DE69926996T2

DE69926996T2 - Verwendung von riluzol zur behandlung der retinalischemie

Info

Publication number: DE69926996T2
Application number: DE69926996T
Authority: DE
Inventors: Michel Lazdunski; Catherine Heurteaux
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: EP1054668B1; ES2247779T3; EP1054668A1; FR2774908B1; FR2774908A1; WO1999042103A1; DE69926996D1

Description

Vorliegende Erfindung betrifft den Gebrauch eines die Freisetzung von Glutamat hemmenden Stoffes bei der Behandlung von Retinalischämie. Die Erfindung betrifft insbesondere den Gebrauch von Riluzol und seinen aktiven Derivaten im Neuroschutz oder den pharmazeutisch akzeptierbaren Salzen dieser Zusammensetzungen, für die Vorbereitung von Medikamenten bestimmt zur Behandlung und/oder Vorbeugung der Krankheiten verbunden mit einer Ischämie der Netzhaut.
Die Ischämie der Netzhaut ist klinisch in akuten Situationen zu beobachten, wie z.B. bei arteriellen oder venösen Okklusionen der Netzhaut oder Augenquetschungen, und auch bei chronischen Krankheiten, wie z.B. der altersbedingten makulären Degeneration (AMD), dem grünen Star, der diabetischen Retinopathie, der Retinopathie der Frühgeburt, bei entzündlichen Krankheiten und Blutkrankheiten, die zur Beschädigung der Netzhaut und in zahlreichen Fällen sogar zur kompletten Degeneration derselben führen. Grüner Star und altersbedingte makuläre Degeneration sind verbunden mit der Erhöhung der Lebenserwartung die Hauptursachen für Sehbehinderungen in den westlichen Ländern und ein Problem des öffentlichen Gesundheitswesens. Durch Häufigkeit und Schwere der neuronalen Beschädigung bei Augenleiden stößt der Begriff des Neuroschutzes in der Augenheilkunde auf großes Interesse.
Ischämie ist ein wesentliches Element in der Pathogenese dieser Netzhauterkrankungen. Es ist auch ein ungemein komplexes Phänomen, da mehrere Faktoren eine Rolle spielen. Die Analyse der Netzhautbeschädigung führt zur Suche einer vorbeugenden Behandlung gegen Neurodegeneration. Die bei der neuronalen Degeneration im Gehirn implizierten Mechanismen wurden zwar eingehend untersucht, dennoch gibt es gegenwärtig nur wenig Daten zu der durch Retinalischämie hervorgerufenen Neurodegeneration.
Es gibt derzeit keine effiziente Therapie. Echte Fortschritte wurden in Bezug auf das Verständnis der Ursachen des neuronalen Todes im zentralen Nervensystem gemacht. Die gleichen Konzepte wurden kürzlich auf die Netzhaut angewandt. Glutamat ist bei der zerebralen Ischämie (7) der wichtigste excitotoxische Neurotransmitter. Die Excitotoxizität, die an die verstärkte Freisetzung von Glutamat (7, 18) gekoppelt ist, scheint eine der Hauptursachen für die neuronale Degeneration zu sein. Die Neurotoxizität von endogenem Glutamat war bei mehreren neurodegenerativen, traumatischen und ischämischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (7, 9) beteiligt. Glutamat spielt eine wichtige Rolle bei der synaptischen Übertragung der Netzhaut (17). Auch die excitotoxische Hypothese (7, 18) könnte auf die Retinalischämie angewendet werden. Die verstärkte extrazelluläre Glutamatansammlung, die infolge einer Ischämie und einer Hypoxie auftritt, führt angeblich zu einer Netzhautdegeneration. Das daraus resultierende Energiedefizit würde die Fähigkeit der Müller-Fasern, freigesetztes Glutamat wieder an sich zu binden, einschränken. Und das Agglomerat des Neurotransmitters in den extrazellulären Bereichen führt angeblich eine Depolarisierung der Ganglienzellen, eine Erhöhung des intrazellulären Kalziums und schließlich den Tod der Zelle herbei. Lucas und Newhouse (13) waren die ersten, die nachwiesen, dass die inneren Netzhautschichten infolge einer systemischen Glutamatinjektion zerstört werden. Geringe Dosen Glutamat, die über einen lagen Zeitraum in den Glaskörperhohlraum der Ratte injiziert wurden, erwiesen sich als toxisch für die Ganglienzellen der Netzhaut (21). Eine spezielle Glutamatfreisetzung infolge einer Ischämie, die durch intraokulare Druckerhöhung herbeigeführt wird, wurde beim Kaninchen (12) beschrieben. In der Glaskörperhöhle des an grünem Star (8) leidenden Menschen und des Affen wurde eine deutliche Erhöhung von Glutamat festgestellt.
Riluzol, das auch 2-Amino-6-Trifluoromethoxybenzothiazol genannt wird, ist eine Verbindung, die aufgrund ihrer zahlreichen Eigenschaften bekannt ist. Es wird beschrieben als Antikonvulsivum und Antiepileptikum (europäisches Patent Nr. 50 551) bei der Behandlung neurologischer Schädigungen im Zusammenhang mit Verletzungen (Französisches Patent Nr. 2 699 077) und bei der Behandlung von Schizophrenie (Europäisches Patent Nr. 305 276), Schlafstörungen und Depression (Europäisches Patent Nr. 305 277). Kürzlich wurde die Verwendung von Riluzol für die Behandlung von Mitochondrienerkrankungen vorgeschlagen (Internationale Patentanmeldung Nr. WO95/19170).
Man fand jetzt heraus, dass Riluzol und seine aktiven Derivate im Neuroschutz, beschrieben im vorhergehenden Artikel, bei der Behandlung oder zum Vorbeugen vor Erkrankungen in Verbindung mit einer Retinalischämie, wie z.B. arterielle oder venöse Okklusion der Netzhaut oder Augenquetschungen, benutzt werden können, und auch bei chronischen Erkrankungen wie altersbedingter makulärer Degeneration, grünem Star, diabetischer Retinopathie, Retinopathie der Frühgeburt, entzündlichen Krankheiten und Blutkrankheiten.
Riluzol hat die Eigenschaft, die präsynaptische Freisetzung von Glutamat zu hemmen (6, 10, 15). Die Neuroschutzeigenschaften von Riluzol wurden an der zerebralen Ischämie (9, 14, 19, 22) und an Rückenmarkverletzungen (20) aufgezeigt; in Modellen der Parkinson- und Huntington-Krankheit (1, 2, 4, 5, 16). In klinischen Tests ist Riluzol bis heute das einzig effiziente Molekül bei der Behandlung der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) (3, 11) und wird von der Firma Rhône Poulenc France unter dem Namen Rilutel^© kommerzialisiert.
Das Aufzeigen der neuen Eigenschaften von Riluzol nach der vorliegenden Erfindung gründet auf einer In-vivo-Studie des möglichen Neuroschutzeffekts von Riluzol in einem Modell der Retinaischämie, hervorgerufen durch intraokulare Druckerhöhung. Als Instrument zur Beurteilung der Funktionsfähigkeit der Retina wird die Elektroretinographie herangezogen.
Die nachstehend dargelegten Resultate ermöglichten das Aufzeigen des Neuroschutzeffektes eines Inhibitors für die Freisetzung von Glutamat und den erstaunlichen Neuroschutzeffekt von Riluzol. Sie gestatten folglich den Einsatz dieser Verbindung und ihrer aktiven Derivate im Neuroschutz, bzw. ihrer pharmazeutisch akzeptierbaren Salze bei der Vorbereitung von Medikamenten, bestimmt zur Behandlung der Krankheiten verbunden mit einer Ischämie der Netzhaut.
CHEW S. J. E AL („Neuroprotection: The next breakthrough in glaucome? Proceedings of The Third Annual Optic Nerve Rescue and Restoration Thin Tank." JOURNAL OF GLAUCOMA, (1997) 6/4 (263–266) und DREYER E B ("Intelligent selection of glutamate antagonists for the management of glaucoma." ANNUAL MEETING OF THE ASSOCIATION FOR RESEARCH IN VISION AND OPHTALMOLOGY, PARTS 1–2, FORT LAUDERALE, FLORIDA, USA, MAY 11–16, 1997. INVESTIGATIVE OPHTALMOLOGY & VISUAL SCIENCE 38 (4 PART 1–2). 1997. S221.) schlagen lediglich vor, dass Riluzol als einer von vielen potentiellen Wirkstoffe einer Liste, eine therapeutische Wirkung auf den grünen Star oder die Retinalischämie haben könnte.
Die in den vorgenannten Patenten beschriebenen Riluzolsalze können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Fachmann kann gegebenenfalls selbst das aussuchen, was sich für den neuen Gebrauch gemäß Erfindung am besten eignet. Von den pharmazeutisch akzeptierbaren Salzen kann man insbesondere Additionssalze mit Mineralsäuren nennen, wie Chorhydrat, Sulfat, Nitrat, Phosphat, oder organische Salze wie Azetat, Propionat, Sukzinat, Oxalat, Benzoat, Fumarat, Maleat, Methansulfonat, Isetionat usw. oder Ersatzderivate derselben.
Die Medikamente gemäß Erfindung bestehen zumindest aus Riluzol in ungebundener Form oder in Form eines Additionssalzes mit einer pharmazeutisch akzeptierbaren Säure, pur oder in Form einer Zusammensetzung, in der es mit anderen pharmazeutisch kompatiblen Produkten kombiniert wird. Die Medikamente gemäß Erfindung können oral, parenteral, rektal oder topisch angewendet werden.
Als Feststoffzusammensetzungen für die orale Verabreichung kann man Tabletten, Pillen, Pulver usw. benutzen, in dem Riluzol mit einem oder mehreren herkömmlicherweise benutzten inerten Lösungsmitteln vermischt wird, und eventuell mit anderen Stoffen, wie z.B. einem Gleitmittel, einem Farbstoff, einer Umhüllung usw.
Als Flüssigzusammensetzungen für die orale oder okulare Verabreichung kann man Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, pharmazeutisch akzeptierbare Sirupe benutzen, die herkömmlicherweise benutzte inerte Lösungsmittel enthalten, und eventuelle andere Stoffe, wie Benetzungsmittel, Süßungsmittel, Verdickungsmittel usw.
Sterile Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung können wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösungsmittel oder Trägerstoff kann man Wasser, Propylenglykol, pflanzliche Fette oder andere geeignete organische Lösungsmittel verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien enthalten, wie Benetzungsmittel, Isotonika, Emulgatoren usw.
Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung können beispielsweise Cremes, Lotionen, Mundwasser, Nasen- oder Augentropen oder Aerosole sein.
Wie den nachstehend dargelegten Experimenten zu entnehmen ist, zieht man insbesondere eine lokale Anwendung der Zusammensetzung der Erfindung im Auge vor.
Die Dosen hängen von der benutzten Verabreichungsart ab. Sie liegen bei oraler Einnahme generell zwischen 50 bis 400 mg pro Tag mit Einheitsdosen zwischen 25 und 200 mg Wirksubstanz.
Die lokale Anwendung im Auge ist eine vorteilhafte Anwendung von Riluzol im Gebrauch gemäß der Erfindung. So zieht man insbesondere eine Verabreichung in Form von Augentropfen vor. Bei einer Extrapolation der beim Kaninchen erzielten Ergebnisse besteht für den Menschen die Möglichkeit einer auf 10^–5 M/I dosierten Lösung, die vorzugsweise 2 Mal am Tag benutzt wird, und zwar jeweils in Form eines Tropfens zu ca. 50 Mikrolitern pro Auge.
Die Erfindung betrifft auch das Vorbereitungsverfahren der Medikamente gemäß Erfindung, das darin besteht, Riluzol oder sein Derivat oder seine pharmazeutisch akzeptierbaren Salze mit einem oder mehreren kompatiblen und pharmazeutisch akzeptierbaren Lösungsmitteln und/oder Adjuvantien zu vermischen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in den nachstehenden Beispielen erläutert.
I – VERFAHREN.
1/Tiere.
Die pigmentierten Brown-Norway-Ratten (Charles River-Zucht) zu 250 bis 300 g wurden wegen ihres hohen Melaningehalt im Auge ausgewählt, was eine erhöhte Effizienz der therapeutischen Versuche ermöglicht.
2/Modell der Ischämie durch intraokulare Druckerhöhun
Die Ratten werden mit einer intraperitonealen Injektion mit 6% Pentobarbital (100 ml/100 g) anästhesiert. Nach der Instillation eines Tropfens Oxybuprocain (Chauvin-Labor), um die Pupille zu erweitern und somit das Kontrollieren des Augenhintergrunds durch direkte Ophtalmoskopie zu ermöglichen, wird eine 30-Gauge-Heparinnadel in die vordere Augenkammer in Höhe des Limbus positioniert. Sie ist mit einem Behältnis verbunden, dass eine isotonische Salzlösung enthält (Hank's Balance Sal Solution), eine Wassersäule, die durch Elevation das Erzielen eines erhöhten Augeninnendrucks von ca. 130 mm Hg ermöglicht. Die Zeit bis zur Feststellung der Ischämie beträgt 30 Minuten. Die ausgewählten Reperfusionszeiten sind 2 und 7 Tage.
3/Behandlung der Tiere
In einem ersten Schritt des Experiments wird Riluzol (8 mg/kg, Research Biochemicals International) das zunächst in 0,1 N Salzsäure aufgelöst und dann in physiologische Kochsalzlösung verdünnt wurde, intraperitoneal 30 Minuten vor (IP-Vorbehandlung) oder 30 Minuten nach der Ischämie (IP-Nachbehandlung) und jeweils einmal täglich bis zum Ende des Experiments injiziert.
In einem zweiten Schritt des Experiments wird eine 0,02%ige Riluzollösung (20 μl), verdünnt in „Hanks Balanced Salt Solution" 30 Minuten vor (Topical-Vorbehandlung) oder direkt nach der Ischämie (Topical-Nachbehandlung) und jeweils zweimal täglich bis zum Ende des Experiments lokal im Auge angewandt.
4/Verfahren der Elektroretinographie
a) Prinzip
Das Auge zeichnet sich im Ruhezustand durch einen dauerhaften Potentialunterschied, das sogenannte Korneoretinalpotential, zwischen der positiven Hornhaut und dem negativen Hintergrund des Augapfels aus. Das Elektroretinogramm (ERG) erfasst dieses Wirkpotential an der Oberfläche des Auges. Mehrere Zellen wirken bei dessen Erstellung mit. Es handelt sich also um eine globale elektrische Antwort. Das erfasste Signal, das verarbeitet und verstärkt wird, kann sich in zwei aufeinanderfolgende Wellen zerlegen:
Die negativ gepolte Welle „a", die von den Fotorezeptoren erzeugt wird (Hyperpolarisierung der Membran durch die Veränderung der Pigmentmoleküle durch Photoneneffekt, die zu einem ionischen Ungleichgewicht führt).
Die positiv gepolte Welle „B", die im wesentlichen von den Müllerschen Zellen (durch Depolarisierung) erzeugt wird.
Die positiv gepolte, sehr langsame Welle „c" erscheint erst spät und wird zum Teil durch das pigmentierte Epithel als Antwort auf eine Stimulierung der Stäbchenzellen erzeugt.
Retinalischämie führt zu Beeinträchtigungen des Ionenaustauschs in den Zellen und folglich der Signalübertragung. Handelt es sich um eine ausgeprägte, lang anhaltende Ischämie, kommt es zu einem Verlust der elektrischen Aktivität, der irreversibel werden und zu Blindheit führen kann.
b) Technik.
Die Tiere werden 4 Stunden vor dem Experiment an die Dunkelheit gewöhnt. Die Elektroretinographie wird im Dunkeln an der anästhesierten Ratte nach der Erweiterung der Pupillen durch Instillation einer Tropfens Mydriaticum (0,5% Tropikamid, Chibret laboratory) durchgeführt. Eine Kontaktlinse mit Silberchloridring wird auf die Kornea gelegt (die zuvor lokal durch einen Tropfen Oxybuprocainhydrochlorid 0,04% betäubt wird). Die Bezugselektrode besteht aus einer Silber/Silberchloridnadel, die in das Ohr des Tiers eingeführt wird. Vor der Durchführung der Retinalischämie wird eine elektroretinographische Grundmessung durchgeführt.
Die Lichtstimuli werden durch ein Stroboskop erzeugt, das in 20 cm Entfernung vom Auge entfernt in der visuellen Achse positioniert wird. Der weiße Lichtblitz dauert 10 μSekunden. Er hat eine Lichtstärke von 5 × 10^–4 cd/m² (cd ist das Symbol für Candela, die Lichtstärkeeinheit des internationalen Einheitensystems).
Nach der Stimulierung durch einen Blitz wird das elektrische Signal durch einen Differentialverstärker erfasst (Verstärkung × 1000, 0,1–500 Hz), auf einem Digital-Analogoszilloskop angezeigt und in einen IBM-Computer übertragen. Eine Software ermöglicht die Erfassung der Daten, sowie die Bestimmung der Amplituden und Latenzzeiten der verschiedenen Wellen des Elektroretinogramms (ERG). Die ERG werden in einem Abstand von je 4 Minuten vor der Ischämie, während der Ischämie und 2 und 7 Tage nach der Ischämie aufgezeichnet. Für jede analysierte Reperfusionszeit wurden sechs Ratten untersucht. Die zur Auswertung des ERG herangezogenen Parameter sind die Amplitude der Welle, gemessen in μV von der Grundlinie bis zum Tiefstpunkt der Linie (für Welle „a) und von diesem Tiefstpunkt bis zur Spitze (bei Welle „b"). Fünfzehn hintereinander erfolgte Antworten werden aufgezeichnet, die Durchschnittswerte berechnet und statistisch nach dem „Mann Witney U" Test pro Rattengruppe analysiert. Die ERG- Wellenwerte für „a" und „b" werden in Prozent des Ausgangswertes ausgedrückt.
II – HISTOPATHOLOGIE
a) Argyrophile Silberimprägnationsfärbung
Diese spezielle Färbung soll den Neuronentod durch Nekrose aufzeigen. Sie wird an 7 μm-Retina-Schnittpräparaten inklusive im Paraffin nach einem von Galyas und Koll. beschriebenen Standardprotokoll (23) vorgenommen. Die histologische Analyse erfolgt eine Woche nach der Ischämie.
b) Apoptose-Test nach dem TUNEL-Verfahren (TdT-mediated dUTP nick end labelling).
Die Technik für die Erkennung und Mengenbestimmung der Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, basiert auf der DNA-Fragmentierung. Sie wird nach der Methode von Gravrieli und Koll. (24) mit Hilfe des von Boerhinger Mannheim kommerzialisierten Sets „In Situ Cell Death Detection" durchgeführt.
III – ERGEBNISSE
1) Elektroretinographie
1 zeigt die Elektroretinogramme (ERGs) von 6 Kontroll- und Versuchsratten (mit Riluzol behandelt), die 30 Minuten nach der durch intraokulare Druckerhöhung induzierten Ischämie aufgezeichnet wurden. Die ERGs werden vor der Ischämie, nach 2 Tagen und nach 7 Tagen Reperfusion aufgezeichnet. Die Behandlung mit Riluzol wird als „Vor- und Nachbehandlung IP" und „Lokale Vor- und Nachbehandlung„ angegeben. Ein Mittel von 15 Versuchen hintereinander als Reaktion auf die Stimulation.
In 2 ist die Wirkung der Ischämie mit einer Reperfusionszeit von 2 und 7 Tagen auf die Amplitude der Wellen „a" und „b" des ERG der Kontrollratten und der mit Riluzol behandelten Ratten dargestellt (IP = Intraperitoneale Injektion oder topikal = lokale Instillation 30 Minuten vor (Vorbehandlung) oder 30 Minuten nach der Ischämie (Nachbehandlung). Das Riluzol wird in der Reperfusionszeit täglich verabreicht. Die Amplituden der Wellen „a" und „b" werden in Prozent der jeweiligen präischämischen Werte ausgedrückt (% of control). Die signifikanten statistischen Unterschiede zwischen den Kontrollratten und den behandelten Ratten sind durch Asterixe gekennzeichnet (P < 0.01 versus Kontrollratte, n = 6, Mann Witney U test).
3 zeigt Fotomikrographien, auf denen die Morphologie der nach der Silberimprägnationsmethode kolorierten Retina bei den Kontrollratten (a), ischämischen unbehandelten Ratten (b) und ischämischen, lokal mit Riluzol behandelten Ratten (c) zu sehen sind und welche nach 7 Tagen Reperfusion beobachtet wurden. Die durch die Pfeile angezeigten Silbergranulaniederschläge erscheinen in der Ganglienschicht (GCL), in den inneren Kernschichten (INL) und den äußeren Kernschichten (ONL) der beschädigten Retina.
4 zeigt Fotomikrographien, auf denen apoptotische Zellen zu sehen sind, die durch das TUNEL-Verfahren in den Retina-Schnittpräparaten der Ratte nach 30 Minuten Ischämie-Reperfusion und der Wirkung von Riluzol bei lokaler Anwendung festgestellt wurden. In der Retina der Kontrollratte (a) gibt es keine apoptotische Zelle. Nach 30-minütiger, durch intraokulare Druckerhöhung hervorgerufene Ischämie erscheint die spezifische Markierung der apoptotischen Zellen (Pfeile) in der Ganglienschicht (CGL) nach zweitägiger Reperfusion (b) und zusätzlich in den inneren und äußeren Kernschichten (INL) nach viertägiger Reperfusion (c). In der Retina der mit Riluzol behandelten Ratte (d) sind nach 30 Minuten Ischämie und 4-tägiger Reperfusion überhaupt keine apoptotischen Zellen vorhanden.
In 1 werden die ERG-Profile der Kontrollratten und der behandelten Ratten direkt vor und 2 Tage bzw. 7 Tage nach der Ischämie miteinander verglichen. Die kontrollierten ERGs der verschiedenen Gruppen von Ratten sind stabil und nicht signikant abweichend von den Grundwerten. Während der durch intraokuläre Druckerhöhung 30 Minuten lang induzierten Ischämie wird die Linie der Wellen „a" und „b" flach (nicht dargestellt). Während der Reperfusion bei Unterlassen einer Riluzol-Behandlung erholen sich die Wellen „a" und „b" langsam (1 und 2). Zwei Tage nach der Ischämie beträgt die Amplitude der Wellen „a" und „b" jeweils 38% und 26% des Ausgangswertes. Nach einer Reperfusionszeit von einer Woche stabilisiert sich die Amplitude der Wellen „a" und „b" jeweils auf 27% und 37% der Ausgangswerte.
Die aufgezeichneten ERGS bei nicht-ischämischen, jedoch mit Riluzol behandelten Ratten bleiben im Laufe der Zeit unverändert und die Amplitude der Wellen „a" und „b" wird durch die Behandlung nicht beeinflusst (1). In allen Gruppen behandelter Ratten verhindert Riluzol die Veränderung der durch Ischämie induzierten Wellen „a" und „b" (1 und 2). Sieben Tage nach der Ischämie hat die Amplitude der Wellen „a" und „b" bei den Kontrollratten ungefähr 40% der Ausgangswerte erreicht, wohingegen sie bei den behandelten Ratten zwischen 65% und 95% liegt. Die Art der Riluzol-Verabreichung (intraperitoneale Injektion oder lokale Behandlung) und der Zeitpunkt der Behandlung (vor oder nach der Ischämie) scheinen nach einer langen Reperfusionszeit (7 Tage) keine größeren Auswirkungen auf die Erholung von Welle „b" zu haben. In sämtlichen Fällen beträgt die Amplitude der Welle „b" ca. 75% des Kontrollwerts. In kürzeren Reperfusionszeiten (2 Tage nach der Ischämie), gewährleistet vor der Ischämie lokal angewendetes Riluzol eindeutig den wirksamsten Schutz ( 2). Die Erholung von Welle „a" ist bei den mit Riluzol behandelten Ratten auch nach einer Woche Reperfusion ausgezeichnet. Die beste Erholung der Amplitude von Welle „a" wird erzielt, wenn Riluzol vor der Ischämie verabreicht wird, sowohl mit intraperitonealer als auch lokaler Behandlung, und nach 2 Tagen oder 7 Tagen Reperfusion.
2) Histopathologie
Der neuronale Tod durch Ischämie erfolgt durch Nekrose und Apoptose. Nekrose wird durch die argyrophile Färbung in Form von sichtbaren Silbergranulaniederschlägen im Zellkern nachgewiesen. Auf der Retina der Kontrollratten (3a) erscheint keine Färbung. Auf 3b dagegen ist zu sehen, dass die Retinazellen durch die Ischämie stark beschädigt sind. In der Schicht der Ganglienzellen (GCL), der inneren Kernzellen (INL) und der äußeren Kernzellen (ONL) erscheinen nach der Ischämie und nach 7 Tagen Reperfusion Silbergranulaniederschläge. 3c zeigt den spektakulären Effekt von Riluzol. Eine Behandlung vor und/oder nach der Ischämie intraperitoneal injiziert oder lokal angewendet schützt die Retina vollständig vor Ischämie. 3c zeigt, dass nach einer lokalen Anwendung von Riluzol 30 Minuten nach der Ischämie und nach 7 Tagen Reperfusion in den Zellen der 3 Netzhautschichten, die bekannt dafür sind, nach einer Ischämie verletzt zu sein, keine Silbergranulaniederschläge auftreten.
Der Apoptoseprozess wird mithilfe der DNA-Fragmentierungs-Methode, dem sogenannten TUNEL-Verfahren nachgewiesen. Die apoptotischen Zellen werden in Form einer dunkelrosa gefärbten Kernkondensation hervorgehoben. Die Retina der Kontrollratten weist keine Färbung auf (4a). Die Retina-Schnitte der „ischämischen" Ratten weisen Apoptose nach der Ischämie und nach 2 Tagen Reperfusion in der Ganglienschicht (GCL) auf (4b) und nach 4 Tagen Reperfusion in den inneren (INL) und äußeren Kernschichten (ONL) (4c). Diese Apoptoseuntersuchung zeigt wiederum auf, dass Riluzol einen Neuroschutz bewirkt. Die systemische und lokale Verabreichung von Riluzol mindert den Tod durch Apoptose erheblich. 4d zeigt, dass vier Tage nach einer lokalen Riluzolanwendung 30 Minuten nach der Ischämie die apoptotischen Zellen in der Ganglienschicht und den Schichten der Fotorezeptoren praktisch komplett verschwunden sind.
III – SCHLUSSFOLGERUNG.
Das Modell der durch intraokulare Druckerhöhung induzierten Ischämie wird zur Untersuchung sowohl der Mechanismen als auch der potentiellen Therapien der Retinalischämie am häufigsten benutzt. Der Verletzungsgrad der Retina ist abhängig von der Tierspezies, der Dauer und der Stärke des auferlegten Augendrucks. In vorliegender Studie wird dieses Modell auf die Ratte 30 Minuten lang mit einem Augeninnendruck von 130 mm Hg angewendet, um Ischämie hervorzurufen. Die elektrische Antwort der Retina ist stark verändert und die zum Tod der Retinazellen führenden Mechanismen sind bereits in Gang gesetzt. Die im Rahmen dieser Erfindung durchgeführten Forschungsarbeiten zeigen anhand der Untersuchung der ERGs zur Beurteilung der Retinaschäden erstmals die spektakuläre Neuroschutzwirkung von Riluzol gegenüber Retinalischämie auf. Bis heute gab es keine wirksame Behandlung gegen die ischämisch bedingte Degeneration der Retina. Vorliegende Forschungsarbeiten zeigen, dass Riluzol sowohl bei systemischer als auch bei lokaler Verabreichung die Erholung der Wellen „a" und „b" des ERGs verglichen mit einer unbehandelten Ratte spektakulär verbessert. Nach einer Vor- und selbst einer Nachbehandlung mit Riluzol bei lokaler Anwendung stimmen die Wellen „a" und „b" fast mit den Amplituden der Zellen der Kontrolltiere nach einwöchiger Reperfusion überein.
Der neuronale Tod durch Ischämie wird durch Apoptose und/oder Nekrose, zwei ganz unterschiedliche Arten des Zelltodes, erzeugt, die sowohl aktive als auch passive Mechanismen beinhalten. In diesen Forschungsarbeiten werden die apoptotischen Mechanismen über das TUNEL-Verfahren erkannt, das die DNA-Fragmentierung in den Zellkernen markiert. Die nekrotischen Neuronen werden durch Silberimprägnationsfärbung sichtbar gemacht, bei der in den sich degenerierenden Neuronenkernen Silbergranulaniederschläge sichtbar werden. In den Schichten GCL, INL und ONL der Retina von Ratten, bei denen der Augeninnendruck erhöht wurde, sind zahlreiche apoptotische Zellen und argyrophile Neuronen ersichtlich. Riluzol verhindert zum einen eindeutig Nekrose und Gliosis-Reaktionen und reduziert zum andern erheblich das Phänomen der Apoptose. Die lokale Anwendung ist im Vergleich zu einer systemischen (intraperitonealen) Injektion das wirksamste Mittel zum Schutz der Retina. Die Vorbehandlung mit lokal angewendetem Riluzol (vor der Ischämie) führt bei kürzeren Reperfusionszeiten zu einem Neuroschutzeffekt, wohingegen eine Nachbehandlung bei lokaler Anwendung wirksamer bei längeren Reperfusionszeiten ist. Die hier erläuterten Ergebnisse (Schutz und lokale Behandlung) beschreiben Riluzol als ein wichtiges potentielles Molekül in der Augenheilkunde. Diese Wirkungen lassen sich auf andere schwere Netzhauterkrankungen anwenden, wie z.B. grünen Star, Pigmentretinopathie und altersbedingte makuläre Degeneration (AMD). In allen diesen Pathologien hat Riluzol eine Neuroschutzwirkung.

Claims

Gebrauch von Riluzol oder seinen aktiven Derivaten im Neuroschutz oder den pharmazeutisch akzeptierbaren Salzen dieser Zusammensetzungen, für die Vorbereitung von Medikamenten bestimmt zur Behandlung der Krankheiten verbunden mit einer Ischämie der Netzhaut.
Gebrauch nach Anspruch 1, charakterisiert dadurch dass besagte Medikamente bestimmt sind zur Behandlung der arteriellen oder venösen Okklusion der Netzhaut, der Augenquetschungen, der altersbedingten makulären Degeneration, des grünen Stars, der diabetischen Retinopathie, der Retinotherapie der Frühgeburt, der entzündlichen Krankheiten und der Blutkrankheiten.
Gebrauch nach einem der Ansprüche 1 oder 2, charakterisiert dadurch dass besagte Medikamente bestimmt sind zur lokalen Behandlung im Auge.