NO780822L - PEROXYDASE DETERMINATION. - Google Patents

PEROXYDASE DETERMINATION.

Info

Publication number
NO780822L
NO780822L NO780822A NO780822A NO780822L NO 780822 L NO780822 L NO 780822L NO 780822 A NO780822 A NO 780822A NO 780822 A NO780822 A NO 780822A NO 780822 L NO780822 L NO 780822L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
peroxidase
buffer
mmol per
sample
concentration
Prior art date
Application number
NO780822A
Other languages
Norwegian (no)
Inventor
Harald Gallati
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of NO780822L publication Critical patent/NO780822L/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/50—Phenols; Naphthols; Catechols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/90—Developer
    • C12Q2326/96—4-Amino-antipyrine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte ved bestemmelse av<p>eroksydase som særlig er av betydning i sammenheng med enzym-immunologiske prøver hvor dette enzymet anvendes for markering av antigener eller antistoffer. The present invention relates to a new method for determining<p>eroxidase which is particularly important in the context of enzyme-immunological tests where this enzyme is used for marking antigens or antibodies.

For enzym-immunologisk bestemmelse av bestanddeler i fysiologiske væsker, i vev eller i celle- og vevsektrakter markeres tilsvarende antigener eller antistoffer med enzymer.. Som markeringsenzym ble det tidligere mest anvendt peroksydase fra pe<p>perrot. Dette enzymet er lett tilgjengelig i høy renhet, har en høy spesifikk aktivitet, er resistent overfor de fleste kjemiske koblingsreagenser, har en god lagringsstabilitet og kan som relativt lite proteinmolekyl (MG = 40 000) lett adskilles fra peroksydase som er bundet til antigenet eller antistoffene. For enzyme-immunological determination of components in physiological fluids, in tissue or in cell and tissue extracts, corresponding antigens or antibodies are marked with enzymes. As a marking enzyme, peroxidase from pe<p>perrot was formerly most commonly used. This enzyme is readily available in high purity, has a high specific activity, is resistant to most chemical coupling reagents, has a good storage stability and, as a relatively small protein molecule (MG = 40,000), can be easily separated from the peroxidase that is bound to the antigen or antibodies .

Til aktivitetsbestemmelse av peroksydase ble tidligere fremfor alt anvendt o-dianisidin, o-tpluidin, guajacol og 2,6-diklorfenolindofenol. Disse kromoforene er generelt dårlig løselige slik at de bare kan anvendes i forsøket i lave konsentrasjoner. Dertil er de ikke i stand til å beskytte peroksydase effektivt mot inaktivering ved H^02. To determine the activity of peroxidase, o-dianisidine, o-tpluidin, guaiacol and 2,6-dichlorophenolindophenol were previously used above all. These chromophores are generally poorly soluble so that they can only be used in the experiment in low concentrations. In addition, they are unable to protect peroxidase effectively against inactivation by H 2 O 2 .

I forskjellige arbeider ble det påvist at det under den katalytiske reaksjonen danner peroksydase med f^O^et stabilt og en enzymatisk inaktiv kompleks, slik åt stadig mindre peroksydase foreligger i aktiv form. Dette resul-terer i at etter en 10 - 20 minutters reaksjonsperiode er peroksydasen ved en inkubasjonstemperatur på 37°C full-stendig inaktivert. Denne inaktiveringen er særlig uheldig ved enzym-immunologiske forsøk, da bestanddeler ofte skal bestemmes i så lave konsentrasjoner at for å oppnå en tilstrekkelig sensibilitet må peroksydasen som er bundet til antigenet eller antistoffet inkuberes opptil 2 timer med den tilsvarende substrat-pufferløsningen. In various works, it was demonstrated that during the catalytic reaction, peroxidase forms a stable and enzymatically inactive complex with f^O^, so that less and less peroxidase exists in active form. This results in the peroxidase being completely inactivated at an incubation temperature of 37°C after a 10-20 minute reaction period. This inactivation is particularly unfortunate in enzyme-immunological experiments, as components often have to be determined in such low concentrations that in order to achieve sufficient sensitivity, the peroxidase that is bound to the antigen or antibody must be incubated for up to 2 hours with the corresponding substrate buffer solution.

Ifølge foreliggende oppfinnelse ble en ny fremgangsmåte utviklet som ikke har de ovennevnte ulemper. Den muliggjør å bestemme de minste mengder peroksydase kvantitativt og dermed oppnå den nødvendige sensibilitet for de ehzym-immunologiske prøver. According to the present invention, a new method was developed which does not have the above-mentioned disadvantages. It makes it possible to determine the smallest amounts of peroxidase quantitatively and thus achieve the necessary sensitivity for the ezzyme immunological samples.

Nærmere definert vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved bestemmelse av<p>eroksydase i en prøvekarakterisert vedat man blander prøven i en puffer under innstilling av en pH-verdi fra 3 til 10,5 med et substrat for peroksydase samt med en blanding av en eller flere forbindelse med formelen More precisely defined, the present invention relates to a method for determining<p>peroxidase in a sample characterized by mixing the sample in a buffer while setting a pH value from 3 to 10.5 with a substrate for peroxidase and with a mixture of one or more connection with the formula

hvor R betyr hydrogen eller alkaliraetall og R-^, R2 r ' , R^og R^hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe, og 4-aminoantipyrin, inkuberer den erholdte blanding ved en temperatur mellom 10 - 60°C og bestemmer det i prøven tilstedeværende innhold av peroksydase ved måling av den oppståtte fargeintensitetsøkning pr. tidsenhet. where R means hydrogen or alkali group and R-^, R2 r', R^ and R^hydrogen, bromine, chlorine, nitro, lower alkyl or a carboxyl group, and 4-aminoantipyrine, incubate the resulting mixture at a temperature between 10 - 60°C and determines the content of peroxidase present in the sample by measuring the resulting increase in color intensity per unit of time.

Innenfor rammen av bestemmelséfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan analyseprøven (f.eks. en fysiologisk-væske eller et celleekstrakt) direkte undersøkes med hensyn til peroksydaseinnhold. Within the framework of the determination method according to the invention, the analysis sample (e.g. a physiological fluid or a cell extract) can be directly examined with regard to peroxidase content.

Fortrinnsvis anvendes dog fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til aktivitetsbestemmelse av peroksydase innenfor rammen av enzym-immunologiske forsøk som beskrevet i Clin. Chem. 22, 733-738 (1976) eller i Clin.Chem. 22, 1243-1255 Preferably, however, the method according to the invention is used to determine the activity of peroxidase within the framework of enzyme immunological experiments as described in Clin. Chem. 22, 733-738 (1976) or in Clin.Chem. 22, 1243-1255

(1976). I dette tilfelle inneholder prøven som undersøkes (1976). In this case, the sample being examined contains

i den enzymatiske delen av den immunologiske fremgangsmåten peroksydasen i en form som er bundet til et immunologisk aktivt materiale (antigen eller antistoff). in the enzymatic part of the immunological method the peroxidase in a form which is bound to an immunologically active material (antigen or antibody).

Uttrykket "immunologisk aktivt materiale" omfatter alle de bestanddeler i fysiologiske væsker, vev, celle- og vevs-ekstrakter, hvor en immunologisk reaksjonspartner er tilstede eller kan dannes. Til disse hører primære aminer, aminosyrer, peptider, . proteiner, lipoproteiner, glykopro-teider, steriner, steroider, lipoider, nukleinsyre, enzymer, hormoner, vitaminer, polysakkarider og alkaloider. The term "immunologically active material" includes all the components in physiological fluids, tissue, cell and tissue extracts, where an immunological reaction partner is present or can be formed. These include primary amines, amino acids, peptides, . proteins, lipoproteins, glycoproteins, sterols, steroids, lipoids, nucleic acid, enzymes, hormones, vitamins, polysaccharides and alkaloids.

Særlig foretrukne immunologiske aktive materialer er humant choriongonadotropin, rheumatoidfaktor, toksoplasma, candida, trypanosoma, CEA-antigen og myoglobin. Particularly preferred immunologically active materials are human chorionic gonadotropin, rheumatoid factor, toxoplasma, candida, trypanosoma, CEA antigen and myoglobin.

For formålet ved foreliggende oppfinnelse er et puffer-system egnet som kan innstilles på en.pH-verdi mellom 3 og 10,5, fortrinnsvis mellom 6 og 9. Særlig foretrukket er en pH-verdi mellom 6,5 og 7,5. For the purpose of the present invention, a buffer system is suitable which can be set to a pH value between 3 and 10.5, preferably between 6 and 9. A pH value between 6.5 and 7.5 is particularly preferred.

Egnede puffersystemer er f.eks. fosfatpuffer, trispuffer og boratpuffer. Pufferkonsentrasjonen er ikke kritisk, men er dog foretrukket 50 til 200 mmol pr. 1. Suitable buffer systems are e.g. phosphate buffer, tris buffer and borate buffer. The buffer concentration is not critical, but is however preferably 50 to 200 mmol per 1.

Som substrat for peroksydasen tjener. J^C^• H2°2kan enten anvendes direkte eller kan dannes ved hjelp av egnede enzymsystemer under reaksjonen. Slike enzymsystemer er f.eks. glukoseoksydase/glykose eller urikase/urinsyre. As a substrate for the peroxidase serves. J^C^• H2°2 can either be used directly or can be formed with the help of suitable enzyme systems during the reaction. Such enzyme systems are e.g. glucose oxidase/glucose or uricase/uric acid.

Ved direkte anvendelse av ^ 2^ 2 velc?es en konsentrasjonBy direct application of ^ 2^ 2 a concentration is selected

fra 0,05 til 10 mmol pr. 1 fortrinnsvis 0,2 til 1 mmol pr. 1. from 0.05 to 10 mmol per 1 preferably 0.2 to 1 mmol per 1.

Forbindelsen med den generelle formel I som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen danner sammen med 4-aminoantipyrin under innvirkning av'H00-og<p>eroksydase et fargestoff hvis dannelseshastighet er direkte propors-jonalt med mengden av tilstedeværende peroksydase og kan bestemmes ved måling av den dannede fargeintensitet under definerte forsøksbetingelser. The compound with the general formula I which is used in the method according to the invention forms, together with 4-aminoantipyrine under the influence of H00 and<p>peroxidase, a dye whose rate of formation is directly proportional to the amount of peroxidase present and can be determined by measuring the formed color intensity under defined experimental conditions.

Egnede eksempler på forbindelsen med den generelle formel I er fenol, o-klorfenol, m-klorfenol, p-klorfenol, 2,4-diklorfenol, 2,5-diklorfenyl, 3,4-diklorfenol, 2,4-dibrom-fenol, o-nitrofenol, m-nitrofenol, p-nitrofenol, o-kresol, m-kresol, p-kresol, 2,4-dimetylfenol, 2,4-dinitrofenol og 4-hydroksybenzosyre-. Særlig foretrukket er fenol. Suitable examples of the compound of the general formula I are phenol, o-chlorophenol, m-chlorophenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,5-dichlorophenyl, 3,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, o-nitrophenol, m-nitrophenol, p-nitrophenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 2,4-dimethylphenol, 2,4-dinitrophenol and 4-hydroxybenzoic acid-. Particularly preferred is phenol.

Konsentrasjonen av forbindelse med formel I ligger med fordel mellom 1 og 200 mmol pr. 1 hvorved 10 til 50 mmol pr. The concentration of compound of formula I is advantageously between 1 and 200 mmol per 1 whereby 10 to 50 mmol per

• 1 er særlig foretrukket.• 1 is particularly preferred.

Konsentrasjonen av 4-aminoantipyrin er fortrinnsvis 0,1 - 10 mmol pr. 1 hvorved 1-3 mmol pr.'1 er særlig foretrukket. The concentration of 4-aminoantipyrine is preferably 0.1 - 10 mmol per 1 whereby 1-3 mmol per 1 is particularly preferred.

Rekkefølgen av tilsetningen av de ovennevnte reagenser velges slik at for kompletering av systemet tilsettes til slutt enten peroksydasen i form av prøven eller substratet for. peroksydasen. The order of the addition of the above-mentioned reagents is chosen so that to complete the system either the peroxidase in the form of the sample or the substrate is finally added. the peroxidase.

Reaksjonstemperaturen er kritisk. Den kan velges mellom 10 og 60°C, fortrinnsvis 25° til 40°C og må holdes konstant under hele reaks jonens varighet. Inkubas jonsvarigheten er ved gitt reaksjonstemperatur avhengig av peroksydaseinn-holdet i prøven. Den ligger ved enzymimmunologiske forsøk mellom 1 minutt og 4 timer, fortrinnsvis mellom 30 og 120 minutter. The reaction temperature is critical. It can be chosen between 10 and 60°C, preferably 25° to 40°C and must be kept constant throughout the duration of the reaction. At a given reaction temperature, the duration of incubation depends on the peroxidase content in the sample. In enzyme immunological tests, it is between 1 minute and 4 hours, preferably between 30 and 120 minutes.

Innholdet av peroksydase som er tilstede i prøven bestemmes ved måling av fargingsintensiteten som oppstår ved den enzymmatiske reaksjonen under definerte forsøksbetingelser (konsentrasjon av reagensene, pH-verdi, temperatur, varighet av inkubasjon). Man måler ekstinksjonsdifferanse som svarer til økningen i fargeintensitet og dermed er direkte pro-<p>orsjonalt med mengden av tilstedeværende peroksydase. The content of peroxidase present in the sample is determined by measuring the staining intensity that occurs in the enzymatic reaction under defined experimental conditions (concentration of the reagents, pH value, temperature, duration of incubation). An extinction difference is measured which corresponds to the increase in color intensity and is thus directly proportional to the amount of peroxidase present.

Målingen av fargeintensiteten skjer med fordel fotometrisk ved en bølgelengde mellom 450 - 580 nm. The measurement of the color intensity is preferably done photometrically at a wavelength between 450 - 580 nm.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen egner seg både for manuell og automatiske bestemmelse av peroksydase. The method according to the invention is suitable for both manual and automatic determination of peroxidase.

De nødvendige reagenser for utførelse av fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen pakkes fortrinnsvis i et reagenssett. Et reagenssett som er egnet, for formålet ved foreliggende oppfinnelse inneholder med fordel i flere beholdere The necessary reagents for carrying out the method according to the invention are preferably packaged in a reagent set. A reagent set which is suitable for the purpose of the present invention advantageously contains several containers

a) eheller flere forbindelser med formela) or several compounds with formula

hvor R.betyr hydrogen eller alkalimetall og R^, R2, R^ , where R.means hydrogen or alkali metal and R^, R2, R^,

R^og R^_ hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe, R^ and R^_ hydrogen, bromine, chlorine, nitro, lower alkyl or a carboxyl group,

og and

b) 4-aminoantipyrin og eventueltb) 4-aminoantipyrine and optionally

c) en puffer for innstilling av en pH-verdi fra 3 til 10,5 c) a buffer for setting a pH value from 3 to 10.5

og eventueltand eventually

d) et substrat for peroksydase.d) a substrate for peroxidase.

Reaksjonssettet kan også inneholde ytterligere en beholder med en kontroll- eller innstillingsløsning og/eller en beholder med en reagens for avbrytelse av reaksjonen og/ eller reagenser for utførelse av en immunologisk bestemmelse. The reaction set can also contain a further container with a control or setting solution and/or a container with a reagent for interrupting the reaction and/or reagents for carrying out an immunological determination.

Det er dog ikke nødvéndig å oppbevare alle reagenser i However, it is not necessary to store all reagents in

separate beholdere. Den foreliggende oppfinnelse omfatter også et reagenssett hvor enkelte av de nødvendige bestanddeler for utførelse av fremgangsmåten iføl<q>e o<p>pfinnelsen oppbevares sammen i. samme beholder. separate containers. The present invention also includes a reagent set where some of the necessary components for carrying out the method according to the invention are stored together in the same container.

Således kan f.eks. puffersubstansen oppbevares sammen med 4-aminoantipyrin i en enkelt beholder. Thus, e.g. the buffer substance is stored together with 4-aminoantipyrine in a single container.

De forskjellige reagenser kan forpakkes såvel i flytende som i fast form. The various reagents can be packaged both in liquid and solid form.

Oppfinnelsen belyses i det følgende ved eksempler nærmere. The invention is explained in more detail in the following examples.

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

En nøyaktig innveiet mengde pepperrot-peroksydase med høye renhetsgrad oppløses i 0,1 mol pr. 1 Na^HPO^-puffer og derav fremstilles forskjellige fortynninger. An accurately weighed amount of horseradish peroxidase with high degrees of purity is dissolved in 0.1 mol per 1 Na^HPO^-buffer and different dilutions are prepared from it.

For aktivitetsbestemmelse av disse peroksydaseløsningene tilblandes 2,0 ml forsøksløsning (0,1 mol pr. 1 fosfatpuffer med pH 7,2 5 med 2 5 mmol pr. 1 fenol, 2 mmol pr. 1 4-aminoantipyrin og 0,8 mmol pr. 1 t^O^) 0,0 5 ml prøve og med 37 C bestemmes ékstinksjonsdifferansen pr. 30 minutter ved bølgelengde 492 nm. To determine the activity of these peroxidase solutions, 2.0 ml test solution (0.1 mol per 1 phosphate buffer with pH 7.2 5 with 25 mmol per 1 phenol, 2 mmol per 1 4-aminoantipyrine and 0.8 mmol per 1 t^O^) 0.0 5 ml sample and at 37 C the extinction difference per 30 minutes at a wavelength of 492 nm.

En standardkurve oppstilles på grunnlag av de ovenfor gitte måleverdier. A standard curve is drawn up on the basis of the measurement values given above.

Den ovenstående fremgangsmåte gjentas med ukjente prøverThe above procedure is repeated with unknown samples

og de derved erholdte måleverdier sammenliknes for bestemmelse av peroksydase-innholdet med peroksydase-standardkurven. and the measurement values thus obtained are compared to determine the peroxidase content with the peroxidase standard curve.

EKSFMPEL 2EXAMPLE 2

For bestemmelse av CEA-innholdet inkuberes prøver med.kanin-CEA-antiserum ved romtemperatur i 2 4 timer i en boratpuffer med pH 8,4. Deretter tilsettes en bestemt mengde pepperrot-peroksydase (POD) markert CEA til denne blandinaen og igjen inkuberes ved romtemperatur i mørke.16 timer. To determine the CEA content, samples are incubated with rabbit CEA antiserum at room temperature for 24 hours in a borate buffer with pH 8.4. A specific amount of horseradish peroxidase (POD) labeled CEA is then added to this mixture and again incubated at room temperature in the dark for 16 hours.

Denne løsningen tilsettes nå gjeit-anti-kanin-immunglobulin som er bundet til et fast stoff. Etter 30 minutter avskilles den faste fasen fra den flytende fasen og peroksydase-aktivi-teten i den ovenstående løsningen bestemmes som følger: Goat anti-rabbit immunoglobulin, which is bound to a solid, is now added to this solution. After 30 minutes, the solid phase is separated from the liquid phase and the peroxidase activity in the above solution is determined as follows:

1,0 ml prøveløsning (0,2 mmol pr. 1 fosfatpuffer med pH1.0 ml sample solution (0.2 mmol per 1 phosphate buffer with pH

7,25 med 50 mmol pr. 1 fenol, 4 mmol pr. 1 4-aminoantipyrin og 1,6 mmol pr. 1 ^C^) blandes med 1,0 ml av ovenstående løsning. Deretter bestemmes ved 37°C ekstinksjonsdifferansen pr. tidsenhet ved -492 nm fotometrisk. 7.25 with 50 mmol per 1 phenol, 4 mmol per 1 4-aminoantipyrine and 1.6 mmol per 1 ^C^) is mixed with 1.0 ml of the above solution. Then, at 37°C, the extinction difference per time unit at -492 nm photometrically.

CEA-innholdet i prøven beregnes ved hjelp av en CEA-standardkurve som ble oppstilt etter utførelse av den beskrevne r fremgangsmåte med standardløsningen av egnet CEA.-innhold. The CEA content in the sample is calculated by means of a CEA standard curve which was drawn up after carrying out the described procedure with the standard solution of suitable CEA content.

Claims (22)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av <p> eroskydase i en prøve, karakterisert ved at man blander prøven i en puffer for innstilling av pH-verdien ' fra 3 til 10,5, med et substrat for peroksydasen samt med en blanding av eller flere forbindelser med formelen1. Method for the determination of <p>eroskydase in a sample, characterized by mixing the sample in a buffer for setting the pH value from 3 to 10.5, with a substrate for the peroxidase and with a mixture of one or more compounds with the formula hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og , R^ , R^/ o.g R5 hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe,.og 4-aminoantipyrin, inkuberer den erholdte blanding ved en temperatur mellom 10 - 6 0°C og bestemmer innholdet ' av peroksydase som er tilstede i prøven ved måling av fargeintensitetsøkningen pr. tidsenhet. where R means hydrogen or alkali metal and , R^ , R^/ and R5 hydrogen, bromine, chlorine, nitro, lower alkyl or a carboxyl group, and 4-aminoantipyrine, incubate the resulting mixture at a temperature between 10 - 60° C and determines the content of peroxidase present in the sample by measuring the increase in color intensity per unit of time. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-veriden inntilles mellom 6,5 og 7,5. 2. Method according to claim 1, characterized in that the pH value is adjusted between 6.5 and 7.5. 3. Fremgangsmåte iføle ett av kravene 1 og 2, karakterisert ved at pufferkonsentrasjonen er 50 til 2 00 mmol pr. 1. 3. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the buffer concentration is 50 to 200 mmol per 1. 4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at pufferen er en fosfat <p> uffer. 4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the buffer is a phosphate buffer. 5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at substratet for peroksydase er H? 02 . 5. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the substrate for peroxidase is H? 02 . 6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av 1^0 er ®^ mmol pr. 1. 6. Method according to claim 5, characterized in that the concentration of 1^0 is ®^ mmol per 1. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at konsentrasjonen av R 2® 2 er ^' ^ ^ mmol pr. 1. 7. Method according to claim 6, characterized in that the concentration of R 2® 2 is ^' ^ ^ mmol per 1. 8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, karakterisert ved at konsentrasjonen av forbindelsen med formel I er 1 til 200 mmol pr. 1. 8. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the concentration of the compound of formula I is 1 to 200 mmol per 1. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at konsentrasjonen av forbindelsen med formel I er 10 til 50 mmol pr. 1. 9. Method according to claim 8, characterized in that the concentration of the compound of formula I is 10 to 50 mmol per 1. 10. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det som forbindelse med formel I anvendes fenol. 10. Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that phenol is used as compound of formula I. 11. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 10, k a r a k- terisert ved at det anvendes en konsentrasjon av 4-aminoantipyrin på 0,1 - 10 mmol pr. 1. 11. Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that a concentration of 4-aminoantipyrine of 0.1 - 10 mmol per 1. 12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det anvendes en konsentrasjon av 4-aminoantipyrin 1-3 mmol pr. 1. 12. Method according to claim 11, characterized in that a concentration of 4-aminoantipyrine 1-3 mmol per 1. 13. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 12,' karakterisert ved at inkubasjonstempera-turen ligger mellom 25 og 40°C. 13. Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the incubation temperature is between 25 and 40°C. 14. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 3, karakterisert ved at peroksydasen som skal bestemmes er bundet til et immunologisk aktivt materiale. 14. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the peroxidase to be determined is bound to an immunologically active material. 15 i Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det immunologiske aktive materialet er CEA. 15 in Method according to claim 14, characterized in that the immunologically active material is CEA. 16. Reagenssett ved bestemmelse av peroksydase i en prøve som i flere beholdere inneholdera) en eller flere forbindelser med formelen 16. Reagent set for the determination of peroxidase in a sample which in several containers contains a) one or more compounds with the formula hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og R^ , R2 r ? R^ og R^ hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgruppe, b) 4-aminoantipyrin og eventuelt c) en puffer til innstilling av én pH-verdi fra 3 til 10,5 og eventuelt d) et substrat for peroksydasen. where R means hydrogen or alkali metal and R^ , R2 r ? R^ and R^ hydrogen, bromine, chlorine, nitro, lower alkyl or a carboxyl group, b) 4-aminoantipyrine and optionally c) a buffer for setting one pH value from 3 to 10.5 and optionally d) a substrate for the peroxidase. 17. Reagenssett ifølge krav 16, karakterisert ved at pufferen er fosfatpuffer. 17. Reagent set according to claim 16, characterized in that the buffer is phosphate buffer. 18. Reagenssett ifølge ett av kravene 16 og 17, karakterisert ved at substratet for peroksydasen er f^O^ . 18. Reagent set according to one of claims 16 and 17, characterized in that the substrate for the peroxidase is f^O^ . 19. Reagenssett ifølge ett av kravene 16 til 18, karakterisert ved at forbindelsen med formel I er fenol. 19. Reagent set according to one of claims 16 to 18, characterized in that the compound of formula I is phenol. 20. Amvendelse av en blanding av en eller flere for- bindelser med formel 20. Use of a mixture of one or more pre- bonds with formula hvor R betyr hydrogen eller alkalimetall og P.-^, R?, R3 , R^ og R5 hydrogen, brom, klor, nitro, lavere-alkyl eller en karboksylgrup <p> e, og 4-aminoantipyrin for bestemmelse av <p> eroksydase i en prøve. where R means hydrogen or alkali metal and P.sub.1, R.sub.3, R.sub.3, R.sub.3 and R5 is hydrogen, bromine, chlorine, nitro, lower alkyl or a carboxyl group <p> e, and 4-aminoantipyrine for the determination of <p> eroxidase in a sample. 21. Anvendelse av en blanding ifølge krav 20 i sammenheng med en enzym-immunologisk bestemmelse av et immunologisk aktivt materiale i en prøve. 21. Use of a mixture according to claim 20 in connection with an enzyme-immunological determination of an immunologically active material in a sample. 22. Anvendelse av en blanding ifølge krav 21, karakterisert ved at det immunologiske aktive materialet er C. KA .22. Use of a mixture according to claim 21, characterized in that the immunologically active material is C. KA .
NO780822A 1977-03-09 1978-03-08 PEROXYDASE DETERMINATION. NO780822L (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH294677 1977-03-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO780822L true NO780822L (en) 1978-09-12

Family

ID=4245187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO780822A NO780822L (en) 1977-03-09 1978-03-08 PEROXYDASE DETERMINATION.

Country Status (12)

Country Link
JP (1) JPS53110897A (en)
AU (1) AU3382778A (en)
BE (1) BE864669A (en)
DE (1) DE2809755A1 (en)
DK (1) DK104578A (en)
ES (1) ES467667A1 (en)
FR (1) FR2383441A1 (en)
IL (1) IL54187A0 (en)
IT (1) IT1095456B (en)
NL (1) NL7801413A (en)
NO (1) NO780822L (en)
SE (1) SE7802667L (en)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4184923A (en) * 1977-11-03 1980-01-22 Eastman Kodak Company Reduction of gentisic acid interference in analytical elements
WO1980000454A1 (en) * 1978-08-18 1980-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method of measuring substrate of xanthine oxidase,and composition for the determination
JPS56117798A (en) * 1980-02-21 1981-09-16 Toyo Jozo Co Ltd Kit for measuring lipoid peroxide
JPS5783287A (en) * 1980-11-14 1982-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Elimination of hydrogen peroxide
DE3125667C2 (en) * 1981-06-30 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Method and means for the detection of hydrogen peroxide
IT1168043B (en) * 1981-10-22 1987-05-20 Sclavo Inst Sieroterapeut CHROMOGEN FOR THE COLORIMETRIC DETERMINATION OF PEROXIDES AND METHOD USING THE SAME
WO1983003104A1 (en) * 1982-03-03 1983-09-15 Carter, Timothy, Joseph, Nicholas Enhanced luminescent and luminometric assay
US4460684A (en) * 1982-08-02 1984-07-17 Miles Laboratories, Inc. Ascorbate-resistant broad range glucose test composition, test device and method
US4521511A (en) * 1982-09-22 1985-06-04 Enzyme Technology Company Catalyzed colorimetric and fluorometric substrates for peroxidase enzyme determinations
EP0108526A3 (en) * 1982-11-01 1984-07-11 Beckman Instruments, Inc. Method and reagent for the determination of peroxide and precursors thereof
DE3463395D1 (en) * 1983-02-11 1987-06-04 Nat Res Dev Enhanced luminescent or luminometric assay
CA1252703A (en) * 1984-02-27 1989-04-18 Nutan B. Shah Diagnostic saliva test for detecting periodontal disease
US4828983A (en) * 1986-07-10 1989-05-09 Eastman Kodak Company Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes
GB2450351B (en) 2007-06-20 2012-01-18 Cozart Bioscience Ltd Monitoring an Immunoassay

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT986838B (en) * 1972-05-12 1975-01-30 Sclavo Inst Sieroterapeut COMPLEX OF REAGENTS FOR THE ENZYMATIC DETER MINATION OF GLUCOSE GLUCOSE SYSTEM OXIDASE PEROXIDASE DASES WITH MANUAL AND AUTOMATED METHODS CO WITH READING AT TERM OR IN KINETICS

Also Published As

Publication number Publication date
DE2809755A1 (en) 1978-09-14
BE864669A (en) 1978-09-08
FR2383441A1 (en) 1978-10-06
AU3382778A (en) 1979-09-06
JPS53110897A (en) 1978-09-27
NL7801413A (en) 1978-09-12
IL54187A0 (en) 1978-06-15
IT1095456B (en) 1985-08-10
IT7820739A0 (en) 1978-02-28
SE7802667L (en) 1978-09-10
ES467667A1 (en) 1979-09-01
DK104578A (en) 1978-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4503143A (en) Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen
US4851335A (en) Process and reagent for the specific determination of HDL cholesterol in serum or plasma
NO780822L (en) PEROXYDASE DETERMINATION.
CA1281643C (en) Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes
US4615972A (en) Stabilization of indicators for detecting enzyme activity
FI70727C (en) PREPARATION OF THE REAGENTS FOR ENZYMATIC BLEANING OF THE ENZYME SUBSTRATE
GB2162946A (en) Enhanced luminescent or luminometric assay
NO146558B (en) PROCEDURE FOR DETERMINING FREE CHOLESTEROL IN A BIOLOGICAL LIQUID TEST, AND PREPARATION FOR USE IN THE PROCEDURE
US4940660A (en) Color developing method in clinical examinations
EP0176357A1 (en) Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol
EP0062892B1 (en) Single incubation immunochemical assay for creatin phosphokinase mb
US4001089A (en) Method for determination of triglycerides and glycerol
Shatton et al. A microcolorimetric assay of inorganic pyrophosphatase
US4452903A (en) Assay method and reagent kit means for lipid-containing body fluid
Rani et al. Measurement of bile acid in serum and bile with arylamine-glass-bound 3α-hydroxysteroid dehydrogenase and diaphorase
US4022667A (en) Substrate solution for carboxylic ester hydrolase determination
US5096812A (en) Assay method for gamma glutamyltransferase (GGT) in liquid blood and dried blood
US5780239A (en) Method for the determination of cast in urine
US4212939A (en) Substrate solution for carboxylic ester hydrolase determination
US4302537A (en) Reagent and method for the determination of peroxidase
Landis et al. Evaluation of a kinetic method for simultaneous determination of conjugated and unconjugated bilirubin.
US4971918A (en) Reducible indicator compositions containing pyrogallol derivatives
US3278394A (en) Method and composition for diagnosing glucose
US4142938A (en) Determination of triglycerides and glycerol
Rani et al. Discrete analysis of bile acid in serum and bile with 3⍺-hydroxysteroid dehydrogenase and diaphorase immobilized onto alkylamine glass beads