DE69912806T2

DE69912806T2 - Vorrichtung zur schnellen messung der aktivität von enzymen

Info

Publication number: DE69912806T2
Application number: DE69912806T
Authority: DE
Inventors: Neil Stockport ROBERTS; Janet Stockport MOORES
Original assignee: Aventis Animal Nutrition SA
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2019-08-17
Also published as: ID28921A; EP1105456B1; FR2782523B1; EA002734B1; CA2341581A1; JP4531258B2; US6821722B1; SA00200919B1; ATE254169T1; KR20010072751A; EA200100247A1; EP1105456A1; FR2782523A1; CN1181182C; DE69912806D1; BR9914294B1; ES2209474T3; MXPA01001628A; DK1105456T3; BR9914294A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur schnellen Messung einer enzymatischen Aktivität in einem festen Nahrungsmittel, die (i) ein Behältnis, das dazu bestimmt ist, die zu testende Probe zu enthalten, (ii) ein Reagenz, das für das Enzym geeignet ist, dessen Aktivität zu messen ist, und (iii) einen Puffer, der das In-Lösung-Bringen des Enzymes ermöglicht, aufweist.
Das Nahrungsmittel ist vorzugsweise ein festes und vor der Messung unbehandeltes Nahrungsmittel.
Zu für Zuchttiere bestimmten Nahrungsmitteln werden üblicherweise Enzyme hinzugegeben, deren Funktion hauptsächlich in einer Verbesserung der Verdaubarkeit der Nahrungsmittelration liegt. Diese Enzyme werden meistens in flüssiger Form auf die Nahrungsmittel gesprüht, wie dies insbesondere in dem Patent EP 0789291 beschrieben ist. Die Enzyme können außerdem in Form von Pulver in das Nahrungsmittel gegeben werden.
Dabei ergeben sich zwei Probleme, das erste besteht darin, die gleichmäßige Verteilung der zu dem Nahrungsmittel hinzugegebenen Enzyme zu verifizieren, das zweite besteht darin, schnell und einfach die Aktivität des oder der zu dem Nahrungsmittel hinzugegebenen Enzyme zu bestimmen. Diese Probleme werden insbesondere von Nahrungsmittelherstellern und Züchtern zur Sprache gebracht, die die Qualität der Nahrungsmittel prüfen möchten, die sie ihren Tieren verabreichen wollen. Bis heute konnte die enzymatische Aktivität im Labor gemessen werden, was Erfordernisse in Bezug auf Logistik und Termine bedingte, wobei diese Erfordernisse hinderlich waren, sofern ein unmittelbares Ergebnis benötigt wurde. Von den Messungen, die durchgeführt werden können, beschreibt das Dokument: US-A-4,277,561 eine Vorrichtung und ein Verfahren, um in einem biologischen Extrakt die enzymatische Aktivität zu messen. Die Vorrichtung weist einen Träger auf, der aus einem faserigen Material gefertigt ist, das über ein pH-stabilisierendes Verfahren mit einem enzymatischen Substrat vollgesaugt war. Die enzymatische Aktivität des Extraktes wird durch ein colorimetrisches Verfahren gemessen, bei dem der Extrakt auf den Träger gegeben und mit einem Reagenz reagieren gelassen wird, das ein in einem Puffer gelöstes Chromophor enthält. Diese Art von Vorrichtung ist nicht an die Messung einer enzymatischen Aktivität ausgehend von einer festen Probe angepasst.
Die vorliegende Erfindung begegnet diesem Problem, indem eine Vorrichtung zur Messung der enzymatischen Aktivität irgendeines enzymangereicherten Nahrungsmittels vorgeschlagen wird, das als Tiernahrung vorgesehen ist. Diese Vorrichtung, deren Messung auf einer colorimetrischen Reaktion basiert, ermöglicht sowohl eine qualitative Messung der enzymatischen Aktivität der getesteten Probe, als auch eine semiquantitative Messung dieser Probe.
1 zeigt ein Mittel zur Umsetzung der Erfindung in Form einer Vorrichtung zur Messung der enzymatischen Aktivität, die sich in Form einer Säule darstellt.
Die nachfolgende Beschreibung lässt sich unter Bezug auf die oben erwähnte Figur lesen.
Die Vorrichtung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, weist ein Behältnis auf, das dazu bestimmt ist, die zu testende Probe zu enthalten, ein Reagenz, das für das Enzym geeignet ist, dessen Aktivität zu messen ist, und einen Puffer, der das In-Lösung-Bringen des Enzyms ermöglicht.
Das Behältnis dieser Vorrichtung kann, wobei dies nicht einschränkend ist, eine Säule (1) sein, die aus einem unteren engen mit einer Skalierung versehenen Teil (11) und aus einem weiten oberen Teil unter Ausbildung eines Trichters (12) zusammengesetzt ist, wodurch das Einbringen von verschiedenen Reagenzien in die Säule sowie deren Mischung bei Bewegung erleichtert wird. Die Säule ist mit einem System zum Öffnen und dichten Verschließen (13) versehen, wie mit einem Verschluss, der mit dem Säulenkörper über eine Feder (131) verbunden ist.
Das Behältnis kann außerdem aus einem Röhrchen zur einmaligen Verwendung (2) gebildet sein.
Das Behältnis kann aus synthetischem Material, wie einem Kunststoff, zur einmaligen Verwendung sein.
Vorzugsweise weist das Behältnis an seiner Basis eine schneidbare Ausstülpung auf, die den Abfluss des flüssigen Teils von dessen Inhalt ermöglicht. Die Ausstülpung wird vorteilhafterweise von einer Verengung (141) überragt, die feste Nahrungsmittelstücke zurückhält.
Die Messung der enzymatischen Aktivität basiert auf der Färbereaktion des Azo-Verfahrens. Das Prinzip der Färbereaktion des Azo-Verfahrens beruht auf der enzymatischen Hydrolyse eines charakteristischen Substrates eines Enzyms, das an ein Chromophor gebunden ist. Die Reaktion bringt lösliche Oligomere hervor, die das Medium blau färben. Die Absorption des Mediums kann bei 590 nm gemessen werden.
Das in der Vorrichtung verwendete Reagenz ist das Substrat der Reaktion, die durch das Enzym katalysiert wird, das an ein Chromophor gebunden ist. Folglich setzt die enzymatische Hydrolysereaktion das chromophore Substrat frei.
Die Vorrichtung weist gleichermaßen ein Puffer auf, der das In-Lösung-Bringen der Enzyme, die auf das Nahrungsmittel gesprüht werden, sowie das Halten der Enzyme in ihrem pH-Optimum, ermöglicht.
Es kann, beispielhaft und ohne einschränkend zu sein, die Vorrichtung zum Nachweis der Aktivität von Xylanasen genannt werden.
Zur Messung der Aktivität von Xylanasen wird als Reagenz „Oat spelt Xylan Remazol Brillant Blue R" oder „Xylazyme AX" verwendet (vertrieben von der Firma Megazyme und bestehend aus Araboxylan aus Hafer oder Weizen, gebunden an einen Farbstoff).
Der verwendete Puffer ist ausgewählt aus den Essigsäure/Natriumacetat-; Glycin-Chlorhydrat/Glycin-; Aconitsäure/Natriumhydroxyd-; Ameisensäure/Natriumformiatpuffern.
Es kann ferner die Vorrichtung zum Nachweis der Aktivität von β-Glucanasen genannt werden, die gleichermaßen auf der Färbereaktion des Azo-Verfahrens beruht.
Von den verwendbaren Substraten kann 1,3 : 1,4-β-D-Glucan mit Remazol Brillant Blue R und Beta-Glucazym genannt werden, die von der Firma Megazyme vertrieben werden und aus Betaglucan, das an Azurin gebunden ist, bestehen.
Der verwendete Puffer ist ausgewählt aus den Essigsäure/Natriumacetat-; Glycin-Chlorhydrat/Glycin-; Aconitsäure/Natriumhydroxyd-; Ameisensäure/Natriumformiatpuffern.
Um die Aktivität der Cellulase zu messen, besteht das verwendete Substrat aus Cellazymtabletten (vermarktet von der Firma Megazyme). Diese Tabletten bestehen aus Substraten auf der Basis von Cellulose und/oder Cellulose und Xyloglucanen, die mit einem Azurinfarbstoff polymerisiert wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Reagenz in fester Form vor.
Vorteilhafterweise kann, um das In-Lösung-Bringen des Enzyms zu erleichtern, dem Substrat, das das chromophore Agens enthält, ein oberflächenaktiver Stoff hinzugegeben werden. Dieser oberflächenaktive Stoff ist insbesondere ausgewählt aus Natriumlaurylsulfat oder Natriumdodecylsulfat.
Gemäß eines besseren Mittels zur Umsetzung der Erfindung erfolgt die Messung in vier Schritten:

– Einbringen von 10 ml einer Probe, deren enzymatische Aktivität zu messen ist, in das Behältnis (1), wobei bei einer festen Probe mit dem Feststoff bis zur Skalierung 10 ml aufzufüllen ist;
– Einbringen des Reagenz in Form einer festen Kugel;
– Einbringen eines spezifischen Puffers bis zur Skalierung 20 ml;
– nach dem Verschließen der Säule mit dem Verschluss wird die Säule mehrfach wiederholend kräftig geschüttelt;

Es kann ggf. ein zusätzlicher Schritt zur Trennung der flüssigen Phase von der festen Phase (durch Zentrifugation oder Filtration) vorgesehen werden, um die flüssige Phase zurückzugewinnen und die Intensität der Färbung durch Spektrophotometrie oder durch einfachen Vergleich mit einer farbigen Skala zu messen.
Das Erscheinen einer blauen Färbung nach einer Reaktionszeit von 4 bis 8 Stunden bestätigt das Vorhandensein von aktiven Enzymen, wobei die Intensität der Färbung proportional zur Aktivität der in der Probe vorhandenen Enyzme ist.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass eine semiquantitative Messung der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden kann. Die gefärbte flüssige Phase der Säule kann durch Einschneiden der schneidbaren Ausstülpung der Säule zurückgewonnen werden. Die Intensität ihrer Färbung kann dann mit einer OD-Eichkurve verglichen werden.
Dieses Messverfahren ist schnell und zusätzlich dazu sehr einfach und die Vorrichtung kann überall verwendet werden, ohne eine spezielle Ausstattung zu erfordern. Beispielsweise kann ein Hersteller oder Züchter bei der Herstellung von Nahrungsmitteln eine Kontrollmessung durchführen.
Die vorliegende Erfindung wird nun vollständiger mittels der nachfolgenden Beispiele beschrieben, die nicht als die Erfindung einschränkend zu betrachten sind.
Beispiele
Es wurden zwei Versuchsreihen auf Rovabio Xylan LC (Mischung aus Xylanase und Betaglucanase aus Penicillium funiculosum) und auf Rovabio Xylanase TRLC (Xylanase von Trichoderma reesei) durchgeführt, deren Xylanaseaktivität bei 350 bis 550 uAXC/ml liegt. Vermutlich führt die Sprühbehandlung der Nahrungsmittel mit der flüssigen Zusammensetzung zu einem Betrag von 70 bis 110 uAXC/kg Nahrungsmittel.
Bei dem verwendeten Puffer handelt es sich um den Acetatpuffer, der ein pH von 4,7 aufrechterhält. Das Besprühen kann auf feinpulvriges oder granuliertes Nahrungsmittel erfolgen.

Claims

Vorrichtung zur Messung von enzymatischer Aktivität einer festen Nahrungsmittelprobe, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Behältnis, das dazu bestimmt ist, die zu testende Probe zu enthalten, ein Reagenz, das für das Enzym geeignet ist, dessen Aktivität zu messen ist, und einen Puffer, der das In-Lösung-bringen des Enzymes ermöglicht, aufweist, und dass das Behältnis eine Säule ist, die aus einem unteren engen mit einer Skalierung versehenen Teil und aus einem breiten oberen Teil unter Ausbildung eines Trichters zusammengesetzt ist, wodurch das Einbringen von verschiedenen Reagenzien in die Säule sowie deren Mischung bei Bewegung erleichtert wird, wobei die Säule mit einem System zum Öffnen und zum dichten Verschließen versehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testende Probe ein festes, vorzugsweise unbehandeltes Nahrungsmittel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis eine mit einer Skalierung versehene Säule zur einmaligen Verwendung ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis an seiner Basis eine schneidbare Ausstülpung aufweist, die den Abfluss des flüssigen Teils von dessen Inhalt ermöglicht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz das an ein Chromophor gebundene Substrat des Enzymes ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz in fester oder flüssiger Form vorliegt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der für die Messung der Enzymaktivität verwendete Puffer ausgewählt ist aus den Essigsäure/Natriumacetat-; Glycin-Chlorhydrat/Glycin-; Aconitsäure/Natriumhydroxyd-; Ameisensäure/Natriumformiat-Puffern.
Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1, um die enzymatische Aktivität quantitativ zu messen, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene Färbung mit. einer Eichkurve verglichen wird.
Verfahren, um die enzymatische Aktivität eines Nahrungsmittels zu messen, dadurch gekennzeichnet, dass 10 ml einer Probe, deren enzymatische Aktivität zu messen ist, und ein Reagenz in Form einer festen Kugel in die Vorrichtung gemäß der Ansprüche 1 bis 5 eingebracht werden; ein spezifischer Puffer bis zur Skalierung 20 ml eingebracht wird; nach Verschließen der Säule mit dem Verschluss die Säule mehrfach wiederholend kräftig geschüttelt wird; die flüssige Phase von der festen Phase getrennt wird, die flüssige Phase zurückgewonnen und die Intensität der Färbung durch den Vergleich mit einer farbigen Skala gemessen werden.