DE69922958T2

DE69922958T2 - Hcv hüllproteine partikel : verwendung für therapeutische impfung

Info

Publication number: DE69922958T2
Application number: DE69922958T
Authority: DE
Inventors: Erik Depla; Geert Maertens; Alfons Bosman; Frans Van Wijnendaele
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: PL201679B1; HU227275B1; DK1090033T3; AU765940B2; ATE286067T1; PT1090033E; EP1555270A1; EP1090033B1; US6635257B1; NZ508797A; WO1999067285A1; EP1090033A1; KR100559096B1; JP2002518037A; HUP0102478A2; EP1090033B2; CA2330526A1; HUP0102478A3; TR200003843T2; NZ528952A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die HCV-Hüllproteine in Schimpansen, die mit einem heterologen HCV-Stamm des Subtyps 1a oder des Subtyps 1b chronisch infiziert sind, eine vorteilhafte Immunantwort induzieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Erkenntnis, daß Hüllproteine hoch immunogen sind und zur Stimmulierung sowohl der zellulären als auch der humoralen Immunantwort führen. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Erkenntnis, daß die Blockierung von Cysteinen durch Alkylierung zu noch stärker immunogenen Proteinen führt. Darüber hinaus lassen sich die Hüllproteine der vorliegenden Erfindung in Partikel einbauen, die eine hohe Immunogenität und Immunreaktivität zeigen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß solche Partikel andere Proteine beinhalten können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) stellt ein ernstes Gesundheitsproblem sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern dar. Schätzungsweise sind etwa 1 bis 5% der Weltbevölkerung von dem Virus betroffen. Bei der Infektion mit HCV scheint es sich um die wichtigste Ursache für eine Hepatitis im Zusammenhang mit Transfusionen zu handeln, wobei sich diese Infektion häufig zu einer chronischen Leberschädigung weiterentwickelt. Zudem gibt es Hinweise dafür, daß HCV mit der Induktion von Leberzellenkarzinom im Zusammenhang steht. Infolge dessen besteht ein hoher Bedarf an zuverlässigen Diagnoseverfahren und wirksamen Therapeutika. Empfindliche sowie spezifische Screeningverfahren für mit HCV kontaminierten Blutprodukten sowie verbesserte Verfahren zur Kultivierung von HCV werden ebenso benötigt.
Das HCV ist ein Positivstrang-RNA-Virus mit ungefähr 9600 Basen, die wenigstens drei Struktur- und sechs Nichtstrukturproteine codieren. Aufgrund der Sequenzhomologie konnten die Strukturproteine funktionell als ein einzelnes Kernprotein („Core") und zwei Hüllproteine, nämlich E1 und E2, zugeordnet werden. Das E1-Protein besteht aus 192 Aminosäuren und enthält, je nach HCV-Genotyp, 5 bis 6 N-Glycosylierungsstellen. Das E2-Protein besteht aus 363 bis 370 Aminosäuren und enthält, je nach HCV-Genotyp, 9–11 N-Glycosylierungsstellen (für Übersichtsartikel, siehe: Major und Feinstone, 1997; Maertens und Stuyver, 1997). Das E1-Protein enthält verschiedene variable Domänen (Maertens und Stuyver, 1997), während das E2-Protein drei Hypervariable Domänen enthält, wobei die Hauptdomäne am N-Terminus des Proteins lokalisiert ist (Maertens und Stuyver, 1997). Die zuletzt genannten Hüllproteine konnten bereits durch rekombinante Techniken in Escherichia coli, Insektenzellen, Hefezellen sowie Säugerzellen produziert werden. Die Verwendung eines Expressionssystems in höheren Eukaryonten und vor allem in einer Säugerzellkultur führt zu Hüllproteinen, die von Antikörpern in Patientenproben effektiv erkannt werden (Maertens et al., 1994).
Es ist vorgeschlagen worden, daß das E1-Hüllprotein das E2-Hüllprotein dazu benötigt, einen korrekten Faltungszustand zu erreichen (Deleersnyder et al., 1997). Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, daß E1 und E2 Heterodimere bilden, die die Grundeinheit der Virushülle bilden könnten (Yi et al., 1997). In der WO 98/21338 von Liang et al. wurden diese Annahmen dazu verwendet, HCV-Partikel zu konstruieren, die aus E1 und E2 ebenso wie aus Core und P7 bestehen. Mit anderen Worten: Eine getrennte Verwendung von E1 oder E2 für die Immunisierung und weitere Zwecke wird im Stand der Technik nicht vorgeschlagen. Von Houghton (1997) wurde jedoch berichtet, daß wiederholte Immunisierungen von drei chronisch mit HCV infizierten Schimpansen mit rekombinantem gpE1E2 (4 × 25 μm) keine signifikante Immunantwort induzierten. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung kamen zu dem Schluß, daß die Induktion einer Anti-Hüllen-Immunantwort in Patienten mit chronischer Hepatitis C tatsächlich wünschenswert und vorteilhaft für den Patienten wäre, da höhere Spiegel solcher Antikörper mit einer positiven Reaktion auf Interferontherapie zu korrelieren scheinen und daher bei der Eliminierung des Virus aus dem Patienten behilflich sein können (PCT/EP 95/03031 von Maertens et al.). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung kamen weiterhin zu dem Schluß, daß, da die Antikörperspiegel gegen E1 in chronischen HCV-Trägern zu den niedrigsten aller HCV-Antikörper gehören, es vorteilhaft sein kann, diese Antikörperspiegel, und möglicherweise die Zellantwort, zu erhöhen, um eine Kontrolle oder sogar die Eliminierung der Infektion durch den Wirt zu induzieren. Ebenso scheinen höhere Spiegel der zellulären Immunität gegen E1 mit einer positiven Reaktion auf Interferontherapie zu korrelieren (Leroux-Roels et al., 1996).
Neben der Bedeutung der Anti-E1-Immunität in Verbindung mit Interferontherapie deuten andere Anzeichen darauf hin, daß gewisse andere Teile des HCV-Genoms für die Induktion einer spezifischen Immunantwort, die eine Kontrolle der Infektion gestatten könnte, wichtig sein könnten. Ebenso konnte eine T-Zellreaktivität gegen den C-terminalen Bereich des Kernproteins häufiger bei auf Interferontherapie reagierenden Patienten beobachtet werden (Leroux-Roels et al., 1996). In Patienten mit abklingender HCV-Infektion nach einer Lebertransplantation konten potentiell neutralisierende Antikörper gegen das NS4B-Protein gezeigt werden (Villa et al., 1998). Ebenso konnten innerhalb von NS3 mehrere T-Zellepitope kartiert werden, die mit der Eliminierung von HCV während der akuten Phase zu korrelieren scheinen (siehe: PCT/EP 94/03555 von Leroux-Roels et al.; Leroux-Roels et al., 1996; Rehermann et al., 1996 und 1997; Diepolder et al., 1995 und 1997). Weiterhin zeigen Antikörper gegen NS5A wie die E1-Antikörper höhere Spiegel auf Grundlinienniveau vor der Therapie mit Interferon-alpha in Patienten mit einer Langzeitreaktion (long term responders, LTR) im Vergleich mit Patienten ohne Reaktion.
Die Impftherapie gegen HCV war bislang noch nicht erfolgreich. Ebenso konnte gezeigt werden, daß eine prophylaktische Impfung nur gegen einen homologen HCV-Stamm wirksam ist (Choo et al., 1994). Die folgende Erfindung betrifft die überraschende Erkenntnis, daß die Verabreichung eines HCV-Hüllantigens den Zustand einer chronischen aktiven Hepatitis in einem mit einem heterologen Stamm oder Isolat infizierten Individuum dramatisch verbessern kann, und zwar sowohl bei einer Infektion mit einem heterologen Subtyp 1a als auch einem heterologen Subtyp 1b. Tatsächlich zeigten chronisch infizierte Schimpansen, denen sechs Dosen von 50 μg E1s (d.h. AS 192–326 von E1) appliziert worden waren, überraschenderweise starke humorale und zelluläre Immunantworten, die vor dieser Impfung über den gesamten Zeitraum der chronischen Infektion nicht zustande gebracht worden waren. Zudem konnte virales Antigen über einen Zeitraum von zwei bis fünf Monaten in der Leber nicht nachgewiesen werden, und dies blieb der Fall für wenigstens 5 Monate nach der Impfung. Obwohl die HCV-RNA-Titer im Serum nicht abnahmen, zeigten die Leberenzymspiegel im Serum eine deutliche Tendenz zur Normalisierung. Von größter Wichtigkeit war hierbei die dramatische Verbesserung der Leberhistologie in beiden geimpften Individuen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die überraschende Erkenntnis, daß das zur Impfung verwendete E1-Protein, das als einzelnes HCV-Protein ohne seinen hydrophoben Anker exprimiert wurde, stabile Partikel bildet. Es sollte hier auch festgehalten werden, daß zur Vermeidung der Induktion einer Immunantwort gegen nichtrelevante Epitope das zur Impfung verwendete E1-Protein als Konsensussequenz aus aus einer einzigen Serumprobe von einem chronischen Träger stammenden individuellen Klonen konstruiert wurde. Die vorliegende Anmeldung betrifft darüber hinaus die Erkenntnis, daß die Induktion solcher Anti-E1-Antworten durch Verwendung von Antigenen eines Genotyps, der sich von denen der im Wirt vorhandenen Infektion unterscheidet, erhöht werden kann. Zudem betrifft die vorliegende Anmeldung die Erkenntnis, daß bei einer Alkylierung der Cysteine der HCV-Hüllproteine, beispielsweise mittels N-(Jodethyl)-trifluoracetamid, Ethylenimin oder aktiver Halogene, wie z.B. Jodacetamid, die wie oben beschriebenen oligomeren Partikel eine noch höhere Immunogenität zeigen. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Erkenntnis, daß eine Mutation von Cysteinen der HCV-Hüllproteine zu einer anderen natürlich vorkommenden Aminosäure vorzugsweise zu Methionin, Glutaminsäure, Glutamin oder Lysin, in den wie oben beschriebenen oligomeren Partikeln ebenso zu einer höheren Immunogenität, verglichen mit den ursprünglichen Hüllproteinen, führt.
ZIELE DER ERFINDUNG
Aus der Literatur ist ersichtlich, daß ein dringender Bedarf an der Entwicklung zuverlässiger Impfstoffe und wirksamer Therapeutika gegen HCV besteht. Daher besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, eine Antigenpräparation bereitzustellen, die zur Induktion einer spezifischen humoralen und zellulären Immunität gegenüber HCV-Hüllproteinen fähig ist, und zwar selbst (aber nicht ausschließlich) in chronischen HCV-Trägern. Die gleichen Antigene lassen sich zur Diagnose der Immunantwort verwenden.
Insbesondere besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, eine wie oben definierte Antigenpräparation bereitzustellen, die aus stabilen Partikeln einzelner HCV-Hüllproteine besteht. Dabei versteht sich, daß derartige Partikel oder ein Verfahren zur Herstellung derartiger Partikel zur Zeit im Stand der Technik nicht bekannt sind. Zudem findet sich im Stand der Technik kein Hinweis darauf, daß irgendeine Antigenpräparation, einschließlich solcher stabiler Partikel, erfolgreich als (heterologer) prophylaktischer oder therapeutischer Impfstoff gegen HCV eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Herstellung stabiler Partikel bereitzustellen, die sich erfolgreich als prophylaktisches oder therapeutisches Mittel gegen HCV einsetzen lassen, wobei das Verfahren zusätzliche HCV-Antigene codierende DNA-Impfstoffe bereitstellt. Insbesondere besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Herstellung dieser Partikel auf Grundlage der Detergens-unterstützten Partikelbildung (siehe weiter unten) bereitzustellen. Weiterhin besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, Verfahren zur Herstellung von Partikeln, die aus von unterschiedlichen HCV-Genotypen erhaltenen Antigenen bestehen, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Behandlung oder therapeutischen Impfung chronisch infizierter Patienten unter Verwendung der oben angegebenen Antigenimpfstoffe, möglicherweise kombiniert mit weiteren Verbindungen, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur prophylaktischen Impfung des Menschen gegen HCV bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, oligomere Partikel bereitzustellen, die aufgrund der Alkylierung wenigstens eines Cysteinrests des HCV-Hüllproteins eine bessere Immunogenität aufweisen. Dieses Protein läßt sich insbesondere mittels Ethylenimin, N-(Iodethyl)trifluoracetamid oder aktiver Halogene alkylieren. Diesbezüglich besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung der zusätzlichen Verwendung von oligomeren Partikeln als Vehikel zur wirksamen Präsentation von nicht-HCV-Epitopen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines T-Zellenstimulierenden Antigens.
Alle Ziele der vorliegenden Erfindung werden als durch die unten aufgeführten Ausführungsformen erfüllt betrachtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN UND ZEICHNUNGEN
In Tabelle 1 sind Sequenzen von aus einem einzigen chronischen Träger gewonnenen E1-Klonen aufgeführt, wobei das zur Produktion eines Impfstoffs verwendete E1-Konstrukt die Konsensussequenz aller dieser einzelnen Klone darstellt. V1–V5: Variable Bereiche 1–5; C4: Konstante Domäne 4; HR: Hyrophober Bereich; HCV-B con: Konsensussequenz an den Positionen, die zwischen den Klonen und HCV-J variabel sind.
In Tabelle 2 sind Sequenzen des E1-Impfstoffproteins sowie des E1-Proteins, wie es in den infizierten Schimpansen Phil und Ton gefunden wurde, aufgeführt. Das Subtyp 1b-Isolat aus Phil unterschied sich vom Impfstoffstamm um 5,92. Der Unterschied zwischen dem Impfstoff und dem Subtyp-1a-Isolat aus Ton betrug 20,74%.
In Tabelle 3 ist eine schematische Übersicht über die Änderungen, die durch die therapeutische Impfung in zwei chronisch infizierten Schimpansen (Ton und Phil) induziert wurden, dargestellt. Die Analyse wurde wie für 8 und 11 erläutert durchgeführt. Darüber hinaus wurden aus den Leberbiopsien Histologie und Entzündung aufgezeichnet.
In Tabelle 4 sind Sequenzen von zur Kartierung der B-Zellepitope verwendeten Peptiden aufgeführt. Dabei ist zu beachten, daß HR mit V4V5 überlappt.
Tabelle 5 zeigt die Umstellung von NS3 zur Bildung eines kürzeren Proteins, das alle wesentlichen, mit der Viruseliminierung korrelierenden Epitope trägt.
In Tabelle 6 ist die LIA-Reaktivität von E1s-Acetamid gegenüber E1s-Maleimid mit Seren chronischer HCV-Träger gezeigt. Dabei wurden Proteine auf den LIA-Membranen immobilisiert. E1s-Acetamid wurde als solches auf die LIA-Streifen aufgesprüht, während E1s-Maleimid (das auch Biotin-Maleimid enthielt) vor dem Aufsprühen mit Streptavidin komplexiert wurde. Antigene wurden an LIA-Membranen gebunden, und die Streifen wurden im wesentlichen wie bei Zrein et al. (1998) beschrieben weiterbehandelt. Gegen diese Antigene gerichtete menschliche Antikörper wurden unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten menschlichen Anti-IgGs sichtbar gemacht. Zur Farbentwicklung des Streifens wurden NBT und BCIP verwendet. Die Färbung wurde von 0,5 bis 4 bewertet, wie bei Zrein et al. (1998) erläutert. Die Anzahl positiver Proben (#pos) sowie der Prozentanteil (%pos) sind bei einer für diesen Test verwendeten Ausschlußgrenze von 0,5 am Ende der Tabelle angegeben.
1. Übereinandergelegte Größenausschlußchromatographieprofile der gemäß Maertens et al. (PCT/EP95/03031) exprimierten und gereinigten Proteine E1s und E2s in PBS/3% Empigen-BB.
2. Übereinandergelegte Größenausschlußchromatographieprofile (SEC [size exclusion chromatography]-Profile) der gemäß Maertens et al. (PCT/EP95/03031) exprimierten und gereinigten Proteine E1s und E2s, wobei diese einem weiteren Lauf auf der gleichen SEC-Säule in PBS/0,2% CHAPS unterworfen wurden, so daß spezifische oligomere Strukturen mit einem geschätzten scheinbaren Molekulargewicht von 250–300 kDa erhalten wurden. Ein ähnlicher Assoziationsgrad läßt sich mit 3% Betain erzielen.
3. Übereinandergelagerte Größenausschlußchromatographieprofile der gemäß Maertens et al. (PCT/EP95/03031) exprimierten und gereinigten Proteine E1s und E2s, die zur Erhaltung spezifischer oligomerer Strukturen, wie in 2 gezeigt, einem zweiten Lauf in 0,2% CHAPS oder 3% Betain sowie zur Erhaltung spezifischer homooligomerer Strukturen mit einem geschätzten scheinbaren Molekulargewicht von 250–300 kDa (E2s) sowie > 600 kDa (E1s) einem dritten Lauf auf der gleichen SEC-Säule in 0,05% CHAPS unterworfen wurden. Ähnliche Assoziationsgrade lassen sich mit 0,1 oder 0,5% Betain erzielen.
4 Dynamische Lichtstreuungsanalyse, ausgedrückt als Prozentanteil der Anzahl Partikel im Verhältnis zum beobachteten Durchmesser in nm, von E1s in PBS/0,05% CHAPS.
5 Dynamische Lichtstreuungsanalyse, ausgedrückt als Prozentanteil der Anzahl Partikel im Verhältnis zum beobachteten Durchmesser in nm, von E1s in PBS/0,1% Betain (oben) oder 0,5% Betain (unten).
6 EM-Färbung von (A) E1s in PBS/0,05% CHAPS und (B) E1s in PBS/3% Betain.
7 Größenverteilung von E1s-Partikeln in PBS/0,05% CHAPS
8 Entwicklung von Anti-E1-Antikörpern, induziert durch sechs aufeinanderfolgende Immunisierungen sowie drei Auffrischungsimmunisierungen (durch kleine Pfeile angedeutet) in einem 1b-infizierten Schimpansen (Phil), und die Entwicklung von ALT, HCV-RNA und Anti-E1-Antikörpern. An Festphasen-E1 bindende Anti-E1-Antikörper wurden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten Anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet. Die Ergebnisse sind als Endpunkttiter ausgedrückt. Die ALT-Spiegel wurden mit einem klinischen Analysegerät bestimmt und sind als U/I ausgedrückt. HCV-RNA im Serum wurde mit einem HCV-Monitor (Roche, Basel, Switzerland) bestimmt. Die Viruslast in der Leber wurde durch halbquantitative Bestimmung der Menge an in der Leberbiopsie angefärbtem E2-Antigen unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers (ECACC-Zugangsnummer 98031215, wie in der EP-Anmeldung Nr. 98870060.5 beschrieben) bestimmt.
9 Epitopkartierung der durch Immunisierung mit E1 im Schimpansen Phil induzierten Antikörperantworten. Die Antikörperreaktivität gegenüber den verschiedenen Peptiden wurde mit einem indirekten ELISA, bei dem biotinylierte Peptide (siehe auch Tabelle 4) über Streptavidin an den Mikrotiterplatten adsorbiert werden, gemessen. Spezifische Antikörper werden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten Anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachge wiesen. Als Substrat zur Farbentwicklung wurde TMB verwendet.
10 Ergebnisse des Lymphozytenproliferationstests vor und nach Impfung im Schimpansen Phil. Gefrorene PBMC wurden aufgetaut und in Dreifachbestimmung mit unterschiedlichen Antigenen stimuliert. Als Negativkontrolle diente Medium allein, während Concanavalin A als Positivkontrolle bei einer Konzentration von 5 μg/ml verwendet wurde. PBMC wurden mit einer Konzentration von 2–4 × 10⁵ Zellen/Loch in einem Gesamtvolumen von 150 μl in RPMI-1640-Medium, dem 10% hitzeinaktiviertes FCS zugesetzt war, in U-förmigen 96-Loch Mikrotiterplatten zusammen mit den Kontrollen oder 1 μg/ml E1 90 h bei 37°C in einer luftfeuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. Während der letzten 18 h wurden die Zellen mit 0,5 μCi (³H)-Thymidin pro Loch gepulst. Anschließend wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern geerntet, und die Aufnahme der Markierung wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind als Stimulationsindizes (SI) ausgedrückt: Mittlere cpm Antigen/mittlere cpm Medium allein, jeweils Dreifachbestimmungen.
11 Entwicklung von Anti-E1-Antikörpern, induziert durch sechs aufeinanderfolgende Immunisierungen sowie drei Auffrischungsimmunisierungen (angedeutet durch kleine Pfeile) im mit HCV-Subtyp 1a infizierten Schimpansen Ton. Gezeigt sind die Entwicklung von ALT, HCV-RNA im Serum sowie die Bestimmung des HCV-Antigens in der Leber. Anti-E1-Antikörper wurden mittels eines indirekten ELISA bestimmt: An festphasenbeschichtetes E1 bindende spezifische Antikörper werden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet. Die Ergebnisse sind als Endpunkttiter ausgedrückt. Die ALT-Spiegel wurden mit einem klinischen Analysegerät bestimmt und sind als U/I ausgedrückt. HCV-RNA wurde mit dem HCV-Monitor (Roche, Basel, Switzerland) bestimmt. E2-Antigen wurde unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers (ECACC-Zugangsnummer 98031215, wie in der EP-Anmeldung Nr. 98870060.5 beschrieben) bei der Leberbiopsie angefärbt. Die halbquantitative Bewertung ist durch schwarze Quadrate für eine deutlich positive Anfärbung in der Mehrzahl der Zellen, durch graue Quadrate für eine deutliche Anfärbung in der Minorität der Zellen und durch weiße Quadrate für Biopsien, die keine nachweisbare Anfärbung zeigen, angedeutet. HCV-RNA ist durch kleine schwarze Kästchen angedeutet. Die Anfärbung von E2 ließ sich durch Anfärbung von Core und E1 bestätigen (Daten nicht gezeigt).
12 Epitopkartierung der durch Immunisierung mit E1 in Ton induzierten Antikörperantwort. Die Antikörperreaktivität gegenüber den verschiedenen Peptiden wurde mit einem indirekten ELISA gemessen, bei dem biotinylierte Peptide (siehe auch Tabelle 4) über Streptavidin an den Mikrotiterplatten adsorbiert werden. Spezifische Antikörper werden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Als Substrat zur Farbentwicklung wurde TMB verwendet.
13 Analyse von E1-Antikörper-Antworten auf E1-Proteine des Subtyps 1a und des Subtyps 1b im Schimpansen Ton. Zu diesem Zweck wurde ein rekombinantes Vaccinia-Virus mit einem von der HCV-H-Sequenz abgeleiteten E1-Genotyp 1a erzeugt, das den gleichen E1-Teil wie für Genotyp 1b (siehe unten) exprimiert. E1 wurde aus Rohlysaten aus mit Vaccinia-Virus infizierten RK13-Zellen (hergestellt wie bei Maertens et al. (PCT/EP95/03031) beschrieben) gewonnen. Die Antikörperreaktivität wurde mit einem indirekten ELISA gemessen, bei dem E1 über das „High-Mannose" [Mannosereiche Strukturen] bindende Agglutinin aus Galanthus nivalis (GNA) auf den Mikrotiterplatten adsorbiert wurde. Spezifische Antikörper wurden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet. Die Ergebnisse sind als differentielle OD (OD des Lochs mit adsorbiertem E1 minus OD des Lochs ohne adsorbiertes E1) ausgedrückt.
14 Ergebnisse des Lymphozytenproliferationstests vor und nach Impfung des Schimpansen Ton. Gefrorene PBMC wurden aufgetaut und in Dreifachbestimmung mit unterschiedlichen Antigenen stimuliert. Als Negativkontrolle diente Medium allein, während Concanavalin A als Positivkontrolle bei einer Konzentration von 5 μg/ml verwendet wurde. PBMC wurden mit einer Konzentration von 2–4 × 10⁵ Zellen/Loch in einem Gesamtvolumen von 150 μl in RPMI-1640-Medium, dem 10% hitzeinaktiviertes FCS zugesetzt war, in U-förmigen 96-Loch Mikrotiterplatten zusammen mit den Kontrollen oder 1 μg/ml E1 90 h bei 37°C in einer luftfeuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. Während der letzten 18 h werden die Zellen mit 0,5 μCi (³H)-Thymidin pro Loch gepulst. Anschließend werden die Kulturen auf Glasfaserfiltern geerntet, und die Aufnahme der Markierung wird bestimmt. Die Ergebnisse sind als Stimulationsindizes (SI) ausgedrückt: Mittlere cpm Antigen/mittlere cpm Medium allein, jeweils Dreifachbestimmungen.
15 Karten der zur Erzielung der Expression eines E2-Proteins, dessen N-terminaler hypervariabler Bereich deletiert ist, verwendeten Konstrukte. Bei den Konstrukten pvHCV-92 und pvHCV-99 handelt es sich um Zwischenkonstrukte, die zur Konstruktion der Deletionsmutanten pvHCV-100 und pvHCV-101 verwendet wurden.
16 Sequenz (Nukleotide: A; Translation: B), die den in 15 (siehe oben) dargestellten Konstrukten entspricht.
17 In Mäusen nach Immunisierung mit unterschiedlichen E1-Präparationen, wie in Beispiel 9 beschrieben, erhaltene Antikörpertiter. Die Titer wurden mittels ELISA bestimmt: Mausseren wurden 1:20 und weiter (0,5 log₁₀) verdünnt und auf mit E1s (entweder Acetamid- oder Maleimid-modifiziert) beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert. Nach dem Waschen werden bindende Antikörper mit einem mit Peroxidase konjugierten anti-Maus-IgG-spezifischen sekundären Antiserum nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet. Die Ergebnisse sind als Endpunkttiter ausgedrückt, wobei die Standardabweichungen gezeigt sind (n = 6).
18 Epitopkartierung der durch Immunisierung mit unterschiedlichen E1s-Präparationen in Mäusen induzierten Antikörperantwort. Die Antikörperreaktivität gegenüber den verschiedenen Peptiden wurde mit einem indirekten ELISA gemessen, bei dem biotinylierte Peptide (in Tabelle 4 aufgeführt) über Streptavidin auf den Mikrotiterplatten adsorbiert werden. Mausseren wurden 1:20 verdünnt, und spezifische Antikörper werden mit einem mit Peroxidase konjugierten anti-Maus-IgG-spezifischen sekundären Antiserum nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet.
19 Immunglobulin-Isotypisierungsprofil von mit unterschiedlichen E1s-Präparationen immunisierten Mäusen. Spezifische Antikörper der Ig-Klasse und -Unterklasse wurden an der Mikrotiterplatte adsorbiert. Nach dem Einfangen des Maus Ig aus den 1:500 verdünnten Immunseren, wurde E1s bei 1 μg/ml inkubiert. Die gebildeten Immunkomplexe wurden weiter mit einem polyklonalen gegen E1 gerichteten Kaninchen-Antiserum inkubiert. Schließlich wurden die Kaninchen-Antikörper mit einem mit Peroxidase konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Ig sekundären Antiserum nachgewiesen. Als Substrat für die Farbentwicklung wurde TMB verwendet. Die Ergebnisse wurden auf IgG₁ normiert (d.h. das IgG₁-Signal wurde für jedes Tier getrennt als eins angenommen, wobei alle Ergebnisse für die anderen Isotypen relativ zu diesem IgG₁-Ergebnis ausgedrückt wurden).
20 Durch 2 Imunisierungen mit E1s-Acetamid im Schimpansen Phil um den Tag 1000 herum induzierte Antikörpertiter. Anti-E1-Antikörper wurden mittels eines indirekten ELISA bestimmt: spezifische, an Festphasen-E1 bindende Antikörper werden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten Anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Der Titer wird in Einheiten/ml ausgedrückt, wobei diese Einheiten sich auf einen auf Menschenseren beruhenden Hausstandard beziehen.
21 Durch zwei Immunisierungen mit E1s-Acetamid im Schimpansen Ton um Tag 900 herum induzierte Antikörpertiter. Anti-E1-Antikörper wurden mittels eines indirekten ELISA bestimmt: spezifische, an Festphasen-E1 bindende Antikörper werden unter Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten anti-Mensch-IgG-spezifischen sekundären Antiserums nachgewiesen. Der Titer wird in Einheiten/ml ausgedrückt, wobei diese Einheiten sich auf einen auf Menschenseren beruhenden Hausstandard beziehen.
22 SEC-Profil des abschließenden Detergenz-Reduzierungsschritts (0,2 auf 0,05% CHAPS): Partikel mit E1 allein (A), Partikel mit E2 allein (B) oder äquimolares Gemisch aus E1 und E2; Mischpartikel (C). Die Figur zeigt ebenso eine Überlagerung der OD-Werte eines ELISA, mit dem spezifisch nur E1 (oben) oder nur E2 (mitte) nachgewiesen wird, sowie eines ELISA, mit dem nur Mischpartikel nachgewiesen werden (unten).
23 SEC-Profil des abschließenden Detergenz-Reduzierungsschritts (0,2 auf 0,05% CHAPS): Partikel mit E1-Genotyp 1b allein (oben), Partikel mit E1-Genotyp 4 allein (mitte) oder äquimolares Gemisch aus E1-Genotyp 1b und 4, Mischpartikel (unten). Die Figur zeigt ebenso eine Überlagerung der OD-Werte eines ELISA, mit dem nur Mischpartikel spezifisch nachgewiesen werden (siehe auch 22).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier beschriebene Erfindung greift auf zuvor veröffentlichte Arbeiten sowie anhängige Patentanmeldungen zurück. Bei diesen Arbeiten handelt es sich beispielhaft um wissenschaftliche Veröffentlichungen, Patente oder anhängige Patentanmeldungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die HCV-Impfung. Dabei konnte zum ersten Mal eine erfolgreiche Immuntherapie von Schimpansen mit schwerer chronischer aktiver Hepatitis C durch Impfung mit einem HCV-Antigen erzielt werden. Der Impfstoff induzierte nicht nur starke Immunantworten sondern auch die Eliminierung von viralem Antigen aus der Leber sowie eine beträchtliche Verbesserung der histologischen Aktivität und eine deutliche Besserung der Lebererkrankung. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Oligomerpartikel. Die Oligomerpartikel bestehen im wesentlichen aus HCV-Hüllproteinen und weisen einen Durchmesser von 5–100 nm auf, wie mittels dynamischer Lichtstreuung oder möglicherweise Elektronenmikroskopie gemessen. In diesem Zusammenhang sollte betont werden, daß die Partikel nur aus E1- und/oder E2-Proteinen oder Teilen davon gebildet werden können (siehe unten). Daher unterscheiden sich die Oliomerpartikel der vorliegenden Erfindung grundsätzlich von den in der WO 98/21338 beschriebenen HCV ähnlichen Partikeln, die notwendigerweise aus E1 und E2 sowie Core und P7 bestehen. Die Begriffe „im wesentlichen aus HCV-Hüllproteinen bestehende Oligomerpartikel" sind hier als Strukturen einer besonderen Art und Form definiert, die mehrere Basiseinheiten der HCV-E1- und/oder -E2-Hüllproteine enthalten, von denen angenommen wird, daß sie selbst aus einem oder zwei E1- bzw. E2-Monomeren bestehen. Dabei sollte offensichtlich sein, daß die Partikel der vorliegenden Erfindung als frei von infektiösen HCV-RNA-Genomen definiert sind. Bei den Partikeln der vorliegenden Erfindung kann es sich um Partikel höherer Ordnung in Kugelform handeln, die leer sein können und dabei aus einer Schale von Hüllproteinen bestehen, in denen Lipide, Detergenzien, das HCV-Kernprotein oder Hilfsmoleküle eingelagert sein können. Die letzteren Partikel können ebenso von Liposomen oder Apolipoproteinen, wie z.B. Apolipoprotein B oder Lipoproteinen niedriger Dichte oder von anderen Mitteln zum Lenken dieser Partikel auf ein spezifisches Organ oder Gewebe umschlossen sein. In diesem Fall werden solche leeren kugelförmigen Partikel häufig als „virusähnliche Partikel" oder VLPs [= viral-like-particles] bezeichnet. Andererseits kann es sich bei den Partikeln höherer Ordnung um massive kugelförmige Strukturen handeln, wobei die komplette Kugel aus HCV-E1- oder E2-Hüllproteinoligomeren besteht, in denen zusätzlich Lipide, Detergenzien, das HCV-Kernprotein oder Hilfsmoleküle eingelagert sein können, oder die wiederum selbst von Liposomen oder Apolipoproteinen, wie z.B. Apolipoprotein B, Lipoproteinen niedriger Dichte, oder von beliebigen anderen Mitteln zum Lenken dieser Partikel auf ein spezifisches Organ oder Gewebe, z.B. Asialoglycoproteinen, umschlossen sein können. Die Partikel können auch aus kleineren Strukturen (verglichen mit den oben angegebenen leeren bzw. massiven kugelförmigen Strukturen) bestehen, die normalerweise eine runde (siehe weiter unten) Form aufweisen und die normalerweise nicht mehr als eine einzige Schicht aus HCV-Hüllproteinen enthalten. Ein typisches Beispiel für solche kleineren Partikel sind rosettenähnliche Strukturen, die aus einer geringen Anzahl HCV-Hüllproteinen, normalerweise zwischen 4 und 16, bestehen. Zu den letzteren gehören beispielsweise die mit E1s in 0,2% CHAPS erhaltenen kleineren Partikel, wie sie hier beispielhaft dargestellt sind und die anscheinend 8–10 E1s-Monomere enthalten. Solche rosettenähnlichen Strukturen sind üblicherweise in einer Ebene organisiert und weisen eine runde Form, d.h. die Form eines Rads, auf. Dabei können wiederum zusätzlich Lipide, Detergenzien, das HCV-Kernprotein oder Hilfsmoleküle eingelagert sein, oder die kleineren Partikel können von Liposomen oder Apolipoproteinen, wie z.B. Apolipoprotein B oder Lipoproteinen niedriger Dichte, oder von beliebigen anderen Mitteln zum Lenken dieser Partikel auf ein spezifisches Organ oder Gewebe umschlossen sein. Kleinere Partikel können auch kleine kugelförmige oder globuläre Strukturen bilden, die aus einer ähnlichen, geringen Anzahl an HCV-E1- oder -E2-Hüllproteinen bestehen, in denen zusätzlich Lipide, Detergenzien, das HCV-Kernprotein oder Hilfsmoleküle eingelagert sein können oder die wiederum von Liposomen oder Apolipoproteinen, wie z.B. Apolipoprotein B oder Lipoproteinen niedriger Dichte, oder von beliebigen anderen Mitteln zum Lenken dieser Partikel auf ein spezifisches Organ oder Gewebe umschlossen sein können. Die Größe (d.h. der Durchmesser) der oben definierten Partikel, wie sie mit den im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken der dynamischen Lichtstreuung gemessen wird (siehe weiter unten im Beispielteil), liegt üblicherweise zwischen 5 bis 100 nm, stärker bevorzugt zwischen 5 bis 70 nm, noch stärker bevorzugt zwischen 5 und 40 nm, zwischen 5 bis 20 nm, zwischen 5 bis 16 nm, zwischen 7 bis 14 nm oder zwischen 8 bis 12 nm.
Die Erfindung betrifft weiter ein Oligomerpartikel mit der oben angegebenen Bedeutung, wobei die Hüllproteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus HCV-E1-, HCV-E1s-, HCV-E2-Proteinen, SEQ ID No 13 oder SEQ ID No 14 oder Teilen davon. Die Proteine HCV-E1 und HCV-E2 sowie eine ausführliche Beschreibung, wie diese Proteine zu reinigen sind, sind in der PCT/EP 95/03031 von Maertens et al. gut beschrieben und charakterisiert. HCV E1s, SEQ ID No 13 oder SEQ ID No 14 oder Teile davon lassen sich, ähnlich wie für HCV-E1 oder HCV-E1s in der PCT/EP 95/03031 von Maertens et al. Beschrieben, reinigen. Das Protein HCV-E1s bezieht sich auf die Aminosäuren 192 bis 326 von E1 und stellt das E1-Protein ohne seinen C-terminalen hydrophoben Anker dar. Der Begriff „oder Teile davon" betrifft einen beliebigen Teil der hier angezeigten Proteine, die immunogen sind, sobald sie Teil eines Partikels der vorliegenden Erfindung sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin Oligomerpartikel, wie hier beschrieben, wobei wenigstens ein Cysteinrest des wie oben beschriebenen HCV-Hüllproteins alkyliert ist, und zwar vorzugsweise alkyliert mit Hilfe von Alkylierungsmitteln, wie z.B. aktiven Halogenen, Ethylenimin oder N-(Jodethyl)trifluoracetamid. In diesem Zusammenhang versteht es sich, daß die Alkylierung von Cysteinen sich auf Cysteine bezieht, bei denen der Wasserstoff am Schwefelatom durch (CH₂)_nR ersetzt ist, wobei n gleich 0, 1, 2, 3 oder 4 und R = H, COOH, NH₂, CONH₂, Phenyl oder ein Derivat davon ist. Die Alkylierung läßt sich mit allen im Fachgebiet bekannten Verfahren durchführen wie z.B. mit aktiven Halogenen X(CH₂)_nR wobei X für ein Halogen, wie z.B. I, Br, Cl oder F steht. Aktive Halogene sind beispielsweise Methyliodid, Iodessigsäure, Iodacetamid und 2-Bromethylamin. Zu weiteren Alkylierungsverfahren gehören die Verwendung von Ethylenimin oder N-(Iodethyl)trifluoracetamid, die beide zur Substitution von H durch -CH₂-CH₂-NH₂ führen (Hermanson, 1996). Der Begriff „Alkylierungsmittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Verbindungen, die in der Lage sind, eine Alkylierung, wie sie hier beschrieben ist, durchzuführen. Solche Alkylierungen führen schließlich zu einem modifizierten Cystein, das andere Aminosäuren imitieren kann. Die Alkylierung mit einem Ethylenimin führt zu einer lysinähnlichen Struktur, und zwar in einer solchen Weise, daß neue Spaltstellen für Trypsin eingeführt werden (Hermanson 1996). Analog dazu führt die Verwendung von Methyliodid zu einer methioninähnlichen Aminosäure, während die Verwendung von Iodacetat und Iodacetamid zu glutaminsäureähnlichen bzw. glutaminähnlichen Aminosäuren führt. In Analogie dazu werden diese Aminosäuren bevorzugt bei der direkten Mutation von Cystein eingesetzt.
Der Begriff „gereinigt", wie er hier angewandt wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, wobei die gewünschten Bestandteile, wie z.B. HCV-Hüllproteine oder Oligomerpartikel, wenigstens 35% der gesamten Bestandteile in der Zusammensetzung umfassen. Die gewünschten Bestandteile umfassen vorzugsweise wenigstens etwa 40%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 50%, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 60%, noch stärker bevorzugt etwa 70%, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 80%, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 90%, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 95% und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 98% der Gesamtbestandteilfraktion der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung kann weitere Verbindungen enthalten, wie z.B. Kohlenhydrate, Salze, Lipide, Lösungsmittel u.ä., ohne daß dadurch die Bestimmung der prozentualen Reinheit, wie sie hier verwendet wird, beeinflußt wird. Ein „isoliertes" HCV-Oligomerpartikel soll dabei eine HCV-Oligomerpartikelzusammensetzung darstellen, die wenigstens 35% rein ist. Der Begriff „im wesentlichen gereinigte Oligomerpartikel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf HCV-Oligomerpartikel, so daß diese für in-vitro-Diagnoseverfahren und Therapeutika verwendet werden können. Diese HCV-Oligomerpartikel sind weitgehend frei von zellulären Proteinen, vektorabgeleiteten Proteinen oder anderen HCV-Virusbestandteilen. Üblicherweise werden diese Partikel oder Proteine zur Homogenität gereinigt (mindestens 80% rein, vorzugsweise 85%, stärker bevorzugt 90%, stärker bevorzugt 95%, stärker bevorzugt 97%, stärker bevorzugt 98%, stärker bevorzugt 99%, noch stärker bevorzugt 99,5%, wobei am meisten bevorzugt die kontaminierenden Proteine mit herkömmlichen Verfahren, wie z.B. SDS-PAGE und Silberfärbung nicht nachweisbar sein sollten).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Oligomerpartikel mit der oben angegebenen Bedeutung, wobei es sich bei den Hüllproteinen um ein beliebiges Gemisch aus HCV-E1, HCV-E1s, HCV-E2, SEQ ID No 13 und/oder SEQ ID No 14 oder Teilen davon handelt, so daß beispielsweise ein Partikel der vorliegenden Erfindung weitgehend aus HCV-E1- und HCV-E2-Proteinen, HCV-E1- und HCV-E1s-Proteinen, HCV-E1s- und HCV-E2-Proteinen sowie HCV-E1-, HCV-E1s- und HCV-E2-Proteinen bestehen kann. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ebenso ein Oligomerpartikel mit der oben angegebenen Bedeutung, wobei die Proteine aus unterschiedlichen HCV-Stämmen, -Subtypen oder -Genotypen stammen, so daß beispielsweise die Proteine aus dem Genotyp 1b und dem Genotyp 4 stammen oder ein Gemisch, bestehend aus HCV-Hüllproteinen von einem HCV-Stamm oder -Genotyp und wenigstens einem weiteren HCV-Stamm oder -Genotyp, darstellen. Die unterschiedlichen HCV-Stämme oder -Genotypen sind in der PCT/EP 95/04155 von Maertens et al. gut definiert und charakterisiert. Somit betrifft die vorliegende Erfindung Oligomerpartikel, die aus einem beliebigen, im Fachgebiet bekannten HCV-Stamm oder Genotyp stammende Hüllproteine umfassen, oder Partikel, die ein Gemisch aus aus einem beliebigen im Fachgebiet bekannten HCV-Stamm oder -Genotyp stammenden Proteinen umfassen. In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung ebenso eine von individuellen Klonen abgeleitete Konsensussequenz, wie unten und im Beispielteil beispielhaft dargestellt (siehe weiter unten).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein wie hierin beschriebenes Oligomerpartikel, das mit einem Verfahren erhältlich ist, ebenso wie das Verfahren zur Herstellung des Oligomerpartikels. Das Verfahren ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

(I) Reinigung von HCV-Hüllproteinen, möglicherweise unter Einschluß der Verwendung eines gegebenenfalls ersten Detergenz. Das Reinigungsverfahren in Schritt (I) wurde im wesentlichen ausführlich in der PCT EP 95/03031 von Maertens et al. beschrieben. Wichtig ist gemäß der vorliegenden Erfindung dabei, daß der Blockierungsschritt im Reinigungsverfahren, wie in der PCT EP 95/03031 beschrieben, z.B. mit NEM-Biotin, mit einem Alkylierungsschritt, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, durchgeführt wird, vorzugsweise unter Verwendung von Iodacetamid. Zudem kann das Reinigungsverfahren in Schritt (I) möglicherweise die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels sowie möglicherweise die Verwendung eines Alkylierungsmittels beinhalten. Das Verfahren in Schritt (I) führt schließlich zu gereinigten HCV-Hüllproteinen in einer Lösung.
(II) Austauschen der Lösung von den gereinigten HCV-Hüllproteinen gegen ein Detergenz oder Salz, was zur Bildung von Oligomerpartikeln führt.
(III) Gewinnung oder Reinigung der Oligomerpartikel, was möglicherweise eine weitere Verringerung der Konzentration des Detergenz oder Salzes in Schritt (II) beinhaltet, wodurch die Bildung und Stabilisierung der Oligomerpartikel, die nach dem Austausch gebildet wurden, weiter unterstützt wird.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung des Partikels, wobei es sich bei dem gegebenenfalls ersten Detergenz um Empigen-BB handelt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung des Partikels, wobei es sich bei dem Detergenz in Schritt (II) um CHAPS, Octylglucasid oder Tween, insbesondere Tween-20 oder Tween-80, oder ein anderes Detergenz handelt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung ebenso wie das Verfahren zur Herstellung des Partikels, wobei es sich bei dem Salz um Betain hadelt. Noch stärker bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung ebenso wie das Verfahren zur Herstellung des Partikels, wobei das Empigen-BB in einer Konzentration von 1% bis 10% verwendet und wobei das CHAPS oder Tween in einer Konzentration von 0,01% bis 10% verwendet oder das Betain in einer Konzentration von 0,01 bis 10% verwendet wird. Noch stärker bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung ebenso wie das Verfahren zur Herstellung des Partikels, wobei das Empigen-BB in einer Konzentration von 3% und wobei das CHAPS oder Betain in Konzentrationen von 0,2% bzw. 0,3% verwendet werden, wonach der Puffer gewechselt wird und das CHAPS oder Betain in Konzentrationen von 0,05% bzw. 0,1–0,5% verwendet werden. Es versteht sich dabei, daß alle im oben beschriebenen Verfahren verwendeten Prozentangaben als Gewicht/Volumen angegeben sind. Es sollte offensichtlich sein, daß das oben beschriebene Verfahren (siehe auch PCT/EP 95/03031 sowie den Beispielteil der vorliegenden Anmeldung) ein Beispiel dafür darstellt, wie man die Partikel der vorliegenden Erfindung herstellt. In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung auch alle weiteren im Fachgebiet bekannten Verfahren, die sich zur Herstellung der Oligomerpartikel der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, wie z.B. das Weglassen des Reduktionsmittels, wie in der PCT/EP 95/03031 sowie im Beispielteil (unten) beschrieben, wobei statt dessen Wirtszellen verwendet werden, die zur Reduzierung von Cysteinbrücken einen optimierten Redoxstatus im endoplasmatischen Retikulum aufweisen. Es sollte darüber hinaus offensichtlich sein, daß eine ganze Reihe von Alkylbetainen verwendet werden kann, wie z.B. solche mit einem C_n-Schwanz, wobei n = eine positive ganze Zahl im Bereich von 1 bis 20 ist, ebenso wie Betainderivate, wie z.B. Sulfobetaine.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ebenso ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung sowie dessen Verwendung, wobei das HCV-Hüllprotein von einer Konsensussequenz, die auf der Quasi-Speziesvariabilität innerhalb eines Isolats (Isolat-Konsensussequenz) oder auf der Konsensussequenz von unterschiedlichen Isolaten innerhalb eines Subtyps (Subtyp-Konsensussequenz), Typs oder einer Spezies (Typ- oder Spezies-Konsensussequenz) oder des kompletten HCV-Genus (Genus-Konsensussequenz) beruht, codiert wird. Dementsprechend handelt es sich bei der Aminosäuresequenz dieses Konsensus-HCV-Hüllproteins um eine von einer Isolat-, Subtyp-, Stamm- oder Genus-Konsensussequenz abgeleitete Konsensussequenz. Hinsichtlich der Konnotation des Begriffs „Konsensus" wird insbesondere auf Maertens und Stuyver (1997) sowie die darin verwendeten Zitate verwiesen.
Das Oligomerpartikel der vorliegenden Erfindung präsentiert Epitope äußerst effizient (siehe unten). Somit stellt das Oligomerpartikel ein Mittel zur Präsentation von Epitopen in solch einer Weise dar, daß diese eine gute Immunantwort hervorrufen können. In diesem Zusammenhang versteht sich, daß die HCV-Hüllproteine mit der hier angegebenen Bedeutung nicht ausschließlich HCV-Epitope enthalten müssen. Die HCV-Hüllproteine, die die Oligomerpartikel bilden, können ausschließlich aus HCV stammende Epitope und möglicherweise aus anderen exogenen Agensien, wie z.B. HBV oder HIV, stammende Epitope enthalten. Mit anderen Worten: das Oligomerpartikel mit einem HCV-Hüllproteinrückgrat läßt sich als Vehikel zur Präsentation von nicht-HCV-Epitopen, möglicherweise zusätzlich zu HCV-Epitopen, verwenden. Daher umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung, jedoch möglicherweise ohne HCV-Epitope, sowie seine Anwendungen und seine Herstellung, wobei nicht-HCV-Epitope enthalten sein können. Der Begriff „exogenes Agens", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein beliebiges Agens gleichgültig ob lebend oder nicht, das eine Immunantwort hervorrufen kann und das für den Wirt nicht endogen ist und nicht HCV ist. Insbesondere bezieht sich der letzte Begriff auf die Gruppe, bestehend aus pathogenen Agensien, Allergenen und Haptenen. Pathogene Agensien umfassen Prionen, Viren, Prokaryonten und Eukaryonten. Insbesondere umfassen Viren besonders HBV, HTV oder Herpesvirus, jedoch nicht HCV. Allergene umfassen Substanzen oder Moleküle, die selbst zur Auslösung einer Immunantwort in einem Wirt fähig sind, wenn ein Wirt den Allergenen ausgesetzt wird. Haptene verhalten sich ähnlich wie Allergene im Hinblick auf die Fähigkeit zur Auslösung einer Immunantwort, benötigen jedoch im Gegensatz zu Allergenen ein Trägermolekül.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine ein Oligomerpartikel mit der oben angegebenen Bedeutung umfassende Zusammensetzung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung. Der Begriff „Impfstoffzusammensetzung" bezieht sich auf eine immunogene Zusammensetzung, die einen Schutz gegen HCV hervorrufen kann, gleichgültig ob es sich dabei um einen Teilschutz oder einen vollständigen Schutz handelt. Er umfaßt daher HCV-Peptide, -Proteine oder -Polynukleotide. Der Schutz gegen HCV bezieht sich insbesondere auf Menschen, doch auch auf nichtmenschliche Primaten, die Trimera-Maus (Zaubermann et al., 1999) oder andere Säuger.
Die Partikel der vorliegenden Erfindung lassen sich als solche, in biotinylierter Form (wie in der WO 93/18054) erläutert) und/oder mit Neutralite Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) komplexiert verwenden. Es sollte ebenso angemerkt werden, daß „eine Impfstoffzusammensetzung" neben einer aktiven Substanz einen geeigneten Hilfsstoff, ein geeignetes Verdünnungsmittel, einen geeigneten Träger und/oder ein geeignetes Adjuvans umfaßt, die für sich allein weder die Produktion von für das die Zusammensetzung erhaltende Individuum gesundheitsschädlichen Antikörpern induzieren noch einen Schutz hervorrufen. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie z.B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere sowie inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann allgemein bekannt. Zu bevorzugten Adjuvansien zur Verstärkung der Wirksamkeit der Zusammensetzung gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Aluminiumhydroxid, Aluminium in Verbindung mit 3-0-deacyliertem Monophosphoryllipid A, wie in der WO 93/19780 beschrieben, Aluminiumphosphat, wie in der WO 93/24148 beschrieben, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, wie im US-Patent Nr. 4,606,918 beschrieben, N-Acetylnonmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2-(1'2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin und RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), das Monophosphoryllipid A enthält, detoxifiziertes Endotoxin, Trehalose-6,6-Dimycolat sowie Zellwandgrundgerüst (MPL + TDM + CWS) in einer Emulsion mit 2% Squalen/Tween 80. Die drei Komponenten MPL, TDM oder CWS können jeweils auch für sich allein oder jeweils zu zweit kombiniert verwendet werden. Darüber hinaus können Adjuvansien, wie z.B. Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) oder SAF-1 (Syntex), ebenso wie Adjuvansien, wie z.B. Kombinationen zwischen QS21 und 3-de-O-acetyliertem Monophosphoryllipid A (WO94/00153), oder Adjuvansien auf MF-59-(Chiron)- oder Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazen]-Basis (Virus Research Institute) oder Adjuvansien auf Blockcopolymerbasis, wie z.B. Optivax (Vaxcel, Cythx) oder Adjuvansien auf Inulinbasis, wie z.B. Algammulin und Gammalnulin (Anutech), inkomplettes Freund'sches Adjuvans (IFA) oder Gerbu-Präparationen (Gerbu Biotechnik) verwendet werden. Es versteht sich, daß komplettes Freund'sches Adjuvans (Complete Freund's Adjuvant, CFA) sowohl für Anwendungen, die nicht für den Menschen vorgesehen sind, als auch zu Forschungszwecken verwendet werden kann. „Eine Impfstoffzusammensetzung" enthält weiterhin Hilfsstoffe und Verdünnungsmittel, die von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch sind, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen, Konservierungsstoffe, u.ä. Typischerweise wird eine Impfstoffzusammensetzung in injizierbarer Form, entweder als flüssige Lösung oder Suspension, präpariert. Festformen, die sich zur Lösung auf oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion eignen, können ebenso hergestellt werden. Zur Verstärkung der Adjuvanswirkung kann die Präparation auch emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden. Die Polypeptide können auch in „Immune Stimulating Complexes" [immunstimulierende Komplexe] zusammen mit Saponinen, z.B. Quil A (ISCOMS), eingebaut werden. Impfstoffzusammensetzungen umfassen eine immunologisch wirksame Menge der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ebenso wie einen beliebigen weiteren der oben erwähnten Bestandteile. Unter einer „immunologisch wirksamen Menge" versteht man, daß die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in Form einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe zur Vorbeugung oder Behandlung wirksam ist. Diese Menge variiert je nach dem Gesundheits- und physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z.B. Mensch, nichtmenschlicher Primat, Primat, usw.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, eine wirksame Immunantwort zu geben, dem Grad des gewünschten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Beurteilung durch den behandelnden Arzt, dem Stamm des infizierenden HCV und anderen relevanten Faktoren. Man darf erwarten, daß die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der sich durch Routineversuche bestimmen läßt. Im allgemeinen variiert die Menge von 0,01 bis 1000 μg/Dosis, insbesondere von 0,1 bis 100 μg/Dosis. Die Impfstoffzusammensetzungen werden herkömmlicherweise parenteral, typischerweise durch Injektion, beispielsweise subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die sich für andere Verabreichungsverfahren eignen, umfassen orale Formulierungen und Suppositorien. Bei der Dosierung kann es sich um ein Einzeldosisregime oder ein Mehrfachdosisregime handeln. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden. Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligomerpartikels mit der hier angegebenen Bedeutung zur prophylaktischen Induktion der Immunität gegen HCV. Es sollte dabei angemerkt werden, daß ein Impfstoff sich auch zur Behandlung eines Individuums, wie oben dargelegt, eignen kann, wobei er in diesem Fall ein „therapeutischer Impfstoff" genannt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung, die ebenso die Proteine HCV-Core, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und/oder NS5B oder Teile davon umfaßt. Beispielsweise können E1-, E2- und/oder E1-E2-Partikel mit T-Zellen stimulierenden Antigenen, wie z.B. Core, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und/oder NS5B, kombiniert werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung, wobei das NS3-Protein oder Teile davon eine Aminosäuresequenz, wie sie durch SEQ ID 1 oder SEQ ID 2 angegeben ist, aufweisen (siehe weiter unten im Beispielteil).
Die Reinigung dieser NS3-Proteine umfaßt vorzugsweise eine reversible Modifikation der Cysteinreste und noch stärker bevorzugt die Sulfonierung von Cysteinen. Verfahren zur Erzielung einer solchen reversiblen Modfikation, einschließlich Sulfonierung, wurden für NS3-Proteine in Maertens et al. (PCT/EP99/02547) beschrieben.
Aus dem oben Gesagten ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Oligomerpartikels mit der oben angegebenen Bedeutung oder einer Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung zur Herstellung einer HCV-Impfstoffzusammensetzung betrifft. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligomerpartikels mit der hier angegebenen Bedeutung zur Induktion der Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern. Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligomerpartikels mit der hier angegebenen Bedeutung zur Induktion der Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern vor, gleichzeitig mit oder nach einer anderen Therapie, wie z.B. der allgemein bekannten Interferontherapie, und zwar entweder in Kombination mit der Verabreichung kleiner Arzneistoffe zur Behandlung von HCV, wie z.B. Ribavirin, oder nicht. Eine solche Zusammensetzung kann auch vor oder nach einer Lebertransplantation oder nach einer vermuteten Infektion, wie z.B. nach einer Nadelstichverletzung, eingesetzt werden. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen die Oligomerpartikel der vorliegenden Erfindung enthaltenden Kit zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorhandenen HCV-Antikörpern. Der Begriff „biologische Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine aus einem Individuum isolierte Gewebs- oder Flüssigkeitsprobe, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, beispielsweise Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, den äußeren Hautabschnitten, den Atmungswegen, dem Darmtrakt, dem Urogenitaltrakt, Oocyten, Tränenflüssigkeit, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organen, Magensekreten, Schleim, Rückenmarksflüssigkeit, externen Sekreten, wie z.B. Faeces, Urin, Sperma u.ä. Da die Oligomerpartikel sowie die einzelnen HCV-Hüllproteine der vorliegenden Erfindung hoch immunogen sind und sowohl die humorale als auch zelluläre Immunantwort stimulieren, betrifft die vorliegende Erfindung ebenso ein Kit zum Nachweis einer mit HCV verbundenen T-Zellantwort, der das Oligomerpartikel der vorliegenden Erfindung umfaßt. Die HCV-T-Zellantwort läßt sich beispielsweise, wie im Beispielteil beschrieben oder wie in der PCT/EP 94/03555 von Leroux-Roels et al. Beschrieben, messen.
Es sollte offensichtlich sein, daß die vorliegende Erfindung auch die Verwendung spezifischer HCV-Immunglobuline zur Behandlung und Vorbeugung einer HCV-Infektion betrifft. Dabei wird hier zum ersten Mal gezeigt, daß hinreichende HCV-Antikörperspiegel, insbesondere von Antikörpern gegen die HCV-Hülle, eine Linderung der Hepatitis-C-Erkrankung induzieren. Ebenso wird zum ersten Mal gezeigt, daß durch hinreichende Antikörperspiegel zirkulierendes Virus binden können und daß die Gegenwart von antikörperkomplexiertem Virus mit dem Verschwinden des HCV-Antigens aus der Leber sowie mit der Linderung der Lebererkrankung zusammenfällt. Antikörper gegen die HCV-Hülle können durch Impfung induziert oder durch Injektion passiv übertragen werden, nachdem die Antikörper aus Reservoirs von HCV-infiziertem Blut oder aus von mit HCV geimpften Individuen gewonnenem Blut gereinigt wurden. Daher betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin spezifische Antikörper, die gegen ein wie oben beschriebenes Oligomerpartikel oder gegen eine wie oben beschriebene Zusammensetzung erzeugt wurden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen die Antikörper umfassenden Kit zum Nachweis von HCV-Antigenen. Der Begriff „spezifische Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Antikörper, die gegen für das Oligomerpartikel, wie es in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, spezifische Epitope gebildet werden. Mit anderen Worten: spezifische Antikörper werden gegen Epitope gebildet, die sich aus der Bildung von Oligomerpartikeln ergeben und nur auf diesen vorhanden sind. Zudem sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von HCV-Peptiden bekannt. Diese Verfahren könnten zu HCV-Peptiden führen, die zur Präsentation von Epitopen fähig sind. Es ist denkbar, daß die HCV-Peptide, die mit diesen verschiedenen unterschiedlichen Verfahren erhalten wurden, zur Präsentation ähnlicher Epitope fähig sind. Ähnliche Epitope sind Epitope, die aus unterschiedlichen Herstellungs- oder Reinigungsverfahren entstehen, die jedoch von ein und demselben Antikörper erkennbar sind. Die Oligomerpartikel der vorliegenden Erfindung präsentieren jedoch Epitope äußerst effizient. Infolge dessen sind die Epitope auf den Oligomerpartikeln hochimmunogen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Epitope auf Oligomerpartikeln, wobei diese Epitope wenigstens 10mal, vorzugsweise wenigstens 20mal, vorzugsweise wenigstens 50mal, vorzugsweise wenigstens 100mal, vorzugsweise wenigstens 500mal, und am meisten bevorzugt wenigstens 1000mal immunogener sind als Epitope auf HCV-Peptiden, die nicht erfindungsgemäß produziert, d.h. die nicht durch Detergenz-unterstützte Partikelbildung produziert werden. Es ist dem Fachmann ersichtlich, daß die Immunogenität beispielsweise nachgewiesen und daher verglichen werden kann, indem man Säuger durch Verabreichung vergleichbarer Mengen an Peptiden, die mit einem der beiden Verfahren produziert wurden, immunisiert. Zudem bezieht sich der Begriff „spezifischer Antikörper" auch auf Antikörper, die gegen ein gereinigtes einzelnes HCV-Hüllprotein gebildet werden. Der Begriff „Antikörper", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf polyklonale oder monoklonale Antikörper. Der Begriff „monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation. Der Begriff „Antikörper" ist weder hinsichtlich der Spezies oder Quelle des Antikörpers limitierend, noch soll er durch die Art und Weise, in der er hergestellt wird, beschränkt sein. Darüber hinaus bezieht sich der Begriff „Antikörper" auch auf humanisierte Antikörper, bei denen wenigstens ein Teil der Grundgerüstbereiche eines Immunglobulins von menschlichen Immunglobulinsequenzen und Einzelketten-Antikörpern stammen, wie sie beispielsweise im US-Patent Nr. 4,946,778 beschrieben sind, auf Fragmente von Antikörpern, wie z.B. F_ab, F_(ab)2, F_v, sowie andere Fragmente, in denen die Antigenbindungsfunktion und Spezifität des Ausgangsantikörpers erhalten bleiben.
Zudem besteht ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung in der Verwendung eines wie oben beschriebenen Oligomerpartikels oder einer wie oben beschriebenen Zusammensetzung zum Nachweisen von Antikörpern gegen HCV-Hüllproteine. Der Begriff „nachweisen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle zum Nachweis geeigneten, im Fachgebiet bekannten Tests. Insbesondere bezieht sich der Begriff auf einen Immunoassay, wie er in der WO 96/13590 beschrieben ist.
Die Begriffe „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" werden in der vorliegenden Erfindung gegeneinander austauschbar verwendet. „Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren (Aminosäuresequenz) und nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Somit sind Oligopeptide von der Begriffsdefinition Polypeptid umfaßt. Es versteht sich, daß Peptidomimetika natürlicherweise in den Begriffen „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" enthalten sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines wie hier beschriebenen Oligomerpartikels zur Induktion einer Immunität gegen HCV, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomerpartikel als Teil einer zeitlichen Reihe von Verbindungen verwendet wird. In dieser Hinsicht versteht es sich, daß der Begriff „eine zeitliche Reihe von Verbindungen" sich auf die in zeitlichen Abständen vorgenommene Verabreichung der zum Hervorrufen einer Immunantwort verwendeten Verbindungen an ein Individuum bezieht. Dabei können diese Verbindungen einen der folgenden Bestandteile umfassen: Oligomerpartikel, HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung, HCV-Polypeptide.
Diesbezüglich umfaßt eine Reihe die Verabreichung entweder:

(I) eines HCV-Antigens, wie z.B. eines Oligomerpartikels, in zeitlichen Abständen, oder
(II) eines HCV-Antigens, wie z.B. eines Oligomerpartikels, in Kombination mit einer HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung, wobei die Oligomerpartikel und die HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung gleichzeitig oder in unterschiedlichen Zeitabständen, einschließlich in abwechselnden Zeitabständen, verabreicht werden können oder
(III) entweder von (I) oder von (II), möglicherweise in Kombination mit anderen HCV-Peptiden in zeitlichen Abständen.

In dieser Hinsicht sollte es offensichtlich sein, daß eine HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung Nukleinsäuren umfaßt, die für HCV-Hüllpeptid, einschließlich E1-, E2-, E1/E2-Peptide, E1s-Peptid, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, NS3-Peptid, andere HCV-Peptide oder Teile dieser Peptide codieren. Zudem versteht es sich, daß die HCV-Peptide HCV-Hüllpeptide, einschließlich E1-, E2-, E1/E2-Peptide, E1s-Peptid, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, NS3-Peptid, andere HCV-Peptide oder Teile davon umfassen. Der Begriff „andere HCV-Peptide" bezieht sich auf ein beliebiges HCV-Peptid oder Fragment davon, unter der Vorgabe, daß es sich bei dem HCV-Peptid nicht um E1-, E2-, E1s, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14 oder NS3 handelt. In Punkt II des obigen Schemas umfaßt die HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung vorzugsweise HCV-Hüllpeptide codierende Nukleinsäuren. In Punkt II des obigen Schemas besteht die HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung ganz besonders bevorzugt aus HCV-Hüllpeptide codierenden Nukleinsäuren, möglicherweise in Kombination mit einer HCV-NS3-DNA-Impfstoffzusammensetzung. In dieser Hinsicht sollte es offensichtlich sein, daß eine HCV-DNA-Impfstoffzusammensetzung einen Plasmidvektor umfaßt, der eine ein wie oben beschriebenes HCV-Peptid codierende Polynukleotidsequenz in operativer Verknüpfung mit Transkriptionsregulationselementen umfaßt. Der Begriff „Plasmidvektor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekühl, das zum Transport einer anderen Nukleinsäure, mit der es verknüpft ist, fähig ist. Dabei sind solche Vektoren bevorzugt, die zur autonomen Replikation und/oder Expression von Nukleinsäuren, mit denen sie verknüpft sind, fähig sind. Im allgemeinen handelt es sich bei Plasmidvektoren, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, um zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleifen, die in ihrer Vektorform nicht am Chromosom gebunden sind. Eine „Polynukleotidsequenz", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf Polynukleotide, wie etwa Desoxyribonukleinsäure (DNA) und gegebenenfalls Ribonukleinsäure (RNA). Dabei versteht sich, daß der Begriff auch als Äquivalente RNA- oder DNA-Analoge, die aus Nukleotidanalogen gebildet werden, sowie Einzel-(Sense- oder Antisense-) und doppelsträngige Polynukleotide umfaßt. Der Begriff „Transkriptionsregulationselemente", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die wesentliche Regulationselemente enthält, so daß sie nach Einführung in eine lebende Vertebraten zelle dazu in der Lage ist, die Zellmaschinerie so zu steuern, daß von dem Polynukleotid codierte Translationsprodukte produziert werden. Der Begriff „in operativer Verknüpfung" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, wobei die Komponenten so konfiguriert sind, daß sie ihre normale Funktion ausüben. Somit sind Transkriptionsregulationselemente in operativer Verknüpfung mit einer Nukleotidsequenz dazu in der Lage, die Expression dieser Nukleotidsequenz zu bewirken. Dabei kann der Fachmann erkennen, daß unterschiedliche Transkriptionspromotoren, Termina toren, Trägervektoren oder spezifische Gensequenzen erfolgreich eingesetzt werden können.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Immunoassay zum Nachweis von HCV-Antikörper, bei dem man: (1) das Oligomerpartikel mit der hier angegebenen Bedeutung oder ein funktionelles Äquivalent davon bereitstellt, (2) eine biologische Probe mit dem Oligomerpartikel unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes gestatten, inkubiert, (3) bestimmt, ob der Antikörper-Antigen-Komplex das Oligomerpartikel umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, in denen besonders vorteilhafte Ausführungsformen aufgeführt sind, veranschaulicht. Dabei sollte jedoch angemerkt werden, daß diese Ausführungsformen lediglich der Veranschaulichung dienen und nicht so zu verstehen sind, als daß sie die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Expression, Reinigung und Detergenzunterstützte Homooligomerisierung des HCV-E1-Proteins
Das HCV-E1s-Protein (Aminosäuren 192–326) wurde aus RK13-Zellen unter Verwendung des rekombinanten Vaccinia-Virus pvHCV-11A gemäß der in Maertens et al. (PCT/EP 95/03031) beschriebenen Vorschrift exprimiert und gereinigt. Darüber hinaus wurde das gereinigte E1-Protein in 3% Empigen-BB, das ein einem E1-Homodimer entsprechendes scheinbares Molekulargewicht (ungefähr etwa 60 kDa; 1) zeigt, vereinigt, und die vereinigten Fraktionen wurden wiederum auf eine Größenausschlußchromatographiesäule (gemäß der PCT/EP 95/03031) aufgetragen, wobei die Säule in Gegenwart von 0,2% CHAPS oder 3% Betain gefahren wurde. Obwohl dem E1s-Protein sein Membranankerbereich fehlt, ließ sich überraschenderweise eine homogene Population aus spezifisch assoziierten E1-Homooligomeren mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 260–280 kDa mit beiden Detergenzien erhalten (2). Eine solche homooligomere Struktur könnte eine ungefähre Anzahl von 9 E1s-Monomeren enthalten. Dabei versteht es sich, daß es sich bei der letzteren Angabe um eine grobe Abschätzung handelt, da die Form des Oligomers sein scheinbares Molekulargewicht, wie es mittels Größenausschlußchromatographie gemessen wird, drastisch beeinflussen kann. Beim Wechsel von 0,2% CHAPS auf 0,05% CHAPS und Wiederholung des gleichen Verfahrens verschob sich das scheinbare Molekulargewicht weiter außerhalb des Auflösungsbereichs der Säule (Ausschlußgrenze der Säule: > 600 kDa, 3), das die Bildung von Partikeln vermuten läßt. Der Wechsel von 3% Betain auf 0,1% Betain ergab eine Population von E1s-Oligomeren mit einer ähnlichen Verhaltensweise (Daten nicht gezeigt). Es könnten weitere Detergenzien gewählt werden, mittels derer eine ähnliche Detergenzunterstützte Oligomerisierung erzielt werden könnte. Bei der zur Partikelbildung führenden Oligomerisierung handelt es sich nicht um einen für CHAPS oder Betain einzigartigen Vorgang, da ähnliche Ergebnisse mit Tween-20 oder Tween-80 oder Octylglucasid erzielt werden konnten. Zudem kann eine weitere Abtrennung des Detergenz möglich sein, wodurch die Erzeugung noch größerer Partikel gestattet sein könnte. Daher wird die Gegenwart von Detergenz möglicherweise nicht länger benötigt, um Partikel zu erhalten. Die Partikel können beispielsweise mittels SSC, ohne jegliches Detergenz, erhalten werden. Bemerkenswerterweise weist ein E1-Monomer eine Größe von ungefähr 31 kDa auf, während ein E2-Monomer ungefähr 70 kDa groß ist. Diese Werte können jedoch je nach Glycosylierungszustand des Proteins variieren.
Beispiel 2: Analyse der E1s-Oligomerstrukturen höherer Ordnung mittels dynamischer Lichtstreuung
Um das unerwartete Ergebnis, nämlich das Partikel gebildet wurden, zu bestätigen, wurden E1s-Präparationen in 0,05% CHAPS und 0,1% Betain, hergestellt gemäß Beispiel 1, oder in 0,1% Betain, hergestellt durch Verdünnung von Präparationen in 0,5% Betain, einer Analyse mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) unterzogen.
Die Technik der dynamischen Lichtstreuung mißt die Brownsche Bewegung und setzt diese in Beziehung zur Größe von Partikeln. Je größer das Partikel, desto langsamer ist die Brownsche Bewegung. Die Geschwindigkeit der Brownschen Bewegung ist durch eine Eigenschaft definiert, die als Diffusionskoeffizient (normalerweise durch das Symbol D angegeben) bekannt ist. Die Größe des Partikels wird aus dem Diffusionskoeffizienten mit der Stokes-Einstein-Gleichung: d(H) = kT/3πηD, wobei d(H) den hydrodynamischen Durchmesser, k die Boltzmann-Konstante, T die absolute Temperatur, η die Viscosität bedeutet, berechnet. Insbesondere handelt es sich bei dem gemessenen Durchmesser um einen Wert, der sich darauf bezieht, wie ein Partikel in einer Flüssigkeit diffundiert. Somit wird er als hydrodynamischer Durchmesser bezeichnet. Der Diffusionskoeffizient wird aus einer Autokoreelationsfunktion (zeitabhängige Variation der Lichtintensitätsschwankung) abgeleitet. Dabei wird vom Instrument ein computergesteuerter Korrelator verwendet, um die Intensität der Autokorrelationsfunktion automatisch zu berechnen.
Zur Messung von Größenverteilungen wird die obige Autokorrelationsfunktion korrigiert, um lineare Kurven zu erhalten, wobei das Instrument mit einem Computerprogramm zur Analyse der Größenverteilung ausgestattet ist. Die Technik weist jedoch einschränkende Annahmen auf, ähnlich denen für die Technik mit der Bezeichnung MALLS (mulit angle laser light scattering), wobei von keinem der beiden Verfahren angenommen werden darf, daß es absolute Daten liefert. Die Größenverteilungsergebnisse der DLS sind als halbquantitative Indikatoren für Polydispersität und nicht als eine wahre Repräsentation der Verteilung zu interpretieren.
E1s-Partikel enthaltende Proben (80–400 μg E1s/ml PBS-0,5% CHAPS, 0,1% oder 0,5% Betain) wurden in die Meßzelle eines mit einem 10 mW-HeNe-Laser ausgestatteten LSP 3.53 DLS-Instruments (PolymerLabs) pipettiert. Eine graphische Darstellung der Analyse ist in den 4 (E1s in 0,05% CHAPS) und 5 (E1s in 0,1% oder 0,5% Betain) gezeigt.
Diese Analysen bestätigten in der Tat das unerwartete Ergebnis, nämlich daß es sich bei den erhaltenen E1s-Strukturen um kugelförmige, monodisperse Partikel handelte. Die E1s-Partikel in PBS/0,1% Betain zeigten eine durchschnittliche Größenverteilung von 21,3 ± 4 nm, in PBS/0,5% Betain: 27,9 ± 5 nm, wohingegen ein Durchmesser von 12,5 für E1s in PBS/0,05% CHAPS erhalten wurde.
Beispiel 3: Größen- und Formanalyse mittels Elektronenmikroskopie
10 μl E1s (226 μg/ml in PBS/0,05% CHAPS; und 143 μg/ml in PBS 3% Betain) wurden mit einer Standard-Negativanfärbung mit 1% Uranylacetat auf kohlenstoffstabilisierten Formvar-Gittern sichtbar gemacht. Die Probe wurde 30 Sekunden lang aufgetragen, danach wurde mit dH₂O gespült, anschließend 5 Sekunden angefärbt und danach fotografiert (6).
Die statistische Analyse ergab die folgenden Ergebnisse: Das E1s-Partikel in CHAPS wies einen mittleren Durchmesser von 8,7 ± 0,27 nm (Bereich 4,3–29,0; 95% Cl 5,4) auf, wobei das E1s-Partikel in Betain mit einem mittleren Durchmesser von 9,7 ± 0,55 nm (Bereich 4,3–40,5; 95% Cl 11,0) weniger homogen war. Überaschenderweise zeigt die 3%-Betain-Präparation, die ursprünglich ein MW [= Molekulargewicht] von 250–300 kDa, wie mittels SEC [= Größenausschlußchromatographie], analysiert, zeigte, sogar größere Partikel als die 0,05%-CHAPS-Präparation, die ursprünglich ein MW von > 600 kDa zeigte. Wir stellten daher die Hypothese auf, daß mit 3% Betain erhaltene homooligomere Zwischenformen von E1s mit der Zeit Partikel höherer Ordnung gebildet haben könnten. Dieser überraschende Effekt deutet auf weitere Möglichkeiten zur Erhaltung von Partikeln höherer Ordnung hin. Eine Größenverteilung der Partikel (7) zeigt, daß die CHAPS-Präparation monodispers ist, obwohl ein Auslaufen der Kurve in einen Schwanz größerer Partikel beobachtet wird (bis zu 29 nm für 0,05% CHAPS). Da größere Strukturen in DLS-Analysen überschätzt werden, kann das Vorhandensein dieser größeren Partikel, obwohl ihre Anzahl geringer ist, den größeren Durchmesser, der mit der DLS-Analyse erhalten wurde (Beispiel 2), erklären. Der unterschiedliche Durchmesser kann auch dadurch erklärt werden, daß durch DLS ein sich bewegendes Partikel gemessen wird, während man in der Elektronenmikroskopie statische Partikel mißt. Dabei sollte offensichtlich sein, daß die Immunogenität dieser Präparationen, wie in den Beispielen unten gezeigt, auf die Gesamtheit der Präparation und eventuell auf die durchschnittlichen, kleineren oder größeren Partikel oder auf das Gemisch daraus zurückzuführen ist.
Beispiel 4: Immunisierung eines mit dem HCV-Subtyp 1b chronisch infizierten Schimpansen
Ein Schimpanse (Phil), der bereits 13 Jahre lang (5015 Tage vor der Immunisierung) mit einem HCV-Stamm des Subtyps 1b infiziert war, wurde mit E1 (AS 192–326), das sich von einem unterschiedlichen Stamm des Genotyps 1b mit einer 95,1%igen Identität auf der Aminosäureebene (siehe auch Tabelle 2) ableitete und das wie in den Beispielen 1–3 beschrieben präpariert wurde, geimpft. Der Schimpanse erhielt insgesamt 6 intramuskuläre Immunisierungen von jeweils 50 μg E1 in PBS/0,05% CHAPS im Gemisch mit RIBI R-730 (MPLA + TDM + CWS) gemäß der Vorschrift des Herstellers (Ribi Inc. Hamilton, MT). Die 6 Immunisierungen wurden in 2 Reihen von jeweils 3 Impfungen im dreiwöchigen Abstand appliziert, wobei zwischen den beiden Reihen eine Wartezeit von 6 Wochen lag. Der Schimpanse wurde hinsichtlich verschiedener Parameter, die die Aktivität der HCV-induzierten Krankheit anzeigen, ständig überwacht, wobei damit 150 Tage vor der Immunisierung begonnen wurde und dies während des Immunisierungszeitraums und dann bis 1 Jahr nach der Immunisierung (siehe jedoch unten) fortgesetzt wurde. Zu den genannten Parametern gehörten Blutchemie, ALT, AST, gamma-GT, Blutchemie, Viruslast in Serum, Viruslast in der Leber und Leberhistologie. Darüber hinaus wurde die Immunantwort auf die Immunisierung sowohl auf humoraler als auch zellulärer Ebene verfolgt. Während dieses Zeitraums wurde das Tier auch hinsichtlich eventueller negativer Effekte der Immunisierung, wie z.B. einer Veränderung im Verhalten, klinischer Symptome, Körpergewicht, Temperatur und örtlicher Reaktionen (Röte, Schwellung, Indurationen) überwacht. Solche Effekte wurden nicht nachgewiesen.
Die ALT-Spiegel (und vor allem die gamma-GT-Spiegel, Daten nicht gezeigt) nahmen eindeutig ab, sobald der Antikörperspiegel gegen E1 sein Maximum erreichte (8). ALT erholte sich ziemlich rasch wieder, sobald die Antikörperspiegel zu fallen begannen, doch blieb gamma-GT auf einem niedrigeren Niveau, solange Anti-E1 nachweisbar blieb.
E2-Antigen in der Leber nahm auf fast nicht nachweisbare Niveaus während des Zeitraums, in dem Anti-E1 nachweisbar war, ab, wobei sich das E2-Antigen kurz nach dem Verschwinden dieser Antikörper wieder erholte. Zusammen damit, daß Core und E2-Antigen in der Leber nicht mehr nachgewiesen werden konnten, nahm die Entzündung der Leber deutlich ab (siehe auch Tabelle 3). Dies ist ein wichtiger Beweis dafür, daß der Impfstoff einen Rückgang der Leberschädigung induziert möglicherweise durch, zumindest teilweise Eliminierung der viralen Antigene aus seinem Hauptzielorgan, der Leber.
Das Virämieniveau, wie es mit dem Amplicor HCV-Monitor (Roche, Basel, Schweiz) gemessen wurde, blieb während des gesamten Untersuchungszeitraums im Serum in etwa unverändert.
Genauere Analysen der humoralen Antwort zeigten, daß der maximale Endpunkttiter 14,5 × 10³ (nach der sechsten Immunisierung) erreichte, wobei dieser Titer 1 Jahr nach der Immunisierung auf einen nicht nachweisbaren Wert abfiel (8). 9 zeigt, daß die Hauptepitope, die sich von Peptiden, die von den B-Zellen erkannt werden, imitieren lassen, auf dem N-terminalen Bereich von E2 lokalisiert sind (Peptide V1V2 und V2V3, hinsichtlich Einzelheiten über die verwendeten Peptide, siehe Tabelle 4). Da die Reaktivität gegen das rekombinante E1 höher ist und länger andauert, läßt sich aus dieser Figur auch ableiten, daß die diese Peptide erkennenden Antikörper nur einen Teil der gesamten Antikörperpopulation gegen E1 darstellen. Der restliche Teil richtet sich gegen Epitope, die von Peptiden nicht imitiert werden können, d.h. diskontinuierliche Epitope. Solche Epitope sind nur auf dem vollständigen E1-Molekül oder sogar nur auf der partikelähnlichen Struktur vorhanden. Eine solche Immunantwort gegen E1 ist einzigartig, zumidest im Vergleich dazu, was normalerweise in menschlichen chronischen HCV-Trägern (WO 96/13590 von Maertens et al.) und in Schimpansen (van Doom et al., 1996), die Anti-E1-Antikörper innerhalb ihres natürlichen Infektionsverlaufs bilden, beobachtet wird. In solchen Patienten ist Anti-E1 zum Teil auch gegen diskontinuierliche Epitope gerichtet, doch richtet sich ein großer Anteil gegen das C4-Epitop (±50% der Patientenseren), ein geringer Anteil gegen V1V2 (im Bereich von 2–70%, je nach Genotyp), wobei eine Reaktivität gegen V2V3 nur in Ausnahmen aufgezeichnet wurde (Maertens et al., 1997).
Die Analyse der T-Zellreaktivität deutete an, daß auch dieses Kompartiment des Immunsystems durch den Impfstoff auf spezifische Weise stimuliert wird, da der Stimulationsindex dieser T-Zellen von 1 auf 2,5 ansteigt und während des Nachuntersuchungszeitraums etwas erhöht bleibt (10). Es ist diese T-Zellreaktivität, die lediglich in Patienten mit einer Langzeitreaktion auf eine Interferontherapie beobachtet wird (siehe: PCT/EP 94/03555 von Leroux-Roels et al.; Leroux-Roels et al., 1996).
Beispiel 5: Immunisierung eines chronischen HCV-Trägers mit unterschiedlichem Subtyp
Ein Schimpanse (Ton), der bereits mehr als 10 Jahre (3809 Tage vor der Immunisierung) mit HCV des Genotyps 1a infiziert war, wurde mit E1 des Genotyps 1b mit einer Identität von nur 79,3% auf Aminosäureebene (siehe auch Tabelle 2) geimpft, wobei die Präparation wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben durchgeführt wurde. Der Schimpanse erhielt insgesamt 6 intramuskuläre Immunisierungen von jeweils 50 μg E1 in PBS/0,05% CHAPS im Gemisch mit RIBI R-730 gemäß der Vorschrift des Herstellers (Ribi Inc. Hamilton, MT). Die 6 Immunisierungen wurden in 2 Reihen von jeweils 3 Impfungen im dreiwöchigen Abstand appliziert, wobei zwischen den beiden Reihen eine Wartezeit von 4 Wochen lag. Der Schimpanse wurde hinsichtlich verschiedener Parameter, die die Aktivität der HCV-induzierten Krankheit anzeigen, ständig überwacht, wobei damit 250 Tage vor der Immunisierung begonnen wurde und dies während des Immunisierungszeitraums und dann bis 9 Monate nach der Immunisierung (siehe jedoch unten) fortgesetzt wurde. Zu den genannten Parametern gehörten Blutchemie, ALT, AST, gamma-GT, Viruslast in Serum, Viruslast in der Leber und Leberhistologie. Darüber hinaus wurde die Immunantwort auf die Immunisierung sowohl auf humoraler als auch zellulärer Ebene verfolgt. Während dieses Zeitraums wurde das Tier auch hinsichtlich eventueller negativer Effekte der Immunisierung, wie z.B. einer Veränderung im Verhalten, klinischer Symptome, Körpergewicht, Temperatur und örtlicher Reaktionen (Röte, Schwellung, Indurationen) überwacht. Solche Effekte wurden nicht nachgewiesen. Die ALT-Spiegel (sowie gamma-GT-Spiegel, Daten nicht gezeigt) namen eindeutig ab, sobald der Antikörperspiegel gegen E1 sein Maximum erreichte (11). ALT und gamma-GT erholten sich, sobald die Antikörperspiegel abzunehmen begannen, doch blieben ALT und gamma-GT auf einem niedrigeren Niveau während des gesamten Nachuntersuchungszeitraums. Die ALT-Spiegel waren sogar nach der Impfung (62 ± 6 U/I) im Vergleich mit dem Zeitraum vor der Impfung (85 ± 11 U/I) deutlich reduziert. Da weniger Marker für Gewebeschädigung im Serum gefunden wurden, waren diese Befunde ein erster Hinweis darauf, daß die Impfung eine Besserung der Lebererkrankung induzierte.
E2-Antigenspiegel konnten in dem Zeitraum, in dem Anti-E1 oberhalb eines Titers von 1,0 × 10³ blieb, nicht mehr nachgewiesen werden, doch wurden bei niedrigeren E1-Antikörperspiegeln wieder nachweisbar. Zusammen mit dem Verschwinden von HCV-Antigenen nahm die Entzündung der Leber deutlich ab und zwar von gemäßigter chronischer aktiver Hepatitis zu minimalen Formen chronischer dauerhafter Hepatitis (Tabelle 3). Dies ist ein weiterer wichtiger Beweis dafür, daß der Impfstoff einen Rückgang der Leberschädigung induziert, möglicherweise durch, zumindest teilweise, Eliminierung des Virus aus seinem Hauptzielorgan, der Leber.
Das Virämieniveau, wie es mit dem Amplicor-HCV-Monitor (Roche, Basel, Schweiz) gemessen wurde, blieb während des gesamten Untersuchungszeitraums auf in etwa ähnlichen Niveaus im Serum. Eine ausführlichere Analyse der humoralen Antwort zeigte, daß der erreichte maximale Endpunkttiter 30 × 10³ betrug (nach der sechsten Immunisierung) und daß dieser Titer 9 Monate nach der Immunisierung auf einen Wert von 0,5 × 10³ abfiel (11). 12 zeigt, daß die Hauptepitope, die von Peptiden imitiert werden können und durch die B-Zellen erkannt werden, auf dem N-terminalen Bereich lokalisiert sind (Peptide V1V2 und V2V3, hinsichtlich Einzelheiten über die verwendeten Peptide siehe Tabelle 4). Da die Reaktivität gegen das rekombinante E1 höher ist und länger andauert, läßt sich aus dieser Figur auch ableiten, daß die diese Peptide erkennenden Antikörper nur einen Teil der gesamten Antikörperpopulation gegen E1 darstellen. Der restliche Teil richtet sich höchstwahrscheinlich gegen Epitope, die nicht von Peptiden imitiert werden können, d.h. diskontinuierliche Epitope. Solche Epitope sind möglicherweise nur auf dem vollständigen E1-Molekül oder sogar nur auf der partikelähnlichen Struktur vorhanden. Eine solche Immunantwort gegen E1 ist einzigartig, zumindest im Vergleich damit, was normalerweise in menschlichen chronischen HCV-Trägern, die nachweisbares Anti-E1 aufweisen, beobachtet wird. In solchen Patienten ist Anti-E1 zum Teil auch diskontinuierlich, doch richtet sich ein großer Anteil gegen das C4-Epitop (50% der Patientenseren), ein geringerer Anteil gegen V1V2 (im Bereich von 2–70%, je nach Genotyp), wobei in Ausnahmen eine Reaktivität gegen V2V3 aufgezeichnet wurde (Maertens et al., 1997). Da dieser Schimpanse mit einem 1a-Isolat infiziert ist, wurde die Antikörperantwort auch hinsichtlich Kreuzreaktivität gegenüber einem E1-Ia-Antigen beurteilt. Wie aus 13 ersichtlich ist, werden solche kreuzreaktiven Antikörper tatsächlich erzeugt, obwohl sie nur einen Teil der gesamten Antikörperpopulation bilden. Bemerkenswert ist die Korrelation zwischen dem Wiedererscheinen des viralen Antigens in der Leber und dem Verschwinden von nachweisbaren Anti-1a-E1-Antikörpern im Serum.
Die Analyse der T-Zellreaktivität deutete an, daß auch dieses Kompartiment des Immunsystems durch den Impfstoff auf spezifische Weise stimuliert wird, da der Stimulationsindex dieser T-Zellen von 0,5 auf 5 ansteigt und während des Nachuntersuchungszeitraums erhöht bleibt (14).
Beispiel 6: Wiederauffrischung chronischer HCV-Träger mit E1
Da die E1-Antikörpertiter, wie sie in den Beispielen 4 und 5 beobachtet wurden, nicht stabil waren und mit der Zeit abnahmen, und zwar bei dem mit 1b infizierten Schimpansen sogar auf nicht nachweisbare Niveaus, wurde untersucht, ob sich diese Antikörperantwort durch zusätzliche Auffrischung wieder erhöhen ließ. Beide Schimpansen wurden wiederum mit 3 aufeinanderfolgenden intramuskulären Immunisierungen im dreiwöchigen Abstand immunisiert (jeweils 50 μg E1 im Gemisch mit RIBI-Adjuvans). Wie sich aus den 8 und 11 beurteilen läßt, konnte die Anti-E1-Antwort tatsächlich aufgefrischt werden, wobei das virale Antigen in der Leber wiederum auf einen Wert unterhalb der Nachweisgrenze abnahm. Die Viruslast im Serum von Tom blieb jedoch konstant (11). Ein Virämieniveau von < 10⁵ Genomäquivalenten pro ml wurde zum ersten Mal während des Nachuntersuchungszeitraums gemessen.
Bemerkenswert ist der Befund, daß, wie bereits bei der ersten Reihe von Immunisierungen, der mit dem HCV-Stamm des Subtyps 1b infizierte Schimpanse (Phil) mit niedrigeren Anti-E1-Titern reagiert als der mit dem HCV-Stamm des Subtyps 1a infizierte Schimpanse (maximaler Titer in der ersten Runde: 14,5 × 10³, gegenüber 30 × 10³ für Ton, und nach zusätzlicher Auffrischung lediglich 1,2 × 10³ für Phil, gegenüber 40 × 10³ für Ton). Obwohl die positive Wirkung bei beiden Tieren ähnlich zu sein scheint, könnte aus diesem Experiment geschlossen werden, daß die Immunisierung eines chronischen Trägers mit einem von einem anderen Subtyp oder Genotyp stammenden E1-Protein besonders günstig für das Erreichen hoher Titer sein kann, wobei möglicherweise eine zuvor existierende und spezifische Immunsupression im Wirt, die durch den infizierenden Subtyp oder Genotyp induziert wird, umgangen wird. Andererseits können die in der homologen Situation (1b-Impfstoff + 1b-Infektion) beobachteten niedrigeren Titer eine Bindung des größten Teils der Antikörper an Virus andeuten. Die induzierten Antikörper könnten daher eine neutralisierende Kapazität besitzen.
Beispiel 7a: Konstruktion eines NS3-Proteins, in dem die Hauptepitope, von denen man weiß, daß sie mit der Infektionskontrolle korrelieren, kombiniert sind
Außer den Epitopen in E1 können auch andere Epitope mit der Eliminierung von HCV während der akuten Phase oder durch Interferontherapie verknüpft sein. Mehrere dieser Epitope sind innerhalb von NS3 lokalisiert (Leroux-Roels et al., 1996; Rehermann et al., 1996 und 1997; Diepolder et al., 1995 und 1997). Zwei Hauptepitope sind das von Rehermann und Mitarbeitern kartierte CTL-Epitop (AS 1073–1081) sowie das von Diepolder und Mitarbeitern kartierte T-Zellepitop (CD4-Epitop) (AS 1248–1261). Unglücklicherweise sind diese Epitope über das gesamte NS3-Protein verstreut. Um zumindest diese Epitope zur Verfügung zu haben, wäre ein relativ großes Protein nötig (AS 1073–1454). Die Produktion solch eines großen Proteins führt normalerweise zu niedrigen Ausbeuten und kann nach der Impfung zu einer Antwort führen, die nur zu einem geringen Teil auf die wichtigen Epitope gerichtet ist. Daher wäre die Herstellung eines kleineren Proteins eine geeignetere Lösung für dieses Problem. Um dies zu bewerkstelligen, müssen einige dieser Epitope innerhalb eines solchen kleineren Proteins repositioniert werden. Unter Ausnutzung bestehender Erkenntnisse, d.h. eines anderen CTL-Epitops (AS 1169–1177), das nicht mit der HCV-Eliminierung zusammenhängt (Rehermann et al. 1996, 1997), wurde ein NS3-Molekül konstruiert, das bei AS 1166 beginnt und bei AA 1468 endet (Tabelle 5). Dieses Konstrukt enthält bereits die von Weiner und Mitarbeitern sowie Diepolder und Mitarbeitern beschriebenen Epitope. Durch multieren des Bereichs 1167 bis 1180 zur Sequenz des Bereichs 1071 bis 1084 wurde das nichtrelevante CTL-Epitop in das Epitop, das, wie Rehermann und Mitarbeiter herausfanden, mit der Viruseliminierung zusammenhängt, umgeändert. Das Konstrukt wurde zusätzlich so modifiziert, daß es an Position 1166 ein Methionin enthält, das den Start der Translation gestattet. Dieses Methionin wird in E. coli abgespalten, da es von einem Alanin gefolgt wird. Auf diese Weise wird die Einführung neuer Epitope, die nicht im natürlichen NS3 vorhanden sind, auf ein Minimum beschränkt. Andererseits kann, falls die Expression dieses Proteins mühsam sein sollte, das CTL-Epitop mit dem C-Terminus bei AS 1468 verknüpft werden, wie ausführlich in Tabelle 5 dargestellt.
Die codierende Sequenz eines HCV-NS3-Fragments wurde isoliert und exprimiert, wie bei Maertens et al. beschrieben (PCT/EP99/02547; Klon 19b; HCV AS 1188–1468 wurde als Ausgangsmaterial verwendet). Das CTL-Epitop, wie es von Rehermann beschrieben wurde und das im 19b-NS-3-Fragment nicht vorhanden ist, wurde mit diesem Fragment fusioniert. Dabei wurde sowohl eine N-terminale als auch eine C-terminale Fusion konstruiert, da die Auswirkungen der Fusion auf Expressionsniveaus, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau und Funktionalität durch die Position auf dem Epitop beeinflußt werden können.
Unter Verwendung des Plasmids plGRl2NS-3, bei dem es sich um ein E. coli-Expressionsplasmid handelt, das das NS3-19b-Fragment unter der Kontrolle des linksseitigen Promotors des Phagen Lambda exprimiert, als Matrize für die PCR wurden N- bzw. C-terminal mit dem Rehermann-CTL-Epitop fusionierte NS3-19b-codierende Sequenzen (mit der Bezeichnung NS-319bTn bzw. NS-3 19bTc) zunächst in den Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) subkloniert, wodurch man die Vektoren pGEM-TMS-319b Tn und pGEM-TNS-319bTc erhält. Die PCR-amplifizierten Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
Im Fall der Fusion der T-Zellepitopsequenz mit dem N-terminalen Bereich von NS-3 wurde die PCR mit einem langen Sense-Primer, der das CTL-Epitop trägt, sowie einem kurzen Antisense-Primer, der mit Sequenzen, die 3' vom NS-3-19b-Stopcodon liegen, homolog ist, durchgeführt. Die Primersequenzen sind nachfolgend dargestellt.
Primer 9038 (sense)
Primer 1901 (antisense)
Im Fall des C-terminal fusionierten NS-3 wurde die PCR mit einem kurzen Sense-Primer, der homolog zu Sequenzen, die 5' vom NS-3-19b-Startcodon liegen, ist, sowie einem langen Antisense-Primer, der das CTL-Epitop, gefolgt von im Leseraster liegenden Stopcodons, trägt, durchgeführt. Die Primer-Sequenzen sind nachfolgend dargestellt.
Primer 1052 (sense)
Primer 9039 (antisense)
Ausgehend von den in die pGEM-T-Vektoren klonierten codierenden Sequenzen werden die NS-3-19bT-Sequenzen in den E. coli-Expressionsvektor plGRl2 inseriert. Beim N-terminal fusionierten NS-3-19bT wurde die NS-3-19bT codierende Sequenz als ein 379 bp großes NcoI/SnaBI-Fragment isoliert und mit SnaBI/AllwNI- und AlwNI/NcoI-Fragmenten aus dem Vektor plGRl2NS-3 ligiert, wodurch der Vektor plGRl2NS-3Tn erhalten wird. Beim C-terminal fusionierten NS-3-19bT wurde die NS-3-19bT codierende Sequenz als ein 585 bp SnaBI/SpeI-Fragment isoliert und in den SnaBI/SpeI-geöffneten Vektor plGRl2NS-3 inseriert, wodurch der Vektor plGRl2NS-3Tc erhalten wurde.
Beide Vektoren, plGRl2NS-3Tn und plGRl2NS-3Tc, wurden anschließend in den E. coli-Expressionsstamm MC1061(pAcI) transformiert, und nach Temperaturinduktion des Lambda-P_L-Promotors wurden die Expressionsniveaus auf SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-NS-3-Serums analysiert.
Aminosäuresequenz des NS-3-19bTn-Proteins
Aminosäuresequenz des NS-3-19bTc-Proteins
Nukleotidsequenz des NS-3-19bTn codierenden Bereichs
Nukleotidsequenz des NS-3-19bTc codierenden Bereichs
Beispiel 7b: Reinigung der Proteine NS-3-19bTn und NS-3-19bTc
E. coli-Zellpasten aus Erlenmeyer-Kulturen wurden von einem Zellaufschlußgerät (CSL, Modell B) bei 1,4 kbar in 50 mM TRIS, pH 8, aufgebrochen. Dieses Lysat wurde durch Zentrifugation (15000 g, 30 min., 4°C) geklärt. Der Überstand wurde verworfen, da sowohl für das N- als auch das C-terminale Konstrukt NS3 im Pellet wiedergefunden wurde. Es stellte sich heraus, daß dieses Pellet im Fall des N-terminalen Konstrukts hochstabil war, was ein gründliches Waschen (erster Waschschritt mit 2% Sarcosyl, 0,5 M Guanidiniumchlorid und 10 mM DTT, zweiter und dritter Waschschritt mit 1% Triton X-100, 0,5 M Guanidiniumchlorid und 10 mM EDTA) vor der Solubilisierung gestattete. Dies war für das C-terminale Konstrukt nicht der Fall. Die Aufreinigung wurde am N-terminalen Konstrukt fortgesetzt. Das gewaschene Pellet wurde schließlich in 6 M Guanidiniumchlorid/50 mM Na₂HPO₄ bei pH 7,2 gelöst und sulfoniert, wie in Maertens et al. (PCT/EP99/02547) beschrieben. Das sulfonierte Pellet wurde zunächst auf einer Sephadex-G25-Säule in 6 M Harnstoff/50 mM Triethanolamin, pH 7,5, entsalzt und abschließend durch zwei aufeinanderfolgende Anionenaustauschchromatographien in der gleichen Pufferzusammensetzung gereinigt. Der erste Anionenaustausch wurde auf einer Hyper DQ-Säule (50 μm) (BioSpra Inc. Marlbourough, Ma, USA) durchgeführt, wobei das NS3 zwischen 0,11 und 0,19 M NaCl wiedergefunden wurde. Diese Fraktionen wurden nach Verdünnung auf eine zweite Hyper DQ-Säule (20 pm) (BioSpra Inc. Marlbourough, Ma, USA) aufgetragen, wobei das NS3 in den 0,125 M NaCl enthaltenden Fraktionen wiedergefunden wurde. Diese Fraktionen wurden auf 6 M Harnstoff in PBS, pH 7,5, entsalzt. Die endgültige Reinheit wurde auf Grundlage einer SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung auf > 90% geschätzt. Die N-terminale Sequenzierung mittels EDMAN-Abbau zeigte, daß dieses NS3 einen intakten N-Terminus aufweist, der das gewünschte Epitop in der korrekten Sequenz enthält. Ebenso wurde bestätigt, daß das für den Translationsstart verwendete Methionin wie vorhergesagt abgespalten wurde.
Beispiel 8: Konstruktion eines E2-Proteins ohne den hypervariablen Bereich I
Es wurde eine immundominante homologe Antwort auf dem HVR-I-Bereich von E2 bemerkt. Diese Antwort ist bei einem Impfstoffansatz von geringem Nutzen, da ein Impfstoffansatz einen heterologen Aufbau aufweist (der Impfstoffstamm unterscheidet sich stets von den Feldstämmen). Daher wäre die Deletion dieses Bereichs notwendig, damit ein E2-Protein Antikörper gegen die stärker konservierten, jedoch weniger immunogenen Bereiche von E2 induzieren kann. Durch sorgfältige Analyse der E2-Leader-Sequenz und des hypervariablen E2-Bereichs wurde das am besten geeignete Konstrukt zur Expression eines E2-Proteins ohne HVR I konstruiert. Dieses Konstrukt gestattet die Expression eines E2-Peptids, das bei der Position AS 409 statt AS 384 beginnt. Als Leader-Sequenz wurden die C-terminalen 20 Aminosäuren von E1 verwendet. Da jedoch dieser HVR nicht eindeutig skizziert ist, wurde eine zweite Version hergestellt (beginnend mit AS 412), die ebenso eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, an der richtigen Stelle gespalten zu werden.
Zwischenkonstrukt pvHCV-99 (siehe auch 15 und 16)
In der Expressionskassette sollte der codierenden Sequenz von E2-715 ein E1-Leader-Signalpeptid, beginnend mit Met364, vorangestellt sein. Daher wurde im Plasmid pvHCV-92 (15), das die codierende Sequenz für E2-715-HCV Typ 1b mit der langen Version des E1-Signalpeptids (beginnend bei Met347) enthält, eine Deletion erzeugt, indem eine Doppelverdauung mit EcoRI und NcoI mit einer anschließenden Auffüllreaktion des 5'-überstehenden Endes mit T4-DNA-Polymerase durchgeführt wurde. Durch Ligation der erhaltenen stumpfen Enden (Rezirkularisierung des 6621 bp großen Fragments) wurde das Plasmid pvHCV-99 erhalten, das für das gleiche Protein (E2-715) mit einem kürzeren E1-Leader-Signalpeptid (beginnend bei Met364) codiert. pvHCV-99 wurde in der Stammliste als ICCG 3635 hinterlegt. Dabei sollte offensichtlich sein, daß HCV- oder heterologe Signalsequenzen mit variabler Länge verwendet werden können.
Die Plasmide pvHCV-100 und -101 sollten eine Deletion in der E2-Sequenz, d.h. eine Deletion des hypervariablen Bereichs I (HVR-I), enthalten. Im Plasmid pvHCV-100 wurden die Aminosäuren 384(His)–408(Ala) deletiert, während im Plasmid pvHCV-101 Aminosäuren 384(His)–411(Ile) deletiert wurden.
Konstruktion pvHCV-100
Für die Konstruktion von pvHCV-100 wurden zwei Oligonukleotide konstruiert:
Die PCR-Amplifikation (Denaturierung: 5 min. 95°C, 30 Amplifikationszyklen, bestehend aus Annaeling bei 55°C, Polymerisierung bei 72°C und Denaturierung bei 95°C, jeweils für 1 min., Elongation: 10 min. bei 72°C) der pvHCV-99-Matrize mit Gpt-pr[3757] und HCV-pr 408[8750] ergab ein 221 bp großes Fragment, während die Amplifikation mit HCV-pr 409[8749] und TKr-pr [3756] ein 1006 bp großes Fragment ergab. Beide PCR-Fragmente überlappen einander um 19 Nukleotide. Diese beiden Fragmente wurden zusammengesetzt und mittels PCR mit den Primern Gpt-pr[3757] und TKr-pr [3756] amplifiziert. Das erhaltene 1200 bp große Fragment wurde mit EcoRI und HinDIII verdaut und in den EcoRI/HinDIII-verdauten Vektor pgsATA18 [ICCG 1998] (5558 bp) ligiert. Dieses Konstrukt, pvHCV-100, wurde durch Restriktions- und Sequenzanalyse analysiert und in der Stammliste als ICCG 3636 hinterlegt.
Konstruktion pvHCV-101
Für die Konstruktion von pvHCV-101 wurden zwei Oligonukleotide konstruiert:
Die PCR-Amplifikation der pvHCV-99-Matrize mit Gpt-pr [3757] und HCV-pr 410 [8748] führte zu einem 221 bp großen Fragment, während die Amplifikation mit HCV-pr 411 [8747] und TKr-pr [3756] ein 997 bp großes Fragment ergab. Beide PCR-Fragmente überlappen einander um 19 Nukleotide. Diese beiden Fragmente wurden zusammengesetzt und mittels PCR mit Gpt-pr [3757] und TKr-pr [3756] amplifiziert. Das erhaltene 1200 bp große Fragment wurde mit EcoRI und HinDIII verdaut und in den EcoRI/HinDIII-verdauten Vektor pgsATA18 [ICCG 1998] (5558 bp) ligiert. Dieses Konstrukt, pvHCV-101, wurde mittels Restriktions- und Sequenzanalyse analysiert und in der Stammliste als ICCG 3637 hinterlegt.
Alle Plasmide wurden mittels Sequenzanalyse überprüft und in der Innogenetics-Stammliste hinterlegt. Für jedes Plasmid wurden zwei Mini-DNA-Präparationen (PLASmix) unter sterilen Bedingungen durchgeführt und vereinigt. Die DNA-Konzentration wurde bestimmt und eine QA mittels Restriktionsanalyse durchgeführt. Gereinigte DNA wurde zur Erzeugung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, wie in Maertens et al. (PCT/EP95/03031) beschrieben, verwendet. Die rekombinanten Viren vvHCV-100 und vvHCV-101 wurden jedoch auf WHO-zertifizierten Vero-Zellen erzeugt. Nach zwei Runden Plaquen-Reinigung wurde das Expressionsprodukt mittels Western-Blot-Analyse wie in Maertens et al. (PCT/EP95/03031) beschrieben, analysiert. Proteine wurden mit einem spezifischen monoklonalen Anti-E2-Antikörper (IGH 212, der von den Erfindern bei Innogenetics N. V., Zwijnaarde, Belgien, erhalten werden kann) mit einem geschätzten Molekulargewicht von 69 und 37 kDa für vvHCV-100 und von 68 und 35 kDa für vvHCV-101 sichtbar gemacht. Diese Molekulargewichte zeigen das Vorhandensein sowohl eines glycosylierten als auch eines nichtglycosylierten E2-Proteins an, was durch Behandlung der Proben mit PNGaseF vor der Western-Blot-Analyse bestätigt wurde. Diese Behandlung führte zum Nachweis nur eines einzigen Proteins von 37 kDa bzw. 35 kDa für vvHCV-100 bzw. vvHCV-101.
Aminosäuresequenz des reifen E2, abgeleitet von pvHCV-100
Aminosäuresequenz des reifen E2, abgeleitet von pvHCV-101
Beispiel 9: Ein E1-Partikel mit weiter verbesserter Immunogenität
Wie in Beispiel 1 dargelegt, wurde das E1s-Protein gemäß der in der PCT/EP95/03031 von Maertens et al. beschriebenen Vorschrift gereinigt. Diese Vorschrift umfaßt die kovalente Modifikation von Cysteinen (freie Cysteine und an der intermolekularen Brückenbildung beteiligte Cysteine, letztere nach Reduktion dieser Cysteinbrücken mit DTT) unter Verwendung von Maleimidderivaten (N-Ethylmaleimid und Biotin-Maleimid, jeweils von der Firma Sigma bezogen). Als alternatives Verfahren zur Maleimidblockierung wurden aktive Halogene ebenso bewertet. Diese Verbindungen, d.h. die aktiven Halogene, blockieren freie Cysteine mittels Alkylierung. Dabei wurde ein aktives Halogen (Iodacetamid, Merck) beispielhaft bewertet. Zur Reinigung von E1 wurde die gleiche Vorschrift, wie bei Maertens et al. (PCT/EP 95/03031) beschrieben, verwendet, doch wurde statt Maleimidverbindungen Iodacetamid eingesetzt. Das durch diese Vorgehensweise erhaltene E1s-Protein verhielt sich während des gesamten Reinigungsvorgangs ähnlich wie die Maleimidblockierten Proteine. Nach dem abschließenden Absenken der Detergenskonzentration auf 0,05% CHAPS oder dem Wechsel auf 0,5% Betain, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden ähnliche Partikel erhalten, wie mit DLS bestimmt wurde. Der überraschende Effekt wurde jedoch nach Immunisierung von Mäusen mit diesem Acetamid-modifizierten E1s gefunden.
Insgesamt wurden drei Reihen von jeweils 6 Mäusen mit E1s mittels drei Injektionen im dreiwöchigen Abstand immunisiert, wobei jede Injektion aus 5 μg E1s bei 100 μg/ml PBS und im Gemisch mit einem gleichen Volumen an RIBI-Adjuvans (R-700) bestand. Eine erste Reihe erhielt in 0,05% CHAPS formuliertes E1-Maleimid, eine zweite Reihe erhielt ebenso in 0,05% CHAPS formuliertes E1-Acetamid, während eine dritte Reihe mit 0,12% Betain formuliertes E1-Acetamid erhielt. Abschließend wurden alle Mäuse 10 Tage nach der dritten Immunisierung ausgeblutet. Endpunkttiter (definiert als diejenige Verdünnung des Serums, die noch doppelt so hohe OD-Werte wie die Hintergrundwerte ergibt) wurden für jedes Tier getrennt gegen E1-Maleimid und E1-Acetamid bestimmt. In 17 sind diese Endpunkttiter dargestellt, und zwar als Mittelwerte mit Standardabweichungen. Mäuse, die E1-Maleimid erhalten hatten, produzierten lediglich eine Antikörperantwort, die in der Lage ist, maleimidhaltige Epitope zu erkennen (überhaupt keine Reaktivität gegenüber E1-Acetamid), wobei Mäuse, die E1-Acetamid erhielten, eindeutig eine Antikörperantwort gegen echte E1-Epitope produzieren, da die Antikörper sowohl gegen E1-Acetamid als auch E1-Maleimid reaktiv sind. Dies wurde eindeutig in einem zusätzlichen Experiment gezeigt, bei dem Antikörper gegen spezifische Bereiche von E1 unter Verwendung von Peptiden, die weder mit Acetamid noch mit Maleimid modifiziert waren, bestimmt wurden. Die Ergebnisse, wie sie in 18 gezeigt sind, demonstrieren, daß die mit E1-Acetamid (CHAPS- und Betain-formuliert) immunisierten Mäuse tatsächlich eine Antikörperantwort produzieren, die in der Lage ist, die Peptide V1V2, V2V3, V3V4, V5C4, C4V6 zu erkennen. Da V6 nicht Teil von E1s war, kann daraus geschlossen werden, daß Antikörper gegen C4, V3 (V3V4 ist positiv, während dies bei V4V5 nicht der Fall ist) und V1V2 produziert wurden. Mit E1s-Maleimid immunisierte Mäuse produzieren nur eine sehr schwache Antwort gegen die V1V2- und V2V3-Peptide. Dadurch wird nochmals die Tatsache betont, daß der einigermaßen hohe Titer, der für diese Mausantikörper gegen das Maleimid-E1s gemessen wurde, hauptsächlich gegen maleimid-abhängige Epitope gerichtet ist. Darüber hinaus konnte bewiesen werden, daß es sich bei der E1s-Acetamid-induzierten Antwort teilweise um eine Antwort des Th1-Typs handelt, da eine beträchtliche Menge der induzierten Antikörper dem IgG2(a + b)-Subtyp angehört. Die Menge an IgG2 ist sogar noch höher für die Betain-Formulierung verglichen mit der CHAPS-Formulierung (19). Aus diesen Ergebnissen wird die Schlußfolgerung gezogen, daß HCV-Hüllproteine, in denen wenigstens ein Cystein (möglicherweise jedoch mehr als ein Cystein) alkyliert ist, äußerst immunogene Proteine darstellen.
Folglich wurde das in Betain formulierte Acetamid-modifizierte E1 auch zur Wiederauffrischung der Schimpansen Phil und Ton verwendet. Beide Schimpansen wurden wiederum mit zwei aufeinanderfolgenden intramuskulären Immunisierungen in einem Abstand von drei Wochen immunisiert (50 μg E1 im Gemisch mit RIBI-Adjuvans, wie für die Beispiele 4 und 5). Wie man aus den 20 und 21 beurteilen kann, konnte die Anti-E1-Antwort tatsächlich wieder aufgefrischt werden, und zwar auf höhere Niveaus als bei den vorhergehenden Immunisierungen nach zwei Injektionen erhalten wurden.
Diese Titration wurde gegen einen Standard durchgeführt, bei dem es sich um ein Gemisch aus drei menschlichen Anti-E1-Seren mit hohem Titer (gewonnen aus chronischen HCV-Trägern) handelt. Der Anti-E1-Titer dieser Seren wurde als eine Einheit/ml definiert. Im Schimpansen Phil (20) wurden doppelt so hohe Titer wie in menschlichen Trägern nur nach zwei Immunisierungen induziert. Im Schimpansen Ton (21) wurden bis zu 140fach höhere Titer induziert. Dadurch wird wiederum die hohe Immunogenität dieser E1-Partikel betont.
Beispiel 10: Alkyliertes E1 besitzt bessere Qualitäten für eine diagnostische Verwendung
Das wie in Beispiel 9 beschriebene E1s-Acetamid wurde weiter als Antigen zum Nachweis von Anti-E1-Antikörpern in Serumproben aus menschlichen chronischen HCV-Trägern bewertet. Dabei wurden diese Antigene beispielhaft an LIA-Membranen gebunden, und Streifen wurden im wesentlichen wie bei Zrein et al. (1998) beschrieben bearbeitet. Zunächst wurden Serumproben aus 72 Blutspendern bewertet, um die optimale Konzentration des E1-Antigens zu bestimmen, die im Test verwendet werden kann, um „Falsch"-Positive auszuschließen. Es zeigte sich, daß für E1s-Maleimid diese Konzentration 8 μg/ml betrug, während für E1s-Acetamid eine Konzentration von bis zu 50 μg/ml keine falschpositiven Ergebnisse ergab (keine Proben, die eine relative Färbung von mehr als 0,5 zeigten). Mit 8 bzw. 50 μg/ml E1s-Maleimid bzw. E1s-Acetamid wurden 24 Seren von chronischen HCV-Trägern einem Screening auf Antikörper gegen E1s unterzogen. Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, führt das E1s-Acetamid eindeutig zu mehr Proben mit positivem Ergebnis (67% gegenüber 38% für E1s-Maleimid). Dabei wurde keine Probe gefunden, die nur mit E1s-Maleimid ein positives Ergebnis erzielte. Bei Proben, die ein positives Ergebnis sowohl mit E1s-Maleimid als auch mit E1s-Acetamid erzielten, war die Reaktivität gegenüber dem letzteren höher. Aus diesem Beispiel läßt sich schließen, daß alkylierte Hüllproteine des HCV bessere Antigene zum Nachweis menschlicher Antikörper sind als Maleimid-modifizierte Hüllproteine.
Beispiel 11: Herstellung von E1 und E2 enthaltenden Mischpartikeln
E1s und E2s (wHCV-44) wurden, wie bei Maertens et al., PCT/EP95/03031, beschrieben, hergestellt und gereinigt, mit Ausnahme davon, daß die Maleimid-Modifikation durch eine Alkylierung mit Iodacetamid ersetzt wurde. E1s und E2s wurde in 3% Empigen entweder allein oder als äquimolares Gemisch auf eine in PBS/0,2% CHAPS equilibrierte Superdex-200 PC3.2/30-Säule injiziert. Diese Säule ist zur Verwendung mit der HPLC-Apparatur SMART^TM von Pharmacia LKB (Schweden) vorgesehen. Die Fraktionen wurden einem Screening mit drei unterschiedlichen Sandwich EUSAs unterzogen. Für diese ELISAs wurden für E1-(IGH 207) und E2-(IGH 223) spezifische monoklonale Antikörper bei 2 μg/ml beschichtet. Fraktionen der Gelfiltration wurden in einer Verdünnung von 1:2500 inkubiert. Zwei weitere mit Biotin konjugierte monoklonale E1 (IGH 200)- und E2 (IGH 212)-Antikörper wurden zum Nachweis des gebundenen Antigens verwendet. Zur Entwicklung des gebundenen Biotins in eine Gelbfärbung, die bei 450 nm gemessen wurde, wurde das Streptavidin-HRP/TMB-System verwendet.
Dieses ELISA-System wurde in einem homologen (Anti-E1-Beschichtung/Anti-ELISA-Nachweis oder Anti-E2-Beschichtung/Anti-E2-Nachweis) und einem heterologen Aufbau (Anti-E1-Beschichtung/Anti-E2-Nachweis) verwendet. Bei dem letzteren werden theoretisch nur Partikel nachgewiesen, in die sowohl E1 als auch E2 eingebaut wurden. Die reaktiven Fraktionen wurden vereinigt, auf einem 10-kDa-Filter konzentriert und wiederum am Superdex-200 in PBS/0,05% CHAPS chromatographiert. Alle diese Fraktionen wurden unter Verwendung der unterschiedlichen ELISA-Aufbauten auf Reaktivität getestet. Wie sich aus 22 beurteilen läßt, führt die Zugabe von E2 zu E1 nicht zu einer größeren Verschiebung in der Retentionszeit, verglichen mit E1 allein, was darauf hindeutet, daß Partikel tatsächlich noch vorhanden sind. Diese Partikel enthalten sowohl E1 als auch E2, da nur bei diesem Aufbau der heterologe ELISA ein positives Ergebnis erzielt.
Beispiel 12: Herstellung von E1 aus zwei unterschiedlichen Genotypen enthaltenden Mischpartikeln
E1s des Genotyps 1b und des Genotyps 4 (vvHCV-72) wurden, wie bei Maertens et al., PCT/EP95/03031, beschreiben, hergestellt und gereinigt, mit Ausnahme davon, daß für den Genotyp 1b die Maleimid-Modifikation durch eine Alkylierung mit Iodacetamid ersetzt wurde. E1s-1b und E1s-4 in 3% Empigen wurden allein oder als äquimolares Gemisch auf eine in PBS/0,2% CHAPS equilibrierte Superdex-200 PC 3.2/30-Säule injiziert. Diese Säule ist zur Verwendung mit der HPLC-Apparatur SMART^TM von Pharmacia LBK (Schweden) vorgesehen. Die Hauptfraktionen mit Protein wurden vereinigt, auf einem 10-kDa-Filter konzentriert und wiederum an Superdex-200 in PBS/0,05% CHAPS chromatographiert. Alle diese Fraktionen wurden unter Verwendung eines ELISA-Aufbaus, der nur Partikel mit E1 von beiden Genotypen nachweisen sollte, auf Reaktivität getestet. Hierzu wurde das ELISA-Streptavidin bei 2 μg/ml beschichtet. Fraktionen der Gelfiltration wurden in einer Verdünnung von 1:2500 inkubiert. Ein monoklonaler E1-Antikörper (IGH 200), der lediglich E1 von Genotyp 1 und 10 erkennt, wurde zum Nachweis des gebundenen Antigens verwendet. Zur Entwicklung des Tests in eine Gelbfärbung, die bei 450 nm gemessen wurde, wurde das Ziege-anti-Maus-HRP/TMB-System verwendet. Wie sich aus 23 beurteilen läßt, führt die Zugabe von E1-4 zu E1-1b nicht zu einer größeren Verschiebung in der Retentionszeit der Proteine, was darauf hindeutet, daß Partikel tatsächlich noch vorhanden sind. Diese Partikel enthalten beide E1-Proteine, d.h. E1s des Genotyps 1b und des Genotyps 4, da nur bei diesem Aufbau der ELISA ein positives Ergebnis erzielt wird.
LITERATURANGABEN

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Tabelle 5
Tabelle 6
Tabelle 6 (Fortsetzung)

Claims

Oligomerpartikel, bestehend aus gereinigten HCV-Hüllproteinen und mit einem Durchmesser von 5 bis 100 Nanometern, wobei wenigstens ein Cysteinrest des Hüllproteins alkyliert ist.
Oligomerpartikel, bestehend aus einer Hülle aus gereinigten HCV-Hüllproteinen, wobei wenigstens ein Cysteinrest des Hüllproteins alkyliert ist, oder ein Oligomerpartikel, bei dem die gesamte Kugelform aus gereinigten HCV-Hüllproteinen besteht, wobei wenigstens ein Cysteinrest des Hüllproteins alkyliert ist, wobei das Partikel einen Durchmesser von 5 bis 100 Nanometern aufweist.
Oligomerpartikel nach Anspruch 1 oder 2, mit einem Durchmesser von 5 bis 40 Nanometern.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin es sich bei der Aminosäuresequenz des HCV-Hüllproteins um eine von einer HCV-Isolat-, HCV-Subtyp-, HCV-Stamm- oder HCV-Genus-Konsensussequenz abgeleitete Konsensussequenz handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei wenigstens ein Cysteinrest des Hüllproteins mittels eines Alkylierungsmittels alkyliert wird.
Oligomerpartikel nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Alkylierungsmittel um Ethylenimin, N-(Iodethyl)trifluoracetamid oder ein aktives Halogen X-(CH₂)_n-R handelt, wobei X für ein Halogen und R für H, COOH, NH₂, CONH₂, Phenyl oder ein Derivat davon steht und n gleich 0, 1, 2, 3 oder 4 ist.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den Hüllproteinen um HCV-E1-Proteine oder Teile davon handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den Hüllproteinen um HCV-E1s-Proteine oder Teile davon handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den Hüllproteinen um HCV-E2-Proteine oder Teile davon handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den Hüllproteinen um SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 14 oder Teile davon handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Hüllproteine von einer HCV-Isolat-Nukleotidkonsensussequenz, einer HCV-Subtyp-Nukleotidkonsensussequenz, einer HCV-Spezies-Nukleotidkonsensussequenz oder einer HCV-Genus-Nukleotidkonsensussequenz oder Teilen davon codiert werden.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei den Hüllproteinen um ein Gemisch aus HCV-E1-Protein und/oder Teilen davon, HCV-E1s-Protein und/oder Teilen davon, HCV-E2-Protein und/oder Teilen davon handelt.
Oligomerpartikel nach Anspruch 12, wobei die HCV-E2-Proteine oder Teile davon durch SEQ ID NO: 13 und/oder Teile davon oder durch SEQ ID NO: 14 und/oder Teile davon definiert sind.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Hüllproteine, oder Teile davon, aus unterschiedlichen HCV-Stämmen, HCV-Subtypen oder HCV-Genotypen stammen.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei es sich bei den Hüllproteinen, oder Teilen davon, um ein Gemisch, bestehend aus HCV-Hüllproteinen aus einem HCV-Stamm oder HCV-Genotyp, und HCV-Hüllproteinen aus wenigstens einem weiteren HCV-Stamm oder HCV-Genotyp handelt.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 15, erhältlich mit einem Verfahren, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: (i) Reinigung von HCV-Hüllproteinen in Lösung, wobei ein Alkylierungsmittel verwendet wird; (ii) Austauschen der Lösung von den gereinigten HCV-Hüllproteinen gegen ein Detergenz oder Salz, was zur Bildung von Oligomerpartikeln führt; und (iii) Reinigung der in (ii) gebildeten Oligomerpartikel.
Oligomerpartikel nach Anspruch 16, wobei im Schritt (i) des Verfahrens ein erstes Detergenz verwendet wird.
Oligomerpartikel nach Anspruch 16 oder 17, wobei im Schritt (i) ein Mittel zur Spaltung von Disulfidbindungen verwendet wird.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei im Schritt (iii) des Verfahrens die Konzentration des Detergenz oder Salzes aus Schritt (ii) weiter verringert wird.
Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei es sich bei dem ersten Detergenz in Schritt (i) um Empigen-BB, bei dem Detergenz in Schritt (ii) oder Schritt (iii) um CHAPS, Octylglucosid, Tween oder ein beliebiges anderes Detergenz und bei dem Salz um Betain handelt.
Oligomerpartikel nach Anspruch 20, wobei das Empigen-BB in einer Konzentration von 1% bis 10% und das CHAPS oder Tween in einer Konzentration von 0,01% bis 10% oder das Betain in einer Konzentration von 0,01% bis 10% verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (i) Reinigung von HCV-Hüllproteinen in Lösung, wobei ein Alkylierungsmittel verwendet wird; (ii) Austauschen der Lösung von gereinigten HCV-Hüllproteinen gegen ein Detergenz oder Salz, was zur Bildung von Oligomerpartikeln führt; und (iii) Reinigung der in (ii) gebildeten Oligomerpartikel.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei im Schritt (i) ein erstes Detergenz verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei im Schritt (i) ein Mittel zur Spaltung von Disulfidbindungen verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei im Schritt (iii) des Verfahrens die Konzentration des Detergenz oder Salzes aus Schritt (ii) weiter verringert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei es sich bei dem ersten Detergenz in Schritt (i) um Empigen-BB, bei dem Detergenz in Schritt (ii) oder Schritt (iii) um CHAPS, Octylglucosid, Tween oder ein beliebiges anderes Detergenz und bei dem Salz um Betain handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Oligomerpartikels nach Anspruch 26, wobei das Empigen-BB in einer Konzentration von 1% bis 10% und das CHAPS oder Tween in einer Konzentration von 0,01% bis 10% oder das Betain in einer Konzentration von 0,01% bis 10% verwendet wird.
Zusammensetzung, umfassend ein Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
Zusammensetzung nach Anspruch 28, die ebenso das HCV-Core-, P7-, E1-, E2-, NS2-, NS3-, NS4A-, NS4B-, NS5A- und/oder NS5B-Protein oder Teile davon umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das NS3-Protein oder Teile davon eine durch SEQ ID NO: 1 oder Teile davon gegebene oder durch SEQ ID NO: 2 oder Teile davon gegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, bei der es sich um eine Impfstoffzusammensetzung handelt.
Verwendung eines Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung einer HCV-Impfstoffzusammensetzung.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern vor, gleichzeitig mit oder nach einer beliebigen anderen Therapie.
Verwendung des Oligomerpartikels nach Anspruch 35, wobei es sich bei der anderen Therapie um eine Interferontherapie handelt.
Verwendung des Oligomerpartikels nach Anspruch 35, wobei es sich bei der anderen Therapie um eine Interferontherapie in Kombination mit kleinen Arzneistoffen handelt.
Verwendung des Oligomerpartikels nach Anspruch 37, wobei es sich bei den kleinen Arzneistoffen um Ribavirin handelt.
Verwendung des Oligomerpartikels nach Anspruch 35 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in mit HCV infizierten Individuen vor oder nach einer Lebertransplantation oder nach einer vermuteten Infektion.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen Induzierung von Immunität gegen HCV.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomerpartikel als Teil einer zeitlichen Reihe von Verbindungen verwendet wird.
Verwendung des Oligomerpartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer HCV-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 42, wobei die Behandlung zur – Eliminierung viraler HCV-Antigene aus der Leber und/oder – Normalisierung der Leberenzymspiegel im Serum und/oder – Verbesserung der Leberhistologie und/oder – Besserung einer Lebererkrankung und/oder – Besserung einer Leberentzündung führt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines HCV-Impfstoffs.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 46 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in chronischen HCV-Trägern vor, gleichzeitig mit oder nach einer beliebigen anderen Therapie.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei der anderen Therapie um eine Interferontherapie handelt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei der anderen Therapie um eine Interferontherapie in Kombination mit kleinen Arzneistoffen handelt.
Verwendung nach Anspruch 49, wobei es sich bei den kleinen Arzneistoffen um Ribavirin handelt.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV in mit HCV infizierten Individuen vor oder nach einer Lebertransplantation oder nach einer vermuteten Infektion.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen Induzierung von Immunität gegen HCV.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung von Immunität gegen HCV, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung Teil einer zeitlichen Reihe von Verbindungen ist.
Spezifischer Antikörper, erzeugt gegen das Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
Verwendung des spezifischen Antikörpers nach Anspruch 54 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer HCV-Infektion.
Kit zum Nachweis von HCV-Antigenen, umfassend den spezifischen Antikörper nach Anspruch 54.
Kit zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorhandenen HCV-Antikörpern, umfassend das Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21, in einem geeigneten Behälter.
Kit zum Nachweis einer T-Zellantwort in Verbindung mit HCV, umfassend das Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
Immunassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einer biologischen Probe, bei dem man (i) das Oligomerpartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21 bereitstellt; (ii) die biologische Probe mit dem Oligomerpartikel aus (i) unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem Oligomerpartikel und den Antikörpern gegen HCV gestatten, inkubiert; (iii) aus (ii) bestimmt, ob der Komplex gebildet worden ist, und daraus das Vorhandensein von Antikörpern gegen HCV in der biologischen Probe ermittelt.