DE2809755A1 - Peroxidasebestimmung - Google Patents

Peroxidasebestimmung

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DE2809755A1
DE2809755A1 DE19782809755 DE2809755A DE2809755A1 DE 2809755 A1 DE2809755 A1 DE 2809755A1 DE 19782809755 DE19782809755 DE 19782809755 DE 2809755 A DE2809755 A DE 2809755A DE 2809755 A1 DE2809755 A1 DE 2809755A1
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F Hoffmann La Roche AG
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Description

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7 fcirz i978
RAN 4093/23
F. HofSnann-La Rochc & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz Peroxidasebestimmung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase, das insbesondere im Zusammenhang mit enzym-immunologischen Tests, in welchen dieses Enzym zur Markierung von Antigenen oder Antikörpern eingesetzt wird, von Bedeutung ist.
Zur enzym-immunologischen Bestimmung von Bestandteilen in physiologischen Flüssigkeiten, in Geweben oder in Zeil- und Gewebsextrakten werden entsprechende Antigene oder Antikörper mit Enzymen markiert. Als Markierungsenzym wurde bisher am meisten die Peroxidase aus Meerrettich eingesetzt. Dieses Enzym ist in hoher Reinheit leicht erhältlich, weist eine hohe spezifische Aktivität auf, ist gegenüber den meisten chemischen Kopplungsreagenzien resistent, besitzt eine gute Lagerstabilität und kann als relativ kleines Proteinmolekül (MG = 4O1OOO) leicht von der ans Antigen oder den Antikörper gebundenen Peroxidase abgetrennt werden.
809837/0814
Hen/6.1.1978
(ο
Zur Aktivitätsbestiinmung der Peroxidase wurden bisher vor allem o-Dianisidin, o-Toluidin, Guajacol und 2,6-Dichlorphenolindophenol eingesetzt. Diese Chromophore sind im allgemeinen schlecht löslich, sodass sie im Test nur in geringen Konzentrationen eingesetzt werden können. Zudem vermögen sie die Peroxidase vor der Inaktivierung durch H3O2 nicht wirksam zu schützen. In verschiedenen Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass während der katalytischen Reaktion laufend Peroxidase mit H3O2 einen stabilen und enzymatisch inaktiven Komplex bildet, sodass immer weniger Peroxidase in aktiver Form vorhanden ist. Dies hat zur Folge, dass nach einer 10-20-minütigen Reaktionsdauer bei einer Inkubationstemperatur von 37°C die Peroxidase vollständig inaktiviert ist. Diese Inaktivierung ist bei enzymimmunologischen Tests besonders nachteilig, da oft Bestandteile in so geringen Konzentrationen zu bestimmen sind, dass zur Erreichung einer genügenden Sensibilität die an Antigen oder Antikörper gebundene Peroxidase bis zu 2 Stunden mit der entsprechenden Substrat-Pufferlösung inkubiert werden muss.
Erfindungsgemäss wurde nun eine Methode entwickelt, welche die obigen Nachteile nicht aufweist. Sie ermöglicht kleinste Mengen an Peroxidase quantitativ zu bestimmen und damit eine für die enzym-immunologischen Tests notwendige Sensibilität zu erreichen.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Peroxidase in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe in einem Puffer zum Einstellen eines pH-Wertes von 3 bis 10,5 mit einem Substrat für die Peroxidase sowie mit einer Mischung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel
809837?08U
worin R Wasserstoff oder Alkalimetall und R,, R2, R-., R. "und R1. Wasserstoff, Brom, Chlor, Nitro, nieder-Alkyl oder eine Carboxylgruppe bedeuten,
und 4-Aminoantipyrin mischt, das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur zwischen 10-6O0C inkubiert und den in der Probe vorhandenen Gehalt an Peroxidase durch Messung der entstandenen Farbintensitätszunähme pro Zeiteinheit bestimmt.
tO Im Rahmen des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens kann die Analysenprobe (z.B. eine physiologische Flüssigkeit oder ein Zellextrakt) direkt auf den Peroxidasegehalt untersucht werden.
Mit Vorzug wird jedoch das erfindungsgemässe Verfahren zur Aktivitätsbestimmung der Peroxidase im Rahmen von enzym-immunologischen Tests eingesetzt, wie sie z.B. in Clin. Chem. 22, 733-738 (1976) oder in Clin. Chem. 22, 1243-1255 (1976) beschrieben sind. In diesem Fall enthält die im enzymatischen Teil des immunologischen Verfahrens untersuchte Probe die Peroxidase in einer an ein immunologisch aktives Material (Antigen oder Antikörper) gebundenen Form.
Der Ausdruck "immunologisch aktives Material" umfasst all jene Bestandteile in physiologischen Flüssigkeiten, Geweben, Zeil- und Gewebeextrakten, für die ein immunologischer Reaktionspartner vorhanden ist oder gebildet werden kann. Dazu gehören primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteide, Sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Enzyme, Hormone, Vitamine, Polysaccharide und Alkaloide.
Besonders bevorzugte immunologisch aktive Materialien sind menschliches Choriongonadotropin, Rheumatoidfaktor, Toxoplasma, Candida, Trypanosoma, CEA-Antigen und Myoglobin. 35
809837/08U
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignet sich ein Puffersystem, mit welchem ein pH-Wert zwischen 3 und 10,5, vorzugsweise zwischen 6 und 9 eingestellt werden kann. Ganz besonders bevorzugt ist ein pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5.
Geeignete Puffersysteme sind z.B. Phosphatpuffer, Tris-Puffer und Boratpuffer. Die Konzentration an Puffer ist nicht kritisch, beträgt jedoch mit Vorzug 50 bis 200 mMol/1.
Als Substrat für die Peroxidase dient H„02· H20„
kann entweder direkt eingesetzt werden oder mit Hilfe von geeigneten Enzymsystemen im Laufe der Reaktion gebildet werden. Solche Enzymsysteme sind z.B. Glucoseoxidase/Glucose oder üricase/ Harnsäure.
Beim direkten Einsatz von H„02 wird eine Konzentration von 0,05 bis 10 mMol/1, vorzugsweise 0,2 bis 1 mMol/1 gewählt.
Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzte Verbindung der allgemeinen Formel I bildet zusammen mit 4-Aminoantipyrin unter Einwirkung von H~0~ und Peroxidase einen Farbstoff, dessen Bildungsgeschwindigkeit der Menge an vorhandener Peroxidase direkt proportional ist und durch Messung der entstandenen Farbintensität unter definierten Testbedingungen bestimmt werden kann.
Geeignete Vertreter der Verbindungen der allgemeinen Formel I sind Phenol, o-Chlorphenol, m-Chlorphenol, p-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,5-Dichlorphenol, 3,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol, o-Nitrophenol, m-Nitrophenol, p-Nitrophenol, o-Cresol, m-Cresol, p-Cresol, 2,4-Dimethylphenol, 2,4-Dinitrophenol und 4-Hydroxybenzoesäure. Besonders bevorzugt ist Phenol.
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' Die Konzentration der Verbindung der Formel I liegt mit Vorteil zwischen 1 und 200 mMol/1, wobei 10 bis 50 inMol/1 besonders bevorzugt sind.
Die Konzentration an 4-Aminoantipyrin beträgt vorzugsweise 0,1-10 mMol/1, wobei 1-3 mMol/1 besonders bevorzugt sind.
Die Reihenfolge der Zugabe der oben erwähnten Reagenzien wird so gewählt, dass zur Vervollständigung des Systems zuletzt entweder die Peroxidase in Form der Probe oder das Substrat für die Peroxidase zugesetzt wird.
Die Reaktionstemperatur ist kritisch. Sie kann gewählt werden zwischen 10 und 60°C, vorzugsweise 25 bis 40 C und muss während der gesamten Reaktionsdauer konstant gehalten werden. Die Inkubationsdauer bei gegebener Reaktionstemperatur ist abhängig vom Peroxidasegehalt in der Probe. Sie liegt bei enzymimmunologisehen Tests zwischen 1 Minute und 4 Stunden, vorzugsweise zwischen 30 und 120 Minuten.
Der in der Probe vorhandene Gehalt an Peroxidase wird durch Messung der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Farbintensität bei definierten Testbedingungen (Konzentration der Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Inkubationsdauer) bestimmt. Man misst eine Extinktionsdifferenz, welche der Zunahme der Farbintensität entspricht und somit der Menge an vorhandener Peroxidase direkt proportional ist.
Die Messung der Farbintensität erfolgt mit Vorteil photometrisch bei einer Wellenlänge zwischen 450-580 nm.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich sowohl für manuelle wie für automatische Bestimmungen der Peroxidase.
Die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Reagenzien werden vorzugsweise in eine Reagenziengarnitur verpackt. Eine für die Zwecke der vorliegenden Er-
809837/0814
findung geeignete Reagenziengarnitur enthält mit Vorteil in mehreren Behältern
a) eine oder mehrere Verbindungen der Formel
OR
worin R Wasserstoff oder Alkalimetall und R,, R„, R-., R. und Rn. Wasserstoff, Brom, Chlor, Nitro, nieder-Alkyl oder eine
Carboxylgruppe bedeuten, und
b) 4-Aminoantipyrin und gegebenenfalls 20
c) einen Puffer zum Einstellen eines pH-Wertes von 3 bis 10,5 und gegebenenfalls
d) ein Substrat für die Peroxidase. 25
Die Reagenziengarnitur kann auch noch zusätzlich einen Behälter mit einer Kontroll- oder Eichlösung und/oder einen Behälter mit einem Reagens zum Abstoppen der Reaktion und/oder Reagenzien zur Durchführung einer immunologischen Bestimmung enthalten.
Es ist jedoch nicht notwendig alle Reagenzien in separaten Behältern aufzubewahren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Reagenziengarnitur, worin einige der zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Bestandteile gemeinsam im gleichen Behälter aufbewahrt werden.
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So kann z.B. die Puffersubstanz zusammen mit 4-Aminoantipyrin in einem einzigen Behälter aufbewahrt werden.
Die verschiedenen Reagenzien können sowohl in flüssiger als auch in fester Form verpackt werden.
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4%
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Eine genau eingewogene Menge Meerrettich-Peroxidase von hohem Reinheitsgrad wird in 0,1 Mol/l Na2HPO.-Puffer gelöst und davon verschiedene Verdünnungen hergestellt. Zur Aktivitätsbestimmung dieser Peroxidaselösungen werden zu 2,0 ml Testlösung (0,1 Möl/1 Phosphatpuffer vom pH 7,25 mit 25 inMol/l Phenol, 2 mMol/1 4-Aminoantipyrin und 0,8 mMol/1 H2O2) 0,05 ml Probe zugemischt und bei 37°C die Extinktionsdifferenz pro 30 Minuten bei der Wellenlänge 492 nm bestimmt.
Peroxidasegehalt in
der Probe		 ΔΕ492 nm/30 Min/37°C
0,2 Mg/ml
0,1 pg/ml
0,05 Mg/ml
0,025 Mg/ml
0,0125 Mg/ml
0,00625 pg/ml
0 ng/ml		 0,940
0,465
0,240
0,115
0,058
0,030
0,002
Mit den vorgegebenen Messwerten wird eine Standardkurve aufgetragen.
Das obige Verfahren wird mit unbekannten Proben wiederholt und die dabei erhaltenen Messwerte zur Bestimmung des Peroxidasegehaltes mit der Peroxidase-Standardkurve verglichen.
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-s-
Beispiel 2
Zur Bestimmung des CEA-Gehalts werden Proben mit Kaninchen-CEA-Antiserum bei Raumtemperatur während 24 Stunden in einem Boratpuffer vom pH 8,4 inkubiert. Anschliessend wird eine bestimmte Menge von Meerrettich-Peroxidase (POD)-markiertem CEA dieser Mischung zugefügt und nochmals bei Raumtemperatur im Dunkeln während 16 Stunden inkubiert.
Dieser Lösung wird nun Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin, das an einen Festkörper gebunden ist, zugesetzt. Nach 30 Minuten wird die feste Phase von der flüssigen Phase abgetrennt und die Peroxidase-Aktivität in der überstehenden Lösung wie . folgt bestimmt:
1,0 ml Testlösung (0,2 mMol/1 Phosphatpuffer vom pH 7,25 mit 50 mMol/1 Phenol, 4 mMol/1 4-Aminoantipyrin und 1,6 mMol/1 H3O2) wird mit 1,0 ml der überstehenden Lösung vermischt. Anschliessend wird bei 37°C die Extinktionsdifferenz pro Zeiteinheit bei 492 nm photometrisch bestimmt.
Der CEA-Gehalt in der Probe wird anhand einer CEA-Standardkurve berechnet, die nach Durchführung des beschriebenen Verfahrens mit Standardlösungen von geeignetem CEA-Gehalt, aufgetragen wurde.
809837/031

Claims (22)

  1. 2803755
    Patentansprüche
    1J Verfahren zur Bestimmung der Peroxidase in einer Probe,
    dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe, in einem Puffer zum Einstellen eines pH-Wertes von 3 bis 10,5, mit einem Substrat für die Peroxidase, sowie mit einer Mischung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel
    OR
    worin R Wasserstoff oder Alkalimetall und R,, R„, R-., R4 und R1- Wasserstoff, Brom, Chlor, Nitro, nieder-Alkyl oder eine Carboxylgruppe bedeuten,
    und 4-Aminoantipyrin mischt, das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur zwischen 10-600C inkubiert und den in der Probe vorhandenen Gehalt an Peroxidase durch Messung der FarbintensitätsZunahme pro Zeiteinheit bestimmt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 eingestellt wird.
  3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Puffer 50 bis 200 mMol/1 ist.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer ein Phosphatpuffer ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für die Peroxidase H9O9 ist.
    B09837/0814
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an H-O,, 0,05 bis 10 mMol/1 ist.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6; dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an H3O3 0,2 bis 1 mMol/1 ist.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Verbindungen der Formel I 1 bis 200 mMol/1 beträgt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Verbindungen der Formel I 10 bis 50 mMol/1 beträgt.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel I Phenol eingesetzt wird.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an 4-Aminoantipyrin 0,1-10 mMol/1 beträgt.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an 4-Aminoantipyrin 1-3 mMol/1 beträgt.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationstemperatur zwischen 25 und 40°C liegt.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Peroxidase an ein immunologisch aktives Material gebunden ist.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material CEA ist.
    809837/08H
  16. 16. Reagenziengarnitur zur Bestimmung von Peroxidase in einer Probe enthaltend in mehreren Behältern
    a) eine oder mehrere Verbindungen der Formel
    OR
    worin R Wasserstoff oder Alkalimetall und R,, R2, R-., R. und R1. Wasserstoff, Brom, Chlor, Nitro, nieder-Alkyl oder eine Carboxylgruppe bedeuten,
    b) 4-Aminoantxpyrin und gegebenenfalls
    c) einen Puffer zum Einstellen eines pH-Wertes von 3 bis 10,5 und gegebenenfalls
    d) ein Substrat für die Peroxidase.
  17. 17. Reagenziengarnxtur nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer Phosphatpuffer ist.
  18. 18. Reagenziengarnxtur nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für die Peroxidase H3O3 ist.
  19. 19. Reagenziengarnxtur nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel I Phenol eingesetzt wird.
    809837/081
  20. 20. Verwendung einer Mischung von einer oder mehreren Verbindungen der Formel
    OR
    worin R Wasserstoff oder Alkalimetall und R,, R„, R-j, R. und R1- Wasserstoff, Brom, Chlor, Nitro, nieder-Alkyl oder eine Carboxylgruppe bedeuten,
    und 4-Aminoantipyrin zur Bestimmung der Peroxidase in einer Probe.
  21. 21. Verwendung einer Mischung nach Anspruch 20 im Zusammenhang mit einer enzym-immunologischen Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe.
  22. 22. Verwendung einer Mischung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material CEA ist.
    809837/08U
DE19782809755 1977-03-09 1978-03-07 Peroxidasebestimmung Pending DE2809755A1 (de)

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