DE69925264T2

DE69925264T2 - Fullerenverbindungen

Info

Publication number: DE69925264T2
Application number: DE69925264T
Authority: DE
Inventors: Eiichi Bunkyo-ku NAKAMURA; Masaya Bunkyo-ku SAWAMURA; Hiroyuki Bunkyo-ku ISOBE
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: NAKAMURA, EIICHI, TOKIO/TOKYO, JP; Astellas Pharma Inc
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2019-03-11
Also published as: WO1999046235A1; US20040214218A1; EP1069107B1; DE69925264D1; US6765098B1; EP1069107A4; EP1069107A1; US7018599B2; EP1420066A3; ATE295345T1; EP1420066A2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fulleren-Derivat, welches DNA-Kompaktierungs-Aktivität aufweist und als DNA-Kompaktionsreagenz nützlich ist, neben anderen Verwendungen, und beispielsweise in der pharmazeutischen Industrie anwendbar ist.
Stand der Technik
DNA-Kompaktion in einem Protein-DNA-Komplex, wie die Anordnung von DNAs auf einem Chromosom, ist ein sehr wichtiges Thema der biochemischen Forschung. Kompaktion durch organische Mikromoleküle und anorganische Ionen ist ebenfalls ein wichtiger Gegenstand der Forschung, der für die Transfektion relevant ist [z.B. Yoshikawa, Y. et al., FEBS Letters, 1995, 361: 277–281 und FEBS Letters, 1996, 396: 71–76; Behr, J-P, Acc. Chem. Res., 1993, 26: 274–278].
Als DNA-Träger geeignete Polyamin-Copolymere wurden von Asayama et al. beschrieben (Bioconjugate Chem, 1997, 8: 833–838).
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Mittel zur DNA-Kompaktion.
Offenbarung der Erfindung
Bisher wurde eine Technologie zur Anwendungs-maßgeschneiderten Modifikation von Fulleren bereitgestellt, und es wurde eine Vielzahl von Fulleren-Derivaten hergestellt [z.B. Friedman, S. H. et al. J. Am. Chem. Soc., 1993, Band 115, 6506–6509; Yamago, S. et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, Band 116, 1123; Taki, M. et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, Band 119, 926; An. Y. Z. et al., Tetrahedron, 1996, Band 52, 5179–5189; Nakamura, E. et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1996, Band 69, 2143–2151; Yamago, S. et al., Chemistry Leiters, 1996, 395–396; Murata, Y. et al., The 2nd International Forum on Chemistry of Functional Organic Chemicals (IFOC-2), 1997, P-31, Tokyo, Japan, usw.].
Weitere Quellen für die Beschreibung von Fullerenen und Fulleren-Derivaten sind WO-A-94/25424, WO-A-95/09564, WO-A-96/09275, WO-A-96/36631, DE-A-43 12 475, US-A-5 679 861 und EP-A-0 770 577.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten, dass unter diesen Fulleren-Derivaten Fulleren-Derivate mit 1 bis 4 stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette(n), einschließlich von Salzen davon, amphiphil sind und eine außergewöhnlich hohe DNA-Kompaktierungs-Aktivität aufweisen, und haben dementsprechend die vorliegende Erfindung entwickelt.
1. Struktur der erfindungsgemäß verwendeten Fulleren-Derivate
Das erfindungsgemäß verwendete Fulleren-Derivat ist ein Fulleren-Derivat mit 1 bis 4 stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette(n). Dieses Fulleren-Derivate schließt nicht nur im folgenden beschriebene neue Verbindungen ein, sondern auch bekannte Verbindungen.
Die DNA-Kompaktierungs-Aktivität der Fulleren-Derivate ist das Ergebnis eines Wechselspiels der Größe und Hydrophobizität des Fullerens und der Affinität der stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette(n) des Derivats für die Phosphatgruppe. Es wird angenommen, dass die Wechselwirkung zwischen Fulleren und hydrophoben Einheiten einer DNA (z.B. Hauptfurche der DNA) und die Wechselwirkung zwischen den stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette(n) und der Phosphatgruppe der DNA eine Biegung und Faltung der DNA-Einzelmoleküle verursacht, und dass die hydrophoben Einheiten einer großen Anzahl solcher gefalteten DNA-Einzelmoleküle koaleszieren, so dass die Kompaktion verursacht wird.
Daher kann das molekulare Design eines Fulleren-Derivats von Fachleuten frei ausgewählt werden, wobei die obigen Mechanismen in Betracht gezogen werden. Die DNA-Kompaktierungs-Aktivität des dementsprechend hergestellten Fulleren-Derivats kann durch Elektrophorese einer Mischlösung des Fulleren-Derivats und einer DNA (z.B. Plasmid-DNA) und Messung der Menge an DNA beurteilt werden. Da diese Kompaktierungs-Aktivität des Fulleren-Derivats eng mit der hohen Bindungsaffinität des Derivats für DNA in Verbindung steht, kann ein Screening durch ein Ethidiumbromid-Verdrängungsassay unter Verwendung von Kälberthymus-DNA durchgeführt werden.
Während das Fulleren-Derivat in Form eines Salzes verwendet werden kann, ist das Salz bevorzugt ein konventionelles nicht-toxisches Salz, insbesondere ein pharmazeutisch verträgliches Salz. Genauer gesagt schließt das Salz Salze anorganischer Säuren (z.B. Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat usw.), Salze organischer Carbonsäuren oder Sulfonsäuren (z.B. Formiat, Acetat, Trifluoracetat, Maleat, Tartrat, Fumarat, Methansulfonat, Benzolsulfonat, Toluolsulfonat usw.), und Salze mit basischen oder Aminosäuren (z.B. Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure usw.) ein.
Das Fulleren-Derivat kann aufgrund der Anwesenheit von asymmetrischem Kohlenstoff und molekularer Asymmetrie als verschiedene Isomere auftreten, und alle diese fallen unter das Konzept des erfindungsgemäß verwendeten Fulleren-Derivats.
Das erfindungsgemäß verwendete Fulleren des Fulleren-Derivats ist nicht auf [60]Fulleren beschränkt, sondern schließt auch Fullerene höherer Ordnung ein (z.B. [70]Fulleren usw.).
Die bevorzugte stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette schließt eine Kohlenwasserstoffgruppe ein, welche 1 oder 2 geradkettige oder verzweigtkettige Substituenten-Gruppen aufweist, welche jeweils 1 bis 10 Stickstoffatom(e) und 2 bis 30 Kohlenstoffatome umfassen, und ist so konfiguriert, dass sie an ein oder zwei der 2 bis 8 sp³-Kohlenstoffatome gebunden ist, die am Fulleren-Kern vorliegen. Bevorzugter ist eine Kohlenwasserstoffgruppe, welche 1 oder 2 geradkettige oder verzweigtkettige Substituenten-Gruppe(n) aufweist, welche jeweils 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome umfassen, und ist so konfiguriert, dass sie an zwei der 2 bis 8 sp³-Kohlenstoffatome gebunden ist, die am Fulleren-Kern vorhanden sind.
Die Aminogruppe in der stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette kann primär, sekundär oder tertiär sein und kann eine stickstoffhaltige heterocyclische Gruppen bilden [wie eine 3 bis 8- (bevorzugt 5- oder 6-)-gliedrige ungesättigte heteromonocyclische Gruppe, enthaltend 1 bis 4 Stickstoffatom(e) (z.B. Pyrrolyl, Pyrrolinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Dihydropyridyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, Triazolyl, Tetrazolyl); und ungesättigte kondensierte heterocyclische Gruppen, enthaltend 1 bis 4 Stickstoffatom(e) (z.B. Indolyl, Isoindolyl, Indolidinyl, Benzimidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Indazolyl, Benzotriazolyl, Acridinyl)]. Darüber hinaus kann sie gegebenenfalls durch Niederalkyl oder ähnliches substituiert sein.
Die oben erwähnte stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette kann als ihre Gerüstatome und/oder Substituenten weitere Heteroatome aufweisen wie Sauerstoff, Schwefel usw..
Wenn darüber hinaus zwei oder mehr stickstoffhaltige Seitenketten vorliegen, kann eine vernetzende Alkylen-Einheit existieren, die diese stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenketten verbrückt.
Die Kohlenwasserstoffgruppe der stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette schließt geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppen ein, entweder gesättigt oder ungesättigt, und ist bevorzugt eine Kohlenwasserstoffgruppe aus 1 bis 20 Kohlenstoffatom(en), bevorzugter 1 bis 15 Kohlenstoffatom(en).
Die spezifische Struktur der stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette schließt die folgenden ein (der Fulleren-Kern ist ebenfalls gezeigt), wobei sie nicht darauf beschränkt ist.
In den obigen Formeln können Rs gleich oder verschieden sein und stellen jeweils eine geradkettige oder verzweigt-kettige Acylgruppe dar, umfassend 1 bis 10 Stickstoffatom(e) und 2 bis 30 Kohlenstoffatom(e) [bevorzugter [N-(N,N-Di(nieder)alkylamino)(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkanoyl-Gruppen, [N-(N-(Nieder)alkylamino)(nieder)-alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkanoyl-Gruppen, [N-Pyrrolyl(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkanoyl-Gruppen, [N-(N,N-Di(nieder)alkylamino)(höher)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkanoyl-Gruppen, [N-(N-(Nieder)alkylamino)(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(höher)alkanoyl-Gruppen, [N-Pyrrolyl(höher)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(höher)alkanoyl-Gruppen; Gruppen der Formel;
(wobei R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ in den unterschiedlichen Vorkommen jeweils gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff oder eine Niederalkylgruppe darstellen; A eine Alkylengruppe darstellt; Y CH oder N darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt)]; geradkettige oder verzweigtkettige (C₂-C₃₀)Alkylgruppen, umfassend 1 bis 10 Stickstoffatom(e) und 2 bis 30 Kohlenstoffatome [bevorzugter [N-(N,N-Di(nieder)alkylamino)(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkyl-Gruppen, [N-(N-(Nieder)alkylamino)(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkyl-Gruppen, [N-Pyrrolyl(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkyl-Gruppen, [N-(N,N-Di(nieder)alkylamino)(höher)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(nieder)alkyl-Gruppen, [N-(N-(Nieder)alkylamino)(nieder)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(höher)alkyl-Gruppen, [N-Pyrrolyl(höher)alkyl-N-(nieder)alkyl]amino(höher)alkyl-Gruppen; oder Gruppen der Formel:
(worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, A, Y und n jeweils wie oben definiert sind; A' eine Alkylengruppe darstellt)].
Ar stellt eine Arylgruppe dar (z.B. Phenyl, Naphthyl, Anthryl, usw.);
R' stellt Wasserstoff oder eine Niederalkylgruppe dar;
Ra und Rb können gleich oder verschieden sein und stellen jeweils Wasserstoff oder eine Niederalkylgruppe dar, oder Ra und Rb können gemeinsam und zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, ein 3- bis 6-gliedrige Cycloalkylgruppe darstellen.
A, A¹, A² und A³ können gleich oder verschieden sein und stellen jeweils eine Alkylengruppe dar;
X stellt -O-, -N- oder -S- dar; und
m stellt eine ganze Zahl von 0 oder 1 dar.
Es sollte jedoch so verstanden werden, dass die verschiedenen stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenketten, die oben erwähnt werden, nur Beispiele sind und dass als Struktur zwischen „dem Fulleren-Kern" und „der Gruppe der Formel"
die verschiedenen bekannten Strukturen selektiv verwendet werden können, die von den oben illustrierten verschieden sind.
Die Niederalkylgruppe oder Niederalkyleinheit im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließt geradkettige oder verzweigtkettige Gruppen mit jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en) ein wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert-Pentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl usw.
Die Alkylengruppe schließt geradkettige oder verzweigt-kettige Gruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatom(en) ein, wie Methylen Ethylen, Trimethylen, 2-Methyltrimethylen, Tetramethylen, Ethylethylen, Pentamethylen, 3-Methylpentamethylen, Hexamethylen, 2-Ethyltetramethylen, Heptamethylen, Octamethylen, Nonamethylen, Decamethylen usw. ein.
Die Höheralkylgruppe oder Höheralkyleinheit schließt geradkettige oder verzweigt-kettige Gruppen mit jeweils 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ein wie Heptyl, Octyl, 2-Ethylhexyl, Nonyl, Decyl, 3, 7-Dimethyloctyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, 3-Methyl-10-ethyldodecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl, Nonadecyl, Eicosyl usw. ein.
Die Anzahl der stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenketten am Fulleren-Kern ist bevorzugt 1 bis 4, und die Anwesenheit einer oder zweier solcher Seitenketten ist besonders bevorzugt. Wenn nur eine Seitenkette verwendet werden soll, ist es bevorzugt, eine Seitenkette auszuwählen, die eine relativ große Anzahl von Stickstoffatomen enthält (bevorzugt 4 oder mehr N-Atome). Besonders bevorzugt ist ein Polypyrrol, welches eine vergleichsweise hohe Bindungsaffinität aufweist. Wenn zwei Seitenketten beteiligt sind, ist die Verwendung von Alkylpolyaminen, welche 2 bis 8 Stickstoffatome enthalten, und die vergleichsweise wenig hydrophil sind, bevorzugt.
Von den verschiedenen oben beschriebenen Fulleren-Derivaten können geeignete Derivate unter Berücksichtigung der Leichtigkeit der Synthese und der Bindungsaffinität für DNA neben anderen Faktoren geeignet ausgewählt werden, basierend auf der bisher verfügbaren Information können jedoch Derivate der folgenden allgemeinen Formel (I), einschließlich ihrer Salze erwähnt werden.
[wobei zwei Rs gleich oder verschieden sein können und jeweils eine geradkettige oder verzweigt-kettige Acylgruppe mit 1 bis 10 Stickstoffatom(en) und 2 bis 30 Kohlenstoffatomen oder Wasserstoff darstellen (vorausgesetzt jedoch, dass die zwei Rs nicht gleichzeitig Wasserstoff darstellen)].
Als bevorzugtere Beispiele für das Fulleren-Derivat können bald Derivate der allgemeinen Formel (I) erwähnt werden, wobei zwei Rs gleich oder verschieden sind und jeweils eine geradkettige oder verzweigt-kettige Acylgruppe mit 2 bis 8 Stickstoffatomen und 2 bis 30 Kohlenstoffatomen als Gerüstatome umfassen.
Als noch bevorzugtere Beispiele für das Fulleren-Derivat können Derivate der allgemeinen Formel (I) genannt werden, wobei die beiden Rs gleich oder verschieden sind und jeweils eine geradkettige oder verzweigtkettige Acylgruppe darstellen, welche 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome als Gerüstatome aufweist.
Weiter haben erfindungsgemäße Fulleren-Derivate die folgende allgemeine Formel (II):
[wobei R eine geradkettige oder verzweigtkettige Acylgruppe mit 1 bis 10 Stickstoffatom(en) und 2 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellt und R' Wasserstoff oder eine Niederalkylgruppe darstellt], einschließlich ihrer Salze.
Als bevorzugtere Beispiele für das Fulleren-Derivat können Derivate der allgemeinen Formel (II) genannt werden, wobei R eine geradkettige oder verzweigt-kettige Acylgruppe darstellt, umfassend 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 30 Kohlenstoffatome.
Die noch bevorzugteren Beispiele für das Fulleren-Derivat sind Derivate der allgemeinen Formel (II), wobei R eine geradkettige oder verzweigtkettige Acylgruppe umfassend 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome darstellt.
2. Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Fulleren-Derivats
Die oben genannten Fulleren-Derivate und Salze der vorliegenden Erfindung können durch die den Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt werden, entweder als solche oder geeignet modifiziert, entsprechend den jeweiligen gewünschten Strukturen [siehe oben oder unten zitierte Literatur].
Das Verfahren zur Herstellung von Fulleren-Derivaten wird nun in größerem Detail beschrieben, wobei Fulleren-Derivate mit einer oder zwei stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenketten als Beispiele genommen werden.
Verfahren A (eine Seitenkette)
Das Organo-Fulleren (Methano-Fulleren, Propano-Fulleren), welches erhältlich ist durch Durchführung der bekannten Reaktion der aus einem Cyclopropenonacetal erzeugten Vinylcarben-Spezies mit Fulleren (Literatur 1; Tokuyama, H.; Isobe, H.; Nakamura, E., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1995, Band 68, 935–941) wird einer Transformationsreaktion der funktionellen Gruppe unterzogen, um eine stickstoffhaltige Seitenkette einzuführen. Methano-Fulleren und Propano-Fulleren werden jeweils in hydroxyhaltige Organo-Fullerene durch das Verfahren umgewandelt, welches im Fall von Methano-Fulleren Zugabe von Wasser nach der Reaktion der Vinylcarben-Spezies umfasst, um das Ketenacetal zu hydrolysieren, und durch das Verfahren, welches hydrolytische Entfernung des Acetals mit Hilfe des Schwefelsäure-Katalysators in Wasser/Tetrahydrofuran/Chlorbenzol und anschließende Reduktion mit Diisobutylaluminiumhydrid umfasst. Das angestrebte Fulleren-Derivat kann durch Durchführung einer Transformation der funktionellen Gruppe mit der so erzeugten Hydroxylgruppe hergestellt werden.

1. Bekannte Reaktion (Literatur 2, Nakamura, E.; Tokuyama, H.; Yamago, S.; Shiraki, T.; Sugiura, Y., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1996, Band 69, 2143–2151). Durch Kupplungsreaktion von Bernsteinsäureanhydrid und einem hydroxyhaltigen Organo-Fulleren wird das Carbonsäure-Derivat hergestellt. Diese Carbonsäure und eine Amin-Verbindung mit einer primären oder sekundären Amino-Funktion werden einer Kupplungsreaktion zur Herstellung des angestrebten Produktes unterzogen. Als oben erwähnte Amin-Verbindung kann ein Polypyrrol-Derivat in Analogie zum in Literatur 2 beschriebenen Netropsin-Derivat, ein Polyamin wie ein Alkylspermidin oder ähnliches und sogar Acridin oder ähnliches verwendet werden, das in das DNA-Basenpaar einschiebbar ist.
2. Ein α-Halogensäurehalogenid wird an ein Hydroxylgruppen enthaltendes Organo-Fulleren gekuppelt (Literatur 3: Boutorine, A. S.; Tokuyama, H.; Takasugi, M.; Isobe, H.; Nakamura, E.; Helene, C., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1994, Band 33, 2462–2465; Literatur 4: An, Y. Z.; Chen, C. H. B.; Anderson, J. L. Sigman; D. S. Foote, C. S.; Rubin, Y., Tetrahedron, 1996, Band 52, 5179–5189), um eine α-Halocarbonyl-Verbindung herzustellen. Das angestrebte Produkt kann durch Kuppeln dieses Halogenids mit einer Amin-Verbindung hergestellt werden, welche eine primäre oder sekundäre Amino-Funktion aufweist.

Als diese Amin-Verbindung können die vorstehend genannten spezifischen Amin-Verbindungen eingesetzt werden.
Diese Verfahren können bei den bekannten hydroxyhaltigen Fulleren-Derivaten angewendet werden (Literatur 4 wie oben angegeben; Literatur 5: Tokuyama, H.; Yamago, S.; Nakamura, E.; Shiraki, T.; Sugiura, Y., J. Am. Chem. Soc., 1993, Band 115, 7918–7919).
Verfahren B (2 Seitenketten)
Ein Fulleren-Derivat mit potenterer DNA-Kompaktierungs-Aktivität kann aus einem Organo-Fulleren (Bispropanofulleren) hergestellt werden, welches durch Durchführung der bekannten Reaktion eines Biscyclopropenonacetals mit einem Fulleren erhalten wird (Literatur 6: Isobe, H.; Tokuyama, H.; Sawamura, M.; Nakamura, E., J. Org. Chem, 1997, Band 62, 5034–5041) in Verbindung mit dem Verfahren des Verfahrens A durch Durchführung einer Transformation der funktionellen Gruppe, um dadurch hydrophile Reste einzuführen. Die Transformation der funktionellen Gruppe des Bispropano-Fullerens wird wie oben erwähnt durch hydrolytische Entfernung des Acetals in Gegenwart des Schwefelsäure-Katalysators in Wasser/Tetrohydrofuran/Chlorbenzol und anschließende Reduktion mit Diisobutylaluminiumhydrid durchgeführt, wodurch das Bispropano-Fulleren in einOrgano-Fulleren mit einem Hydroxylgruppenpaar umgewandelt wird. In diesem Verfahren wird eine Mischung aus 8 verschiedenen Isomeren einschließlich Diastereomeren erhalten, und das angestrebte Fulleren-Derivat kann durch Durchführung derselben Transformation der funktionellen Gruppe wie oben hergestellt werden.

1. Bernsteinsäureanhydrid wird mit einem hydroxyhaltigen Organo-Fulleren gekoppelt, um das Carbonsäure-Derivat herzustellen. Diese Carbonsäure wird an eine Amin-Verbindung mit einer primären oder sekundären Amino-Funktion zur Herstellung des angestrebten Produktes gekoppelt. Als Amin-Verbindung können dieselben spezifischen Verbindungen wie oben erwähnt verwendet werden.
2. Ein α-Halogensäurehalogenid wird an ein Organo-Fulleren mit zwei Hydroxylgruppen zur Herstellung der entsprechenden α-Halocarbonyl-Verbindung gekoppelt. Als α-Halogensäurehalogenid für die Verwendung in diesem Verfahren ist α-Bromacetylbromid bekannt. Als Halogenid können sowohl das Chlorid als auch das Bromid verwendet werden, und sogar eine eine Substituenten in α-Position tragende Verbindung kann eingesetzt werden. Was das Organo-Fulleren betrifft, so ist ein Bericht über Derivate mit C₂-Symmetrie verfügbar (Literatur 7: Isobe, H.; Sawamura, M.; Nakamura, E., 13th Fullerene Symposium, 1997, 2–20, Nagano, Japan), eine äquivalente oder höhere Aktivität kann jedoch durch Verwendung von Organo-Fullerenen mit anderen Symmetrien erzielt werden, wie in der oben zitierten Literatur 6 beschrieben, oder durch Verwendung einer Mischung von Isomeren, die durch Durchführung der Reduktion mit Diisobutylaluminiumhydrid erhältlich sind. Die Kopplung des resultierenden Halogenids mit einer Amin-Verbindung mit einer primären oder sekundären Amino-Funktion, wie die oben genannten Verbindung, ergibt das angestrebte Produkt.

Die obige Amin-Verbindung schließt die vorstehend genannten Arten ein.
Die obigen Verfahren können bei allen bekannten Fulleren-Derivaten mit mehreren Hydroxylgruppen angewendet werden (Literatur 8: Taki, M.; Sugita, S.; Nakamura, Y.; Kasashima, E.; Yashima, E.; Okamoto, Y.; Nishimura, J., J. Am. Chem. Soc., 1997, Band 119, 926).
Fachleute sollten dazu fähig sein, Fulleren-Derivate mit den gewünschten Strukturen erfindungsgemäß unter Bezug auf die Offenbarung in der in dieser Beschreibung zitierten Literatur, bekannte Technologien und die spezifische Offenbarung der Verfahren A oder B oder der im folgenden beschriebenen Beispiele herzustellen.
3. Anwendungsarten des Fulleren-Derivats
Das Fulleren-Derivat ist eine amphiphile Verbindung mit hervorragender DNA-Kompaktierungs-Aktivität. Die Einwirkung des Fulleren-Derivats auf DNA führt zu dem Ergebnis, dass das Derivat an die DNA bindet und die einzelmolekulare DNA durch die Zwischenbindungskräfte zwischen den intramolekularen Doppelsträngen gebogen und gefaltet wird. Darüber hinaus wird durch die intermolekulare Bindungskraft ein DNA-Kondensat gebildet. Diese Kompaktierung ist reversibel bezogen auf die Konzentration des Fulleren-Derivats, und die Regeneration der DNA findet bei extraktiver Entfernung des Fulleren-Derivats statt.
Das Vorstehende wurde durch Agarose-Elektrophorese-Analyse und AMF-mikroskopische morphologische Beobachtung der Proben bestätigt, die durch Anwenden einer variierenden Konzentration der Tetramin-Verbindung auf das Plasmid pBR322, wie unten beschrieben, hergestellt wurden. Dies wird im folgenden unter Verwendung spezifischer experimenteller Daten erklärt.
Test-Verbindung
Das in Beispiel 1 erhaltene Fulleren-Derivat, welches im folgenden erscheint (im folgenden als Tetramin-Verbindung bezeichnet) wurde dem Experiment unterzogen.
Elektrophorese-Experiment-Protokoll
Die Elektrophorese wurde in Übereinstimmung mit den in Short Protocols in Molecular Biology, dritte Auflage, 1992, Wiley, 2–13 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Als Test-Proben wurden durch Lösen des Plasmids pBR322 (25 μg/mL) und verschiedener Mengen Tetramin-Verbindung in 20 % THF/HEPES-Mg-Puffer (20 μL) hergestellte Lösungen verwendet. Jede Probe wurde bei 25°C während 5 Minuten inkubiert und dann auf einem Agarosegel unter Verwendung einer Puffer-Lösung (5 μL) entwickelt, die 0,25 % (m/v) Bromphenol-Blau und 50 % (v/v) Glycerin enthielt.
Die Elektrophorese wurde unter Verwendung einer Ethidiumbromid (0,5 mg/mL) enthaltenden 1 % (m/v) Agarosegel/TBE-Puffer-Lösung verwendet. Die integrierte optische Dichte (IOD) der Fluoreszenz-Emissions-Photographie wurde unter Verwendung des NIH-Image Programms vl 60 gemessen. Durch dieses Verfahren wurde die Migrationsmenge der DNA bestimmt.
Ergebnisse
Die Details sind in 1 gezeigt.
In Abhängigkeit von der Konzentration der Tetramin-Verbindung trat ein Phasenübergangs-Phänomen auf. So nahm die Menge der DNA-Migration bei der Agarose-Elektrophorese schnell ab, wenn das Verhältnis der Anzahl der Moleküle des Fulleren-Derivats zur Anzahl der Basenpaare der DNA 1/1 betrug, und wurde bei 1/2,6 null.
Bei der AMF-mikroskopischen Untersuchung derselben Proben in einem dünnen Wasserfilm wurde ziemlich unterschiedliche AMF-Bilder vor und nach dem Phasenübergang erhalten. Die Kompaktion der DNA begann vor dem Beginn des Phasenübergangs, und es wurde bestätigt, dass das nach dem Phasenübergang erhaltene polymolekulare Kompakt eine hydrophobe Masse war.
Die obigen experimentellen Ergebnisse legen nahe, dass zur Bildung eines vollständigen DNA-Kompakts das Verhältnis der Anzahl der Moleküle des Fulleren-Derivats zur Anzahl der Basenpaare der DNA bevorzugt im Bereich von 4 : 1 bis 1 : 2 liegt.
Die obige Bildung eines DNA-Kondensats durch das Fulleren-Derivat wird durch Mischen der beiden Reagenzien in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Dies ist jedoch nicht eine ausschließliche Auswahl, sondern jedes andere routinemäßig verwendete Verfahren kann verwendet werden. Darüber hinaus kann das gebildete DNA-Kondensat durch das Routineverfahren isoliert werden, beispielsweise durch Durchführung einer Ethanolausfällung mit der DNA-Lösung nach dem Phasenübergang. Darüber hinaus kann durch Extraktion des Fulleren-Derivats aus der Lösung der DNA, die durch Zugabe des Derivats kompaktiert wurde, mit einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform die Regeneration der ursprünglichen DNA erzielt werden.
Wie vorstehend erwähnt ist die DNA-Kompaktierungs-Aktivität des Fulleren-Derivats eng mit der hohen Bindungsaffinität für DNA verbunden. Als Referenz sind die Ergebnisse eines relevanten Experiments mit der Tetramin-Verbindung im folgenden gezeigt.
Experimentelles Verfahren
Die DNA-Kompaktierungs-Aktivität wurde in einem Ethidiumbromid-Verdrängungsassay beurteilt. Dieser kompetetive Bindungsassay wurde entsprechend dem in Journal of Medicinal Chemistry, 21, 658–668 (1978) beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Ergebnisse
Die Tetramin-Verbindung bei einer Konzentration von 1,9 μM verdrängte 50 % des Ethidiumbromids.
Dieses Ergebnis kann als Referenz bei dem molekularen Design eines Fulleren-Derivats verwendet werden, welches zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich ist, und ein Derivat mit einer äquivalenten oder höheren Bindungsaffinität für DNA, verglichen mit der zuvor genannten Verbindung, ist besonders bevorzugt.
Um die Mechanismen der DNA-Kompaktion durch das erfindungsgemäße Fulleren-Derivat zu untersuchen, wurden die folgenden beiden Experimente durchgeführt.
Experimentelles Verfahren
Messung des CD-Spektrums
Eine Lösung von Kälberthymus-DNA (mittleres MW = 8,6 MDa, 13 kbp, 42 % GC, hochpolymerisiert, Typ 1, Sigma) oder Plasmid pBR322 DNA (MW = 2,83 MDa, 4361 bp, New England Biolabs) in HEPES-Mg-Puffer (40 mM HEPES, 10 mM MgC12; pH = 7,6) mit einer Basenpaar-Konzentration von 100 mM wurde hergestellt und in eine Quarzglaszelle gegeben, und unter Verwendung eines JASCO J-720-Spektrometers wurde das CD-Spektrum bei 25°C gemessen. Darüber hinaus wurde das Nukleinsäure-kompaktierende Fulleren-Derivat zu der obigen Lösung bei Konzentrationen von 10 bis 200 mM gegeben, und die CD-Spektren wurden gemessen.
Ergebnisse
Es trat keine Änderung der konformationellen DNA-CD-Spektren auf, was anzeigte, dass die DNA ihre B-Form beibehielt.
Experimentelles Verfahren
Messung der DNA-Schmelz-Temperatur (Tm)
Eine Lösung von Kälberthymus-DNA (mittleres MW = 8,6 MDa, 13 kbp, 42 % GC, hochpolymerisiert, Typ 1, Sigma) in HEPES/Mg-Puffer (40 mM HEPES, 10 mM MgC12; pH = 7,6) mit einer Basenpaar-Konzentration von 100 mM wurde hergestellt, und das Nukleinsäure-kompaktierende Fulleren wurde mit einer Konzentration von 10 mM zugegeben.
Die obige Lösung wurde in eine Quarzglaszelle gegeben, und während die Temperatur ausgehend von 60°C mit einer Geschwindigkeit von 1°C/min. erhöht wurde, wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 258 nm, bei der der Hypochromismus eines DNA-Doppelstrangs beobachtet wird, mit einem JASCO J-720-Spektrometer gemessen.
Ergebnisse
Die Schmelz-Temperatur des Doppelstrangs stieg um 2,7°C auf 74,2°C an, verglichen mit dem Fall, bei dem das Nukleinsäure-kompaktierende Fulleren nicht zugegeben wurde (71,5°C), was die Stabilisierung der Doppelstrang-Struktur anzeigte.
Die obigen experimentellen Ergebnisse deuteten stark darauf hin, dass der Mechanismus, nachdem das DNA-Einzelmolekül gefaltet wird, das Ergebnis einer Wechselwirkung zwischen dem Nukleinsäure-kompaktierenden Fulleren und der hydrophoben Einheit der DNA (z.B. der Hauptfurche der DNA) und einer Wechselwirkung zwischen den stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenketten und der Phosphatgruppe der DNA ist, und dass die hydrophoben Einheiten einer großen Anzahl von gefalteten DNA-Einzelmolekülen koaleszieren, so dass die Kompaktion verursacht wird.
Es ist ein relativ neuer Befund, dass die Fulleren-Derivate nicht nur eine Bindungsaffinität für DNA, sondern sogar die Fähigkeit zur Kompaktierung einer polynuklearen DNA aufweisen.
Daher schließen die Art der Verwendung zur DNA Kompaktion und die Art der Verwendung als DNA-Kompaktionsreagenz gemäß der vorliegenden Erfindung alle möglichen Ausführungsformen ein, die die DNA-Kompaktierungs-Aktivität der Fulleren-Derivate, wie vorstehend beschrieben, ausnutzen. In solchen Ausführungsformen eingeschlossen sind die Verwendung als DNA-Kompaktierungsreagenz; die Verwendung zur Einführung eines Vektors in Zellen; die Verwendung zur Einführung einer DNA (oder eines Derivats davon) -Fragments, wie einer Antisense-DNA (oder eines Derivats davon) oder einer Decoy-DNA (oder eines Derivats davon) in Zellen; die Verwendung zur Kontrolle der Genexpression durch die Bindung an einen Promotor oder eine Enhancer-Region; die Verwendung zur Modulierung des Zellzyklus durch Unterdrückung der Umwandlung einer Doppelstrang-DNA in eine Einzelstrang-DNA; und die Verwendung zur Kontrolle der PCR-Effizienz durch Einstellung des Schmelzpunkts, der beim Übergang von einer Einzelstrang-DNA in eine Doppelstrang-DNA oder von einer Doppelstrang-DNA in eine Einzelstrang-DNA beteiligt ist. Darüber hinaus ist die Anwendung für die Gentherapie ebenfalls umfasst.
Bei der Verwendung des Fulleren-Derivats in jeder der obigen Anwendungsformen können die Fulleren-Derivate oder ihre Salze als solche oder in Form einer Zusammensetzung zur Erreichung des angestrebten Ziels eingesetzt werden.
Beispiele
Präparat 1
Zu einer Lösung von Dienon 6 (130 mg, 143 μMol) in Chlorbenzol (130 mL) wurde Diisobutylaluminiumhydrid (in Hexan) (0,95 M, 751 μL) langsam bei Raumtemperatur gegeben. Nach 2 Stunden konstantem Rühren wurde eine 30 %ige wässrige Lösung Kaliumnatriumtartrat zugegeben und die Mischung während 1 Stunde gerührt. Die rohe Lösung wurde mit Wasser gewaschen, und die Entfernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum ergab ein Rohprodukt als kaum lösliche schwarze feste Masse (130 mg). Dieses Diol 7 ist eine Mischung aus C₂-symmetrischen und C₁-symmetrischen Diastereomeren (etwa 7 : 3). Diese Mischung wird nicht weiter gereinigt, sondern direkt in die nachfolgende Reaktion gegeben.
Diol 7

R_f = 0.15 (PhCl)
IR (KBr): 3417, 2925, 1506, 798, 694 cm^–1
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/CS₂1/1) δ 1.54–1.62 (br m, 4H, (CH₂)₂-(CN₂)₂-(CH₂)₂), 1.76–1.88 (br m, 2H, homoallylisches Methylenproton), 1.88–1.99 (br m, 2H, homoallylisches Methylenproton), 2.28 (d, 2H, J = 12.0 Hz, OH), 2.65–2.80 (m, 4H, allylisches Methylenproton), 6.22 (br s, 2H, Vinylproton), 6.34 (br d, 2H, J = 12.0 Hz, allylisches Methylenproton)

Präparat 2
Zu einer Lösung von Diol 7 (50 mg, 54,7 μMol) in Chlorbenzol (50 mL) wurden Bromacetylbromid (23,7 μL, 274 μMol) und Pyridin (22,1 μL, 274 μMol) gegeben. Nach 6 Stunden konstantem Rühren wurde die Reaktion durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat gestoppt. Extraktion mit Wasser ergab ein Rohprodukt. Reinigung durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Kieselgel 5 g, Elution mit Chlorbenzol) ergab Dibromid 8 (31,6 mg, 50 %, 2 Stufen).
Dibromid 8

R_f = 0.65 (PhCl)
IR (KBr); 2925, 2854, 1733, 1261, 694 cm^–1
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.55–1.63 (br m, 4H, (CH₂)₂-(CH₂)₂-(CH₂)₂), 1.80–2.00 (br m, 4H, homoallylisches Methylenproton), 2.70–2.84 (br m, 4H, allylisches Methylenproton), 3.80 (d, 2H, J = 12.0 Hz, BrCH₂CO), 3.84 (d, 2H, J = 12.0 Hz, BrCH₂CO), 6.16 (br s, 2H, Vinylproton), 7.33 (br s, 2H, allylisches Methylenproton)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 25.66 (CH₂), 27.03 (CH₂), 29.33 (CH₂), 73.11 (sp³, C60), 74.11 (sp³, C60), 88.04 (allylisches CH), 125.05 (Vinyl CH), 127.24, 132.98, 136,38, 136.52, 138.30, 139.56, 141.79, 141.93, 142.07, 142.11, 143.14, 144.74, 144.76, 144.90, 145,32, 145.41, 145,62, 145.67, 146.01, 146.05, 146.35, 147,36, 147.61, 147.83, 148.34, 148.74, 148.98, 149.87, 152.51, 166.78 (C=O)

Beispiel 1
Zu einer Lösung von Dibromid 8 (23,1 mg, 20,0 μMol) in Chlorbenzol (10 mL) wurde N,N,N'-Trimethyl-1,3-propandiamin (14,7 μL, 100 μMol) gegeben. Nach 1 Stunde konstantem Rühren wurde eine wässrige Extraktion durchgeführt, wobei ein Rohprodukt erhalten wurde. Reinigung durch Gelpermeations-Chromatographie (JAIGEL-1H 20 × 600 mm und – 2H 20 × 600 mm GPC-Säulen, Elution mit 0,5 % Triethylamin/Chloroform) ergab Tetramin 1 (12,2 mg, 50 %).
Tetramin 1

R_f = 0.05 (CHCl₃/MeOH/AcOE 85/10/5)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.40–1.54 (überlappendes m, 8H, NCH₂CH₂ und (CH₂)₂-(CH₂)₂-(CH₂)₂), 1.50–1.75 (br m, 2H, homoallylisches Methylenproton), 1.75–2.00 (br m, 2H, homoallylisches Methylenproton), 2.08 (überlappendes s, 16H, N(CH₃)₂ und NCH₂), 2.20 (s, 6H, NCH₃), 2.36 (t, 4H, J = 7.4 Hz, NCH₂), 2.60–2.74 (br m, 4H, allylisches Methylenproton), 3.15 (d, 2H, J = 17.2 Hz, NCH₂CO), 3.28 (d, 2H, J = 17.2 Hz, NCH₂CO), 6.08 (br s, 2H, Vinylproton), 7.35 (br s, 2H, allylisches Methylenproton)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 25.53 (CH₂), 25.96 (CH₂), 26.91 (CH₂), 29.29 (CH₂), 42.09 (NCH₃), 45.55 (N(CH₃)₂), 54.63 (CH₂), 57.55 (CH₂), 58.30 (CH₂), 73.28 (sp³, C60), 74.08 (sp³, C60), 86.68 (allylisches CH), 125.86 (Vinyl CH), 127.24, 132.76, 136.34, 136.40, 138.19, 139.49, 141.80, 141.83, 141.86, 142.08, 143.17, 144.65, 144.73, 144.97, 145.20, 145.44, 145.46, 145.65, 145.96, 145.99, 146.29, 147.52, 147.82, 148.71, 148.91, 148.96, 150.23, 151.21, 155.30, 170.68 (C=O)

Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem die Tetramin-Verbindung einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen wurde. Die Ordinate stellt IOD (%) dar, und die Abszisse zeigt das Verhältnis der Anzahl der Moleküle der Tetramin-Verbindung zur Anzahl der Basenpaare der DNA.

Claims

Verwendung des Fulleren-Derivats mit 1 bis 4 stickstoffhaltigen hydrophilen Seitenkette(n) oder eines Salzes davon für die in vitro-DNA-Compaction.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche 1 bis 2 geradekettige oder verzweigtkettige Substituentengruppe(n) aufweist, welche jeweils 1 bis 10 Stickstoffatom(e) und 2 bis 30 Kohlenstoffatome umfassen, und so konfiguriert ist, dass sie an 1 oder 2 der 2 bis 8 sp³-Kohlenstoffatome gebunden ist, welche im Fullerenkern vorliegen, jedoch vorausgesetzt, dass eine Vernetzungseinheit vorliegen kann, welche eine Alkylengruppe umfasst, die 2 oder mehr stickstoffhaltige hydrophile Seitenketten verbrückt.
Verwendung wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei das Fulleren-Derivat oder das Salz davon 1 oder 2 stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette(n) aufweist.
Verwendung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche 1 oder 2 geradkettige oder verzweigtkettige Substituentengruppe(n) aufweist, welche jeweils 2 bis 8 Stickstofatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome umfassen, und so konfiguriert ist, dass sie an 2 der 2 bis 8 spd³-Kohlenstoffatome gebunden ist, die im Fullerenkern vorliegen, vorausgesetzte jedoch, dass eine Vernetzungseinheit vorliegen kann, welche eine Alkylengruppe umfasst, die 2 stickstoffhaltige hpydrophile Seitenketten verbrückt.
DNA-Compaction, gebildet durch Verwendung eines Fulleren-Derivats, welches 1 bis 4 stickstoffhaltige hydrophile Seitenkette(n) aufweist oder eines Salzes davon.
DNA-Compaction wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei das Verhältnis der Anzahl von Molekülen des Fulleren-Derivats oder eines Salzes davon zur Anzahl der Basenpaare der DNA 4 : 1 bis 1 : 2 beträgt.
Fulleren-Derivat der folgenden allgemeinen Formel oder Salz davon:
wobei zwei Rs gleich oder verschieden sein können und jeweils eine geradkettige oder verzweigtkettige Acylgruppe, umfassend 1 bis 10 Stickstoffatome und 2 bis 30 Kohlenstoffatome, oder Wasserstoff darstellen, vorausgesetzt jedoch, dass zwei Rs nicht gleichzeitig Wasserstoff darstellen; mit Ausnahme des Fulleren-Derivats der folgenden Formel:
Fulleren-Derivat oder Salz davon wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die beiden Rs gleich oder verschieden sind und jeweils eine geradkettige oder verzweitkettige Acylgruppe darstellen, die 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome umfasst.
Fulleren-Derivat oder Salz davon wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei die beiden Rs gleich oder verschieden und jeweils eine [N-(N,N-di(C₁-C₆)Alkylamino)(C₁-C₆)alkyl-N(C₁-C₆)alkyl]amino(C₁-C₆)alkanoylgruppe darstellen.
Verwendung der Fulleren-Derivate wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 definiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur DNA-Compaction.
Verwendung des Fulleren-Derivats wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 definiert zur in vitro-DNA-Compaction.
Fulleren-Derivat der folgenden allgemeinen Formel oder Salz davon:
wobei R eine geradkettige oder verzweigtkettige Acylgruppe darstellt, welche 1 bis 10 Stickstoffatome und 2 bis 30 Kohlenstoffatome umfasst, und R¹ Wasserstoff oder eine (C¹-C⁶)-Alkylgruppe darstellt; mit Ausnahme des Fulleren-Derivats der folgenden Formel:
Fulieren-Derivat oder Salz davon wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei R eine geradkettige oder eine verzweigtkettige Acylgruppe darstellt, welche 2 bis 8 Stickstoffatome und 2 bis 20 Kohlenstoffatome umfasst.
Fulleren-Derivat oder Salz davon wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei R eine [N-(N,N-di(C₁-C₆)Alkylamino)(C₁-C₆)alkyl-N(C₁-C₆)alkyl]amino(C1-C6)alkanoylgruppe ist.