DE69927599T2

DE69927599T2 - Verwendung von wachstumshormon und analoga davon für die behandlung von säugern mit familiärer hypercholesterolämie

Info

Publication number: DE69927599T2
Application number: DE69927599T
Authority: DE
Inventors: Mats Rudling; Bo Angelin
Original assignee: SAHLTECH AB; Sahltech i Goteborg AB
Current assignee: SAHLTECH AB; Sahltech i Goteborg AB
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: DE69927599D1; WO2000023097A1; EP1124571A1; JP2002527486A; AU764779B2; ATE305795T1; EP1124571B1; US6559289B1; SE9803623D0; CA2342794A1; AU1428800A

Description

Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von biologisch aktiven Verbindungen, die aus Wachstumshormon (WH), Analoga davon und WH-freisetzenden Verbindungen ausgewählt sind, als Lipid-senkende Mittel zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Säugetieren mit familiärer Hypercholesterolämie der homozygoten Form. Durch die Bereitstellung eines Medikaments, das Verbindungen umfasst, die aus WH, Analoga davon und WH-freisetzenden Verbindungen ausgewählt sind, optional in Kombination mit einer weiteren Lipid-senkenden Behandlung kann erhöhtes Plasmacholesterin in LDLR-defizitären Säugetieren mit familiärer Hypercholesterolämie der homozygoten Form behandelt werden.
Wachstumshormon (WH) hat pleiotrope Wirkungen auf den Cholesterinmetabolismus. WH stimuliert die Expression von Rezeptoren des hepatischen Lipoproteins geringer Dichte (LDL) und die Aktivität der Cholesterin-7α-Hydroxylase (C7αOH), ein regulatorischer Schlüsselschritt der Gallensäuresynthese. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass die WH-Behandlung Plasmacholesterin in der Situation einer familiären Hypercholesterolämie der homozygoten Form, wie sie durch den kürzlich entwickelten LDL-Rezeptor Knockout Mausstamm gezeigt wird, verringert.
Die WH-Infusion in LDL-Rezeptor-Knockout-Mäuse resultierte in einer um 30 – 40 % verringerten Plasmacholesterinmenge. Zusätzlich wurden die verringerten enzymatischen Aktivitäten der Cholesterin-7α-hydroxylase und der HMG CoA-Reduktase normalisiert. Es wird daraus geschlossen, dass die WH-Behandlung die schwere homozygote Form der familiären Hypercholesterolämie in LDLR-defizitären Mäusen verringert. Solch eine Therapie hat eine vorteilhafte Wirkung in der sehr therapieresistenten Erkrankung der familiären homozygoten Hypercholesterolämie, einer Krankheit, von der bekannt ist, dass sie gegen eine lipidsenkende Behandlung sehr resistent ist.
In dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
C7αOH bezeichnet die Cholesterin-7α-Hydroxylase; HMG CoA-Reduktase bezeichnet die 3-Hydroxy-3-methyl-glutarylcoenzym-A-Reduktase, FPLC bezeichnet die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie; WH bezeichnet das Wachstumshormon; HDL bezeichnet das Lipoprotein hoher Dichte; LDL bezeichnet das Lipoprotein geringer Dichte; LDLR bezeichnet den Rezeptor für das Lipoprotein geringer Dichte; LDLRKO bezeichnet den LDL-Rezeptor-Knockout; SDS-PAGE bezeichnet die Natriumdodecylsulphatpolyacrylamidgelelektrophorese; TNA bezeichnet die Gesamtnukleinsäure; VLDL bezeichnet das Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte.
Hintergrund der Erfindung
Die familiäre Hypercholesterolämie (FH) ist eine übliche autosomal dominant vererbte Erkrankung und ist in heterozygoter und homozygoter Form vorhanden.
Die heterozygote FH kommt mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 : 300 – 500 in der allgemeinen Bevölkerung vor. Die Betroffenen haben ein Typ II-A Lipidmuster und ungefähr zwei Mal die normalen LDL-Cholesterinmengen. Heterozygote haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer frühzeitigen Herzerkrankung und deren erwartete Lebensdauer ist auf 10 bis 15 Jahre verringert. FH-Heterocygote haben eine Mutation in dem Gen, das den I_DL-Rezeptor kodiert. Dieser Rezeptor ist auf der Oberfläche der Zellen in der Leber und anderen Organen lokalisiert. Die LDL-Rezeptoren binden LDL und erleichtern dessen Aufnahme durch Rezeptor-vermittelte Endozytose und die anschließende Ablieferung in Lysosomen, wo das LDL abgebaut wird und freies Cholesterin zur zellulären Verwendung ergibt. Wenn LDL-Rezeptoren fehlen, verringert sich die Geschwindigkeit der Entfernung von LDL aus dem Plasma und die Menge an LDL erhöht sich umgekehrt proportional zu der Rezeptorzahl. Der Überschuss an Plasma-LDL wird in Fresszellen und anderen Zelltypen abgelagert, die Atherome und Xanthome produzieren. FH-Heterozygote haben ein normales und ein mutiertes Allel an dem LDL-Rezeptorlocus; somit sind deren Zellen in der Lage, LDL mit ungefähr der Hälfte der normalen Geschwindigkeit zu binden und abzubauen. (Siehe in: The metabolic and molecular bases of inherited disease. Siebte Ausgabe, Mac Graw-Hill, Kapitel 62, Familial Hypercholesterolemia, von J.L. Goldstein et al., S. 1981 – 2030).
Die Betroffenen mit der homozygoten Form von FH (Vorkommen = 1 : 10⁶) haben Plasmacholesterinmengen, die 3 – 5-fach höher sind als bei normalen Menschen und entwickeln häufig eine koronare Herzerkrankung in der Kindheit, und meist ausnahmslos vor dem 20. Lebensjahr. Homozygote besitzen zwei mutierte Allelen an dem LDL- Rezeptorlocus und deren Zellen zeigen eine vollständige oder fast vollständige Unfähigkeit zur Bindung oder Aufnahme von LDL.
Es gibt zwei Tiermodelle für die FH, die der menschlichen Krankheit stark ähneln. Das erste ist ein natürlich mutierter Stamm von Kaninchen, Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL) Kaninchen und das Zweite ist der seit kurzem verfügbare Maus-LDLR Knock-out (LDLRKO) Stamrn, der von Herz et al. (Ishibashi, S. et al. 1993, J. Clin. Invest. 92; 883 – 893) entwickelt wurde. Vorangegangene Studien in WHHL-Kaninchen haben gezeigt, dass homozygote Tiere eine stark unterdrückte Aktivität des regulatorischen Enzyms C7αOH aufweisen (Xu et al. 1995, J. Clin. Invest. 95; 1447 – 1504).
Bei der Therapie der Typ II-A Hyperlipidämie basiert die Strategie auf dem Konzept der Erhöhung der Anzahl der verfügbaren hepatischen LDL-Rezeptoren, was wiederum das Plasmacholesterin, bedingt durch eine erhöhte hepatische Aufnahme von LDL und LDL-Vorstufenlipoproteinen wie Lipoprotein intermediärer Dichte (IDL), verringern wird. In der heterozygoten FH ist die wirksamste Therapie die; Beeinflussung der enterophatischen Zirkulation der Gallensäuren durch oral verabreichte Gallensäure-abbauende Verbindungen wie Cholestyramin in Kombination mit spezifischen 3-Hydroxy-3-methyl-glutarylcoenzym A (HMG CoA)-Reduktasehemmern. Eine erhöhte Anzahl von solchen Medikamenten (Statine und Vastatine) wurde in den Markt eingeführt. Solch eine kombinierte Therapie kann Plasma-LDL normalisieren, tut dieses aber nur selten vollständig.
Jedoch müssen in Homozygoten, die keinerlei funktionelle LDL-Rezeptoren ihr Eigen nennen, andere Mittel zur Verringerung der hohen LDL-Mengen eingesetzt werden. Dieser Krankheitstyp ist ein Kandidat für die Gentherapie. Solch eine Behandlung wurde in Labortieren unter Verwendung dass LDLR-Gens und des Gens, das die Cholesterin-7α-Hydroxylase (C7αOH) kodiert, den regulatorischen Schlüsselschritt in der Synthese von Gallensäuren, getestet (Ishibashi, S. et al. 1993, J. Clin. Invest. 92, 883 – 893, Spady, D.K. und Cuthbert, J.A. 1995, J. Clin. Invest 96; 700 – 709). Die Wirkungen sind bedauerlicherweise transient. Bis jetzt war die einzige verfügbare Therapie die Lebertransplantation oder Plasmapherese und/oder die selektive extrakorporale Entfernung von cholesterinreichen LDL-Partikeln. Die zuletzt genannte Therapie kann, wenn sie alle zwei bis drei Wochen durchgeführt wird, die erhöhte Plasmacholesterinmenge verringern, nicht aber normalisieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass bestimmte FH- Homozygote auch von einer hochdosierten Statintherapie profitieren können (Marais, A.D. et al. 1997, J. Lipid Res. 38 : 2071 – 8). Daher gibt es bis eine Gentherapie klinisch verfügbar ist, einen Bedarf an neuen pharmakologischen therapeutischen Strategien in der Homozygoten-FH.
Das Wachstumshormon (WH) der Hypophyse hat verschiedene Wirkungen auf den Cholesterin- und Lipidmetabolismus. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die WH-Therapie eine stimulierende Wirkung auf die hepatische LDLR-Expression sowohl in Ratten wie auch in Menschen hat (Rudling, M. et al. Proc. NatI.Acad. Sci. USA, 1992, 89; 6983 – 6987), und insbesondere haben wir das WH als ein wichtiges Stimulans der enzymatischen Aktivität von C7αOH identifiziert (Rudling et al., 1997, J. Clin. Invest. 99; 2239 – 2245). Wir haben gezeigt, dass das WH die C7αOH-Aktivität stimuliert und zwar nicht nur in hypophysektomierten Tieren, sondern auch in normalen jungen Ratten (P. Parini, et al. 1999, Cholesterol and lipoprotein metabolism in aging: reversal of hypercholesterolemia by growth hormone treatment in old rats, Arterioscl. Thromb. & Vasc. Biol. 19; 832 – 839). Die Experimente wurden in Säugetieren durchgeführt, die normale LDL-Rezeptoren exprimieren.
Aus „Current opinion in Lipidology", 1997, Bd. 8, S. 337 – 341 von B. Angelin sowie aus "Metabolism", 1996, Bd. 45 Nr. 11, S. 1414 – 1421 von Tostad et al. ergab sich in offensichtlicher Weise, dass die familiäre Hypercholesterolämie der heterozygoten Form von der Behandlung mit WH profitieren kann, weil solche Patienten funktionelle LDL-Rezeptoren exprimieren.
Weil jedoch Homozygote keine funktionellen LDL-Rezeptoren aufweisen, war es für einen Fachmann auf dem Gebiet nicht offensichtlich, dass die homozygote Form der Erkrankung von einer WH-Behandlung profitieren kann.
Beschreibung der Erfindung
Wir haben nun überraschender Weise herausgefunden, dass die Verabreichung von Verbindungen, die aus WH, Analoga davon und WH-freisetzenden Verbindungen ausgewählt sind, optional in Kombination mit einer etablierten Lipid-senkenden Behandlung, an Säugetiere mit familiärer Hypercholesterolämie der homozygoten Form, vorteilhafte Wirkungen auf die Plasmacholesterinmengen hat. Wir können zeigen, dass die Infusion von WH in LDLR-defizitäre Tiere die Gesamtplasma- und LDL-Cholesterinmengen verringert. Dieses kommt parallel mit einer Normalisierung einer unterdrückten C7αOH-enzymatischen Aktivität zustande. Zusätzlich haben wir auch herausgefunden, dass die WH-Behandlung die Wirkung der Stative und Gallensäureabbauenden Mittel, die zwei wichtige Klassen von Lipid-senkenden Medikamenten sind, die in der etablierten Behandlung von Patienten verwendet werden, potenzieren kann.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch gezeigt, dass die WH-Therapie zur Verringerung von Plasma-LDL-Cholesterin in der FH der homozygoten Form verwendet werden kann. Somit kann die WH-Behandlung allein, optional in Kombination mit einer etablierten Lipid-senkenden Behandlung, verwendet werden, um Säugetiere zu behandeln, die durch einen Mangel an LDL-Rezeptoren gekennzeichnet sind. Daher könnte WH ein Adjuvans zur derzeitigen Therapie von FH-Homozygoten werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Verbindungen gerichtet, die aus WH, Analoga davon und WH-freisetzenden Verbindungen ausgewählt sind, optional in Verbindung mit konventionellen Lipid-senkenden Mitteln zur Herstellung eines Medikaments, das die Serumlipide in einem Säugetier verringert, das das Syndrom der FH der homozygoten Form aufzeigt. Die Therapie kann auch mit einer etablierten Lipidsenkenden Behandlung kombiniert werden. Die Art des WHs, das verwendet werden kann, umfasst natürliches oder rekombinantes WH und Molekülvarianten des WHs oder Analoga mit dem gemeinsamen Nenner, dass sie letztendlich in der Lage sind, ein WH-Rezeptorsignal in Zellen in den Spezies zu aktivieren, die das Syndrom der homozygoten Form aufzeigen. Ein Bleispiel von WH ist Genotropin, das von Pharmacia & Upjohn hergestellt wird. Beispiele von Analoga sind Verbindungen, die die WH-Freisetzung verstärken können oder die zellulären Mechanismen der WH-Wirkung beeinflussen. Verbindungen, die eine WH-Freisetzung bewirken, werden durch das WH-freisetzende Hormon, Somatostatin-Antagonisten, Hexarelin und die Wachstumshormonfreisetzende Verbindung L-692 429 von Merck beispielhaft aufgeführt. Der Weg der WH-Verabreichung an Säugetiere kann variieren und ein üblicher Weg der Verabreichung ist die Injektionstherapie. Alternative Wege der Verabreichung können jedoch bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung anwendbar sein. Solche alternativen Wege zur WH-Verabreichung, die derzeit existieren oder entwickelt werden können, umfassen die orale, nasale, rektale und transdermale WH-Therapie. Die Dosierung des WHs zur Verwendung bei der Behandlung des Syndroms der FH der homozygoten Form kann von dem verwendeten WH und der zu behandelnden Spezies sowie der klinischen Bewertung eines Patienten abhängen. In Menschen würde ein WH vorzugsweise 7 Mal pro Woche injiziert werden, aber es könnten auch weniger häufige Injektionen verwendet werden, so lange das Kriterium der Aktivierung eines WH-Rezeptorsignals, das in einer Verringerung des Cholesterins resultiert, eingehalten wird.
Eine Ausführungsform der voliegenden Erfindung umfasst die kombinierte Behandlung mit WH und einer Lipid-senkenden Therapie wie der LDL-Apherese oder mit Verbindungen, die vorzugsweise aus der Liste der Lipid-senkenden Mittel ausgewählt werden, die zum Beispiel Statine und Gallensäure-verbrauchende Mittel wie Cholestyramin umfassen. Derzeit sind 5 Statine auf dem Markt in Schweden verfügbar, Atarvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Pravastatin und Simvastatin.
Die Dosisbereiche dieser Medikamente werden diejenigen sein, die durch die jeweiligen Vertriebsorganisationen zur klinischen Verwendung empfohlen werden. Die tägliche Dosis von menschlichem WH (wie Genotropin) würde abhängig von den erhaltenen Reaktionen vorzugsweise in dem Bereich von 0,02 bis 0,14 IU/kg liegen. Die Dauer der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die WH-Behandlung in einer kontinuierlichen oder in einer diskontinuierlichen Weise mit und ohne die Kombination von anderen Arten von Lipid-senkenden Medikamenten oder Prozeduren. Die Dauer der Behandlung hängt von der Bewertung des verantwortlichen Arztes ab. Es ist bevorzugt, dass die Dauer der Behandlung für mehrere Monate dauert und dass die Wirkung der Behandlung wenigstens jedes habe Jahr durch die Analyse des Serumcholesterins beobachtet wird.
Das Syndrom der FH, das zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst homozygote LDLR-Mutationen jeglicher Art, die in einer LDLR-Mangelfunktion resultieren. Solche Patienten können klinisch durch einen erhöhten Plasmacholesterinwert identifiziert werden. In einer genaueren Diagnose könnte das LDLR-Gen sequenziert werden oder das Muster der Lipoproteine bestimmt werden.
Diese Erfindung entspritcht der Offenbarung der beifügten Ansprüche.
Im Folgenden werden wir Beispiele bereit stellen, die die vorliegende Erfindung illustrieren. Diese Beispiele dienen nur dem Zweck der Darstellung der Erfindung und werden nicht als Einschränkungen davon angesehen.
Verfahren
Tiere und experimentelles Verfahren: Die Studien wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee in Schweden bewilligt. Insgesamt wurden 75 männliche LDLRKO- und 45 C57 BL/6J-Mäuse von Bommice, Dänemark, erworben. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen in Gruppen von 10 gehalten. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Wasser und Nahrung; die Lichtzyklusstunden lagen zwischen 6.00 Uhr vormittags und 6.00 Uhr nachmittags. Zu Beginn des Experiments wurden osmotische Minipumpen, die WH enthalten, subkutan unter leichter Ätheranästhesie implantiert. Nicht mit WH behandelte Tiere wurden zum Schein operiert. Rekombinantes menschliches WH (Genotropin^®), das von Pharmacia & Upjohn käuflich erworben wurde, wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,0 mg/kg pro Tag infundiert. Nach 6 Tagen Infusion wurden die Tiere mit Äther anästhesiert und es wurde Blut aus dem Auge entnommen. Die Mäuse wurden danach durch Genickbruch getötet. Die Leber wurden sofort entfernt und falls indiziert, wurde 1 g Leber zur anschließenden Zubereitung von Mikrosomen zur Untersuchung der Enzymaktivität, wie es unten beschrieben wird, entnommen. Die verbleibende Leber wurde sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70 °C gelagert.
In dem Experiment, das die Wirkungen von Cholestyramin, Atorvastatin, WH und Kombinationen davon vergleicht, wurde den Tieren Blut aus dem Auge unter leichter Ätheranästhesie entnommen und sie wurden nicht getötet. Kot wurde bei zwei Gelegenheiten während zweier Tage gesammelt, wobei der erste Zeitraum 4 Tage vor dem Beginn der Behandlung begann und der zweite von Tag 3 bis Tag 5 während der Medikamentenbehandlung lag. Die Tiere wurden auf einem Metallgitter während der zwei Tage des Sammelns des Kots gehen gelassen. Die Proben wurden täglich gesammelt und zusammengeführt. Cholestyramin (Questran^®), das von Bristol-Myers Squibb erhalten wurde, wurde zu der vermahlenen Mausnahrung in einer Endkonzentration von 2 % hinzugegeben. Atorvastatin (Lipitor^®) wurde von Parke-Davies als 20 mg Tabletten erworben. Zermahlene Tabletten wurden zu vermahlener Mausnahrung in einer Endkonzentration von 1500 mg Atorvastatin/kg gemahlener Nahrung hinzugegeben. Unter Annahme einer täglichen Nahrungsaufnahme von 2 – 3 g von 25 g Mäusen, sollte dieses einer täglichen Dosis von 120 – 180 mg/kg entsprechen.
Das gesamte hepatische Cholesterin wurde bestimmt, gefolgt durch die Extraktion und das anschließende Trocknen der Leberproben unter Stickstoff, wie es beschrieben wurde (Rudling M. J. Lipid Res. 33 : 493 – 50, 1992). Gesamtes hepatisches und Plasmacholesterin und Plasmatriglyceride wurden unter Verwendung kommerziell verfügbarer Verfahren (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Deutschland) untersucht.
Enzymatische Aktivitäten der HMG CoA-Reduktase und C7αOH. Hepatische Mikrosomen wurden durch differnzielle Ultrazentrifugation von Leberhomogenaten in der Abwesenheit von Fluorid, wie es zuvor beschrieben wurde, hergestellt (Angelin et al. 1984, J. Lipid Res. 25; 1159 – 1166, Einarsson et al. 1986, J. Lipid Res. 27; 82 – 88, Einarsson et al. 1989, J. Lipid Res. 30; 739 – 746). Die mikrosomale HMG CoA-Reduktase wurde durch die Umsetzung von [¹⁴C] HMG CoA zu Mevalonat untersucht und als Picomal ausgedrückt, die pro mg Protein pro Minute gebildet wurden. Die Aktivität der C7αOH wurde aus der Bildung von 7α-Hydroxycholesterin (Picomol/mg Protein/Min.) aus endogenem mikrosomalen Cholesterin durch die Verwendung einer Isotopenverdünndungs-Massenspektroskopie, wie sie im Detail beschrieben wurde, bestimmt. Alle Enzymassays wurden als Doppelwerte durchgeführt.
Ein Ligandenblotassay der LDL-Rezeptoren wurde unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem, β-migrierenden Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte (VLDL) aus Kaninchen, wie es zuvor beschrieben wurde, durchgerührt (Rudling et al., 1992, PNAS 89; 6983 – 6987). Die Membranproteine wurden durch SDS-PAGE (6 % Polyacrylamid) aufgetrennt. Nach dem Elektrotransfer der Proteine auf Nitrozellulosefilter und anschließende Inkubation wurden ¹²⁵I-β-VLDL-Filter einem DuPont Röntgenfilm bei –70 °C ausgesetzt.
Grössenfaktionierung von Lipoproteinen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (FPLC). Gleiche Volumen an Plasma aus jedem Tier wurden zusammengefasst (1 – 2 ml) und die Dichte wurde auf 1,21 g/ml mit festem KBr angepasst. Nach der Ultrazentrifugation bei 10⁵ g für 48 Std. wurde der Überstand entfernt und mit 0,15 M NaCl, 0,01 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,02 % Natriumazid, pH 7,3, angepasst. Eine Probe dieser Lösung wurde in eine 54 × 1,8 cm Superose 6B Säule nach dem Filtrieren durch einen Millipore 0,45 mm HA-Filter injiziert und es wurden 2 ml-Fraktionen gesammelt.
Gallensäureausscheidung im Kot. Diese wurde durch das Verfahren von Beher, W.T.S. et al., 1981, Steroids. 38: 281 – 295, so wie es durch Wolle et al., 1995, J. Clin. Invest. 96 : 260 – 272 modifiziert wurde, gemessen. In Kürze, Kot wurde zwei Mal für zwei aufeinander folgende Tage gesammelt und in zwei Volumen (v/w) Wasser homogenisiert. Proben (die 1 g Kot entsprechen) wurden für 30 Minuten bei 70 °C nach der Zugabe von 7 ml Ethanol inkubiert. Die Mischung wurde durch einen Papierfilter filtriert, der ein Mal mit 6 ml 70 °C Ethanol gespült wurde. Nach dem Trocknen einer 4 ml Probe unter Stickstoff wurden 2 ml 3 M NaOH hinzugegeben und die Proben wurden durch Inkubation bei 100 °C für zwei Stunden hydrolysiert. Nach der Anpassung des pH-Wertes auf 9 wurde die Gallensäurekonzentration in einer 70 μl Probe unter Verwendung eines auf Resazurin-basierenden Fluoreszenzsystems gemessen.
Beispiel 1
Die Wirkungen von WH auf Plasmalipide und den hepatischen Cholesterinmetabolismus
Infusion von WH in C57BL/6J- und LDLRKO-Mäuse. Zwei Sätze von 10 Tieren von jedem Stamm wurden kontinuierlich bei einer Geschwindigkeit von 1 mg/kg/Tag infundiert. Nach 6 Tagen Behandlung wurden die Tiere getötet und Plasma und Leber wurden gesammelt.
Gesamtplasmacholesterin und Triglyceride waren jeweils um 250 und 80 % in LDLRKO-Tieren im Vergleich zu C57BL/6J-Mäusen (1) erhöht. Es gab auch eine 45 %-ige Erhöhung des gesamten hepatischen Cholesterins in LDLRKO-Tieren. Die Behandlung mit WH verringerte eindeutig das Gesamtplasmacholesterin in LDLRKO-Tieren, wo hingegen keine signifikante Wirkung in C57BL/6J-Mäusen erhalten wurde. Die WH-Infusion in normale Mäuse erhöhte leicht das gesamte hepatische Cholesterin, wohingegen es zu einer leichten Verringerung in LDLRKO-Tieren kam. Es gab eine geringe aber nicht signifikante Reduktion der Gesamtplasmatriglyceride in LDLRKO-Tieren, wohingegen die Gesamtplasmatriglyceride in C57BL/6J-Mäusen unverändert waren.
Die FPLC-Trennung der Plasmalipoproteine zeigte, dass die Verringerung des Cholesterins, die durch GH in LDLRKO-Tieren induziert war, in allen Größenfraktionen vorhanden war (2), obwohl diese am deutlichsten bei den VLDL- und LDL-Partikeln war; die Verringerung der Triglyceride kam nur in VLDL-Partikeln zustande (3). In C57BL/6J-Mäusen erhöhte das WH die Triglyceride in den VLDL-Partikeln.
Die Abwesenheit von LDL-Rezeptoren in LDLRKO-Tieren wurde durch den Ligandenblot von hepatischen Membranen, die aus gesammelten Lebern aus jeder Tiergruppe erhalten wurden, durch Verwendung von β-VLDL als Ligand (nicht gezeigt) bestätigt. Die Expression der LDL-Rezeptoren in C57BL/gJ-Mäusen wurde durch die WH-Behandlung nicht verändert.
Zur Bestätigung dieser übenaschenden Feststellung einer Plasmacholesterin-senkenden Wirkung von WH in LDLR-defizitären Tieren mit deutlicher Hypercholesterolämie wurde das vorherige Experiment wiederholt. Zusätzlich wollten wir auch die enzymatischen Aktivitäten der 3-Hydroxy-3-methyl-glutarylcoenzym A (HMG CoA)-Reduktase und der Cholesterin-7α-Hydroxylase (C7αOH), welches jeweils die Geschwindigkeitsbeschränkenden Schritte in der Synthese von Cholesterin und Gallensäuren sind, bestimmen. Die Tiere erhielten die gleiche Dosis an WH, die für 6 Tage infundiert wurde. Die anschließende Untersuchung des Gesamtplasmacholesterins und der Triglyceride sowie des gesamten hepatischen Cholesterins (4) zeigte praktisch identische Ergebnisse, obwohl die Verringerung des Gesamtplasmacholesterins etwas weniger deutlich war.
Die FPLC-Trennung der Plasmalipoproteine bestätigte, dass das WH Plasmalipoproteincholesterin, insbesondere in VLDL- und LDL-Partikeln, verringerte (5). In diesem Experiment waren die Triglyceride nicht nur in VLDL-Partikeln, sondern auch in DLD- und HDL-Partikeln (6) erniedrigt.
Die Untersuchung der C7αOH-Aktivität zeigte eine 40 %-ige Erhöhung in LDLRKO-Tieren im Vergleich zu C57/BL6J-Tieren (7). Die Behandlung mit WH erhöhte deutlich die Aktivität in beiden Tiergruppen (jeweils um 115 und 46 % für C57/BL6J- und LDLRKO-Mäuse). Die enzymatische Aktivität der HMG CoA-Reduktase war in LDLRKO-Tieren stark unterdrückt (30 % von derjenigen, die in Kontroll-C57/BL6J-Tieren zu finden war, 8). Die WH-Behandlung erhöhte die Aktivität der HMG CoH-Reduktase in C57/BL6J- und LDLRKO-Mäusen um jeweils 53 und 113 %. Die Untersuchung der mRNA-Mengen der C7αOH durch Lösungshybridisierung (9) zeigte ein 60 erniedrigtes Vorkommen in LDLRKO-Tieren im Vergleich zu C57/BL6J-Tieren. Die WH-Behandlung erhöhte die C7αOH mRNA-Menge um 170 % in LDLRKO-Mäusen, wohingegen es eine 50 %-ige Reduktion in der C7αOH mRNA-Menge in C57/BL6J-Tieren nach der Behandlung mit WH gab.
Die HMG CoA-Reduktase-mRNA-Mengen waren in LDLRKO-Tieren im Vergleich zu C57BL/6J-Tieren leicht erniedrigt und eine Infusion mit WH erhöhte diese um 20 %, wohingegen es keine Wirkung in C57/BL6J-Mäusen gab.
Somit gab es wie in normalen Rasten (P. Parini, et al. 1998, Cholesterol and lipoprotein metabolism in aging: reversal of hypercholesterolemia by growth hormone treatment in old rats. Arterioscl. Thromb. & Vasc. Biol. im Druck) keine Erniedrigung des Plasmacholesterins in normalen Mäusen nach Behandlung mit WH, was mit den vorherigen Ergebnissen mit Sprague Dawley Ratten übereinstimmt (Rudling et al., 1997, J. Clin. Invest. 99; 2239 – 2245). Die Behandlung von Mäusen mit WH stimulierte auch die Aktivität der C7αOH sowohl in normalen wie auch LRLRKO-Tieren. Jedoch war die Aktivität der HMG CoA-Reduktase in LDLRKO-Tieren stark unterdrückt und die Infusion mit WH erhöhte die Aktivität auf die gleiche Menge, wie sie in normalen C57BL/6J-Tieren zu finden ist. Diese zuletzt genannte Wirkung sollte theoretisch der Plasmacholesterinerniedrigenden Wirkung des Hormons stark entgegentreten.
Beispiel 2
Die Behandlung mit WH potenziert die Wirkungen von Gallensäure-abbauenden Mitteln und HMG CoA-Reduktasehemmern auf Plasmalipide
Zur Untersuchung, ob die Behandlung mit WH vorteilhafte Wirkung in der Kombinationstherapie mit etablierten Lipid-senkenden Medikamenten wie Stativen und Gallensäureabbauenden Mitteln aufweisen, wurden Gruppen von 5 Mäusen mit Cholestyramin, Atorvastatin und WH allein und in Kombination behandelt. Nach 6 Tagen der Behandlung wurde den Tieren Blut aus dem Auge entnommen und auf Cholesterin und Triglyceride hin untersucht.
Bei den eingesetzten Dosierungen gab es keine Auswirkungen auf das Cholesterin nach der Behandlung mit Atorvastatin oder Cholestyramin allein, wohingegen es zu einer 10 %-igen Erniedrigung nach WH kam. Atorvastatin und WH verringerten beide Plasmatriglyceride um ungefähr 20 %. Wenn WH in Kombination mit Cholestyramin oder Atorvastatin gegeben wurde, verringerte sich das Cholesterin um jeweils 29 und 36 % und die Triglyceride waren um jeweils 34 und 43 % verringert. Die Kombination all dieser drei Medikamente resultierte in der stärksten Wirkung auf das Plasmacholesterin und es gab eine 43 %-ige Erniedrigung. Die Triglyceride wurden nicht weiter verringert.
Die Untersuchung des Gehalts an Gallensäuren vor und während der Behandlung mit den drei Medikamenten zeigte, das alle drei Medikamente Gallensäuremengen in Kot erhöhen könnten, wenn sie allein gergeben werden (11). Fäkale Gallensäuremengen waren am höchsten, wenn das WH mit Cholestyramin kombiniert wurde, wohingegen es zu keiner weiteren Änderung kam, wenn das WH mit Atorvastatin oder mit Cholestyramin kombiniert wurde.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Grafik, die das Gesamtplasmacholesterin, Triglyceride und hepatisches Gesamtcholesterin in normalen (C57 BL)- und LDLRKO (KO)-Mäusen ± WH (1 mg/kg/Tag) für 6 Tage zeigt. Jede Gruppe bestand aus 10 Tieren, die Balken zeigen die Standardabweichung.
Die 2 und 3 zeigen die Lipoproteinmuster in den vier Gruppen der Tiere, die in der Legende zu 1 beschrieben werden. Gleiche Volumen an Plasma aus jedem Tier wurden zusammengegeben und einer Ultrazentrifugation bei einer Dichte von 1,21 ausgesetzt. Der Überstand wurde danach auf einer Superose 6 Säule getrennt und fraktioniert. Gesamtcholesterin und Gesamttriglyceride wurden letztendlich bestimmt und die Ergebnisse werden jeweils in 2 und 3 gezeigt.
4 zeigt das Gesamtplasmacholesterin, Triglyceride und hepatisches Gesamtcholesterin in normalen C57BL- und LDLRKO (KO)-Mäusen ± WH (1 mg/kg/Tag) für 6 Tage in einem Wiederholungsexperiment. Jede Gruppe bestand aus 10 Tieren. Die Balken zeigen die Standardabweichung.
Die 5 und 6 zeigen die Lipoproteinmuster (Cholesterin und Triglyceride) in den vier Gruppen der Tiere, die in der Legende zu 4 beschrieben werden, nach der Trennung des gesammelten Plasmas durch FPLC.
7 zeigt die enzymatische Aktivität von C7αOH in Microsomen, die aus zusammengelegten Leberproben der vier Gruppen von Tieren, die in der Legende zu 4 beschrieben werden, hergestellt wurden. Es werden die Mittelwerte und Standardabweichung vom Mittel der drei getrennten Sammelproben von allen Tieren gezeigt.
8 zeigt die enzymatische Aktivität der HMG CoA-Reduktase in Microsomen, die aus zusammengelegten Leberproben der vier Gruppen der Tiere hergestellt wurden, die in der Lebende zu 4 beschrieben werden. Es werden die Mittelwerte und Standardabweichung vom Mittelwert der drei getrennten Probengruppen von allen Tieren gezeigt.
9 zeigt die mRNA-Häufigkeit für den LDLR, die HMG CoA-Reduktase und das C7αOH, die durch Lösungshybridisierung bestimmt wird. Die Gesamtnukleinsäuren wurden aus einer Probe der Leber von jedem Einzeltier extrahiert und mit der jeweiligen komplementären radiomarkierten cRNA-Sonde inkubiert.
Die 10 und 11 zeigen die Gesamtplasmacholesterin- und Triglyceridmengen und den Gallensäuregehalt in Kot von LDLRKO-Mäusen nach 6 Tagen der Behandlung mit Cholestyramin, Atorvastatin und WH. Die drei Medikamente wurden allein oder in den gezeigten Kombinationen an die Gruppen von 5 Mäusen in den unter Methoden beschriebenen Dosierungen abgegeben; Tiere und Expeerimente. Nach 6 Tagen der Behandlung wurde den Tieren Blut aus dem Auge unter leichter Ätheranästhesie zur Bestimmung des Gesamtcholesterins und der Triglyceride entnommen (10). Kot wurde während 2 Tagen bei 2 Gelegenheiten entnommen, die erste Gelegenheit begann 4 Tage vor dem Beginn der Behandlung (11, offener Balken) und an Tag 3 bis Tag 5 während der Medikamentenbehandlung (11, gefüllter Balken).

Claims

Verwendung von Verbindungen, die aus Wachstumshormon (WH), Analoga davon und WH-freisetzenden Verbindungen ausgewählt sind, optional in Kombination mit Lipid-senkenden Mitteln zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Säugetieren mit familiärer Hypercholesterolämie der homozygoten Form.
Verwendung von natürlichem WH, rekombinantem WH, Molekülvarianten des WH und Analoga davon gemäß Anspruch 1.
Verwendung von WH-freisetzenden Verbindungen, die aus WH-freisetzendem Hormon, Somatostatin-Antagonisten, Hexarelin und der Wachstumshormonfreisetzenden Verbindung L-692 429 von Merck ausgewählt sind, gemäß einem der Ansprüche 1 – 2.
Verwendung eines WH und der Analoga davon in Kombination mit Mitteln, die aus der Gruppe, bestehend aus HMG CoA-Reduktasehemmern und Gallensäureabsondernden Verbindungen ausgewählt sind, gemäß Anspruch 1 – 3.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 – 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung in einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Weise durch Verabreichungswege, die zur Stimulation einer biologischen Reaktion des GH-Rezeptors führen.
Verwendung eines WH und der Analoga davon in einer Menge von 0,02 bis 0,14 IE/kg gemäß einem der Ansprüche 1 – 7.
Verwendung eines Lipid-senkenden Mittels in den Mengen, die durch die jeweiligen Hersteller zur klinischen Verwendung empfohlen werden, gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche.