FI70727C - Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat - Google Patents

Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat Download PDF

Info

Publication number
FI70727C
FI70727C FI801025A FI801025A FI70727C FI 70727 C FI70727 C FI 70727C FI 801025 A FI801025 A FI 801025A FI 801025 A FI801025 A FI 801025A FI 70727 C FI70727 C FI 70727C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
substrate
reagent
determination
buffer
enzyme
Prior art date
Application number
FI801025A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI801025A (fi
FI70727B (fi
Inventor
Peter Scheibe
Erich Bernt
Sigmar Klose
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of FI801025A publication Critical patent/FI801025A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI70727B publication Critical patent/FI70727B/fi
Publication of FI70727C publication Critical patent/FI70727C/fi

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

|ffl r , „ KUULUTUSJULKAISU .
·$ϋΟί! B (11)UTLÄGGN,NGSSKR,FT ',f J^ ^ 7 (•ggj <45) rati'it'ic 'i’ln'cG 10 1300 (51) Kv.ik.*/Int.ci.‘ c 12 Q 1/00 g U Q I _ FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansdkning 801025 (22) Hakemispäivä -- Ansökningsdag 01. 0^.80 (FI) (23) Alkupäivä — Glltlghetsdag 01 . 0*1.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentllg 05 10.80
Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuut.julkaisun pvm. —
Patent- och registerstyrelsen ' 1 Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 26.06.86 (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 0*1.0*4 . 79 Saksan 1i i ttotasavalta-Förbundsrepubl iken Tysk)and(DE) P 2913553-3 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof, Saksen 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Peter Scheibe, Munchen, Erich Bernt, Munchen, Sigmar Klose, Berg,
Saksan 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7**) Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä ja reagenssi entsyymisubstraattien entsymaattiseksi määrittämiseksi - Förfarande och reagens för enzymatisk bestämning av enzym-substrat
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ja reagenssia entsyymi-substraattien entsymaattiseksi määrittämiseksi.
Entsyymisubstraattien, kuten esimerkiksi glukoosin, virtsa-hapon ja kolesterolin entsymaattiset määritykset häiriintyvät usein sen johdosta, että näiden reagenssien sisältämät aineet, esimerkiksi pelkistävät tai hapettavat aineet, reagoivat koejärjestelmän välituotteiden tai lopputuotteiden kanssa. Nämä häiritsevät sivureaktiot voivat tapahtua puhtaasti kemiallisesti tai häiriintyminen voi olla seurauksena entsyymin estymisestä osallistua entsymaattiseen reaktioon kilpailevan substraatin tai senkaltaisen johdosta. Joka tapauksessa pienenee varsinaisen indikaattorituotteen väkevyys, joka mitataan kvantitatiivisissä, erikoisesti fotometrisissä määrityksissä, samoin kuin esimerkiksi myös muodostuneen väriaineen konsentraatio. Menetelmän tarkkuudelle tärkeä suhde osoitettavan substraattiväkevyyden ja mitatun indikaattorituotteen väkevyyden välillä vääristyy täten. Osoitettavan substraatin saanti vaihtelee täten 100 %:sta alkaen. Toisin sanoen saadaan vääriä tuloksia.
2 70727
Esillä olevan keksinnön tehtävänä on poistaa tämä probleemi ja aikaansaada sellainen menetelmä ja sellainen reaqenssi entsyymi-substraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi häiritsevien aineiden läsnäollessa, joilla aikaansaadaan oikea tulos ja vältetään edellä esitetyt vaikeudet.
Keksinnön mukaisesti ratkaistaan tämä tehtävä menetelmän avulla entsyymisubstraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi häiritsevien aineiden läsnäollessa, jotka kykenevät reagoimaan itse substraatin kanssa tai indikaattorireaktion väli- tai lopputuotteen kanssa, jolle on tunnusomaista se, että ennen tutkittavan näytteen lisäystä saatetaan substraatin määrätty määrä reagoimaan ensin reagenssin kanssa siksi, kunnes reaktio on päättynyt ja vasta tämän jälkeen lisätään määritettävä näyte.
Lisäämällä määrätty substraatin määrä, joka alittaa aina huomattavasti analyysijärjestelmän substraattimäärityskapasiteetin, mahdollistetaan esireaktion tapahtuminen siksi, kunnes kaikki lisätty substraatti on kulunut loppuun. Tämän esireaktion aikana myös häiritsevät aineet kuluvat täydellisesti loppuun. Heti kun tämä reaktio on päättynyt, lisätään varsinaisesti tutkittava näyte, joka sisältää tuntemattoman määrän määritettävää substraattia. Määritettävän substraatin määrä saadaan sitten erosta määritettävän reaktiotuotteen esireaktion loppuarvon ja sen loppuar-von välillä, joka saadaan tutkittavan näytteen lisäämisen jälkeen.
On myös mahdollista seurata varsinaista näytteen määritystä kineettisestä, so. ei mitata loppuarvoa vaan ainoastaan reaktionopeus.
Keksinnön mukaisesti lisättävän substraatin määrän suhteen ei voida antaa mitään yleisiä arvoja. Tämä määrä riippuu määritysjär-jestelmän luonteesta ja odotettavissa olevien häiritsevien aineiden määrästä. Yleensä käytetään riittävää substraatin ylimäärää häiritseviin aineisiin verrattuna varmuuden aikaansaamiseksi sen suhteen, ettei ole enää olemassa reagoimattomia häiritseviä aineita silloin kun varsinainen tuntematon näyte lisätään. Toiselta puolen ei lisätä myöskään liian paljon substraattia jottei varsinaiseen näytereaktioon nähden saada liian suurta ja mittausreaktion tarkkuuteen negatiivisesti vaikuttavaa nolla-arvoa. Viimemainitulla on merkitystä esimerkiksi mitattaessa fo-tometrisesti menetelmän tuotteena muodostettua väriainetta. Täi- 70727 3 laisissa reaktiotuotteena saadun väriaineen fotometriseen mittaukseen perustuvissa menetelmissä pidetään lisätty määrätty substraattimäärä niin alhaisena, ettei muodostu väriaineen häiritseviä väkevyyksiä. Tämä voidaan saavuttaa käytännössä aina helposti, koska tällainen väriaine tai indikaattorituote muodostuu vasta sellaista substraattimäärää käytettäessä, joka ylittää häiritsevien aineiden loppureaktioon tarvittavan substraattimää-rän.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä ei ole tarpeellista tuntea häiritsevien vieraiden aineiden laatua. Tällöin ovat kuitenkin usein kysymyksessä pelkistävät aineet, mutta myös hapettavat tai muut häiritsevät aineet voidaan keksinnön mukaisella menetelmällä varmuudella eliminoida.
Keksinnön kohteena on edelleen reagenssi entsyymisubstraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi, joka reagenssi sisältää järjestelmän substraatin määrittämiseksi, jonka muodostaa ainakin yksi entsyymi, ainakin yksi puskuriaine ja ainakin yksi indikaattoriaine, sekä mahdollisesti apuaineet, jolle reagenssille on tunnusomaista se, että se sisältää määrätyn määrän substraattia alimäärin sen järjestelmän substraatin määrityskapasiteettiin nähden, jota käytetään tämän substraatin määrittämiseen.
Kun kuivassa muodossa oleva keksinnön mukainen reagenssi liuotetaan veteen, tapahtuu reaktio häiritsevien aineiden poistamiseksi kokonaan jo liukenemisen aikana ja sen jälkeen. Täten saatu liuos voidaan sitten lisätä suoraan entsyymisubstraatin varsinaiseen määritykseen tai myös muuttaa uudelleen kuivareagenssiksi, jota käytetään myöhempään uudelleenliuottamiseen ennen määritys-reaktion toteuttamista. On kuitenkin myös mahdollista täydentää keksinnön mukaista reagenssia vasta välittömästi ennen sen käyttöä substraatin lisäyksen avulla tai vaihtoehtoisesti lisätä toista reaktion alkamiseen tarpeellista ainetta vasta jälkeenpäin, esimerkiksi entsyymiä, tai kun kysymyksessä on useampivaiheinen reaktio,jossa on useampia entsymaattisia vaiheita, jotakin reaktiossa tarpeellista entsyymiä.
Keksinnön mukaisen reagenssin erään edullisen toteuttamismuodon mukaisesti sisältää se glukoosia substraattina, ja järjestelmä 4 7 0 7 2 7 glukoosisubstraatin määrittämiseksi muodostuu glukoosioksidaasis-ta (GOD) , peroksidaasista (POD) , puskurista ja ABT^ (2,2'-atsi-no-di-/3-etyyli-bentstiatsoliini-sulfcnaatti (6 )_/) värireagenssina.
Tällaista reagenssia käytettäessä lisätään, laskettuna 100 ml kohden substraattimääritys järjestelmän vesipitoista liuosta, noin 750-1500 U, edullisesti 900-1200 U Q0D:ta, jonka spesifinen aktiivisuus on noin 100 U/mg. Vastaava määrä POD:n suhteen, aktiivisuuden ollessa myös noin lOO U/mg, on 10-150 U, edullisesti 80-120 U/100 ml käyttövalmista reagenssiliuosta. Vastaavat ABTS:n väkevyydet ovat 75-150 mg, edullisesti 90-120 mg/ 100 ml. Puskurina tulee kysymykseen sellainen, jonka pH-arvo on 6,5-7,5, edullisesti 6,8-7,2. Väkevyys on tarkoituksenmukaisesti välillä 50 ja 200 mmoolia, edullisesti 80-120 mmoolia/1. Puskurina on edullinen natriumfosfaattipuskuri (Na2HP04/NaH2/ P04). Esimerkkejä muista sopivista puskureista ovat fosfaatti-tris-puskuri, sitruunahappo-tris-puskuri, viinihappo-tris-puskuri ja maleiinihappo-tris-puskuri. Väkevyyden ja pH-arvon suhteen pätee edellä esitetty.
Edellä kuvatulla tavalla muodostetussa reagenssissa on glukoosi-pitoisuus tarkoituksenmukaisesti 0,01-0,05 mg, edullisesti 0,02-0,04 mg/100 ml liuosta.
Eräässä toisessa edullisessa keksinnön mukaisessa reagenssissa glukoosin määrittämiseksi sisältää järjestelmä substraatin määrittämiseksi G0D:n ja P0D:n ohella värinmuodostuskomponentteina 4-amino-fenatsonia (PAP) ja fenolia. Tässä tapauksessa lisätään G0D:tä 100 ml kohden käyttövalmista reagenssiliuosta 3000-5000 U, edullisesti 3800-4200 U/100 ml, PODrtä 50-240 U, edullisesti 160-200 U/100 ml liuosta, sekä 10-20 mg, edullisesti 13-17 mg/ 100 ml PAP, ja 120-240 mg, edullisesti 160-200 mg/100 ml, fenolia. Puskurina on edullista käyttää tässä tapauksessa kaliumfosfaattipuskuria, jolla on edellä mainittu pH-alue.
Väkevyys on tarkoituksenmukaisesti välillä 150 ja 250 mmoolia, edullisesti 180-220 mmoolia/1. Tässä reagenssissa on glukoosi-pitoisuus tarkoituksenmukaisesti 0,05-0,25 mg, edullisesti 0,1-0,2 mg/100 ml liuosta.
Il 70727
Edellä esitetty koskee liuotettua reagenssia. Se koskee myös samalla tavalla 100 ml:n suuruisen liuosmäärän valmistamiseksi tarvittavaa kuivan reagenssin määrää.
Eräs toinen edullinen reagenssi sisältää substraattina virtsahap-poa, ja järjestelmä tämän substraatin määrittämiseksi käsittää uri-kaasia, P0D:tä, värinmuodostusainetta ja puskuria. Värinmuodos-tusaineena käytetään edullisesti seosta, jossa on 2,4-dikloori-fenolaattia ja 4-aminoantipyriiniä.
Tällaisen reagenssin tarkoituksenmukainen toteuttamismuoto sisältää urikaasia 35-45 U, edullisesti 38-42 U/IOO ml käyttövalmista liuosta, jonka aineen spesifinen aktiivisuus on noin 9 U/mg. Sellaisen preparaatin POD-määrä, jonka vahvuus on noin 100 U/mg, on tarkoituksenmukaisesti 30-40 U, edullisesti 33-37 U/lOO ml liuosta. 2,4-dikloorifenolaatin määrä, joka lisätään alkalisuo-lana, ammoniumsuolana tai aminosuolana, edullisesti etyyliammo-niumsuolana, on tarkoituksenmukaisesti välillä 150 ja 200 mg, edullisesti 165-180 mg/100 ml, etyyliammoniumsuolana laskettuna. Tämä määrä vaihtelee luonnollisesti kationin luonteesta riippuen.
4-aminoantipyriiniä lisätään edullisesti 150-250 mg, edullisesti 180-220 mg/100 ml reagenssia.
Puskuriaineen tulee puskuroida alueella 8,5-9,5, edullisesti alueella 8,7-9,3. Väkevyys on edullisesti 100-200 mmoolia, vielä edullisemmin 130-180 mmoolia/1. Edullisesti käytetään tris-sitraatti-puskuria, ja muita hyvin sopivia puskuriaineita ovat tris-viinihappo ja tris-maleiinihappo.
Näitä reagensseja käytettäessä on virtsahappolisäys tarkoituksenmukaisesti välillä noin 0,05 ja 0,25 mg, edullisesti 0,1-0,2 mg/100 ml, litium- tai natriumsuolana laskettuna.
Vielä eräs toinen edullinen keksinnön mukainen reagenssi sisältää kolesterolia substraattina, ja järjestelmän tämän substraatin määrittämiseksi muodostaa kolesteroliesteraasi, kolesterolioksi-daasi, POD ja värinmuodostaja sekä puskuriaine. Värinmuodosta-jaksi soveltuu erikoisesti 4-aminoantipyriinin ja fenolin seos.
6 70727
Erään tarkoituksenmukaisen toteuttamismuodon mukaisesti sisältää tämä reagenssi 15-25 U, edullisesti 17-23 U/100 ml reagenssiliuosta, kolesteroliesteraasia, jonka spesifinen aktiivisuus on noin 20 U/mg, 20-30 U, edullisesti 22-28 U/100 ml, kolestero-lioksidaasia, jonka spesifinen aktiivisuus on noin 25 U/mg, 50-200 U, edullisesti 130-180 U/100 ml liuosta, PODrtä, jonka aktiivisuus on noin 100 U/mg, 15-25 mg, edullisesti 17-23 mg/ 100 ml reagenssiliuosta, 4-aminoantipyriiniä, ja 40-60 mg, edullisesti 45-55 mg/100 ml, fenolia. Puskurina käytetään jotain sopivaa puskuriainetta pH 7-8,5, edullisesti 7,8-8,2, jonka väkevyys on välillä 150 ja 250 mmoolia, edullisesti 180-220 mmoo-lia/1. Erittäin sopiva on kaliumfosfaattipuskuri, mutta sopivia ovat myös muut puskuriaineet, jotka myös kykenevät puskuroimaan esitetyllä alueella. Tällaisen reagenssin kolesterolipitoisuus on tarkoituksenmukaisesti 0,20-0,60 mg, edullisesti 0,30-0,50 mg/100 ml reagenssiliuosta vast, tällaisen reagenssiliuosmäärän valmistukseen käytettyä kuiva-ainemäärää.
On ymmärrettävää, että edellä kuvattuja edullisia keksinnön mukaisia reagenssikoostumuksia varten käytetyt entsyymimäärät koskevat vain sellaisia entsyymejä, joilla on kulloinkin esitetty spesifinen aktiivisuus, ja että ne voidaan korvata muunlaisen aktiivisuuden omaavilla preparaateilla.
Edellä olevan perusteella voidaan todeta, että keksinnön mukaisesti voidaan häiritsevät reaktiot entsyymisubstraattien entsy-maattisessa määrityksessä välttää. Tämä tekee mahdolliseksi käyttää vähemmän puhtaita reagensseja, pidentää reagenssien varastoimiskestävyyttä, joissa syntyy häiritseviä aineita vasta varastoimisen aikana, ja suurentaa määrityksen tarkkuutta.
Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä.
Esimerkki 1
Reagenssi glukoosin määritykseen ABTS-menetelmän mukaisesti.
II
7 70 7 2 7
Natriumfosfaatti-puskuri, pH 7,0 100 mmoolia/1
Glukoosioksidaasi (noin 100 U/mg) 1000 U/100 ml
Peroksidaasi (noin 100 U/mg) 80 U/100 ml ABTS+) 100 mg/100 ml
Glukoosi 0,05 mg/100 ml + * 2,2’-atsino-di-/3-etyyli-bentstiatsoliini-sulfonihappo(6)7-diammoniumsuola.
Esimerkki 2
Reagenssi glukoosin määrittämiseksi GOD-PAP-menetelmällä.
Kaliumfosfaatti-puskuri, pH 7,1 205 mmoolia/1
Glukoosioksidaasi (GOD noin 100 U/mg) 4100 U/100 ml
Peroksidaasi (POD noin 100 U/mg) 190 U/100 ml PAP (4-aminofenatsoni) 17 mg/100 ml
Fenoli 200mg/100 ml
Glukoosi 0,2 mg/100 ml
Esimerkki 3
Reagenssi kolesterolin määrittämiseksi.
Kaliumfosfaatti-puskuri, pH 7,9 200 mmoolia/1
Kolesteroliesteraasi (noin 20 U/mg) 22 U/100 ml
Kolesterolioksidaasi (noin 25 U/mg) 24 U/100 ml
Peroksidaasi (noin 100 U/mg) 150 U/100 ml 4-aminoantipyriini 21 mg/lOO ml
Fenoli 47 mg/lOO ml
Kolesteroli 0,4 mg/100 ml.
Esimerkki 4
Reagenssi virtsahapon määrittämiseksi.
Tris-sitraatti-puskuri, pH 9,1 150 mmoolia/1
Urikaasi (noin 9 U/mg) 39 U/100 ml
Peroksidaasi (noin 100 U/mg) 36 U/100 ml 2,4-dikloorifenolaatti-etyyliammoniumsuola 170 mg/100 ml 4-aminoantipyriini 190 mg/100 ml
Virtsahappo (Li- tai Na-suola) 0,16 mg/100 ml.
8 70727
Esimerkki 5
Vertaileva glukoosimääritys.
Keksinnön mukaisen parantuneen tarkkuuden osoittamiseksi glukoo-simäärityksessä meneteltiin seuraavasti:
Kaksi reagenssiliuosta A ja B valmistettiin liuottamalla esimerkin 1 mukaista reagenssia tarpeellisessa määrässä veteen. Liuoksesta A jätettiin pois glukoosilisäys. Määritystä varten valmistettiin glukoosi-vakiosarja, jonka glukoosipitoisuus kas-voi alueella 50-400 mg/100 ml, sekä lisättiin ihmisseerumia.
Määrityslaitteisto:
Aallonpituus: Hg 436 nm
Malja: 1 cm kerroksen paksuus Inkubointilämpötila: 20-25°C
Mittaus tapahtui nolla-arvoon verrattuna kaupan olevan fotometrin avulla. Maljaan pipetoitiin seuraavat liuokset:
Nolla- arvo Standardi Näyte
Tislattua vettä 0,1 ml
Laimennettua standardi- liuosta - 0,1 ml
Munavalkuaisesta vapautettu näyte - - 0,1 ml
Koereagenssi (A/B) 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml sekoitettiin ja inkuboitiin lämpötilassa 20-25°C. 25-50 minuutin jälkeen mitattiin näytteen ekstinktio (E-^ 3a standardin ekstinktio (E- . , ,.) 0-arvoon verrattuna, standardi
Glukoosiväkevyyden laskeminen näytteessä: c = 100 x yte- /mg/100 ml/ standardi
Mittaustulokset:
Glukoosi-vakio-sarja (50-400 mg/100 ml)
II
70727 9
Glukoosi-väkevyys Ekstinktio reagenssissa
A B
50 mg/100 ml - 0,095 100 mg/100 ml 0,060 0,170 200 mg/100 ml 0,236 0,353 300 mg/100 ml 0,400 0,533 400 mg/100 ml 0,577 0,700
Edellä olevat mittaustulokset on esitetty graafisesti oheenliitetyn piirustuksen kuviossa. Liuoksen A käyrä osoittaa, että koenesteitä, joiden glukoosipitoisuus on alle noin 70 mg/ 100 ml ei mitata, koska mitään ekstinktiota, so. värinkehitystä, ei tapahdu. Käytettäessä tavanomaista yksi-piste-standardia (esimerkiksi 100 mg glukoosia/100 ml) ovat näytteet, joiden glukoosiväkevyys on välillä 70 ja 100 mg/100 ml, liian alhaiset, ja näytteet, joiden glukoosipitoisuus on yli 100 mg/100 ml, liian korkeat verrattuna tosiasialliseen pitoisuuteen. Ainoastaan näyteväkevyydet, jotka vastaavat tarkoin standardien väkevyyttä, antavat oikeita mittausarvoja. Keksinnön mukainen rea-genssi B sitä vastoin antaa kauttaaltaan oikeita arvoja.
Tulokset, jotka saatiin ihmisseeruminäytteillä, suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin vertailun vuoksi määritettiin heksokinaasi-menetelmällä (standardimenetelmä) saadut arvot. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.
HK/G6P-DH Reagenssi Reagenssi (standardimenetelmä) A_ b_
Seerumi 1 53 mg/100 ml ei mittaus- 51 mg/100 ml arvoa
Seerumi 2 84 mg/100 ml 55 mg/100 ml 83,5 mg/100 ml
Seerumi 3 135 mg/100 ml 213 mg/100 ml 135 mg/100 ml

Claims (6)

1. Menetelmä entsyymisubstraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi häiritsevien aineiden läsnäollessa, jotka kykenevät reagoimaan itse substraatin kanssa tai indikaattorireaktion väli-tai lopputuotteen kanssa, tunnettu siitä, että ennen tutkittavan näytteen lisäystä saatetaan substraatin määrätty määrä reagoimaan ensin reagenssin kanssa siksi, kunnes reaktio on päättynyt, ja vasta tämän jälkeen lisätään määritettävä näyte.
1 o 7 0 7 2 7
2. Reagenssi entsyymisubstraatin entsymaattiseksi määrittämiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, joka reagenssi sisältää järjestelmän substraatin määrittämiseksi, jonka muodostaa ainakin yksi entsyymi, ainakin yksi puskurianne ja ainakin yksi indikaattorianne, sekä mahdollisesti apuaineet, tunnettu siitä, että se sisältää määrätyn määrän substraattia alimäärin sen järjestelmän substraatin määrityskapasiteettiin nähden, jota käytetään tämän substraatin määrittämiseen.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää substraattina glukoosia ja järjestelmän substraatin määrittämiseksi muodostaa glukoosioksidaasi, peroksidaasi, 2,2'-atsino-di-/3-etyyli-bentstiatsoliini-sulf o-naatti(6)y ja puskuri.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää substraattina virtsahappoa, ja järjestelmän substraatin määrittämiseksi muodostavat urikaasi, peroksidaasi, 2,4-dikloorifenolaatti, 4-aminoantipyriini ja puskuri.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää kolesterolia substraattina, ja järjestelmän substraatin määrittämiseksi muodostavat kolesterolieste-raasi, kolesterolioksidaasi, peroksidaasi, 4-aminoantipyriini, fenoli ja puskuri.
6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää glukoosia substraattina ja järjestelmän substraatin määrittämiseksi muodostavat glukoosioksidaasi, peroksidaasi, 4-aminofenatsoni, fenoli ja puskuri. Il 11 70727
FI801025A 1979-04-04 1980-04-01 Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat FI70727C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2913553A DE2913553C2 (de) 1979-04-04 1979-04-04 Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten
DE2913553 1979-04-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI801025A FI801025A (fi) 1980-10-05
FI70727B FI70727B (fi) 1986-06-26
FI70727C true FI70727C (fi) 1986-10-06

Family

ID=6067435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI801025A FI70727C (fi) 1979-04-04 1980-04-01 Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4517287A (fi)
EP (1) EP0016947B1 (fi)
JP (1) JPS55135599A (fi)
AT (1) ATE4126T1 (fi)
AU (1) AU515851B2 (fi)
CA (1) CA1152871A (fi)
CS (2) CS228127B2 (fi)
DD (1) DD150256A5 (fi)
DE (2) DE2913553C2 (fi)
FI (1) FI70727C (fi)
HU (1) HU181089B (fi)
YU (1) YU44100B (fi)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56164797A (en) * 1980-05-21 1981-12-17 Toyo Jozo Co Ltd Improved method of determining components in samples
DE3374019D1 (en) * 1982-07-23 1987-11-12 Wako Pure Chem Ind Ltd Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
DE3314308A1 (de) * 1983-04-20 1984-10-25 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung des haemoglobin-haptoglobin komplexes in gegenwart von freiem haemoglobin
DE3509238A1 (de) * 1985-03-14 1986-09-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Stabilisierung der aktivitaet von peroxidase in loesung
US4937186A (en) * 1988-01-28 1990-06-26 Iqbal Siddiqi Method for the determination of bilirubin in solution
US5183743A (en) * 1989-06-12 1993-02-02 Miles Inc. Chromogenic dibenzoxazepinone and dibenzothiazepinone enzyme substrates
GB9113212D0 (en) * 1991-06-19 1991-08-07 Hypoguard Uk Ltd Reagent mixture
US5614010A (en) * 1994-03-14 1997-03-25 Clearwater, Inc. Hydrocarbon gels useful in formation fracturing
AUPM506894A0 (en) * 1994-04-14 1994-05-05 Memtec Limited Novel electrochemical cells
AUPN239395A0 (en) * 1995-04-12 1995-05-11 Memtec Limited Method of defining an electrode area
AUPN363995A0 (en) 1995-06-19 1995-07-13 Memtec Limited Electrochemical cell
US6413410B1 (en) * 1996-06-19 2002-07-02 Lifescan, Inc. Electrochemical cell
AUPN661995A0 (en) * 1995-11-16 1995-12-07 Memtec America Corporation Electrochemical cell 2
US6638415B1 (en) * 1995-11-16 2003-10-28 Lifescan, Inc. Antioxidant sensor
US6521110B1 (en) 1995-11-16 2003-02-18 Lifescan, Inc. Electrochemical cell
US6863801B2 (en) * 1995-11-16 2005-03-08 Lifescan, Inc. Electrochemical cell
US6632349B1 (en) 1996-11-15 2003-10-14 Lifescan, Inc. Hemoglobin sensor
AUPO855897A0 (en) * 1997-08-13 1997-09-04 Usf Filtration And Separations Group Inc. Automatic analysing apparatus II
US6193865B1 (en) 1997-09-11 2001-02-27 Usf Filtration And Separations Group, Inc. Analytic cell
RU2278612C2 (ru) 2000-07-14 2006-06-27 Лайфскен, Инк. Иммуносенсор
US6444115B1 (en) * 2000-07-14 2002-09-03 Lifescan, Inc. Electrochemical method for measuring chemical reaction rates
IL156007A0 (en) 2001-10-10 2003-12-23 Lifescan Inc Electrochemical cell
US20030180814A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Alastair Hodges Direct immunosensor assay
US20060134713A1 (en) * 2002-03-21 2006-06-22 Lifescan, Inc. Biosensor apparatus and methods of use
US8529751B2 (en) * 2006-03-31 2013-09-10 Lifescan, Inc. Systems and methods for discriminating control solution from a physiological sample
US8778168B2 (en) * 2007-09-28 2014-07-15 Lifescan, Inc. Systems and methods of discriminating control solution from a physiological sample
US8097674B2 (en) * 2007-12-31 2012-01-17 Bridgestone Corporation Amino alkoxy-modified silsesquioxanes in silica-filled rubber with low volatile organic chemical evolution
US8603768B2 (en) 2008-01-17 2013-12-10 Lifescan, Inc. System and method for measuring an analyte in a sample
US8551320B2 (en) * 2008-06-09 2013-10-08 Lifescan, Inc. System and method for measuring an analyte in a sample
CN111808921A (zh) * 2020-06-15 2020-10-23 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种基于Trinder反应的检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL137003C (fi) * 1967-10-14
GB1385320A (en) * 1971-09-22 1975-02-26 Nat Res Dev Cholesterol assay
IT986838B (it) * 1972-05-12 1975-01-30 Sclavo Inst Sieroterapeut Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica
US4000042A (en) * 1973-09-06 1976-12-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Diagnostic reagent for the determination of amylase
DE2417230A1 (de) * 1974-04-09 1975-11-06 Lebrecht Von Dr Klitzing Verfahren und anordnung zur enzymatischen bestimmung der konzentration von substraten, insbesondere stoffwechselmetaboliten
BE856461A (nl) * 1977-07-04 1978-01-04 Henau Paul Indicator voor zuurstofoverdracht, preparaat voor het verrichten van enzymatische bepalingen op basis van deze indicator en werkwijze
US4242446A (en) * 1978-07-26 1980-12-30 Coulter Electronics, Inc. Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method
US4241179A (en) * 1978-08-14 1980-12-23 Coulter Electronics, Inc. Method for determining a transaminase in a biological fluid and reagent combination for use in the method

Also Published As

Publication number Publication date
YU44100B (en) 1990-02-28
JPS55135599A (en) 1980-10-22
DD150256A5 (de) 1981-08-19
CS783481A2 (en) 1985-09-17
FI801025A (fi) 1980-10-05
EP0016947B1 (de) 1983-07-13
HU181089B (en) 1983-05-30
DE2913553B1 (de) 1980-10-09
CS244665B2 (en) 1986-08-14
AU515851B2 (en) 1981-05-07
CA1152871A (en) 1983-08-30
YU91780A (en) 1984-04-30
DE3064075D1 (en) 1983-08-18
EP0016947A1 (de) 1980-10-15
AU5677980A (en) 1980-10-09
DE2913553C2 (de) 1981-09-17
US4517287A (en) 1985-05-14
CS228127B2 (en) 1984-05-14
FI70727B (fi) 1986-06-26
ATE4126T1 (de) 1983-07-15
JPS5646800B2 (fi) 1981-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI70727C (fi) Foerfarande och reagens foer enzymatisk bestaemning av enzymsubstrat
KR920001449B1 (ko) 효소적산화에 의한 검체의 비색적 측정방법 및 시약
US4543326A (en) Stabilization of oxidase
FI83975C (fi) Foerfarande och reagens foer specifik bestaemning av hdl-kolesterolhalt i serum.
US4492754A (en) Composition and method for the determination of hydrogen peroxide
FI61916B (fi) Foerfarande och reagens foer bestaemning av alfa-amylas
FI57782C (fi) Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat
Morin et al. Single Glucose Oxidase—Peroxidase reagent for two-minute determination of serum glucose
EP0116307B1 (en) Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase
FI57024B (fi) Foerfarande foer kvantitativ bestaemning av ammoniak i blodet
JPH0698032B2 (ja) クレアチンもしくはクレアチニンの測定法及びこれらの測定用試薬
CN111944872A (zh) 测定肌酐含量的试剂组合、试剂或试剂盒
US4439527A (en) Composition and method for the detection of hydrogen peroxide
US4782016A (en) Analytical element and method for determination of theophylline by enzyme inhibition
US4810642A (en) Method and test composition for determination of hydrogen peroxide
US4778757A (en) Method for the determination of substrates or enzyme activities
US4695539A (en) Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase
US4247633A (en) Reagent for colorimetric determination of creative phosphokinase
US5874229A (en) Method for avoiding influence of hemoglobin
EP0258035B1 (en) Analytical element and method for theophylline determination having increased alkaline phosphatase isoenzyme
JPH07303497A (ja) 生体成分の測定方法および測定用試薬組成物
JPS6123998B2 (fi)
JPS5911197A (ja) 基質または酵素活性の定量方法
JP2001116756A (ja) 液状試薬および保存方法
JPH1084994A (ja) トレハロースの酵素的測定方法およびトレハロース分析用試薬

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH