben, wobei man eine grüne Suspension erhielt. Diese
wurde 5 min. gerührt,
und anschließend
wurde mit der Kanüle
eine gerührte
Suspension von lithiertem N-Cyclopropylmethoxy-2,3,4-trifluorbenzolsulfonamid
(hergestellt durch Zugabe von 3,0 ml der 1,0M Lithium-bis-trimethylsilylamidlösung bei –78°C unter gasförmigem Stickstoff
zu einer gerührten
Lösung
aus N-Cyclopropylmethoxy-2,3,4-trifluor-benzolsulfonamid in 10 ml
Tetrahydrofuran) zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und die
Suspension wurde 1 h gerührt.
Darauf wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ml 10% wässriger
Salzsäure
gequencht, und das Zwei-Phasen-Gemisch wurde im Vakuum unter Erhalt
einer wässrigen
Suspension eingeengt, die mit 200 ml Diethylether extrahiert wurde. Die
organische Phase wurde über
MgSO
4 getrocknet und im Vakuum unter Erhalt
eines hellbraunen Öls
eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
Nach Elution mit einem Gradienten von Hexan/Ethylacetat 99:1 → (2 min.)
9:1 → (25
min.) 3:1 erhielt man 1,10 g eines weißen amorphen Schaums, 73% Ausbeute.
1H-NMR(400 MHz, DMSO) δ 7,69(m, 1H), 7,59(d, 1H, J
= 1,9 Hz), 7,34(dd, 1H, J = 8,7, 1,9 Hz), 7,27(s, 1H), 7,00(s, 1H),
6,95(m, 1H), 6,43(dd, 1H, J = 8,7, 5,8 Hz), 3,52(d, 2H, J = 7,5
Hz), 0,74(m, 1H), 0,34(m, 2H), 0,02(m, 2H).
19F-NMR(376
MHz, CDCl
3) δ –124,76(m, 1F), –136,69(d,
1F, J = 18,3 Hz). MS(APCl+)515(M + 1, 100); (APC–)513(M – 1, 50), 443(73), 428(100).
IR(KBr)1491
cm
–1 -
Der
APK-IC50-Wert für PD 0297447 beträgt 0,965 μM.
-
BIOLOGISCHE BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Kaskade-Assay für Inhibitoren
des MAP-Kinase-Pathway
-
Es
wird der Einbau von 32P in Myelin-basischem
Protein (myelin basic protein, MBP) in Gegenwart eines Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteins,
enthaltend p44MAP-Kinase,
(GST-MAPK) und eines Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteins, enthaltend
p45MEK, (GST-MEK) untersucht. Die Assaylösung enthält 20 mM HEPES, pH 7,4, 10
mM MgCl2, 1 mM MnCl2,
1 mM EGTA, 50 μM[γ-32P]ATP, 10 μg GST-MEK, 0,5 μg GST-MAPK
und 40 μg
MBP in einem Endvolumen von 100 μl.
Die Reaktion wird nach 20 min. durch Zugabe von Trichloressigsäure beendet
und durch eine GF/C-Filtermatte filtriert. Auf der Filtermatte zurückgehaltenes 32P wird mit Hilfe eines 120S Betaplate bestimmt.
Die Verbindungen werden bei einer Konzentration von 10 μM hinsichtlich
ihrer Fähigkeit,
den Einbau von 32P zu hemmen, bewertet.
-
Um
festzustellen, ob die Verbindungen GST-MEK oder GST-MAPK hemmen,
werden zwei weitere Protokolle verwendet. Im ersten Protokoll werden
die Verbindungen in GST-MEK enthaltende Reagenzgläser gegeben,
wobei anschließend
GST-MAPK, MBP und [γ-32P]ATP zugegeben werden. Im zweiten Protokoll
werden die Verbindungen in GST-MEK und GST-MAPK enthaltende Reagenzgläser gegeben,
und anschließend werden
MBP und [γ-32P]ATP zugegeben.
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Verbindungen,
die in beiden Protokollen Aktivität zeigen, werden als MAPK-Inhibitoren bewertet,
während
Verbindungen, die nur im ersten Protokoll Aktivität zeigen,
als MEK-Inhibitoren bewertet werden.
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BEISPIEL 2
-
In vitro-MAP-Kinase-Assay
-
Die
inhibitorische Aktivität
kann in direkten Assays überprüft werden,
Für die
MAP-Kinase wird
1 μg GST-MAPK
mit 40 μg
MBP im Verlauf von 15 min. bei 30°C
in einem Endvolumen von 50 μl,
enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 10 μM MgCl2,
2 μM EGTA
und 10 μM
[γ-32P]ATP, inkubiert. Die Reaktion wird beendet
durch Zugabe von Laemmli-SDS-Probenpuffer und phosphoryliertem MBP,
aufgelöst
durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel. Die in MBP
eingebaute Radioaktivität
wird durch Autoradiographie und Szintillationszählung der ausgeschnittenen
Banden bestimmt.
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BEISPIEL 3
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in vitro-MEK-Assay
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Zur
Bewertung der direkten MEK-Aktivität werden 10 μg GST-MEK
mit 5 μg
Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein, enthaltend p44MAP-Kinase
mit einer Lysin-zu-Alanin-Mutation
in Position 71 (GST-MAPK-KA), inkubiert. Diese Mutation beseitigt
die Kinaseaktivität
von MAPK, so dass nur die Kinaseaktivität verbleibt, die dem zugegebenen
MEK zugeschrieben wird. Die Inkubation erfolgt im Verlauf von 15
min. bei 30°C
in einem Endvolumen von 50 μl,
enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 10 μM MgCl2,
2 μM EGTA
und 10 μM
[γ-32P]ATP. Die Reaktion wird durch Zugabe von
Laemmli-SDS-Probenpuffer beendet. Das phosphorylierte GST-MAPK-KA
wird durch Elektrophorese an einem 10% Polyacrylamidgel aufgelöst. Die
in GST-MAPK-KA eingebaute Radioaktivität wird durch Autoradiographie
und anschließende
Szintillationszählung
der ausgeschnittenen Banden bestimmt. Zusätzlich wird künstlich
aktiviertes MEK, enthaltend Serin-zu-Glutamat-Mutationen in den
Positionen 218 und 222 (GST-MEK-2E), verwendet. Wenn diese beiden
Stellen phosphoryliert werden, wird die MEK-Aktivität erhöht. Die
Phosphorylierung dieser Stellen kann durch Mutation der Serinreste zu
Glutamat nachgeahmt werden. Für
diesen Assay werden 5 μg
GST-MEK-2E mit 5 μg
GST-MAPK-KA 15 min. bei 30°C
im selben Reaktionspuffer wie oben beschrieben inkubiert. Beendigung
der Reaktion und Analyse erfolgen wie oben beschrieben.
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BEISPIEL 4
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Ganzzellen-MAP-Kinase-Assay
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Um
festzustellen, ob Verbindungen die Aktivierung von MAP-Kinase in
Ganzzellen blockieren, wird das folgende Protokoll verwendet. Die
Zellen werden auf Multi-Well-Platten
aufgebracht und zur Konfluenz kultiviert. Dann werden die Zellen über Nacht
ohne Serum gehalten. Die Zellen werden 30 min. mit einer Verbindung
oder einem Trägerstoff
(DMSO) der gewünschten
Konzentration behandelt, wonach ein Wachstumsfaktor, z. B. PDGF
(100 ng/ml) zugegeben wird. Nach 5-minütiger Behandlung mit dem Wachstumsfaktor
werden die Zellen mit PBS gewaschen und in einem Puffer, enthaltend
70 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM Glycerinphospat und 1% Triton
X-100, lysiert. Die Lysate werden durch Zentrifugieren bei 13 000 × g im Verlauf von
10 min. geklärt.
5 μg der
erhaltenen Überstände werden
15 min. bei 30°C
in einem Endvolumen von 25 μl, enthaltend
50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 2 mM EGTA
und 30 μM
[γ-32P]ATP, mit 10 μg Mikrotubuli-assoziiertem Protein-2
(Map2) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Laemmli-SDS-Probenpuffer beendet. Das
phosphorylierte Map2 wird an einem 7,5% Acrylamidgel aufgelöst, und
die eingebaute Radioaktivität
wird durch Szintillationszählung
der ausgeschnittenen Banden bestimmt.
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BEISPIEL 5
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Einschichtkultivierung
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Die
Zellen werden zu 10 000–20
000 Zellen/ml auf Multi-Vertiefungsplatten aufgebracht. 48 h nach
der Aussaat werden die Testverbindungen dem Zellkulturmedium zugefügt, und
es wird weitere 2 d inkubiert. Darauf werden die Zellen durch Inkubation
mit Trypsin aus den Vertiefungen entfernt und mit einem Coulter-Zähler ausgezählt.
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BEISPIEL 6
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Kultivierung in Soft-Agar
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Die
Zellen werden zu 5 000–10
000 Zellen/Schale unter Verwendung von Wachstumsmedium mit 0,3%
Agar in 35 mm-Schalenausgesät.
Nach Kühlung
zur Härtung
des Agar werden die Zellen in einen auf 37°C eingestellten Brutschrank
gestellt. Nach 7–10
Tagen Kultivierung werden die sichtbaren Kolonien manuell mit Hilfe
eines Dissektionsmikroskops ausgezählt.
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BEISPIEL 7
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Collagen-induzierte Arthritis
bei Mäusen
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Typ
II-Collagen-induzierte Arthritis (CIA) bei Mäusen stellt ein Arthritis-Versuchsmodell
dar, das einige pathologische, immunologische und genetische Merkmale
mit rheumatoider Arthritis gemeinsam hat. Die Krankheit wird durch
Immunisierung von DBA/1-Mäusen
mit 100 μg
Typ II-Collagen, das ein Hauptbestandteil von Gelenkknorpel ist,
induziert, wobei das Collagen in komplettem Freundschen Adjuvans
intradermal verabreicht wird. Die Anfälligkeit für die Krankheit wird durch
den MHC-Genort Klasse II, der analog ist zur Assoziation rheumatoider
Arthritis mit HLA-DR4, reguliert.
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Bei
der Mehrzahl der immunisierten Mäuse
entwickelt sich eine progressive und entzündliche Arthritis, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass die Pfotenbreite um bis zu 100% zunimmt.
Den Mäusen
wird eine Testverbindung in verschiedenen Mengen, zum Beispiel zu
20, 60, 100 und 200 mg/kg Körpergewicht/Tag,
verabreicht. Die Versuchsdauer kann einige Wochen bis einige Monate
betragen, z. B. 40, 60 oder 80 Tage. Zur Bewertung der Krankheitsprogression
von Erythem und Ödem
(Stufe 1) zu Gelenkdistorsion (Stufe 2) und Gelenkankylose (Stufe
3) wird eine klinische Punktebewertungsskala verwendet. Die Krankheit
verläuft
insofern variabel, als sie eine oder alle Pfoten des Tieres betreffen
kann, wobei die Höchstzahl
der erreichbaren Punkte pro Maus 12 beträgt. Die Histopathologie eines
arthritischen Gelenks ergibt Synovitis, Pannusbildung sowie Knorpel-
und Knochenerosion. Alle Mäusestämme, die
anfällig
für CIA
sind, reagieren mit einer großen
Menge Antikörper
auf Typ II-Collagen, und es tritt eine ausgeprägte Zellreaktion auf Typ II-Collagen auf.
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BEISPIEL 8
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SCW-induzierte monoartikuläre Arthritis
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Arthritis
wird induziert wie bei Schwab et al., Infection and Immunity, 59:
4436–4442
(1991) beschrieben, wobei geringe Modifikationen vorgenommen werden.
Ratten werden am Tag 0 durch intraartikuläre Injektion in das rechte
Tibiotalargelenk 6 μg
ultraschallbehandeltes SCW [in 10 μl Dulbecco-PBS (DPBS)] verabreicht.
Am Tag 21 wird die DTH mit 100 μg
intravenös
verabreichtem SCW (250 μl)
gestartet. Für
die Studien mit oraler Verabreichung der Verbindungen werden diese
in Träger
(0,5 Hydroxypropyl-Methylcellulose/0,2% Tween 80) suspendiert, ultraschallbehandelt
und zweimal täglich
(in einem Volumen von 10 ml/kg) verabreicht, womit 1 h vor Reaktivierung
mit SCW begonnen wird. Die Verbindungen werden in Mengen zwischen
10 und 500 mg/kg Körpergewicht/d
verabreicht, beispielsweise zu 20, 30, 60, 100, 200 und 300 mg/kg/d.
Die Messungen des Ödems
werden durch Bestimmung des Anfangsvolumens der sensibilisierten
Hinterpfote vor Reaktivierung am Tag 21 und Vergleich mit den Volumen
zu späteren
Zeitpunkten wie den Tagen 22, 23, 24 und 25 vorgenommen. Das Pfotenvolumen
wird durch Quecksilber-Plethysmographie
gemessen.
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BEISPIEL 9
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Ohr-Herz-Transplantations-Modell
bei der Maus
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T.
A. Fey et al. beschreiben Verfahren zur Transplantation von Neugeborenen-Herzgewebe aus zweigeteilten
Herzen in die Ohrmuschel von Ratten und Mäusen (J. Pharm. and Toxic.
Meth. 39: 9–17
(1998)). Die Verbindungen werden in Lösungen gelöst, die Kombinationen von absolutem
Ethanol, 0,2% Hydroxypropylmethylcellulose in Wasser, Propylenglycol,
Cremophor und Dextrose oder andere Lösungsmittel oder Träger für Suspensionen
enthalten. Den Mäusen
wird vom Tage der Transplantation an (Tag 0) bis zum Tag 13 oder bis
zur Abstoßung
der Transplantate einmal, zweimal oder dreimal täglich oral oder intraperitoneal
Verbindung verabreicht. Die Ratten werden ebenfalls vom Tag 0 bis
zum Tag 13 einmal, zweimal oder dreimal täglich behandelt. Die Tiere
werden anästhesiert,
und an der Basis des Empfängerohrs
wird ein Schnitt ausgeführt,
der lediglich durch dorsale Epidermis und die Dermis geht. Der Schnitt
wird bis zum Knorpel parallel zum Kopf aufgespreizt bis zu einer
Weite, die zum Einführen
der Röhre
für die
Ratte oder das Einsetzwerkzeug für
die Maus erforderlich ist. Eine neugeborene Maus oder eine weniger
als 60 h alte Ratte wird anästhesiert
und decapitiert. Das Herz wird entnommen, mit Salzlösung gespült, mit
einem Skalpell längs
in zwei Teile geteilt und mit steriler Salzlösung gespült. Das Spenderherz-Fragment
wird mit dem Einsetzwerkzeug in die vorgeformte Röhre gesetzt,
und Luft oder Restflüssigkeit
wird unter sanftem Druck aus der Röhre entfernt. Nähen, Kleben,
Bandagieren oder Behandlung mit Antibiotika sind nicht erforderlich.
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Die
Implantate werden ohne Anästhesie
unter 10–20facher
Vergrößerung mit
einem stereoskopischen Dissektionsmikroskop untersucht. Empfängertiere,
deren Transplantate nicht sichtbar schlagen, können anästhesiert werden, und das Vorhandensein
elektrischer Aktivität
kann unter Verwendung von subkutanen E-2-Platin-Nadel-Mikroelektroden von
Grass, die entweder in der Ohrmuschel oder direkt im Transplantat
gelegt werden, und einem Tachographen beurteilt werden. Die Implantate
können über einen
Zeitraum von 10, 20 oder 30 Tagen oder länger 1–4mal täglich untersucht werden. Die
Fähigkeit
einer Verbindung, Symptome der Abstoßung des Transplantats zu mindern,
kann durch Vergleich mit einer Kontrollverbindung wie Cyclosporin,
Tacrolimus oder oral verabreichtem Leflunomid beurteilt werden.
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BEISPIEL 10
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Ovalbumin-induzierte Eosinophilie
bei der Maus
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Von
Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) werden weibliche C57BL/6-Mäuse erworben.
Alle Tiere erhalten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Mäuse werden
am Tag 0 mit einer Einmalinjektion (i.p.) von OVA (Klasse V, Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO, USA), adsorbiert auf Alaun (10 μg OVA + 9
mg Alaun 200 μl
Salzlösung)
oder Trägerstoff
als Kontrolle (9 mg Alaun in 200 μl
Salzlösung)
sensibilisiert. Am Tag 14 werden die Mäuse einer 12minütigen Inhalation
eines Aerosols, enthaltend 1,5% OVA (Gewicht-Volumen-Verhältnis) in
Salzlösung,
erhalten mit Hilfe eines Zerstäubers
(small particle generator, Modell SPAG-2, ICN Pharmaceuticals, Costa
Mesam CA, USA) ausgesetzt. Gruppen zu 8 Mäusen erhalten orale Träger (0,5% Hydroxypropylmethylcellulose/0,25%
TWEEN-80) oder eine Testverbindung zu 10, 30 oder 100 mg/kg in oralem
Träger
in einem Volumen von 200 μl
pro Maus p.o. Die Verabreichung erfolgt einmal täglich, beginnend mit Tag 7
oder Tag 13, fortgesetzt bis Tag 16.
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Zur
Bestimmung pulmonärer
Eosinophilie werden die Mäuse
3 Tage nach der ersten Reizsetzung mit OVA-Aerosol (Tag 17) durch
eine i.p. gegebene Injektion mit einem Anästhetikum (Ketamin/Acepromazin/Xylazin)
anästhesiert,
und die Trachea wird freigelegt und mit einer Kanüle versehen.
Lunge und obere Luftwege werden zweimal mit 0,5 ml kaltem PBS gespült. 200 μl der bronchoalveolären Spülung (BAL)
werden unter Verwendung eines Coulter-Zählers Modell ZB1 (Coulter Electronics,
Hialeah, FL, USA) ausgezählt.
Die übrige BAL-Flüssigkeit
wird dann 5 min. bei 300 × g
zentrifugiert, und die Zellen werden in 1 ml HBSS (Gibco BRL), enthaltend
0,5 fötales
Kälberserum
(HyClone) und 10 mM HEPES (Gibco BRL) resuspendiert. Die Zellsuspension
wird in einem Cytospin-Apparat (Shandon Southern Instruments, Sewickley,
PA, USA) zentrifugiert und mit Diff Quick (American Scientific Products,
McGraw Park, IL, USA) angefärbt,
um die BAL-Leukocyten in Neutrophile, Eosinophile, Monocyten oder
Lymphocyten zu unterteilen. Die Zahl der Eosinophilen in der BAL-Flüssigkeit
wird durch Multiplikation des Prozentsatzes der Eosinophilen mit
der Gesamtzahl an Zellen bestimmt.
