DE69922498T2 - Fluorescierende Cyaninlabels mit einem Sulphamidobrückenglied - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Klasse von fluoreszierenden Farbstoffen, die zur Familie der Cyanine gehören. Die neuartigen fluoreszierenden Farbstoffe können unter Verwendung leistungsstarker, aber dennoch kostengünstiger Leuchtdioden und Diodenlaser angeregt werden; sie weisen eine gute Wasserlöslichkeit auf und können zu Markierungszwecken mit einer breiten Vielfalt von Molekülen oder Oberflächen verbunden oder konjugiert werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In den letzten Jahren gab es einen Aufschwung in der Forschung bezüglich der fluoreszierenden Markierung biologischer Verbindungen zwecks Entwicklung einfacherer, empfindlicherer Analysemethoden. Insbesondere eine Klasse von fluoreszierenden Farbstoffen zog viel Aufmerksamkeit auf sich, nämlich die Klasse der Cyaninfarbstoffe. Während sich in der Vergangenheit viel Arbeit bei diesen Verbindungen auf das Erhalten lipophiler Materialien, die bei fotografischen Verfahren zu verwenden sind, konzentrierte, erfordert das derzeitige Anwendungsgebiet in den biologischen Wissenschaften stattdessen hydrophile Sorten. Überdies enstand ein neues Erfordernis mit der Notwendigkeit, reaktionsfähige Spacerverbindungen bereitzustellen, die zum Binden der Farbstoffe an Biomoleküle zu verwenden sind.
  • Bezüglich der Grundstruktur von Verbindungen, wie sie in 1 gezeigt werden, ist ersichtlich, dass solche Linkerarme im Allgemeinen entweder am aromatischen Teil des Moleküls oder an den Indoleninstickstoffen oder an der den Q-Rest bildenden Polymethinbrücke angebracht sein können.
  • Waggoner et al. beschrieben in Cytometry 10, 3-10 (1989) zum Beispiel an den aromatischen Rahmen gebundene Iodacetamidogruppen zum Markieren thiolhaltiger Moleküle und ebenfalls an einen aromatischen Rahmen gebundene Isothiocyanidgruppen zum Markieren aminhaltiger Verbindungen (in Cytometry 10, 11-19 (1989)).
  • Mank und Kollegen produzierten in Anal. Chem. 67, 1742-1748 (1995) N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Estercyaninfarbstoffderivate aus am aromatischen Rahmen angebrachten Carboxylgruppen oder Carboxymethylgruppen für die Vorsäulen-Derivatisierung von Aminen bei der Flüssigkeitschromatographie. Die markierten Amine konnten dann durch Diodenlaser-induzierte Fluoreszenz im sichtbaren Bereich mit äußerst hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden.
  • Waggoner und Kollegen entwickelten Cyaninmarkierungen, bei denen die reaktionsfähige NHS-Funktion durch eine Alkylkette mit dem Indoleninstickstoff verbunden ist (Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993). Diese Vorgehensweise wurde auch von Brush und Erie ( US 5,808,044 ) befolgt, die ein Verfahren zur Herstellung von in der Nucleotidmarkierung nützlichen Cyaninphosphoramiditen offenbarten.
  • Patonay und Kollegen beschrieben in J. Org. Chem., 57, 4578-4580 (1992) eine Tricarbocyanin-Klasse von Cyaninfarbstoffen, enthaltend Isothiocyanidgruppen, die an der Polymethinbrücke angebracht sind, und zwar über einen Thiophenol-Linker zum Binden von Molekülen mit der Aminofunktionalität.
  • Obwohl die vorhergehenden Ansätze unterschiedliche Erfolgsgrade erbrachten, führten sie in vielen Fällen zu unerwünschten Nebeneffekten bei den Farbstoffen. Wenn die reaktionsfähige Gruppe zum Beispiel direkt am aromatischen Rahmen angebracht ist, wird die Fluoreszenzleistung des Farbstoffs negativ beeinflusst, wie in Anal. Chem. 67, 1742-1748 (1995) gezeigt. In anderen Fällen ermöglicht die Existenz einer direkt am Indolenin N angebrachten flexiblen Seitenkette, dass das markierte Molekül in einen engen Kontakt mit der chromophoren Polymethinkette tritt: ebenso kann dies die Fluoreszenz des Farbstoffs durch intermolekulares Quenchen stören oder negativ beeinflussen. Letztendlich können manche Ansätze (z.B. Organic Chem., 57, 4578-4580 (1992) nur für bestimmte Farbstoffe verwendet werden.
  • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden fluoreszierende Cyaninfarbstoffe entwickelt, bei denen geeignete reaktionsfähige Gruppen über eine Sulfamidoalkylkette mit dem aromatischen Rahmen verbunden sind, wie in 1 gezeigt.
  • Durch Befolgung dieser Vorgehensweise kann eine breite Vielfalt von fluoreszierenden Cyaninmarkierungen hergestellt werden, welche für das Markieren von Molekülen, die Amino-, Thiol-, Hydroxyl-Funktionalitäten enthalten, nützlich sind. Durch dasselbe allgemeine Verfahren können Cyaninmarkierungen auch für das Binden von Molekülen, die Aldehyde, Carbonsäurederivate wie z.B. Chloride, Anhydride und aktive Ester oder Maleimidogruppen enthalten, geeignet gemacht werden. Die vorliegende Erfindung bietet gegenüber zuvor geoffenbarten Verfahren beträchtliche Vorteile hinsichtlich der Beseitigung aller möglichen Störungen zwischen den fluoreszierenden Cyaninmarkierungen und dem markierten Molekül. Ebenso ist ihre Anwendbarkeit allgemeiner.
  • Diese wertvollen Eigenschaften werden erhalten, indem ein flexibler Alkylen-Spacerarm über eine äußerst stabile und leicht einzuführende Sulfamidobindung am starren aromatischen Rahmen des Farbstoffs angebracht wird. Da der reaktionsfähige Teil der Markierungen am äußersten Ende der zuvor erwähnten Alkylenkette positioniert ist, wird das markierte Molekül unfähig gemacht, in einen engen Kontakt mit dem chromophoren Polymethinsegment des Farbstoffs zu treten. Die durch die Alkylenkette geschaffene Flexibilität kann jedoch beim Erzielen einer guten Markierungsausbeute, insbesondere bei beeinträchtigten Molekülen, häufig von Vorteil sein.
  • Die Arylsulfamidogruppe wurde ausgewählt, da sie das Fluoreszenzverhalten des Farbstoffs nicht stört, und ebenso da ihr Vorläufer, die Sulfonatgruppe, in einer sehr großen Zahl von Arylaminen, die für die Synthese der Cyaninfarbstoffe erforderlich sind, häufig zu finden ist. Im Gegensatz dazu bewirkt die Carboxylgruppe, die als Linker oder für eine direkte Aktivierung via NHS-Ester ausgewählt wurde, nicht nur eine Abnahme der Fluoreszenz-Quantenausbeute der Farbstoffe, wie von Mank und Kollegen in Anal. Chem. 67, 1742-1748 (1995) gezeigt, sondern überdies sind die für die Farbstoffsynthese geeigneten Aminoarylcarboxyl-Vorläufer auch nicht so allgemein erhältlich wie die entsprechenden Aminoarylsulfonsäuren oder -sulfonate. Letztere Aussage trifft insbesondere auf die Naphthalinserie zu. In diesem Fall müssen die Carboxyl- und Aminogruppen in unterschiedlichen aromatischen Ringen lokalisiert sein, um die Bildung des Indolenin-Vorläufers zu ermöglichen. Bei allen allgemein erhältlichen Aminonaphthalincarbonsäuren sind jedoch beide funktionelle Gruppen am selben Ring angebracht. Im Gegensatz dazu sind Dutzende von Aminonaphthalinsulfonsäuren wegen ihrer Verwendung als Farbstoff-zwischenprodukte erhältlich, und in vielen derartigen Verbindungen sind die Amino- und Sulfongruppen in separaten Ringen zu finden, wie von der vorliegenden Erfindung gefordert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist auf fluoreszierende Farbstoffe der Formel
    Figure 00030001
    gerichtet, wobei:
    X1 und X2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -C(CH3)2 oder -C=CH2;
    Y1 und Y2 Nichtmetallatome sind, die zur Bildung eines Benzo-kondensierten oder Naphtho-kondensierten Rings erforderlich sind;
    Q ein konjugierter Rest ist, der die Fluoreszenz-Quantenausbeute und die Stabilität der Verbindung erhöht;
    R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C4, Alkyl, Alkylensulfongruppe oder Alkylensulfonatgruppe, wobei die Alkylengruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt;
    R3, R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, einer Sulfongruppe, einer Sulfonatgruppe, Alkylensulfon, Alkylensulfonat und -SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ, wobei Alkylen 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt, mit der Maßgabe, dass zumindest eines von R1 bis R5 eine Sulfon- oder Sulfonatgruppe enthält;
    W fehlt oder eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus -SO2NH-, -O-, -COO- oder -CONH-; n = 0-12 und m = 0-12, mit der Maßgabe, dass m+n ≤ 12 und zumindest eines von m und n ≠ 0;
    und Z eine N-, O- oder S-Nucleophilfunktionalität ist oder enthält oder eine Funktionalität, die in der Lage ist, mit N-, O- oder S-Nucleophilen zu reagieren, ist oder enthält.
  • Nucleophilfunktionalitäten umfassen -NH2-, -OH- und -SH-Gruppen; Gruppen, die in der Lage sind, mit solchen Funktionalitäten zu reagieren, umfassen -COCl, -COOCOR, -CONHNH2, N-Hydroxysuccinimidester, -NCS, -CHO, -COCH2I, Phosphoramidit und Maleimido; R ist ein C1-C4-Alkyl.
  • Vorzugsweise enthalten zumindest zwei der Gruppen R1 bis R5 eine Sulfonsäure oder eine Sulfonatgruppe.
  • Vorzugsweise können R3, R4, R5 alle eine Gruppe des Typs -SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ sein und stellen dabei einen Farbstoff mit bis zu vier reaktionsfähigen Funktionalitäten bereit.
  • Q ist vorzugsweise eine Polymethinkette mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen, welche vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00040001
    Figure 00050001
    wobei R6 H, ein Halogenatom oder die Gruppe SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ und i 0 oder 1 ist.
  • Im Umfang der Erfindung sind auch die Valenztautomeren der Verbindungen der Formel (1) enthalten, wobei die Valenztautomerie das Verschieben der konjugierten Bindungen in der Polymethyinkette bedeuten soll.
  • Genauer können die fluoreszierenden Markierungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung durch die allgemeinen Formeln der 2 und 3 dargestellt werden, wobei X1 und X2 so wie obenstehend definiert und vorzugsweise -C(CH3)2 sind. Zwei allgemeine Verfahren zur Herstellung von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-Indolen mit Sulfamidoalkyl-Linkerarmen werden in 4 gezeigt. Diese Verbindungen sind Hauptzwischenprodukte bei den Synthesen von Cyaninfarbstoffen. Ähnliche Schemata können hinsichtlich der Synthesen von 1,1,2-(1H)-Benz[e]indolen mit Sulfamidoalkylen-Linkerarmen befolgt werden. Gemäß dem in 4a gezeigten Schema startet die Synthese mit preiswertem, leicht erhältlichem 4-Acetamidobenzolsulfonylchlorid (einem Ausgangsmaterial bei der Synthese von Sulfa-Arzneimitteln). Diese Verbindung reagiert mit einer breiten Vielfalt von Aminoalkylenverbindungen H2N(CH2)nZ. In vielen Fällen ist es notwendig, die Funktionalität Z während dieses Schritts oder in späteren Schritten zu schützen. Geschützte Funktionalitäten werden als Z(prot) bezeichnet. Dies kann bei Verwendung von Standardschutzgruppen erreicht werden. Carboxylgruppen können beispielsweise als t-Butylester, Alkoholgruppen als Tetrahydropyranyl (THP)-Acetale und Amine als Trifluoracetamide geschützt werden, oder zweckmäßiger kann ein großer Überschuss von Diaminoalkanen verwendet werden: die distale Aminogruppe kann dann als Trifluoracetamid geschützt werden. Im nächsten Schritt der 4a wird die Acetamido-Schutzgruppe durch Basenhydrolyse entfernt. Unter diesen Bedingungen sind die zuvor gebildeten Sulfamidobindungen stabil. Die resultierenden primären aromatischen Aminogruppen werden durch die Wirkung von SnCl2 in konzentrierter Salzsäure zu Hydrazinen reduziert. Im letzten Schritt wird eine Fischer-Indolsynthese durchgeführt, indem die Hydrazino-Derivate mit 3,3-Dimethyl-2-Butanon kondensiert werden.
  • Gemäß dem alternativen Schema (4b) findet die Fischer-Indolsynthese im ersten Schritt statt, das heißt, 4-Hydrazinobenzolsulfonsäure wird mit 3,3-Dimethyl-2-Butanon kondensiert. Das Produkt, 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfonsäurekaliumsalz, wird durch Erhitzen mit Phosphorpentachlorid in 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochloridsulfonylchlorid umgewandelt. Wie beim vorhergehenden Verfahren wird das Sulfochlorid daraufhin mit einer breiten Vielfalt von Aminoalkylverbindungen H2N(CH2)nZ(prot) umgesetzt. Die Schutzgruppen können am günstigsten nach der N-Alkylierung des Indolenins entfernt werden.
  • Genauer gesagt werden Verbindungen, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, so synthetisiert wie in den 5-44 gezeigt.
  • Ähnliche Schemata können bei der Synthese von Oxa- und Thiacyaninen mit Sulfamidoalkyl-Linkerarmen befolgt werden. Insbesondere 2-Methylbenzoxazole, 2-Methylnaphthoxazole, 2-Methylbenzothiazole und 2-Methylnaphthothiazole mit den passenden Substituenten im Benzo- oder Naphtho-Ring (Sulfon- oder Sulfamidoalkylen-Gruppen) werden anstelle der entsprechenden 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indole, 1,1,2-(1H)-Benz[e]indole verwendet. Asymmetrische Farbstoffe (Oxa-Indocyanine, Thia-Indocyanine, Oxa-Thiacyanine) können ebenso durch passendes Auswählen der entsprechenden Heterocyclen hergestellt werden.
  • Die optischen Eigenschaften mancher Farbstoffserien in phosphatgepufferter Salzlösung sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
    Figure 00060001
  • Immunoassays können entwickelt werden, die auf Fluoreszenzmessungen im Quantifizierungsschritt beruhen. Diese Messungen umfassen die Fluoreszenzintensität, die Lebensdauer-Fluoreszenz oder die Anisotropie (Fluoreszenzpolarisierung). Zu diesem Zweck wird die fluoreszierende Verbindung der Erfindung mit einem immunologisch bindenden Reagens, wie z.B. einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder Antigen, konjugiert.
  • Die Konjugation von Cyaninfarbstoffen mit einem Sulfamidoalkylen-Spacerarm mit anti-β-HCG- und anti-α-Fetoprotein-Antikörpern ist im Beispiel 26 und 28 beschrieben. Standardmäßige Trennungsanalysen, bei denen die Cyaninkonjugate und die Fluoreszenzintensitätsmessung der eingefangenen fluoreszierenden Markierung eingesetzt werden, sind im Beispiel 25 bzw. 27 beschrieben.
  • Die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung sind auch bei jeder derzeitigen Anwendung zur Detektion von Nucleinsäuren von Nutzen, welche ein empfindliches Nachweisreagens erfordert. Die Nucleinsäure in der Probe kann entweder RNA oder DNA oder eine Mischung davon sein. Wenn die Nucleinsäure DNA ist, kann die DNA gegebenenfalls eine einzel-, doppel-, drei- oder viersträngige DNA sein. Die Nucleinsäure kann entweder natürlich (biologischen Ursprungs) oder synthetisch (künstlich hergestellt) sein und kann in der Probe als Nucleinsäurefragmente, Oligonucleotide oder Nucleinsäurepolymere vorhanden sein. Das Vorhandensein der Nucleinsäure in der Probe kann an einer erfolg-reichen oder nicht erfolgreichen Versuchsmethodik, an einer unerwünschten Verunreinigung oder an einem Erkrankungszustand liegen.
  • Die fluoreszierenden Farbstoffe der vorliegenden Erfindung können auch für DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet werden. Typischerweise wird eine für die Sequenz spezifische, Fluorophor-markierte Sonde mit der Ziel-DNA hybridisiert, und die Sequenzleitern werden durch laserinduzierte Fluoreszenz oder andere geeignete Mittel zum Nachweisen einer fluoreszenzmarkierten DNA identifiziert.
  • Beispiel 29 beschreibt ein Verfahren zur Markierung von Ribonucleotiden, Desoxyribonucleotiden und Didesoxyribonucleotiden mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen. Die Strukturen der durch dieses Verfahren erhaltenen Verbindungen werden in den 45-56 gezeigt.
  • Eine besonders nützliche Art der Fluoreszenzanalyse ist die Anwendung einer Fluoreszenzpolarisierung. Eine Fluoreszenzpolarisierung tritt auf, wenn ein fluoreszierendes Molekül mit polarisiertem Licht angeregt wird, was dazu führt, dass das vom fluoreszierenden Molekül ausgestrahlte Licht ebenfalls polarisiert ist. Eine mengenmäßige Bestimmung der Polarisierung des angeregten Moleküls kann erhalten werden, indem die relative Intensität des emittierten Lichts parallel und senkrecht zur Polarisierungsebene des Anregungslichts gemessen wird. Diese Art der Analyse hat den Vorteil, homogen zu sein, das heißt, sie benötigt keine Trennungsschritte. Beispiel 30 beschreibt die Herstellung eines Theophyllin(sulfamidoalkylamino)cyanin-Konjugats.
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (I)
  • 5g trockenes 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-5-sulfonsäurekaliumsalz (18 mmol), hergestellt wie bei Mank et al., Anal. Chem. 1995, 67, S. 1744, beschrieben, wurden in einem 500 ml-Rundkolben mit 7,5 g PCl5 (36 mmol) und 2 ml POCl3 (22 mmol) vermischt. Der mit einem Rücklaufkondensator ausgestattete Kolben wurde unter Argon 2 Stunden lang bei 110°C in einem Ölbad erhitzt. Nicht umgesetzte Phosphorchloride wurden bei 110°C unter Vakuum entfernt, wobei eine bei 7 mm Hg arbeitende Membranpumpe verwendet wurde. Die gekühlte Mischung wurde mit zwei 150 ml-Mengen von trockenem Hexan trituriert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Hexanextrakte wurden verworfen, und das rohe Sulfochlorid wird bei 110°C unter Vakuum getrocknet (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 2a
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit dem t-Butylester von Glycin, 5-(SO2-NH-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol (IIa)
  • 5,15 g Glycin-t-butylesterdibenzolsulfimidsalz (12 mmmol) und 8 ml Pyridin werden in 100 ml Chloroform aufgelöst. 2 g rohes 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 werden unter Rühren zu dieser Lösung hinzugefügt. Nach einem Rührvorgang bei Raumtemperatur und über Nacht werden das Lösungsmittel und das Pyridin unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird dreimal mit 100 ml Chloroform behandelt, das dann unter Vakuum wieder entfernt wird. Das rohe Sulfonamid wird daraufhin in Chloroform aufgelöst und durch tropfenweise Zugabe von 1 l Diethylether ausgefällt. (Ausbeute: 70%).
  • BEISPIEL 2b
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit dem t-Butylester von β-Alanin, 5-(SO2NH-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol (IIb)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2a aus 2,18 g β-Alanin-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 67%).
  • BEISPIEL 2c
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit dem t-Butylester von γ-Aminobuttersäure, 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol (IIc)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2a aus 2,35 g γ-Aminobuttersäure-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 2d
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit dem t-Butylester von ε-Aminocapronsäure, 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol (IId)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2 aus 2,68 g ε-Aminocapronsäure-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 2e
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit 1,4-Diaminobutan, 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IIe)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2a aus 8 ml 1,4-Diaminobutan (80 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 75%).
  • BEISPIEL 2f
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit 1,6-Diaminohexan, 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IIf)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2a aus 10 g 1,4-Diaminohexan (86 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 2g
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol mit 6-Amino-1-hexanol, 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IIg)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 2a aus 1,4 g 6-Amino-1-hexanol (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol-4-sulfochlorid (7,8 mmol) des Beispiels 1 hergestellt. (Ausbeute: 78%).
  • BEISPIEL 3a
  • Herstellung von 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IIIa)
  • 1,8 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 2d hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäureanhydrid behandelt. (Ausbeute: 96%).
  • BEISPIEL 3b
  • Herstellung von 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IIIb)
  • 1,8 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 2e hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäureanhydrid behandelt. (Ausbeute: 99%).
  • BEISPIEL 4
  • Herstellung von 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OTHP)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol (IVa)
  • 1,8 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 2g hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit einem Überschuss von 3,4-Diidro-2H-pyran und einigen Tropfen Trifluoressigsäure als Katalysator behandelt. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 5
  • Herstellung von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfochlorid (V)
  • 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfonsäure, hergestellt wie in der WO 97/13810 beschrieben, wurde in Methanol aufgelöst und mit einem gesättigten Kaliumhydroxid in Isopropanol gerührt. Das Kaliumsalz präzipitierte und wurde auf einem Filter gesammelt, mit Isopropanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet. 6,0 g des Salzes (18,3 mmol) wurden in einem 500 ml-Rundkolben mit 7,5 g PCl5 (36 mmol) und 2 ml POCl3 (22 mmol) vermischt. Der mit einem Rücklaufkondensator ausgestattete Kolben wurde unter Argon 2 Stunden lang bei 110°C in einem Ölbad erhitzt. Nicht umgesetzte Phosphorchloride wurden bei 110°C unter Vakuum entfernt, wobei eine bei 7 mm Hg arbeitende Membranpumpe verwendet wurde. Die gekühlte Mischung wurde mit zwei 150 ml-Mengen von trockenem Hexan trituriert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Hexanextrakte wurden verworfen, und das rohe Sulfochlorid wird bei 110°C unter Vakuum getrocknet (Ausbeute: 60%).
  • BEISPIEL 6a
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit dem t-Butylester von Glycin, 6-(SO2NH-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIa)
  • 5,15 g Glycin-t-butylesterdibenzolsulfimidsalz (12 mmmol) und 8 ml Pyridin werden in 100 ml Chloroform aufgelöst. 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 5 werden unter Rühren zu dieser Lösung hinzugefügt. Nach einem Rührvorgang bei Raumtemperatur und über Nacht werden das Lösungsmittel und das Pyridin unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird dreimal mit 100 ml Chloroform behandelt, das dann unter Vakuum wieder entfernt wird. Das rohe Sulfonamid wird daraufhin in Chloroform aufgelöst und durch tropfenweise Zugabe von 1 l Diethylether ausgefällt. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 6b
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit dem t-Butylester von β-Alanin, 6-(SO2NH-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIb)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 6a aus 2,18 g β-Alanin-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 5 hergestellt. (Ausbeute: 81%).
  • BEISPIEL 6c
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit dem t-Butylester von γ-Aminobuttersäure, 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIc)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 6a aus 2,35 g γ-Aminobuttersäure-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 5 hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 6d
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 21,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit dem t-Butylester von ε-Aminocapronsäure, 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VId)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 6a aus 2,68 g ε-Aminocapronsäure-t-butylesterhydrochlorid (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-6-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 5 hergestellt. (Ausbeute: 89%).
  • BEISPIEL 6e
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit 1,4-Diaminobutan, 7-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIe)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13 aus 8 ml 1,4-Diaminobutan (80 mmol), 8 ml Pyridin und 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-7-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 12 hergestellt. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 6f
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit 1,6-Diaminohexan, 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIf)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13 aus 10 g 1,4-Diaminohexan (86 mmol), 8 ml Pyridin und 2 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-7-sulfochlorid (7,6 mmmol) des Beispiels 12 hergestellt. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 6g
  • Herstellung des Sulfonamidderivats von 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol mit 6-Amino-1-hexanol, 7-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIg)
  • Das Sulfonamid wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 10 aus 1,4 g 6-Amino-1-hexanol (12 mmol), 8 ml Pyridin und 2,5 g 1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol-4-sulfochlorid (7,6 mmol) des Beispiels 9 hergestellt. (Ausbeute: 99%).
  • BEISPIEL 7a
  • Herstellung von 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIIa)
  • 2,6 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 6e hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäureanhydrid behandelt. (Ausbeute: 83%).
  • BEISPIEL 7b
  • Herstellung von 7-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIIb)
  • 3,1 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 6f hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäureanhydrid behandelt. (Ausbeute: 91%).
  • BEISPIEL 8
  • Herstellung von 7-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OTHP)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol (VIII)
  • 2,8 g des gemäß dem Verfahren des Beispiels 6g hergestellten Sulfonamids wurden bei Raumtemperatur mit Tetrahydropyren behandelt. (Ausbeute: 97%).
  • BEISPIEL 9a
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXa)
  • In einem 100 ml-Rundkolben wurden 2,5 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol des Beispiels 2a in 30 ml heißem Sulfolan unter Argon aufgelöst. 1,4-Butansulton (1 ml, 9,8 mmol) wurde zu dieser Lösung hinzugefügt. Die Mischung wurde daraufhin 12 Stunden lang bei 130°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die dunkle Lösung mit 50 ml Toluol vermischt. Das braune Präzipitat wurde filtriert und mit zwei 50 ml-Mengen von Toluol gewaschen. Die Schutzgruppe wurde durch Auflösen des Rohprodukts in einigen Millilitern Methanol/konzentrierter Salzsäure entfernt. Die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und das Titelprodukt wurde durch tropfenweises Hinzufügen zu 500 ml Ether ausgefällt und unter Vakuum getrocknet. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 9b
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol, Beispiel 2b, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 89%).
  • BEISPIEL 9c
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,5 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol, Beispiel 2c, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 58%).
  • BEISPIEL 9d
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,8 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indol, Beispiel 2d, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 89%).
  • BEISPIEL 9e
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-indol, Beispiel 3a, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 79%).
  • BEISPIEL 9f
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-2,3,3-Trimethylbenz[e]-(3H)-indol, Beispiel 3b, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 99%).
  • BEISPIEL 9g
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium (IXg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 5-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OTHP)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 4, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 89%).
  • BEISPIEL 10a
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 6a, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 95%).
  • BEISPIEL 10b
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 6b, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt, gefolgt von einer Säurehydrolyse. (Ausbeute: 90%).
  • BEISPIEL 10c
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,5 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 6c, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt, gefolgt von einer Säurehydrolyse. (Ausbeute: 85%).
  • BEISPIEL 10d
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,8 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COO-t-Butyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 6d, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 88%).
  • BEISPIEL 10e
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 7a, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 10f
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NHCOCF3)-1,1,2-Trimethyl-(1H)-benz[e]indol, Beispiel 7b, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 67%).
  • BEISPIEL 10g
  • Herstellung von 1-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium (Xg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 9a aus 2,2 g (7,1 mmol) 6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OTHP)-2,3,3-Trimethyl-(3H)-benz[e]indol, Beispiel 8, und 1,0 ml (9,8 mmol) 1,4-Butansulton hergestellt. (Ausbeute: 3,0 g).
  • BEISPIEL 11a
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIa)
  • In einem mit einem Rücklaufkondensator ausgestatteten Rundkolben wurde eine Mischung aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (von Mujumdar et al., Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 105-11) und 163 mg (0,83 mmol) N,N'-Diphenylformamidin in 2 ml Essigsäure 3 Stunden lang bis zum Rückfluss erhitzt. Die Essigsäure wurde unter Vakuum abgedampft und das Produkt mit einer Mischung aus Ethylacetat und Wasser trituriert. Das Rohprodukt wurde in einer Mischung aus Acetanhydrid (2 ml) und Pyridin (2 ml) erneut aufgelöst. 316 mg des in Beispiel 9a hergestellten 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliums wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 110°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der Farbstoff durch Zugabe von Ethylether ausgefällt. Das Rohprodukt wurde durch eine Michel-Miller-Chromatographie auf Lichroprep RP18, Partikelgröße 25-40 Mikrometer, gereinigt, wobei eine Methanol-Wasser-Mischung als Elutionsmittel verwendet wurde (Ausbeute: 70%).
  • BEISPIEL 11b
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 326 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 50%).
  • BEISPIEL 11c
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 336 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 11d
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 357 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2-NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 11e
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonattrifluoracetat (XIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 11f
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonattrifluoracetat (XIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 35%).
  • BEISPIEL 11g
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 70%).
  • BEISPIEL 12a
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIa)
  • 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (von Mujumdar et al., Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 105-11) wurden in einem 25 ml-Rundkolben in 1,8 ml Essigsäure aufgelöst. 845 mg (6,4 mmol) 1,3,3-Trimethoxypropen wurden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. 10 ml Diethylether wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde weitere 15 Minuten lang gerührt und in einem Eisbad gekühlt. Der Überstand wurde abgegossen, und der Rückstand wurde unter Argon in einer kleinen Menge Essigsäure/Methanol (50/50) aufgelöst. Kalter Ether wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, bis sich ein gelbes Präzipitat bildete. Dieses Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge von kaltem Ether gewaschen.
  • 241 mg (0,50 mmol) des Präzipitats wurden in 10 ml Methanol aufgelöst, woraufhin 216 mg (0,50 mmol) des in Beispiel 9a hergestellten 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliums (0,50 mmol) und 120 mg (1,22 mmol) Kaliumacetat hinzugefügt wurden. Sofort bildete sich eine blaue Farbe. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit Ethylether verdünnt. Ein dunkelblauer Feststoff schied sich ab. Das Präzipitat wurde gesammelt und in 1 M Salzsäure aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde bis zur Trockenheit rotoevaporiert. Salzsäurespuren wurden entfernt, indem der Rückstand unter Vakuum in Gegenwart von festem KOH getrocknet wurde. Eine Reinigung durch Michel-Miller-Chromatographie über Lichroprep RP18 (25-40 Mikrometer, Merck, mit Methanol/Wasser 60:40 als Elutionsmittel) erbrachte 345 mg (77%, berechnet hinsichtlich des Dikaliumsalzes) Zwischenproduktfarbstoff (XII-a-Cl). Das Chloratom im Cyclohexenring wurde entfernt, indem das Produkt über Nacht in einem geringen Volumen einer Lösung von Natriumethanthiolat in N,N-Dimethylformamid gerührt wurde. Die Titelverbindung wurde durch Etherpräzipitation in einer im Wesentlichen quantitativen Ausbeute isoliert.
  • BEISPIEL 12b
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 223 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 55%).
  • BEISPIEL 12c
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 230 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 67%).
  • BEISPIEL 12d
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 244 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 12e
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonattrifluoracetat (XIIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 280 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 12f
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonattrifluoracetat (XIIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 282 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 48%).
  • BEISPIEL 12g
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (IIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 237 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 80%).
  • BEISPIEL 13a
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIa)
  • 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (von Mujumdar et al., Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 105-11) wurden in einem 25 ml-Rundkolben in 1,8 ml Essigsäure aufgelöst. 298 mg (0,83 mmol) 5-Phenylamino-2,4-trimethylen-2,4-pentadienylidenphenylammoniumchlorid wurden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. 10 ml Diethylether wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde weitere 15 Minuten lang gerührt und in einem Eisbad gekühlt. Der Überstand wurde abgegossen, und der Rückstand wurde unter Argon in einer kleinen Menge Essigsäure/Methanol (50/50) aufgelöst. Kalter Ether wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, bis sich ein braunes Präzipitat bildete. Dieses Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge von kaltem Ether gewaschen.
  • 322 mg (0,50 mmol) des Präzipitats wurden in 10 ml Methanol aufgelöst, woraufhin 216 mg (0,50 mmol) des in Beispiel 9a hergestellten 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliums (0,50 mmol) und 120 mg (1,22 mmol) Kaliumacetat hinzugefügt wurden. Sofort bildete sich eine blaue Farbe. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit Ethylether verdünnt. Ein dunkelblauer Feststoff schied sich ab. Das Präzipitat wurde gesammelt und in 1 M Salzsäure aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde bis zur Trockenheit rotoevaporiert. Salzsäurespuren wurden entfernt, indem der Rückstand unter Vakuum in Gegenwart von festem KOH getrocknet wurde. Eine Reinigung durch Michel-Miller-Chromatographie über Lichroprep RP18 (25–40 Mikrometer, Merck, mit Methanol/Wasser 70:30 als Elutionsmittel) erbrachte eine 30%ige Ausbeute von Zwischenproduktfarbstoff (XIII-a-Cl). Das Chloratom im Cyclohexenring wurde entfernt, indem das Produkt über Nacht in einem geringen Volumen einer Lösung von Natriumethanthiolat in N,N-Dimethylformamid gerührt wurde. Die Titelverbindung wurde durch Etherpräzipitation in einer im Wesentlichen quantitativen Ausbeute isoliert.
  • BEISPIEL 13b
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 223 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 25%).
  • BEISPIEL 13c
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 230 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 37%).
  • BEISPIEL 13d
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 244 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 50%).
  • BEISPIEL 13e
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 280 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 35%).
  • BEISPIEL 13f
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 282 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 40%).
  • BEISPIEL 13g
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XIIIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 237 mg (0,5 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 65%).
  • BEISPIEL 14a
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVa)
  • In einem mit einem Rücklaufkondensator ausgestatteten Rundkolben wurde eine Mischung aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (aus der WO 97/13810) und 163 mg (0,83 mmol) N,N'-Diphenylformamidin in 2 ml Essigsäure 3 Stunden lang bis zum Rückfluss erhitzt. Die Essigsäure wurde unter Vakuum abgedampft und das Produkt mit einer Mischung aus Ethylacetat und Wasser trituriert. Das Rohprodukt wurde in einer Mischung aus Acetanhydrid (2 ml) und Pyridin (2 ml) erneut aufgelöst. 352 mg (0.73 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 110°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der Farbstoff durch Zugabe von Ethylether ausgefällt. Das Rohprodukt wurde durch eine Michel-Miller-Chromatographie auf Lichroprep RP18, Partikelgröße 25-40 Mikrometer, gereinigt, wobei eine Methanol-Wasser-Mischung (70/30) als Elutionsmittel verwendet wurde (Ausbeute: 46%).
  • BEISPIEL 14b
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 362 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10b hergestellt. (Ausbeute: 40%).
  • BEISPIEL 14c
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 373 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10c hergestellt. (Ausbeute: 49%).
  • BEISPIEL 14d
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 373 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 34%).
  • BEISPIEL 14e
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 445 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 14f
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 465 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 14g
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIVg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 383 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 47%).
  • BEISPIEL 15a
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVa)
  • 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (aus der WO 97/13810) wurden in einem 25 ml-Rundkolben in 1,8 ml Essigsäure aufgelöst. 845 mg (6,4 mmol) 1,3,3-Trimethoxypropen wurden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. 10 ml Diethylether wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde weitere 15 Minuten lang gerührt und in einem Eisbad gekühlt. Der Überstand wurde abgegossen, und der Rückstand wurde unter Argon in einer kleinen Menge Essigsäure/Methanol (50/50) aufgelöst. Kalter Ether wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, bis sich ein gelbes Präzipitat bildete. Dieses Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge von kaltem Ether gewaschen.
  • 266 mg (0,50 mmol) des Präzipitats wurden in 10 ml Methanol aufgelöst, woraufhin 241 mg (0,50 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums und 120 mg (1,22 mmol) Kaliumacetat hinzugefügt wurden. Sofort bildete sich eine blaue Farbe. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit Ethylether verdünnt. Ein dunkelblauer Feststoff schied sich ab. Das Präzipitat wurde gesammelt und in 1 M Salzsäure aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde bis zur Trockenheit rotoevaporiert. Salzsäurespuren wurden entfernt, indem der Rückstand unter Vakuum in Gegenwart von festem KOH getrocknet wurde. Eine Reinigung durch Michel-Miller-Chromatographie über Lichroprep RP18 (25–40 Mikrometer, Merck, mit Methanol/Wasser 60:40 als Elutionsmittel) erbrachte eine 73%ige Ausbeute der Titelverbindung.
  • BEISPIEL 15b
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 248 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10b hergestellt. (Ausbeute: 67%).
  • BEISPIEL 15c
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(3''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 255 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10c hergestellt. (Ausbeute: 55%).
  • BEISPIEL 15d
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 269 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 47%).
  • BEISPIEL 15e
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 305 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 60%).
  • BEISPIEL 15f
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-5-sulfonat (XVf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 319 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 79%).
  • BEISPIEL 15g
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 262 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 59%).
  • BEISPIEL 16a
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIa)
  • 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H-benz[e]indolium-6-sulfonat (aus der WO 97/13810) wurden in einem 25 ml-Rundkolben in 1,8 ml Essigsäure aufgelöst. 298 mg (0,83 mmol) 5-Phenylamino-2,4-trimethylen-2,4-pentadienylidenphenylammoniumchlorid wurden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. 10 ml Diethylether wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde weitere 15 Minuten lang gerührt und in einem Eisbad gekühlt. Der Überstand wurde abgegossen, und der Rückstand wurde unter Argon in einer kleinen Menge Essigsäure/Methanol (50/50) aufgelöst. Kalter Ether wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, bis sich ein braunes Präzipitat bildete. Dieses Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge von kaltem Ether gewaschen.
  • 322 mg (0,50 mmol) des Präzipitats wurden in 10 ml Methanol aufgelöst, woraufhin 241 mg (0,50 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums und 120 mg (1,22 mmol) Kaliumacetat hinzugefügt wurden. Sofort bildete sich eine blaue Farbe. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und mit Ethylether verdünnt. Ein dunkelblauer Feststoff schied sich ab. Das Präzipitat wurde gesammelt und in 1 M Salzsäure aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde bis zur Trockenheit rotoevaporiert. Salzsäurespuren wurden entfernt, indem der Rückstand unter Vakuum in Gegenwart von festem KOH getrocknet wurde. Eine Reinigung durch Michel-Miller-Chromatographie über Lichroprep RP18 (25–40 Mikrometer, Merck, mit Methanol/Wasser 70:30 als Elutionsmittel) erbrachte eine 30%ige Ausbeute der Titelverbindung.
  • BEISPIEL 16b
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 248 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10b hergestellt. (Ausbeute: 36%).
  • BEISPIEL 16c
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 255 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10c hergestellt. (Ausbeute: 89%).
  • BEISPIEL 16d
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 269 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 41%).
  • BEISPIEL 16e
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 305 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 16f
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 319 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 16g
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 262 mg (0,5 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 70%).
  • BEISPIEL 17a
  • Herstellung von 2-{3'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 316 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9a hergestellt. (Ausbeute: 40%).
  • BEISPIEL 17b
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 326 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 55%).
  • BEISPIEL 17c
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 336 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 37%).
  • BEISPIEL 17d
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 357 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 35%).
  • BEISPIEL 17e
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 38%).
  • BEISPIEL 17f
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 17g
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 78%).
  • BEISPIEL 18a
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 316 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9a hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 18b
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 326 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 53%).
  • BEISPIEL 18c
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 336 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 47%).
  • BEISPIEL 18d
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 357 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 44%).
  • BEISPIEL 18e
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 42%).
  • BEISPIEL 18f
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 34%).
  • BEISPIEL 18g
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XVIIIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 12a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 67%).
  • BEISPIEL 19a
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 316 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9a hergestellt. (Ausbeute: 36%).
  • BEISPIEL 19b
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 326 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9b hergestellt. (Ausbeute: 33%).
  • BEISPIEL 19c
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 336 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9c hergestellt. (Ausbeute: 41 %).
  • BEISPIEL 19d
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 357 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9d hergestellt. (Ausbeute: 22%).
  • BEISPIEL 19e
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9e hergestellt. (Ausbeute: 35%).
  • BEISPIEL 19f
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 9f hergestellt. (Ausbeute: 32%).
  • BEISPIEL 19g
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat (XIXg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 338 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 9g hergestellt. (Ausbeute: 33%).
  • BEISPIEL 20a
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 20b
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10b hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 33%).
  • BEISPIEL 20c
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10c hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 39%).
  • BEISPIEL 20d
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXd)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) und 357 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 43%).
  • BEISPIEL 20e
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 33%).
  • BEISPIEL 20f
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 20g
  • Herstellung von 2-{3'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1'-propen-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 78%).
  • BEISPIEL 21a
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 27%).
  • BEISPIEL 21b
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10b hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 36%).
  • BEISPIEL 21c
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10c hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 39%).
  • BEISPIEL 21d
  • Herstellung von 2-{5'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) und 357 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 48%).
  • BEISPIEL 21e
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 30%).
  • BEISPIEL 21f
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 45%).
  • BEISPIEL 21g
  • Herstellung von 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SOaNH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 11a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 56%).
  • BEISPIEL 22a
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIIa)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10a hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 14%).
  • BEISPIEL 22b
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIIb)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10b hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 25%).
  • BEISPIEL 22c
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIIc)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) des in Beispiel 10c hergestellten 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indoliums hergestellt. (Ausbeute: 23%).
  • BEISPIEL 22d
  • Herstellung von 2-{7'-[3''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIId)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 352 mg (0,73 mmol) und 357 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10d hergestellt. (Ausbeute: 28%).
  • BEISPIEL 22e
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat (XXIIe)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat und 409 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-6-(SO2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium des Beispiels 10e hergestellt. (Ausbeute: 20%).
  • BEISPIEL 22f
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXIIf)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 429 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indoliumtrifluoracetat des Beispiels 10f hergestellt. (Ausbeute: 65%).
  • BEISPIEL 22g
  • Herstellung von 2-{7'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-6''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-1'',1''-dimethyl-(1''H)-benz[e]indol-2''-yliden]-3',5'-(propan-1''',3'''-diyl)-1',3',5'-heptatrien-1'-yl}-3-(δ-sulfonatobutyl)-1,1-dimethyl-(1H)-indolium-6-sulfonat (XXIIg)
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels 13a aus 300 mg (0,73 mmol) 3-(δ-Sulfonatobutyl)-1,1,2-trimethyl-(1H)-benz[e]indolium-6-sulfonat und 346 mg (0,73 mmol) 1-(δ-Sulfonatobutyl)-5-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)-2,3,3-trimethyl-(3H)-indolium des Beispiels 10g hergestellt. (Ausbeute: 53%).
  • BEISPIEL 23
  • Allgemeine Verfahrensweise zur Herstellung von Succinimidylestern der Farbstoffe mit -SO2NH(CH)nCOOH-Linkerarm
  • Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung von Succinimidylestern der Farbstoffe mit einem (N-Carboxyalkyl)sulfamoyl-Linkerarm -SO2NH(CH)nCOOH.
  • 0,5 Mol eines einen -SO2NH(CH)nCOOH-Linkerarm tragenden Cyaninfarbstoffs, hergestellt wie in den Beispielen 11a-d–22a-d gezeigt, 83,9 mg (1,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 100 mg (1,5 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden in 10 ml trockenem Acetonitril aufgelöst. Nachdem sie über Nacht gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung zwecks Entfernung von Dicyclohexylharnstoff filtriert. Acetonitril wurde bei Raumtemperatur abgedampft. Nach Triturierung mit 50 ml Ethylacetat wurde der Rückstand in einer minimalen Menge von trockenem Acetonitril aufgelöst und durch Hinzufügen von Diethylether erneut gefällt.
  • BEISPIEL 24
  • Allgemeine Verfahrensweise zur Herstellung von Phosphoramiditen der Farbstoffe mit -SO2NH(CH2)6OH-Linkerarm
  • Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung von Phosphoramiditen der Farbstoffe mit einem (N-Hydroxyalkyl)sulfamoyl-Linkerarm -SO2NH(CH2)6OH.
  • Ein einen -SO2NH(CH2)6OH-Linkerarm tragender Cyaninfarbstoff (0,5 mmol), hergestellt wie in den Beispielen 11g-22g gezeigt, wurde durch Koevaporation mit trockenem Acetonitril getrocknet, gefolgt von der Auflösung in 30 ml trockenem Acetonitril. Einige Körnchen Tetrazol wurden zur Lösung hinzugefügt, gefolgt vom Phosphitylierungs mittel Bis-(N,N-diisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramidit (232 mg, 0,77 mmol). Die Reaktion wurde durch DSC überwacht. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Kolben über Nacht unter Hochvakuum evakuiert. Der resultierende Feststoff wurde mehrere Male mit trockenem Diethylether trituriert, über Nacht unter Hochvakuum getrocknet und unter Argon bei –20°C gelagert.
  • BEISPIEL 25
  • Markierung eines anti-HCG-Antikörpers mit den Succinimidylester-Farbstoffen des Beispiels 23
  • Die Kupplung der Succinimidylester-Farbstoffe des Beispiels 23 wurde wie folgt durchgeführt:
    Stammlösungen wurden für die Kupplungsreaktionen hergestellt:
    • (1) 5 mg/ml Succinimidylester-Farbstoff des Beispiels 23 in trockenem DMF,
    • (2) 1,0 mg/ml anti-HGH vom Kaninchen (DAKO) in 0,1 M, Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,3.
  • 50 μl Farbstoff wurden zu 1 ml anti-HCG-Stammlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde mit einem Wirbelmischer gründlich vermischt und über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtemperatur in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde daraufhin unter Verwendung eines 150 mM NaCl, 10 mM-Phosphatpuffers, pH 7,0, über Sephadex G-25 chromatographiert. Je nach verwendetem Farbstoff wurde ein Farbstoff-Antikörper-Verhältnis von 5-7 berechnet, und zwar unter Verwendung der folgenden Formel: Farbstoff/IgG = AFarbstoffεIgG/(A278 – c%AFarbstoff)εFarbstoff, wobei AFarbstoff die Konjugatextinktion bei der maximalen Absorption des Farbstoffs ist, εIgG der Extinktionskoeffizient des IgG-Antikörpers bei 278 nm ist, εFarbstoff der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs bei seiner maximalen Absorption ist, A280 die Konjugatextinktion bei 280 nm ist und c% der Prozentsatz an Farbstoffabsorption bei 278 nm, bezogen auf dessen maximale Absorption, ist.
  • BEISPIEL 26
  • Leistung eines Fluoreszenzimmunoassay mit β-HCG-Standards
  • Für die quantitative Bestimmung von β-HCG-Standards wurde ein Sandwichtest durchgeführt. Folgendes wurde in einen Satz silikonisierter Reagenzgläser gegeben: 50 μl β-HCG-Standardlösung (0 mIU/ml; 10 mIU/ml; 25 mIU/ml; 50 mIU/ml; 100 mIU/ml; 200 mIU/ml). Danach 50 μl einer Lösung, enthaltend 3,9 × 10–8 M anti-HCG, markiert wie in Beispiel 25 beschrieben, in einem Verdünnungspuffer pH 7,0 (0,1 M Tris-Puffer, 20% fötales Kälberserum, 0,05 Thimerosal und 0,02% Tween 20). Zusätzliche 150 μl einer Pufferlösung (150 mM Na-Phosphat mit 20 g/l Rinderserumalbumin) werden in jedes Reagenzglas hinzugefügt, und schließlich wird eine 6,5 mm-Styroporkugel, die durch eine Streptavidin-Biotin-Schicht mit Einfang-anti-β-HCG-IgG bedeckt ist, in jedes Reagenzglas hinzugefügt. Die Mischung wird über Nacht bei 37°C mit einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Einfangkugeln werden dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und daraufhin in Reagenzgläser übertragen, die 2 ml von 0,1 M Schwefelsäure enthalten. Nach 30 Minuten wird die Schwefelsäurelösung in Fluoreszenzküvetten pipettiert, und der Farbstoffgehalt wird durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Eine typische Kalibrierkurve ist wie folgt: 0 mIU/ml – 0,050 FI; 10 mIU/ml – 1,56 FI; 25 mIU/ml – 3,54 FI; 50 mIU/ml – 5,01 FI; 100 mIU/ml – 8,93 FI; 200 mIU/ml – 15,99 FI, wobei FI die relative Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten ist.
  • BEISPIEL 27
  • Markierung eines anti-α-Fetoprotein-Antikörpers mit den Succinimidylester-Farbstoffen des Beispiels 23
  • Die Kupplung eines anti-α-Fetoproteins mit den Succinimidylester-Farbstoffen des Beispiels 23 wurde in derselben Art und Weise durchgeführt wie jene des anti-β-HCG, über die in Beispiel 25 berichtet wurde:
    Stammlösungen wurden für die Kupplungsreaktionen hergestellt:
    • (3) 4,0 mg/ml Succinimidylester-Farbstoff des Beispiels 23 in trockenem DMF,
    • (4) 2,0 mg/ml anti-α-Fetoprotein vom Kaninchen (DAKO) in 0,1 M, Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,3.
  • 50 μl Farbstoff wurden zu 1 ml anti-α-Fetoprotein-Stammlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde mit einem Wirbelmischer gründlich vermischt und über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtemperatur in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde daraufhin unter Verwendung eines 150 mM NaCl, 10 mM-Phosphatpuffers, pH 7,0, über Sephadex G-25 chromatographiert. Je nach verwendetem Farbstoff wurde ein Farbstoff-Antikörper-Verhältnis von 3,5–4,5 berechnet, und zwar unter Verwendung der folgenden Formel: Farbstoff/IgG = AFarbstoffεIgG/(A278 – c%AFarbstoff)εFarbstoff, wobei AFarbstoff die Konjugatextinktion bei der maximalen Absorption des Farbstoffs ist, εIgG der Extinktions-koeffizient des IgG-Antikörpers bei 278 nm ist, εFarbstoff der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs bei seiner maximalen Absorption ist, A280 die Konjugatextinktion bei 280 nm ist und c% der Prozentsatz an Farbstoffabsorption bei 278 nm, bezogen auf dessen maximale Absorption, ist.
  • BEISPIEL 28
  • Leistung eines Fluoreszenzimmunoassay mit α-Fetoprotein-Standards
  • Für die quantitative Bestimmung von α-Fetoprotein-Standards wurde ein Sandwichtest durchgeführt. Folgendes wurde in einen Satz silikonisierter Reagenzgläser gegeben: 50 μl α-Fetoprotein-Standardlösung (0 ng/ml; 5 ng/ml; 15 ng/ml; 50 mIU/ml; 100 mIU/ml; 250 ng/ml). Danach 50 μl einer Lösung, enthaltend 5,8 × 10–8 M anti-α-Fetoprotein, markiert wie in Beispiel 27 beschrieben, in einem Verdünnungspuffer pH 7,0 (0,1 M Tris-Puffer, 20% fötales Kälberserum, 0,05 Thimerosal und 0,02% Tween 20). Zusätzliche 150 μl einer Pufferlösung (150 mM Na-Phosphat mit 20 g/l Rinderserumalbumin) werden in jedes Reagenzglas hinzugefügt, und schließlich wird eine 6,5 mm-Styroporkugel, die durch eine Streptavidin-Biotin-Schicht mit Einfang-α-Fetoprotein-IgG bedeckt ist, in jedes Reagenzglas hinzugefügt. Die Mischung wird über Nacht bei 37°C mit einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Einfangkugeln werden dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und daraufhin in Reagenzgläser übertragen, die 2 ml von 0,1 M Schwefelsäure enthalten. Nach 30 Minuten wird die Schwefelsäurelösung in Fluoreszenzküvetten pipettiert, und der Farbstoffgehalt wird durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Eine typische Kalibrierkurve ist wie folgt: 0 ng/ml – 0,71 FI; 5 ng/ml – 0,92 FI; 15 ng/ml – 1,25 FI; 50 ng/ml – 1,97 FI; 100 mIU/ml – 4,01 FI; 250 mIU/ml – 7,56 FI, wobei FI die relative Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten ist.
  • BEISPIEL 29
  • Verfahren zur Markierung von Ribonucleotiden, Desoxyribonucleotiden und Didesoxyribonucleotiden mit den Succinimidylester-Farbstoffen des Beispiels 23
  • 3-Amino-1-propynyl-Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide und Didesoxyribonucleotide (AP-3-Nucleotide) wurden hergestellt wie in der US 5,151,507 beschrieben. In solchen Verbindungen ist der 3-Amino-1-propynyl-Linker an der 5-Position von Pyrimidinen oder an der 7-Position von 7-Desazapurinen angebracht. Die AP-3-Nucleotide wurden zu einer endgültigen Konzentration von 10 mM gelöst.
  • Stammlösungen, die 2 mg/100 μl Succinimidylester-Farbstoffe des Beispiels 23 in wasserfreiem Dimethylsulfoxid enthielten, wurden hergestellt. Zu 0,1 μmol von AP-3- Ribonucleotiden, Desoxyribonucleotiden oder Didesoxyribonucleotiden wurden 30 μl von 0,25 M Carbonatpuffer, pH 9,0, hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 5 μl Succinimidylester-Farbstoffen in Dimethylsulfoxid. Die Mischung wurde mit einem Wirbelmischer rasch vermischt und danach über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtemperatur in einem Schüttelinkubator inkubiert. Farbstoffmarkierte Nucleotide wurden durch Gradienten-RP-HPLC gereinigt (Puffer A: 100 mM Triethylammoniumacetat pH 7,0 in Wasser; Puffer B: 100 mM Triethylammoniumacetat in 70% (v/V) Acetonitril; Durchsatz: 1,0 ml/min), beinahe bis zur Trockenheit abgedampft und in 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, verdünnt.
  • BEISPIEL 30
  • Herstellung eines Theophyllin-Cyanin-Konjugats
  • 515 mg (0,56 mmol) 2-{5'-[1''-(δ-Sulfonatobutyl)-5''-(SO2NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)-3'',3''-dimethyl-(3''H)-indol-2''-yliden]-1',3'-pentadien-1'-yl}-1-(δ-sulfonatobutyl)-3,3-dimethyl-(3H)-indolium-5-sulfonat des Beispiels 12e und 165 mg (0,56 mmol) Theophyllin-8-(3',3'-dimethyl)buttersäure (8-(2',6'-dihydroxy-1',3'-dimethylpurin-8'-yl)-3,3-buttersäure; hergestellt durch Kondensieren von 5,5-Diamino-1,3-dimethyluracilhydrat mit 3,3-Dimethylglutarsäureanhydrid in Pyridin gemäß dem Traube-Verfahren) wurden bei Raumtemperatur in 1 ml trockenem Pyridin aufgelöst. 116 mg (0,56 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 64 mg (0,56 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden zur Lösung hinzugefügt. Das Rühren bei Raumtemperatur wurde über Nacht fortgesetzt. Präzipitierter Dicycloharnstoff wurde durch Filtration entfernt, und das Pyridin wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in der kleinstmöglichen Menge einer 50:50-Wasser-Methanol-Mischung aufgelöst und durch RP-HPLC-Chromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Wasser/Methanol 50:50).

Claims (13)

  1. Fluoreszierende Verbindung der Formel:
    Figure 00510001
    wobei: X1, X2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -C(CH3)2 oder -C=CH2; Y1, Y2 Nichtmetallatome sind, die zur Bildung eines Benzo-kondensierten oder Naphtho-kondensierten Rings erforderlich sind; Q eine Polymethinkette mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00510002
    wobei R6 H, ein Halogenatom oder die Gruppe SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ und i 0 oder 1 ist; R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C4, Alkyl, Alkylensulfongruppe oder Alkylensulfonatgruppe, wobei die Alkylengruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt; R3, R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, einer Sulfongruppe, einer Sulfonatgruppe, Alkylensulfon, Alkylensulfonat und -SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ, wobei Alkylen 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt, mit der Maßgabe, dass zumindest eines von R1 bis R5 eine Sulfon- oder Sulfonatgruppe enthält; W fehlt oder eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus -SO2NH-, -O-, -COO- oder -CONH-; n = 0-12 und m = 0-12, mit der Maßgabe, dass m+n ≤ 12 und zumindest eines von m und n ≠ 0; und Z eine N-, O- oder S-Nucleophilfunktionalität ist oder eine Funktionalität, die in der Lage ist, mit N-, O- oder S-Nucleophilen zu reagieren.
  2. Fluoreszierende Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Z eine Nucleophilfunktionalität ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -NH2, -OH und -SH.
  3. Fluoreszierende Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Z eine Funktionalität ist, die in der Lage ist, mit N-, O-, S-Nucleophilen zu reagieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -COCl, -COOCOR, -CONHNH2, N-Hydroxysuccinimidestern, -NCS, -CHO, -CHOCH2I, Phosphoramidit und Maleimido; R ein C1-C4-Alkyl ist.
  4. Fluoreszierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest zwei der Gruppen R1 bis R5 eine Sulfonsäure oder eine Sulfonatgruppe enthalten.
  5. Fluoreszierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R3, R4, R5 alle eine Gruppe der Formel -SO2NH(CH2)m – W – (CH2)nZ sind.
  6. Fluoreszierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sowohl X1 als auch X2 -C(CH3)2 ist.
  7. Fluoreszierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit der Formel 2a bis 2n:
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
  8. Nucleinsäuresonde, die mit einer fluoreszierenden Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 markiert ist.
  9. Immunologisch bindendes Reagens, das mit einer fluoreszierenden Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 markiert ist.
  10. Nucleotid, das mit einer fluoreszierenden Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 markiert ist.
  11. Nucleosid, das mit einer fluoreszierenden Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 markiert ist.
  12. Prüfung zum Ermitteln des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer Probe, umfassend das Kontaktieren einer Nucleinsäuresonde oder eines immunologisch bindenden Reagens, die bzw. das mit einer fluoreszierenden Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 markiert ist, mit einem Analyten unter für eine Bindung geeigneten Bedingungen, wobei die Bindung für das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe repräsentativ ist, und das Bestimmen des Ausmaßes der Bindung durch Messen der Fluoreszenz der gebundenen Nucleinsäuresonde oder des gebundenen immunologisch bindenden Reagens, die bzw. das mit der fluoreszierenden Verbindung markiert ist.
  13. Kit für eine Prüfung gemäß Anspruch 12, umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und eine Nucleinsäuresonde oder ein immunologisch bindendes Reagens.
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