DE69924746T3

DE69924746T3 - Verfahren zur herstellung von proteinmaterial

Info

Publication number: DE69924746T3
Application number: DE69924746T
Authority: DE
Inventors: Outi Vaarala; Olli Tossavainen; Outi Kerojoki; Kari Salminen; Marika Eriksson
Original assignee: Valio Oy
Current assignee: Valio Oy
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-29
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: NZ510871A; EP1124436B2; ATE292895T1; US6866879B1; DE69924746T2; WO2000018251A1; AU759834B2; HUP0103862A3; NO321174B1; FI982114A; CZ20011132A3; DK1124436T3; AU5986699A; FI982114A0; SK4422001A3; EE200100198A; NO20011585L; CA2345701C; PL346978A1; CA2345701A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung eines Proteinmaterials, genauer gesagt, ein Verfahren zur Entfernung von Rinderinsulin aus einem aus Kuhmilch stammenden flüssigen fettfreien Proteinmaterial. Die Erfindung betrifft zudem ein Proteinmaterial, das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, das durch das oben genannte Verfahren hergestellt wurde, sowie dessen Verwendung als Proteinbestandteil einer Säuglingsanfangsnahrung oder eines anderen speziellen Nährpräparates oder als Rohmaterial bei Verzehrsmilch, anderen Milchgetränken oder verschiedenen Milchpräparaten. Bei der Herstellung dieser Produkte kann das fettfreie Proteinmaterial, das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist und das aus Kuhmilch stammt und durch das obenstehend genannte Verfahren hergestellt wird, als Proteinbestandteil verwendet werden.
Da die erfindungsgemäße Bearbeitung den Geschmack des Produktes nicht wesentlich verändert, ist das fettfreie Proteinmaterial, das im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, das aus Kuhmilch stammt und gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, in den obenstehend genannten Produkten ein optimal geeigneter Proteinbestandteil.
Insulin-abhängige Diabetes Mellitus (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) ist eine Krankheit, die durch die Zerstörung der Insulin-produzierenden Betazellen in den Langerhans-Inseln des Pankreas hervorgerufen wird, wobei andere Zellen der Inseln intakt bleiben (Castano L. und Eisenbarth GS. Annu. Rev. Immunol., 8 (1990) 647–79).
Es wird angenommen, dass sowohl genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren das Risiko beeinflussen, dass Kinder an IDDM erkranken. Zur Erklärung der Entwicklung von IDDM ist der genetische Faktor wichtig, aber nicht ausreichend. Das Risiko, dass einer von monozygoten Zwillingen im Laufe seines Lebens an IDDM erkrankt, liegt nur zwischen 30 und 50%, wenn der andere Zwilling an IDDM erkrankt ist. Nur 10% der neuen IDDM Fälle treten in Familien auf, bei denen es bereits ein Fall von IDDM gab, und 90% der neuen Fälle werden bei Patienten diagnostiziert, in deren Familien es noch keine IDDM-Fälle gab. In anderen Worten heißt dies, dass umweltbedingte Faktoren bei der Entwicklung von IDDM sogar noch eine größere Bedeutung haben können als genetische Faktoren.
Verschiedene epidemiologische Untersuchungen zeigen, dass die Aussetzung gegenüber Kuhmilchprotein in einem frühen Säuglingsalter das Risiko einer Erkrankung an IDDM erhöht (Gerstein H., Diabetes Care 17 (1994) 13–19). Epidemiologische Beobachtungen wurden bisher verwendet, um mehrere Hypothesen hinsichtlich Mechanismen, in denen Kuhmilchproteine als Faktoren für Diabetes agieren könnten, aufzustellen. Eine der neuesten ist eine Hypothese nach der das Insulin in Kuhmilch eine Immunantwort, die irrtümlicherweise gegen die eigene Insulinproduktion des Kindes gerichtet ist, verursachen kann (Vaarala, O., Paronen, J., Otonkoski, T.,
H.K., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 131–135).
Oral verabreichtes heterologes Insulin, das sich von autologem Insulin leicht unterscheidet, kann die immunologische Toleranz gegen Betazellen verletzen. Die Bildung von Lympozyten, die Insulin identifizieren, kann bei Personen schädlich sein, die eine erbliche Empfindlichkeit gegenüber IDDM haben, und die Aktivierung solch einer Lympozytpopulation kann später im Leben zu einem autoimmunen Angriff gegen insulinproduzierende Betazellen führen. Wir haben gezeigt, dass die Verabreichung von Säuglingsanfangsnahrung an Säuglinge die Herstellung von Antikörpern gegen Rinderinsulin induziert (Vaarala, O., Paronen, J., Otonkoski, T.,
H.K., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 131–135). Diese Antikörper kreuzreagieren mit humanem Insulin. Da die Gegenwart von Insulinautoantikörpern (IAA) dem Ausbruch von IDDM vorangeht und diesen voraussagt, kann die Immunisierung hinsichtlich Insulin, die durch Milchprodukte erzeugt wird, schädlich sein und das Risiko einer Erkrankung an IDDM erhöhen. Daher könnten die Milchprodukte, die kein immunreaktives Rinderinsulin enthalten, als nicht-diabetogene Nahrungsmittel angesehen werden.
Falls der Faktor, der die Autoimmunisierung aktiviert, Rinderinsulin ist, das in kleinen Mengen in Kuhmilch vorhanden ist, ist es äußerst wichtig, dass dieses aus den Säuglingsanfangsnahrungsmitteln entfernt wird, um das Ausbrechen von IDDM bei Kindern zu verhindern. Dementsprechend besteht Bedarf an im Handel erhältlichen Kuhmilchprodukten und auf Kuhmilch basierenden Produkten, die kein immunreaktives Rinderinsulin enthalten. Dies betrifft insbesondere Säuglingsanfangsnahrungsmittel, die die ersten auf Kuhmilch basierenden Produkte sind, die von Säuglingen verzehrt werden. Zudem betrifft es andere spezielle Nährpräparate und verschiedene Milchgetränke und Milchprodukte, wie zum Beispiel Speiseeis, Yoghurt und Käse.
Desweiteren wäre es wünschenswert, dass der in den Produkten verwendete Proteinteil deren gewohnten Geschmack nicht wesentlich ändert.
Wir haben vorher gezeigt, dass Rinderinsulin durch einen Kationenaustausch und nachfolgende optionale Hydrolyse und, nach der Hydrolyse, gefolgt von einer optionalen chromatographischen Behandlung, die zum Beispiel eine Behandlung mit einem Adsorptionsmedium sein kann ( Finnische Patentanmeldung 971872 ), aus einem fettfreien Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, wie zum Beispiel aus Molke oder entrahmter Milch entfernt werden kann. Unser finnisches Patent Nr. 94089 offenbart auch eine Harzadsorbtionsbehandlung eines Proteinhydrolysats.
Nun wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Rinderinsulin aus einem flüssigen fettfreien Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, wie zum Beispiel Molke oder entrahmte Milch, direkt durch eine Behandlung mit einem Adsorptionsmedium entfernt werden kann. Dieses neue Verfahren entfernt Rinderinsulin vollständiger und ökonomischer aus dem Proteinmaterial als bisher.
Bei dem neuen Verfahren wird nicht einmal eine Proteinhydrolyse benötigt. Dies vermeidet zusätzliche Kosten, die durch den Schritt der Hydrolyse verursacht werden, sowie die Veränderung des Geschmackes, die durch die Hydrolyseprodukte verursacht wird. Die erhaltenen Hydrolyseprodukte sind gespaltene Proteine, die den gewohnten Geschmack des Produktes, das erzeugt werden soll, verändern. So schmeckt zum Beispiel Milch, dessen Proteinanteil wenigstens teilweise durch Molke ersetzt wurde, die hydrolysiert wird und daher gespaltene Proteine enthält, nicht nach Milch. Im Gegensatz dazu schmeckt Milch, dessen Proteinanteil wenigstens teilweise durch Molke ersetzt wurde, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt wurde und ganze Proteine enthält, im Wesentlichen nach Milch.
Kuhmilch enthält für gewöhnlich kleine Mengen an Rinderinsulin. Der Gehalt schwankt je nach Analysenerfahren. Es wurde jedoch zum Beispiel durch das ELISA-Verfahren (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) und das RIA-Verfahren (Radio Immuno Assay) ein Gehalt von etwa 1 ng/ml festgestellt.
In dieser Erfindung wurde Rinderinsulin durch das RIA-Verfahren von Proben analysiert. Die Probenlösung wurde gefriergetrocknet, als eine konzentrierten Lösung aufgelöst und durch das RIA-Verfahren analysiert. Das ELISA-Verfahren wurde als zweites unabhängiges Verfahren verwendet, wobei die verwendeten Antikörper nicht dieselben waren wie bei dem RIA-Verfahren. Die RIA-Analyse muss vor der Wärmebehandlung durchgeführt werden, damit zuverlässige Ergebnisse erhalten werden. Die RIA- und ELISA-Verfahren ergaben Ergebnisse, die im selben Bereich lagen.
Flüssigkeitschromatographie und eine Umkehrphasensäule (Kroeff et al., J. Chromatogr. 461 (1989) 45–61; Poll und Harding, J. Chromatogr. 539 (1991) 37–45; Cox, J. Chromatogr. 599 (1992) 195–203; Welinder, J. Chromatogr. 542 (1991) 83–99), Gelfiltration oder eine Anionenaustauschsäule ( WO 90/00176 und WO 90/00177 ) oder eine schwache Kationenaustauschsäule ( DE 351 12 70 A1 und GB 2173503A ) wurden für gewöhnlich bei der Reinigung von Insulin aus den Herstellungs- und Extraktions-Lösungen verwendet. Außer unserer obenstehend genannten finnischen Patentanmeldung 971872 hat bisher keine der Veröffentlichungen die direkte Trennung von Rinderinsulin aus entrahmter Milch oder Molke diskutiert. An sich ist die Umkehrphasenfiltrations- oder Gelfiltrationschromatographie nicht zur Behandlung von Milch geeignet, da die behandelte Milch für Nahrungsmittel geeignet sein soll und einen angemessenen Preis haben soll.
Insulin kann leicht durch eine Wärmebehandlung immunologisch inaktiviert werden. So inaktivieren zum Beispiel die Pasteurisierung (72°C) und die Ultrahocherhitzung (UHT Behandlung, 135–140°C) die Mehrheit des Insulins in eine Form, die durch das RIA-Verfahren nicht feststellbar ist. Es wurde jedoch festgestellt, dass Säuglinge, denen Säuglingsanfangsnahrung gegeben wurde, eine Immunisierung gegen Rinderinsulin durch die Säuglingsanfangsnahrung erhalten haben (Vaarala, O., Paronen, J., Otonkoski, T.,
H.K., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 131–135), bei deren Herstellung das Meiste des Insulins in dem Erhitzungsschritt nicht durch das RIA detektierbar wurde.
Die Anmelderin hat nun herausgefunden, wie Rinderinsulin effektiver als bisher aus flüssigem fettfreiem Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, entfernt werden kann. In diesem Fall wird, bei angemessenen Kosten, eine Proteinzusammensetzung erhalten, die aus Kuhmilch stammt und die für Nahrungsmittel geeignet ist und im Wesentlichen frei von Rinderinsulin ist, und die zur Verwendung als Proteinteil insbesondere in einer Säuglingsanfangsnahrung geeignet ist, aber auch in anderen speziellen Nährpräparaten, oder als Rohmaterial in Milch zum Verzehr, anderen Milchgetränken und verschiedenen Milchprodukten, wie zum Beispiel Speiseeis, Yoghurt oder Käse, und die ihren Geschmack nicht von dem gewohnten Geschmack verändert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung von Rinderinsulin aus einem aus Kuhmilch stammenden flüssigen fettfreien Proteinmaterial ist dadurch gekennzeichnet, dass das aus Kuhmilch stammende flüssige fettfreie Proteinmaterial, wobei das Material einen pH-Wert von 2 bis 8 aufweist, bei einer Temperatur, die unter 65°C liegt, mit einem Adsorptionsmedium in Kontakt gebracht wird, wobei das Gewichtsverhältnis des Proteinmaterials, das mit dem Adsoptionsharz behandelt werden soll, höchstens 100:1 beträgt, und dadurch gekennzeichnet, dass mit der Mediumbehandlung wenigstens eine Ultra- und Diafiltrationsbehandlung des Proteinmaterials kombiniert wird, und dadurch gekennzeichnet, dass, wenn nötig, das so erhaltene flüssige Material zu einem Proteinkonzentrat konzentriert wird und optional zu einem Pulver getrocknet wird.
Die Entfernung von Fett und Kasein aus der Milch führt zu einer Molke, die die Molkeproteine umfasst. Von dem Gesamtprotein der Milch sind etwa 20% Molkeprotein und der Rest ist Kasein. Die Molke, die bei der Käseherstellung erhalten wird, wird Käsemolke genannt und die Molke, die bei der Kaseinherstellung erhalten wird, wird wiederum Kaseinmolke genannt.
Die Erfindung ist am Besten zur Behandlung von Molke geeignet. Die in der Erfindung verwendete Molke kann eine beliebige aus Kuhmilch stammende Molke sein, wie zum Beispiel Käsemolke, Labkaseinmolke, saure Kaseinmolke oder Sauerkäsemolke. Bevorzugt ist die Molke eine Käsemolke.
Das fettfreie Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, kann auch eine ultra- und diafiltrierte Molke sein, d. h. ein Molkeproteinkonzentrat. In diesem Fall ist das Flüssigkeitsvolumen, das mit Harz behandelt werden soll, kleiner und der Grad der Rinderinsulinentfernung ist etwa so hoch wie bei der Molkebehandlung.
Zusätzlich zu den oben genannten können bei der Erfindung entrahmte Milch oder eine aus fettfreiem Milchpulver hergestellte wässrige Lösung oder eine aus Milchkasein hergestellte wässrige Lösung, d. h. eine Kaseinlösung als das fettfreie Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, verwendet werden. In diesem Fall ist jedoch der Grad an Rinderinsulinentfernung nicht der Gleiche wie bei der Molkebehandlung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Rinderinsulin aus einem fettfreien Proteinmaterial, das aus Kuhmilch stammt, bevorzugt aus Molke oder einem Molkeproteinkonzentrat, entfernt, indem das zu behandelnde Material mit einem Adsorptionsmedium in Kontakt gebracht wird. Als Adsorptionsmedium, an welches das Rinderinsulin gebunden wird, wird ein auf Styrol basierendes oder auf Acryl basierendes Adsorptionsmedium verwendet, das bevorzugt makroretikulär ist. Geeignete Adsorptionsmedien umfassen Dowex XUS 40285.00 (Porengröße etwa 50
Hersteller Dow Inc., Deutschland) und Amberlite XAD 7 (Porengröße zwischen 450 und 500
Hersteller Rohm & Haas, Frankreich).
Die Behandlung mit einem Adsorptionsmedium kann entweder durchgeführt werden, indem das zu behandelnde Proteinmaterial durch eine Säule, die mit einem Adsorptionsmedium gefüllt ist, hindurchgeleitet wird, oder indem das Proteinmaterial in einem Mischbehälter mit einem Adsorptionsmedium in Kontakt gebracht wird. Bei der Adsorptionsmediumbehandlung beträgt der pH-Wert 2 bis 8, geeigneterweise 4 bis 6,7, und die Temperatur liegt unter 65°C, für gewöhnlich bei 2 bis 30°C, und geeigneterweise bei 2 bis 10°C.
Wenn die Adsorptionsmediumbehandlung in einer Säule durchgeführt wird, wird die Säule mit einem Adsorptionsmedium gefüllt, das geeigneterweise mit NaOH und HCl regeneriert ist. Das zu behandelnde Proteinmaterial wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 bis 20 Säulenvolumen (BV)/Std., geeigneterweise bei einer Fließgeschwindigkeit von 6 bis 8 Säulenvolumen/Stunde, durch eine Säule, die mit dem Adsorptionsmedium gefüllt ist, hindurchgeleitet. Das Gewichtsverhältnis des in dieser Mediumbehandlung zu behandelnden Proteinmaterials zu dem Adsorptionsmedium beträgt höchstens 100:1, geeigneterweise 10:1 bis 40:1.
Wenn die Adsorptionsmediumbehandlung in einem Mischbehälter durchgeführt wird, werden das auf die obenstehend beschriebene Art und Weise regenerierte Adsorptionsmedium und das zu behandelnde Proteinmaterial in den Mischbehälter eingebracht, in dem sie durch ein geeignetes leichtes Vermischen miteinander in Kontakt gebracht werden. Das Gewichtsverhältnis des in der Mediumbehandlung zu behandelnden Proteinmaterials zu dem Adsorptionsmedium beträgt höchstens 100:1, geeigneterweise 10:1 bis 40:1, und die Dauer des Kontaktes beträgt weniger als 2 Stunden, geeigneterweise 60 Minuten.
Wenigstens eine Ultra- und Diafiltrationsbehandlung des flüssigen fettfreien Proteinmaterials, das aus Kuhmilch stammt, wird mit der obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung kombiniert. Das flüssige Material kann durch Ultra- und Diafiltration zur Trocknung oder anderer Weiterverarbeitung konzentriert werden, gleichzeitig kann die Ultra- und Diafiltration jedoch auch verwendet werden, um die Entfernung des Rinderinsulins aus dem zu behandelnden Material zu vervollständigen. Semipermeable 5.000 bis 25.000 D-Cut-off-Membranen, geeigneterweise 10.000 D Cut-off-Membranen werden bei der Ultra- und Diafiltration verwendet. Membranmaterialien, die für die Ultrafiltration geeignet sind, umfassen Polysulfon, Polyethersulfon, und hydrophil beschichtete Materialien.
Die Menge, die durch Ultra- und Diafiltration an Insulin entfernt wird, steigt, wenn das Konzentrationsverhältnis ansteigt. Ein geeignetes Konzentrationsverhältnis wird für jeden besonderen Fall ausgewählt.
Molke oder ein anderes verdünntes Ausgangsmaterial kann vor der obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung durch die obenstehend genannte Ultra- und Diafiltration in Molkeproteinkonzentrat beziehungsweise in ein anderes konzentriertes Ausgangsmaterial konzentriert werden. Andererseits kann die Ultra- und Diafiltration nach der obenstehend genannten Adsorptionsmediumbehandlung durchgeführt werden, wobei ein Proteinkonzentrat erhalten wird, das zu Pulver getrocknet werden kann, geeigneterweise durch Sprüh- oder Gefriertrocknung.
Bei der Behandlung des Ausgangsmaterials kann das Gesamtkonzentrationsverhältnis zum Beispiel etwa 24 betragen (Konzentrationsverhältnis zuerst 6 und dann 4), jedoch kann bei der Konzentration des Materials in ein Proteinkonzentrat das Gesamtkonzentrationsverhältnis zum Beispiel etwa 120 betragen (Konzentrationsverhältnis zuerst 10 und dann 12).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ultra- und Diafiltration vor und/oder nach der Adsorptionsmediumbehandlung durchgeführt.
Vor dem Kontakt mit einem Adsorptionsmedium kann das flüssige fettfreie proteinhaltige Material, das aus Kuhmilch stammt, bevorzugt Molke, vorbehandelt werden, indem es bei einer Temperatur unter 65°C geklärt wird, geeigneterweise durch Mikrofiltration, Ultrafiltration oder Zentrifugation. Diese Vorbehandlung wird bevorzugt durch Filtern des zu behandelnden Materials durch Mikrofiltrationsmembrane durchgeführt, wobei die Membranen 0,05 bis 1,4 Mikrometermembranen sind, bevorzugt 0,1 Mikrometermembranen. In diesem Fall können Kaseinstaub oder denaturierte Molkeproteine, die optional vorliegen, und mit denen zusammen ein Teil der makromolekularen Proteine, an welche Insulin häufig gebunden ist, besonders von der Molke entfernt werden. Bei der Ultrafiltration können wiederum Membranen mit einem Cut-off Wert von 50.000 bis 200.000 D verwendet werden, wobei die Rotationsgeschwindigkeit bei der Zentrifugation bevorzugt zwischen 1.000 und 10.000 Runden pro Minute liegt.
Eine Klärungsbehandlung senkt zudem leicht den Rinderinsulingehalt des zu behandelnden Materials. Der Rinderinsulingehalt der Molke beträgt bei der obenstehend genannten Klärungsbehandlung zum Beispiel 6 bis 10%.
Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Molke durch ein Adsorptionsmedium behandelt und diese Mediumbehandlung wird mit einer Ultra- und Diafiltrationsbehandlung kombiniert, die entweder vor oder nach der Mediumbehandlung durchgeführt wird. Untersuchungen haben ergeben, dass das obenstehende Verfahren zur Entfernung des Rinderinsulins aus Molke durch Behandlung von Käse oder Kaseinmolke, der/die ein Adsorptionsmedium aufweist, wie zum Beispiel Dowex XUS 40285.00 (Dow Inc., Deutschland) oder Amberlite XAD 7 (Rohm & Haas, Frankreich) führt. Das Insulin wurde an das Medium gebunden, indem die Molke bei einem pH-Wert von 2 bis 8 durch ein Adsorptionsmedium geleitet wurde, das mit NaOH and HCl regeneriert war. Die so behandelte Molke wurde bei einem pH-Wert von 6,5 ultrafiltriert, um ein Molkeproteinkonzentrat zu erhalten, das evaporiert und zu Pulver eingetrocknet wurde. Die Behandlung wurde ferner durchgeführt, indem zuerst die Molke ultra- und diafiltriert wurde und dann das erhaltene Proteinkonzentrat durch das Adsorptionsmedium behandelt wurde. Bei der Behandlung sank der Insulingehalt der Molke von 21 auf 3 ng/g Protein, bestimmt durch das RIA-Verfahren, d. h. auf etwa 85% im Verhältnis zum Protein.
Durch die auf obenstehende Weise behandelte Molke wurde eine Molkeproteinpräparation erzeugt, die, hinsichtlich des Rinderinsulins, wesentlich reiner war als ein entsprechendes herkömmliches Säuglingsnahrungspulver (etwa 22 bis 30 ng/g Protein), Milchpulver (etwa 30 ng/g Protein) oder ultra- oder diafiltriertes Molkeproteinpulver (Proteingehalt 70 bis 80%) (15 bis 25 ng/g Protein). Das auf diese Weise erhaltene im Wesentlichen rinderinsulinfreie Molkeproteinpräparat ist zur Verwendung als Rohmaterial und als alleinige Proteinquelle bei Säuglingsanfangsnahrung geeignet, da Molkeprotein ernährungsphysiologisch eine extrem hohe Qualität aufweist und keine anderen Proteine benötigt, um den Nährstoffgehalt zu vervollständigen. Ferner ist das im Wesentlichen insulinfreie Proteinmaterial, das gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, zur Verwendung als Rohmaterial und Proteinanteil in verschiedenen speziellen Nährstoffpräparaten, verschiedenen Milchgetränken, wie zum Beispiel Trinkmilch, und verschiedenen anderen Milchpräparaten, wie zum Beispiel Speiseeis, Joghurt und Käse geeignet.
Herkömmlicherweise sind Säuglingsanfangsnahrung, die ersten auf Kuhmilch basierenden Produkte, die von Säuglingen konsumiert werden, aus Milch, Sahne, Gemüseöl, Molkepulver mit geringem Salzgehalt, Mineralien und Vitaminen zusammengesetzt, von denen Milch, Sahne und das Molkepulver mit geringem Salzgehalt Rinderinsulin umfassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine wesentliche Verringerung des Rinderinsulingehalts bei Säuglingsanfangsnahrung oder anderen auf Kuhmilch basierenden speziellen Nährpräparaten, Milchgetränken und anderen Milchpräparaten, und in deren Rohmaterialien.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer im Wesentlichen rinderinsulinfreien Säuglingsanfangsnahrung oder anderen speziellen Nährpräparaten oder Verzehrmilch, anderen Milchgetränken oder anderen Milchpräparaten oder deren Rohmaterialien ist durch die Verwendung eines im Wesentlichen rinderinsulinfreien fettfreien proteinhaltigen Materials gekennzeichnet, das von Kuhmilch stammt, wobei der durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene Proteinanteil bei der Herstellung eines Produktes verwendet wird.
Beispiele
BEISPIEL 1 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung von Rinderinsulin aus Molke mit einem makroretikulären auf Styrol basierenden Adsorptionsmedium, Dowex XUS 40285,00 bei einem pH-Wert von 5,8.
Das Adsorptionsmedium XUS 40285.00 wurde mit 2% NaOH + 2% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20-ml Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml frische Käsemolke, wurden bei einem pH-Wert von 5,8 durch die Säule geleitet.
Bei der Behandlung wurden 45% des Rinderinsulins aus der Molke entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 93%, d. h. der Insulingehalt wurde proportional zum Protein um 42% gesenkt.
BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung von Rinderinsulin aus Molke mit dem Adsorptionsmedium XUS 40285.00 bei pH-Werten von 4, 5,8 und 6,4.
Das Adsorptionsmedium XUS 40285.00 wurde mit 2% NaOH + 2% HCl regeneriert und auf Neutral gespült. 145 ml Käsemolke, die auf einen pH-Wert von 4, 5,8 oder 6,4 eingestellt wurde, und 25 ml Harz wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eingebracht, der in einem Schüttler angeordnet war. Nach einem Schüttelvorgang von 60 Minuten wurde das Harz von der Molke getrennt und der Rinderinsulingehalt der Molke wurde durch das RIA-Verfahren analysiert.
Bei der Behandlung wurden 57% des Rinderinsulins bei einem pH-Wert von 4,0 entfernt, 71% wurden bei einem pH-Wert von 5,8 entfernt, und 58% wurden bei einem pH-Wert von 6,4 entfernt. Die Proteinausbeute betrug 69% bei einem pH-Wert von 4,0, 66% bei einem pH-Wert von 5,8 and 63% bei einem pH-Wert von 6,4, d. h. im Verhältnis zum Protein sank der Insulingehalt um 39%, 47%, bzw. 37%. Die Untersuchung zeigt, dass Rinderinsulin innerhalb einer weiten pH-Spanne durch ein Adsorptionsmedium aus der Molke entfernt werden kann.
BEISPIEL 3 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung des Rinderinsulins aus Molke unter Verwendung eines makroretikulären auf Acryl basierenden Adsorptionsmediens, Amberlite XAD 7.
Ein XAD 7 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20 ml-Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml an Frischkäsemolke wurden bei einem pH-Wert von 6,4 durch die Säule geleitet.
Bei der Behandlung wurden 76% des Rinderinsulins entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 90%, d. h. der Insulingehalt wurde proportional zum Protein um 68% gesenkt.
BEISPIEL 4
Entfernung von Rinderinsulin aus einem Molkeproteinkonzentrat mit einem Adsorptionsmedium XUS 40285.00 bei einem pH-Wert von 5,8.
Ein XUS 40285.00 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20 ml-Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml eines mikrofiltrierten (1,4 Mikrometer) Molkeproteinkonzentrates (Trockenmasse 5%, Protein 32% der Trockenmasse) wurde bei einem pH-Wert von 5,8 durch die Säule geleitet. Bei der Behandlung wurden 46% des Rinderinsulins aus dem Molkeproteinkonzentrat entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 98%, d. h. der Insulingehalt wurde proportional zum Protein um 45% gesenkt.
BEISPIEL 5
Entfernung von Rinderinsulin aus einem Molkeproteinkonzentrat mit einem makroretikulären auf Acryl basierenden Adsorptionsmedium, Amberlite XAD 7.
XAD 7 Adsorptionsmedium wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20 ml-Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml eines frischen Molkeproteinkonzentrates (Proteingehalt 2%) wurden bei einem pH-Wert von 6,4 durch die Säule geleitet.
Bei der Behandlung wurden 86% des Rinderinsulins aus dem Molkeproteinkonzentrat entfernt. Die Proteinausbeute betrug bei der Behandlung 85%, d. h. der Insulingehalt wurde proportional zum Protein um 73% gesenkt.
BEISPIEL 6 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung von Rinderinsulin aus entrahmter Milch mit dem Adsorptionsmedium Amberlite XAD 7 bei einem pH-Wert von 6,7.
Das Adsorptionsmedium XAD 7 wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20-ml Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml entrahmter Milch (Trockenmasse 9%, Protein 35% der Trockenmasse) wurden bei einem pH-Wert von 6,7 durch die Säule geleitet.
Bei der Behandlung wurden proportional zum Protein 40% des Rinderinsulins entfernt. Die Untersuchung ergibt, dass Rinderinsulin auch aus Milch entfernt werden kann, jedoch ist der Grad der Entfernung von Insulin geringer als bei der Behandlung von Molke.
BEISPIEL 7 (Vergleichsbeispiel)
Entfernung von Rinderinsulin aus einer Kaseinlösung mit dem Adsorptionsmedium Amberlite XAD 7 bei einem pH-Wert von 6,7.
Das Adsorptionsmedium XAD 7 wurde mit 4% NaOH + 0,09% HCl regeneriert, auf Neutral gespült und in eine 20-ml Säule eingebracht. 20 Säulenvolumen (BV), d. h. 400 ml an Natriumkaseinatlösung (Trockenmasse 3%, Protein 89% der Trockenmasse) wurden bei einem pH-Wert von 6,7 durch die Säule geleitet.
Bei der Behandlung wurden 50% des Rinderinsulins entfernt.
BEISPIEL 8
14 l Frischkäsemolke wurden bei 40°C durch ein Labstak-Ultrafiltriergerät bei einem Konzentrationsverhältnis von 6 ultra- und diafiltriert, wobei GR8lPP Membrane (6,000 D Cut-off-Membrane) verwendet wurden, auf das Ausgangsvolumen gelöst und bei einem Konzentrationsverhältnis von 4 erneut filtriert, d. h. das Gesamtkonzentrationsverhältnis betrug 24. Der Rinderinsulingehalt wurde durch das RIA-Verfahren analysiert und der Proteingehalt wurde aus der Ausgangsmolke analysiert und das Molkeproteinkonzentrat wurde als das Endretentat erhalten. Die Ausgangsmolke umfasste 21,2 ng Rinderinsulin pro g an Protein, und das Molkeproteinkonzentrat, das nach der Ultra- und Diafiltration erhalten wurde, umfasste 14,8 ng Insulin pro g an Protein.
Daher verringerte die Ultra- und Diafiltration den Rinderinsulingehalt proportional zum Protein um 30%.
BEISPIEL 9 (Vergleichsbeispiel)
5,040 kg Molkeproteinpulver, das aus Molke hergestellt wurde, die gemäß Beispiel 1 behandelt worden war, 11,423 kg einer Gemüsefettmischung, 11,232 kg gereinigter Laktose, 12,260 kg Maltodextrin (DE 21), 135 g einer Vitamin- und Mineralvormischung (enthaltend Vitamine A, D, E, K, B1, B2, B6, B12, Niacin, Folsäure, Pantothensäure, Biotin, Ascorbinsäure, Cholin, Inositol, Ferrogluconat, Zinksulphat, Mangansulfat, Natriumselenit, Kupfergluconat, und 70 g Calciumchlorid, 300 g Calciumphosphat, 65 g Magnesiumsulfat, 125 g Natriumchlorid und 620 g Kaliumcitrat wurden in 60 Litern Wasser (50°C) aufgelöst. Der Gehalt an Trockenmasse der Mischung betrug etwa 40%.
Die auf diese Weise erhaltene Mischung wurde einem Homogenisator zugeführt (150/50 Bar) und durch einen Sprühtrockner bei Trocknungstemperaturen von 180/75°C auf einem Fließbett bei 70/120/30°C zu einem Pulver getrocknet. Zusammensetzung, Enderscheinung und Geschmack des Produktes entsprachen denjenigen eines herkömmlichen Säuglingsanfangsnahrungspulvers.

Claims

Ein Verfahren zur Entfernung von Rinderinsulin aus einem aus Kuhmilch stammenden flüssigen fettfreien Proteinmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das aus Kuhmilch stammende flüssige fettfreie Rinderinsulin enthaltende Proteinmaterial, wobei das Material einen pH-Wert von 2 bis 8 aufweist, bei einer Temperatur, die geringer ist als 65°C, mit einem makroretikulären auf Styrol basierenden oder auf Acryl basierenden Adsorptionsharz, wobei das Gewichtsverhältnis des zu behandelnden Proteinmaterials zu dem Adsorptionsharz höchstens 100:1 beträgt, in Kontakt gebracht wird, und mit der Harzbehandlung wenigstens eine Ultra- und Diafiltrationsbehandlung des Proteinmaterials kombiniert wird, und wenn nötig, das so erhaltene flüssige Material zu einem Proteinkonzentrat konzentriert wird und optional zu einem Pulver getrocknet wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Molke, ein Molkeproteinkonzentrat, entrahmte Milch oder eine Kaseinlösung, bevorzugt Molke, als das aus Kuhmilch stammende fettfreie Rinderinsulin enthaltende Proteinmaterial verwendet wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis des Proteinmaterials, das behandelt werden soll, zu dem Absorptionsharz geeigneterweise 10:1 bis 40:1 beträgt.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinmaterial durch eine Säule, die mit einem Absorptionsharz gefüllt ist, bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 bis 20 Säulenvolumen (BV)/Stunde eingefüllt wird, geeigneterweise bei einer Flussgeschwindigkeit von 6 bis 8 Säulenvolumen (BV)/Stunde, bei einer Temperatur von 2 bis 30°C, geeigneterweise bei einer Temperatur von 2 bis 10°C.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinmaterial mit dem Adsorptionsharz bei einer Temperatur von 2 bis 30°C, geeigneterweise bei einer Temperatur von 2 bis 10°C, in einem Mischbehälter in Kontakt gebracht wird, wobei die Kontaktzeit unter leichtem Mischen geringer als 2 Stunden ist, geeigneterweise 60 Minuten.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das aus Kuhmilch stammende flüssige fettfreie Rinderinsulin enthaltende Proteinmaterial bevor das Proteinmaterial mit dem Adsorptionsharz in Kontakt gebracht wird und/oder nach der Adsorptionsharzbehandlung unter Verwendung von 5.000 bis 25.000 D Molekulargewicht-Cut off-Membranen ultra- und dia-gefiltert wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das aus Kuhmilch stammende flüssige fettfreie Rinderinsulin enthaltende Proteinmaterial durch Klären, geeigneterweise durch Mikrofiltration, Ultrafiltration oder Zentrifugieren, bevorzugt durch Filtern des Materials durch 0,05 bis 1,4 Mikrometer-Mikrofiltrationsmembranen, bevorzugt 0,1 Mikrometermembranen, vorbehandelt wird, bevor es mit dem Adsorptionsharz in Kontakt gebracht wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Material, behandelt mit dem Absorptionsharz, durch Ultra- und Diafiltration unter Verwendung von 5.000 bis 25.000 D Molekulargewicht-Cut off-Membranen, geeigneterweise von 10.000 D Molekulargewicht-Cut off-Membranen, zu einem Proteinkonzentrat konzentriert wird, das optional zu einem Pulver getrocknet wird, geeigneterweise durch Sprüh- oder Gefriertrocknung.