DE69829223T2 - Zytotoxische alkaloidderivate, die asmarin a und b umfassen, und aus einem schwamm isoliert wurden - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue zytotoxische Alkaloide, Asmarin A and B, welche aus dem Schwamm Raspailia sp. isoliert worden sind.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Seeorganismen, insbesondere weiche Korallen, Schwämme und Manteltiere liefern viele sekundäre Metaboliten und zeigen ein veränderliches Maß an biologischer Aktivität (Referenz 1). Eine Familie von diesen Metaboliten ist die Diterpen-Alkaloid Familie; im Jahre 1984 (Referenz 2) wurde über die Struktur von vier Agelasinen berichtet, nämlich:

  
• Wir haben aus dem Schwamm Raspailia sp. neue zytotoxische Diterpen-Alkaloide isoliert, welche mit dieser Agelasin Familie verwandt sind.
• Asmarin A, B und C sind in Tetrahedron Lett., 1998, 39 (20), 3323-6 offenbart worden, welche Schrift nach dem frühesten Prioritätsdatum der vorliegende Anmeldung veröffentlicht wurde.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung liefert ein neues Diterpen-Alkaloid, welches entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt ist:

  

  wobei:
  R¹ für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl oder ein niedrigeres Alkanoyl steht; R² für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl steht; R³ eine Alkylgruppe darstellt, welche eine oder mehrere Isopreneinheiten enthält; R⁴ und R⁵ für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl stehen; R⁶ ein niedrigeres Alkyl darstellt; X für F oder Cl oder Br oder I steht.
• In den Definitionen der Gruppen in den Formeln (I) und (II) bedeuten das niedrigere Alkyl und die niedrigere Alkylhälfte des niedrigeren Alkanoyls eine geradlinige Kette oder eine verzweigte Alkylgruppe, welche 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Neopentyl und Hexyl.
• Spezifischer betrachtet bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Asmarin A and B, welche aus dem Schwamm Raspailia sp. extrahiert und isoliert worden sind. Die Struktur von Asmarin A ist die folgende:

  
• Die gezeigte Stereochemie steht für eine verwandte Konfiguration.
• Asmarin A und Asmarin B weisen eine antitumorale Aktivität auf. Insbesondere zeigen Asmarin A und Asmarin B eine Antitumoraktivität gegenüber Zelllinien, welche von menschlichen, festen Tumoren abgeleitet sind, wie etwa von einem menschlichen Lungenkarzinom, von einem menschlichen Dickdarmkarzinom und von einem menschlichen Melanom und dergleichen, und sie sind aktiv gegenüber anderen Tumorzelllinien, wie etwa Leukämie und Lymphknotentumor.
• Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung einer Verbindung vor, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt ist, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren. Solch ein Medikament kann wahlweise eine oder mehrere antitumorale Verbindungen enthalten.
• Die vorliegende Erfindung sieht weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen vor, welche als ein aktives Ingrediens eine Verbindung enthalten, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt ist, sowohl wie auch ein Verfahren zur Herstellung derselben.
• Beispiele pharmazeutischer Zusammensetzungen erstrecken sich auf irgendeinen Feststoff (Tabletten, Pillen, Kapseln, Granulate, usw.) oder auf irgendeine Flüssigkeit (Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) mit einer geeigneten Formulierung einer oralen, einer topischen oder einer parenteralen Verabreichung, und sie können die reine Verbindung enthalten oder dieselbe in Kombination mit irgendeinem Träger oder mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen. Diese Zusammensetzungen müssen steril sein, wenn sie parenteral verabreicht werden.
• Die richtige Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche Verbindungen enthält, die entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt sind, wird variieren gemäß der pharmazeutischen Formulierung, der Art der Anwendung und der besonderen Lage, wobei die Wirtszelle und der Tumor behandelt werden. Andere Faktoren wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Zeit der Verabreichung, Geschwindigkeit der Ausscheidung, Zustand der Wirtszelle, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und die Schwere der Krankheit sollten mit berücksichtigt werden. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb des Maximums der zulässigen Dosis vorgenommen werden.
• ANTITUMORALE AKTIVITÄT
• Zellen wurden in einer logarithmischen Phase des Wachstums in einem sog. Eagle's Minimum Essential Medium gehalten, mit sog. Earle's Balanced Salts, mit 2,0 mM L-Glutamin, mit nicht essentiellen Aminosäuren, ohne Natriumbicarbonat (EMEM/neaa); ergänzt mit 10% fötalem Kalbserum (FCS = Fetale Calf Serum), 10^–2 M Natriumbicarbonat and 0,1 g/l Penicillin-G + Streptomycinsulfat.
• Ein Verfahren zur Durchmusterung ist vorgenommen worden, um die antitumorale Aktivität dieser Verbindungen zu bestimmen und zu vergleichen, dies unter Verwendung einer angepassten Form des von Bergeron et al. (Referenz 3) beschriebenen Verfahrens. Die eingesetzten, antitumoralen Zellen waren P-388 (Suspensionskultur eines lymphoiden Neoplasmas aus einer DBA/2 Maus), A-549 (einschichtige Kultur eines menschlichen Lungenkarzinoms), HT-29 (einschichtige Kultur eines menschlichen Dickdarmkarzinoms) und MEL-28 (einschichtige Kultur eines menschlichen Melanoms).
• Eine Kultur mit P-388 Zellen wurde in 16 mm Vertiefungen mit 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 1 ml Aliquots von MEM 5FCS angesetzt, welche die angezeigte Konzentration an Arzneimitteln enthielten. Ein getrennter Satz von Kulturen ohne Arzneimittel wurde angesetzt als Kontrollzüchtung, um zu gewährleisten, dass die Zellen in ihrer exponentiellen Wachstumsphase blieben. Alle Bestimmungen wurden doppelt ausgeführt. Nach drei Tagen der Inkubation bei 37°C, 10% CO₂ in einer 98% feuchten Atmosphäre, wurde ein IC₅₀ annähernd bestimmt, indem man das Wachstum in den Vertiefungen mit Arzneimitteln mit dem Wachstum in den Kontrollvertiefungen verglich.
• Kulturen von A-549, HT-29 und MEL-28 Zellen wurden in 16 mm Vertiefungen mit 2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 1 ml Aliquots von MEM 10FCS angesetzt, welche die angezeigte Konzentration an Arzneimitteln enthielten. Ein getrennter Satz von Kulturen ohne Arzneimittel wurde angesetzt als Kontrollwachstum, um zu gewährleisten, dass die Zellen in ihrer exponentiellen Wachstumsphase blieben. Alle Bestimmungen wurden doppelt ausgeführt. Nach drei Tagen der Inkubation bei 37°C, 10% CO₂ in einer 98% feuchten Atmosphäre, wurden die Vertiefungen mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Ein IC₅₀ wurde annähernd bestimmt, indem man das Wachstum in den Vertiefungen mit Arzneimittel mit dem Wachstum in den Kontrollvertiefungen verglich.
• Die Ergebnisse der in vitro zytotoxischen Proben für Asmarin A and Asmarin B mit den Zelllinien P-388, A-549, HT-29 and MEL-28 sind in der folgenden Tabelle gegeben:

  
• EXTRAKTION AND ISOLIERUNG
• Massenspektren von geringer Auflösung wurden in einem EIMS Massenspektrometer aufgezeichnet. ¹H and ¹³C-NMR Spektren wurden auf einem Bruker ARX-500 Spektrometer aufgezeichnet. Alle chemischen Verschiebungen werden angegeben mit Bezug auf TMS (δ = 0 ppm).
• Raspailia sp. (Rob Van Soest), (Klasse Demorspongia, Ordnung Poecilosclerida, Familie Raspailiidea) wurde in dein Dahlak Archipel, Eritrea, über ein sog. SCUBA Tauchen auf eine Tiefe von 23,5 m im Mai 1997 gesammelt. Eine Referenzprobe ist an der Tel Aviv Universität hinterlegt (ET-338). Der Schwamm wurde an Ort und Stelle gefroren. Der gefrorene, getrocknete Schwamm (20 g) wurde mit Ethylacetat 2x extrahiert, um ein braunes Gummi von 1.2 g nach der Verdampfung zu ergeben. Dieses braune Gummi wurde durch Kupchon in vier Fraktionen unterteilt: Hexan, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Wasser. Die Fraktionen mit CHCl₃ und CCl₄ waren ähnlich. Diese zwei Fraktionen wurden kombiniert und chromatographiert an einer Sephadex LH-20 Kolonne durch Eluieren mit MeOH:CHCl₃ (1:1), was fünf Fraktionen ergab. Die Fraktionen (3-5) wurden weiter wiederholt auf einer Sephadex LH-20 Kolonne mit demselben Lösungsmittelsystem chromatographiert, was Asmarin A (100 mg) als einen Feststoff ergab, mit Schmelzpunkt (melting point) mp = 232°C, in/z+ = 423 (C₂₅H₃₇N₅O), (100%) 188 (C₈H₆N₅O⁺), [α]_D ²⁰ + 55° (c = 0,5, CHCl₃), IR 3400, 2928, 1600, 1553, 1451, 1400, 1388, 900 cm^–1, und die Struktur dieses Asmarin A wurde durch eine Analyse unter Röntgenstrahlen bestätigt. Mit demselben Lösungsmittel wurde auch Asmarin B (120 mg) als ein Öl isoliert, m/z⁺ = 423 (C₂₅H₃₇N₅O), (100%) 188 (C₈H₆N₅O⁺, [α]_D ²⁰+ 60° (c = 0,5, CHCl₃), IR 3400, 2927, 1606, 1553, 1451, 1404, 1388, 900 cm^–1.
• Für die NMR Daten von Asmarin A und B wird auf die nachstehende Tabelle verwiesen: in allen Fällen besteht das Lösungsmittel aus CDCl₃ and alle chemischen Verschiebungen werden mit Bezug auf TMS (δ = 0 ppm) angegeben.
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• REFERENZEN
• 1. Faulkner, D. Nat.Prod.Rep. 1997, 14, 259-302 und darin angegebene Referenzen.
• 2. Nakamura, H. et al. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2989-2992
• 3. Raymond J. Bergeron, Paul F. Cavanaugh, Jr., Steven J. Kline, Robert G. Hughes, Jr., Gary T. Elliot und Carl W. Porter. Antineoplastic and antiherpetic activity of spermidine catecholamide iron chelators. Biochem. Bioph. Res. Comm. 1984, 121, 848-854.

Claims (9)

1. Verbindung, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt wird:

   

   wobei: R¹ für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl oder ein niedrigeres Alkanoyl steht; R² für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl steht; R³ eine Alkylgruppe darstellt, welche eine oder mehrere Isopreneinheiten enthält; R⁴ und R⁵ für Wasserstoff oder ein niedrigeres Alkyl stehen; R⁶ ein niedrigeres Alkyl darstellt; X für F oder Cl oder Br oder I steht; und das niedrigere Alkyl und die niedrigere Alkylhälfte des niedrigeren Alkanoyls eine geradlinige Kette oder eine verzweigte Alkylgruppe bedeutet, welche 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Neopentyl und Hexyl.
2. Verbindung, Asmarin A, gemäß Anspruch 1, mit der folgenden Formel:

   
3. Verbindung, Asmarin B, gemäß Anspruch 1, mit der Formel:

   

   und mit den folgenden NMR Daten in CDCl₃:

   

   
4. Verwendung einer Verbindung, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt wird, so wie in Anspruch 1 definiert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bösartigen Tumoren.
5. Verwendung von Asmarin A (so wie in Anspruch 2 definiert) oder von Asmarin B (so wie in Anspruch 3 definiert) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bösartigen Tumoren.
6. Pharmazeutisches Arzneimittel, welches als ein aktives Ingrediens eine Verbindung enthält, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt wird, so wie in Anspruch 1 definiert.
7. Pharmazeutisches Arzneimittel, welches als ein aktives Ingrediens Asmarin A (so wie in Anspruch 2 definiert) oder Asmarin B (so wie in Anspruch 3 definiert) enthält.
8. Verwendung einer Verbindung, welche entweder durch die Formel (I) oder durch die Formel (II) dargestellt wird, so wie in Anspruch 1 definiert, zusammen mit einer oder mit mehreren anderen antitumoralen Verbindungen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bösartigen Tumoren.
9. Verwendung von Asmarin A (so wie in Anspruch 2 definiert) oder von Asmarin B (so wie in Anspruch 3 definiert) zusammen mit einer oder mit mehreren anderen antitumoralen Verbindungen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von bösartigen Tumoren.