TW201704476A - 量測飼料中蛋白酶活性之方法及套組 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於量測飼料中蛋白酶活性之方法及包含用於量測飼料中蛋白酶活性之組件之套組。

Description

量測飼料中蛋白酶活性之方法及套組
本發明描述用於量測飼料中蛋白酶活性之方法及套組。
蛋白酶用作動物飼料添加劑以改良家畜健康及行為表現，但僅公開少數將動物飼料中蛋白酶活性定量之方法。此外，彼等方法通常涉及特定設備、複雜程序或專業知識，從而使得在結果最有用之位置處極難執行此等分析。在一些情況下，定性結果可足以判定蛋白酶是否以正確劑量添加至飼料中，或是否足量之酶耐受飼料生產條件(諸如丸化)。
儘管存在許多已知之蛋白酶分析法，但其均未解決在嘗試將動物飼料情景下之外源添加蛋白酶之活性定量中的所有固有障礙。所添加蛋白酶可吸附至飼料之組分，使得難以提取酶。蛋白酶活性之飼料中方法必須解決存在於某些飼料中的特定蛋白酶抑制劑之存在。由於蛋白酶的通常低含量，故必須使用高度靈敏分析來偵測飼料中之蛋白酶活性。飼料中之內源蛋白質基質可遮蔽蛋白酶活性之存在且難以確立適合的條件來精確地定量所添加蛋白酶。動物飼料充當良好緩衝劑之能力意謂必須仔細注意調整pH，因為所有酶僅在某一範圍內之pH值下作用最佳。由於進行蛋白酶活性之飼料中分析的此等障礙，現有方法通常需要額外步驟，該等額外步驟增加了分析複雜度且降低準確 度及精密度。
因此，需要艱苦的努力及專業技術來將此等飼料中方法轉至其可為最適用之位置(亦即飼料廠)。或者，將樣品運送至中心實驗室進行分析產生額外的成本及時間，且在獲取結果之前，飼料通常已使用。
因此，需要經校準之簡單方法來偵測飼料中之蛋白酶活性，該方法可當場執行且不需要複雜設備。
圖1A展示蛋白酶活性分析之影像，其中角蛋白天青蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖1B呈現蛋白酶活性分析之影像，其中生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質(hide-Remazol Brilliant Blue R protease substrate)之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖1C展示蛋白酶活性分析之影像，其中偶氮膠原蛋白蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖2A描繪蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及Protazyme AK蛋白酶受質之溶液在不存在或存在0.025%或0.05%之蛋白酶下培育。
圖2B呈現蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質之溶液在不存在或存在0.025%或0.05%之蛋白酶下培育。
圖3A展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及Protazyme AK蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育1小時。
圖3B展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及Protazyme AK蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育2小 時。
圖3C呈現蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、Protazyme AK蛋白酶受質及6M之尿素之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育1小時。
圖3D展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、Protazyme AK蛋白酶受質及6M之尿素之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育2小時。
圖4A展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育1小時。
圖4B展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育2小時。
圖4C呈現蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質及6M之尿素之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育1小時。
圖4D展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質及6M之尿素之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育2小時。
圖5A展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及Protazyme AK蛋白酶受質之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖5B展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、Protazyme AK蛋白酶受質及6M之尿素之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖5C呈現蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、Protazyme AK蛋白酶受質及0.05%之SDS之溶液在不存在或存在蛋白 酶下培育。
圖5D展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物及Protazyme AK蛋白酶受質及0.1%之SDS之溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖5E展示蛋白酶活性分析之影像，其中包含飼料提取物、Protazyme AK蛋白酶受質及0.05%之SDS及6M之尿素的溶液在不存在或存在蛋白酶下培育。
圖6A展示在不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下進行蛋白酶活性分析之影像。展示使用Protazyme AK蛋白酶受質培育30分鐘後之蛋白酶活性。
圖6B呈現不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下進行蛋白酶活性分析之影像。展示使用Protazyme AK蛋白酶受質培育60分鐘後之蛋白酶活性。
圖6C展示不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的蛋白酶活性分析之影像。所呈現為使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質培育30分鐘後之蛋白酶活性。
圖6D呈現不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下進行蛋白酶活性分析之影像。展示使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質培育60分鐘後之蛋白酶活性。
圖7A展示在不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下在磷酸鹽緩衝劑中進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用Protazyme AK蛋白酶受質培育30分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖7B呈現在不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下在磷酸鹽緩衝劑中進行之蛋白酶活性分析之影像。展示使用Protazyme AK蛋白酶受質培育60分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖7C展示在不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情 況下在磷酸鹽緩衝劑中進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質培育30分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖7D呈現在不添加變性劑，添加0.05% SDS或添加1% SDS的情況下在磷酸鹽緩衝劑中進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質培育60分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖8A描繪用未過濾飼料提取物進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用Protazyme AK蛋白酶受質在培育30分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖8B描繪用未經過濾飼料提取物進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用Protazyme AK蛋白酶受質培育60分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖8C描繪用未經過濾飼料提取物進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質在培育30分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖8D描繪用未經過濾飼料提取物進行之蛋白酶活性分析之影像。呈現使用生皮-雷馬素亮藍R蛋白酶受質在培育60分鐘後之蛋白酶活性分析。
圖9描繪展示包含各種量之蛋白酶的樣品中使用Protazyme AK蛋白酶受質培育60分鐘後蛋白酶活性分析之經校準量測結果的影像。
圖10A描繪展示使用所指示飼料調配物之蛋白酶活性分析之量測結果的影像。
圖10B描繪展示使用所指示飼料調配物之蛋白酶活性分析之量測結果的影像。
本文中提供用於偵測或量測飼料中蛋白酶活性之方法及套組。有利地，該等方法直接、精確且不需要使用諸如pH量測裝置及離心 或過濾裝置的昂貴設備。另外，已發現磷酸鹽緩衝劑可用於量測飼料中蛋白酶活性之方法。因此，本發明之方法可不使用昂貴設備在飼料/食品加工場所執行，且無需將樣品運輸離開場所以進行分析，由此避免在獲得結果方面的冗長延遲。
I. 方法
本文中提供用於偵測及/或量測飼料中蛋白酶活性之方法。該等方法可用於飼料樣品中之蛋白酶活性之定性或定量量測。大體而言，定性量測用於判定飼料樣品中蛋白酶之存在(或不存在)。或者，定量量測用於測定飼料樣品中蛋白酶活性之量。該等方法一般包含：(a)藉由組合飼料樣品、蛋白酶之受質及包含磷酸鹽之反應緩衝劑來製備反應混合物；及(b)在允許多肽裂解之條件下培育反應混合物以使得產生用於蛋白酶活性量測之信號。
(a)製備反應混合物
用於量測蛋白酶活性之方法涉及形成反應混合物。反應混合物通常包含飼料樣品、蛋白酶之受質及通常包含磷酸鹽之反應緩衝劑。在涉及定量量測之一些重複發明中，方法進一步包含在製備反應混合物之前自飼料樣品製備蛋白酶提取物。下文描述反應混合物之各組分。
i. 飼料樣品
本文所揭示方法之反應混合物包括飼料樣品。術語「飼料」、「食品」、「飼料樣品」及「食品樣品」在本文中可互換地使用且可指含有待量測之蛋白酶活性的任何樣品。飼料樣品可包括動物飼料之一或多種組分。飼料物質或動物飼料物質之非限制性實例可包括(但不限於)：玉米或玉米之組分，諸如玉米粉、玉米纖維、玉米皮、玉米DDGS(具有可溶物之乾酒渣)、青貯料、碾磨玉米、玉米胚芽、玉米麩質、玉米油或玉米植物之任何其他部分；大豆或大豆之組分，諸如 大豆油、大豆粉、大豆皮、大豆青貯料、碾磨大豆或大豆植物之任何其他部分；小麥或小麥之任何組分，諸如小麥粉、小麥纖維、小麥皮、小麥殼、碾磨小麥、小麥胚芽或小麥植物之任何其他部分；菜籽或菜籽植物之任何其他部分，諸如菜籽油、菜籽粉、菜籽蛋白、菜籽皮、碾磨菜籽或菜籽植物之任何其他部分；葵花或葵花植物之組分；高樑或高樑植物之組分；甜菜或甜菜植物之組分；甘蔗或甘蔗植物之組分；大麥或大麥植物之組分；棕櫚油、棕櫚仁或棕櫚植物之組分；甘油；玉米漿；來自農業加工設施之廢棄物；卵磷脂；瘤胃保護脂肪；糖蜜；大豆糖蜜；亞麻；花生；豌豆；燕麥；草，諸如果園草及羊毛草；魚粉、肉及骨粉；羽化粉；及家禽副產物粉；及用於青貯料或乾草之苜蓿及/或三葉草，及本文所闡述之任何飼料成分之各種組合，或此項技術中一般已知之其他飼料成分。如在此項技術中所公認，飼料組合物可進一步補充胺基酸、維生素、礦物質及其他飼料添加劑，諸如其他類型之酶、有機酸、精油、益生菌、益菌助生質、抗氧化劑、色素、抗結塊劑及其類似物。
該飼料樣品可經調配以供投與任何動物個體。適合個體包括人類、食用動物、伴侶動物、研究動物及動物園動物。食用動物之非限制性實例包括家禽(例如，雞，包括肉雞、產卵雞及種雞；鴨；比賽用母雞；鵝；珍珠雞/母雞；鵪鶉及火雞)、肉牛、乳牛、小牛、豬、山羊、綿羊、野牛及魚。適合的伴侶動物包括(但不限於)貓、狗、馬、兔、嚙齒動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠及天竺鼠)、刺蝟及雪貂。研究動物之實例包括嚙齒動物、貓、狗、兔、豬及非人類之靈長類動物。適合的動物園動物之非限制性實例包括非人類之靈長類動物、獅子、老虎、熊、大象、長頸鹿及其類似動物。
根據本發明之各種實施例，飼料樣品可呈動物飼料領域中已知的任何適合形式，且可為濕或乾組分。舉例而言，根據某些實施例， 飼料組合物可呈選自由以下各者組成之群的形式：全價飼料、飼料補充劑、飼料添加劑、預混合物、追肥、槽、礦物質、粉、粗料、顆粒、糊狀物、液體補充劑、浸液、食團、零食及其任一者之組合。另外，可視情況在製備反應混合物之前研磨飼料樣品。
飼料樣品可包括作為動物飼料添加劑之蛋白酶。蛋白酶出於各種目的用於農業中，諸如以改良飼料之消化性。用作動物飼料添加劑之蛋白酶在此項技術中通常已知。適合蛋白酶包括內切蛋白酶及外切蛋白酶。在各種實施例中，蛋白酶可為天冬胺酸蛋白酶、天冬醯胺蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶、未知催化機制之蛋白酶或其組合。在一個較佳實施例中，蛋白酶可為來自芽孢桿菌(Bacillus)之熱穩定蛋白酶。在另一較佳實施例中，蛋白酶可為來自芽孢桿菌之絲胺酸蛋白酶。在又另一較佳實施例中，蛋白酶可為來自芽孢桿菌之廣效性蛋白酶。在另一較佳實施例中，蛋白酶可為來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)之蛋白酶。地衣芽孢桿菌之菌株可為PWD-1。
可添加至動物飼料之蛋白酶之量可變化且將變化。一般而言，添加至動物飼料中之蛋白酶之量可在一公克飼料約10個偶氮酪蛋白單位之蛋白酶活性(U/g)至約1000U/g範圍內。舉例而言，添加至動物飼料之蛋白酶之量可為約10U/g、50U/g、100U/g、150U/g、200U/g、250U/g、300U/g、350U/g、400U/g、450U/g、500U/g、550U/g、600U/g、650U/g、700U/g、750U/g、800U/g、850U/g、900U/g、950U/g或約1000U/g。在一些實施例中，添加至動物飼料之蛋白酶之量可為約100U/g、110U/g、120U/g、130U/g、140U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、200U/g、210U/g、220U/g、230U/g、240U/g、250U/g、260U/g、270U/g、280U/g、290U/g、300U/g、310U/g、320U/g、330U/g、340U/g、350U/g、360 U/g、370U/g、380U/g、390U/g、400U/g、410U/g、420U/g、430U/g、440U/g、450U/g、460U/g、470U/g、480U/g、490U/g或約500U/g。在較佳實施例中，添加至動物飼料之蛋白酶之量可為約200U/g、210U/g、220U/g、230U/g、240U/g、250U/g、260U/g、270U/g、280U/g、290U/g、300U/g、310U/g、320U/g、330U/g、340U/g、350U/g、360U/g、370U/g、380U/g、390U/g或約400U/g。
用於製備反應混合物之飼料樣品之量可變化且將變化。一般而言，飼料樣品之量可為約1公克、5公克、10公克、15公克、20公克、25公克、30公克、35公克、40公克、45公克、50公克、55公克或約60公克或更多。在一些實施例中，約1公克、2公克、3公克、4公克、5公克、6公克、7公克、8公克、9公克、10公克、11公克、12公克、13公克、14公克或約15公克飼料樣品用於製備反應混合物。在較佳實施例中，約3公克、3.5公克、4公克、4.5公克、5公克、5.5公克、6公克、6.5公克、7公克、7.5公克或約8公克飼料用於製備反應混合物。在例示性實施例中，約5公克飼料用於製備反應混合物。
ii. 蛋白酶受質
反應混合物亦包含蛋白酶之受質。合適受質一般包括連接至產生信號之基團之多肽，以便多肽被所要量測之蛋白酶裂解時可以產生信號。
術語「多肽」以其最廣泛意義使用且可包括肽、多肽及蛋白質，以及含有一或多種非天然胺基酸或含有可使多肽具有作為蛋白酶之受質以供進行活性量測的功能之任何其他化學修飾之肽、多肽及蛋白質。多肽可為天然存在之多肽，諸如酪蛋白、膠原蛋白、明膠、白蛋白、血球蛋白及其類似物。或者，多肽可為合成肽或合成多肽。
產生信號之基團可提供可藉由諸如比色、螢光、電化學、光譜、層析、密度測定或放射技術及其類似技術的技術偵測的信號。用 於本發明之合適之產生信號之基團包括(但不限於)放射性原子、螢光染料、發色團、化學發光標記、電化學發光標記、具有特定結合搭配物之配體或可彼此相互作用以增強、更改或削弱信號的任何其他產生信號之基團。亦預期產生信號之基團可為本身不會產生可偵測信號，但當與另一標記結合使用時則可產生或抑止可偵測信號之分子。舉例而言，標記可為消光劑-染料配對中之消光劑。舉例而言，消光劑-染料配對包含螢光團及消光劑。受質之產生信號之基團可藉由任何方式(包括藉由共價或非共價方式)連接至多肽受質，以使得存在於飼料樣品中之多肽被所要量測之蛋白酶裂解時，由產生信號之基團產生信號。
在一些實施例中，蛋白酶受質之產生信號之基團可為螢光團。適合螢光團包括(但不限於)螢光素異硫氰酸酯(FITC)、螢光素胺基硫脲、若丹明、Texas Red、CyDye(例如，Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例如Alexa488、Alexa555、Alexa594、Alexa647)及近紅外(NIR)(700nm至900nm)螢光染料。
在其他實施例中，蛋白酶受質之產生信號之基團可為放射性同位素。適合的放射性核素之非限制性實例包括鎝-99m、碘-123、碘-125及碘-131、鉈-201、鎵-67、氟-18、氟去氧葡萄糖及銦-111。
在其他實施例中，蛋白酶受質之產生信號之基團可為發色團。若受質裂解，則發色團產生包含可見顏色變化之信號。適合發色團之非限制性實例包括羊毛罌紅、Reactive Black 5、Reactive Blue 21、Reactive Orange 78、Reactive Yellow 15、Reactive Blue 19、Reactive Blue 4、Reactive Red 11、Reactive Yellow 86、Reactive Blue 163、Reactive Red 180、單鹵三嗪及二鹵三嗪染料(諸如單氟三嗪及二氟三嗪染料、單氯三嗪及二氯三嗪染料)、單-(m'-羥基吡啶)三嗪、PROCION®系列染料中之染料、CIBACRONTM系列之柏油色、2,4,5三 鹵基嘧啶、2,3二鹵基喹喏啉、N-羥基磺基丁二醯亞胺(磺基-NHS)酯官能化染料、N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)官能化染料、乙烯碸染料(諸如REMAZOL®系列之柏油染料，包括REMAZOL® Blue)、偶氮染料(諸如Sudan I、Sudan II、Sudan III、Sudan IV、Sudan Black)、Disperse Orange、Disperse Red、Oil Red O、Trypan Blue、Congo Red、β-胡蘿蔔素、對硝基醯基替苯胺(pNA)、磺醯基氯染料(諸如麗絲胺(lissamine)、若丹明及4-二甲胺基偶氮苯-4-磺醯基氯)、四氟苯酯官能化染料、異硫氰酸酯官能化染料及碘乙醯基官能化染料及結構上等效於在此所列出之染料的其他染料。
蛋白酶受質可為不溶的。如本文中所使用，術語「不可溶」係指在約6至約9之pH下及在約25℃至約50℃之溫度下不能溶解於磷酸鹽緩衝水溶液中之受質。因此，不可溶受質一般非均勻地分散、物理上分離且與反應緩衝劑之主體視覺上可區分。適合用於本發明方法之不可溶受質的非限制性實例包括生皮-雷馬素亮藍R、偶氮膠原蛋白、天青交聯酪蛋白、明膠-雷馬素亮藍、酪蛋白-雷馬素亮藍及膠原蛋白-雷馬素亮藍。在例示性實施例中，不可溶受質為酪蛋白-雷馬素亮藍。
或者，蛋白酶受質可為可溶的。如本文中所使用，術語「可溶」係指在約6至約9之pH下及在約25℃至約50℃之溫度下能夠溶解於磷酸鹽緩衝水溶液中以形成均勻溶液之受質。適合的可溶受質之非限制性實例包括N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO：1)-對硝基醯基替苯胺、N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Leu(SEQ ID NO：2)-對硝基醯基替苯胺、N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Arg(SEQ ID NO：3)-對硝基醯基替苯胺、N-甲磺醯基-D-Phe-Gly-Arg-對硝基醯基替苯胺及鄰胺基苯甲醯基-AGSRGAGQ(SEQ ID NO：4)-(2,3-二硝基苯基-乙二胺)。在一較佳實施例中，可溶受質為N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Leu(SEQ ID NO：2)- 對硝基醯基替苯胺。在一例示性實施例中，可溶受質為N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO：2)-對硝基醯基替苯胺。
iii. 反應緩衝劑
反應混合物亦包含反應緩衝劑。在較佳實施例中，反應緩衝劑包含磷酸鹽。作為非限制性實例，反應緩衝劑可包含TRIS(參(羥基甲基)胺基甲烷)、TRIS HCl、3-{[參(羥基甲基)甲基]胺基}丙烷磺酸(TAPS)、N,N-雙(2-羥基乙基)甘胺酸(Bicine)、參(羥基甲基)甲胺(tris)、N-參(羥基甲基)甲基甘胺酸(tricine)、3-[N-參(羥基甲基)甲基胺基]-2-羥基丙烷磺酸(TAPSO)、4-2-羥基乙基-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、2-{[參(羥基甲基)甲基]胺基}乙烷磺酸(TES)、3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、二甲基胂酸(二甲胂酸鹽)、鹽水檸檬酸鈉(SSC)、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、2(R)-2-(甲胺基)丁二酸(丁二酸)、硼酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、甘胺酸、碳酸鎂或碳酸鈣及碳酸氫鹽。在例示性實施例中，反應緩衝劑包含磷酸鈉或磷酸鉀。
反應緩衝劑之pH值可變化且將變化。舉例而言，反應緩衝劑可調整至約6.0至約12.0之pH。舉例而言，反應緩衝劑可調整至約6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或約12.0之pH。在一些實施例中，反應緩衝劑具有約7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或約9.0之pH。在其他實施例中，反應緩衝劑具有約8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或約10.0之pH。在又其他實施例中，反應緩衝劑具有約9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或約11.0之pH。在一較佳實施例中，反應緩衝劑具有約7.5、 7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或約8.5之pH。在另一較佳實施例中，反應緩衝劑具有約8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或約9.5之pH。在又另一較佳實施例中，反應緩衝劑具有約9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或約10.5之pH。在一例示性實施例中，反應緩衝劑具有約8.0之pH。在另一例示性實施例中，反應緩衝劑具有10.0之pH。
反應緩衝劑中緩衝劑之濃度通常足以維持所需pH範圍，且因此可變化且將變化。反應緩衝劑中緩衝劑之濃度例如可為約20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或約200mM。在一些實施例中，反應緩衝劑中緩衝劑之濃度為約50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM或約150mM。在較佳實施例中，反應緩衝劑中緩衝劑之濃度為約50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM或約150mM。在更佳實施例中，反應緩衝劑中緩衝劑之濃度為約90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、101mM、102mM、103mM、104mM、105mM、106mM、107mM、108mM、109mM或約110mM。在一例示性實施例中，反應緩衝劑中磷酸鹽緩衝劑之濃度為約100mM。
反應緩衝劑可視情況包括變性劑。適用於本發明之變性劑可為能夠破壞多肽之二級及三級結構的任何試劑且為此項技術中已知。可用於反應緩衝劑中之變性劑之非限制性實例包括：溶劑，諸如乙醇及甲醇；交聯劑，諸如甲醛及戊二醛；離液劑；及界面活性劑，諸如溴 化鯨蠟基三甲銨(CTAB)、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲銨基]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、月桂醇醚硫酸鈉(十二烷基硫酸鈉或SDS)、聚氧乙烯(10)鯨蠟醚(BRIJ® 56)、聚氧乙烯(20)鯨蠟醚(BRIJ® 58)、聚氧乙烯乙二醇十二烷基醚(BRIJ® 35)、聚氧乙烯(9)對第三辛基酚(NONIDETTM P-40)、聚氧乙烯(4-5)對第三辛基酚(TRITONTM X-45)、聚氧乙烯(7-8)對第三辛基酚(TRITONTM X-114)、聚氧乙烯(9-10)對第三辛基酚(TRITONTM X-100)、聚氧乙烯(9-10)壬基酚(TRITONTM N-101)、聚山梨糖醇酯界面活性劑(諸如聚氧乙烯(20)山梨糖醇單月桂酸酯(TWEEN® 20)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇單棕櫚酸酯(TWEEN® 40)、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(Tween® 60)及聚氧乙烯(20)山梨糖醇單油酸酯(TWEEN® 80))。
在一些實施例中，變性劑可為離液劑。適用於該方法之離液劑之非限制性實例可為尿素、氯化胍、過氯酸鋰、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇及TCEP(參(2-羧基乙基)膦)。在實施例之替代方案中，離液變性劑可為氯化胍。在另一替代方案中，離液變性劑可為過氯酸鋰。在一較佳實施例中，離液變性劑可為尿素。如熟習此項技術者應瞭解，尿素之變性濃度可在約5M至約8M範圍內。在實施例之一例示性替代方案中，本文中所揭示方法之反應緩衝劑中的尿素之濃度為約6M尿素。
在其他實施例中，變性劑可為界面活性劑。在一些實施例中，界面活性劑可為非離子界面活性劑。較佳的非離子界面活性劑可為聚山梨糖醇酯界面活性劑，諸如Tween® 20、Tween® 40、Tween® 60或Tween® 80。在替代性實施例中，界面活性變性劑可為陰離子界面活性劑。在一些實施例中，界面活性劑可為SDS。反應緩衝劑中之SDS之重量分率可在約0.001%至約20%之範圍內。在實施例之一些替代方案中，反應緩衝劑中SDS之重量分率可在約0.1%至約10%之範圍內在 該實施例之其他替代方案中，反應緩衝劑中SDS之重量分率可在約1%至約4%之範圍內。在例示性實施例中，用於本文中所揭示方法中之反應緩衝劑中SDS之重量分率為約0.25%。
在定性量測蛋白酶活性之實施例中，緩衝劑可為100mM磷酸鈉，且具有約10.0之pH。在定性量測蛋白酶活性之其他實施例中，緩衝劑可為100mM磷酸鈉、6M尿素，且具有約8.0之pH。在定性量測蛋白酶活性之某些實施例中，緩衝劑可為100mM磷酸鈉、0.25% SDS，且具有約8.0之pH。
反應緩衝劑可進一步包含：鹽，諸如氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)；還原劑，諸如二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇(BME)及參(2-羧基乙基)膦(TCEP)；膨化劑，諸如硫酸葡聚糖、聚乙二醇(PEG)；用以防止過度發泡或起泡之消泡劑；酶抑制劑；及四乙二醇及其他物質。
iv. 混合組分
反應混合物之各種組分之添加次序可視飼料樣品、待偵測或待量測蛋白酶及蛋白酶受質變化且將視該等因素變化。在一些實施例中，可藉由將反應緩衝劑添加至試管中之蛋白酶受質及飼料樣品中來製備反應混合物。在其他實施例中，可藉由將反應緩衝劑添加至試管中之飼料樣品中及將蛋白酶受質添加至反應緩衝劑與飼料樣品之混合物中來製備反應混合物。在一些較佳實施例中，可藉由將蛋白酶受質及飼料樣品添加至試管中之反應緩衝劑中來製備反應混合物。在其他較佳實施例中，可藉由將反應緩衝劑添加至試管中之蛋白酶受質中及將飼料樣品添加至反應緩衝劑與蛋白酶受質之混合物中來製備反應混合物。反應混合物之各種組分之量可變化且將變化，且可藉由實驗測定。
v. 製備飼料提取物或蛋白酶提取物
在一些實施例中，藉由混合飼料樣品與反應緩衝劑且使飼料樣 品在飼料提取物中沈降來製備飼料提取物。一般而言，在與反應緩衝劑混合之前不研磨飼料樣品。接著將飼料提取物(其包含反應緩衝劑)之等分試樣與蛋白酶受質混合形成反應混合物。可在與蛋白酶受質混合之前過濾飼料提取物以形成反應混合物。
在定量量測信號之其他實施例中，方法可進一步包含在製備反應混合物之前製備飼料樣品之蛋白酶提取物。一般而言，蛋白酶提取物藉由以下步驟製備：(a)研磨飼料樣品；(b)混合經研磨飼料與提取緩衝劑；及(c)使經研磨飼料與提取緩衝劑之混合物澄清以產生蛋白酶提取物。
研磨飼料樣品之方法為此項技術中已知。在較佳實施例中，使用弗里奇轉子速度研磨機(Fritsch rotor speed mill)研磨飼料樣品。飼料樣品可研磨至約10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm或約0.1mm或更小之粒度。在較佳實施例中，將飼料樣品研磨至約10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm或約1mm或更小之粒度。在例示性實施例中，將飼料樣品研磨至約1mm或更小之粒度。
適合的提取緩衝劑為此項技術中已知。在較佳實施例中，提取緩衝劑可為硼酸鹽緩衝水溶液。舉例而言，提取緩衝劑可包含硼酸鈉、四硼酸鈉或硼酸鉀。
提取緩衝劑之pH可在約7.0至約13.0範圍內。舉例而言，提取緩衝劑可具有約7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5或約13.0之pH。在一些實施例中，提取緩衝劑可具有約9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或約11.0之pH。在一較佳實施例中，提取緩衝劑可具有約9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或約10.5之pH。在例示性實施例 中，提取緩衝劑具有約10.0之pH。
提取緩衝劑中硼酸鹽之濃度可為約20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或約200mM。在一些實施例中，提取緩衝劑中硼酸鹽之濃度為約50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM或約150mM。在較佳實施例中，提取緩衝劑中硼酸鹽之濃度為約50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM或約150mM。在更佳實施例中，提取緩衝劑中硼酸鹽之濃度為約90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、101mM、102mM、103mM、104mM、105mM、106mM、107mM、108mM、109mM或約110mM。在一例示性實施例中，提取緩衝劑中硼酸鹽之濃度為約100mM。
提取緩衝劑可視情況進一步包括變性劑。用於提取緩衝劑中之適合變性劑為此項技術中已知。在一個較佳實施例中，變性劑可為非離子界面活性劑，諸如聚氧乙烯(20)山梨糖醇單月桂酸酯(TWEEN® 20)或聚氧乙烯(9-10)對第三辛基酚(TRITONTM X-100)。提取緩衝劑中非離子界面活性劑之量可為約0.1wt%、約0.2wt%、約0.3wt%、約0.4wt%、約0.5wt%、約0.6wt%、約0.7wt%、約0.8wt%、約0.9wt%或約1.0wt%。
混合飼料樣品與提取緩衝劑之持續時間可視飼料樣品之類型、飼料樣品中蛋白酶之濃度及進行提取之溫度而變化且將視該等因素變化且可以實驗方法分析。一般而言，飼料樣品可與提取緩衝劑混合約 1min、5min、10min、20min、30min、40min、50min或約60min。在一些實施例中，將飼料樣品與提取緩衝劑混合約1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或約20min。在較佳實施例中，將飼料樣品與提取緩衝劑混合約10min。
可在與其他組分混合之前使蛋白酶提取物澄清以形成反應混合物。使提取物澄清之方法為此項技術中已知。舉例而言，蛋白酶提取物可藉由離心或過濾來澄清。在較佳實施例中，蛋白酶提取物在與其他組分混合之前藉由離心來澄清。
最後，藉由組合蛋白酶提取物與反應緩衝劑及蛋白酶受質來製備反應混合物。在一些實施例中，反應緩衝劑包含磷酸鹽。舉例而言，約pH 7至pH 11下之反應緩衝劑可包含約50mM至約200mM磷酸鹽。在例示性實施例中，約pH 10下之反應緩衝劑包含約100mM磷酸鈉或磷酸鉀。
(b)培育反應混合物
如以上部分(I)(a)中詳述製備反應混合物後，本文中所揭示之方法通常涉及在允許蛋白酶受質裂解之條件下培育反應混合物。熟習此項技術者應瞭解，培育反應混合物所需之條件及時間可視飼料樣品、飼料樣品中蛋白酶之濃度及在製備反應混合物中所使用之蛋白酶受質之身分而變化且將視該等因素變化。一般而言，反應混合物可在約室溫至約100℃範圍內之溫度下培育。舉例而言，反應混合物可在約15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或約100℃之溫度下培育通常，培育反應混合物直至產生足量信號以允許測定蛋白酶活性。舉例而言，培育之持續時間可在約1分鐘至約10小時或更久之範圍內。
(c)量測蛋白酶活性
方法之下一步驟包含量測反應混合物中之蛋白酶活性。量測之方法可變化且將變化。蛋白酶活性一般藉由量測在藉由反應混合物中之蛋白酶裂解蛋白酶受質後所產生之信號來測定。在較佳實施例中，產生信號之基團為發色團。當產生信號之基團為發色團時，可經由自視檢查由發色團產生之信號所產生的顏色變化來定性地量測信號。或者，當產生信號之基團為發色團時，可經由分光光度法偵測發色團產生之信號，來定量地量測信號。
i. 定性量測
在一些實施例中，定性量測蛋白酶活性。如本文中所使用，術語「定性」係指簡單判定飼料樣品中蛋白酶之存在或不存在。因此，本發明之方法可用以判定蛋白酶是否已添加至飼料樣品中及/或蛋白酶活性是否能承受飼料製備過程。一般而言，當定性地量測蛋白酶活性時，蛋白酶活性經由目視檢查由發色團產生之信號所引起的顏色變化來量測。
在實施例之較佳替代方案中，產生信號之基團為發色團，且經由目視檢查由發色團產生之信號所引起的顏色變化來定性量測。在實施例之例示性替代方案中，受質為不可溶的，產生信號之基團為發色團，且經由目視檢查由發色團產生之信號所引起的顏色變化來量測。
當定性地量測蛋白酶活性時，本文中所揭示之方法可進一步經最佳化以判定飼料樣品中最小量之蛋白酶活性的存在或不存在。飼料樣品中蛋白酶活性之最小量可為約50U/g飼料至約500U/g飼料。舉例而言，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量可為約50U/g飼料、60U/g飼料、70U/g飼料、80U/g飼料、90U/g飼料、100U/g飼料、150U/g飼料、160U/g飼料、170U/g飼料、180U/g飼料、190U/g飼料、200U/g飼料、300U/g飼料、400U/g飼料或約500U/g飼料。在一些實施 例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約50U/g飼料、60U/g飼料、70U/g飼料、80U/g飼料、90U/g飼料、100U/g飼料、110U/g飼料、120U/g飼料、130U/g飼料、140U/g飼料或約150U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約100U/g飼料、110U/g飼料、120U/g飼料、130U/g飼料、140U/g飼料、150U/g飼料、160U/g飼料、170U/g飼料、180U/g飼料、190U/g飼料或約200U/g飼料。在又其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約150U/g飼料、160U/g飼料、170U/g飼料、180U/g飼料、190U/g飼料、200U/g飼料、210U/g飼料、220U/g飼料、230U/g飼料、240U/g飼料或約250U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約200U/g飼料、210U/g飼料、220U/g飼料、230U/g飼料、240U/g飼料、250U/g飼料、260U/g飼料、270U/g飼料、280U/g飼料、290U/g飼料或約300U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約250U/g飼料、260U/g飼料、270U/g飼料、280U/g飼料、290U/g飼料、300U/g飼料、310U/g飼料、320U/g飼料、330U/g飼料、340U/g飼料或約350U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約300U/g飼料、310U/g飼料、320U/g飼料、330U/g飼料、340U/g飼料、350U/g飼料、360U/g飼料、370U/g飼料、380U/g飼料、390U/g飼料或約400U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約350U/g飼料、360U/g飼料、370U/g飼料、380U/g飼料、390U/g飼料、400U/g飼料、410U/g飼料、420U/g飼料、430U/g飼料、440U/g飼料或約450U/g飼料。在其他實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約400U/g飼料、410U/g飼料、420U/g飼料、430U/g飼料、440U/g飼料、450U/g飼料、460U/g飼料、470U/g飼料、480U/g飼料、490U/g飼料或約500U/g飼料。在較佳實施例中，飼料樣品中蛋白酶 活性之最小量為約130U/g飼料、135U/g飼料、140U/g飼料、145U/g飼料、150U/g飼料、155U/g飼料、160U/g飼料、165U/g飼料、170U/g飼料、175U/g飼料、180U/g飼料、185U/g飼料、190U/g飼料、195U/g飼料或約200U/g飼料。在例示性實施例中，飼料樣品中蛋白酶活性之最小量為約150U/g飼料。
方法可藉由調整反應緩衝劑組合物而最佳化，反應緩衝劑組合物包括緩衝劑、緩衝劑濃度、緩衝劑pH、存在或不存在變性劑、變性劑之身分、變性劑之濃度及其組合。或者，方法可藉由調整反應條件而最佳化，該等反應條件包括反應時間、反應溫度及包括於反應混合物中之飼料之量。在一較佳實施例中，方法藉由調整反應緩衝劑中之變性劑之濃度而最佳化。在例示性實施例中，變性劑為SDS，且反應緩衝劑中SDS之濃度為約0.25%。
ii. 定量量測
在一些實施例中，定量量測蛋白酶活性。如本文中所使用，術語「定量」可指飼料樣品中蛋白酶活性之量的精確測定。舉例而言，本發明之方法可用於測定存在於飼料中之蛋白酶活性之絕對量或多少蛋白酶活性能經受住飼料製備過程。
一般而言，當定量量測蛋白酶活性時，蛋白酶活性經由分光光度法量測所產生信號來量測。在實施例之較佳替代方案中，產生信號之基團為發色團，且經由分光光度法量測所產生信號來定量量測。在實施例之例示性替代方案中，受質為不可溶的且產生信號之基團為發色團，且其中經由分光光度法量測所產生信號來定量量測。
當定量量測蛋白酶活性時，本文所揭示方法適合於測定廣泛範圍之蛋白酶濃度的蛋白酶活性。舉例而言，方法可適合於測定在約1U/g飼料至約1500U/g飼料或更多之範圍內的蛋白酶活性。在較佳實施例中，方法可適合於測定在約40U/g飼料至約200U/g飼料範圍內之 蛋白酶活性。在例示性實施例中，方法可適合於測定在約40U/g飼料至約80U/g糊狀飼料範圍內之蛋白酶活性。在其他例示性實施例中，方法可適合於測定在約100U/g飼料至約150U/g顆粒飼料範圍內之蛋白酶活性。
II. 套組
在另一態樣中，本發明涵蓋用於量測飼料中蛋白酶活性之套組。本發明之套組可用於藉由量測由飼料中蛋白酶之活性自受質產生的信號之量來定性或定量量測蛋白酶活性。使用本發明之套組量測蛋白酶活性之方法可如以上部分(I)中所描述。
一般而言，套組包含如上文部分(I)(a)(ii)中所描述之蛋白酶受質及如以上部分(I)(a)(iii)中詳述之反應緩衝劑。一般而言，蛋白酶受質可為乾式的(亦即，粉末、顆粒、錠劑等)且反應緩衝劑可為乾式的(亦即，包含乾式組分)。在一些實施例中，套組可進一步包含如上文部分(I)(a)(v)中所描述之提取緩衝劑。可提供乾式組分混合物形式之提取緩衝劑。
在一些實施例中，套組可用於定性地量測蛋白酶活性。在實施例之較佳替代方案中，套組可包含：包含反應緩衝劑之乾式組分之第一管，該反應緩衝劑該包含磷酸鹽；包含乾式蛋白酶受質之第二管，其中該蛋白酶受質包含連接至產生信號之基團之多肽以使得在多肽藉由蛋白酶裂解後產生信號；及使用套組量測飼料中之蛋白酶活性之說明書。
在一些實施例中，套組可用於定性地量測蛋白酶活性。在實施例之較佳替代方案中，套組可包含：用於自飼料提取蛋白酶之提取緩衝劑；用於量測蛋白酶活性之蛋白酶受質，其中蛋白酶受質為連接至產生信號之基團之肽以使得在肽藉由蛋白酶裂解後產生信號；包含磷酸鹽之反應緩衝劑；及用於使用套組量測飼料中蛋白酶活性之說明 書。
定義
當介紹本文中所描述之實施例之元件時，冠詞「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」、「該(said)」欲意謂存在一或多個該等元件。術語「包含」、「包括」及「具有」意欲為包含性的且意謂可存在除所列元件之外的其他元件。
由於在不脫離本發明之範疇的情況下，可對上述化合物、產品及方法作出各種變化，因此意欲將包含於以上描述及下文給出之實例中的所有物質解釋為示意性的且非限制性意義的。
實例
包括以下實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明者所發現的完全適用於實踐本發明之技術，因此可視為組成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相似或類似結果。
實例1. 鑑別適用於蛋白酶分析之蛋白酶受質。
執行下列實驗以開發用於量測飼料中蛋白酶活性之蛋白酶分析。在此實例中，首先測試不同材料作為蛋白酶受質之適合性。受質材料包括天青染料浸染之羊毛角蛋白(亦即，角蛋白天青)、結合至雷馬素亮藍R染料(亦即，生皮-雷馬素)之經研磨動物生皮及經偶氮染料浸染之膠原蛋白(亦即，偶氮膠原蛋白)。
在37℃下，在存在含蛋白酶產品(CIBENZA® DP100，Novus International,Inc)下，在40ml 100mM Tris緩衝劑(pH 8.0)中培育材料1小時，且當與無蛋白酶下在相同緩衝劑中培育之材料相比時觀測到顯色。此實驗中所使用之含蛋白酶產品為CIBENZA® DP100(Novus International,Inc.)，即一種包含最佳化動物飼料成分中蛋白質之消化 性的固有熱穩定、強力蛋白酶之飼料添加劑。當使用生皮-雷馬素及偶氮膠原蛋白作為受質時，存在實質顏色變化(圖1B、圖1C)具有角蛋白天青之顏色變化遠不夠明顯(圖1A)。此實驗表明角蛋白天青、生皮-雷馬素亮藍R及偶氮膠原蛋白為用於分析通常添加至飼料中之蛋白酶之適合受質。
實例2. 用添加至飼料中之蛋白酶執行蛋白酶分析。
在不存在任何飼料下執行實例1中詳述之分析。在此實例中，在添加或不添加蛋白酶之飼料提取物中執行蛋白酶分析。將蛋白酶以飼料之0.025%及0.05%(w/w)之濃度添加至飼料中。用40ml 100mM Tris(pH 8.0)提取約10g添加或不添加蛋白酶之飼料，且經由0.45μm PVDF過濾器過濾，隨後在50℃下在蛋白酶受質存在下培育提取物。所用蛋白酶受質包括Protazyme AK錠劑(Megazyme International)或生皮-雷馬素亮藍R。Protazyme錠劑包含在水中快速水合但保持不可溶之天青交聯酪蛋白。藉由蛋白酶裂解釋放可溶的經染色多肽片段。所有未反應受質沈降，而所釋放之染色多肽片段將溶液變成藍色。
在此等條件下，添加與不添加蛋白酶之飼料提取物之間存在可辨別之顏色差異(圖2A、圖2B)。另外，顯色具有濃度依賴性；具有0.025%蛋白酶之飼料提取物與具有0.05%蛋白酶(w/w)之飼料提取物之間存在可辨別之顯色差異。然而，該差異僅在培育5小時後才對裸眼顯而易見。當使用Protazyme AK錠劑(圖2A)或生皮-雷馬素亮藍R(圖2B)時，存在實質顯色。生皮-雷馬素之藍色為比由Protazyme錠劑獲得之藍色更加可辨別，但背景亦暗許多。執行另一實驗，其中在定性飼料中分析中使用之前洗滌生皮-雷馬素。在對照飼料(無CIBENZA® DP100)中之背景比具有未洗滌生皮-雷馬素之飼料明亮得多，從而使得含有與缺少CIBENZA® DP100之飼料清楚地區別於彼此(資料未示)。
實例3. 尿素在蛋白酶分析中加速顯色。
儘管實例2所使用之反應條件能夠區分添加與不添加蛋白酶之飼料，但其需要5個小時來對裸眼變得顯而易見。在當前實例中，用添加尿素之飼料執行蛋白酶分析。
簡而言之，用40ml 100mM Tris(pH 9.0)提取約5g添加或不添加蛋白酶之飼料，且在執行分析之前經由0.45μm PVDF過濾器過濾。當使用時，尿素之濃度為6M。在50℃下進行分析，其中每20min混合一次。蛋白酶受質包括Protazyme AK錠劑或生皮-雷馬素亮藍R。諸如尿素及十二烷基硫酸鈉(SDS)的變性劑通常用於展開包括酶之蛋白質，從而消除其功能。出乎意料地，當尿素添加至分析緩衝劑中時，加速反應之溶液相中之蛋白質分解且因此加速顯色，以使得可在少至1-2小時內區分具有蛋白酶之飼料內與不添加蛋白酶之飼料(圖3A至圖3D、圖4A至圖4D)。
實例4. 在蛋白酶分析中SDS加速顯色。
含有6M尿素之反應物(諸如實例3中所使用之反應條件)難以過濾。因此，探尋具有相同的蛋白酶反應加速作用之替代性變性劑。亦測試變性劑SDS加速蛋白酶反應之能力。在此實例中，SDS單獨測試或與尿素組合測試。
簡而言之，用40ml 100M Tris(pH 9.0)及各種變性劑提取約5g添加或不添加蛋白酶之飼料，且經由0.45μm PVDF過濾器過濾，隨後執行分析。變性劑濃度為6M脲，0.05% SDS、0.1% SDS及0.05% SDS以及6M尿素。Protazyme AK用作受質。SDS以濃度依賴性方式單獨加速顯色以使得添加或不添加蛋白酶之飼料可在少至2小時內彼此區分(圖5C、圖5D)。在培育2小時之後，藉由0.05% SDS與6M尿素之組合達成之顯色(圖5E)與僅藉由6M尿素所達成(圖5B)無區別。重要的是，僅0.1% SDS(圖5D)產生類似於僅6M尿素(圖5B)之結果，表明在 加速蛋白酶反應中SDS可幾乎等同於6M尿素。
實例5. 用較高濃度之SDS執行之蛋白酶分析。
基於以上所見之在SDS存在下反應之濃度依賴性加速，測試較高濃度之SDS對顯色速率之影響。在此實驗中，SDS濃度為1%，且蛋白酶受質為Protazyme AK及生皮-雷馬素亮藍R。在50℃下培育反應物30分鐘或60分鐘。出人意料地，當Protazyme AK用作受質時，0.5%及1.0% SDS能夠在一定程度上加速反應以使得溶液在30分鐘後幾乎不透明(圖6A、圖6B)。此外，當生皮-雷馬素亮藍R用作受質時，緩衝劑中SDS之存在明顯加速顯色(圖6C、圖6D)。
實例6. 可在蛋白酶分析中使用磷酸鹽緩衝劑。
接著，探索使用磷酸鹽而非Tris作為緩衝劑以開發需要儘可能少設備之分析。藉由將磷酸鹽用作緩衝劑，當用水水合時，可供應粉末狀磷酸二氫鈉及磷酸氫鈉之混合物以獲得適合之pH，從而使最終使用者無需製備Tris緩衝劑，該製備將需要pH計。然而，已表明需要基本上不含磷酸鹽之緩衝劑以觀測諸如動物飼料的複雜基質中之蛋白酶活性。
用40ml 100mM磷酸鹽緩衝劑(pH 8.0)及0.05%或1% SDS提取約5g添加或不添加蛋白酶之飼料，且經由0.45μm PVDF過濾器過濾，隨後執行分析。使用Protazyme AK或生皮-雷馬素作為受質。在50℃下培育反應物30分鐘或60分鐘。出乎意料地，在將Protazyme AK或生皮-雷馬素亮藍R用作受質時，在使用磷酸鹽作為緩衝劑時，包括0.5% SDS或1.0% SDS使得無需使用基本上不含磷酸鹽之緩衝劑(圖7A至圖7D)。
實例7. 可用未經過濾之飼料提取物執行蛋白酶分析。
為更進一步簡化方法，探索消除對過濾飼料提取物之需求的可能性。藉由在40ml緩衝劑(100mM磷酸鹽(pH 8.0)+1.0% SDS)中振盪 飼料來製備飼料提取物。接著使較大飼料粒子沈降20-30秒，接著將上清液之一部分(約8ml)轉移至含有約2ml預水合受質之新管中。將Protazyme AK或生皮-雷馬素亮藍用作受質。在50℃下培育反應物30分鐘或60分鐘。在未經過濾之不具有或含有蛋白酶之飼料提取物之間存在明顯顏色差異，從而指示未經過濾飼料提取物可在方法中使用(圖8A至8D)。
實例8. 經校準以偵測飼料中蛋白酶之最小含量的蛋白酶分析的開發。
僅在存在某一最小含量之蛋白酶時經校準以產生信號之方法將適用於使用者判定飼料中是否存在足以達成所需生物作用的蛋白酶。因此，改變該方法之條件以使得約150U/g飼料之僅最小CIBENZA® DP100蛋白酶活性可偵測。
簡而言之，用40ml 100mM磷酸鹽緩衝劑(pH 8.0)及0.25% SDS提取約5g添加或不添加蛋白酶之飼料。將蛋白酶(CIBENZA® DP100)添加至0U/g飼料、75U/g飼料、150U/g飼料、225U/g飼料、300U/g飼料及375U/g飼料之濃度的飼料中。Protazyme AK用作受質。在50℃下培育反應物1小時。
藉由將SDS濃度降低至0.25%，校準該方法以使得飼料需要含有至少150U/g飼料，隨後觀測到可辨別信號(圖9)。
實例9. 使用各種飼料源分析蛋白酶。
世界區域中及之間的飼料調配物基於不同飼料成分之可用性及成本而不同。為適用於世界之不同部分，定性偵測方法必須能夠在不同飼料成分存在下偵測蛋白酶。為檢驗方法關於不同成分之穩定性，使用如實例8中所描述之分析評估含有或不存在蛋白酶產品之八種不同半純化膳食。各膳食由單一蛋白質源加上作為碳水化合物來源之澱粉組成。可在所有八種膳食中偵測蛋白酶活性，展示所有測試成分與 藉由此方法偵測蛋白酶活性均為相容的(圖10A、圖10B)。
實例10. 定量蛋白酶分析方案。
有時分析飼料中活性蛋白酶之精確量係有意義的。因此，亦開發定量方法且接著進行驗證。該定量方法藉由分光光度法量測發色團對硝基醯基替苯胺(pNA)將飼料中之活性蛋白酶定量，pNA在將發色團連結至肽之醯胺鍵裂解後自合成肽受質丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO：1)-對硝基醯基替苯胺釋放。藉由量測410nm下之光學密度偵測游離發色團。該方法之步驟由以下各者組成：(1)藉由研磨飼料且接著混合飼料與pH 10.0之由100mM四硼酸鈉及Tween® 20組成之提取緩衝劑來製備飼料；(2)製備反應物，該反應物由(a)包含pH 10之磷酸氫鈉的反應緩衝劑、(b)受質及(c)飼料提取物之一部分組成，接著在37℃下培育以使得飼料提取物中之蛋白酶可裂解受質；及(3)用包含乙酸及十二烷基硫酸鈉之溶液終止反應，接著藉由量測410nm下之光學密度定量由蛋白酶裂解之受質的量。對方法進行驗證程序且認為適用於其預定目的。
實例11. 定量量測客戶之飼料樣品中的CIBENZA ® DP100蛋白酶。
對客戶提供之飼料樣品執行定量分析。該分析如實例10中所描述。飼料樣品包括不存在蛋白酶之對照膳食飼料樣品及含有添加建議劑量之CIBENZA® DP100的兩種飼料樣品。對照膳食中之蛋白酶活性低於偵測限，而在含有CIBENZA® DP100之膳食中蛋白酶活性為292U/g及279U/g，其分別表示蛋白酶活性之建議劑量之97%及93%。
亦對不同客戶提供之飼料樣品執行定量分析。飼料樣品包括具有CIBENZA® DP100之四種飼料樣品，其中兩者呈糊狀形式且其中兩者經粒化。兩種糊狀膳食中之蛋白酶活性為316U/g及321U/g，而兩種顆粒狀膳食中之蛋白酶活性為263U/g及280U/g。在此等樣品中所量測之蛋白酶活性表示蛋白酶活性之建議劑量之105%、107%、88% 及93%。
<110> 美商諾華斯國際股份有限公司 德魯 L 列支敦斯登 艾咪 羅宏
<120> 量測飼料中蛋白酶活性之方法及套組
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<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> 合成
<400> 4

Claims (25)

  1. 一種用於量測飼料樣品中蛋白酶活性之方法，該方法包含：(a)藉由組合該飼料樣品、蛋白酶受質及包含磷酸鹽之反應緩衝劑製備反應混合物，其中該蛋白酶受質包含連接至產生信號之基團之多肽，該產生信號之基團在該蛋白酶受質受到蛋白質水解作用裂解時會產生信號；(b)在允許該蛋白酶受質裂解之條件下培育該反應混合物，以便產生該信號；及(c)藉由量測該信號來量測該反應混合物中之蛋白酶活性。
  2. 如請求項1之方法，其中該飼料樣品為粉狀動物飼料或顆粒狀動物飼料。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該蛋白酶為源自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)之蛋白酶。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該蛋白酶受質之該產生信號之基團為發色團、螢光團或放射性同位素。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該反應緩衝劑包含約50mM至約200mM之約pH 7至約pH 11的磷酸鹽緩衝劑，且視情況包含約0.1%至約10%十二烷基硫酸鈉(SDS)。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該蛋白酶受質之該產生信號之基團為發色團，且經由目視檢查由該發色團產生之信號所引起的顏色變化來定性量測。
  7. 如請求項6之方法，其中該蛋白酶受質為不可溶性。
  8. 如請求項7之方法，其中該蛋白酶受質之該多肽為酪蛋白、膠原蛋白或明膠，且該蛋白酶受質之該產生信號之基團為天青染料(azurine dye)。
  9. 如請求項6之方法，其中該反應緩衝劑包含100mM之約pH 8的磷酸鈉緩衝劑及0.25% SDS。
  10. 如請求項6之方法，其中在步驟(a)之前先混合該飼料樣品與包含磷酸鹽之反應緩衝劑，製備飼料提取物，且使該飼料樣品在該飼料提取物中沈降；且由該飼料提取物之等分試樣與該蛋白酶受質混合，來製備該反應混合物。
  11. 如請求項10之方法，其中在製備該飼料提取物之前不研磨該飼料樣品。
  12. 如請求項10之方法，其中在與該蛋白酶受質混合之前先過濾該飼料提取物。
  13. 如請求項6之方法，其中在約50℃下培育該反應混合物約15min至約90min。
  14. 如請求項1或2之方法，其中藉由分光光度法量測所產生信號來定量量測。
  15. 如請求項14之方法，其中在步驟(a)之前製備蛋白酶提取物，其係形成包含該飼料樣品及提取緩衝劑之混合物，且使該混合物澄清化以形成該蛋白酶提取物。
  16. 如請求項15之方法，其中該飼料樣品先研磨至1mm或更小之粒度後才與該提取緩衝劑混合。
  17. 如請求項15之方法，其中該提取緩衝劑包含約50mM至約200mM之約pH 9至約pH 11的硼酸鹽，及約0.2%至約1.0%重量計之非離子界面活性劑。
  18. 如請求項17之方法，其中該提取緩衝劑包含100mM之約pH 10的硼酸鈉，及約0.5%重量計之聚氧乙烯(20)山梨糖醇單油酸酯。
  19. 如請求項15之方法，其中藉由混合該蛋白酶提取物之等分試樣與包含磷酸鹽之該反應緩衝劑及該蛋白酶受質來製備該反應混 合物。
  20. 如請求項14之方法，其中該蛋白酶受質係可溶性，且該產生信號之基團為發色團。
  21. 如請求項14之方法，其中該蛋白酶受質為N-丁二醯基-Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO：1)-對硝基醯基替苯胺。
  22. 如請求項14之方法，其中該反應緩衝劑包含100mM之約pH 10之磷酸鈉緩衝劑。
  23. 如請求項14之方法，其中在約37℃下培育該反應混合物約60min。
  24. 一種用於量測飼料樣品中蛋白酶活性之套組，該套組包含：(a)蛋白酶受質，其包含連接至產生信號之基團之多肽，該產生信號之基團在該多肽受到蛋白質裂解作用時會產生信號；及(b)反應緩衝劑，其包含磷酸鹽。
  25. 如請求項24之套組，其進一步包含用於自該飼料樣品提取蛋白酶之提取緩衝劑。
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