DE69838104T2

DE69838104T2 - C-terminale region des "agouti-related-transcript"-proteins (art)

Info

Publication number: DE69838104T2
Application number: DE69838104T
Authority: DE
Inventors: Tung Ming Rahway FONG; Leonardus H. Rahway VAN DER PLOEG; Michael R. Rahway TOTA
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: WO1999031508A1; EP1040351B1; DE69838104D1; EP1040351A4; CA2314971A1; EP1040351A1; JP2002508194A; ES2288770T3; ATE367581T1

Description

ERKLÄRUNG BEZÜGLICH AUS BUNDESMITTELN GEFORDERTER FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG

Nicht anwendbar.

VERWEIS AUF MIKROFILMANHANG

Nicht anwendbar.

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die vom C-terminalen Bereich des ART („agouti-related transcript")-Proteins stammen, und Verwendungen solcher Polypeptide, einschließlich der Verwendung als Inhibitoren der Bindung von melanozytenstimulierenden Hormonen an Melanocortin-Rezeptoren und die Verwendung zur Identifizierung von Inhibitoren der Bindung von ART-Protein an Melanocortin-Rezeptoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
ART („agouti-related transcript") wurde ursprünglich als eine mRNA entdeckt, die im Hypothalamus von ob/ob- und db/db-Mäusen hochreguliert ist. Das ART-Gen wurde von sowohl Mäusen als auch Menschen kloniert und codiert für ein Protein von 131 Aminosäuren bei Mäusen und 132 Aminosäuren bei Menschen (Shutter et al., 1997, Genes and Development 11: 593-602). Von rekombinant hergestelltem ART-Protein wurde gezeigt, dass es ein funktioneller Antagonist des Melanocortin-3-Rezeptors (MC3R) und des Melanocortin-4-Rezeptors (MC4R) ist (Fong et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 629-631; Ollman et al., 1997, Science 278: 135-138).
MC3R und MC4R gehören zu einer Klasse von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, welche als die Melanocortin-Rezeptoren bekannt sind, da diese Rezeptoren Adenylylcyclase als Reaktion auf Liganden aktivieren, die als Melanocortine bekannt sind (z.B. Adrenocorticotrophin (ACTH) und die α-, β- und γ-melanozytenstimulierenden Hormone). MC3R und MC4R sind neurale Melanocortin-Rezeptoren, wobei MC3R im Hypothalamus und limbischen System des Gehirns und MC4R allgemein im Gehirn exprimiert wird. Insbesondere wurde eine MC4R-Expression in einer Anzahl von Hypothalamus-Stellen gefunden, einschließlich der ventromedialen, lateralen, dorsomedialen und paraventrikulären Nuklei (Mountjoy et al., 1994, Mol. Endocrinol. 8: 1298-1308), Regionen, von denen gezeigt wurde, dass sie eine Rolle beim Ernährungsverhalten spielen (Brav, 1987, Nutr. Rev. 45: 33-43). Gentargeting-Experimente haben gezeigt, dass MC4R eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Ernährungsverhaltens und Obesität aufweist. Knockout-Mäuse, denen MC4R fehlt, entwickeln ein Obesitätssyndrom, welches durch Hyperphagie, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie charakterisiert ist (Huszar et al., 1997, Cell 88: 131-141).
In Anbetracht dessen besteht ein großes Interesse an dem ART-Protein, welches ein natürlicher Regulator von MC3R und MC4R bei Menschen zu sein scheint. Es wird angenommen, dass das ART-Protein wahrscheinlich ein natürlicher Regulator von humaner Obesität ist, welcher durch Antagonisierung von entweder MC3R oder MC4R wirkt. Dementsprechend ist die Identifizierung von Substanzen, welche die Bindung von ART-Protein an MC3R oder MC4R inhibieren, wünschenswert, da solche Inhibitoren wahrscheinlich von Nutzen bei der Kontrolle von Obesität sind. Substanzen, welche die Wirkung von ART-Protein auf MC3R oder MC4R potenzieren, sind wahrscheinlich auch von Nutzen bei der Kontrolle des Körpergewichts.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Polypeptide bereit, welche vom C-terminalen Bereich der Human- und Maus-ART-Proteine abgeleitet sind. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Sequenzen, welche für die neuen C-terminalen Polypeptide codieren. Die neuen C-terminalen Polypeptide können zur Inhibierung der Bindung von melanozytenstimulierenden Hormonen an Melanocortin-Rezeptoren verwendet werden. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Wirkung von ART-Protein auf die Bindung von melanozytenstimulierenden Hormonen an Melanocortin-Rezeptoren werden ebenfalls bereitgestellt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die quantitative Bestimmung von c-ART-b aus COS-7-Zellen durch die Verwendung eines ELISA unter Verwendung eines Antikörpers, der das myc-Epitop in c-ART-b erkennt. Gezeigt ist die Standardkurve, welche unter Verwendung bekannter Mengen von myc-Peptid generiert wurde. Für die c-ART-b-Präparation, hergestellt aus COS-7-Zellen, ergab eine 10fache Verdünnung der Probe eine Extinktion von 0,079, entsprechend 10 nM in der obigen Standardkurve. Somit hatte die c-ART-b-Präparation eine Konzentration von 100 nM.
2 zeigt die Bindungsaffinität von c-ART-b für den Human-MC3R. Gezeigt ist die Inhibierung von ¹²⁵I-[Tyr²][Nle⁴, D-Phe⁷]-α-melanozytenstimulierendem Hormon (¹²⁵I-NDP-α-MSH) an den Human-MC3R durch c-ART-b.
3 zeigt die Bindungsaffinität von c-ART-b für den Human-MC4R. Gezeigt ist die Inhibierung der Bindung von ¹²⁵I-NDP-α-MSH an den Human-MC4R durch c-ART-b.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt C-terminale Polypeptide bereit, die von dem ART („agoutirelated transcript")-Protein abgeleitet sind, und DNA-Sequenzen, welche für diese Polypeptide codieren. Die C-terminalen Polypeptide von dem ART-Protein werden hier als "ART-Polypeptide” bezeichnet. In bestimmten Ausführungsformen liegen die ART-Polypeptide in einer zusammenhängenden Polypeptidsequenz vor, d.h. ein Fusionsprotein, das, im Allgemeinen am C-Terminus des Fusionsproteins, eine oder mehrere Aminosäuresequenz(en) inkorporiert, die nicht von dem ART-Protein abgeleitet ist/sind. Solche Nicht-ART-Proteinsequenzen können z.B. "Tags" sein, wie z.B. eine Proteinkinase A-Stelle (für leichtere Radioisotopenmarkierung) oder eine antigene Sequenz (z.B. ein myc-Epitop) für quantitative ELISA-Bestimmung. Andere Tags sind im Stand der Technik bekannt und ART-Polypeptide, die solche anderen Tags inkorporieren, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. In anderen Ausführungsformen liegen die ART-Polypeptide in einem Fusionsprotein mit einem weiteren Protein vor, das zu einem leicht nachweisbaren Signal führt, z.B. alkalische Phosphatase (ART-AP) oder Luciferase (ART-luc). Fusionsproteine wie ART-AP oder ART-luc sind von Nutzen in Bindungsassays, da deren Anwesenheit und/oder Konzentration ohne Verwendung von Radioaktivität nachgewiesen werden kann.
Insbesondere schließt die vorliegende Erfindung die folgenden ART-Polypeptide ein:
c-ART-a: Dieses Polypeptid enthält vom N- zum C-Terminus: (1) ein Hefe-Signalsequenzpeptid; (2) Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) ein myc-Epitop; (5) eine Proteinkinase A (PKA)-Stelle; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz von c-ART-a ist:
c-ART-b: Dieses Polypeptid enthält vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) ein myc-Epitop; und (5) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz von c-ART-b ist:
c-ART-c: Dieses Polypeptid enthält vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) eine PKA-Stelle; (5) ein myc-Epitop; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz von c-ART-c ist:

ART-AP: Dieses Polypeptid enthält vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-132 des Human-ART-Proteins; (2) eine Thrombin-Stelle; (3) das Protein von alkalischer Phosphatase; (4) ein myc-Epitop; und (5) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz von ART-AP ist:
ART-luc: Dieses Polypeptid enthält vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-132 des Human-ART-Proteins; (2) eine Thrombin-Stelle; (3) das Luciferase-Protein; (4) ein myc-Epitop; und (5) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz von ART-luc ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid, das die Aminosäuren 1-26 und 76-132 des Human-ART-Proteins enthält, mit der folgenden Polypeptidsequenz:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid, das die Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins enthält, mit der folgenden Polypeptidsequenz:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid, das die Aminosäuren 1-26 und 75-131 des Maus-ART-Proteins enthält, mit der folgenden Polypeptidsequenz:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid, das die Aminosäuren 75-131 des Maus-ART-Proteins enthält, mit der folgenden Polypeptidsequenz:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) ein Hefe-Signalsequenzpeptid; (2) Aminosäuren 75-131 des Maus-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) ein myc-Epitop; (5) eine PKA-Stelle; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz dieses ART-Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Maus-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 75-131 des Maus-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) ein myc-Epitop; und (5) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz dieses ART-Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypepid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Maus-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 75-131 des Maus-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) PKA-Stelle; (5) ein myc-Epitop; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz dieses ART-Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-131 des Maus-ART-Proteins; und (2) das Protein der alkalischen Phosphatase. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-131 des Maus-ART-Proteins; und (2) das Luciferase-Protein. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) das Protein der alkalischen Phosphatase; (5) ein myc-Epitop; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) Aminosäuren 76-132 des Human-ART-Proteins; (3) eine Thrombin-Stelle; (4) das Luciferase-Protein; (5) ein myc-Epitop; und (6) ein Hexahistidin-Tag. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-132 des Human-ART-Proteins; und (2) das Protein der alkalischen Phosphatase. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-132 des Human-ART-Proteins; und (2) das Luciferase-Protein. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) das Protein der alkalischen Phosphatase; (3) Aminosäuren 27-132 des Human-ART-Proteins. Die Aminosäuresequenz ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein ART-Polypeptid mit der folgenden Sequenz, vom N- zum C-Terminus: (1) Aminosäuren 1-26 des Human-ART-Proteins; (2) das Luciferase-Protein; (3) Aminosäuren 27-132 des Human-ART-Proteins. Die Aminosäuresequenz ist:
Die ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Form vorliegen, die im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist. "Im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden" bedeutet mindestens zu 90 %, vorzugsweise 95 %, bevorzugter 99 %, und noch bevorzugter 99,9 % frei von anderen Proteinen. Somit wird eine ART-Polypeptid-Präparation, die im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist, als Prozentsatz seiner gesamten Polypeptide nicht mehr als 10 %, vorzugsweise nicht mehr als 5 %, bevorzugter nicht mehr als 1 % und noch bevorzugter nicht mehr als 0,1 % Nicht-ART-Polypeptide enthalten. Ob eine gegebene ART-Polypeptid-Präparation im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist, kann durch solche herkömmlichen Techniken wie z.B. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), kombiniert mit geeigneten Färbemethoden, z.B. Silberfärbung, bestimmt werden.
Es ist möglich, viele der Aminosäuren der ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu modifizieren und immer noch im Wesentlichen die selbe biologische Aktivität zu behalten, wie sie das unmodifizierte ART-Polypeptid besitzt. Ein modifiziertes ART-Polypeptid hat "im Wesentlichen die selbe biologische Aktivität" wie ein unmodifiziertes ART-Polypeptid, wenn das modifizierte Polypeptid einen IC₅₀-Wert für die Inhibierung der Bindung von ¹²⁵I-markiertem NDP-α-MSH an MC3R oder MC4R aufweist, die nicht mehr als 5fach größer ist als der IC₅₀-Wert des unmodifizierten ART-Polypeptids für die Inhibierung der Bindung von ¹²⁵I-markiertem NDP-α-MSH an MC3R oder MC4R.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung ART-Polypeptide, welche Aminosäuredeletionen, -additionen oder -substitutionen aufweisen, jedoch immer noch im Wesentlichen die selbe biologische Aktivität behalten wie das unmodifizierte ART-Polypeptid, von dem sie abgeleitet sind. Es ist allgemein akzeptiert, dass einzelne Aminosäuresubstitutionen an nicht-kritischen Positionen gewöhnlich die biologische Aktivität eines Proteins oder Polypeptids nicht ändern (siehe z.B. Molecular Biology of the Gene, Watson et al., 1987, 4. Auflage, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Seite 226; und Cunningham & Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung modifizierte Polypeptide, bei denen eine einzige Aminosäuresubstitution in den SEQ-ID-Nm. 1-20 durchgeführt wurde, wobei die modifizierten Polypeptide immer noch im Wesentlichen die selbe biologische Aktivität wie die unmodifizierten ART-Polypeptide behalten. Die vorliegende Erfindung umfasst auch modifizierte Polypeptide, bei denen zwei Aminosäuresubstitutionen in den SEQ-ID-Nm. 1-20 durchgeführt wurden, wobei die Polypeptide immer noch im Wesentlichen die selbe biologische Aktivität wie die unmodifizierten ART-Polypeptide behalten. Allgemeiner umfasst die vorliegende Erfindung modifizierte Polypeptide, bei denen Aminosäuresubstitutionen in Regionen der Polypeptide durchgeführt wurden, die nicht kritisch sind, d.h. in Regionen, in denen Modifikationen zu einem Polypeptid mit im Wesentlichen der selben biologischen Aktivität wie das unmodifizierte Polypeptid führen.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, bei denen die oben beschriebenen Substitutionen konservative Substitutionen sind. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" bezieht sich auf den Ersatz eines Aminosäurerests durch einen anderen chemisch ähnlichen Aminosäurerest. Beispiele solcher konservativen Substitutionen sind: Substitution eines hydrophoben Rests (Isoleucin, Leucin, Valin oder Methionin) gegen einen anderen; Substitution eines polaren Rests durch einen anderen polaren Rest der selben Ladung (z.B. Arginin für Lysin; Glutaminsäure für Asparaginsäure).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch DNA-Sequenzen, die für Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen der SEQ-ID-Nm. 1-20 codieren, mit der Maßgabe, dass im Falle der DNA-Sequenzen, welche für die SEQ-ID-Nm. 6-9 codieren, die DNA-Sequenzen nicht für irgend eine andere zusammenhängende Folge von Aminosäuren des ART-Proteins als die SEQ-ID-Nm. 6-9 codieren.
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in einer Form vorliegen, die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren ist. "Im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren" bedeutet zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, bevorzugter 99 % und noch bevorzugter 99,9 % frei von anderen Nukleinsäuren. Somit wird eine Präparation von DNA-Sequenzen, codierend für ein ART-Polypeptid, die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren ist, als Prozentsatz ihrer gesamten Nukleinsäuren nicht mehr als 10 %, vorzugsweise nicht mehr als 5 %, bevorzugter nicht mehr als 1 % und noch bevorzugter nicht mehr als 0,1 % anderer Nukleinsäuren enthalten als die DNA-Sequenzen, die für ART-Polypeptide codieren. Ob eine gegebene Präparation von DNA-Sequenzen, codierend für ein ART-Polypeptid, im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren ist, kann durch solche herkömmlichen Techniken wie z.B. Agarosegelelektrophorese in Kombination mit geeigneten Färbemethoden, beispielsweise Ethidiumbromid-Anfärbung, bestimmt werden.
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die für ART-Polypeptide codieren, können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft sein, z.B. DNA-Sequenzen, mit denen DNA-Sequenzen, die für das ART-Protein codieren, nicht natürlicherweise verknüpft sind, um "rekombinante DNA-Moleküle" zu bilden, die für ART-Polypeptide codieren. Solche anderen Sequenzen können DNA-Sequenzen einschließen, welche die Transkription oder Translation steuern, wie z.B. Translationsinitiationssequenzen, Promotoren für RNA-Polymerase II, Transkriptions- oder Translationsterminationssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Sequenzen, welche die Replikation in Mikroorganismen steuern oder welche Antibiotikaresistenz verleihen.
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in Vektoren wie Plasmide, Cosmide, virale Vektoren oder künstliche Hefechromosomen inseriert werden.
Von der vorliegenden Erfindung umfasst sind DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen, die für ART-Polypeptide codieren, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Als Beispiel und nicht als Beschränkung ist ein Verfahren unter Anwendung von Bedingungen hoher Stringenz wie folgt: Die Vorhybridisierung von Filtern, enthaltend DNA, wird für 2 h bis über Nacht bei 65° C in Puffer durchgeführt, der aus 6 × SSC, 5 × Denhardts Lösung und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA besteht. Die Filter werden für 12 bis 48 h bei 65° C in Vorhybridisierungsmischung hybridisiert, die 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5-20 × 10⁶ CpM von ³²P-markierter Sonde enthält. Das Waschen der Filter erfolgt bei 37° C für 1 h in einer Lösung, die 2 × SSC, 0,1 % SDS, enthält. Dem folgt ein Waschschritt in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 50° C für 45 Minuten vor der Autoradiographie. Andere Verfahren unter Anwendung von Bedingungen hoher Stringenz würden entweder eine Hybridisierung einschließen, die in 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung, 50 % Formamid bei 42° C für 12 bis 48 h durchgeführt wird, oder einen Waschschritt, der in 0,2 × SSPE, 0,2 % SDS, bei 65° C für 30 bis 60 Minuten durchgeführt wird.
Die Reagenzien, die in den vorstehenden Prozeduren zur Durchführung einer hoch stringenten Hybridisierung erwähnt wurden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Details der Zusammensetzung dieser Reagenzien sind beispielsweise in Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, zu finden. Neben den Vorstehenden sind andere Bedingungen hoher Stringenz, die angewandt werden können, im Stand der Technik wohlbekannt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Wirtszellen, welche gentechnisch manipuliert wurden, um DNA-Sequenzen, codierend für ART-Polypeptide zu enthalten und/oder zu exprimieren. Solche rekombinanten Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen, um ART-Polypeptide zu produzieren, kultiviert werden. Ein Expressionsvektor, enthaltend DNA, die für ART-Polypeptide codiert, kann zur Expression von ART-Polypeptiden in einer rekombinanten Wirtszelle verwendet werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zelllinien, die von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und Seidenraupe abgeleitete Zelllinien, Von Säugerspezies abgeleitete Zelllinien, welche für die rekombinante Expression von ART-Polypeptiden geeignet sind und welche im Handel erhältlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Eine Vielfalt von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von ART-Polypeptiden in Säugerzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), pcDNAI und pcDNAIamp, pcDNA3, pcDNA3.1, pCR3.1 (Invitrogen), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198) und pSV2-dhfr (ATCC 37146). Nach der Expression in rekombinanten Zellen können ART-Polypeptide mit herkömmlichen Techniken auf ein Niveau gereinigt werden, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist. Solche Substanzen sind wahrscheinlich von Nutzen bei der Kontrolle des Körpergewichts. Das Verfahren nutzt die Tatsache, dass ART-Polypeptide die Bindung von melanozytenstimulierenden Hormonen an Melanocortin-Rezeptoren inhibieren, indem sie selbst an den Rezeptor binden. Somit wird eine Substanz, welche der inhibitorischen Wirkung von ART-Polypeptiden auf die Bindung von melanozytenstimulierenden Hormonen an Melanocortin-Rezeptoren entgegenwirkt, wahrscheinlich durch Inhibierung der Bindung des ART-Polypeptids selbst an den Melanocortin-Rezeptor wirken. Das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren;
(b) Aussetzen der Zellen einer ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Abwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an die Zellen, um einen ersten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten;
(c) Aussetzen der Zellen der ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit einer ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons, um einen zweiten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten, wobei der zweite Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons anzeigt, dass im Vergleich zu dem ersten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons weniger Bindung von melanozytenstimulierendem Hormon erfolgt ist;
(d) Aussetzen der Zellen der ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit der ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids und in Anwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons, um einen dritten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten; wobei die Substanz ein Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor ist, wenn der dritte Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons größer als der zweite Wert ist.

In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor natürlicherweise exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, den Melanocortin-Rezeptor nicht natürlicherweise, sondern sind mit einem Expressionsvektor transfiziert worden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik für die Einführung des Expressions vektors, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, in die Zellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion calciumphosphat- oder calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das den Melanocortin-Rezeptor enthält, und Elektroporation.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, welche aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist der Melanocortin-Rezeptor kein Xenopus-Melanocortin-Rezeptor.
Die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, können prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen sein. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Hefezellen, Säugerzellen, Bakterienzellen und Insektenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus humanen Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, Rinderzellen, Schweinezellen, Hamsterzellen und Affenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293-Zellen (ATCC CRL 1573), Raji-Zellen (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171) besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen keine Xenopus-Melanophor-Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform ist das melanozytenstimulierende Hormon ausgewählt aus der Gruppe, welche aus α-melanozytenstimulierendem Hormon, β-melanozytenstimulierendem Hormon und γ-melanozytenstimulierendem Hormon besteht.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und die Bedingungen, unter denen das Verfahren praktiziert wird, sind Bedingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahren beträgt die ausgewählte Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons 0,05 nM bis 2,0 nM, vorzugsweise 0,1 nM bis 1,0 nM und bevorzugter 0,2 nM bis 0,5 nM.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens beträgt die ausgewählte Konzentration des ART-Polypeptids 10^-12 M bis 10^-7 M.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und das melanozytenstimulierende Hormon ist markiert, z.B. enzymatisch, radioaktiv oder dgl., und das Ausmaß der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an den Melanocortin-Rezeptor wird durch Bestimmung der Menge an Markierung, die an die Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor enthalten, gebunden ist, gemessen.
Die Schritte (b), (c) und (d) des oben beschriebenen Verfahrens können so modifiziert werden, dass anstatt intakte Zellen dem melanozytenstimulierenden Hormon, dem ART-Polypeptid oder der Substanz auszusetzen, Membranen aus den Zellen präpariert werden können und die Membranen dem melanozytenstimulierenden Hormon, dem ART-Polypeptid oder der Substanz ausgesetzt werden können. Eine solche Modifikation unter Verwendung von Membranen statt intakten Zellen in ähnlichen Verfahren wie den oben beschriebenen, obwohl auf die bindenden Wechselwirkungen anderer Liganden und Rezeptoren gerichtet, ist wohl bekannt und in beispielsweise Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 260-268, beschrieben.
Als weitere Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens kann RNA, die für den Melanocortin-Rezeptor codiert, hergestellt werden, z.B. durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines Plasmids, das Nukleotidsequenzen, die für den Melanocortin-Rezeptor codieren, unter der Kontrolle eines Bakteriophagen T7-Promoters enthält, und die RNA kann in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert werden, um die Expression des Melanocortin-Rezeptors in den Oozyten zu veranlassen. Diese Oozyten nehmen dann den Platz der Zellen in dem oben beschriebenen Verfahren ein.
Sobald eine Substanz als Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor identifiziert wurde, kann die Substanz getestet werden, um festzustellen, ob sie auch ein Agonist des Melanocortin-Rezeptors ist. Solche Tests würden das Aussetzen von Zeilen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, der Substanz in Abwesenheit des melanozytenstimulierenden Hormons und des ART-Proteins oder der ART-Polypeptide und die Feststellung, ob der Melanocortin-Rezeptor dabei durch die Substanz aktiviert wird, beinhalten. Auf diese Weise kann ein Inhibitor der Wirkung von ART-Protein auf MC3R oder MC4R identifiziert werden, der keine oder wenig MC3R- oder MC4R-Agonistenaktivität aufweist, jedoch die Inhibierung von MC3R- oder MC4R-Rezeptoraktivität, welche von dem ART-Protein hervorgerufen wird, verringert. Auf ähnliche Weise kann festgestellt werden, ob die Substanz ein Antagonist des Melanocortin-Rezeptors ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren;
(b) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und in Abwesenheit des Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid an den Melanocortin-Rezeptor binden würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre;
(c) Messen des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit und in Abwesenheit der Substanz; wobei eine Verringerung des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Mclanocortin-Rezeptor in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit anzeigt, dass die Substanz ein Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor ist.

In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor natürlicherweise exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, den Melanocortin-Rezeptor nicht natürlicherweise, sondern sind mit einem Expressionsvektor transfiziert worden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik für die Einführung des Expressionsvektors, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, in die Zellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion calciumphosphat- oder calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das den Melanocortin-Rezeptor enthält, und Elektroporation.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, welche aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist der Melanocortin-Rezeptor kein Xenopus-Melanocortin-Rezeptor.
Die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, können prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen sein. in einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Hefezellen, Säugerzellen, Bakterienzellen und Insektenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus humanen Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, Rinderzellen, Schweinezellen, Hamsterzellen und Affenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171) besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen keine Xenopus-Melanophor-Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht. In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das ART-Polypeptid in einer Konzentration von 10^-12 M bis 10^-7 M eingesetzt.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und die Bedingungen sind Bedingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und das ART-Polypeptid ist markiert, z.B. enzymatisch, radioaktiv oder dgl., und das Ausmaß der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor wird durch Bestimmung der Menge an Markierung, die an den Melanocortin-Rezeptor gebunden ist, gemessen. Das ART-Polypeptid wird entweder durch ³²P, ³³P oder ¹²⁵I (z.B. für c-ART-a oder c-ART-c) radioaktiv markiert sein oder nicht-radioaktiv (z.B. ART-AP, ART-luc, c-ART-AP oder c-ART-luc) markiert sein. Im Falle dieser letzteren ART-Polypeptide könen die ART-Polypeptide durch den Nachweis der enzymatischen Aktivität der Gruppierungen von alkalischer Phosphatase oder Luciferase der Polypeptide nachgewiesen werden.
Der Schritt (b) des oben beschriebenen Verfahrens kann so modifiziert werden, dass anstatt die Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz auszusetzen, Membranen aus den Zellen präpariert werden können und die Membranen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz ausgesetzt werden können. Eine solche Modifikation unter Verwendung von Membranen statt Zellen in ähnlichen Verfahren wie den oben beschriebenen, obwohl auf die bindenden Wechselwirkungen anderer Liganden und Rezeptoren gerichtet, ist wohl bekannt und in beispielsweise Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 260-268, beschrieben.
Als weitere Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens kann RNA, die für einen Melanocortin-Rezeptor codiert, hergestellt werden, z.B. durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines Plasmids, das Nukleotidsequenzen, die für einen Melanocortin-Rezeptor codieren, unter der Kontrolle eines Bakteriophagen T7-Promoters enthält, und die RNA kann in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert werden, um die Expression des Melanocortin-Rezeptors in den Oozyten zu veranlassen. Diese Oozyten nehmen dann den Platz der Zellen in dem oben beschriebenen Verfahren ein.
Sobald eine Substanz als Inhibitor der ART-Bindung an einen Melanocortin-Rezeptor identifiziert wurde, kann die Substanz getestet werden, um festzustellen, ob sie auch ein Agonist des Melanocortin-Rezeptors ist. Solche Tests würden das Aussetzen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, der Substanz in Abwesenheit von ART-Protein oder ART-Polypeptiden und die Feststellung, ob der Melanocortin-Rezeptor dabei durch die Substanz aktiviert wird, beinhalten. Auf diese Weise kann ein Inhibitor der ART-Protein-Bindung an MC3R oder MC4R identifiziert werden, der keine oder wenig MC3R- oder MC4R-Agonistenaktivität aufweist, jedoch die Inhibierung von MC3R- oder MC4R-Rezeptoraktivität, welche von dem ART-Protein hervorgerufen wird, verringert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein allosterischer Enhancer der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren;
(b) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid an den Melanocortin-Rezeptor binden würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre;
(c) Messen des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; wobei eine Erhöhung des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit anzeigt, dass die Substanz ein allosterischer Enhancer der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor ist.

In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor natürlicherweise exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, den Melanocortin-Rezeptor nicht natürlicherweise, sondern sind mit einem Expressionsvektor transfiziert worden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik für die Einführung des Expressionsvektors, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, in die Zellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion calciumphosphat- oder calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das den Melanocortin-Rezeptor enthält, und Elektroporation.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, welche aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist der Melanocortin-Rezeptor kein Xenopus-Melanocortin-Rezeptor.
Die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, können prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen sein. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Hefezellen, Säugerzellen, Bakterienzellen und Insektenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus humanen Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, Rinderzellen, Schweinezellen, Hamsterzellen und Affenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171) besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen keine Xenopus-Melanophor-Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht. in speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das ART-Polypeptid in einer Konzentration von 10^-12 M bis 10^-7 M eingesetzt.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und die Bedingungen sind Bedingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und das ART-Polypeptid ist markiert, z.B. enzymatisch, radioaktiv oder dgl., und das Ausmaß der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor wird durch Bestimmung der Menge an Markierung, die an Melanocortin-Rezeptor gebunden ist, gemessen.
Der Schritt (b) des oben beschriebenen Verfahrens kann so modifiziert werden, dass anstatt die Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz auszusetzen, Membranen aus den Zellen präpariert werden können und die Membranen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz ausgesetzt werden können. Eine solche Modifikation unter Verwendung von Membranen statt Zellen in ähnlichen Verfahren wie den oben beschriebenen, obwohl auf die bindenden Wechselwirkungen anderer Liganden und Rezeptoren gerichtet, ist wohl bekannt und in beispielsweise Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 260-268, beschrieben.
Als weitere Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens kann RNA, die für einen Melanocortin-Rezeptor codiert, hergestellt werden, z.B. durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines Plasmids, das Nukleotidsequenzen, die für einen Melanocortin-Rezeptor codieren, unter der Kontrolle eines Bakteriophagen T7-Promoters enthält, und die RNA kann in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert werden, um die Expression des Melanocortin-Rezeptors in den Oozyten zu veranlassen. Diese Oozyten nehmen dann den Platz der Zellen in dem oben beschriebenen Verfahren ein.
Melanocortin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, welche G_s stimulieren, was zur Produktion von cAMP führt (Cone et al., 1996, Recent Prog. Hormone Res. 51: 287-318). Somit können die ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden in einem Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein funktioneller Inhibitor der antagonistischen Wirkung eines ART-Polypeptids auf einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren;
(b) Aussetzen der Zellen einem melanozytenstimulierenden Hormon, wodurch der Melanocortin-Rezeptor aktiviert wird und die Bildung von cAMP veranlasst wird, die durch den Melanocortin-Rezeptor vermittelt wird;
(c) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und in Abwesenheit der Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid die durch den Melanocortin-Rezeptor vermittelte Bildung von cAMP inhibieren würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre;
(d) Messen der Menge an cAMP, die in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz gebildet wird; wobei eine Erhöhung der gebildeten Menge an cAMP in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein funktioneller Inhibitor der antagonistischen Wirkung des ART-Polypeptids auf den Melanocortin-Rezeptor ist.

In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor natürlicherweise exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, den Melanocortin-Rezeptor nicht natürlicherweise, sondern sind mit einem Expressionsvektor transfiziert worden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik für die Einführung des Expressionsvektors, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, in die Zellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion calciumphosphat- oder calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das den Melanocortin-Rezeptor enthält, und Elektroporation.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, welche aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist der Melanocortin-Rezeptor kein Xenopus-Melanocortin-Rezeptor.
Die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, können prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen sein. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Hefezellen, Säugerzellen, Bakterienzellen und Insektenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus humanen Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, Rinderzellen, Schweinezellen, Hamsterzellen und Affenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171) besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen keine Xenopus-Melanophor-Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform ist das melanozytenstimulierende Hormon aus der Gruppe ausgewählt, welche aus α-melanozytenstimulierendem Hormon, β-melanozytenstimulierendem Hormon und γ-melanozytenstimulierendem Hormon besteht.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und die Bedingungen sind Bedingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
Sobald eine Substanz als funktioneller Inhibitor der antagonistischen Wirkung eines ART-Polypeptids auf einen Melanocortin-Rezeptor identifiziert wurde, kann die Substanz getestet werden, um festzustellen, ob sie auch ein Agonist des Melanocortin-Rezeptors ist. Solche Tests würden das Aussetzen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, der Substanz in Abwesenheit von ART-Protein oder ART-Polypeptiden und die Feststellung, ob der Melanocortin-Rezeptor dabei durch die Substanz aktiviert wird, beinhalten. Auf diese Weise kann ein Inhibitor der ART-Protein-Bindung an MC3R oder MC4R entwickelt werden, der keine oder wenig MC3R- oder MC4R-Agonistenaktivität aufweist, jedoch die Inhibierung von MC3R- oder MC4R-Rezeptoraktivität, welche von dem ART-Protein hervorgerufen wird, verringert. Auf ähnliche Weise kann festgestellt werden, ob die Substanz ein Antagonist des Melanocortin-Rezeptors ist.
Die ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden in einem Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Wirkung eines ART-Polypeptids ist, welches von einem Assay unter Verwendung einer Xenopus-Melanophor-Zelllinie Gebrauch macht (siehe z.B. Quillan et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2894; Potenza & Lerner, 1992, Pigment Cell Res. 5:372; Ollman et al., 1997, Science 278: 135-138). Ein solches Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Xenopus-Melanophor-Zelllinie;
(b) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie einer ausgewählten Konzentration eines melanozytenstimulierenden Hormons in Abwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen ersten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten;
(c) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie der ausgewählten Konzentration von α-melanozytenstimulierendem Hormon in Anwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen zweiten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten, wobei der zweite Wert für die Pigment-Dispersion anzeigt, dass im Vergleich zum ersten Wert für die Pigment-Dispersion weniger Pigment dispergiert wurde;
(d) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie der ausgewählten Konzentration von α-melanozytenstimulierendem Hormon in Anwesenheit des ART-Polypeptids und in Anwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen dritten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten; wobei die Substanz ein Inhibitor der Wirkung des ART-Polypeptids ist, wenn der dritte Wert für die Pigment-Dispersion anzeigt, dass im Vergleich zum zweiten Wert mehr Pigment dispergiert wurde.

In einer speziellen Ausführungsform ist das melanozytenstimulierende Hormon aus der Gruppe ausgewählt, welche aus α-melanozytenstimulierendem Hormon, β-melanozytenstimulierendem Hormon und γ-melanozytenstimulierendem Hormon besteht.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens sind die Bedingungen Bedingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
Sobald eine Substanz als Inhibitor der Wirkung eines ART-Polypeptids identifiziert wurde, kann die Substanz getestet werden, um festzustellen, ob sie auch ein Agonist des Xenopus-Melanocortin-Rezeptors ist. Solche Tests würden das Aussetzen von Melanophorzellen, die den Xenopus-Melanocortin-Rezeptor exprimieren, der Substanz in Abwesenheit von ART-Protein oder ART-Polypeptiden und die Feststellung, ob der Melanocortin-Rezeptor dabei durch die Substanz aktiviert wird, beinhalten. Auf diese Weise kann ein Inhibitor der ART-Protein-Bindung an den Xenopus-Melanocortin-Rezeptor identifiziert werden, welcher als Leitsubstanz zur Entwicklung von ART-Eindungs-Inhibitoren für Human-MC3R oder -MC4R, die keine oder wenig MC3R- oder MC4R-Agonistenaktivität aufweisen, jedoch die Inhibierung von MC3R- oder MC4R-Rezeptoraktivität, welche von dem ART-Protein hervorgerufen wird, verringern, eingesetzt werden kann. Auf ähnliche Weise kann festgestellt werden, ob die Substanz ein Antagonist des Melanocortin-Rezeptors ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren;
(b) Aussetzen der Zellen einer ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons und einer ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids in Anwesenheit und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an die Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; wobei eine Erhöhung des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist.

In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor natürlicherweise exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform exprimieren die Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, den Melanocortin-Rezeptor nicht natürlicherweise, sondern sind mit einem Expressionsvektor transfiziert worden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik für die Einführung des Expressionsvektors, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, in die Zellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion calciumphosphat- oder calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das den Melanocortin-Rezeptor enthält, und Elektroporation.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, welche aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist der Melanocortin-Rezeptor kein Xenopus-Melanocortin-Rezeptor.
Die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, können prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen sein. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Hefezellen, Säugerzellen, Bakterienzellen und Insektenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, welche aus humanen Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, Rinderzellen, Schweinezellen, Hamsterzellen und Affenzellen besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der die Expression des Melanocortin-Rezeptors steuert, aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293-Zellen (ATCC CRL 1573), Raji-Zellen (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171) besteht. In einer speziellen Ausführungsform sind die Zellen keine Xenopus-Melanophor-Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform ist das melanozytenstimulierende Hormon aus der Gruppe ausgewählt, welche aus α-melanozytenstimulierendem Hormon, β-melanozytenstimulierendem Hormon und γ-melanozytenstimulierendem Hormon besteht.
In einer speziellen Ausführungsform hat das ART-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-19 und 20 besteht.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und die Bedingungen, unter denen das Verfahren praktiziert wird, sind Be dingungen, die typischerweise im Stand der Technik für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, die durch solche herkömmlich verwendeten Puffer wie PBS oder in Gewebekulturmedien repräsentiert werden, eine Temperatur von etwa 4° C bis etwa 55° C.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahren beträgt die ausgewählte Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons 0,05 nM bis 2,0 nM, vorzugsweise 0,1 nM bis 1,0 nM und bevorzugter 0,2 nM bis 0,5 nM.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens beträgt die ausgewählte Konzentration des ART-Polypeptids 10^-12 M bis 10^-7 M.
In speziellen Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens wird das Verfahren in vitro praktiziert und das melanozytenstimulierende Hormon ist markiert, z.B. enzymatisch, radioaktiv oder dgl., und das Ausmaß der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an den Melanocortin-Rezeptor wird durch Bestimmung der Menge an Markierung, die an die Zellen, welche den Melanocortin-Rezeptor enthalten, gebunden ist, gemessen.
Der Schritt (b) des oben beschriebenen Verfahrens kann so modifiziert werden, dass anstatt intakte Zellen dem melanozytenstimulierenden Hormon, dem ART-Polypeptid oder der Substanz auszusetzen, Membranen aus den Zellen präpariert werden können und die Membranen dem melanozytenstimulierenden Hormon, dem ART-Polypeptid oder der Substanz ausgesetzt werden können. Eine solche Modifikation unter Verwendung von Membranen statt intakten Zellen in ähnlichen Verfahren wie den oben beschriebenen, obwohl auf die bindenden Wechselwirkungen anderer Liganden und Rezeptoren gerichtet, ist wohl bekannt und in beispielsweise Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 260-268, beschrieben.
Als weitere Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens kann RNA, die für den Melanocortin-Rezeptor codiert, hergestellt werden, z.B. durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines Plasmids, das Nukleotidsequenzen, die für den Melanocortin-Rezeptor codieren, unter der Kontrolle eines Bakteriophagen T7-Promoters enthält, und die RNA kann in Xenopus-Oozyten mikroinjiziert werden, um die Expression des Melanocortin-Rezeptors in den Oozyten zu veranlassen. Diese Oozyten nehmen dann den Platz der Zellen in dem oben beschriebenen Verfahren ein.
Sobald eine Substanz als Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor identifiziert wurde, kann die Substanz getestet werden, um festzustellen, ob sie auch ein Agonist des Melanocortin-Rezeptors ist. Solche Tests würden das Aussetzen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren, der Substanz in Abwesenheit des melanozytenstimulierenden Hormons und des ART-Proteins oder der ART-Polypeptide und die Feststellung, ob der Melanocortin-Rezeptor dabei durch die Substanz aktiviert wird, beinhalten. Auf diese Weise kann ein Inhibitor der Wirkung von ART-Protein auf MC3R oder MC4R identifiziert werden, der keine oder wenig MC3R- oder MC4R-Agonistenaktivität aufweist, jedoch die Inhibierung von MC3R- oder MC4R-Rezeptoraktivität, welche von dem ART-Protein hervorgerufen wird, verringert. Auf ähnliche Weise kann festgestellt werden, ob die Substanz ein Antagonist des Melanocortin-Rezeptors ist.
Im Vergleich zum Volllängen-ART-Protein sind die ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kleiner und deshalb leichter herzustellen und es ist weniger wahrscheinlich, dass sie abgebaut werden. Bezüglich solcher Ausführungsformen der Erfindung wie z.B. c-ART-b beeinträchtigen die Nicht-ART-Protein-Aminosäuresequenzen, die dem C-Terminus der ART-Sequenzen hinzugefügt wurden, nicht die Bindung oder funktionelle Aktivität und erlauben eine ³²P- oder ³³P-Markierung ohne das Erfordernis, die ART-Sequenz zu markieren. Fusionspolypeptide, wie z.B. ART-AP oder ART-luc, erlauben die Verwendung von nicht-radioaktiven Methoden, um ART-Polypeptide in Bindungsassays nachzuweisen.
Es ist überraschend, dass die ART-Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Aminosäuresequenzen von Nicht-ART-Proteinen an ihrem C-Terminus funktionell sind. Der C-Terminus des ART-Proteins ist homolog zum C-Terminus des Agouti-Proteins, sowohl das ART-Protein als auch das Agouti-Protein haben ein charakteristisches Muster von Cysteinresten in dieser Region. Ein ähnliches Muster von Cysteinresten wurde in bestimmten Ionenkanalblockern aus Spinnen- und Schneckentoxinen gefunden. Es wurde postuliert, dass dieses Muster von Cysteinen zur Bildung spezieller Disulfidbrücken führt, welche die Toxine in eine charakteristische dreidimensionale Struktur zwingen, die für die biologische Aktivität der Toxine verantwortlich ist (Kim et al. 1995, J. Mol. Biol. 250: 659-671; hier im folgenden "Kim"). Obwohl die äußersten C-terminalen Aminosäuren des von Kim untersuchten Toxins nicht Teil dieser dreidimensionalen Struktur waren, waren diese äußersten C-terminalen Aminosäuren nichtsdestoweniger "von kritischer Bedeutung", da deren Änderung zu einem Aktivitätsverlust führte. Siehe Seite 665, rechte Spalte von Kim: "Diese Ergebnisse legen nahe, dass das C-terminale Segment von ω-AGA-IVA von kritischer Bedeutung für dessen Blockierungswirkung auf den Calciumkanal vom P-Typ ist, der in Ratten-Cerebellum-Purkinje-Zellen exprimiert wird." Somit würde man erwartet haben, dass die Veränderung des C-Terminus des ART-Proteins, z.B. durch dessen Verknüpfung mit Sequenzen aus einem Nicht-ART-Protein, zu einem ART-Fusionspolypeptid führte, dem die Aktivität des Volllängen-ART-Proteins fehlen würde oder mindestens wesentlich weniger Aktivität zeigen würde. Die vorliegende Erfindung demonstriert, dass dem nicht so ist.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele werden zur besseren Erläuterung der Erfindung gegeben.
BEISPIEL 1
Herstellung eines Konstrukts, das c-ART-b exprimiert
Das Expressionsplasmid für c-ART-b wurde konstruiert durch Modifizierung des ART-Expressionsplasmids, welches durch Insertion der ART-cDNA in die EcoRI- und BamHI-Stellen von pcDNA3.1-Myc-His-A (Fong et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 629-631; hier im folgenden "Fong") erzeugt worden war. Die c-ART-b-Sequenz unterscheidet sich von derjenigen des rekombinanten ART wie von Fong beschrieben insofern, als die Reste 27-75 von ART deletiert waren. Um dies zu erreichen, wurde eine erste PCR unter Verwendung des ART-Expressionsplasmids als Matrize und zweier Oligos (GGGCTCGGCGGTCCTGCAGGGCCAAGCCCATCTGGGC (SEQ-ID-Nr. 21) und der T7-Primer TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ-ID-Nr. 22)) durchgeführt, um das DNA-Fragment zu amplifizieren, welches für die ART-Reste 1-26, unmittelbar gefolgt von den Resten 76-81, codiert. Eine zweite PCR wurde unter Verwendung des ART-Expressionsplasmids als Matrize und zweier anderer Oligos (CTGCAGGACCGCGAGCCC (SEQ-ID-Nr. 23) und der pcDNA3.1A-Primer GTCGACGGCGCTATTCAG (SEQ-ID-Nr. 24)) durchgeführt, um das DNA-Fragment zu amplifizieren, welches für die ART-Reste 76-132 codiert. Eine dritte PCR wurde dann unter Verwendung der ersten und zweiten PCR-Produkte als Matrize und zweiter Oligos (der T7-Primer und der pcDNA3.1A-Primer) durchgeführt, um die c-ART-b-cDNA zu amplifizieren. Das endgültige PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespalten und mit dem pcDNA3.1-Myc-His-A-Vektor, der auf gleiche Weise mit EcoRI und BamHI gespalten worden war, ligiert. Die Thrombinstellen-Sequenz basierte auf der Thrombinstelle in pEP-34b (Novagen, Milwaukee, WI). Die Myc-Epitop-Sequenz und Hexahistin-Sequenz waren innerhalb des Vektors pcDNA3.1-Myc-His-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) enthalten.
BEISPIEL 2
Expression von c-ART-b
COS-7-Zellen in T-175-Kolben wurden transient mit dem c-ART-b-Expressionsplasmid (24 μg) mittels Lipofectamin (Gibco) transfiziert und in Opti-mem-Medium (Gibco), ergänzt mit 1 % fötalem Rinderserum, gezüchtet. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Kulturmedien gewonnen, zentrifugiert, um restliche Zellen zu entfernen, etwa 100fach in Centriprep-3 (Amicon) konzentriert und bei 4° C in Anwesenheit von 2,5 mM EGTA, 4 mg/ml Leupeptin und 0,01 mM Phosphoramidon gelagert. Nach Bestimmung der Konzentration von c-ART-b wurde NaN₃ auf 0,02 % zugegeben. Die Bestimmung der Konzentration von c-ART-b, welches die Myc-Sequenz enthält, basierte auf einer ELISA-Standardkurve. In Kürze, die Mikrotiterplatte wurde mit 0,2 μg eines Myc-Peptids (Human-c-Myc 408-439) über Nacht beschichtet, gewaschen, blockiert und gefolgt von einer Inkubation mit Anti-Myc-mAb-HRP-Konjugaten (Invitrogen) in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen des freien Myc-Peptids für 2 h. Das gebundene mAb-HRP wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Substrats, Tetramethylbenzidin (BioRad), nachgewiesen. Für die c-ART-b-Konzentrationsbestimmung ersetzte eine c-ART-b-Probe das freie Myc-Peptid.
BEISPIEL 3
Bindung von c-ART-b an MC3R und MC4R
Bindungsassays erfolgten auf die gleiche Weise wie in Fong et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 629-631, beschrieben. Bindungsassays wurden durchgeführt unter Verwendung von Membranen, die aus L-Zellen oder CHO-Zellen, die stabil Human-MC3R, -MC4R oder -MC5R exprimierten, präpariert worden waren. Die Bindungsassay-Mischung enthielt 0,2 nM an ¹²⁵I-[Tyr²][Nle⁴, D-Phe⁷]-α-melanozytenstimulierendes Hormon (¹²⁵I-NDP-α-MSH), variierende Konzentrationen an c-ART-b oder Volllängen-ART-Protein und eine geeignete Menge an Membranen, so dass der gesamte gebundene Radioligand weniger als 10 % des zugesetzten Radioliganden betrug. Die obige Mischung in Bindungspuffer (50 mM Tris, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM KCl, pH 7,2) wurde bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert, gefolgt von Filtration durch GFC-Papier. Der gebundene Ligand wurde in einem γ-Zähler quantitativ bestimmt. IC₅₀-Werte wurden berechnet wie bereits beschrieben (Fong et al., 1996, Mol. Pharmacol. 50: 1605-1611). Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Aus 2 ist ersichtlich, dass c-ART-b die Bindung von ¹²⁵I-NDP-α-MSH an MC3R inhibiert.
Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt, um festzustellen, ob c-ART-b die Bindung von ¹²⁵I-markiertem NDP-α-MSH an MC4R inhibiert. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Aus 3 ist ersichtlich, dass c-ART-b die Bindung von ¹²⁵I-NDP-α-MSH an hMC4R inhibiert.
Ähnliche Experimente wurden mit Volllängen-Human-ART-Protein durchgeführt. Ähnliche Experimente wurden auch mit Volllängen-ART-Protein und mit c-ART-b für den Melanocortin-5-Rezeptor (MC5R) durchgeführt. Aus diesen Experimenten, anhand der Ergebnisse, die in den 2 und 3 gezeigt sind, und aus ähnlichen Experimenten können die folgenden IC₅₀-Werte für die Inhibierung von ¹²⁵I-markiertem NDP-α-MSH an MC3R, MC4R und MC5R durch Volllängen-ART-Protein und durch c-ART-b bestimmt werden. Tabelle 1

hMC3R hMC4R hMC5R

Volllängen-ART 1,0 O' 0,4 (4) 0,5 O' 0,1 (3) > 40

c-ART-b 1,9 O' 1,0 (2) 1,4 O' 0,1 (2) nicht durchgeführt
Die in Tabelle 1 gezeigten IC₅₀-Werte sind in nM angegeben. Die Zahlen in Klammern repräsentieren die Anzahl der durchgeführten Experimente. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass überraschenderweise c-ART-b, obwohl ihm ein signifikantes Ausmaß der Sequenz vom N-Terminus des ART-Proteins fehlt, im Wesentlichen funktionell äquivalent zu dem Volllängen-ART-Protein ist. Darüber hinaus ist c-ART-b funktionell, obwohl es ein signifikantes Ausmaß an Nicht-ART-Sequenzen an seinem C-Terminus aufweist (eine Thrombin-Stelle, ein myc-Epitop und ein Hexahistidin-Tag).
BEISPIEL 4
Funktioneller Assay für die Bindung von c-ART-b an MC3R und MC4R
Das Vermögen von c-ART-b zur Inhibierung der Bildung von cAMP durch α-melanozytenstimulierendes Hormon, wirkend über MC3R oder MC4R, kann demonstriert werden durch Vorinkubation von L-Zellen, die stabil humanen MC3R oder MC4R exprimieren, mit c-ART-b für 10 Minuten, gefolgt von Inkubation mit 20 nM α-melanozytenstimulierendem Hormon für 45 Minuten. Der Inkubationspuffer enthält auch Earle's ausgewogene Salzlösung, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA und 0,5 mM IBMX. Nach der Inkubation werden die Zellen durch Kochen für vier Minuten lysiert. Die Konzentration an intrazellulärem cAMP wird mittels RIA (Huang et al., 1997, J. Rezeptor Signal Transduc. Res. 17: 599-607) unter Verwendung von Anti- cAMP-Antikörper und ¹²⁵I-cAMP wie modifiziert in dem Szintillationsproximity-Assay-Format (Amersham) gemessen.
Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Umfang nicht auf die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt sein. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung neben den hier beschriebenen für Fachleute auf dem Gebiet anhand der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sein.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ-ID-Nm. 1-3, 10-12, 15 und 16 besteht.
DNA-Sequenz, welche für das Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren; (b) Aussetzen der Zellen einer ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Abwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an die Zellen, um einen ersten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten; (c) Aussetzen der Zellen der ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit einer ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons, um einen zweiten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten, wobei der zweite Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons anzeigt, dass im Vergleich zu dem ersten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons weniger Bindung von melanozytenstimulierendem Hormon erfolgt ist; (d) Aussetzen der Zellen der ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit der ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids und in Anwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons, um einen dritten Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons zu erhalten; wobei die Substanz ein Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Mclanocortin-Rezeptor ist, wenn der dritte Wert für die Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons größer als der zweite Wert ist; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren; (b) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid an den Melanocortin-Rezeptor binden würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre; (c) Messen des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; wobei eine Verringerung des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein Inhibitor der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor ist; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein allosterischer Enhancer der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren; (b) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid an den Melanocortin-Rezeptor binden würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre; (c) Messen des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; wobei eine Erhöhung des Ausmaßes der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein allosterischer Enhancer der Bindung des ART-Polypeptids an den Melanocortin-Rezeptor ist; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein funktioneller Inhibitor der antagonistischen Wirkung eines ART-Polypeptids auf einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Zellen, die einen Melanocortin-Rezeptor exprimieren; (b) Aussetzen der Zellen einem melanozytenstimulierenden Hormon, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus α-melanozytenstimulierendem Hormon, β-melanozytenstimulierendem Hormon und γ-melanozytenstimulierendem Hormon besteht, um den Melanocortin-Rezeptor zu aktivieren, was zur Bildung von cAMP führt; (c) Aussetzen der Zellen einem ART-Polypeptid in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz unter solchen Bedingungen, dass das ART-Polypeptid die durch den Melanocortin-Rezeptor vermittelte Bildung von cAMP inhibieren würde, wenn die Substanz nicht anwesend wäre; (d) Messen der Menge an cAMP, die in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz gebildet wird; wobei eine Erhöhung der gebildeten Menge an cAMP in Anwesenheit der Substanz im Vergleich zur Abwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein funktioneller Inhibitor der antagonistischen Wirkung des ART-Polypeptids auf den Melanocortin-Rezeptor ist; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Wirkung eines ART-Polypeptids ist, umfassend: (a) Bereitstellen einer Xenopus-Melanophor-Zelllinie; (b) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie einer ausgewählten Konzentration von α-melanozytenstimulierendem Hormon in Abwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen ersten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten; (c) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie der ausgewählten Konzentration von α-melanozytenstimulierendem Hormon in Anwesenheit des ART-Polypeptids und in Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen zweiten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten; wobei der zweite Wert für die Pigment-Dispersion anzeigt, dass im Vergleich zum ersten Wert für die Pigment-Dispersion weniger Pigment dispergiert wurde; (d) Aussetzen der Xenopus-Melanophor-Zelllinie der ausgewählten Konzentration von α-melanozytenstimulierendem Hormon in Anwesenheit des ART-Polypeptids und in Anwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Pigment-Dispersion, um einen dritten Wert für die Pigment-Dispersion zu erhalten; wobei die Substanz ein Inhibitor der Wirkung des ART-Polypeptids ist, wenn der dritte Wert für die Pigment-Dispersion anzeigt, dass im Vergleich zum zweiten Wert mehr Pigment dispergiert wurde; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Zellen, die den Melanocortin-Rezeptor exprimieren; (b) Aussetzen der Zellen einer ausgewählten Konzentration des melanozytenstimulierenden Hormons und einer ausgewählten Konzentration des ART-Polypeptids in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz und Messen des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons an die Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; wobei eine Erhöhung des Ausmaßes der Bindung des melanozytenstimulierenden Hormons in Anwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz ein Inhibitor der Bindung eines ART-Polypeptids an einen Melanocortin-Rezeptor ist; wobei das ART-Polypeptid das Fusionsprotein nach Anspruch 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Melanocortin-Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) und dem Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) besteht.