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Technischer Hintergrund
der Erfindung
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1. Technisches Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Laser
Mikrodissektion (LCM). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung
eine Vorrichtung für
das Aufnehmen von LCM-Abfragen, die einen LCM-Film beinhaltet, der
auf zumindest einem Teil des Inneren eines Analysebehälters angebracht
ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein LCM-Abfrageaufnahmegerät des Typs,
der als ebene Kappe bezeichnet werden kann.
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2. Erörterung des relevanten Standes
der Technik
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Krankheiten,
wie zum Beispiel Krebs, wurde lange durch Untersuchen von Gewebebiopsien
untersucht, um ungewöhnliche
Zellen zu identifizieren. Das Problem bestand darin, daß es kein
zufriedenstellendes Verfahren im Stand der Technik gab, um die interessierenden
Zellen von dem Umgebungsgewebe zu extrahieren. Gegenwärtig müssen Versuchsleiter
versuchen, die Zellen von Interesse manuell zu extrahieren oder
mittels Mikrodissektion durch entweder Versuche, diese mit einem
Handwerkzeug mechanisch zu isolieren, oder über einen verschachtelten Prozeß der Isolierung
und Kultivierung der Zellen. Die meisten Versuchsleiter erachten
beide Ansätze
als mühsam,
zeitraubend und ineffizient.
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Eine
neue Technik wurde entwickelt, die einen kleinen Zellcluster bzw.
Zellhaufen von einer Gewebeprobe in Sekunden extrahieren kann. Diese Technik
wird Laser Mikrodissektion (Lasereinfang einer Zellsektion (LCM)
genannt. Die Laser Mikrodissektion ist eine Einschritt-Technik,
die ein Standardlabormikroskop mit einem Niedrigenergielaser und einem
transparenten Ethylen-Vinyl-Acetat-Polymer-Thermoplastfilm,
wie er zum Beispiel für
die Kunststoffversiegelung in Nahrungsmittelproduktverpackungen
verwendet wird, zusammengefaßt.
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Bei
der Laser Mikrodissektion schaut der Benutzer durch ein Mikroskop
auf einen Gewebebiopsieschnitt, der auf einem histo-pathologischen
Standardglasobjektträger
gehalten wird, der typischerweise Gruppen von unterschiedlichen
Zelltypen enthält. Ein
thermoplastischer Film wird oberhalb und in Kontakt mit dem Gewebebiopsieschnitt
plaziert. Mit der Identifizierung einer Zellgruppe von Interesse
innerhalb des Gewebeabschnitts zentriert der Benutzer diese in einem
Zielgebiet des Mikroskopfeldes und erzeugt dann einen Puls von einem
Laser, wie zum Beispiel einem Kohlendioxidlaser, mit einer Intensität von etwa
50 Milliwatt (mW) und einer Pulsdauer von zwischen etwa 50 bis etwa
500 Millisekunden (mS). Der Laserpuls verursacht eine lokale Aufheizung
des Kunststofffilms, wenn er diesen durchdringt, was diesem eine
haftende Eigenschaft verleiht. Die Zellen haften dann an dem lokalisierten
Haftbereich des Kunststoffbandes direkt auf diesem, worauf die Zellen
sofort extrahiert werden und für
die Analyse bereit sind. Aufgrund des kleinen Durchmessers des Laserstrahls
können
extrem kleine Zellcluster aus einem Gewebeabschnitt mittels Mikrodissektion
entnommen werden.
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Durch
Aufnehmen nur dieser Zielzellen direkt von der Gewebeprobe können Wissenschaftler sofort
die Gen- und Enzymaktivität
der Targetzellen unter Verwendung von anderen Untersuchungswerkzeugen
analysieren. Solche Verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktionsverstärkung von
DNA und RNA und die Enzymgewinnung von der Gewebeprobe wurden demonstriert.
Keine Begrenzungen wurden in der Fähigkeit, DNA oder RNA von Tumorzellen,
die mittels Laser Mikrodissektion entfernt wurden, zu verstärken, festgestellt.
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Die
Laser Mikrodissektion hat erfolgreich in allen Geweben Zellen extrahiert,
in denen sie getestet wurde. Diese beinhalten Nierenkörperchen
(Glomeruli), in situ Brustkrebs, atypische duktale Hyperblasie der
Brust, prostatische epiteliale Neoplasie und lymphoide Follikel.
Der direkte Zugriff auf Zellen, der durch die Laser Mikrodissektion
bereitgestellt wird, wird wahrscheinlich zu einer Revolution beim Verständnis der
molekularen Basis von Krebs und anderen Krankheiten führen, was
dabei hilft, die Grundlage für
eine frühere
und präzisere
Krankheitserfassung zu legen.
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Eine
andere wahrscheinliche Rolle für
die Technik liegt in der Aufzeichnung der Muster von Genausdrücken in
verschiedenen Zelltypen, was ein sich abzeichnendes Thema in der
medizinischen Forschung ist. Beispielsweise versucht das Cancer Genome
Anatomy Project des National Cancer Institute (CGAP), die Muster
der Genausdrücke
in den normalen, den vorkarzinomatösen und den bösartigen
Zellen zu definieren. In Projekten, wie zum Beispiel CGAP ist die
Laser Mikrodissektion ein wertvolles Werkzeug für das Beschaffen von reinen
Zellproben aus Gewebeproben.
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Die
LCM-Technik wird allgemein beschrieben in dem kürzlich publizierten Artikel:
Laser Capture Microdissection, Science, Band 274, Nr. 5289, Ausgabe
8, Seiten 998–1001,
veröffentlicht
im Jahr 1996. Das Ziel der LCM-Technik ist es, ein einfaches Verfahren
für das
Beschaffen von ausgewählten menschlichen
Zellen aus einer heterogenen Population, die auf einem typischen
histopathologischen Biopsieschnitt enthalten ist, bereitzustellen.
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Eine
typische Gewebebiopsieprobe besteht aus einem 5 bis 10 Mikrometer
dicken Schnitt aus Gewebe, der auf einem Mikroskopglasobjektträger unter
Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet der Pathologie gut
bekannt sind, plaziert wird. Dieser Gewebeschnitt ist ein Querschnitt
des Körperorgans,
das untersucht wird. Das Gewebe besteht aus einer Vielzahl von unterschiedlichen
Zelltypen. Häufig
wünscht
der Pathologe nur einen kleinen Teil des Gewebes für die weitere
Analyse zu entfernen.
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LCM
setzt einen thermoplastischen Übertragungsfilm
ein, der auf der Gewebeprobe plaziert wird. Dieser Film wird hergestellt
und enthält
organische Farbstoffe, die ausgewählt werden, um selektiv im nahen
Infrarotbereich des Spektrums, das den Emissionsbereich von üblichen
ALGaAs Laserdioden überlappt,
zu absorbieren. Wenn der Film dem fokussierten Laserstrahl ausgesetzt
wird, wird der ausgesetzte Bereich durch den Laser aufgeheizt und schmilzt,
und haftet an dem Gewebe in der Region, die dem Laserstrahl ausgesetzt
war. Der Film wird dann von dem Gewebe angehoben und der ausgewählte Abschnitt
des Gewebes wird mit dem Film entfernt.
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Thermoplastische Übertragungsfilme,
wie zum Beispiel ein 100 Mikrometer dicker Ethyen-Vinyl-Acetatfilm
(EVA), der von Electroseal Corporation aus Pompton Lakes, New Jersey
(Typ E 540) erhältlich
ist, wurde in LCM-Anwendungen verwendet. Der Film wird ausgewählt, so
daß er
einen geringen Schmelzpunkt von etwa 90°C hat.
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Die
thermoplastischen EVA-Filme, die in den LCM-Techniken verwendet
werden, wurden mit Farbstoffen dotiert, wie zum Beispiel einem Infrarot-Napthalocyanin-Farbstoff,
der von der Aldrich Chemical Company erhältlich ist (Farbstoff Nr. 4,296-2
oder 39317-7). Diese Farbstoffe haben eine starke Absorption in
dem 800 nm Bereich, ein Wellenlängenbereich,
der mit Laseremittern überlappt, die
verwendet werden, um selektiv den Film zu schmelzen. Der Farbstoff
wird mit der geschmolzenen Kunststoffmasse bei einer erhöhten Temperatur gemischt.
Der gefärbte
Kunststoff wird dann Verwendung von Standardfilmherstellungstechniken
in einen Film umgearbeitet. Die Farbstoffkonzentration im Kunststoff
beträgt
etwa 0,001 M.
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Während sich
die Filme, die in LCM-Anwendungen eingesetzt werden, als für die Aufgabe
ausreichend erwiesen haben, haben sie verschiedene Nachteile. Die
optische Absorption eines farbstoffimprägnierten Films ist eine Funktion
seiner Dicke. Diese Eigenschaft des Films kann mit einem Wunsch, die
Filmdicke aus anderen Gründen
auszuwählen,
in Konflikt stehen.
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Die
organischen Farbstoffe, die verwendet werden, um die Absorptionscharakteristiken
der Filme zu verändern,
haben in manchen Fällen
nachteilige photochemische Effekte. Dies kann zu einer Kontaminierung
der LCM-Proben führen.
Zusätzlich
sind die organischen Farbstoffe, die heutzutage eingesetzt werden,
empfindlich gegenüber
der Wellenlänge
des einfallenden Laserlichts und somit muß der Film auf den eingesetzten
Laser angepaßt
werden.
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Die
WO-A-9713838 beschreibt eine LCM-Technik, in der eine Übertragungsfläche, die eine
Klebeschicht aufweist, verwendet wird, um Zellmaterial von einem
Trageglied zu übertragen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
Ziel der Erfindung ist es, die Geschwindigkeit der Laser Mikrodissektionstechnik
zu verbessern. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, die Genauigkeit
der Laser Mikrodissektionstechnik zu verbessern. Ein anderes Ziel
der Erfindung ist es, die Reproduzierbarkeit der Laser Mikrodissektionstechnik
zu verbessern. Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist es, die Kontaminationsmenge,
die mit der Laser Mikrodissektionstechnik einhergeht, zu reduzieren.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird eine Laser Mikrodissektionsvorrichtung
bereitgestellt, die aufweist:
einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche,
und
einen Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion, der mit der Substratfläche des Übertragungsfilmträgers verbunden
ist,
dadurch gekennzeichnet, daß der Übertragungsfilm für die Laser
Mikrodissektion zumindest ein einstückig ausgebildetes strukturelles
Merkmal beinhaltet, das vorsteht bzw. übersteht und einen kontrollierbaren
Abstand zwischen dem Übertragungsfilm
für die Laser
Mikrodissektion und einer Probe zur Verfügung stellt.
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Eine
Ausführungsform
des ersten Aspekts der Erfindung beinhaltet einen Laser Mikrodissektionsaufbau,
der aufweist: eine Platte mit einer im wesentlichen ebenen oberen
Fläche
und zumindest einer Laser Mikrodissektionskappe, die mit der im
wesentlichen ebenen oberen Fläche
der Platte verbunden ist, wobei die Laser Mikrodissektionskappe
einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche
und einen im wesentlichen planarisierten Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm,
der mit der Substratfläche des Übertragungsfilmträgers verbunden
ist, aufweist.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird ein integraler Abschnitt eines
biologischen Reaktionsgefäßes bereitgestellt,
der aufweist:
einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche
und
einen Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion, der mit der Substratfläche des Übertragungsfilmträgers verbunden
ist und zumindest ein integral ausgebildetes strukturelles Merkmal
beinhaltet, das vorsteht und einen beherrschbaren bzw. steuerbaren Abstand
zwischen dem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion und einer Probe bereitstellt.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der Erfindung wird ein Aufbau zur Laser Mikrodissektion
bereitgestellt, der aufweist:
eine Platte mit einer oberen
Fläche
und der gekennzeichnet ist durch:
zumindest einer Kappe zur
Laser Mikrodissektion, die mit der oberen Fläche der Platte verbunden ist, wobei
die zumindest eine Kappe zur Laser Mikrodissektion
einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche
und
einen Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion beinhaltet, der mit der Substratfläche des Übertragungsfilmträgers verbunden
ist und zumindest ein integral ausgebildetes strukturelles Merkmal
beinhaltet, das vorsteht und einen beherrschbaren Abstand zwischen
dem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion und einer Probe bereitstellt.
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Gemäß einem
vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Abbilden einer
Probe mit einem Mikroskop bereitgestellt, das aufweist:
Bereitstellen
des Mikroskops und
Positionieren eines Streumediums innerhalb
einem Strahlpfad, der von dem Mikroskop definiert wird,
gekennzeichnet
durch Positionieren des Streumediums innerhalb von wenigen Millimetern
einer Probe und
Abbilden der Probe durch das Streumedium mit
dem Mikroskop, wobei das Streumedium optisch mit einem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion gekoppelt ist, der zumindest ein integral
ausgebildetes strukturelles Merkmal hat, das vorsteht und einen beherrschbaren
Abstand zwischen dem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion und der Probe bereitstellt.
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Gemäß einem
fünften
Aspekt der Erfindung wird ein Mikroskop bereitgestellt, das aufweist:
ein
Streumedium, das in einem Strahlpfad lokalisiert ist, der von dem
Mikroskop definiert wird, und innerhalb von wenigen Millimetern
einer Probe lokalisiert ist, und
einen Übertragungsfilm für die Laser
Mikrodissektion, der optisch mit dem Streumedium gekoppelt ist und
zumindest ein integral ausgebildetes strukturelles Merkmal beinhaltet,
das vorsteht und einen beherrschbaren Abstand zwischen dem Übertragungsfilm
für Laser
Mikrodissektion und einer Probe bereitstellt.
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Entsprechend
einem sechsten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Brauchbarmachen einer
Laser Mikrodissektion bereitgestellt, das aufweist:
Bereitstellen
eines Übertragungsfilmträgers mit
einer Substratfläche
und
Herstellen eines Übertragungsfilms
für die
Laser Mikrodissektion durch Verbacken des Übertragungsfilms zur Laser
Mikrodissektion mit der Substratfläche unter Vakuum, wobei das
Herstellen das im wesentlichen Glätten zumindest eines Abschnittes
des Übertragungsfilms
für die
Laser Mikrodissektion und das Bilden von zumindest einem strukturellen
Merkmal auf dem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion, das vorspringt bzw. vorsteht, beinhaltet.
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Gemäß einem
siebten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Anfertigen eines
integralen Abschnitts eines biologischen Reaktionsgefäßes bereitgestellt,
das aufweist:
Bereitstellen eines Übertragungsfilmträgers mit
einer Substratfläche
und
Herstellen eines Übertragungsfilms
für die
Laser Mikrodissektion auf der Substratfläche, wobei das Herstellen das
im wesentlichen Glätten
von im wesentlichen einem Abschnitt des Übertragungsfilms für die Laser
Mikrodissektion und das Bilden von zumindest einem vorstehenden
bzw. vorspringenden Merkmal auf dem Übertragungsfilm für die Laser
Mikrodissektion beinhaltet.
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Gemäß einem
achten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines
Aufbaus für die
Laser Mikrodissektion bereitgestellt, das aufweist:
das zur
Verfügungstellen
einer Platte mit einer oberen Fläche,
das
zur Verfügungstellen
zumindest einer Kappe für die
Laser Mikrodissektion, wobei die zumindest eine Kappe für die Laser
Mikrodissektion einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche
beinhaltet,
das zur Verfügungstellen
eines Übertragungsfilms
für die
Laser Mikrodissektion, der mit der Substratfläche des Übertragungsfilmträgers verbunden
ist,
Positionieren der zumindest einen Kappe für die Laser
Mikrodissektion in Kontakt mit der Platte und
Verbacken unter
Vakuum von sowohl der zumindest einen Kappe für die Laser Mikrodissektion
als auch der Platte, so daß der
Aufbau für
die Laser Mikrodissektion erzeugt wird, wobei das Verbacken unter
Vakuum das im wesentlichen Glätten
von zumindest einem Abschnitt des Übertragungsfilms für die Laser Mikrodissektion
und das Bilden von zumindest einem strukturellen Merkmal auf dem Übertragungsfilm
für die
Laser Mikrodissektion, das vorsteht bzw. vorspringt, beinhaltet.
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Eine
Ausführungsform
des fünften
Aspekts der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Herstellen des
Laser Mikrodissektionsaufbaus, das aufweist: Bereitstellen einer
Platte mit einer im wesentlichen ebenen oberen Fläche, Bereitstellen
von zumindest einer Kappe für
die Laser Mikrodissektion, wobei die zumindest eine Kappe für die Laser
Mikrodissektion einen Übertragungsfilmträger mit
einer Substratfläche,
das Bereitstellen eines Laser Mikrodissektionsübertragungsfilms neben der
Substratfläche
des Übertragungsfilmträgers und
das Verbacken unter Vakuum von der zumindest einen Laser Mikrodissektionskappe
und der Platte, um den Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm im wesentlichen
zu glätten,
beinhaltet.
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Es
ist daher möglich,
ein brauchbares LCM bereitzustellen, das den LCM-Film in das Innere
eines Analysebehälters
integriert. Eine ebene Kappe beinhaltet einen im wesentlichen geglätteten Ethylen-Vinyl-Acetat-Polymer-LCM-Film
(EVA), der unter Vakuum auf dem Boden einer Kappe einer Mikrozentrifugenröhre verbacken
ist. Wobei die Laser Mikrodissektionskappen verbacken versendet
werden können
(d. h. verpackt ohne eine Nachverpackungsverarbeitung), um den Laser
Mikrodissektionsübertragungsfilm
zu schützen
und die Kontaminierung zu minimieren. Die Kappe und die Konfiguration,
in der sie versendet wird, stellt die zusätzlichen Vorteile der schnellen
und leichten Verwendung zur Verfügung. Es
wird somit möglich
gemacht, gleichzeitig die Anforderungen an die Geschwindigkeit,
die Genauigkeit und die Widerstandsfähigkeit gegenüber Kontaminierung
zu erfüllen,
die sich im Fall des Standes der Technik gegenseitig ausschließen und
nicht gleichzeitig erfüllt
werden können.
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Eine
bevorzugte Implementierung der vorliegenden Erfindung betrifft einen
im wesentlichen geglätteten
Ethylen-Vinyl-Acetat-(EVA)-LCM-Polymerfilm, der unter Vakuum mit
dem Boden einer Kappe einer Mikrozentrifugenröhre verbacken ist.
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Diese
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden besser gewürdigt und
verstanden, wenn sie in Verbindung mit der folgenden Beschreibung
und der begleitenden Zeichnung betrachtet werden. Es sollte sich
jedoch verstehen, daß die
folgende Beschreibung, während
sie bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und zahllose spezifische Details hiervon
anzeigt, nur als Illustrierung und nicht als Beschränkung gegeben wird.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Ein
klares Konzept der Vorteile und Merkmale, die die vorliegende Erfindung
bilden, und der Komponenten und des Betriebs von Modellsystemen,
die mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, werden
leichter verständlich
durch Bezug auf die beispielhaften und daher nicht beschränkenden
Ausführungsformen,
die in den begleitenden Figuren dargestellt werden und einen Teil
dieser Beschreibung bilden, wobei gleiche Bezugszahlen (falls sie
in mehr als einer Ansicht auftreten) dieselben Elemente bezeichnen.
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Es
soll erwähnt
werden, daß die
dargestellten Merkmale in den Figuren nicht notwendigerweise maßstabsgetreu
sind.
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Die 1A–1C zeigen
drei Ansichten einer Laser Mikrodissektion (LCM) Probenplatte, die
eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellt;
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die 2A–2C zeigen
drei Ansichten der Probenplatte, die in den 1A–1C gezeigt ist, nach der
Beschichtung mit einem Lösemittel,
die eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellen;
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die 3A–3D zeigen
vier Ansichten eines Probenträgers,
der eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellt;
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die 4A–4D stellen
vier Ansichten des in den 3A–3D gezeigten Probenträgers dar,
nachdem ein LCM-Film hinzugefügt
wurde, die eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellen;
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die 5A–5D stellen
drei Ansichten eines Aufbaus dar, der vier der in den 4A–4D und
eine der in den 2A–2C dargestellten Platten
beinhaltet, dar und der eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist;
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die 6A–6C stellen
drei Ansichten eines komplettierten Aufbaus nach der Vakuumheißformung
dar, die eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellen;
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die 7A–7B stellen
zwei sequentielle Ansichten eines Laser Mikrodissektionsfilms mit
ausgeformten Merkmalen dar, die eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung darstellen;
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8 stellt eine Ansicht von
unten eines Laser Mikrodissektionsfilms mit ausgeformten Merkmalen
dar, der eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darstellt;
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9 stellt eine Seitenansicht
eines Laser Mikrodissektionsgeräts
dar, das eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert;
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10 stellt eine Seitenansicht
einer Kappe einer Mikrozentrifugenröhre dar mit einer negativen Konizität, die eine
Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert,
und
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die 11A–11D zeigen
verschiedene Ansichten eines biologischen Reaktionsgefäßes, das eine
Ausführungsform
der Erfindung darstellt.
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Beschreibung von bevorzugten
Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung und die verschiedenen Merkmale und vorteilhaften
Details hiervon werden nun vollständiger unter Bezug auf die
nicht beschränkenden
Ausführungsformen
erklärt,
die in den begleitenden Zeichnungen dargestellt sind und in der
folgenden Beschreibung detailliert ausgeführt werden. Beschreibungen
von bekannten Komponenten und Prozeßtechniken werden ausgelassen,
um die vorliegende Erfindung nicht unnötigerweise im Detail zu verdecken
und sind bekannt von der US-Anmeldung Nr. 60/037,864, eingereicht
am 7. Februar 1997 (Dokument Nr. ARC-002), der US-Anmeldung Nr.
08/797,026, eingereicht am 7. Februar 1997, der US-Anmeldung Nr.
08/800,882, eingereicht am 14. Februar 1997, der US-Anmeldung Nr. 60/060,731,
eingereicht am 1. Oktober 1997 und der US-Anmeldung Nr. 60/060,732,
eingereicht am 1. Oktober 1997.
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In
den 1A–1C ist eine Platte 100 dargestellt.
Die Platte 100 kann aus Metall, Glas, Keramik oder irgendeinem
anderen für
die nachfolgenden Verarbeitungsschritte, die unten beschrieben werden,
geeigneten Material hergestellt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Platte 100 ein Mikroskopglasobjektträger. Es
ist wichtig, daß die
obere Fläche 101 der
Platte 100 flach ist. Obgleich die dargestellte Ausführungsform
einen bloßen
Mikroskopobjektträger
zeigt, kann die Platte beschichtet sein oder auf andere Weise oberflächenbehandelt
sein in einem vorherigen Verarbeitungsschritt.
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In
den 2A–2C ist die Platte 100 mit
einem Lösemittel 210 gezeigt.
Das Lösemittel 210 wird auf
die obere Fläche 101 aufgebracht.
Es sei bemerkt, daß die
obere Fläche 101 von
dem Lösemittel 210 in
den A–B verdeckt ist, jedoch als eine Zwischenfläche in 2C klar zu erkennen ist.
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Das
Lösemittel
kann irgendein geeignetes, nicht haftendes Material sein, wie zum
Beispiel Silikon oder Teflon (d. h. Polytetrafluorethylen). Mit
Vorteil kann das Lösemittel
ein oberflächenaktiver
Stoff sein, der den Kontaktwinkel in der Flüssigkeit, mit der es in Kontakt
kommt, erhöht.
Es ist wichtig, daß das Lösemittel 210 die
Ebenheit, die ursprünglich
mit der oberen Fläche 101 bereitgestellt
wird, beibehält
und erweitert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Lösemittel 210 ein
Silikon beinhalten, das einen oberflächenaktiven Stoff, wie zum
Beispiel RIAN-X, enthält.
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In
den 3A–3D ist ein Probenträger 300 dargestellt.
Der Probenträger 300 hat
einen oberen Abschnitt 310 und einen unteren Abschnitt 320.
Der obere Abschnitt 310 beinhaltet eine obere Fläche 315 und
einen äußeren Umfang 317 und
eine Schulter 319. Der untere Abschnitt 320 beinhaltet
eine Aufweitung 322, einen inneren Umfang 324,
eine Abfasung 326 und eine Substratfläche 128.
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Der
Probenträger 300 kann
eine Polymerkappe sein, die aus optisch transparenter Qualität ist. Beispielsweise
könnte
die Kappe aus Polycarbonat oder einem anderen geeigneten optisch
transparenten Kunststoff hergestellt sein. Die Kappe muß jedoch
nicht optisch transparent sein, vorausgesetzt, die Absorptionscharakteristiken
des Polymers, aus der sie hergestellt ist, sind kompatibel mit der
geeigneten Transmission der Laserenergie auf dem Aufnahmefilm.
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In
den 4A–4D ist ein Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm 400 (LCM)
gezeigt, der auf den Probenträger 300 aufgebracht
wird. Es versteht sich, daß der
LCM-Übertragungsfilm 400 aus
Gründen
der Klarheit nicht maßstabsgetreu
dargestellt ist. Der Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm 400 kann
auf den Boden einer kreisförmigen
Kappe durch Ausstanzen eines kreisförmigen Abschnitts aus einer freistehenden
Schicht aus Ethylen-Vinyl-Acetat aufgebracht werden. Alternativ
kann der LCM-Übertragungsfilm 400 auf
den Boden der Kappe gepreßt werden.
Der LCM-Übertragungsfilm 400 kann
auf der Kappe durch Verwendung eines Verfahrens, wie zum Beispiel
Spritzbeschichtung, das Eintauchen oder das Besprühen, abgelagert
werden. In jedem Fall sollte die Herstellung des Verbrauchsartikels
in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden.
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Es
ist von Vorteil, daß der
LCM-Übertragungsfilm 400 dünn ist.
Beispielsweise ist ein 50 Mikrometer dicker Film einem 100 Mikrometer
dicken Film vorzuziehen. Der Film kann jedoch mit Vorteil in Dicken
von näherungsweise
500, 400, 300, 200, 100, 50 Mikrometern oder weniger hergestellt
werden.
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In
den 5A–5C sind eine Mehrzahl von kombinierten
Probenträgern 300 zusammen
mit ihren entsprechenden LCM-Übertragungsfilmen 400 gezeigt,
die in Richtung des Lösemittels 210,
mit dem die Oberfläche
der Platte 100 beschichtet ist, abgesenkt werden. Die LCM-Übertragungsfilme 400 können ein
Ethylen-Vinyl-Acetat (EVA) Polymermaterial sein. Es versteht sich,
daß 5A den Zusammenbauprozeß zu einem
früheren
Zeitpunkt, verglichen mit 5C,
zeigt, bei der die Lücke
bzw. der Abstand zwischen dem LCM-Übertragungsfilm 400 und
dem Lösemittel 210 nahezu
geschlossen ist.
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In
den 6A–6C wird der Zusammenbau von
vier Probenträgern 300 aus
der Platte 100 während
des Verfahrensschrittes des Verbackens unter Vakuum dargestellt.
Der Prozeß des
Verbackens unter Vakuum bewirkt, daß das EVA weicher wird, schmilzt
und fließt,
wodurch es sich an die im wesentlichen ebene Oberfläche angleicht,
die von dem Lösemittel 210 präsentiert
wird. Auf diese Art und Weise wird die Flachheit, welche die Platte 100 besitzt,
auf den LCM-Übertragungsfilm 400 übertragen.
Dies eliminiert ebenso eingeschlossene Luft.
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Das
Verbacken unter Vakuum des Films kann unter moderatem Vakuum erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
findet der Heizschmelzprozeß bei
133 Pa (1 Torr) und 95°C
für näherungsweise
eine Stunde statt.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
kann statt des Befestigens des LCM-Films an der Basis der Kappe
vor ihrer Plazierung auf der mit Lösemittel beschichteten Platte
der LCM-Film auf dem Lösemittel
als eine Filmschicht beschichtet werden. Ein Probenträger kann
dann auf dem LCM-Film
plaziert werden. Ein Aufbau aus einem oder mehreren solcher Kombinationen
kann dann einem Heizvakuumschmelzprozeß ausgesetzt werden, um zumindest den
Abschnitt des LCM-Films, der an der Schnittstelle zwischen dem Probenträger und
dem Lösemittel lokalisiert
ist, zu ebnen. Auf diese Art und Weise wird ein Teil des ebenen
LCM-Films, der zu der unteren Fläche
des Probenträgers
korrespondiert, von dem Aufbau weggebrochen, wenn der Probenträger zusammen
mit der Kappe von der Platte entfernt wird. Diese Teile des LCM-Films,
die nicht neben dem Boden der Kappe, die entfernt wird, sind, verbleiben
auf der Platte. In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn der Probenträger von
der Platte weggezogen wird, eine Drehbewegung auf den Probenträger ausgeübt, entweder
vor und/oder während
der linearen Trennung der beiden Hauptkomponenten, um eine Scherkraft
sowohl innerhalb des LCM-Films als auch zwischen dem LCM-Film und
der Löseschicht auszuüben.
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Die
Lösebeschichtung
kann ein Silikon sein. Alternativ kann die Lösebeschichtung Polytetrafluorethylen
sein.
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Innerhalb
dieser Beschreibung kann der beschreibendere Ausdruck „Übertragungsfilmträger" den Ausdruck „Probenträger" ersetzen. Im allgemeinen
trägt der Übertragungsfilmträger den Übertragungsfilm.
Nur der Teil der Probe, der zu dem Übertragungsfilm übertragen
wird, wird von dem Träger getragen.
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Das
Ethylen-Vinyl-Acetat kann aus den verfügbaren Materialien, basierend
auf den folgenden Kriterien, ausgewählt sein. Das Ethylen-Vinyl-Acetat sollte
einen hohen Schmelzindex haben. Ein hoher Schmelzindex wird durch
eine niedrige Viskosität
und ein niedriges Molekulargewicht angezeigt.
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Es
ist wichtig, daß das
Ethylen-Vinyl-Acetat oder das andere Material, das für den LCM-Übertragungsfilm verwendet wird,
eine mittlere Klebrigkeit hat. Der Übertragungsfilm wird etwas
klebrig, wird jedoch nicht alles binden, mit dem er in Kontakt kommt.
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Die
Kappen können
aus klarem Plexiglas G (d. h. Polymethylmethacrylat) hergestellt
sein. Durch Behandeln des Glasobjektträgers mit einem grenzflächenaktiven
Stoff bevor die Kappen an ihrem Ort Vakuum heißgeschmolzen werden, können die
komplettierten Kappen von dem Glasobjektträger hervorgeholt werden, bevor
sie für
die Erfassung des Probenmaterials benötigt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Kappe in der Größe dimensioniert,
so daß sie
in eine standardisierte Mikrozentrifugenröhre paßt. Der LCM-Übertragungsfilm
kann an der Kappe unter Verwendung von Kleber oder durch Verschweißen des thermoplastischen
Materials oder durch irgendeine andere mechanische Einrichtung,
die den Film an seinem Ort hält,
befestigt sein.
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Die
Seitenwände
der Kappe können
eine negative Konizität
haben. Diese negative Konizität
kann innerhalb des Werkzeugs, mit der die Kappen hergestellt werden,
gefertigt werden.
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Nach
dem Aufnehmen des zu analysierenden Gewebes auf dem Boden der Kappe
wird die Kappe auf der Mikrozentrifugenröhre plaziert, die Proteinase
(d. h. Protease, zum Beispiel Trypsin)-Lösung
enthält,
und die Röhre
wird umgedreht. Das Gewebe wird dann aufgelöst, und die DNA wird frei,
um in die Lösung
einzutreten. Die Lösung
wird dann aus dem Rohr und in die PCR-Mischung pipettiert.
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Es
wird angenommen, während
dies nicht durch die Theorie gestützt ist, daß sich der EVA-Film sowohl nach
oben als auch nach unten ausdehnt, wenn er der Laserenergie ausgesetzt
ist. Als eine Näherung
wird angenommen, daß sich
der EVA-Film näherungsweise
12–15%
nach oben und unten ausdehnt, wenn er der LCM-Ladung von dem Laser
ausgesetzt wird. Die Ausdehnung nach oben wird durch die Plastikkappe
begrenzt.
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Die
Dicke des LCM-Übertragungsfilms
sollte innerhalb einer Schwankung von 20%, vorzugsweise von 5%,
gehalten werden. Die untere, ausgesetzte Fläche des LCM-Übertragungsfilms
kann als Aufnahmefläche
bezeichnet werden. Die Flachheit des LCM-Übertragungsfilms sollte innerhalb
näherungsweise
5 Mikrometern, vorzugsweise näherungsweise 1
Mikrometer gehalten werden. Die Flachheit des Films kann leicht
charakterisiert werden, basierend auf der Anzahl von Ringen, multipliziert
mit λ/2.
Die Ebenheit bzw. Flachheit des LCM-Übertragungsfilms sollte vorzugsweise
innerhalb von zwei Wellen gehalten werden, was näherungsweise ¼ Mikrometer
pro Streifen ist bei einer gegebenen Wellenlänge λ von 540 nm.
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Der
Farbstoff in dem Ethylen-Vinyl-Acetat ist es, der die Laserenergie
absorbiert. Das Ethylen-Vinyl-Acetat geht in eine flüssige Phase über, infundiert in
die interessierenden Zellstrukturen und härtet dann aus.
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Der
bestimmte Herstellungsprozeß,
der für die
Herstellung des Aufbaus verwendet wird, soll günstig und reproduzierbar sein.
Bequemerweise kann die Herstellung der vorliegenden Erfindung durch
Verwendung irgendeines Beschichtungs- und Verbackungsverfahrens
ausgeführt
werden. Es ist bevorzugt, daß der
Prozeß in
einer kontaminationsfreien Umgebung durchgeführt wird. Für den Herstellungsbetrieb ist
es darüber
hinaus von Vorteil, ein automatisiertes Verfahren einzusetzen.
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Der
bestimmte Herstellungsprozeß,
der für das
Herstellen des Aufbaus verwendet wird, ist jedoch nicht für die vorliegende
Erfindung wesentlich, so lange er den beschriebenen Aufbau zur Verfügung stellt.
Normalerweise werden diejenigen, die die Erfindung herstellen oder
verwenden, den Herstellungsprozeß, basierend auf den Werkzeug-
und Energieanforderungen, den erwarteten Anwendungsanforderungen
des Endprodukts und den Anforderungen des Gesamtherstellungsprozesses
auswählen.
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Das
bestimmte Material, das für
die Kappe verwendet wird, sollte biologisch und chemisch inert sein.
Bequemerweise kann die Kappe der vorliegenden Erfindung aus irgendeinem
Material mit einem Schmelzpunkt höher als der von EVA hergestellt
werden. Es ist bevorzugt, daß das
Material kostengünstig
ist. Für
den Herstellungsbetrieb ist es darüber hinaus ein Vorteil, ein
transparentes thermoplastisches Material einzusetzen, das mittel
Spritzguß hergestellt oder
verarbeitet werden kann. Beispielweise kann die Kappe Polymethylmethacrylat
beinhalten. Durch die geeignete Auswahl des Polymermaterials kann die
Kappe fest sein. Es besteht keine Notwendigkeit für ein Durchgangsloch
durch die zentrale Achse der Kappe.
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Das
bestimmte Material, das für
die Kappe ausgewählt
wird, ist jedoch für
die vorliegende Erfindung nicht wesentlich, solange sie die beschriebene Funktion
bereitstellt. Normalerweise werden diejenigen, die die Erfindung
herstellen oder verwenden, das beste kommerziell verfügbare Material
auswählen,
basierend auf den wirtschaftlichen Kosten und der Verfügbarkeit,
der erwarteten Anwendungsanforderungen des Endprodukts und basierend
auf den Anforderungen des gesamten Herstellungsprozesses.
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Der
LCM-Übertragungsfilm
kann irgendein geeignetes thermoplastisches Material sein. Beispielsweise
kann der LCM-Übertragungsfilm
ein oder mehrere EVAs, Polyurethan (PU), Polyvinylacetat, Ethylen-Methylacrylat
(EMAC), Polycarbonat (PC), Ethylen-Vinylalkoholkopolymere (EVOH),
Polypropylen (PP) und expandierbares oder Allzweck-Polystyren (PS)
aufweisen. ELVAX 410, 200 und 205 sind geeignete
Harze von EVA, die kommerziell von DuPont erhältlich sind, in denen die wirksame
Variante die Menge an Vinyl ist.
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Der
LCM-Übertragungsfilm
kann eine absorptionsfähige
Substanz beinhalten. Die absorptionsfähige Substanz kann einen absorptionsfähigen Farbstoff
beinhalten. Diese Farbstoff kann entweder ein breitbandabsorptionsfähiger Farbstoff
oder ein frequenzspezifischer absorptionsfähiger Farbstoff sein. Beispielsweise
können
die absorptionsfähigen Farbstoffe
ein oder mehrer der folgenden Stoffe beinhalten: Zinn (IV), 2,3-Naphthalocyanindichlorid;
Silizium (IV) 2,3-Naphthalocyanindihydrocid, Silizium (IV) 2,3-Naphthalocyanindioctyloxid
und Vanadyl 2,11,20,29-Tetra-tert-butyl-2,3-naphthalocyanin. Ebenso kann die
absorptionsfähige
Substanz eine Mehrzahl von Fullerenen (zum Beispiel Bucky Balls, z.
B. C60) enthalten.
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Der
LCM-Übertragungsfilm
kann ebenso ein Streumedium beinhalten. Da der LCM-Übertragungsfilm
sehr nahe an der Probe ist, reduziert das Streumedium Schatten,
wodurch das Verfahren der Abbildung verbessert wird. Das Streumedium
kann ein diffuses Material beinhalten. Beispielsweise kann der LCM-Übertragungsfilm
mit kleinem partikulärem
Material beladen sein, welches das Beleuchtungslicht streut, so
daß Schatten
minimiert werden und das Abbilden verbessert wird, ohne nachteilige
Effekte auf den LCM-Strahl. Alternativ kann der Übertragungsfilm eine dichromatische
Gelatine (DCG) beinhalten, um dieselben Funktionen durchzuführen. Die DCG
kann belichtet und entwickelt werden, um spezifische Diffusoreigenschaften
innerhalb des Übertragungsfilms
bereitzustellen, wie zum Beispiel das Shaping bzw. die Modellierung.
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Es
gibt eine Vielzahl von Techniken für das Aufbauen eines nichtkontaktierenden
LCM-Übertragungsfilms
und/oder Trägers.
Der Zweck des LCM Nichtkontaktansatzes ist es, ein Verfahren für die Eliminierung
der Probleme bereitzustellen, die mit der nicht spezifischen Bindung
von Gewebe an einem LCM-Film verknüpft sind. Genauer gesagt können diese
Abschnitte der Probe irrtümlicherweise
von dem Schnitt aufgrund einer nicht spezifischen Befestigung an
dem LCM-Film abgehoben werden, wenn ein Probenschnitt Bereiche mit
lose befestigten Zellen hat. D. h., diese Bereiche kleben an dem
Film, obwohl sie nicht von dem Laser beleuchtet wurden. Wenn diese
Abschnitt zu dem Reagenzgefäß übertragen
werden, werden sie von dem Reagenz aufgelöst und erscheinen als Kontaminationsstoffe
in der Probe. Es ist wichtig, die lose befestigten Gewebebereiche
daran zu hindern, den Film zu kontaktieren.
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Ein
Verfahren für
das Verhindern des Kontaktes zwischen dem Film mit Gewebebereichen,
die eine nicht spezifischen Transfer durchführen könnten, ist es, den Filme wenige
Mikrometer von der Gewebeprobe zu beabstanden (Distanz). In dem
Bereich, der von dem Laser beleuchtet wird, dehnt sich der Film
ungefähr
um 10% seiner Dicke (etwa 5–10 Mikrometer,
basierend auf einer typischen Dicke von 50–100 Mikrometern) aus und kontaktiert
das Gewebe, wodurch eine Übertragung
in dem beleuchteten Bereich erlaubt wird. Außerhalb dieses Bereichs kommen
der Film und das Gewebe nie in Kontakt, da der Film von dem Gewebe
beabstandet ist. Der Film darf jedoch nicht zu weit von dem Gewebe
entfernt sein (mehr als ein paar Mikrometer), da der Film das Gewebe
kontaktieren muß,
nachdem er sich aufgrund der Laserbeleuchtung ausdehnt.
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Eine
Technik, einen nichtkontaktierenden LCM-Übertragungsfilm herzustellen,
der wenige Mikrometer Abstand einhält, ist es, eine Reihe von
Sockeln zu erzeugen, die wenige Mikrometer hoch sind, so daß eine Reihe
von Abstandsbolzen für
die Kappe bereitgestellt wird, um hierauf zu ruhen. Diese Sockel können durch
Belichten der Kante des Übertragungsfilms
mit dem fokussierten Laserstrahl erzeugt werden. Der Laserstrahl
deformiert den normalerweise flachen Film in dem Brennbereich, was
die Oberfläche
in diesem Bereich erhöht.
Durch Plazieren dieser Sockel an den Eckpunkten eines gleichseitigen
Dreiecks mit Punkten, die am Rand des Übertragungsfilmträgers lokalisiert
sind, wird eine gute Dreipunktmontage bereitgestellt. Die Höhe dieser
Sockel kann durch Verändern
der Leistung und der Pulslänge
des fokussierten Laserstrahls eingestellt werden. Der Durchmesser
kann durch Verändern
des Durchmessers des Laserstrahls eingestellt werden. Die Belichtungsgrade
sind ähnlich
den Graden, die für
die Gewebeübertragung
verwendet werden: näherungsweise
10–900
mW für
näherungsweise
10–90
Millisekunden (um die Sockel zu erzeugen, kann es hilfreich sein,
den Film zu belichten, wenn er mit einem Glasobjektträger in Kontakt
ist). Das Reagenzfläschchen kann
derart konstruiert sein, so daß es
einen inneren Rand hat, der die Sockel kontaktiert, und sie von
dem Reagenz abschottet, wodurch verhindert wird, daß Gewebe,
das auf den Sockeln sein könnte,
die Probe verunreinigt.
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In
den 7A–7B wird ein LCM-Film 700 mit Merkmalen 710 ausgestattet.
Die Merkmale 710 können
einen erhöhten
Abschnitt 720 (Sockel) und ein vorstehendes Merkmal 730 (zum
Beispiel Rand) beinhalten. Die Merkmale 710 können in
dem LCM-Film 700 geformt sein (zum Beispiel repliziert)
oder auf andere Weise gebildet sein (zum Beispiel durch Laser). Solche
Merkmale geben dem LCM-Film 700 eine Arbeitsfläche, die
eine Topographie bestimmt.
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Der
Zweck der Merkmale 710 ist es, einen zusätzlichen
Weg des Auswählens
von einzelnen Zellen von einer Gewebeprobe unter Verwendung von
LCM bereitzustellen, statt der nur einen sehr kleinen Laserspotgröße. Die
Merkmale 710 können
im LCM-Übertragungsfilm
fabriziert werden, können
näherungsweise
die Größe einer
gewünschten
Zelle 740 haben. Die Merkmale 710 können sich
von der Filmoberfläche
mit einer Distanz von einigen Mikrometern erstrecken.
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Der
Film 700 kann von den Zellen mit einem Abstand von näherungsweise
5 bis näherungsweise 10
Mikrometern durch das vorstehende Merkmal 730, das um den
Umfang der Kappe läuft,
gehalten werden. Um die Ebene des Films zu stabilisieren, versteht
es sich, daß das
vorstehende Merkmal sich nur entlang zumindest drei Punkten eines
Durchmessers des Films erstrecken muß und kein kontinuierlicher
Rand sein muß.
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Die
Merkmale 710 können
durch Heißschmelzformen
des LCM-Films 700 gegenüber
einer Form, die komplementäre
Formen der Merkmale hat, die mittels Laser in die Formoberfläche eingebracht sind,
hergestellt werden. Solch eine Form kann aus einer polierten Metallfläche oder
einer Glasfläche
unter Verwendung eines gütegeschalteten
Lasers hergestellt werden, der auf einen Durchmesser von etwa 5
bis etwa 20 Mikrometer fokussiert ist. Die Merkmale 710 können ebenso
durch Formen des Films gegenüber
einer Formfläche,
die mit einem Diamantstift mikroverarbeitet ist, hergestellt werden.
Die Topographie wird von der Form auf den Film über die Replikation übertragen.
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Eine
Ausstülpung
bzw. Protuberanz (erhöhter
Abschnitt 720) für
das Aufnehmen der gewünschten
Zelle 740 kann einen kleinen erhöhten Bereich des LCM-Films
mit einem Durchmesser von näherungsweise
5 bis 20 Mikrometern beinhalten. Wenn ein Laserstrahl 750 diesen
Abschnitt des Films aufheizt, wird der erhöhte Abschnitt 720 das
Gewebe als erstes kontaktieren und die Laserenergie kann derart eingestellt
werden, so daß die
umgebenden Nachbarfilmregionen das Gewebe nicht kontaktieren. Somit
stellt der erhöhte
Abschnitt 720 eine örtliche
Diskriminierung zusätzlich
zu der örtlichen
Diskriminierung, die durch die Position, die Größe und die Mode des Laserstrahls
bereitgestellt wird, zur Verfügung. Ein
Vorteil des Merkmals 710 ist der, daß ein größerer Laserstrahl verwendet
werden könnte
und ein Forscher oder ein Labortechniker immer noch das Anheben
einer einzelnen Zelle erreichen könnte. Der erhöhte Abschnitt
des Films (erhöhter
Abschnitt 720) wird auf eine höhere Temperatur aufgeheizt
als der Umgebungsbereich des flachen Films. Das vorstehende Merkmal 730 (d.
h. der Rand) wird nicht geheizt. Dies würde ebenso die Wahrscheinlichkeit
erhöhen,
daß eine
Zelle in dem Bereich des Merkmals exklusiv aufgenommen würde. Natürlich ist
es von Vorteil, wenn der erhöhte
Abschnitt 720 nicht so weit vorsteht wie das vorstehende
Merkmal 730.
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Wie
in 8 zu sehen ist, könnten mehrere Säulen 800 in
einem LCM-Film 810 ausgebildet werden, um mehrere Einzelzellenanhebbereiche
zu ermöglichen.
Der LCM-Film 810 könnte
erneut einen Rand 820 beinhalten. Mehrere Zellen könnten dann in
einer einzelnen Mikrozentrifugenröhre analysiert werden.
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Das
strukturelle Merkmal (d. h. der Abstandshalter), der den Film von
der Probe weghält, kann
unter Vakuum in den Übertragungsfilm
heiß verbacken
werden. Entsprechend diesem Prozeß kann ein Negativ des strukturellen
Merkmals in einer Platte ausgebildet werden. Das strukturelle Merkmal
wird dann (als ein Positiv) in dem Film repliziert, wenn es aufgewärmt wird
und in den Hohlraum des Merkmals fließt, der durch das Negativ festgelegt
ist. Alternativ kann das strukturelle Merkmal in dem Übertragungsfilm
mit Verwendung eines Lasers oder sogar mit einem Mikrobearbeitungsgerät ausgebildet
sein.
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Das
strukturelle Merkmal oder der Abstandshalter wird integral in dem
Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm
ausgebildet. Das strukturelle Merkmal stellt eine Trennung zwischen
dem Übertragungsfilm
und der Probe zur Verfügung.
Diese Trennung hält
den Film von der Probe beabstandet, wodurch die nicht-kontaktierende
Laser Mikrodissektion möglich
wird.
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Der Übertragungsfilm
kann mit der Substratfläche
durch einen im Brechungsindex angepaßten transparenten Fluid oder
Klebstoff verbunden sein. Alternativ kann der Übertragungsfilm mit der Substratfläche durch
Stanzen bzw. Lochen von sowohl dem Probenträger als auch dem Übertragungsfilm gleichzeitig
mit dem Probenmaterial gekoppelt sein. Es ist sogar möglich, den
Film am Träger
mit doppelseitigem Klebeband zu befestigen.
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Der
Laser Mikrodissektionsübertragungsfilm beinhaltet
einen im wesentlichen geglätteten
Niedriglandbereich. Dieser Niedriglandbereich wird mit strukturellen
Merkmalen ausgestattet, die so hervorstehen, daß sie eine Laser Mikrodissektionserfassungzone
definieren. Diese Vorsprünge
können
als Säulen
bezeichnet werden. Das niedrige Land kann ebenso mit strukturellen
Merkmalen ausgestattet sein, die den Großteil des Films von der Probe
beabstandet halten. Um die Ebene des Films zu halten, ist es bevorzugt,
zumindest drei solcher Stützmerkmale zu
haben. Falls diese Stützmerkmale
um den Großteil
des Umfangs oder um den gesamten Umfang eines Übertragungsfilmslaufen, können sie
als Rand bezeichnet werden.
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Was
immer das Gewebe kontaktiert, muß in gleichbleibendem Abstand
von dem Gewebe sein, so daß die
Dosimetrie über
dem Übertragungsfilm
konstant wird. Auf diese Art und Weise kann ein bekannter Abstand
zwischen dem Gewebe und dem Übertragungsfilm
errichtet werden. In vielen Fällen
wird solch ein bekannter Abschnitt über wesentliche Abschnitte
der Übertragsfilmfläche festgelegt.
Es ist jedoch ausreichend, daß der
Abschnitt bekannt ist und er muß nicht
festgelegt werden. Der Abstand muß für die Zwecke des Einstellens
der Laserenergie bekannt sein, um die Gewebeübertragung zu erzielen.
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Wenn
der Übertragungsfilm
der elektromagnetischen Energie ausgesetzt wird, dehnt er sich (sowohl
nach oben als auch nach unten) gegen die Substratfläche aus
und kontaktiert das Gewebe, wodurch er sich selbst in die Probe
injiziert. In dem Fall, wo es einen Abstand zwischen dem Übertragungsfilm
und der oberen Fläche
der Probe gibt (nichtkontaktierende Laser Mikrodissektion), wird
der sich ausdehnende Film über
diesen Raum projiziert, bevor er die obere Fläche der Probe zu Beginn der
Injektionsphase kontaktiert.
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In 9 ist eine Streubeleuchtungskonstruktion
für ein
LCM-Gerät
dargestellt. Der Zweck der Streubeleuchtungskonstruktion ist es,
eine geeignetere Beleuchtung für
ein LCM-Mikroskop bereitzustellen, die eine gleichmäßigere Beleuchtung
erzeugt, um Schatten zu verhindern, die innere Zellstrukturen verdecken.
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Ein
Laser Mikrodissektionsgerät
beinhaltet einen oberen Abschnitt 920 und einen unteren
Abschnitt 910. Der obere Abschnitt 920 beinhaltet
eine obere Fläche,
mit der ein Streumedium 930 gekoppelt werden kann. Der
untere Abschnitt 910 beinhaltet eine Substratfläche, mit
der ein Streumedium 940 gekoppelt werden kann. Eines oder
beide der Streumedien 930 und 940 kann verwendet
werden. Das Streumedium kann in den Übertragungsfilmträger und/oder
den LCM-Übertragungsfilm
aufgenommen sein.
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Die
Verwendung einer standardisierten invertierten Mikroskoplichtquelle
und das Plazieren eines Streumediums (zum Beispiel ein Stück Papier) nahe
des Gewebes, um das Licht zu streuen, führt zu einer drastisch verbesserten
Beleuchtung der Probe und einer viel besseren Visualisierung. Ein
Streumedium dieses Typs eliminiert die Notwendigkeit der Brechungsindexanpassung
der Probe. Solch ein Streumedium kann die Visualisierung des Zellkerns und
anderer subzellulärer
Strukturen erlauben, die normalerweise durch normale Beleuchtungstechniken
verdeckt werden.
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Das
Streumedium kann ein diffuses Material sein. Ein diffuses Material,
das für
die Verwendung als ein Streumedium geeignet ist, ist Milchglas,
was sehr dicht und diffus ist und von Edmund Scientific als Teil
Nr. P43.717 verfügbar
ist. Standardlaserdrucker/Photokopierpapier kann sogar als Streumedium verwendet
werden. Andere Typen von transparenten Streumedien können verwendet
werden, wie zum Beispiel Mattglas, eine linsenförmige Schicht, ein Volumendiffusor
und/oder ein Oberflächendiffusor.
In jedem Fall sollte das Streumedium ein Material sein, das aggressiv
das Beleuchtungslicht streut. Eine einzelne Schicht von typischem
Mattglas ist im allgemeinen unzureichend und muß mit mehreren Schichten als
serieller Stapel aus drei oder vier Schichten von Mattglas kombiniert
werden, um das Beleuchtungslicht ausreichend zu streuen.
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Das
Streumedium kann direkt oder indirekt mit dem Übertragungsfilmträger und/oder
dem LCM-Übertragungsfilm
verbunden sein. Alternativ dazu kann das Streumedium auf einer Oberfläche oder
im Inneren des Übertragungsfilmträgers und/oder
des LCM-Übertragungsfilms
ausgebildet sein. Das Streumedium kann derart hergestellt sein, daß es den
LCM-Strahl und/oder den Beleuchtungsstrahl formt. Das Streumedium
muß innerhalb
weniger Millimeter der Probe angeordnet sein, um effektiv zu sein.
Einige wenige Millimeter bedeutet weniger als ein Zentimeter, vorzugsweise
weniger als fünf
Millimeter.
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In 10 ist ein Laser Mikrodissektionsgerät 1000 dargestellt.
Die Vorrichtung 1000 beinhaltet einen oberen Abschnitt 1010 und
einen unteren Abschnitt 1020. Der untere Abschnitt 1020 beinhaltet eine
negative Konizität 1030.
Die negative Konizität 1030 beträgt vorzugsweise
näherungsweise
5°. Der untere
Abschnitt 1020 beinhaltet ebenso eine abgeschrägte Kante 1040.
Die abgeschrägte
Kante 1040 beträgt
vorzugsweise näherungsweise
20°. Der
untere Abschnitt 1020 beinhaltet ebenso einen Gürtel 1050.
Die Breite des Gürtels 1050 für einen
Linienkontakt mit dem Inneren eines Analysegefäßes beträgt vorzugsweise näherungsweise
0,2 mm (0,01 Zoll). Kappen mit einer negativen Konizität können mit
einem wegbrechbaren Kunststoffspritzgußformwerkzeug hergestellt werden.
Alternativ dazu können Kappen
mit negativer Konizität
durch die Interpolation mit Schneidwerkzeugmaschinen mit numerischer Computerkontrolle
hergestellt werden.
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In
den 11A–11D beinhaltet ein biologisches
Reaktionsgefäß 1100 für die Laser
Mikrodissektion (LCM) ein Analysegefäß 1110 mit einer inneren
Rippe und einer Kappe 1120 mit einem Übertragungsfilm 1130.
Der Übertragungsfilm 1130 kann EVA
beinhalten, und hat einen abstehenden Rand 1150. Der abstehende
Rand 1150 kann ein 10–20
Mikrometer Rand sein, der einen Nichtkontaktbereich im Zentrum des Übertragungsfilms 1130 bereitstellt. Das
Analysegefäß 1110 wird
gebildet, um einen inneren vorstehenden Grat zu bilden. Der innere
vorstehende Grat hat eine Steigung in Richtung einer Öffnung in
dem Analysegefäß 1110,
so daß er
eine Abdichtung mit der Kappe 1120 zur Verfügung stellt, selbst
wenn der vorstehende Rand nicht vorhanden ist. Der Zweck des Kombinierens
des inneren vorstehenden Grats 1140 mit dem vorstehenden
Rand 1150 in einer einzelnen Ausführungsform ist es, ein LCM-Analysegefäß und einen
Filmträger
bereitzustellen, der Merkmale hat, um ein nichtkontaktierendes Verfahren
für das
Positionieren des Übertragungsfilms
oberhalb der Gewebeprobe zu erleichtern. Das nichtkontaktierende
LCM-Verfahren reduziert die Wahrscheinlichkeit, daß Bereiche
des Gewebes außerhalb
des fokalen Adhäsionsbereichs übertragen
werden. Falls jedoch der überstehende Rand 1150 später mit
der Reaktion in Kontakt tritt, geht dieser Vorteil verloren. Das
Analysegefäß 1110 mit
seinem inneren Dichtmerkmal erlaubt es, daß der Übertragungsfilm 1130 mit
seinem überstehenden Rand 1150 das
Gewebe kontaktiert, jedoch nicht das Reaktionsfluid in dem Analysegefäß 1110 kontaktiert.
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Das
biologische Reaktionsgefäß 1100 beinhaltet
die Kappe 1120 (Deckel), die entternbar mit dem Analysegefäß 1110 verbunden
sein kann. Der Übertragungsfilm 1130 wird
an der klaren Kunststoffkappe 1120 befestigt. Der Übertragungsfilm 1130 kann
spritzgußgeformt
sein, so daß er
den überstehenden
Rand 1150, der 10 Mikrometer dicker ist als der Zentralbereich
der Kappe 1120, beinhaltet. Der überstehende Rand 1150 kann
kreisförmiger
Rand genannt werden. Der Übertragungsfilm 1130 erweitert
sich in dem Bereich des fokussierten Laserstrahls und ist in der
Lage, den 10 Mikrometer Abstand zu überbrücken, wodurch er das Gewebe
kontaktiert und die Übertragung
eines Teils des Gewebes zu dem Film erlaubt. Dieser überstehende
Rand 1150 kann als überstehender
Bereich bzw. Abstandsbereich bezeichnet werden und fungiert als
ein Abstandelement, das den Zentralbereich des Übertragungsfilms 1130 erhöht über dem
Gewebe hält
und den Übertragungsfilm 1130 daran
hindert, das Gewebe in diesem Zentralbereich zu kontaktieren, bis
der LCM-Laser den Übertragungsfilm 1130 aktiviert.
Dieses Merkmal des Abstandsbereichs kann in dem Übertragungsfilm 1130 durch
Drücken
bzw. Pressen des Übertragungsfilms 1130 auf
eine geheizte Platte, die ein inverses Bild dieses Stufenmerkmals
(Abstandsmerkmal) enthält,
ausgeformt werden. Dieses Verfahren repliziert das Merkmal. Solch
eine Form könnte
unter Verwendung einer polierten Metallplatte und standardisierten
chemischen Ätztechniken
konstruiert werden. Sie könnte
ebenso unter Verwendung von Glas oder Siliziumsubstraten und durch chemisches Ätzen hergestellt
werden. Alternativ könnte
ein Diamantmeißel
verwendet werden, um dieses Merkmal maschinell auf einem geeigneten Metallsubstrat
(zum Beispiel Kupfer, Aluminium, Stahl, usw.) zu bearbeiten.
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Die
Kappe 1120, die das Analysegefäß 1110 für das Reagenzliquid
abdichtet, kann aus inertem Kunststoff sein, wie zum Beispiel Polypropylen
oder Polyethylen. Das Analysegefäß 1110 hat
den inneren Grat 1140 (Stufe), der derart konstruiert ist,
daß er den
kreisförmigen
Rand der Kappe 1120 abdeckt und eine Abdichtung an diesem
Punkt bereitstellt. Diese Abdichtung hindert Flüssigkeit in dem Analysegefäß 1110 daran,
die untere Fläche
des Randes der Kappe zu kontaktieren. Dieses Design eliminiert die nicht-spezifische
Gewebeübertragung,
da der abstehende Rand 1150 der einzige Bereich der Kappe 1120 ist,
der das Gewebe kontaktiert (außer
den gewünschten Übertragungsregionen,
die von dem Laser beleuchtet werden) und Auszugsreagenzien in dem
Analysegefäß 1110 kontaktieren
niemals diesen Bereich (Abstandsrand 1150). Das Merkmal
des inneren Wulstes bzw. Vorsprungs 1140 in dem Analysegefäß kann mit
einem leichten Winkel konstruiert sein, so daß es teilweise in den Übertragungsfilm 1130 einschneidet,
was eine sehr dichte Dichtung ähnlich
den Vakuumflanschdichtungstechniken bereitstellt. Eine kleine Ausbauchung
oder Vertiefung kann in dem Zylinder der Kappe 1120 oder
in dem oberen Abschnitt des Analysegefäßes 1110 ausgeformt
sein, um eine nach unten gerichtete Kraft bereitzustellen und eine
positive Dichtung zwischen der Kappe 1120 und dem Analysegefäß 1110 bereitzustellen.
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Beispiel
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Eine
besondere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird nun durch das folgende nicht beschränkende Beispiel,
das dazu dienen soll, verschiedene signifikante Merkmale detailliert
darzustellen, weiter beschrieben. Das Beispiel ist lediglich dafür vorgesehen,
ein Verständnis
der Wege zu erleichtern, in der die vorliegende Erfindung ausgeführt werden,
und um die Fachleute weiterhin in die Lage zu versetzten, die vorliegende
Erfindung auszuführen.
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In
einer beispielhaften Ausführungsform
der Erfindung wird zunächst
ein Glasmikroskopobjektträger
gereinigt. Dann wird der Mikroskopglasobjektträger mit einer dünnen eines
kommerziell erhältlichen Silikonlösemittels
sprühbeschichtet,
in diesem Beispiel ein Silikon enthaltendes oberflächenaktives
Mittel, das leicht kommerziell verfügbar ist (zum Beispiel RAINEX).
In der Zwischenzeit wird eine Zuführung von Probenträger in der
Form von Kappen für
Mikrozentrifugenröhren
aus Plexiglas G geformt. Zylindrische Chips aus LCM-Film, die aus
einer Schicht von Ethylen-Vinyl-Acetat (EVA) ausgestanzt sind, werden dann
an die untere Fläche
der Kappen, optional mit einem Epoxyklebstoff, befestigt. Die resultierenden Kappenunterzusammenbauten
werden dann oberhalb des mit Lösemittel
beschichteten Glassubaufbaus für
die Vakuumverbackung plaziert. Die Vakuumverbackung wird bei einem
Druck von näherungsweise
einem Torr oder darunter bei einer Temperatur von 95°C für näherungsweise
eine Stunde ausgeführt.
Dies glättet
den Übertragungsfilm.
Dem verbackenen Aufbau wird dann gestattet, sich auf Raumtemperatur
abzukühlen.
Der resultierende Aufbau kann eine plankonkave Lücke haben, die zwischen jeder
der Kappen und der darunterliegenden Platte lokalisiert ist. Auf
diese Art und Weise ist nur der Umfang des Bodens der Kappe mit
der Glasplatte in Kontakt. Dies stellt zwei signifikante Vorteile
bereit. Als erstes ist die Arbeitsfläche des LCM-Films von dem Glasobjektträger in einem
Vakuum beabstandet und bleibt frei von Oberflächenzerstörung und Kontaminierungen.
Als zweites wird das Entfernen von jeder Kappe von dem Glasobjektträger vereinfacht durch
die Tatsache, daß nur
ein Bruchteil des Oberflächenbereichs
des Bodens der Kappe an der Löseschicht
befestigt ist, die auf dem Glasobjektträger beschichtet wurde. Daher
erfordert das Entfernen der Kappe von dem Objektträger viel
weniger Kraft, als notwendig wäre,
wenn die gesamte unter Fläche
der Kappe mit der Löseschicht
in Kontakt wäre.
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Man
sieht ein, daß durch
sowohl das Herstellen als auch das Versenden der Kappe auf demselben
Glasobjektträger
die Anzahl von Verarbeitungs- und Verpackungsschritten reduziert
wird, während die
Reproduzierbarkeit und die Reinheit verbessert werden.
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Die
vollständigen
Einmalprodukte können sterilisiert
werden (zum Beispiel mit Beta- oder Gammastrahlung). Schließlich sollten
die komplettierten Wegwerfprodukte einer strengen Qualitätssicherungsinspektion
ausgesetzt werden.
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Es
gibt eine Anzahl von Vorteilen, die Kappen auf dem Objektträger zu lassen,
bis sie verwendet werden. Diese Vorteile beinhalten den Schutz der optisch
flachen Oberfläche.
Beispielsweise reduziert das Belassen der Kappe auf dem Objektträger die Hydroxyl-Kontamination
des Übertragungsfilms.
Diese Vorteile beinhalten ebenso das Verhindern, daß sich partikuläres Material
auf der Oberfläche
ablagert.
-
Praktische Anwendungen
der Erfindung
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Eine
praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung, die einen Wert
innerhalb der technologischen Technik hat, ist das Sammeln einer
größeren Datenbank
von Genausdrucksmustern von sowohl gesundem als auch krankem Gewebe
bei unterschiedlichen Krankheitsstufen. Diese Datenbank wird verwendet,
um die Pathogenese von Krebs und infektiösen Krankheiten vollständiger zu
verstehen. Die vorliegende Erfindung wird es Wissenschaftlern ermöglichen,
Genmuster zu identifizieren und diese Information in die effektive
Diagnose für
Krankheiten aufzunehmen. Die vorliegende Erfindung erlaubt es medizinischen Ärzten, tatsächliche
Patientengewebeproben mit erhaltenen Daten von Patientenproben bei
unterschiedlichen Krankheitsstufen zu vergleichen, wodurch ihnen
erlaubt wird, eine effektivere Stufentherapie zu verordnen, was
nicht notwendige Prozeduren eliminiert und das Patientenleiden reduziert.
Andere Forschungsgebiete, wo die vorliegende Erfindung Anwendung
findet, sind die Medikamentenentdeckung, die Entwicklungsbiologie,
die Gerichtsmedizin, die Pflanzenkunde und das Studium von infektiösen Krankheiten,
wie zum Beispiel medikamentenresistente Tuberkulose. Es gibt praktisch unzählige Verwendungen
für die
vorliegende Erfindung, die hier nicht detailliert zu werden brauchen.
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Vorteile der Erfindung
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Die
Laser Mikrodissektion, die eine Ausführungsform der Erfindung darstellt,
kann kosteneffektiv und vorteilhaft aufgrund zumindest der folgenden Gründe sein.
Die vorliegende Erfindung wird gegenwärtige Verfahren mit einer besseren
Technologie ersetzen, die genauere und reproduzierbarere Ergebnisse
erlaubt. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um mit
niedrigen Kosten mittels Spritzguß hergestellte Polymereinmalartikel
bereitzustellen, die einen Laser Mikrodis sektionsfilm in eine innere
Fläche
eines Analysecontainers, wie zum Beispiel einem Mikrozentrifugenrohr,
integriert.
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Obgleich
der beste Modus des Ausführens der
Erfindung, so wie er von den Erfindern in Betracht gezogen wurde,
oben beschrieben wurde, ist die Praxis der vorliegenden Erfindung
nicht hierauf beschränkt.
Es ist offenkundig, daß verschiedene
Hinzufügungen,
Modifikationen und Unordnungen der Merkmale der vorliegenden Erfindung
durchgeführt werden
können,
ohne von dem zugrundeliegenden erfinderischen Konzept abzuweichen,
so wie es durch die Ansprüche
festgelegt wird.
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Beispielsweise
müssen
die einzelnen Komponenten nicht in den beschriebenen Formen ausgebildet
werden oder müssen
nicht in den beschriebenen Konfigurationen zusammengesetzt werden,
sondern könnten
in nahezu jeglicher Form bereitgestellt werden und könnte in
nahezu jeglicher Konfiguration, die innerhalb der Erfindung liegt,
so wie sie beansprucht ist, zusammengesetzt werden. Weiterhin müssen die
einzelnen Komponenten nicht aus den beschriebenen Materialien hergestellt
werden, sondern könnten
von nahezu jedem geeignetem Material hergestellt werden. Weiterhin
ist es offensichtlich, daß obgleich
die Kappen und Kappenaufbauten, die hier beschrieben sind, als physikalisch
getrennte Module beschrieben sind, die Kappen und Kappenaufbauten
in andere Vorrichtungen integriert sein können, mit denen sie verknüpft sind.
Weiterhin können alle
beschriebenen Elemente und Merkmale von jeder beschriebenen Ausführungsform
mit den beschriebenen Elementen und Merkmalen von jeder anderen
beschriebenen Ausführungsform
kombiniert oder durch diese substituiert werden, außer wo solche
Elemente oder Merkmale gegenseitig ausschließend sind.