DE69831956T2

DE69831956T2 - Mikrotiterplatte.

Info

Publication number: DE69831956T2
Application number: DE69831956T
Authority: DE
Inventors: Gregory Mathus
Original assignee: Corning Inc
Current assignee: Corning Inc
Priority date: 1997-02-11
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2018-02-04
Also published as: DE69831956D1; AU6055798A; EP1007623B1; WO1998035013A1; EP1007623A1; US5972694A; EP1007623A4

Description

Hintergrund
Diese Erfindung betrifft eine Multiwell-Clusterplatte zum in vitro Züchten von Zell- oder Gewebekulturen und umfasst insbesondere eine neue und verbesserte Zellkulturplatte und Wellstruktur, die eine Vorrichtung zum Tragen von Gewebekulturen in einem fluiden Medium mit einer Struktur, die ungehinderten Zugang zu dem Teil des Wells unterhalb der Gewebekultur erlaubt, vereint.
Vorteile des in vitro Züchtens von Gewebe durch Tragen einer mikroporösen Membran wie zum Beispiel einem Zellzüchtungssubstrat in einem Kulturmedium sind bekannt. Durch das Tragen einer mikroporösen Membran in einem nährstoffreichen Medium kann eine Zellschicht an eine Membran angehaftet und darauf gezüchtet werden. Diese Zellschicht kann Nährstoffe durch die poröse Membran aus dem Medium darunter erhalten. Die Zellschicht ist von dem Medium durch die Membran getrennt. Ein Konzentrationsgradient an Nährstoffen entwickelt sich und versorgt die Zellen durch diese permeable Membran. Dieses basolaterale Verfahren der Ernährung ähnelt den in vivo-Bedingungen besser, nach denen polarisierte Strukturen wie zum Beispiel Epithelzellen sich funktionell verhalten. Die Schaffung natürlicherer Zellbedingungen ist ein Vorteil für Wissenschaftler, die den Zelltransport und andere biologische Aktivitäten untersuchen.
Zellkultureinsätze wurden verwendet, um die basolaterale Ernährungstechnik auszunutzen. Zellkultureinsätze werden von einem Plastikmaterial mit einer Membran auf der Unterseite um fasst. Die Einsätze passen in Wells einer Kulturplatte, so dass die Membran innerhalb eines entsprechenden Wells aufgehängt ist. Das Well selbst enthält ein Kulturmedium, in das die Membran eingetaucht ist. Herkömmliche Zellkultureinsätze und -vorrichtungen sind im dem US-Patent Nr. 4,871,674, dem US-Patent Nr. 5,026,649, dem US-Patent Nr. 5,215,920, dem US-Patent Nr. 5,466,602 und dem US-Patent Nr. 5,468,638 beschrieben. Viele Einsätze schließen auch eine Öffnung in der hängenden Trägerstruktur ein, die Zugang zu dem Kulturmedium unterhalb der Membran erlaubt. Dieser Zugang ist für die Aufrechterhaltung angemessener Niveaus an Nährstoffen und Abfallprodukten in dem Kulturmedium entscheidend. Durch diese Öffnungen kann Kulturmedium entfernt und ersetzt werden, ohne das Membransubstrat zu stören.
Das US-Patent Nr. 5,141,718 offenbart ein Gerät, das einen Streifen aus Einsatzwells mit einer Platte kombiniert, die tränenförmige Reservoirs enthält. Jedes Reservoir weist einen kreisförmigen Teil und einen dreieckigen Teil auf. Die Streifen weisen eine Vielzahl röhrenförmiger Teile auf, die an den Membranen angebracht sind. Diese Streifen werden in die Platten eingesetzt, so dass jedes röhrenförmige Teil in ein Reservoir eingetaucht wird. Das röhrenförmige Element besetzt im Wesentlichen den gesamten kreisförmigen Teil des Reservoirs. Zugang zu dem Reservoir wird durch den dreieckigen Teil bewerkstelligt, ohne das Membransubstrat zu stören. Das Problem bei diesem Einsatzstreifenplattengerät ist zweifach. Erstens entsprechen die Wells nicht dem Standard 96-Well Industriestandard und können daher nicht an viele der Hilfsgeräte angepasst werden, die speziell für solche Platten entworfen worden sind. Zweitens sind die Einsatzstreifen verhältnismäßig instabil gemessen an der Platte, die ihre gesamte Wellstruktur dauerhaft in der Platte selbst integriert hat.
Die Arzneimittelindustrie hat seit mehreren Jahren Einsätze für die Verwendung in Arzneimitteltransportstudien verwendet, wie zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 5,026,649 gezeigt ist. Zellen werden zu einer konfluenten Monolage auf einer mikroporösen Membran gezüchtet. Elektroden können auf jeder Seite der Membran angebracht werden, um die Konfluenz der Monolage zu überprüfen. Danach wird eine zu screenende Verbindung in den unteren Teil des Wells gegeben, unterhalb der Membran. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird eine Untersuchung der Lösung auf der anderen Seite, oberhalb der Membran, durchgeführt. Die Anwesenheit und die Konzentration der Verbindung auf der anderen Seite der Membran zeigt die Fähigkeit der Verbindung an, durch die speziellen Zellen, die die Monolage umfassen, hindurch transportiert zu werden. Es besteht ein Bedarf für eine Kulturplatte, die fähig ist, diese Arten von Zelltransportuntersuchungen in einem industriellen Maßstab für das Screening einer großen Zahl von Arzneistoffen durchzuführen.
Mikrotestclusterplatten nach Industriestandard sind mit 96 Wells ausgelegt, wobei jedes eine ungefähre Querschnittsfläche von 0,053 Quadratzoll besitzt, in einer 8 × 12 Matrix (gegenseitig rechtwinklige 8 und 12 Wellreihen) mit einem Abstand von 0,355 Zoll zwischen den Mittelpunktlinien der Reihen, sowohl in x- als auch in y-Richtung. Zusätzlich sind die Höhe, die Länge und die Breite der Mikrotest-96-Well-Platten standardisiert. Diese Standardisierung hat zu der Entwicklung einer Vielzahl von Hilfsgeräten geführt, die speziell für 96-Well-Formate entwickelt wurden. Die Gerätschaft schließt Vorrichtungen ein, die genaue Volumina von Flüssigkeiten in Vielfache von 8, 12 oder 96 Wells gleichzeitig beladen oder entladen. Zusätzlich gibt es Gerätschaft, um Licht durch einzelne Wells hindurchzuschicken und kolorimetrische Änderungen oder Chemilumineszenz in einzelnen Wells auszulesen. Einige dieser Gerätschaften sind automatisiert und mit Instrumenten ausgestattet, um aufzunehmen, zu analysieren und die aufgenommenen Daten zu verändern.
Ein Problem, das mit Einsatzvorrichtungen einhergeht, besteht darin, dass ihre Größe es ihnen nicht ermöglicht, leicht mit dem Format von Standard 96-Well-Kulturplatten übereinzustimmen. Einsatzvorrichtungen hängen eine Membran innerhalb eines Wells auf. Um die Membran aufzuhängen, ohne dass sie die Wände des Wells berührt, muss die Membran selbst im Wesentlichen im Durchmesser kleiner als der Durchmesser der Innenseite des Wells sein. Des Weiteren wird der Zugang zu dem unteren Teil des Wells durch Einführen einer Pipette oder Spritze an der Seite der aufgehängten Membran erreicht. Daher muss die aufgehängte Membran nicht nur klein genug sein, um Kontakt mit der Wand des Wells zu vermeiden, sondern auch klein genug, um zu ermöglichen, dass eine Pipette oder Spritze zwischen sie und die Wellwand passt. In einer 96-Well-Platte ist der Durchmesser der Wells relativ klein (ungefähr 0,325 Zoll). Einsätze, die in diese kleinen Wells passen, besitzen Membranen, die wesentlich kleiner in ihrem Durchmesser als die Wells sind. Diese kleinen Membranen sind schwer zu handhaben, um es ist schwer, Studien an ihnen durchzuführen.
Die Einsatzstreifen gemäß dem US-Patent Nr. 5,141,718 verwenden mehr des Wellraums für die Membran aufgrund eines alternativen Zugangswegs zu dem unteren Teil des Wells. Die Membran kann jedoch nicht die vollständige Querschnittsfläche des Wells besetzen, da die röhrenförmigen Einsätze Wände haben, die ihrerseits Raum des Wells belegen.
Ein anderes Problem mit Einsätzen schließt die Mittel für den Zugang zur unteren Kammer des Wells ein. Einsätze erlauben den Zugang zu dem unteren Teil eines Wells durch Öffnungen in sich nach unten erstreckenden Wänden des Einsatzes. Während des Zugangs zur unteren Kammer kann eine unruhige Hand dazu führen, dass eine Pipette oder Spritzennadel die Seite der Öffnung berührt und somit den gesamten Einsatz erschüttert, was das Membransubstrat stören kann und Schaden für die Zellschicht selbst hervorrufen kann. Einsatzstreifen erlauben Zugang zu der unteren Kammer durch eine Erweiterung eines Reservoirs, in das die Streifen eingesetzt sind. Wie mit den Welleinsätzen kann jedoch eine Pipette oder Spritze die Membran, die an den Einsatzstreifen angeheftet ist, stören, da der Zugang zu dem Reservoir direkt zu dem Einsatz benachbart ist.
Die vorliegende Erfindung löst diese beiden Probleme durch Bereitstellen einer Platte mit einer Membran, die die gesamte Querschnittsfläche eines Wells mit Standard-96-Well-Format bedeckt, während ein Zugang zu dem unteren Teil des Wells durch vornehmlich getrennte Zugangsöffnungen ermöglicht wird. Die Erfindung verbindet die industriellen Untersuchungsvorteile der standardisierten 96-Well-Clusterplatte mit den funktionalen Vorteilen von Zellkultureinsätzen und Einsatzstreifen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Multiwell-Clusterplatte bereitzustellen, mit der Arzneimitteltransportstudien in großem Maßstab durchgeführt werden können. Eine andere Aufgabe besteht darin, eine Clusterplatte mit Membranen bereitzustellen, die über die gesamte Querschnittsfläche des Wells aufgehängt sind, während ein Zugang zu dem unteren Teil dieser Wells durch benachbarte Zugangsöffnungen bereitgestellt wird. Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Cluster-plattenartige Konstruktion mit den funktionellen Vorteilen von Zellkultureinsätzen, jedoch in einer dauerhaft integrierten Platte, bereitzustellen, wodurch der Bedarf an Welleinsätzen vermieden wird. Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Zugangsöffnung bereitzustellen, die physikalisch von dem oberen Teil des Wells getrennt ist, wodurch die Möglichkeit der Störung des Zellwachstumssubstrates während des Zugangs zu dem unteren Teil des Wells wesentlich vermindert wird. Eine andere Aufgabe besteht darin, ein einzigartiges Verfahren zur Herstellung der Platten der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
In Kürze betrifft die vorliegende Erfindung eine verbesserte Clusterplatte und sein Herstellungsverfahren. Die Clusterplatte umfasst eine Vielzahl von nicht entfernbaren Wells. Die Wells besitzen eine obere Kammer und eine untere Kammer, getrennt durch eine mikroporöse Membran. Jedem Well benachbart ist eine entsprechende Zugangsöffnung. Die Zugangsöffnung ist eine getrennte Öffnung in der oberen Oberfläche der Platte, die direkten Zugang zu der unteren Kammer des entsprechenden Wells bietet. Die Zugangsöffnung stellt eine Verbindung zwischen der unteren Kammer und der umgebenden Umgebung bereit. Die untere Kammer des Wells besitzt eine größere Durchschnittsfläche als die Querschnittsflächen der oberen Kammer und der Zugangsöffnung zusammengenommen.
Das Verfahren zur Herstellung der Platten umfasst mehrere Schritte, nämlich: Ausbilden einer oberen Platte mit einer Vielzahl von oberen Kammern mit bestimmtem Durchmesser und einer Vielzahl von Zugangsöffnungen mit bestimmtem Durchmesser, wobei die oberen Kammern Seitenwände besitzen, und die Zugangsöffnungen Seitenwände besitzen; Ausbilden einer unteren Platte mit einer Vielzahl von Reservoirs, wobei die Querschnittsfläche eines jeden Reservoirs größer als die zusammengenommenen Querschnittsflächen seiner entsprechenden oberen Kammer und der Zugangsöffnung sind, wobei das Reservoir eine untere Wand besitzt; Positionieren einer Membran zwischen die obere Platte und die untere Platte, wobei die Membran entweder in Form eines Blattes oder einzelner Scheiben, die auf die Größe der oberen Kammern angepasst sind, besteht; Verbinden der oberen und der unteren Platten zusammen, so dass die jeweiligen oberen Kammern und Zugangsöffnungen mit jedem Reservoir fluchten; und, wenn ein Membranblatt verwendet wurde, wird das Membranmaterial zwischen der Zugangsöffnung und dem Reservoir entfernt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine ebene Ansicht einer 96-Well-Clusterplatte des Standes der Technik mit seinen Wells und Gesamtdimensionen entsprechend dem standardisierten Format, das von der Industrie angenommen wurde.
2 ist eine ebene Ansicht einer oberen Platte, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung.
3A ist eine ebene Ansicht einer Platte, die als unterer Teil verwendet wird und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
3B–3E sind ebene Ansichten einzelner Ausführungsformen für eine Gestaltungsausbildung eines Reser voirs, das gemäß der derzeitigen Erfindung hergestellt wurde.
4 ist eine nähere Ansicht einer Platte, die als unterer Teil der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
5A ist eine fragmentarische Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Platte aus 4, aufgenommen entlang der Schnittlinie 5-5 in 4.
5B ist eine fragmentarisches Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Platte aus 4, aufgenommen entlang der Schnittlinie 5-5 in 4.
5C ist eine fragmentarisches Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Platte aus 4, aufgenommen entlang der Schnittlinie 5-5 in 4.
5D ist eine fragmentarisches Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Platte aus 4, aufgenommen entlang der Schnittlinie 5-5 in 4.
6 ist eine Explosionsansicht einer Clusterplatte der vorliegenden Erfindung.
7 ist eine Ansicht der Ecke einer Clusterplatte, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
8 ist eine fragmentarische Querschnittsansicht der Clusterplatte aus 7, aufgenommen entlang der Schnittlinie 8-8 in 7.
9A ist eine fragmentarische Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Clusterplatte aus 7, aufgenommen entlang der Schnittlinie 9-9 in 7.
9B ist eine fragmentarische Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Clusterplatte aus 7, aufgenommen entlang der Schnittlinie 9-9 in 7.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In 1 ist ein Beispiel einer Standard-96-Wellplatte gezeigt. Seine Gesamthöhe, -breite und -länge sind auf 0,560, 3,365 bzw. 5,030 Zoll standardisiert. Die Platte schließt eine umgebende Randleiste 10, eine obere Oberfläche 12 und eine Anordnung von Wells, angeordnet ist 12 Reihen von jeweils acht Wells, ein, um 96 identische Wells in der Platte bereitzustellen. Die obere Oberfläche 12 erstreckt sich zwischen der Randleiste 10 und dem Umfang der Wells 14 auf der Außenseite der 96-Well-Matrix.
Industriestandards schreiben vor, dass die Mittellinien der Reihen 0,355 Zoll voneinander beabstandet sind, und ähnlich sind die Mittelpunkte benachbarter Wells in derselben Reihe mit demselben Abstand beabstandet. Jedes Well auf einer standardisierten 96-Well-Platte hat eine Querschnittsfläche von ungefähr 0,053 Quadratzoll. Die Clusterplatten sind für ge wöhnlich aus Plastik gegossen und werden mit durchsichtigen Abdeckungen (nicht gezeigt) mit Tropfringen bereitgestellt, um den Wasserverlust durch Verdampfen zu überprüfen, während Gasaustausch erlaubt wird und die Sterilität beibehalten wird.
Wie oben beschrieben hat das Format der 96-Well-Platte zu der Entwicklung einer beträchtlichen Vielfalt an Gerätschaft geführt, um Flüssigkeitsübertragungen von und zu den Wells durchzuführen, um Licht durch die Wells zu senden, um kolorimetrische Änderungen oder Chemilumineszenz in einzelnen Wells auszulesen, und für viele andere Funktionen. Die Flüssigkeitsübertragungsgerätschaft wird entweder von Hand oder per Roboter durchgeführt, und viele der Einrichtungen, die zur Analyse des Inhalts der Wells verwendet werden, sind automatisiert und instrumentiert, um die aufgenommenen Daten aufzunehmen, zu analysieren und zu verändern. Die vorliegende Erfindung schließt eine Multiwell-Clusterschale ein, die mit der Hilfsgerätschaft, die für dieses Format ausgestaltet wurde, kompatibel ist.
2 zeigt eine obere Platte 24, die bevorzugt durch Spritzguss gebildet wurde, und die bevorzugt aus einem pigmentierten, undurchsichtigen Plastik (z.B. Polystyrol oder Polypropylen) hergestellt ist. Die obere Platte schließt eine periphere Umrandung 16 ein, die Idealerweise mit den Abmessungen der Umrandung 12 der Standard-96-Well-Platte, wie auch der Gesamtlänge und -höhe übereinstimmt. Die Platte 24 besitzt eine obere Oberfläche 22 und schließt obere Kammern 18 ein, die kreisrunde Zylinder mit Seitenwänden sind, die an jedem Ende offen sind und sich durch die Platte 24 erstrecken, und bevorzugt in 12 nummerierten Reihen mit einem Abstand von 0,355 Zoll angeordnet sind, gemessen von der Mittellinie einer Reihe zu einer Mittellinie der nächsten aufeinander folgenden Reihe.
Die Reihen enthalten jeweils bevorzugt acht obere Kammern, die bevorzugt 0,355 Zoll – gemessen an den Zentren – beabstandet sind. Des weiteren ist die Mittellinie der ersten Reihe bevorzugt 0,565 Zoll von der Umrandung 16 auf dem linken Rand beabstandet, wie von der Industrie standardisiert.
Zwischen jeder Reihe oberer Kammern und unmittelbar folgend der letzten Reihe von Kammern sind Reihen von Zugangsöffnungen 20 angebracht. Zugangsöffnungen 20 sind einzelne Öffnungen, die auch kreisrunde Zylinder mit Seitenwänden sind, die an jedem Ende offen sind und sich durch die Platte 24 hindurch erstrecken. Die Platte aus 2 hat eine Zugangsöffnung für jede obere Kammer. Die Reihen der Zugangsöffnungen sind von den Reihen der oberen Kammern versetzt, so dass einzelne Zugangsöffnungen 20 sowohl zwischen Reihen oberer Kammern als auch zwischen einzelnen oberen Kammern 18 einer jeden Reihe angebracht sind. In der Platte aus 2 besitzt jede obere Kammer eine entsprechende Zugangsöffnung, die unterhalb und nach rechts angeordnet ist. Als Beispiel mit Verweis auf 2 entspricht die obere Kammer 26 der Zugangsöffnung 28. Die Zugangsöffnungen 20 stimmen aber allein genommen auch bevorzugt mit der 96-Well-Clustermatrix überein, d.h. sie sind bevorzugt in 12 Reihen angeordnet, mit Öffnungsmittelpunkten 0,355 Zoll voneinander beabstandet. Die Zentren darauf folgender einzelner Zugangsöffnungen in jeder Reihe sind ebenfalls bevorzugt 0,355 Zoll beabstandet. Die Mittellinie der ersten Reihe der Zugangsöffnungen, die zwischen Reihe 1 und Reihe 2 liegt, ist bevorzugt 0,740 Zoll von der Umrandung 16 am linken Rand beabstandet. Diese Anordnung maximiert die Verwendung des Raumes zwischen den Wells.
3A zeigt eine untere Platte 32, die bevorzugt spritzgegossen ist, und aus einem optisch klaren Plastik besteht (z.B.
Polystyrol oder Polypropylen). Die Platte 32 schließt eine Matrix von 96 tränenförmigen Reservoirs 30 ein, die an der oberen Oberfläche 34 offen sind und eine untere Wand besitzen. 3A bis 3E zeigen alternative paddelförmige Ausgestaltungen der Reservoirs. „Paddelförmig" soll jede Form meinen, bei der eine relativ große Querschnittsfläche mit einer kleineren Erweiterung geringerer Querschnittsfläche verbunden ist. 3B bis 3E sind Beispiele paddelförmiger Ausgestaltungen. 4 zeigt einen vergrößerten Eckbereich der unteren Platte 32 der vorliegenden Erfindung.
5A bis 5D zeigen unterschiedliche Ausführungsformen der unteren Wände der Reservoirs 30. 5A zeigt ein Reservoir mit einer flachen unteren Wand 31. 5B zeigt ein Reservoir mit einer geneigten oder gewinkelten unteren Wand 35. 5C zeigt ein Reservoir mit einer Elektrode 33, die das Reservoir 30 mit dem Boden der Platte verbindet. 5C zeigt andere Reservoirs mit einer abgeschrägten Bodenwand 35.
Wenn man 2 und 3A zusammen betrachtet, fluchtet jedes Reservoir 30 der unteren Platte 32 mit einer oberen Kammer 18 und einer Zugangsöffnung 20 der oberen Platte 24, so dass, wenn die obere Platte 24 auf die untere Platte 32 positioniert wird, jede obere Kammer 18 und jede Zugangsöffnung 20 der oberen Platte 24 mit einem entsprechenden Reservoir 30 der unteren Platte 32 in Verbindung steht.
Die horizontale Querschnittsfläche des Reservoirs 30 wird durch die Fläche bestimmt, die durch den Umfang der oberen Kammer 18, den Umfang der Zugangsöffnung 20 und der tangentialen Linien, die den Umfang der oberen Kammer mit dem Umfang der Zugangsöffnung verbindet, eingeschlossen wird. In allen Fällen ist die Querschnittsfläche des Reservoirs größer als die Flächen der oberen Kammer und der Zugangsöffnung zusammen. Zum Beispiel ist die Querschnittsfläche des Reservoirs größer als 0,053 Quadratzoll (die ungefähre Querschnittsfläche eines Wells im 96-Well-Format), wenn sie mit der Querschnittsfläche einer oberen Kammer eines Wells verglichen wird, die einem Well der standardisierten 96-Well-Platte entspricht. Die Mittellinie eines jeden Reservoirs wird durch Aufdrucken des Umfangs einer entsprechenden oberen Kammer 18 von der oberen Platte 24 aus 2 auf ein entsprechendes Reservoir 30 und Verbinden der Zentren dieser Kreise bestimmt. Die Reservoirs sind in 12 Reihen angeordnet, 0,355 Zoll beabstandet, gemessen von der Mittellinie einer Reihe bis zur Mittellinie der nächsten folgenden Reihe. Die Reihen enthalten jeweils 8 Reservoirs. Die Reservoirs in jeder Reihe sind ebenfalls 0,355 Zoll beabstandet, gemessen vom Bezugszentrum eines Reservoirs zum Bezugszentrum des nächsten Reservoirs in der Reihe. Des Weiteren ist die Mittellinie der ersten Reihe 0,565 Zoll vom linken Rand beabstandet, um mit der oberen Platte 24 zu fluchten. Zusätzlich ist jeder Punkt entlang des Umfangs eines jeden Reservoirs gleich beabstandet (bevorzugt 0,355 Zoll) von demselben Punkt des nächsten, entsprechenden Reservoirs, wenn es das nächste Reservoir in der Reihe ist, oder das Reservoir direkt darüber oder darunter.
6 zeigt eine Explosionsansicht der vorliegenden Erfindung. Das Einbringen eines Filterblattes zwischen zwei Plastikplatten ist bekannt, wie im US-Patent Nr. 4,948,442 gezeigt ist. Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Platte der vorliegenden Erfindung schließt mehrere Schritte ein. Als Erstes wird eine untere Platte 32 bevorzugt mit einem optisch klaren Plastik spritzgegossen. Das klare Plastik erlaubt die Durchführung von Lumineszenz betreffenden Untersuchungen von unterhalb der Wells. Als Nächstes wird eine obere Platte 24 spritzgegossen, bevorzugt aus einem undurchsichtigen Plastik. Das undurchsichtige Plastik wird optisches Übersprechen zwischen den oberen Kammern 18 der Wells verhindern. Dann wird ein Membranblatt 42 zwischen die untere Oberfläche 50 der oberen Platte 24 und die obere Oberfläche 34 der unteren Platte 32 positioniert, bevorzugt durch Kleben unter Verwendung eines klebenden Dichtungsmittels, das für Zellen nicht toxisch ist. Alternativ können Membranscheiben einzeln auf die Unterseiten der oberen Kammern der oberen Platte angebracht werden. Schließlich werden die zwei Platten zusammen fixiert, bevorzugt mit Klebstoff, einem druckempfindlichen Film, oder Heißkleber, so dass eine Zugangsöffnung und eine obere Kammer der oberen Platte mit jedem Reservoir fluchtet. Wenn ein Membranblatt während des Verfahrens verwendet wurde, würde das Membranmaterial von den Zugangsöffnungen entfernt, bevorzugt mittels eines Vakuumausstanzers. Die Höhe der resultierenden Clusterplatte der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt 0,560 Zoll sein, in Übereinstimmung mit dem 96-Well-Platten Industriestandard.
7–9 zeigen die Clusterplatte 38 der vorliegenden Erfindung. Die größeren Kreise stellen die Öffnungen dar, die sich in die obere Kammer 18 des Wells 40 erstrecken. Die kleineren Kreise stellen die Zugangsöffnungen 20 dar, die sich direkt in eine untere Kammer 44 des Wells 40 erstrecken. Am Boden der oberen Kammer und die obere Kammer von der unteren Kammer eines jeden Wells trennend ist bevorzugt eine mikroporöse Membran 42, zum Beispiel wie beschrieben im US-Patent Nr. 5,376,273, angebracht. Die permeable Membran dient als ein Substrat zum Zellwachstum und ist bevorzugt trackedged, wie zum Beispiel Nukleopore (Polycarbonat). Gegossene Membranen aus Nylon, Celluloseacetat oder Cellulosenitrat können auch verwendet werden. Das tränenförmige Reservoir 30 aus 3A wird zur unteren Kammer 44 eines Wells 40, nachdem die untere Platte 32 mit der oberen Platte 24 und dem Membransubstrat 42 verbunden wurde, um die Platte 38 der vorliegenden Erfindung zu bilden. Wie beschrieben, kann das Reservoir, das zu der unteren Kammer 44 des Wells 40 wird, eine geneigte Bodenwandung 35 (5B und 5D), oder eine flache Bodenwandung 31 (5A) besitzen. Die Neigung in 5B dient dazu, zu helfen, das gesamte Medium auf die Seite der unteren Kammer 44 zu trichtern, die mit der Zugangsöffnung 20 fluchtet.
Die Membran und die Oberfläche der oberen Kammer können corona- oder plasmabehandelt sein, um eine hydrophile Oberfläche zu erhalten. Alternativ oder zusätzlich kann die untere Kammer corona- oder plasmabehandelt sein, um eine hydrophile Oberfläche zu erzeugen und dadurch die Oberflächenspannung zu vermindern, was wiederum dabei hilft, Lufteinschlüsse zu vermeiden.
Für viele biologische Studien ist es wichtig, eine konfluente Monolage auf dem Membransubstrat zu züchten. Um die Konfluenz der Zellmonolage zu überprüfen, werden Elektroden auf beide Seiten der Membran platziert, und ein elektrisches Potential wird gemessen. Der Wellaufbau der vorliegenden Erfindung erlaubt es, dass eine Elektrode durch die Zugangsöffnung in die untere Kammer eingebracht wird, wobei eine andere Elektrode in der oberen Kammer des Wells platziert ist. Die Elektrode, die in die untere Kammer eingebracht werden soll, kann in solch einer Art und Weise gebogen sein, dass sie direkt unter die Membranoberfläche positioniert werden kann. Das elektrische Potential über die Membranoberfläche kann dann gemessen werden. Eine andere Ausführungsform, die in 5C gezeigt ist, besitzt eine untere Elektrode, die innerhalb der unteren Platte eingeschlossen ist. Ein leitender Kontaktpunkt durchdringt den Boden einer jeden unteren Kammer. Durch Einbringen einer anderen Elektrode in die obere Kammer eines Wells kann dann das elektrische Potential über die Membran gemessen werden.
8 zeigt eine fragmentierte Querschnittsansicht von zwei aufeinander folgenden Wells 40 der vorliegenden Erfindung. Die obere Platte 24 und die untere Platte 32 werden durch eine mikroporöse Membran 42 getrennt. Die obere Kammer 18 und die untere Kammer 44 werden durch die Membran getrennt, die die gesamte Kontaktstelle zwischen der oberen Kammer und der unteren Kammer bedeckt.
9A zeigt eine fragmentierte Querschnittsansicht, aufgenommen entlang der Linie 9-9 aus 7 und durch zwei Wells 40 und ihre angrenzenden Zugangsöffnungen 20. 9A zeigt die Beziehung zwischen den Wells und den Zugangsöffnungen. Die obere Kammer 18 eines jeden Wells 40 wird von der entsprechenden unteren Kammer 44 durch eine Membran 42 getrennt. Eine Zugangsöffnung 20 steht in direkter Verbindung mit der unteren Kammer. Die untere Kammer kann durch eine Pipette oder Spritzennadel 46 durch die Zugangsöffnung erreicht werden. Durch die Zugangsöffnung 20 kann Medium und Arzneistoff in der unteren Kammer 44 des Wells ausgetauscht werden, ohne das Membransubstrat 42 zu stören, das am Boden der oberen Kammer 18 angebracht ist. Die Zugangsöffnung ist merklich von der oberen Kammer durch Seitenwände 48 und einen Bereich 50 der oberen Oberfläche 22 der Clusterplatte getrennt. Diese physikalische Trennung zwischen der oberen Kammer und der Zugangsöffnung vermindert die Wahrscheinlichkeit der Störung des Membransubstrates. Die obere Platte 24 und die untere Platte 32, die die Erfindung ausmachen, sind durch die mikroporöse Membran 42 getrennt. Die obere Platte kann in Zugangsöffnungen 20 und obere Kammern 18 unterteilt werden. Die untere Platte hat eine Vielzahl von Reservoirs 30, die zu unteren Kammern 44 werden, wenn die zwei Platten aneinander gesetzt werden und die Wellbestandteile fluchten.
9B zeigt eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die untere Platte 32 und die obere Platte 24 sind so gegossen, dass sie einen abfallenden Kontaktbereich für die Membran 42 zur Anbringung bereitstellen. Die Membran 42 neigt sich aufwärts hin zu der Ausgangsöffnung 20, wenn sie angebracht ist. Somit kann Gas aus der unteren Kammer 44 durch die Zugangsöffnung 20 entweichen. Der Bereich der oberen Oberfläche 50, der die Zugangsöffnung 20 und die obere Kammer 18 trennt, ist am Ende geneigt und besitzt im Wesentlichen eine geringere Breite als der Rest der oberen Platte 24. Diese Ausführungsform verlangt, dass Membranscheiben auf den Boden der oberen Kammer der oberen Platte angebracht werden, bevor die Platten aneinander befestigt werden.
Jedes einzelne Well 40 kann in Wellbestandteile unterteilt werden, die einen oberen Teil mit einer oberen Kammer 18 und einer Zugangsöffnung 20, ein Membransubstrat 42 und eine untere Kammer 44 umfassen.
Die Multiwell-Platte der derzeitigen Erfindung kann lediglich ein Well mit einer entsprechenden Zugangsöffnung besitzen, jedoch bevorzugt eine Zugangsöffnung pro Well für jedes Well auf der Platte.
Obwohl eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beschrieben wurde, können andere Ausführungsformen anerkannt werden, ohne vom Gedanken der Erfindung abzuweichen, wie er durch die angefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

Multiwell-Clusterplatte mit einer oberen Platte, die eine Anzahl von oberen Kammern und Zugangsöffnungen aufweist, wobei jeder der oberen Kammern eine benachbarten Zugangsöffnung zugeordnet ist, einer Membran, die den Boden jeder der oberen Kammern bildet; und einer unteren Platte mit einer Vielzahl von tränen- oder paddelförmigen Reservoirs, wobei jedes Reservoir eine Bodenwand aufweist, wobei die untere Platte und die obere Platte so aneinander befestigt sind, dass jeder der unteren Kammern und deren zugeordnete Zugangsöffnung zu einem zugeordneten Reservoir ausgerichtet ist.
Multiwell-Clusterplatte nach Anspruch 1, wobei die obere Platte weiterhin eine Matrix an oberen Kammern aufweist, die der Well-Matrix eines Standard-96-Well-Formats entsprechen.
Multiwell-Clusterplatte nach Anspruch 2, wobei die untere Platte weiterhin eine Matrix von so beabstandeten Reservoirs aufweist, dass sie der Well-Matrix eines Standard-96-Well-Formats entspricht.
Multiwell-Clusterplatte nach Anspruch 3, wobei der Abstand zwischen den Zugangsöffnungen derselbe wie der Abstand zwischen den Wells in einem Standard-96-Well-Format ist.
Multiwell-Clusterplatte nach Anspruch 4, wobei die oberen Kammern einen vorgegebenen Durchmesser haben, der derselbe ist wie der Well-Durchmesser in einem Standard-96-Well-Format.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, wobei die Bodenwände der Reservoirs geneigt sind.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in den Bodenwänden der Reservoirs eine Elektrode eingebaut ist.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Bodenwände der Reservoirs parallel zu der oberen Fläche sind.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die obere Kammer und die Zugangsöffnung jeweils, eine Elektrode aufnehmen können.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die obere Kammer und die Membran hydrophil sind.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Reservoir hydrophil ist.
Multiwell-Clusterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Membran porös ist.
Multiwell-Clusterplatte nach Anspruch 12, wobei die Membran bahngeätzt ist.
Multiwell-Clusterplatte mit einer Platte, die eine obere Fläche und eine Vielzahl von Wellkomponenten darin aufweist, wobei die Wellkomponenten jeweils einen oberen Bereich und eine untere Kammer mit einer Bodenwand aufweisen, wobei der obere Bereich eine obere Kammer und eine Zugangsöffnung mit einer Membran aufweist, die die obere Kammer von der unteren Kammer trennt, wobei, die Zugangsöffnung für eine Verbindung zwischen der unteren Kammer und der oberen Fläche sorgt, und wobei ein Abschnitt der oberen Fläche die Zugangsöffnung von der unteren Kammer trennt.
Multiwell-Clusterplatte mit einer Platte, die eine obere Fläche und eine Vielzahl von nicht entfernbaren Wells aufweist, wobei die Wells eine obere Kammer und eine untere Kammer aufweisen, die eine untere Wand aufweist, wobei die oberen und die unteren Kammern von einer Membran getrennt sind und mindestens eine Zugangsöffnung vorgesehen ist, die die untere Kammer mit der oberen Fläche der Platte verbindet.
Platte zur Verwendung als oberen Abschnitt einer Multiwell-Clusterplatte, die einen oberen Abschnitt mit einer Vielzahl von oberen Kammern, die Wände haben, welche sich abwärts von der oberen Fläche zum Boden erstrecken, wobei der Boden an eine Membran bindbar ist, und die obere Fläche eine Vielzahl von Zugangsöffnungen aufweist, die Wände besitzen, die sich von der oberen Fläche aus abwärts erstrecken.
Verfahren zum Fertigen einer Multiwell-Clusterplatte mit folgenden Schritten: (a) Formen einer oberen Platte, die eine Vielzahl von oberen Kammern mit festgelegtem Durchmesser und eine Vielzahl von Zugangsöffnungen mit festgelegtem Durchmesser aufweist, von denen jede kleiner als der Durchmesser jeder der oberen Kammern ist, wobei die oberen Kammern Seitenwände und die Zugangsöffnungen Seitenwände aufweisen; (b) Formen einer unteren Platte mit einer Vielzahl von Reservoirs, wobei der horizontale Querschnittsbereich jedes Reservoirs größer ist als der kombinierte horizontale Quer schnittsbereich von einer der oberen Kammern und einem der Zugangsöffnungen, wobei die Reservoirs eine Bodenwand aufweisen; (c) Anordnen einer Membran zwischen der oberen Platte und der unteren Platte; (d) Verbinden der oberen und unteren Platten so miteinander, dass eine obere Kammer und eine Zugangsöffnung zu jedem Reservoir ausgerichtet sind; und (e) Entfernen der Membran zwischen jedem der Reservoirs und den Zugangsöffnungen.
Verfahren zum Herstellen einer Multiwell-Clusterplatte mit folgenden Schritten: (a) Formen einer oberen Platte mit einer oberen Fläche, die eine Vielzahl von oberen Kammern mit festgelegtem Durchmesser bildet und Bilden einer Vielzahl von Zugangsöffnungen mit vorbestimmtem Durchmesser, wobei die oberen Kammern Seitenwände aufweisen, und wobei die Zugangsöffnungen Seitenwände aufweisen; (b) Formen einer unteren Platte mit einer oberen Fläche, die eine Vielzahl von Reservoirs bildet, wobei der horizontale Querschnittsbereich jedes Reservoirs größer ist als die kombinierten horizontalen Querschnittsbereiche einer der oberen Kammern und einer der Zugangsöffnungen, wobei die Reservoirs eine Bodenwand aufweisen; (c) Anordnen mindestens einer Membranscheibe zwischen einer der oberen Kammern und einem der Reservoirs; und (d) Verbinden der oberen und unteren Platten so miteinander, dass eine obere Kammer und eine Zugangsöffnung zu jedem Reservoir ausgerichtet sind.