NO780822L

NO780822L - Peroksydasebestemmelse.

Info

Publication number: NO780822L
Application number: NO780822A
Authority: NO
Inventors: Harald Gallati
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-03-09
Filing date: 1978-03-08
Publication date: 1978-09-12
Also published as: IT1095456B; SE7802667L; IL54187A0; DK104578A; DE2809755A1; NL7801413A; IT7820739A0; BE864669A; JPS53110897A; AU3382778A; FR2383441A1; ES467667A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte ved bestemmelse averoksydase som særlig er av betydning i sammenheng med enzym-immunologiske prøver hvor dette enzymet anvendes for markering av antigener eller antistoffer.

For enzym-immunologisk bestemmelse av bestanddeler i fysiologiske væsker, i vev eller i celle- og vevsektrakter markeres tilsvarende antigener eller antistoffer med enzymer.. Som markeringsenzym ble det tidligere mest anvendt peroksydase fra peperrot. Dette enzymet er lett tilgjengelig i høy renhet, har en høy spesifikk aktivitet, er resistent overfor de fleste kjemiske koblingsreagenser, har en god lagringsstabilitet og kan som relativt lite proteinmolekyl (MG = 40 000) lett adskilles fra peroksydase som er bundet til antigenet eller antistoffene.

Til aktivitetsbestemmelse av peroksydase ble tidligere fremfor alt anvendt o-dianisidin, o-tpluidin, guajacol og 2,6-diklorfenolindofenol. Disse kromoforene er generelt dårlig løselige slik at de bare kan anvendes i forsøket i lave konsentrasjoner. Dertil er de ikke i stand til å beskytte peroksydase effektivt mot inaktivering ved H^02.

I forskjellige arbeider ble det påvist at det under den katalytiske reaksjonen danner peroksydase med f^O^et stabilt og en enzymatisk inaktiv kompleks, slik åt stadig mindre peroksydase foreligger i aktiv form. Dette resul-terer i at etter en 10 - 20 minutters reaksjonsperiode er peroksydasen ved en inkubasjonstemperatur på 37°C full-stendig inaktivert. Denne inaktiveringen er særlig uheldig ved enzym-immunologiske forsøk, da bestanddeler ofte skal bestemmes i så lave konsentrasjoner at for å oppnå en tilstrekkelig sensibilitet må peroksydasen som er bundet til antigenet eller antistoffet inkuberes opptil 2 timer med den tilsvarende substrat-pufferløsningen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse ble en ny fremgangsmåte utviklet som ikke har de ovennevnte ulemper. Den muliggjør å bestemme de minste mengder peroksydase kvantitativt og dermed oppnå den nødvendige sensibilitet for de ehzym-immunologiske prøver.

Nærmere definert vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved bestemmelse averoksydase i en prøvekarakterisert vedat man blander prøven i en puffer under innstilling av en pH-verdi fra 3 til 10,5 med et substrat for peroksydase samt med en blanding av en eller flere forbindelse med formelen

hvor R betyr hydrogen eller alkaliraetall og R-^, R2 r ' , R^og R^hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe, og 4-aminoantipyrin, inkuberer den erholdte blanding ved en temperatur mellom 10 - 60°C og bestemmer det i prøven tilstedeværende innhold av peroksydase ved måling av den oppståtte fargeintensitetsøkning pr. tidsenhet.

Innenfor rammen av bestemmelséfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan analyseprøven (f.eks. en fysiologisk-væske eller et celleekstrakt) direkte undersøkes med hensyn til peroksydaseinnhold.

Fortrinnsvis anvendes dog fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til aktivitetsbestemmelse av peroksydase innenfor rammen av enzym-immunologiske forsøk som beskrevet i Clin. Chem. 22, 733-738 (1976) eller i Clin.Chem. 22, 1243-1255

(1976). I dette tilfelle inneholder prøven som undersøkes

i den enzymatiske delen av den immunologiske fremgangsmåten peroksydasen i en form som er bundet til et immunologisk aktivt materiale (antigen eller antistoff).

Uttrykket "immunologisk aktivt materiale" omfatter alle de bestanddeler i fysiologiske væsker, vev, celle- og vevs-ekstrakter, hvor en immunologisk reaksjonspartner er tilstede eller kan dannes. Til disse hører primære aminer, aminosyrer, peptider, . proteiner, lipoproteiner, glykopro-teider, steriner, steroider, lipoider, nukleinsyre, enzymer, hormoner, vitaminer, polysakkarider og alkaloider.

Særlig foretrukne immunologiske aktive materialer er humant choriongonadotropin, rheumatoidfaktor, toksoplasma, candida, trypanosoma, CEA-antigen og myoglobin.

For formålet ved foreliggende oppfinnelse er et puffer-system egnet som kan innstilles på en.pH-verdi mellom 3 og 10,5, fortrinnsvis mellom 6 og 9. Særlig foretrukket er en pH-verdi mellom 6,5 og 7,5.

Egnede puffersystemer er f.eks. fosfatpuffer, trispuffer og boratpuffer. Pufferkonsentrasjonen er ikke kritisk, men er dog foretrukket 50 til 200 mmol pr. 1.

Som substrat for peroksydasen tjener. J^C^• H2°2kan enten anvendes direkte eller kan dannes ved hjelp av egnede enzymsystemer under reaksjonen. Slike enzymsystemer er f.eks. glukoseoksydase/glykose eller urikase/urinsyre.

Ved direkte anvendelse av ^ 2^ 2 velc?es en konsentrasjon

fra 0,05 til 10 mmol pr. 1 fortrinnsvis 0,2 til 1 mmol pr. 1.

Forbindelsen med den generelle formel I som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen danner sammen med 4-aminoantipyrin under innvirkning av'H00-ogeroksydase et fargestoff hvis dannelseshastighet er direkte propors-jonalt med mengden av tilstedeværende peroksydase og kan bestemmes ved måling av den dannede fargeintensitet under definerte forsøksbetingelser.

Egnede eksempler på forbindelsen med den generelle formel I er fenol, o-klorfenol, m-klorfenol, p-klorfenol, 2,4-diklorfenol, 2,5-diklorfenyl, 3,4-diklorfenol, 2,4-dibrom-fenol, o-nitrofenol, m-nitrofenol, p-nitrofenol, o-kresol, m-kresol, p-kresol, 2,4-dimetylfenol, 2,4-dinitrofenol og 4-hydroksybenzosyre-. Særlig foretrukket er fenol.

Konsentrasjonen av forbindelse med formel I ligger med fordel mellom 1 og 200 mmol pr. 1 hvorved 10 til 50 mmol pr.

• 1 er særlig foretrukket.

Konsentrasjonen av 4-aminoantipyrin er fortrinnsvis 0,1 - 10 mmol pr. 1 hvorved 1-3 mmol pr.'1 er særlig foretrukket.

Rekkefølgen av tilsetningen av de ovennevnte reagenser velges slik at for kompletering av systemet tilsettes til slutt enten peroksydasen i form av prøven eller substratet for. peroksydasen.

Reaksjonstemperaturen er kritisk. Den kan velges mellom 10 og 60°C, fortrinnsvis 25° til 40°C og må holdes konstant under hele reaks jonens varighet. Inkubas jonsvarigheten er ved gitt reaksjonstemperatur avhengig av peroksydaseinn-holdet i prøven. Den ligger ved enzymimmunologiske forsøk mellom 1 minutt og 4 timer, fortrinnsvis mellom 30 og 120 minutter.

Innholdet av peroksydase som er tilstede i prøven bestemmes ved måling av fargingsintensiteten som oppstår ved den enzymmatiske reaksjonen under definerte forsøksbetingelser (konsentrasjon av reagensene, pH-verdi, temperatur, varighet av inkubasjon). Man måler ekstinksjonsdifferanse som svarer til økningen i fargeintensitet og dermed er direkte pro-orsjonalt med mengden av tilstedeværende peroksydase.

Målingen av fargeintensiteten skjer med fordel fotometrisk ved en bølgelengde mellom 450 - 580 nm.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen egner seg både for manuell og automatiske bestemmelse av peroksydase.

De nødvendige reagenser for utførelse av fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen pakkes fortrinnsvis i et reagenssett. Et reagenssett som er egnet, for formålet ved foreliggende oppfinnelse inneholder med fordel i flere beholdere

a) eheller flere forbindelser med formel

hvor R.betyr hydrogen eller alkalimetall og R^, R2, R^ ,

R^og R^_ hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe,

og

b) 4-aminoantipyrin og eventuelt

c) en puffer for innstilling av en pH-verdi fra 3 til 10,5

og eventuelt

d) et substrat for peroksydase.

Reaksjonssettet kan også inneholde ytterligere en beholder med en kontroll- eller innstillingsløsning og/eller en beholder med en reagens for avbrytelse av reaksjonen og/ eller reagenser for utførelse av en immunologisk bestemmelse.

Det er dog ikke nødvéndig å oppbevare alle reagenser i

separate beholdere. Den foreliggende oppfinnelse omfatter også et reagenssett hvor enkelte av de nødvendige bestanddeler for utførelse av fremgangsmåten iføl<q>e opfinnelsen oppbevares sammen i. samme beholder.

Således kan f.eks. puffersubstansen oppbevares sammen med 4-aminoantipyrin i en enkelt beholder.

De forskjellige reagenser kan forpakkes såvel i flytende som i fast form.

Oppfinnelsen belyses i det følgende ved eksempler nærmere.

EKSEMPEL 1

En nøyaktig innveiet mengde pepperrot-peroksydase med høye renhetsgrad oppløses i 0,1 mol pr. 1 Na^HPO^-puffer og derav fremstilles forskjellige fortynninger.

For aktivitetsbestemmelse av disse peroksydaseløsningene tilblandes 2,0 ml forsøksløsning (0,1 mol pr. 1 fosfatpuffer med pH 7,2 5 med 2 5 mmol pr. 1 fenol, 2 mmol pr. 1 4-aminoantipyrin og 0,8 mmol pr. 1 t^O^) 0,0 5 ml prøve og med 37 C bestemmes ékstinksjonsdifferansen pr. 30 minutter ved bølgelengde 492 nm.

En standardkurve oppstilles på grunnlag av de ovenfor gitte måleverdier.

Den ovenstående fremgangsmåte gjentas med ukjente prøver

og de derved erholdte måleverdier sammenliknes for bestemmelse av peroksydase-innholdet med peroksydase-standardkurven.

EKSFMPEL 2

For bestemmelse av CEA-innholdet inkuberes prøver med.kanin-CEA-antiserum ved romtemperatur i 2 4 timer i en boratpuffer med pH 8,4. Deretter tilsettes en bestemt mengde pepperrot-peroksydase (POD) markert CEA til denne blandinaen og igjen inkuberes ved romtemperatur i mørke.16 timer.

Denne løsningen tilsettes nå gjeit-anti-kanin-immunglobulin som er bundet til et fast stoff. Etter 30 minutter avskilles den faste fasen fra den flytende fasen og peroksydase-aktivi-teten i den ovenstående løsningen bestemmes som følger:

1,0 ml prøveløsning (0,2 mmol pr. 1 fosfatpuffer med pH

7,25 med 50 mmol pr. 1 fenol, 4 mmol pr. 1 4-aminoantipyrin og 1,6 mmol pr. 1 ^C^) blandes med 1,0 ml av ovenstående løsning. Deretter bestemmes ved 37°C ekstinksjonsdifferansen pr. tidsenhet ved -492 nm fotometrisk.

CEA-innholdet i prøven beregnes ved hjelp av en CEA-standardkurve som ble oppstilt etter utførelse av den beskrevne r fremgangsmåte med standardløsningen av egnet CEA.-innhold.

Claims

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av eroskydase i en prøve, karakterisert ved at man blander prøven i en puffer for innstilling av pH-verdien ' fra 3 til 10,5, med et substrat for peroksydasen samt med en blanding av eller flere forbindelser med formelen

hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og , R^ , R^/ o.g R5 hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe,.og 4-aminoantipyrin, inkuberer den erholdte blanding ved en temperatur mellom 10 - 6 0°C og bestemmer innholdet ' av peroksydase som er tilstede i prøven ved måling av fargeintensitetsøkningen pr. tidsenhet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-veriden inntilles mellom 6,5 og 7,5.

3. Fremgangsmåte iføle ett av kravene 1 og 2, karakterisert ved at pufferkonsentrasjonen er 50 til 2 00 mmol pr. 1.

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at pufferen er en fosfat uffer.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at substratet for peroksydase er H? 02 .

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av 1^0 er ®^ mmol pr. 1.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at konsentrasjonen av R 2® 2 er ^' ^ ^ mmol pr. 1.

8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, karakterisert ved at konsentrasjonen av forbindelsen med formel I er 1 til 200 mmol pr. 1.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at konsentrasjonen av forbindelsen med formel I er 10 til 50 mmol pr. 1.

10. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det som forbindelse med formel I anvendes fenol.

11. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 10, k a r a k- terisert ved at det anvendes en konsentrasjon av 4-aminoantipyrin på 0,1 - 10 mmol pr. 1.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det anvendes en konsentrasjon av 4-aminoantipyrin 1-3 mmol pr. 1.

13. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 12,' karakterisert ved at inkubasjonstempera-turen ligger mellom 25 og 40°C.

14. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at peroksydasen som skal bestemmes er bundet til et immunologisk aktivt materiale.

15 i Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det immunologiske aktive materialet er CEA.

16. Reagenssett ved bestemmelse av peroksydase i en prøve som i flere beholdere inneholdera) en eller flere forbindelser med formelen

hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og R^ , R2 r ? R^ og R^ hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe, b) 4-aminoantipyrin og eventuelt c) en puffer til innstilling av én pH-verdi fra 3 til 10,5 og eventuelt d) et substrat for peroksydasen.

17. Reagenssett ifølge krav 16, karakterisert ved at pufferen er fosfatpuffer.

18. Reagenssett ifølge ett av kravene 16 og 17, karakterisert ved at substratet for peroksydasen er f^O^ .

19. Reagenssett ifølge ett av kravene 16 til 18, karakterisert ved at forbindelsen med formel I er fenol.

20. Amvendelse av en blanding av en eller flere for- bindelser med formel

hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og P.-^, R?, R3 , R^ og R5 hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgrup e, og 4-aminoantipyrin for bestemmelse av eroksydase i en prøve.

21. Anvendelse av en blanding ifølge krav 20 i sammenheng med en enzym-immunologisk bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale i en prøve.

22. Anvendelse av en blanding ifølge krav 21, karakterisert ved at det immunologiske aktive materialet er C. KA .