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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren bei mehreren Wellenlängen zum
Analysieren von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten in
einer Probe in einem Reaktionssystem. Die vorliegende Erfindung
ist besonders nützlich
in den Fachgebieten der Umweltuntersuchung, Lebensmittelkontrolle
und der medizinischen Diagnose.
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2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN
FACHGEBIETS
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Das Fluoreszenzpolarisationsverfahren
ist im Stand der Technik bekannt als ein Verfahren zur Untersuchung
einer Substanz in einer Probe. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip,
dass, wenn eine fluoreszenzmarkierte Verbindung durch linear polarisiertes
Licht angeregt wird, die von der Verbindung emittierte Fluoreszenz
einen Polarisationsgrad hat, der im Verhältnis zu dem Molekulargewicht
davon steht.
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Als ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren, das
entwickelt wurde, gibt es einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay,
der auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion
basiert.
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Zum Beispiel offenbart das US-Patent
Nr. 4,902,630 ein Nachweisverfahren, in welchem eine Körperflüssigkeit
(insbesondere Blut), das CRP enthält, also ein Testobjekt, zu
einer vermischten Lösung hinzugefügt wird,
die Folgendes enthält:
eine "fluoreszierende
Substanz", erhalten
durch die Bindung von Fluorescein, einem Fluorochrom, an C-reaktives Protein
(CRP); und einen Antikörper,
der in der Lage ist, spezifisch an CRP zu binden. CRP in der Probe wird
basierend auf der Konkurrenz um die Bindung des Antikörpers zwischen
der fluoreszierenden Substanz und CRP in der vermischten Lösung nachgewiesen.
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Die japanische Offenlegungsschrift
Nr. 3-188374 offenbart ein Verfahren, in welchem ein fluoreszenzmarkiertes
Teilchen, das ein unlösliches Trägerteilchen
umfasst, welches ein Fluorochrom (oder einen Phosphoreszenzfarbstoff)
und ein Antigen (oder einen Antikörper) trägt, mit einer Probenlösung, die
einen Antikörper
(oder ein Antigen) enthält, zur
Reaktion gebracht wird. Der Antikörper (oder ein Antigen) in
der Probe wird basierend auf der Aggregation der Teilchen wegen
einer Antigen-Antikörper-Reaktion
nachgewiesen.
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Die gewöhnlichen Verfahren sind jedoch
gestaltet, um nur eine Substanz in einer Probe nachzuweisen, und
können
nicht zwei oder mehr unterschiedliche Substanzen in einer Probe
in einem Reaktionssystem nachweisen. Demgemäß bestand im Stand der Technik
ein Bedarf für
die Entwicklung eines Verfahrens, das geeignet ist für den Nachweis von
zwei oder mehr verschiedenen Substanzen in einer Probe in einem
Reaktionssystem.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem Aspekt dieser Erfindung
wird ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren bei mehreren Wellenlängen bereitgestellt,
um zwei oder mehr unterschiedliche Testobjekte in einer Probe zu
analysieren. Das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein:
(a) Bereitstellen von zwei oder mehr verschiedenen fluoreszenzmarkierten
Substanzen, wobei jede eine Substanz ist, die in der Lage ist, spezifisch
an jeweils eines der Testobjekte zu binden, und die kovalent an
ein Fluorochrom gebunden ist, worin die Fluorochrome der fluoreszenzmarkierten
Substanzen voneinander verschieden sind; (b) Binden lassen der fluoreszenzmarkierten
Substanzen an die zwei bzw. mehr verschiedenen Testobjekte; und
(c) Messen einer Änderung
in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation, die in jeder der fluoreszenzmarkierten
Substanzen durch deren Bindung an eines der Testobjekte stattgefunden
hat.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
jede der zwei oder mehr verschiedenen Testobjekte unabhängig voneinander
eine biologische Substanz, ein Mikroorganismus, ein Virus, ein Arzneimittel,
ein Umweltschadstoff oder eine missbrauchte Droge.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
die biologische Substanz ein Peptid, ein Protein, ein Lipid, ein
Saccharid oder eine Nukleinsäure.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
das Protein ein Antikörper,
ein Hormon, ein Entzündungsmarker,
ein Gerinnungsfaktor, ein Apolipoprotein, ein Lipoprotein hoher
Dichte (HDL), ein Lipoprotein niedriger Dichte (LDL), ein glykolysiertes
Albumin, ein glykolysiertes Hämoglobin,
ein Hämoglobin
oder ein Enzym.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
das Hormon Choriongonadotropin, thyroidstimulierendes Hormon, Progesteron,
follikel-stimulierendes Hormon, parathyroidstimulierendes Hormon,
adrenocorticotropes Hormon oder Insulin.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
der Entzündungsmarker
C-reaktives Protein (CRP), α1-Antitrypsin
(α1-AT), α1-Antichymotrypsin (α1-X), saures α1-Glycoprotein (α1-AG), Haptoglobin (HP),
Zeruloplasmin (Cp), die 9. Komplementkomponente (C9), die 4. Komplementkomponente
(C4), die 3. Komplementkomponente (C3), Komplementfaktor B (B),
Fibrinogen (Fbg), Serumamyloid A (SAA), C1-Inhibitor (C1I), ein
Sialoglycoprotein, ein säurelösliches
Protein (ASP) oder ein saures immunsuppressives Protein (IAP).
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
der Mikroorganismus Staphylococcus, Sarcina, Spirillum, Streptococcus,
Coccobazillus, Bazillus, Spirochaeta, Tetracoccus, Kommabazillus
oder Actinomyces.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
die spezifisch bindende Substanz ein Protein, welches ein Antikörper, ein
Antigen, ein Rezeptor oder ein Inhibitor ist.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist
der Antikörper
ein Satz an polyclonalen Antikörpern,
ein monoclonaler Antikörper,
ein chimärer
Antikörper,
ein Fab-Antikörper
oder ein (Fab)2-Antikörper.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung hat
das Fluorochrom eine funktionelle Gruppe, die an eine primäre, sekundäre oder
tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe binden kann.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung liegt
eine Lebenszeit der Fluoreszenz des Fluorochroms in dem Bereich
von ungefähr
0,1 Nanosekunden bis ungefähr
500 Nanosekunden.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung hat
das Fluorochrom eine Skelettstruktur von Fluoreszein, Dansyl, Pyren,
Rhodamin, Dialkylaminonaphthalin, Dialkylaminonaphthalinsulfonyl,
Cyanin oder Indolenin.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird
jedes der Fluorochrome ausgewählt,
so dass das Fluorochrom unterschiedlich ist von den anderen Fluorochromen
hinsichtlich eines unter der Anregungswellenlänge, der Fluoreszenzwellenlänge und der
Lebensdauer der Fluoreszenz.
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Gemäß einem anderen Aspekt dieser
Erfindung wird ein Kit zur Verwendung in einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren
bei mehreren Wellenlängen
bereitgestellt für
die Analyse von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten in
einer Probe. Der Kit schließt
zwei oder mehr verschiedene fluoreszenzmarkierte Substanzen ein,
wobei jede eine Substanz ist, die spezifisch an jeweils eines der
Testobjekte binden kann und die kovalent an ein Fluorochrom gebunden
ist, worin die Fluorochrome der fluoreszenzmarkierten Substanzen
voneinander unterschiedlich sind.
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Gemäß noch einem weiteren Aspekt
dieser Erfindung wird ein System bereitgestellt zur Verwendung in
einem Fluoreszenzpolarisationsverfahren bei mehreren Wellenlängen für die Analyse
von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten in einer Probe.
Das System schließt
ein: (a) zwei oder mehr unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Substanzen, wobei
jede eine Substanz ist, die spezifisch an jeweils eines der Testobjekte
binden kann und die kovalent an ein Fluorochrom gebunden ist, worin
die Fluorochrome der fluoreszenzmarkierten Substanzen voneinander
unterschiedlich sind; und (b) Mittel zum Messen des Grades der Fluoreszenzpolarisierung.
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In dem Nachweissystem gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung wird eine Änderung im Molekulargewicht,
die stattgefunden hat in jeder fluoreszenzmarkierten Substanz durch
ihre Bindung an ein Testobjekt, gemessen als eine Änderung über die
Zeit in der Molekülorientierung.
Folglich ist es möglich,
in einem einzelnen Vorgang zwei oder mehr unterschiedliche Testobjekte
mit unterschiedlichen Molekulargewichten zu analysieren durch die
angemessene Auswahl der als Markierungen verwendeten Fluorochromtypen
im Hinblick auf die Änderung im
Molekulargewicht vor und nach der Bindung der Fluorochrome.
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Folglich ermöglicht die hierin beschriebene Erfindung
die Vorteile von (1) Bereitstellen eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bei mehreren Wellenlängen
für die
Analyse von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten, die in
einer Probe enthalten sind, in einem Reaktionssystem durch Messen
einer Änderung
in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation für jedes der Testobjekte; (2)
Bereitstellen eines Kits für
die Analyse von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten, die
in einer Probe enthalten sind, unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bei mehreren Wellenlängen;
und (3) Bereitstellen eines Systems für die Analyse von zwei oder
mehr unterschiedlichen Testobjekten, die in einer Probe enthalten
sind, unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bei mehreren Wellenlängen.
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Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden für
Fachleute augenscheinlich werden, nach dem Lesen und Verstehen der
folgenden detaillierten Beschreibung, mit Bezug auf die begleitende
Zeichnung.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm, das die Ergebnisse einer gleichzeitigen Messung von
CRP und CG unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bei mehreren Wellenlängen
zeigt.
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2 ist
ein Diagramm, das die Ergebnisse einer gleichzeitigen Messung von
CRP und Amyloid A unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsverfahrens
bei mehreren Wellenlängen
zeigt.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Die vorliegende Erfindung wird unten
detaillierter beschrieben werden.
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Gemäß dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren
bei mehreren Wellenlängen
der vorliegenden Erfindung ist es möglich, zwei oder mehr unterschiedliche
Testobjekte in einer Probe in einem Reaktionssystem zu analysieren,
das heißt,
zu quantifizieren oder nachzuweisen, basierend auf dem oben beschriebenen
Prinzip des Fluoreszenzpolarisationsverfahrens.
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Durch das kovalente Binden der Substanz, die
spezifisch an das Testobjekt binden kann (nachfolgend wird hierauf
Bezug genommen als die "spezifisch
bindende Substanz"),
mit einem Fluorochrom, wird eine fluoreszenzmarkierte Substanz bereitgestellt,
die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist.
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Die spezifisch bindende Substanz
kann jede Substanz sein, solange sie eine gewünschte Bindungseigenschaft
bezüglich
dem Testobjekt hat und solange sie eine funktionelle Gruppe hat,
die die Bindung an das Fluorochrom ermöglicht. Die spezifisch bindende
Substanz ist vorzugsweise ein Protein und noch bevorzugter ein Protein,
das klassifiziert ist als irgendeines unter Antikörpern, Antigenen,
Rezeptoren oder Inhibitoren. Ein Antikörper ist besonders bevorzugt
wegen seines breiten Anwendungsspektrums. Der Antikörpertyp
schließt
polyclonale Antikörper,
einen monoclonalen Antikörper,
einen chimären Antikörper, einen
Fab-Antikörper
und einen (Fab)2-Antikörper
ein. Jeder Antikörpertyp
kann in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Ein Antigen wird typischerweise in dem Fall verwendet, wo das Testobjekt
ein Antikörper
ist. Ein Rezeptor kann verwendet werden in dem Fall, wo das Testobjekt
als ein Ligand für
den Rezeptor wirkt. Ein Inhibitor kann beispielsweise verwendet
werden in dem Fall, wo das Testobjekt ein Enzym ist.
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Als das Fluorochrom werden jene mit
einer funktionellen Gruppe verwendet, die kovalent an eine funktionelle
Gruppe der spezifisch bindenden Substanz gebunden werden kann. Die
funktionelle Gruppe der spezifisch bindenden Substanz ist typischerweise
eine primäre,
sekundäre
oder tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe. Insbesondere in dem
Fall, wo ein Protein, wie z. B. ein Antikörper, als die spezifisch bindende Substanz
verwendet wird, wird hinsichtlich der Bindungseffizienz ein Fluorochrom
mit einer aktivierten funktionellen Gruppe, z. B. einer halogenierten
Sulfonylgruppe, einer Carboxylgruppe mit Succinimid, oder einer
primären
Aminogruppe mit Isothiocyan, gewünscht.
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Die Zahl der an ein zu markierendes
Objekt, das heißt
der spezifisch bindenden Substanz, gebundenen Fluorochrommoleküle kann
willkürlich
variiert werden. Es ist bevorzugt, um die Nachweisempfindlichkeit
zu erhöhen,
zwei oder mehr Fluorochrome zu binden. Wenn jedoch mehr Fluorochrome
als notwendig gebunden werden, kann dies eine Eigenschaft der spezifisch
bindenden Substanz nachteilig beeinflussen. Zum Beispiel kann die
Affinität,
Löslichkeit
oder Ähnliches
des Antikörpers
reduziert werden. Deswegen liegt die oben beschriebene Bindungszahl
vorzugsweise bei ungefähr
10 oder weniger und noch bevorzugter bei ungefähr eins.
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Die vorliegende Erfindung verwendet
unterschiedliche Fluorochrome für
unterschiedliche Testobjekte, um zwei oder mehr unterschiedliche
Testobjekte in einem Reaktionssystem zu analysieren. Die Kombination
der Fluorochrome wird vorzugsweise so gewählt, dass jedes Fluorochrompaar
unterschiedlich ist voneinander hinsichtlich mindestens eines unter
der Anregungswellenlänge,
der Fluoreszenzwellenlänge
und der Lebensdauer der Fluoreszenz. Um das Testvorgehen zu vereinfachen,
sind die ausgewählten
Fluorochrome vorzugsweise unterschiedlich voneinander hinsichtlich
von entweder oder sowohl der Anregungswellenlänge und der Fluoreszenzwellenlänge, besonders
der Anregungswellenlänge.
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Wenn die Skelettstruktur des zu verwendenden
Fluorochroms ausgewählt
wird, sind die Anregungswellenlänge,
die Fluoreszenzwellenlänge,
die Verschiebung nach Stokes und die Lebenszeit der Fluoreszenz
wichtig. Vorzugsweise liegen entweder oder sowohl die Anregungswellenlänge als
auch die Fluoreszenzwellenlänge
im Wellenlängenbereich des
sichtbaren Lichtes, das heißt
300 nm bis 700 nm. Vorzugsweise beträgt der Unterschied in der Wellenlänge zwischen
der Anregungswellenlänge
und der Fluoreszenzwellenlänge,
das heißt
der Verschiebung nach Stokes, wenigstens 20 nm oder mehr. Die Lebensdauer
der Fluoreszenz (die Fluoreszenzrelaxationszeit) des Fluorochroms
wird typischerweise in dem Bereich von ungefähr 0,1 Nanosekunden bis ungefähr 1.000
Nanosekunden ausgewählt.
Beim Auswählen
der Lebensdauer der Fluoreszenz wird die Änderung im Molekulargewicht
der fluoreszenzmarkierten Substanz durch die Bindung des Testobjektes in
Betracht gezogen. Dies liegt daran, dass der Polarisationsgrad der
von der fluoreszenzmarkierten Substanz, die an das Testobjekt gebunden
ist, emittierten Fluoreszenz, sich in einer proportionalen Beziehung mit
der Größe des Moleküls befindet.
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Besonders wird, wenn die Änderung
im Molekulargewicht ungefähr
5.000 bis ungefähr
50.000 beträgt,
das heißt
wenn das Molekulargewicht des Testobjektes etliche Tausend bis etliche
Zehntausend beträgt,
ein Fluorochrom mit einer Lebensdauer der Fluoreszenz von ungefähr 1 bis
15 Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms schließen Dansylderivate
und Fluorescein ein. Wenn die Änderung
im Molekulargewicht ungefähr
50.000 bis ungefähr
500.000 beträgt,
das heißt,
wenn das Molekulargewicht des Testobjektes ungefähr etliche Zehntausend bis
etliche Hunderttausend beträgt, wird
ein Fluoro chrom mit einer Lebensdauer der Fluoreszenz von ungefähr 10 Nanosekunden
bis ungefähr
150 Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms schließen Dansylderivate
und Pyrenderivate ein. Wenn die Änderung
in dem Molekulargewicht ungefähr
500.000 bis ungefähr 5.000.000
beträgt,
das heißt,
wenn das Molekulargewicht des Testobjektes ungefähr etliche Hunderttausend bis
etliche Millionen beträgt,
wird ein Fluorochrom mit einer Lebensdauer der Fluoreszenz von ungefähr 100 Nanosekunden
bis ungefähr
1.000 Nanosekunden bevorzugt. Beispiele solch eines Fluorochroms
schließen
Pyrenderivate und Metallkomplexe ein.
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Von den oben beschriebenen Gesichtspunkten
aus betrachtet, schließen
bevorzugte Beispiele an Fluorochromen Fluorochrome mit einer Skelettstruktur
von Rhodamin, Pyren, Fluorescein, Dialkylaminonaphthalin, Dialkylaminonaphthalinsulfonyl, Cyanin
oder Indolenin ein. Ein besonders bevorzugtes Fluorochrom kann ein
Fluorochrom mit einer Skelettstruktur von Fluorescein, Dansyl oder
Pyren sein.
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Die Reaktion der Bildung der kovalenten
Bindung zwischen der spezifisch bindenden Substanz und dem Fluorochrom
kann gemäß den Bedingungen
durchgeführt
werden, die Fachleuten wohl bekannt sind. Wenn die spezifisch bindende
Substanz eine primäre,
sekundäre
oder tertiäre
Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Phenylgruppe,
eine Phenolgruppe oder eine Hydroxylgruppe hat, kann die kovalente
Bindung gebildet werden, indem man die spezifisch bindende Substanz
mit dem Fluorochrom, das eine aktivierte funktionelle Gruppe hat,
normalerweise bei Raumtemperatur für etliche Stunden reagieren
lässt.
Nach dem Abschluss der Reaktion kann nicht umgesetztes Fluorochrom
leicht durch ein gewöhnliches
Verfahren entfernt werden, z. B. durch Gelfiltration oder Dialyse. Die
spezifisch bindende Substanz und das Fluorochrom können direkt
oder indirekt durch ein bifunktionelles Linker-Molekül oder Ähnliches
gebunden sein.
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Durch die Verwendung von geeignet
ausgewählten
zwei oder mehr der oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Substanzen
können
zwei oder mehr unterschiedliche Testobjekte in einer Probe wie folgt
analysiert werden.
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Die Probe, die zwei oder mehr unterschiedliche
Testobjekt enthält,
und die fluoreszenzmarkierten Substanzen werden miteinander vermischt
in einer Lösung,
um den Grad der Fluoreszenzpolarisation der fluoreszenzmarkierten
Substanz in der vermischten Lösung
zu messen. Falls nötig
werden die zwei oder mehr unterschiedlich fluoreszenzmarkierten
Substanzen in einer Lösung
vermischt, und falls nötig
wird der Grad der Fluoreszenzpolarisation jeder der fluoreszenzmarkierten
Substanzen in der Abwesenheit des Testobjektes ebenfalls gemessen.
Jeder Polarisationsmessapparat kann verwendet werden, um den Grad
der Fluoreszenzpolarisation zu messen. Die Messung wird bei einer
schonenden Temperatur (ungefähr
zehn Grad Celsius (°C)
bis ungefähr 40°C) und vorzugsweise
bei einer konstanten Temperatur gemessen.
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Die Messung des Grades der Fluoreszenzpolarisation
kann durchgeführt
werden durch Messen des Grades nach einer vorbestimmten Zeit nach
dem Mischen der Testobjekte und der fluoreszenzmarkierten Substanzen
oder durch Messen einer Änderung in
dem Grad der Fluoreszenzpolarisation über eine Zeiteinheit. Durch
das Messen zu einem Zeitpunkt, in dem die Bindung zwischen jedem
Testobjekt und der korrespondierenden fluoreszenzmarkierten Substanz
vollständig
beendet ist, werden reproduzierbarere Messwerte erhalten. Durch
Messen der Änderung
in dem Grad der Fluoreszenzpolarisation über eine Zeiteinheit, während die
Bindungsreaktion zwischen jedem Testobjekt und der korrespondierenden fluoreszenzmarkierten
Substanz fortschreitet, ist auf der anderen Seite eine schnellere
Messung möglich. Für die Zwecke
der Quantifizierung des in der Probe enthaltenen Testobjektes wird
eine Standardkurve durch eine Messung des Grades der Fluoreszenzpolarisation
unter Verwendung einer Lösung,
die eine bekannte Konzentration des Testobjektes enthält, bereitgestellt,
um sie mit dem gemessenen Wert für
die Probe zu vergleichen.
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Die Probe, von der beabsichtigt wird,
dass sie in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
ist ein Material, das zwei oder mehr Testobjekte einschließt, von
denen gewünscht
wird, dass sie in irgendwelchen Fachgebieten analysiert werden,
einschließlich
Umweltuntersuchung, Lebensmittelkontrolle und medizinische Diagnostik. Beispielhafte
Proben für
Umweltuntersuchungen schließen
Materialien ein, die gewonnen sind aus Erde, einem Fluss, der Luft
oder Ähnlichem.
Beispielhafte Proben für
die Lebensmittelkontrolle schließen einen Extrakt aus gemahlenem
Fleisch und einen Extrakt von einem Hackbrett ein. Beispielhafte
Proben für
die medizinische Diagnose schließen Körperflüssigkeiten, einschließlich einer
Blut-, einer Lymph- und einer Gewebeflüssigkeit ein. Die Probe kann
in irgendeiner Form sein, solange sie in dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann.
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Die Testobjekte des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung schließen
ein, aber sind nicht begrenzt auf eine biologische Substanz, einen
Mikroorganismus, ein Virus, ein Arzneimittel, ein Umweltschadstoff
oder eine missbrauchte Droge.
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Die biologische Substanz bezieht
sich auf irgendeine organische oder anorganische Substanz, die in
dem Körper
eines Menschen oder eines anderen Säugers vorkommt. Typische Beispiele
der biologischen Substanz schließen ein Peptid, ein Protein, ein
Lipid, ein Saccharid und eine Nukleinsäure ein. Der Mikroorganismus
schließt
ein Bakterium, einen Pilz oder einen Einzeller ein. Das Virus schließt ein bakterielles
Virus, ein Pflanzenvirus und ein Tiervirus ein. Das Arzneimittel
schließt
jedes Mittel ein, das verwendet wird für die Behandlung oder Diagnose
eines Menschen oder anderer Säuger.
Beispiele des Arzneimittels schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf
Digoxin und Cyclopoietin. Der Umweltschadstoff schließt jede
Substanz ein, die Umweltverschmutzung erzeugt, welche nachgewiesen
werden kann im Boden, einem Fluss, der Luft oder Ähnlichem.
Beispiele des Umweltschadstoffes schließen ein, aber sind nicht begrenzt
auf umweltschädliche
Hormone, wie z. B. Dioxin. Die missbrauchte Droge bezieht sich auf
eine Droge, deren Einnahme durch einen Menschen durch Gesetz oder
Verordnung beschränkt
ist und welche unter Verletzung der Beschränkung verwendet wurde. Beispiele
missbrauchter Drogen schließen
ein, aber sind nicht begrenzt auf Kokain, Methamphetamin, Opium
und Morphin.
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Die vorliegende Erfindung stellt
auch einen Kit bereit, der geeignet ist für die Verwendung im oben beschriebenen
Verfahren, umfassend zwei oder mehr fluoreszenzmarkierte Substanzen.
Die fluoreszenzmarkierten Substanzen können in einem versiegelten
Behälter
einzeln oder in Kombination enthalten sein. Die fluoreszenzmarkierte
Substanz kann in zahl reichen Formen bereitgestellt sein, wie z. B.
in einer trockenen Form, in einer Lösungsform, worin die Substanz
in einer Pufferlösung
oder Ähnlichem
gelöst
ist. Der Kit kann auch, wenn nötig,
eine Standardlösung,
die eine bekannte Konzentration eines Testobjektes enthält, ein
Verdünnungsmittel
und eine Gebrauchsanweisung einschließen.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiterhin ein System für
die Analyse von zwei oder mehr unterschiedlichen Testobjekten bereit,
umfassend die oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Substanzen
und einen Fluoreszenzpolarisationsmessapparat. Das System kann,
wo nötig,
andere Substanzen und Apparate, wie z. B. einen Apparat für die Vorbehandlung
einer Probe, einen Computer für
die automatisierte Analyse gemessener Daten und Ähnliches einschließen.
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Die folgenden Beispiele der Erfindung
dienen der Illustration, aber nicht der Beschränkung der vorliegenden Erfindung.
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BEISPIELE
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(Beispiel 1)
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Unten werden die Ergebnisse von Messungen
in einem Reaktionssystem für
zwei unterschiedliche Testobjekte: Choriongonadotropin (CG; Molekulargewicht
von ungefähr
37.000) und C-reaktives Protein (CRP; Molekulargewicht von ungefähr 120.000)
gemäß der vorliegenden
Erfindung beschrieben werden. F-4000, hergestellt von Hitachi Ltd.,
wurde als ein Apparat für
das Messen des Grades der Fluoreszenzpolarisation verwendet.
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1. Zubereitung
dansylmarkierter anti-CG-polyclonaler Antikörper
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Ein Satz an dansylmarkierten anti-CG-polyclonalen
Antikörpern
wurde zubereitet, wie unten beschrieben, unter Verwendung von anti-CG-polyclonalen
Antikörpern
(erhalten von Bio Reactive) und Dansylchlorid (erhalten von Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.).
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Eine Lösung (ungefähr 1000 μl), die ungefähr 2,0 mg/ml
der anti-CG-polyclonalen Antikörper
in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) (pH: ungefähr 7,4)
enthält,
wurde mit einer Lösung
(ungefähr
20 μl) vermischt,
die ungefähr
1,00 mg/ml Dansylchlorid (10-fache
Menge der Antikörper),
gelöst
in Aceton, enthält.
Man ließ die
vermischte Lösung
bei ungefähr
4°C für ungefähr 24 Stunden
unter Rühren reagieren.
Die reagierte Lösung
wurde einer Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) ausgesetzt (Größe: ungefähr 10 × 60 mm,
Durchflussgeschwindigkeit ungefähr
2 ml/min). Nicht umgesetztes Dansylchlorid wurde entfernt und Fraktionen,
die die dansylmarkierten anti-CG-polyclonalen Antikörper enthielten,
wurden gesammelt.
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Die gesammelten Fraktionen wurde
verwendet, um die Markierungsmenge und die Fluoreszenzeigenschaft
der zubereiteten dansylmarkierten anti-CG-polyclonalen Antikörper zu
beurteilen. Die Markierungsmenge wurde gemessen unter Verwendung eines
im ultravioletten/sichtbaren Bereich arbeitenden Spektrometers (hergestellt
von Shimadzu Corp., UV-1600PC),
wobei eine Markierung von ungefähr 0,2
Dansyl pro einem Molekül
der anti-CGpolyclonalen Antikörper
bestätigt
wurde. Die Fluoreszenzeigenschaft wurde gemessen unter Verwendung
eines Fluoreszenzspektrometers (hergestellt von Shimadzu Corp.,
RF-5300PC), wobei
bestätigt
wurde, dass die Fluoreszenzeigenschaft von Dansyl, gebunden an die
anti-CG-polyclonalen Antikörper,
der Gestalt war, dass die Anregungswellenlänge bei ungefähr 335 nm
lag, die resultierende Fluoreszenzwellenlänge bei ungefähr 520 nm
lag und die Lebensdauer der Fluoreszenz ungefähr 12 Nanosekunden betrug.
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2. Zubereitung
von pyrenmarkierten anti-CRP-polyclonalen Antikörpern
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Ein Satz an pyrenmarkierten anti-CRP-polyclonalen
Antikörpern
wurde zubereitet, wie unten beschrieben, unter Verwendung von anti-CRP-polyclonalen
Antikörpern
(erhalten von Bio Reactive) und Succinimidylpyrenbutyrat (SPB) (erhalten
von Molecular Probes, Inc.).
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Eine Lösung (ungefähr 1000 μl), die ungefähr 2,0 mg/ml
der anti-CRP-polyclonalen Antikörper in
einer phosphatgepufferten Salzlösung
(PBS) (pH: ungefähr
7,4) enthielt, wurde mit einer Lösung
(ungefähr
20 μl) vermischt,
die ungefähr
1,29 mg/ml SPB (5-fache Menge der Antikörper), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO),
enthielt. Man ließ die
vermischte Lösung
bei Raumtemperatur für
ungefähr
4 Stunden unter Rühren
reagieren. Die reagierte Reaktion wurde einer Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule (Pharmacia)
(Größe: ungefähr 10 × 60 mm,
Durchflussgeschwindigkeit ungefähr
2 ml/min) ausgesetzt. Nicht umgesetztes SPB wurde entfernt und Fraktionen,
die pyrenmarkierte anti-CRP-polyclonale Antikörper enthielten, wurden gesammelt.
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Die gesammelten Fraktionen wurden
verwendet, um die Markierungsmenge und die Fluoreszenzeigenschaft
der zubereiteten pyrenmarkierten anti-CRP-polycloralen Antikörper zu
beurteilen. Die Markierungsmenge wurde gemessen unter Verwendung
eines im ultravioletten/sichtbaren Bereich arbeitenden Spektrometers
(hergestellt von Shimadzu Corp., UV-1600PC), wobei eine Markierung von ungefähr 1,1 Pryenen
pro einem Molekül
der anti-CRP-polyclonalen
Antikörper
bestätigt
wurde. Die Fluoreszenzeigenschaft wurde gemessen unter Verwendung
eines Fluoreszenzspektrometers (hergestellt von Shimadzu Corp.,
RF-5300PC), wobei herausgefunden wurde, dass die Fluoreszenzeigenschaft
von an die anti-CRP-polyclonalen Antikörper gebundenem Pyren der Gestalt
war, dass die Anregungswellenlänge
bei ungefähr
330 nm lag, die resultierenden Fluoreszenzwellenlängen bei
ungefähr
373 nm und ungefähr
397 nm lagen, und die Lebensdauer der Fluoreszenz ungefähr 60 Nanosekunden
betrug. Da die Fluoreszenzintensität bei ungefähr 397 nm größer war,
wurden als die mit dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren zu verwendenden
Messbedingungen festgelegt, die Anregungswellenlänge von ungefähr 330 nm
und die Fluoreszenzwellenlänge von
ungefähr
397 nm zu verwenden.
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3. Gleichzeitige
Messung von CRP und CG
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Die Mengen von CRP und CG in Proben
wurden durch Messen der Fluoreszenzpolarität unter Verwendung der in Beispiel
1.1 zubereiteten dansylmarkierten anti-CG-polyclonalen Antikörper und
der in Beispiel 1.2 zubereiteten pyrenmarkierten anti-CRP-polyclonalen
Antikörper
bestimmt.
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Eine Lösung (ungefähr 350 μl), die die pyrenmarkierten
anti-CRP-polyclonalen Antikörper
in einer Konzentration von ungefähr
400 μg/ml
enthielt, wurde mit einer anderen Lösung (ungefähr 350 μl) vermischt, die die dansylmarkierten
anti-CG-polyclonalen Antikörper
in einer Konzentration von ungefähr 400 μg/ml enthielt.
Die vermischte Lösung
wurde in eine Küvette
(ungefähr
5 × 5
mm) gegeben, um den Grad der Fluoreszenzpolarisation zu messen.
Die Messbedingungen für
die pyrenmarkierten anti-CRP-polyclonalen Antikörper waren wie folgt: eine Messtemperatur
von ungefähr
35°C, eine
Anregungswellenlänge
von ungefähr
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von ungefähr
397 nm und ein G-Faktor von ungefähr 0,942. Die Messbedingungen für die dansylmarkierten
anti-CG-polyclonalen Antikörper
waren wie folgt: eine Messtemperatur von ungefähr 35°C, eine Anregungswellenlänge von
ungefähr
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von ungefähr
520 nm und ein G-Faktor
von ungefähr
1,320.
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Es wurden Lösungen, die 0, 0,1, 0,2, 0,3,
0,4, 0,5, 1, 4, 7, 10, 20, 30 bzw. 50 mg/dl CRP (erhalten von O.
E. M. Concepts, Inc.) enthielten, und andere Lösungen, die 0, 50, 100, 200,
300, 500, 600, 800 bzw. 1000 IU/l CG (erhalten von National Institute
of Health Sciences, Japan) enthielten, zubereitet. Die oben beschriebene
vermischte Lösung
der markierten Antikörper
(ungefähr
700 μl)
wurde mit jeder Konzentration der CRP-Lösung (ungefähr 60 μl) und jeder Konzentration der
CG-Lösung
(ungefähr
60 μl) vermischt.
Die Mischung wurde bei ungefähr
35°C und
für ungefähr 0,5 Minuten
gerührt.
Dann wurde der Grad der Fluoreszenzpolarisation für CRP und
jener für
CG unter den oben beschriebenen Messbedingungen und für ungefähr 0,5 Minuten
gemessen, wobei Änderungen
davon beobachtet wurden. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die horizontale Achse
zeigt die Konzen tration jedes Testobjektes, wie sie hinzugefügt wurde,
bevor sie mit der vermischten Lösung
der markierten Antikörper
vermischt worden war.
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Es wurde bestätigt, dass CRP und CG in dieser
Reihenfolge in einer vermischten Lösung, die CRP und CG enthält, gemessen
werden kann. Von der Änderung
im Grad der Fluoreszenzpolarisation für CRP wurde gezeigt, dass sie
bis zu einer Konzentration von ungefähr 30 mg/dl linear ist, wohingegen von
jener für
CG gezeigt wurde, dass sie bis zu einer Konzentration von ungefähr 1000
IU/L linear ist.
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(Beispiel 2)
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Unten werden die Ergebnisse von Messungen
in einem Reaktionssystem für
zwei unterschiedliche Testobjekte: Amyloid A (Molekulargewicht von ungefähr 85.000)
und C-reaktives
Protein (CRP; Molekulargewicht von ungefähr 120.000) gemäß der vorliegenden
Erfindung beschrieben werden. F-4000, hergestellt von Hitachi Ltd.,
wurde als ein Apparat für
das Messen des Grades der Fluoreszenzpolarisation verwendet.
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1. Zubereitung
dansylmarkierter anti-Amyloid-A-polyclonaler Antikörper
-
Ein Satz an dansylmarkierten anti-Amyloid-A-polyclonalen
Antikörpern
wurde zubereitet, wie unten beschrieben, unter Verwendung von anti-Amyloid-A-polyclonalen
Antikörpern
(erhalten von Bio Reactive) und Dansylchlorid (erhalten von Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.).
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Eine Lösung (ungefähr 1000 μl), die ungefähr 2,0 mg/ml
der anti-Amyloid-A-polyclonalen Antikörper in einer phosphatgepufferten
Salzlösung (PBS)
(pH: ungefähr
7,4) enthielt, wurde mit einer Lösung
(ungefähr
20 μl) vermischt,
die ungefähr
1,00 mg/ml Dansylchlorid (10-fache Menge der Antikörper), gelöst in Aceton,
enthielt. Man ließ die
gemischte Lösung
bei ungefähr
4°C für ungefähr 24 Stunden unter
Rühren
reagieren. Die reagierte Lösung
wurde einer Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) (Größe: ungefähr 10 × 60 mm,
Durchflussgeschwindigkeit ungefähr
2 ml/min) ausgesetzt. Nicht umgesetztes Dansylchlorid wurde entfernt
und Fraktionen, die die dansylmarkierten anti-Amyloid-A-polyclonalen Antikörper enthielten,
wurden gesammelt.
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Die gesammelten Fraktionen wurde
verwendet, um die Markierungsmenge und die Fluoreszenzeigenschaft
der zubereiteten dansylmarkierten anti-Amyloid-A-polyclonalen Antikörper zu
beurteilen. Die Markierungsmenge wurde gemessen unter Verwendung
eines im ultravioletten/sichtbaren Bereich arbeitenden Spektrometers
(hergestellt von Shimadzu Corp., UV-1600PC), wobei die Markierung
von ungefähr
0,26 Dansyl pro einem Molekül
anti-Amyloid-A-polyclonaler Antikörper bestätigt wurde. Die Fluoreszenzeigenschaft
wurde gemessen unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers (hergestellt
von Shimadzu Corp., RF-5300PC), wobei bestätigt wurde, dass die Fluoreszenzeigenschaft
des an den Satz anti-Amyloid-A-polyclonale Antikörper gebundenen Dansyls, der
Gestalt war, dass die Anregungswellenlänge bei ungefähr 335 nm
lag, die resultierende Fluoreszenzwellenlänge bei ungefähr 520 nm
lag und die Lebensdauer der Fluoreszenz ungefähr 12 Nanosekunden betrug.
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2. Gleichzeitige
Messung von CRP und Amyloid A
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Die Mengen von CRP und Amyloid A
in Proben wurden durch Messen der Fluoreszenzpolarität unter
Verwendung des Satzes dansylmarkierter anti-Amyloid-A-polyclonaler
Antikörper,
zubereitet in Beispiel 2.1, und des Satzes pyrenmarkierter anti-CRP-polyclonaler
Antikörper,
zubereitet in Beispiel 1.2, bestimmt.
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Eine Lösung (ungefähr 350 μl), die die pyrenmarkierten
anti-CRP-polyclonalen Antikörper
in einer Konzentration von ungefähr
400 μg/ml
enthielt, wurde mit einer anderen Lösung (ungefähr 350 μl) vermischt, die die dansylmarkierten
anti-Amyloid-A-polyclonalen Antikörper in einer Konzentration
von ungefähr
400 μg/ml
enthielt. Die vermischte Lösung wurde
in eine Küvette
(ungefähr
5 × 5
mm) gegeben, um den Grad der Fluoreszenzpolarisation zu messen.
Die Messbedingungen für
die pyrenmarkierten anti-CRP-polyclonalen An tikörper waren wie folgt: eine
Messtemperatur von ungefähr
35°C, eine
Anregungswellenlänge
von ungefähr
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von ungefähr
397 nm und ein G-Faktor von ungefähr 0,942. Die Messbedingungen für die dansylmarkierten
antiamyoloid-A-polyclonalen Antikörper waren wie folgt: eine
Messtemperatur von ungefähr
35°C, eine
Anregungswellenlänge
von ungefähr
330 nm, eine Fluoreszenzwellenlänge
von ungefähr
520 nm und ein G-Faktor von ungefähr 1,320.
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Es wurden Lösungen zubereitet, die 0, 0,1, 0,2,
0,3, 0,4, 0,5, 1, 4, 7, 10, 20, 30 bzw. 50 mg/dl CRP (erhalten von
O. E. M. Concepts, Inc.) enthielten, und andere Lösungen,
die 0, 1, 2, 3, 5, 7, 8, 12, 15 bzw. 20 mg/dl Amyloid A (erhalten
von COSMO BIO CO., Ltd.) enthielten. Die oben beschriebene vermischte
Lösung
der markierten Antikörper
(ungefähr
700 μl)
wurde mit jeder Konzentration der CRP-Lösung (ungefähr 60 μl) und jeder Konzentration der
Amyloid-A-Lösung
(ungefähr
60 μl) vermischt. Die
Mischung wurde bei ungefähr
35°C und
für ungefähr 0,5 Minuten
gerührt.
Dann wurde der Grad der Fluoreszenzpolarisation für CRP und
jener für
Amyloid A unter den oben beschriebenen Messbedingungen und für ungefähr 0,5 Minuten
gemessen, wobei Änderungen
davon beobachtet wurden. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die horizontale Achse zeigt
die Konzentration jedes Testobjektes, wie es zugegeben wurde, bevor
es mit der Lösung
der markierten Antikörper
vermischt wurde.
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Es wurde bestätigt, dass CRP und Amyloid
A jeweils in einer vermischten Lösung
gemessen werden können,
die CRP und Amyloid A enthält.
Die Änderung
im Grad der Fluoreszenzpolarisation für CRP erwies sich als linear
bis zu einer Konzentration von ungefähr 30 mg/dl, wohingegen jene
für Amyloid
A sich als linear erwies bis zu einer Konzentration von ungefähr 15 mg/dl.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt
ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren bei mehreren Wellenlängen bereit,
das eine leichte, schnelle und hochgenaue Analyse von zwei oder
mehr unterschiedlichen Testobjekten, die in einer Probe in einem
Reaktionssystem enthalten sind, ermöglicht.
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Zahlreiche andere Modifikationen
werden offensichtlich sein und können
leicht durchgeführt
werden von Fachleuten, ohne von der Schutzumfang dieser Erfindung
abzuweichen. Demgemäß ist es nicht
beabsichtigt, dass der Schutzumfang der nachfolgenden Ansprüche beschränkt ist
auf die Beschreibung, wie sie hierin dargelegt ist, sondern eher dass
die Ansprüche
bereit ausgelegt seien.