JP4531258B2 - 酵素活性の高速測定装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、
（ｉ）被検サンプルを収容する容器と、
（ｉｉ）活性を測定すべき酵素に適切な試薬と、
（ｉｉｉ）酵素を溶解し得るバッファとから成る固体食物の酵素活性の高速測定装置に関する。
【０００２】
食物は好ましくは固体食物であり、測定に先立って予め処理しない。
【０００３】
飼育動物の食物には一般に酵素が添加されている。酵素の主要な機能は摂取された飼料の消化率を向上させることである。これらの酵素は大抵の場合、特に欧州特許ＥＰ０７８９２９１に記載されているように、液体の形態で食物に噴霧される。また、酵素を粉末の形態で食物に添加してもよい。
【０００４】
このときに２つの問題が存在する。第一の問題は、食物に添加された酵素の均一な分布の確認が必要なことである。第二の問題は、食物に添加された１種または複数の酵素の活性の迅速かつ容易な評価が必要なことである。これらの問題を提起しているのは、特に食物生産業者及び畜産業者である。畜産業者は飼育動物の飼料の品質を確認することを望んでいる。これまでは酵素活性が試験所で測定されていた。このため、サンプルの輸送管理が容易でない、検査に時間がかかる、などの制約がある。このような制約は、速やかな結果が必要な場合には重大な障害となる。
【０００５】
本発明の目的は、酵素で強化した任意の動物飼育用食物の酵素活性を測定する装置を提案することによってこの問題の解決を図ることである。比色反応に基づいて測定を行う本発明装置は、被検サンプルの酵素活性の定性的な測定及び該サンプルのほぼ定量的な測定の双方を果たし得る。
【０００６】
図１は、カラムを有している本発明の酵素活性測定装置の実施態様を示す。
【０００７】
本発明の実施態様を添付図面に基づいて以下に説明する。
【０００８】
本発明装置は、被検サンプルを収容する容器と、活性を測定すべき酵素に適切な試薬と、該酵素を溶解し得るバッファとから成る。
【０００９】
本発明装置の容器は非限定的にカラム（図１）の形態であり、該カラムは、目盛り付きの狭い下方部分（１１）と、漏斗形の広い上方部分（１２）とから成る。上方部分の漏斗形は、種々の試薬のカラム内導入及び撹拌の際の混合を促進する形態である。カラムは更に、舌状小片（１３１）によってカラムのボディに結合される栓のような水密開閉システム（１３）を備えている。
【００１０】
容器はまた、使い捨て管から構成されてもよい（図２）。
【００１１】
容器は、使い捨てプラスチックのような合成材料から製造され得る。
【００１２】
好ましくは容器の底部が、容器の内容物から液体部分を排出し得る分離可能な付属部（１４）を備えている。付属部の上端が固体食物片をせき止める狭窄部（１４１）を備えているのが有利である。
【００１３】
酵素活性の測定は、Ａｚｏ法の呈色反応に基づく。Ａｚｏ法の呈色反応の原理は、発色団に結合した酵素特異的基質の酵素的加水分解に基づく。反応によって可溶性オリゴマーが生成し、該オリゴマーが媒体を青く着色する。媒体の吸光度を５９０ｎｍで測定し得る。
【００１４】
装置に使用される試薬は、発色団に結合した酵素触媒反応の基質である。酵素的加水分解反応によって発色団が基質から遊離する。
【００１５】
装置はまた、食物に噴霧された酵素を溶解し、酵素をその最適ｐＨに維持し得るバッファを含む。
【００１６】
装置の非限定的な代表例としてはキシラナーゼの活性測定装置がある。
【００１７】
キシラナーゼの活性を測定するために使用される試薬は、“Ｏａｔ ｓｐｅｌｔ Ｘｙｌａｎ Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ”または“Ｘｙｌａｚｙｍｅ ＡＸ”（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から販売されており、色素に結合したカラス麦または小麦のアラボキシランから成る）である。
【００１８】
使用されるバッファは、酢酸／酢酸ナトリウムバッファ、塩酸グリシン／グリシンバッファ、アコニット酸／水酸化ナトリウムバッファ、ギ酸／ギ酸ナトリウムバッファから選択される。
【００１９】
また、同じくＡｚｏ法の呈色反応に基づく装置としてβ−グルカナーゼの活性を測定する装置が挙げられる。
【００２０】
使用可能な基質の例は、Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒに結合した１，３：１，４−β−Ｄ−グルカン、及び、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から販売されているＡｚｕｒｉｎｅに結合したベータグルカンから成るＢｅｔａ−Ｇｌｕｃａｚｙｍｅである。
【００２１】
使用されるバッファは、酢酸／酢酸ナトリウムバッファ、塩酸グリシン／グリシンバッファ、アコニット酸／水酸化ナトリウムバッファ、ギ酸／ギ酸ナトリウムバッファから選択される。
【００２２】
セルラーゼの活性を測定するために使用される基質はＣｅｌｌａｚｙｍｅ錠剤（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から市販されている）の形態である。これらの錠剤は、セルロースを基材とする基質またはセルロースとキシログルカンとを基材とする基質に青色の色素が重合したものである。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様において、試薬は固体形態を有している。
【００２４】
酵素の溶解を促進するために、発色剤を含有する基質に界面活性剤を添加するのが有利である。界面活性剤は特に、ラウリル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウムから選択される。
【００２５】
本発明の測定方法の好ましい実施態様は、以下の４つの段階、即ち、
−酵素活性を測定すべき１０ｍｌのサンプルを容器（１）に導入する段階、固体サンプルの場合には１０ｍｌの目盛りまで固体を充填する段階と；
−固体ビーズの形態の試薬を導入する段階と；
−２０ｍｌの目盛りまで特定のバッファを導入する段階と；
−カラムを栓で閉鎖して、カラムを数回繰り返して激しく撹拌する段階と；
から成る。
【００２６】
任意の追加段階として、液相と固相とを（遠心または濾過によって）分離して液相を回収し、分光光度法またはカラーチャートとの単純比較によって色の濃さを測定する段階を付加し得る。
【００２７】
４−８時間の範囲の反応時間後、青色が呈示されると、活性酵素の存在が証明される。色の濃さはサンプル中に存在する酵素の活性に比例する。
【００２８】
本発明の別の利点は、酵素活性のほぼ定量的な測定を実施し得ることである。分離可能な付属部をカラムから切断することによって呈色した液相をカラムから回収し得る。次に、液相の色の濃さをＯＤ標準曲線に比較する。
【００２９】
本発明装置による測定方法は極めて高速なだけでなく極めて簡単であり、また、本発明装置は特別な設備を要せずにいかなる場所でも使用し得る。例えば、食物生産業者または畜産業者が食物の製造直後に管理測定を行うことが可能である。
【００３０】
以下の実施例から本発明がより十分に理解されよう。但し、本発明が実施例の記載に限定されると解釈してはならない。
【００３１】
実施例
３５０−５５０ｕＡＸＣ／ｍｌのキシラナーゼ活性を有しているＲｏｖａｂｉｏキシランＬＣ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍのキシラナーゼとベータグルカナーゼとの混合物）及びＲｏｖａｂｉｏキシラナーゼＴＲＬＣ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのキシラナーゼ）を用いて２つの試験シリーズを実施した。食物１ｋｇあたり７０−１１０ｕＡＸＣになる量で液体組成物を食物に噴霧処理する。
【００３２】
使用したバッファはｐＨを４．７に維持する酢酸塩バッファである。粉末状または顆粒形態の食物に噴霧を行う。
【００３３】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 カラムを有している本発明の酵素活性測定装置の実施態様を示す。
【図２】 使い捨て管から成る容器を示す。
【符号の説明】
１１ 下方部分
１２ 上方部分
１３ 開閉システム
１３１ 舌状小片
１４ 付属部
１４１ 狭窄部
本発明は、
（ｉ）被検サンプルを収容する容器と、
（ｉｉ）活性を測定すべき酵素に適切な試薬と、
（ｉｉｉ）酵素を溶解し得るバッファとから成る固体食物の酵素活性の高速測定装置に関する。
【０００２】
食物は好ましくは固体食物であり、測定に先立って予め処理しない。
【０００３】
飼育動物の食物には一般に酵素が添加されている。酵素の主要な機能は摂取された飼料の消化率を向上させることである。これらの酵素は大抵の場合、特に欧州特許ＥＰ０７８９２９１に記載されているように、液体の形態で食物に噴霧される。また、酵素を粉末の形態で食物に添加してもよい。
【０００４】
このときに２つの問題が存在する。第一の問題は、食物に添加された酵素の均一な分布の確認が必要なことである。第二の問題は、食物に添加された１種または複数の酵素の活性の迅速かつ容易な評価が必要なことである。これらの問題を提起しているのは、特に食物生産業者及び畜産業者である。畜産業者は飼育動物の飼料の品質を確認することを望んでいる。これまでは酵素活性が試験所で測定されていた。このため、サンプルの輸送管理が容易でない、検査に時間がかかる、などの制約がある。このような制約は、速やかな結果が必要な場合には重大な障害となる。
【０００５】
本発明の目的は、酵素で強化した任意の動物飼育用食物の酵素活性を測定する装置を提案することによってこの問題の解決を図ることである。比色反応に基づいて測定を行う本発明装置は、被検サンプルの酵素活性の定性的な測定及び該サンプルのほぼ定量的な測定の双方を果たし得る。
【０００６】
図１は、カラムを有している本発明の酵素活性測定装置の実施態様を示す。
【０００７】
本発明の実施態様を添付図面に基づいて以下に説明する。
【０００８】
本発明装置は、被検サンプルを収容する容器と、活性を測定すべき酵素に適切な試薬と、該酵素を溶解し得るバッファとから成る。
【０００９】
本発明装置の容器は非限定的にカラム（図１）の形態であり、該カラムは、目盛り付きの狭い下方部分（１１）と、漏斗形の広い上方部分（１２）とから成る。上方部分の漏斗形は、種々の試薬のカラム内導入及び撹拌の際の混合を促進する形態である。カラムは更に、舌状小片（１３１）によってカラムのボディに結合される栓のような水密開閉システム（１３）を備えている。
【００１０】
容器はまた、使い捨て管から構成されてもよい（図２）。
【００１１】
容器は、使い捨てプラスチックのような合成材料から製造され得る。
【００１２】
好ましくは容器の底部が、容器の内容物から液体部分を排出し得る分離可能な付属部（１４）を備えている。付属部の上端が固体食物片をせき止める狭窄部（１４１）を備えているのが有利である。
【００１３】
酵素活性の測定は、Ａｚｏ法の呈色反応に基づく。Ａｚｏ法の呈色反応の原理は、発色団に結合した酵素特異的基質の酵素的加水分解に基づく。反応によって可溶性オリゴマーが生成し、該オリゴマーが媒体を青く着色する。媒体の吸光度を５９０ｎｍで測定し得る。
【００１４】
装置に使用される試薬は、発色団に結合した酵素触媒反応の基質である。酵素的加水分解反応によって発色団が基質から遊離する。
【００１５】
装置はまた、食物に噴霧された酵素を溶解し、酵素をその最適ｐＨに維持し得るバッファを含む。
【００１６】
装置の非限定的な代表例としてはキシラナーゼの活性測定装置がある。
【００１７】
キシラナーゼの活性を測定するために使用される試薬は、“Ｏａｔ ｓｐｅｌｔ Ｘｙｌａｎ Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ”または“Ｘｙｌａｚｙｍｅ ＡＸ”（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から販売されており、色素に結合したカラス麦または小麦のアラボキシランから成る）である。
【００１８】
使用されるバッファは、酢酸／酢酸ナトリウムバッファ、塩酸グリシン／グリシンバッファ、アコニット酸／水酸化ナトリウムバッファ、ギ酸／ギ酸ナトリウムバッファから選択される。
【００１９】
また、同じくＡｚｏ法の呈色反応に基づく装置としてβ−グルカナーゼの活性を測定する装置が挙げられる。
【００２０】
使用可能な基質の例は、Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒに結合した１，３：１，４−β−Ｄ−グルカン、及び、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から販売されているＡｚｕｒｉｎｅに結合したベータグルカンから成るＢｅｔａ−Ｇｌｕｃａｚｙｍｅである。
【００２１】
使用されるバッファは、酢酸／酢酸ナトリウムバッファ、塩酸グリシン／グリシンバッファ、アコニット酸／水酸化ナトリウムバッファ、ギ酸／ギ酸ナトリウムバッファから選択される。
【００２２】
セルラーゼの活性を測定するために使用される基質はＣｅｌｌａｚｙｍｅ錠剤（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社から市販されている）の形態である。これらの錠剤は、セルロースを基材とする基質またはセルロースとキシログルカンとを基材とする基質に青色の色素が重合したものである。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様において、試薬は固体形態を有している。
【００２４】
酵素の溶解を促進するために、発色剤を含有する基質に界面活性剤を添加するのが有利である。界面活性剤は特に、ラウリル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウムから選択される。
【００２５】
本発明の測定方法の好ましい実施態様は、以下の４つの段階、即ち、
−酵素活性を測定すべき１０ｍｌのサンプルを容器（１）に導入する段階、固体サンプルの場合には１０ｍｌの目盛りまで固体を充填する段階と；
−固体ビーズの形態の試薬を導入する段階と；
−２０ｍｌの目盛りまで特定のバッファを導入する段階と；
−カラムを栓で閉鎖して、カラムを数回繰り返して激しく撹拌する段階と；
から成る。
【００２６】
任意の追加段階として、液相と固相とを（遠心または濾過によって）分離して液相を回収し、分光光度法またはカラーチャートとの単純比較によって色の濃さを測定する段階を付加し得る。
【００２７】
４−８時間の範囲の反応時間後、青色が呈示されると、活性酵素の存在が証明される。色の濃さはサンプル中に存在する酵素の活性に比例する。
【００２８】
本発明の別の利点は、酵素活性のほぼ定量的な測定を実施し得ることである。分離可能な付属部をカラムから切断することによって呈色した液相をカラムから回収し得る。次に、液相の色の濃さをＯＤ標準曲線に比較する。
【００２９】
本発明装置による測定方法は極めて高速なだけでなく極めて簡単であり、また、本発明装置は特別な設備を要せずにいかなる場所でも使用し得る。例えば、食物生産業者または畜産業者が食物の製造直後に管理測定を行うことが可能である。
【００３０】
以下の実施例から本発明がより十分に理解されよう。但し、本発明が実施例の記載に限定されると解釈してはならない。
【００３１】
実施例
３５０−５５０ｕＡＸＣ／ｍｌのキシラナーゼ活性を有しているＲｏｖａｂｉｏキシランＬＣ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍのキシラナーゼとベータグルカナーゼとの混合物）及びＲｏｖａｂｉｏキシラナーゼＴＲＬＣ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのキシラナーゼ）を用いて２つの試験シリーズを実施した。食物１ｋｇあたり７０−１１０ｕＡＸＣになる量で液体組成物を食物に噴霧処理する。
【００３２】
使用したバッファはｐＨを４．７に維持する酢酸塩バッファである。粉末状または顆粒形態の食物に噴霧を行う。
【００３３】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 カラムを有している本発明の酵素活性測定装置の実施態様を示す。
【図２】 使い捨て管から成る容器を示す。
【符号の説明】
１１ 下方部分
１２ 上方部分
１３ 開閉システム
１３１ 舌状小片
１４ 付属部
１４１ 狭窄部
Claims (9)
- 固体食品サンプルの酵素活性を測定する装置であって、試験サンプルを収容する容器及び測定する活性を有する酵素に特異的な試薬と当該酵素を溶解するためのバッファを含み、当該容器はカラムであり、当該カラムは目盛り付きの狭い下方部分と種々の試薬のカラム内導入及び撹拌の際の混合を促進する漏斗形の広い上方部分とから成り、当該カラムが水密開閉システムを備えていることを特徴とする前記装置。
- 被検サンプルが非処理の固体食物であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
- 使い捨ての目盛り付き管または目盛り付きカラムであることを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
- 前記容器の底部が、前記容器の内容物から液体部分を排出し得る分離可能な付属部を備えていることを特徴とする請求項３に記載の装置。
- 試薬が発色団に結合した酵素基質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
- 前記試薬が固体または液体の形態を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
- 酵素活性の測定に使用されるバッファが、酢酸／酢酸ナトリウムバッファ、塩酸グリシン／グリシンバッファ、アコニット酸／水酸化ナトリウムバッファ、ギ酸／ギ酸ナトリウムバッファから選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
- 呈示された色を標準曲線と比較することを特徴とする、酵素活性を定量的に測定するための請求項１に記載の装置の使用。
- 酵素活性を測定すべき１０ｍｌのサンプルを請求項１から５のいずれか一項に記載の装置に導入し、固体ビーズの形態の試薬を導入し、２０ｍｌの目盛りまで特定のバッファを導入し、カラムを栓で閉鎖した後、カラムを数回激しく撹拌し、液相を固相から分離し、液相を回収し、カラーチャートと比較することによって色の濃さを測定することを特徴とする食物の酵素活性の測定方法。
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