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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Xantophyllester gehören zu der
Gruppe von natürlichen
Verbindungen, die als Carotinoide bekannt und in der Natur weit
verbreitet sind. Diese sind Fettsäureester (z. B. Palmitat- und
Myristatester) von solchen Carotinoiden wie Lutein und Zeaxanthin.
Zeaxanthinester ist das Pigment, welches in Beeren wie beispielsweise
von solchen der Gattung Lycium und Physalis. Luteinester ist das
Pigment, welches die gelbe/rote Farbe von Früchten wie beispielsweise Orangen,
Pfirsichen, Papayas, Pflaumen und Mangos ergibt. Luteinester sind
ebenfalls in vielen Blüten anwesend,
insbesondere Ringelblumenblüten
der Gattung Tagetes. Xantophyllester werden im Allgemeinen in der
Natur als das Konfigurationsisomer trans-Xantophyll gefunden.
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Die Ringelblumenblüte ist die
reichste Quelle an trans-Luteinester,
die in der Natur gefunden wird. Getrocknete und gemahlene Ringelblumenblüten wurden
seit 1966 kommerziell als botanische Inhaltsstoffe in Tierfutter
verwendet und seit 1969 als Ausgangsmaterialien für die Herstellung
von Ringelblumenextrakten, welche Xantophyllester als den kommerziell
wichtigen Bestandteil enthalten, siehe beispielsweise Lackey, deutsches
Patent Nr. 1,224,597; Levy et al., ecuadorianisches Patent Nr.
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44. Ringelblumenextrakte werden für den internationalen
Handel produziert. Sie werden als Pigmentierungsmittel in Tierfutterformulierungen
und als Nahrungsmittelfarbstoffe wie beispielsweise die europäische Naturfarbe
E161b/Lutein verwendet, siehe z. B. Levy et al., ecuadorianisches
Patent Nr. 44; Rosenberg, US-Patent Nr. 3,539,686; Official Journal
of the European Communities Nr. L-226/37.
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Kürzlich
erfolgte wissenschaftliche Untersuchungen haben gezeigt, dass Ringelblumenextrakte als
menschliche Nahrungsergänzungsmittel
verwendet werden können,
was auf wichtigen biologischen Funktionen von Lutein in Menschen
basiert, wie beispielsweise die Krebsprävention und Prävention
einer Bedingung, die als altersbezogene Degeneration der Macula
des menschlichen Auges bekannt ist, unter anderen möglichen
Verwendungen von Luteinestern in der Ernährung und der Medizin, siehe
beispielsweise Chew et al. Anticancer Research, 16: 3689 (1996);
Marchand et al., „An
Ecological Study of Diet and Lung Cancer in the South Pacific", International Journal
of Cancer, 63: 18–23
(1995); Park et al., „The
Effect of Dietary Lutein on Growth of Mammary tumor in BALB/c Mice", The FASEB Journal,
11: 2586 (1997); H. P. Kim et al., „Hepatoprotective Action of Zeaxanthin
Palmitate from Lycium chinense," Research
Communications Molecular Pathology and Pharmacolo , 97: 301–314 (1997);
Landrum et al., Experimental Eye Research, 65 : 1 : 57 (1997). Um für diese
wichtigen neuen Anwendungen an Menschen geeignet zu sein, müssen die
Ringelblumenextrakte stringentere Qualitätserfordernisse erfüllen, als
diese in der Vergangenheit notwendig waren.
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Für
die Verwendung in menschlichen Nahrungsergänzungsmitteln müssen Xantophyllesterkonzentrate
im Wesentlichen frei von Pestizid-Kontaminationen sein. Sie sollten
den Xantophyllester in ausreichend hoher Konzentration enthalten,
beispielsweise zu wenigstens 40 Gew.-%, um für Formulierungen in Kapseln
und Tabletten geeignet zu sein, obwohl niedrigere Konzentrationen
für die
Verwendung als ein Nahrungsergänzungsmittel
ausreichend sein können.
Um die maximal mögliche
Bioverfügbarkeit
von Xantophyll-enthaltenden Nahrungsergänzungsmitteln zu erzielen,
sollten die Xantophylle in deren natürlich auftretender Esterform
anwesend sein, nicht jedoch in verseifter Form (d. h. als freier
Alkohol oder freies Diol) und das natürlich auftretende trans-Xantophyllisomer
sollte vorherrschen, siehe beispielsweise Herbst et al., FASEB J.
Zusammenfassung 11: 2587 (1997); Johnson et al., J. Nutrition 127:
1993 (1997).
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Bedauerlicherweise sind bisher bekannte kommerzielle
Ringelblumenextrakte nicht in der Lage, ein oder mehrere dieser
qualitativen Kriterien zu erfüllen.
Die größten Produzenten
von Ringelblumenextrakten (Firmen in Peru, Mexiko und Ecuador) erzeugen
Extrakte hauptsächlich
für Tierfutterformulierungen,
die zwischen 14 und 20 Gew.-% Luteinester enthalten. Inexa, Industria
Extractora C. A. aus Quito, Ecuador, erzeugt ebenfalls eine hervorragende
Qualität
als Nahrungsmittelfarbstoff, die ungefähr 35 Gew.-% Luteinester enthält. Typischerweise
haben diese Produkte einen hohen Gehalt an nicht-Xantophylllipiden,
welche aus dem Pflanzenmaterial mit den Xantophyllen extrahiert
werden, wenn Standardextraktionstechniken eingesetzt werden. Des
Weiteren enthalten kommerzielle Luteinesterkonzentrate üblicherweise
ungefähr
20 bis 30 Gew.-% des gesamten Luteinesters in der cis-Isomerenform,
wiederum aufgrund der Standardbedingungen der industriellen Herstellung.
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Schließlich enthalten bekannte Luteinesterkonzentrate
oftmals Rückstände von
Pestiziden, welche in das Xantophyll-enthaltende Pflanzenmaterial durch
weit verbreitete Kultivierungstechniken eingeführt werden, wie beispielsweise
solche, die in Ringelblumenanpflanzungen verwendet werden, und werden
zusammen mit Xantophyllestern durch Standardextraktionsverfahren
extrahiert. Dieses alles macht die gegenwärtig verfügbaren kommerziellen Luteinesterkonzentrate
ungeeignet für
die Verwendung als menschliche Nahrungsergänzungsmittel.
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Einige unterschiedliche Verfahren
sind vorgeschlagen worden, um diese Nachteile zu überwinden.
Das US-Patent Nr. 4,048,203 von Philip beschreibt die Extraktion
von Luteinestern aus Pflanzenmaterial und des Weiteren die Reinigung
der Ester unter Verwendung eines Alkohols bei 75°C. Diese Wärmebehandlung resultiert jedoch
in einem unerwünscht
großen
Anteil des weniger bioverfügbaren cis-Xantophyllisomers
in dem endgültigen
Produkt. Siehe unten stehendes Vergleichsbeispiel 1.
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Das US-Patent Nr. 5,382,714 von Khachik beschreibt
ein Verfahren zur Isolierung, Reinigung und Rekristallisation von
Lutein aus verseiftem Ringelblumenölharz, und das US-Patent Nr.
5,648,564 von Ausich et al. beschreibt ein Verfahren zur Extraktion,
Isolation und Reinigung von Nahrungsmittel-Xantophyllkristallen aus Pflanzen. Keines
dieser Verfahren produziert jedoch Xantophylle in deren natürlicher,
am meisten bioverfügbarer
Esterform, da sie beide einen Verseifungsschritt erfordern, wodurch die
natürliche,
in dem Pflanzenmaterial vorliegende Xantophyllesterform zerstört wird.
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Das US-Patent Nr. 4,105,855 von Schulz lehrt
ein Verfahren zur Synthetisierung symmetrischer Carotinoide, welche
Ester in ihrer all-trans Isomerenform sein können. Lutein ist jedoch nicht
ein symmetrisches Carotinoid, und während Zeaxanthin symmetrisch
ist, ist der einzige durch Schulz genannte Ester von Zeaxanthin
das Diacetat als ein letzter Zwischenschritt bei dem Erhalt des
Diols. Schulz lehrt nicht die Synthese oder Extraktion von Xantophyllpalmitat-
und Myristatestern oder deren Konzentrate.
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Es ist daher offensichtlich, dass
auf dem Fachgebiet ein Bedarf an einem Verfahren zur Herstellung, über die
Extraktion und Reinigung von Pflanzenmaterial, von Xantophyllkonzentraten
besteht, die eine erhöhte
Reinheit aufweisen und überwiegend
trans-Xantophylle in deren natürlicher
Esterform enthalten.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
werden trans-Xantophyllesterkonzentrate erhalten, in welchen der
Gehalt des trans-Xantophyilesters
in dem Konzentrat wenigstens 4 mal größer, vorzugsweise wenigstens
ungefähr
9 mal größer, als
der cis-Xantophyllestergehalt
des Konzentrats ist. Die Gesamtkonzentration des traps- und cis-Xantophyllesters
beträgt
wenigstens ungefähr
40 Gew.-% des Konzentrats und Pestizidrückstände sind von dem Konzentrat auf
einem Nachweisniveau von parts per Billion im Wesentlichen abwesend.
Bevorzugte Ester sind die der Xantophylle Lutein und Zeaxanthin.
Des Weiteren können
die traps-Xantophyllesterkonzentrate der Erfindung einen Gesamtxanto-phyllestergehalt
von größer als
ungefähr
55 Gew.-% des Konzen-trats und oftmals 70 Gew.-% oder mehr aufweisen.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
des Weiteren ein Verfahren, um ein trans-Xantophyllesterkonzentrat
hoher Reinheit zu erhalten, welches umfasst eine Kontaktierung von
Xantophyllester enthaltenden Pflanzenmaterial mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel für eine zur
Extrahierung der Xantophyllester aus dem Pflanzenmaterial ausreichenden
Zeit, Separierung des Kohlenwasserstoff-Lösungsmittels und des in diesem
gelösten
Extrakt von dem verbleibenden Pflanzenmaterial, Verdampfen des Kohlenwasserstoff-Lösungsmittels
von dem gelösten
Extrakt, um ein rohes Xantophyllesterkonzentrat zu erhalten, Beimischung
eines Alkohols zu dem rohen Xantophyllesterkonzentrat bei Umgebungstemperatur,
um nicht-Xantophyllverunreinigungen und cis-Xantophyll-ester aus dem Konzentrat
zu lösen,
und Entfernung des Verunreinigungen und cis-Xantophyllester enthaltenden
Alkohols von dem rohen traps-Xantophyllkonzentrat, um ein gereinigtes traps-Xantophyllesterkonzentrat
zu erhalten.
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Die Erfindung umfasst des Weiteren
ein Verfahren zur Gewinnung eines traps-Luteinesterkonzentrats von
hoher Reinheit, umfassend die Entfernung aller Bestandteile der
Ringelblumenblüten, die von
den Blütenkronen
verschieden sind, Kontaktierung der Ringelblumenblütenkronen
mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel
für eine
zur Extraktion der Luteinester aus den Blütenkronen ausreichende Zeitdauer,
Trennung des Kohlenwasserstofflösungsmittels
und des in diesem gelösten
Extraktes von den verbleibenden Blütenkronen, Verdampfen des Kohlenwasserstoff-Lösungsmittels von dem gelösten Extrakt,
um ein Luteinesterrohkonzentrat zu erhalten, Beimischung eines Alkohols,
vorzugsweise eines niederen aliphatischen Alkohols, zu dem Luteinesterrohkonzentrat
bei Umgebungstemperatur, um die nicht-Xantophyllverunreinigungen
und cis-Luteinester aus dem Konzentrat zu lösen, und Entfernen des Verunreinigungen
und cis-Luteinester enthaltenden Alkohols von dem trans-Luteinrohkonzentrat,
um ein gereinigtes trans-Luteinesterkonzentrat zu erhalten.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein Xantophyllester enthaltendes Pflanzenmaterial dehydratisiert,
gemahlen und mit einem geeigneten aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel
extrahiert. Das Lösungsmittel
wird entfernt, was in einem lösungsmittelfreien,
Xantophyllester enthaltenden Konzentrat resultiert, welches auf
dem Fachgebiet als ein Ölharz
bezeichnet wird. In der vorliegenden Erfindung wird das derart gebildete Ölharz, welches im
Allgemeinen ein Isomerenverhältnis
von trans- zu cis-Xantophyll von 75 : 25 aufweist, mit einem Alkohol
bei Umgebungstemperatur gerührt,
um die nicht-Xantophyllverunreinigungen zu entfernen und die cis-
und trans-Xantophyllisomeren zu fraktionieren. Die flüssige Fraktion
der Suspension, welche Verunreinigungen und das cis-Xantophyllisomer
enthält,
wird anschließend
entfernt, und lässt
eine feste Fraktion zurück:
ein gereinigtes trans-Xantophyllesterkonzentrat mit hoher Reinheit,
einem Xantophyllestergehalt von wenigstens 40 Gew.-% und einem trans
: cis-Xantophyllisomerenverhältnis
von wenigstens 4 : 1, vorzugsweise wenigstens 9.1.
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Die Ausgangsmaterialien für die vorliegende Erfindung
können
jegliche Xantophyllester enthaltende Pflanzenmaterialien umfassen.
Ringelblumenblüten,
insbesondere die Blütenkronen
(Korollas) sind ein bevorzugtes Ausgangsmaterial für Luteinesterkonzentrate,
und Beeren der Gattung Lycium und Physalis sind besonders bevorzugte
Ausgangsmaterialien für
Zeaxanthinesterkonzentrate. Andere bevorzugte Ausgangsmaterialien
für Luteinesterkonzentrate
schließen
Früchte
wie Orangen, Pfirsiche, Papayas, Pflaumen und Mangos ein.
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Eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Herstellung von Luteinesterkonzentraten
aus den Blütenkronen
von Ringelblumenblüten.
Zum Zeitpunkt der Ernte werden nur voll entwickelte Ringelblumenblüten ausgewählt und
die Blütenkronen
werden sorgfältig
von anderen Blütenteilen
getrennt. Die Trennung kann manuell oder maschinell erfolgen, aber
eine manuelle Trennung ist aufgrund der empfindlichen Natur der Blüten und
der Schwierigkeiten einer Automation bevorzugt. Eine mikroskopische
Prüfung
der Fraktion der Blütenkronen
der Ernte sollte zeigen, dass diese im Wesentlichen frei ist von
Kelchblättern,
Blütenkelchen
und insbesondere reifen oder unreifen Samen. Diese Pflanzenteile,
die nicht Blütenkronen
sind, insbesondere die Samen, neigen dazu, höhere Konzentrationen an Pestiziden
als die Blütenkronen
zu haben, so dass die Entfernung der Pflanzenteile nach der Ernte,
die nicht Blütenkronen
sind, als ein Vorextraktionsreinigungsschritt in der vorliegenden
Erfindung fungiert. Dieser zusätzliche
Reinigungsschritt ermöglicht
die Herstellung von Luteinesterkonzentraten von erhöhter Reinheit,
welche keine nachweisbaren Rückstände von
Pestiziden haben, so dass diese in menschlichen Nahrungsergänzungsmitteln
verwendet werden können.
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In dem Verfahren nach der vorliegenden
Erfindung wird das Xantophyllester enthaltende Pflanzenmaterial
dehydratisiert und gemahlen. Frisches Pflanzenmaterial enthält üblicherweise
80% Feuchtigkeit. Die Dehydratation wird im Allgemeinen durch Durchleitung
druckbeaufschlagter heißer
Luft durch das Pflanzenmaterial durchgeführt, bis die Feuchtigkeit unter
Verwendung kommerziell erhältlicher
stationärer
Hordentrockner oder Rotationstrockner auf ungefähr 10% reduziert worden ist.
Das Mahlen des dehydratisierten Pflanzenmaterials wird üblicherweise
in kommerziellen Hammermühlen
durchgeführt, welche
mit einem Sieb ausgestattet sind, welches den Grad der Feinheit
sicherstellt, welcher eine gute Extraktion des Xantophyllesters
erlaubt, aber nicht so fein ist, als dass ein schneller und adäquater Ablauf des
Extraktionslösungsmittels
verhindert wäre.
Das Pflanzenmaterial wird anschließend mit einem aliphatischen
Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel
gemischt, um die Xantophyllester zu extrahieren.
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Gemäß den gegenwärtigen Praktiken
auf dem Fachgebiet ist Hexan das bevorzugte aliphatische Kohlenwasserstofflösungsmittel
für die
Xantophyllesterextraktion, da es eine gute Selektivität hat und
dessen Siedepunkt die vollständige
Entfernung der Lösungsmittelreste
von dem resultierenden Extrakt gestattet. Andere bevorzugte aliphatische
Kohlenwasserstoffe als Extraktionslösemittel schließen Pentan,
Heptan und Mischungen von diesen mit Hexan ein.
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Eine Extraktion unter Verwendung
von Hexan oder anderen Kohlenwasserstofflösungsmitteln wird gemäß auf dem
Fachgebiet bekannter Verfahren durchgeführt. Im Labor wird vorzugsweise
ein Kilogramm von Pflanzenmaterial mit sechs Litern von Hexan bei
Umgebungstemperatur über
wenigstens vier Stunden perkoliert. Für eine Herstellung in industriellem
Maßstab
der Xantophyllesterkonzentrate wird bevorzugt eine Standardanlage
zur Gegenstromextraktion mit Hexan bevorzugt verwendet, so dass ein
Ansatz mit 2.000 kg von botanischem Rohmaterial vollständig mit
12.000 Litern des Lösungsmittels bei
Umgebungstemperatur extrahiert und von der Anlage alle zwei Stunden
ausgestoßen
wird.
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Nachfolgend der Extraktion wird das
Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
welches die extrahierten Xantophyllester enthält, von dem verbleibenden Pflanzenmaterial
entfernt. Eine derartige Entfernung wird vorzugsweise durch Filtration
durch Filtertücher bewerkstelligt.
Das Kohlenwasserstofflösungsmittel wird
anschließend
von dem in diesem gelösten
Xantophyllestern verdampft, was ein Lösungsmittel-freies Extrakt
oder Ölharz
zurücklässt. Die
Verdampfung wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen durchgeführt, am
meisten bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 40°C und 50°C unter einem
reduzierten Druck von ungefähr
4 × 102 [Pa] (3 mm Hg). Das resultierende Ölharz hat
im Allgemeinen ein trans : cis-Xantophyllisomerenverhältnis von
75 : 25, wie durch die HPLC Peakhöhen bestimmt wird.
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Das Ölharz wird mit einem Alkohol
bei ungefähr
Umgebungstemperatur gemischt, um die nicht-Xantophyllverunreinigungen
zu lösen
und die cis- und trans-Xantophyllisomeren zu fraktionieren. Die
für die
Reinigung und Fraktionierung benötigte Zeit
hängt von
den Charakteristika des Ölharzes
ab, wobei höhere
Verunreinigungsgehalte längere
Zeiten erfordern. Die Mischung wird vorzugsweise für zwischen
einer und sechs Stunden fortgesetzt, am meisten bevorzugt für ungefähr drei
Stunden. Der Fortschritt der Reinigung des Ölharzes kann überwacht werden
durch eine periodische Entnahme von Proben aus der Reaktionsmischung,
Trennung des Feststoffes durch Filtration und analytische Bestimmung des
Ester- und trans-Isomerengehaltes der abgetrennten festen Probe,
um sicherzustellen, dass die Mischung unverzüglich beendet wird, wenn der
gewünschte
Grad an Reinigung erzielt worden ist.
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Es wird angenommen, dass die Fraktionierung
der cis- und trans-Xantophyllisomeren
jeweils in die flüssige
und feste Fraktion der Suspension des Ölharzes auftritt, da das cis-Xantophyllisomer
in dem Alkohol bei Umgebungstemperatur vergleichsweise gut löslich ist,
während
eine wesentliche Lösung
des trans-Xantophyllisomers in dem Alkohol in diesem Tempera turbereich
nicht auftritt. Um die gewünschte Fraktionierung
der cis- und trans-Xantophyllisomeren zu erzielen wird daher eine
Mischung bei ungefähr Umgebungstemperatur
durchgeführt.
Temperaturen, die hoch genug sind, um eine wesentliche Lösung des
trans-Xantophyllisomers oder eine Konversion des trans- zu dem cis-Xantophyllisomer
zu erlauben, sollten vermieden werden. Vorzugsweise sollte die Temperatur
für den
Alkoholmischungsschritt 25°C nicht übersteigen
und am meisten bevorzugt sollte eine Temperatur zwischen 18°C und 22°C verwendet werden.
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Nachdem das Ölharz mit dem Alkohol bei ungefähr Umgebungstemperatur
gemischt wurde hat die feste Fraktion der Ölharz/Alkohol-Suspension, welche
ein gereinigtes trans-Xantophyllesterkonzentrat nach einem Lösungsmittelentzug
werden wird, wenigstens ein 4 : 1, vorzugsweise wenigstens ein 9 :
1, trans : cis-Xantophyllisomerenverhältnis, wie es durch die HPLC-Peakhöhen bestimmt
ist, obwohl das ursprüngliche Ölharz ungefähr das übliche Gleichgewichtsisomerenverhältnis von
trans : cis-Xantophyll von 75 : 25 hat. Die meisten bisher bekannten
Xantophyllesterkonzentrate, welche durch Mischung mit einem Alkohol
gereinigt wurden, der warm genug war, um beide Xantophyllisomeren
zu lösen,
haben ebenfalls ein trans : cis-Isomerenverhältnis von ungefähr 75 :
25. Das erhöhte
trans : cis-Isomerenverhältnis,
das durch die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung erzielt
wird, ist für Xantophyllesterkonzentrate
wünschenswert,
welche in Nahrungsergänzungsmitteln
verwendet werden sollen, da das trans-Xantophyllisomer das natürlich auftretende
Isomer ist und es angenommen wird, dass dieses eher bioverfügbar ist,
als das cis-Isomer.
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Der für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung
ausgewählte
Alkohol muss einen ausreichend niedrigen Siedepunkt aufweisen, so
dass dieser von dem endgültigen
Produkt vollständig
bei Temperaturen entfernt werden kann, die niedrig genug sind, eine
Konversion des trans- in das cis-Xantophyllisomer zu vermeiden,
von welcher angenommen wird, dass diese graduell mit zunehmender
Temperatur auftritt. Bevorzugte Alkohole für die Verwendung mit der vorliegenden
Erfindung schließen
die niederen (z. B. C1-C6)
Alkanole ein.
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Die Löslichkeit der nicht-Xantophyllverunreinigungen
sowie auch die Löslichkeiten
von sowohl den cis- und den trans-Xantophyllisomeren steigen mit ansteigendem
Molekulargewicht des Alkohol-Lösungsmittels
an. Daher resultiert die Verwendung von Alkoholen mit höheren Molekulargewichten
in trans-Xantophyllesterkonzentrate
mit größerer Reinheit
aber niedrigerer Ausbeute, da mehr trans-Xantophyllester durch die
Lösung
in der flüssigen
Fraktion der Alkohol/Ölharz-Suspension
verloren gehen. Daher sollte ein Alkohol mit mittlerem Molekulargewicht ausgewählt werden,
um die einander gegenläufigen Trends
der Erhöhung
der Reinheit und der Verringerung der Ausbeute mit steigendem Molekulargewicht des
Alkohols auszugleichen. Daher ist unter den bevorzugten niederen
Alkanolen Isopropanol am meisten bevorzugt, da dessen mittleres
Molekulargewicht es erlaubt, eine gute Reinigung sowie auch eine
gute Ausbeute des trans-Xantophyllesterkonzentrats
zu erzielen.
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Eine ausreichende Menge an Alkohol
sollte verwendet werden, um die meisten der nicht-Xantophyllesterbestandteile
auszuwaschen und die cis-/trans-Xantophyllisomeren zu fraktionieren.
Die Menge des benötigten
Alkohols hängt
ab von den Charakteristika des Ölharzes,
welche durch eine Variation von Faktoren wie beispielsweise dem
Klima (z. B. Menge an Regenfall und Menge von Sonnenschein während des
Wachstums und der Ernte von Xantophyllester enthaltendem Pflanzenmaterial),
Bedingungen der Dehydratation nach der Ernte, Extraktionstemperatur
usw. beeinflusst werden können.
Im Allgemeinen kann die Menge des Alkohols, der für den Alkohol-Vermischungsschritt
nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, basierend auf Laboratoriumsdaten
verändert
werden, d. h. dem Gehalt an Ester und cis-Isomer, der vor und während der
Mischung des Ölharzes
mit dem Alkohol erhalten wird. Der Fortschritt der Reinigung des Ölharzes über den Alko holmischungsschritt
wird überwacht,
so dass das verwendete Alkoholvolumen, wie die für die Mischung benötigte Zeitdauer,
eingestellt werden kann, um die höchstmögliche Reinheit bei den am
niedrigsten möglichen
Verfahrenskosten zu erzielen. Vorzugsweise werden zwischen zwei
und fünf
Volumenteilen Alkohol auf je ein Volumenteil des Ölharzes
in dem Alkoholmischungsschritt eingesetzt. Ein wesentlich größerer Überschuss
von Alkohol kann jedoch in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Sobald der gewünschte Grad der Reinheit und
Isomerenfraktionierung durch den Alkoholmischungsschritt erzielt
worden sind, wird die Feststofffraktion der Alkohol/Ölharz-Suspension
von der Mischung abgetrennt, vorzugsweise durch Filtration oder
Zentrifugation. Die feste Fraktion wird des Weiteren in einem Vakuumhordentrockner
vom Lösungsmittel
befreit, um ein gereinigtes trans-Xantophyllesterkonzentrat zu erhalten.
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Das gereinigte trans-Xantophyllesterkonzentrat
kann anschließend
bei einer Temperatur, die 50°C
nicht überschreitet,
unter einer Inertatmosphäre,
vorzugsweise aus Stickstoffgas, geschmolzen und in Formen von jeglicher
gewünschter
Gestalt, vorzugsweise Barrenformen, gegossen werden. Nach Abkühlung bis
zur Erreichung eines festen Zustandes, üblicherweise bei ungefähr 20°C für ungefähr 3–4 Stunden
(in Abhängigkeit
von der Größe und Gestalt
der Barren), wird das in Formen gegossene trans-Xantophyllesterkonzentrat in fester
Form aus den Gießformen
entfernt, vorzugsweise als feste Barren. Alternativ kann das gereinigte
trans-Xantophyllesterkonzentrat in einen körnchenförmigen Zustand gemahlen werden.
Sowohl die körnchenförmige als
auch die Barrenform des trans-Xantophyllesterkonzentrats sind zur
Herstellung von menschlichen Nahrungsergänzungsmitteln in der Form von Tabletten
oder Kapseln oder für
die Verwendung als Nahrungsmittelfarbstoffe nützlich.
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Die endgültigen gereinigten trans-Xantophyllesterkonzentrate, die
durch die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung erhalten werden,
enthalten Xantophyllester in einem Ausmaß größer als 40 Gew.-%, vorzugsweise
größer als
ungefähr
55 Gew.-% und oftmals größer als
70 Gew.-%, gemessen durch Spektrophotometrie (nach Davies, „Carotenoids" in Chemistry and
Biochemistry of Plant Pigments, herausgegeben von Goodwin, Academic Press,
London, 1976) in Hexan bei der Wellenlänge der maximalen Absorption
(ungefähr
445 nm für
Luteinester unter Verwendung des 1% Extinktionskoeffizienten ε von 1394
und ungefähr
450 nm für
Zeaxanthinester unter Verwendung des 1% Extinktionskoeffizienten ε von 1260)
mit einer im Wesentlichen Abwesenheit von Pestizidrückständen selbst
bei einer Nachweisgrenze von ppb (parts per billion), bestimmt durch
das EPA Verfahren SW-846 8080A, und einem trans : cis-Xantophyllisomerenverhältnis von wenigstens
9 : 1, gemessen durch HPLC Peakhöhen. All
dieses ist eine wesentliche Verbesserung gegenüber kommerziell erhältlichen
Luteinesterkonzentraten, welche oftmals nur soviel wie 25 Gew.-%
Xantophyllester mit einem trans : cis-Isomerenverhältnis von
ungefähr
75 : 25 enthalten. Der erhöhte
Estergehalt, das erhöhte
trans : cis-Isomerenverhältnis
und die resultierende Feststoffform des trans-Xantophyllesterkonzentrats
nach der vorliegenden Erfindung machen diese gegenüber bisher
bekannten Konzentraten zur Verarbeitung und Verwendung in menschlichen
Nahrungsergänzungsmitteln
in der Form von Tabletten, Kapseln oder flüssigen Zubereitungen erstrebenswert.
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Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
stellen daher erstrebenswerte Alternativen von bisher auf dem Fachgebiet
bekannten Verfahren zur Herstellung von Xantophyll-Konzentraten
dar. Die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung sind vergleichsweise
einfach und resultieren unmittelbar in Konzentraten, die Xantophylle
in deren natürlicher Esterform
enthalten und des Weiteren die gewünschten Charakteristika von
erhöhter
Reinheit, hohen Xantophyllesterkonzentrationen und hohen trans : cis-Xantophyllisomerenverhältnissen
haben. Die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
erhaltenen Extrakte sind daher ideal zur Verwendung in menschlichen
Nahrungsergänzungsmitteln
für Anwendungen
wie beispielsweise die Behandlung von Krebs und altersbedingter
Macular-Degeneration des Auges.
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Die Erfindung wird nunmehr unter
Bezugnahme auf die nachfolgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.
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BEISPIEL 1
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Ein Kilogramm getrockneter Ringelblumenblütenkronen,
welche einen Luteinestergehalt von 2,9 Gew.-% aufweisen, wie an
einer Teilmenge durch Soxhlet-Extraktion und nachfolgende spektrophotometrische
Messung bei 445 nm, welches die Wellenlänge der maximalen optischen
Absorption war, bestimmt worden ist, wurden mit 8 Litern Hexan in
einer mit einem Keramikfilter versehenen Glaskolonne perkoliert.
Das Hexan der resultierenden Lösung
wurde bei 60°C
unter Vakuum verdampft. 100 g des Ölharzes mit einem Luteinestergehalt
von 27,9 und einem trans : cis-Luteinisomerenverhältnis von
75 : 25, wie durch die HPLC Peakhöhen bestimmt wurde, wurde erhalten.
Das Ölharz
wurde für
3 Stunden mit 200 g Isopropanol bei 20°C gerührt. Die resultierende Suspension
wurde durch Filterpapier filtriert, das Lösungsmittel unter Vakuum bei
Umgebungstemperatur entfernt, bei 65°C geschmolzen und in Formen gegossen.
Nach dreistündiger
spontaner Abkühlung auf
Umgebungstemperatur wurden zwei Luteinesterbarren erhalten, die
jeweils 10 g wogen und einen Luteinestergehalt von 69,0 Gew.-% (durch
Spektrophotometrie in Hexan bestimmt) und ein trans : cis-Luteinisomerenverhältnis (durch
HPLC Peakhöhen
bestimmt) von 90 : 10 aufwiesen.
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VERGLEICHSBEISPIEL 1
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Dieses Beispiel, welches lediglich
für Vergleichszwecke
eingeführt
wird, veranschaulicht das in Philip, US-Patent 4,048,203 beschriebene
Verfahren der Reinigung von Lutein-Fettsäureestern.
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Ringelblumenblütenkronen (1 kg), wie sie in Beispiel
1 verwendet wurden, wurden mit Petrolether (3 Liter) bei Raumtemperatur
extrahiert. Das Extrakt wurde unter Vakuum bei 50°C zur Trockne
eingedampft (Ausbeute 100 g). Eine Teilmenge von 65 g des Ölharzes
wurde in heißem
Isopropanol (300 ml) bei 75°C
gelöst;
die Lösung
wurde durch einen gesinterten Glastrichter filtriert; und das Filtrat
wurde auf 15°C
gekühlt.
Die ausgefallenen Lutein-Fettsäureester
wurden durch Filtration zurückgewonnen
und unter Vakuum bei 30°C
getrocknet, was eine Ausbeute von 23,4 g an Konzentrat ergab. Der
Luteinestergehalt betrug 54 Gew.-% (durch Spektrophotometrie bestimmt).
Die Isomerenzusammensetzung des Lutein-Fettsäureesters betrug 70 Gew.-%
trans-Luteinester
und 30 Gew.-% cis-Luteinester (durch HPLC bestimmt).
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Es wird angenommen, dass das geringe Übergewicht
des trans-Isomers
(2,3-fach) von diesem Xantophyllkonzentrat und dessen hoher Gehalt an
cis-Isomer das Ergebnis der Behandlung mit Isopropanol ist, die
bei der hohen Temperatur von 75°C ausgeführt wird.
Daher erfüllt
das durch dieses Verfahren hergestellte Xantophyllkonzentrat nicht
die Bedingung eines hohen Übergewichtes
an trans-Isomer, welches für
eine optimale Funktionsfähigkeit
als Nahrungsergänzungsmittel
erforderlich ist.
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BEISPIEL 2
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Dieses Beispiel demonstriert in Zusammenhang
mit Vergleichsbeispiel 2 die erhöhte
Reinheit im Hinblick auf den Pestizidgehalt der Luteinesterkonzentrate,
die aus Ringelblumenblütenkronen
gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, verglichen mit Luteinesterkonzentraten,
die aus vollständigen
Ringelblumenblüten
gemäß allgemein
eingesetzten Verfahren erhalten wurden.
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1 kg Ringelblumenblüten aus
einer normalen Ernte mit einem Lu teinestergehalt von 1,67 Gew.-%, wie
an einer Teilmenge durch eine Soxhlet-Extraktion mit Petrolether
und nachfolgende spektrophotometrische Messung bei 445 nm unter
Verwendung von ε1% = 1.394 bestimmt wurde, wurde manuell
in Blütenkronen
und Bestandteile, die nicht Blütenkronen
sind, getrennt. 500 g der Blütenkronen,
welche 3,34 Gew.-% an Luteinester enthielten, wurden durch das in
Beispiel 1 verwendete Verfahren extrahiert, was 48,6 g an Ölharz mit
einem Luteinestergehalt von 33,0 Gew.%, durch Spektrophotometrie
bestimmt, ergab. Dieses Ölharz
wurde für
drei Stunden mit 150 ml Isopropyl-Alkohol bei Umgebungstemperatur
(19°C) gerührt. Die
Suspension wurde durch ein Filtertuch filtriert und der Feststoff
wurde unter Vakuum bei Umgebungstemperatur von dem Lösungsmittel
befreit. Der resultierende Feststoff (26,6 g) enthielt 41,0 Gew.-%
Luteinester, bestimmt durch Spektrophotometrie, ohne dass Spuren
von Pestizidrückständen durch
ein EPA-Verfahren SW-846 8080A nachweisbar waren (Nachweisgrenze:
48 μg/kg).
Das Luteinesterkonzentrat wurde bei 60°C geschmolzen, in Formen gegossen
und gestattet, über
4 Stunden auf Umgebungstemperatur (20°C) in feste Barren abzukühlen.
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VERGLEICHSBEISPIEL 2
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Ein kg von Ringelblumenblüten aus
derselben Ernte, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde durch
das in Beispiel 1 verwendete Verfahren extrahiert und ergab 88,8
g rohes Ölharz
mit einem Xantophyllestergehalt von 16,9 Gew.-%. Das rohe Ölharz wurde
für 3 Stunden
mit 200 ml Isopropyl-Alkohol bei Umgebungstemperatur (19°C) gerührt, filtriert
und wie in Beispiel 2 beschrieben getrocknet. Ein resultierender
Feststoff (23,0 g) wurde mit einem Xantophyllestergehalt von 40,5
Gew.-% erhalten. Die Pestizidsrückstandsanalyse
des Ölharzes
unter Verwendung des EPA-Verfahrens SW-846 8080A zeigte die Anwesenheit
von 0,9 ppm des Pestizids Endosulfan.
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BEISPIEL 3
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Ein weiterer Ansatz von Ringelblumenblüten wurde
extrahiert und das Ölharz
wurde wie in Beispiel 2 verarbeitet. Der resultierende Feststoff
(19,4 g) enthielt 56,1 Gew.-% Luteinester.
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VERGLEICHSBEISPIEL 3
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Ein weiterer Ansatz von Ringelblumenblüten wurde
extrahiert und das Ölharz
wie in Vergleichsbeispiel 2 verarbeitet. Der resultierende Feststoff
(16,7 g) enthielt 55,6 Gew.-% Luteinester. Die Pestizidrückstandsanalyse
des Feststoffes unter Verwendung des EPS-Verfahrens SW-846 8080A
zeigte die Anwesenheit von 0,9 ppm des Pestizids Endosulfan.
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BEISPIEL 4
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Fünf
kg trockener chinesischer Wolfsbeeren (Lycium chinense) wurden in
einer mit einem Keramikfilter versehenen Glaskolonne durch Perkolation mit
90 Litern heißen
Wassers (80°C)
während
zwei Stunden vorextrahiert, um wasserlösliche Harze zu entfernen.
Die Wolfsbeeren wurden anschließend
in einem Fließbetttrockner
bei 60°C
entwässert,
unter Verwendung einer Hammermühle
gemahlen und langsam (während
8 Stunden) durch Perkolation bei Umgebungstemperatur (21°C) mit 40
Litern Hexan in einer mit einem Keramikfilter versehenen Glaskolonne
extrahiert. Das Extrakt wurde unter Vakuum bei 60°C von dem
Lösungsmittel
befreit. Das resultierende lösungsmittelfreie Ölharz wog
58 g und enthielt 11,5 Gew.-% Zeaxanthinester, durch Spektrophotometrie
einer in Hexan gelösten
Teilmenge, wie oben beschrieben, bestimmt. Dieses Ölharz wurde
mit 250 ml Isopropylalkohol vermischt und für 5 Stunden bei 19°C gerührt. Unlösliche Feststoffe
wurden durch Filtration abgetrennt und in einem Rotationsvakuumverdampfer
bei 25°C
für drei
Stunden vom Lösungsmittel
befreit, was 11,9 g an Zeaxanthinesterkonzentrat ergab, mit einem
Zeaxanthinestergehalt von 56,0 Gew.-% (bestimmt durch Spektro- photometrie, wie oben
beschrieben) und einem Isomerenverhältnis von trans : cis-Zeaxanthin
von 9 : 1 (bestimmt durch die HPLC Peakhöhen).