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Die Erfindung betrifft Stoffkompositionen
auf der Basis von Resveratrolderivaten, die besonders eine große Beständigkeit
an der Luft und gegenüber
Licht aufweisen.
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Das Resveratrol (3,5,4'-Trihydroxystilben)
existiert in der Cis- oder Trans-Form und zwar als Monomer oder
Oligomer, das im allgemeinen zwei bis vier Monomer-Einheiten enthält.
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In der folgenden Beschreibung und
in den Ansprüchen
wird der Ausdruck „OR" verwendet, um sowohl das
Monomer wie die Oligomeren zu bezeichnen.
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Die Untersuchung der Eigenschaften
des Resveratrols hat interessante biologische Aktivitäten aufgezeigt.
Es wurden kardiovaskuläre
und anti-karzinogene Effekte berichtet (M. Jang et al., Science,
275, 218–220 (1997)).
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Die praktische Verwendung der OR
wird selektiv erschwert durch den schwierigen Zugang zu solchen Extrakten
ausgehend von den pflanzlichen Quellen, welche sie enthalten. Die
Verwendung ist auch schwierig wegen ihrer Instabilität in Folge
der phenolischen Gruppen, welche sie aufweisen, und ihres wasserlöslichen Charakters,
der Probleme der Mischbarkeit mit zahlreichen Exzipienten mit sich
bringt, die allgemein in Therapeutika, Kosmetika und im Lebensmittelbereich
verwendet werden und im Gegensatz dazu fettlösliche Eigenschaften aufweisen.
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Um diese Probleme zu lösen, haben
die Erfinder Extraktionsmethoden ausgearbeitet, die zu an OR angereicherten
Extrakten führen,
und haben Schutzgruppen der Phenolfunktion verwendet, die gleichzeitig
ermöglichen,
dem Resveratrolmonomer und -oligomer eine ausreichende Stabilität zu verleihen
und diese fettlöslich
zu machen, wobei diese Gruppen den Vorteil haben, daß sie in
vivo eliminierbar sind.
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Die Erfindung hat daher zur Aufgabe,
Stoffkompositionen auf der Grundlage von Derivaten von Monomeren
und/oder Oligomeren von Resveratrol bereitzustellen, deren Schutzgruppen
leicht eliminiert werden können,
um das aktive Prinzip dann freizusetzen, wenn es gewünscht wird.
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Die Erfindung hat auch zur Aufgabe,
ein Verfahren zu schaffen, um diese Stoffkompositionen sowie die
Ausgangsmonomeren und/oder Ausgangsoligomeren zu liefern.
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Die Erfindung hat weiterhin zur Aufgabe
die Anwendungen dieser Stoffkompositionen in verschiedenen Gebieten,
besonders in der Therapie, Kosmetik und im Lebensmittelsektor.
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Die erfindungsgemäßen Kompositionen sind dadurch
gekennzeichnet, daß sie
im wesentlichen monomere und/oder oligomere Resveratrolester zur
Grundlage haben, wobei die Monomeren mindestens eine Estergruppe
der Formel -O-CO-A aufweisen und die Oligomeren aus Monomer-Einheiten,
die durch C-C-Bindungen oder Ether-Bindungen verbunden sind, und/oder
aus durch Gruppen -O-CO-R-CO-O vernetzten Monomeren gebildet sind,
worin
- – A
einen geraden oder verzweigten gesättigten oder ungesättigten
Alkylrest mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, einen Arylrest,
ausgenommen den Phenylrest im Fall einer Komposition von Resveratrol-Monomer,
Aralkyl oder Aralkylen bedeutet (S. Nonomura et al. Chem. Abstr.,
Vol. 60, Nr. 4, Abstrakt Nr. 4240c. 1964); und
- – R
einen gesättigten
oder ungesättigten
Alkylenrest mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen und/oder einen Arylenrest
mit 1 bis 3 Ringen und/oder einen heterocyklischen Rest und die
Diastereoisomeren dieser Einheiten bedeutet.
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Diese Kompositionen können über einen
langen Zeitraum ohne Veränderung
gelagert werden, insbesondere während
mindestens zwei Jahren unter den normalen Lagerbedingungen (Temperatur
von 10 bis 22°C
in einer vor Licht schützenden
Verpackung (Behälter)
bei einer Feuchtigkeit von 40 bis 50%).
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In einer Ausführungsform der Erfindung basieren
die Kompositionen auf Monomeren und/oder Oligomeren von Resveratrol
mit mindestens einer Gruppe -O-CO-A.
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In einer bevorzugten Gruppe bedeutet
A einen gesättigten
oder ungesättigten
Fettsäurerest.
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Im Fall einer Ungesättigheit
sind die Doppelbindungen vorzugsweise cis, was dem häufigsten
Fall bei den Naturprodukten entspricht. Bei den besonders durch
Synthese oder Halbsynthese erhaltenen Produkten sind die Bindungen
trans.
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Von den zur Durchführung der
Erfindung geeigneten Fettsäuren
seien erwähnt
die Buttersäure
C4:O; Valeriansäure
C5:O, Hexansäure
C6:O:Sorbinsäure
C6:2(n-2); Laurinsäure
C12:O; Palmitinsäure
C16:O; Stearinsäure
C18:O; Ölsäure C18:1(n-9);
Linolsäure
C18:2(n-6); Linolensäure C18:3(n-6); α-Linolensäure C18:3(n-3);
Arachidonsäure
C20:4(n-3); Eicosapentaensäure
C20:5(n-3); und Docosahexaensäure C22:6(n-3).
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Die Fettsäuren mit C16 und mehr sind
besonders geeignet für
kosmetische Anwendungen. Diese Fettsäuren werden beispielsweise
aus Mikroalgen extrahiert.
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In einer anderen bevorzugten Gruppe
bedeutet A eine Arylgruppe, ausgenommen, wie oben erwähnt, der
Phenylrest im Fall einer Stoffkomposition von Resveratrol-Monomer.
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In noch einer anderen Gruppe bedeutet
A eine Aralkyl- oder Aralkylengruppe, wobei die Alkylgruppe oder
Alkylengruppe besonders C1 bis C8, insbesondere C1 bis C4 ist. Besonders
erwähnt
seien die Benzyl oder Styrylgruppe.
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In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung sind die Kompositionen auf der Basis von Monomeren
und/oder Oligomeren des Resveratrols, die durch -O-CO-R-CO-O- Brücken vernetzt
sind.
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In dieser Struktur bedeutet R einen
gesättigten
oder ungesättigten
Alkylenrest mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen und/oder einen Arylenrest
mit 1 bis 3 Ringen und/oder einen heterocyklischen Rest.
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Die vernetzten Ester weisen als Substituenten
R vorzugsweise einen Rest einer Dicarbonsäure auf, die ausgewählt ist
unter Äpfelsäure, Malonsäure, Glutarsäure, Phthalsäure, einen
Rest eines Dicarbonsäurechlorids,
wie Terephthalsäuredichlorid,
Bernsteinsäuredichlorid,
Sebacinsäuredichlorid
und Adipinsäuredichlorid,
eines Anhydrids oder auch eines Isocyanats, wie Toluoldiisocyanat
oder Hexamethylenisocyanat.
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In einer bevorzugten Weise bilden
diese vernetzen Kompositionen Mikrokapseln oder schwammartige Massen.
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Die Erfindung sieht auch ein Verfahren
zur Gewinnung der oben definierten Ester vor.
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Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß es
die Reaktion der Monomeren und/oder Oligomeren von Resveratrol mit
Verbindungen der Formel A-CO-O-A1 oder A1-O-CO-R-CO-O-A1 als Acylierungsmittel umfaßt, worin
- – A
einen geraden oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten
Alkylrest mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, einen Aryl-, Aralkyl-
oder Alkylenrest bedeutet;
- – R
einen gesättigten
oder ungesättigten
Alkylenrest mit 0 bis 10 Kohlenstoffatomen und/oder einen Arylenrest
mit 1 bis 3 Ringen und/oder einen heterocyklischen Rest bedeutet;
und
- – A1
ein Wasserstoff- oder Halogenatom, einen Alkoylrest mit C1 bis C8,
oder Arylrest, eine Gruppe -CO-A- oder Isocyanat bedeutet, wobei
A und A1 in A-CO-O-A1
nicht einen Phenylrest und ein Chloratom bedeuten können.
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Die Veresterungsreaktionen mit den
Säuren
werden im allgemeinen bei Raumtemperatur in Gegenwart eines Aktivierungsmittels
durchgeführt.
Als Beispiel seien erwähnt
das Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder das tert-Butylchloroformiat.
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Die Veresterungen mit den Säurederivaten
werden vorteilhafterweise nach der Schotten-Baumann-Reaktion in
alkalisch wäßrigem Milieu
vorgenommen.
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Durch diese Reaktionen erhält man veresterte
Kompositionen in schwammiger Form, die man aus der Reaktionsmischung
isoliert und im Hinblick auf die gewünschten späteren Anwendungen reinigt.
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Wenn man Dicarbonsäuren oder
deren Derivate verwendet, bildet man eine Emulsion vom Typ Wasser/Öl (E/H),
indem man unter Rühren
eine wäßrige alkalische
Lösung
der Monomeren und/oder Oligomeren des Resveratrols in einem mit
Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel dispergiert und
dann das Vernetzungsmittel A1-O-CO-R-CO-O-A1 in Lösung in
dem nicht mischbaren organischen Lösungsmittel zusetzt oder als
Variante eine Emulsion vom Typ Öl/Wasser
(H/E) bildet, indem man unter Rühren
eine organische Lösung,
die das Vernetzungsmmittel enthält,
in einer wäßrigen Lösung von
Monomeren und/oder Oligomeren des Resveratrols dispergiert, der
ein alkalisches Mittel in wäßriger Lösung zugesetzt
ist, um den pH der dispergierenden Phase auf etwa 9 bis 11,5 einzustellen.
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Man verwendet die Emulgatoren in
einem Verhältnis
von etwa 2 bis 15 Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht der Dispersion,
besonders etwa 3 bis 8 Prozent.
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Geeignete emulgierende Mittel entsprechen
den üblicher
Weise verwendeten, wie den Handelsprodukten Span® (veresterte
Hexylalkohole) oder Tween® (Ester von Fettsäuren und
Sorbit mit Ethylenoxid).
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Je nach den relativen Mengen der
wäßrigen und
organischen Phasen und des Emulgators bildet man eine Emulsion vom
Typ H/E oder E/H.
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Man führt das Rühren so durch, daß die wäßrigen und
organischen Lösungen
rasch homogenisiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines
Magnetstabrührers
mit 500 bis 1000 UpM oder eines Schraubenrührers mit 800 bis 2000 UpM.
Diese Stufe dauert im allgemeinen in der Größenordnung von 30 Minuten.
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Die Vernetzung erfolgt an der Grenzfläche der
Tröpfchen
der Emulsion.
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Man gewinnt die gebildeten vernetzten
Ester beispielsweise durch Zentrifugieren. Die gewaschenen und getrockneten
Produkte liegen in Form von fließfähigem Pulver vor.
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Die gebildeten Ester können auch
gewonnen werden durch Verdünnen
des Reaktionsgemisches mit einem oder mehreren Lösungsmitteln, Dekantieren und/oder
Zentrifugieren und Waschen.
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Unter dem Mikroskop beobachtet man,
daß die
Tröpfchen
die Form von im wesentlichen kugelförmigen Teilchen von gleichmäßiger Größe haben.
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Ihr Durchmesser kann je nach den
angewandten Herstellungsbedingungen von etwa 25 bis 300 μm variieren.
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Im Fall, daß die Mikrokapseln aktive Prinzipien
umschließen,
fügt man
letztere vorzugsweise der wäßrigen oder
organischen Phase zu, in der sie löslich sind.
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Die Monomeren und/oder Oligomeren
von Resveratrol, abgekürzt
OR, die in der Veresterungsstufe eingesetzt werden, können aus
verschiedenen pflanzlichen Quellen erhalten werden. Erwähnt seien
die Vitazeen, Umbelliferen, Myrtazeen, Dipterocarpazeen, Zyperazeen,
Gnetazeen, Leguminosen, Gramineen, Serizeen, Haemodorazeen, Musazeen,
Polygonazeen, Pinazeen, Cupressazeen, Cesalpiniazeen, Poazeen und Solanazeen.
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In vorteilhafterweise verwendet man
Monomere und/oder Oligomere von Resveratrol, wie sie durch Extraktion
mit Wasser und/oder einem organischen Lösungsmittel aus Rebenranken
gewonnen werden.
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Das Verfahren der Gewinnung von Monomeren
und Oligormen von Resveratrol, das auch erfindungsgemäß verwendet
wird, weist die folgenden Stufen auf:
- – Extraktion,
indem man den Rebenranken Wasser und/oder ein oder mehrere organische
Lösungsmittel zusetzt
und das Ganze einer Behandlung wie Mazerierung/Auslagen mit Ultraschall
oder Mikrowellen unterwirft;
- – Entfetten
vor oder nach der Extraktionsstufe mit Hilfe eines Lösungsmittel
vom Typ Petroläther,
Hexan oder Chloroform;
- – zusätzliche
Extraktion des gewonnenen Extrakts durch ein organisches Lösungsmittel
vom Typ Ethylacetat oder Ethylether;
- – Konzentrierung
des erhaltenen Rohextrakts und, falls gewünscht, Lyophilisierung desselben.
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Der Prozentanteil des Resveratrol
und der Oligomeren im Rohextrakt hängt eng mit der verwendeten Rebsorte
und für
eine gegebene Rebsorte von der Extraktionsmethode und den angewandten
Lösungsmitteln ab.
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Gemäß einer besonders interessanten
Maßnahme,
im Hinblick auf die damit erreichbare Anreicherung an OR unterwirft
man den Rohextrakt einer Reinigungsstufe durch Chromatographie.
Eine besonders brauchbare Methode entspricht der Zentrifugal-Verteilungschromatographie
(CPC). Diese Methode ist besonders beschrieben von A. P. FOUCAULT,
Ed., Centrifugal Partition Chromatography, Chromatographic Science
Series, Marcel Dekker Inc., 1995, 68 oder W. D. CONWAY, Ed., Countercurrent
Chromatography apparatus theory and applications, VCH Publishers
Inc., 1990.
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Die Zentrifugalverteilungschromatographie
beruht auf der Verteilung der gelösten Stoffe zwischen zwei nicht
mischbaren flüssigen
Phasen, die hergestellt sind durch Mischen von zwei oder mehr Lösungsmitteln
oder Lösungen.
Die eine der zwei Phasen wird durch eine Zentrifugalkraft stationär gehalten.
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Die Lösungsmittel, ihre Eigenschaften
und der gewählte
Durchsatz hängen
eng sowohl von der Stabilität
der stationären
Phase im Bereich der CPC-Säule
und dem realen Druck ab. Brauchbare Ergebnisse wurden erhalten mit
dem Gemisch Hexan/Ethylacetat/Ethanol/Wasser mit beispielsweise
jeweiligen Anteilen von 6/48/11/42 oder 4/5/3/3.
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Es ist auch möglich, Hexan wegzulassen oder
mindestens eines der genannten Lösungsmittel
durch ein äquivalentes
Lösungsmittel
zu ersetzen, vorausgesetzt daß dessen
Anteile nicht verändert
werden.
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So kann das Hexan ersetzt werden
durch gesättigte,
ungesättigte,
unpolare und mit Wasser nicht mischbare Kohlenwasserstoffe, wie
beispielsweise Heptan, Cyclohexan oder auch chlorierte Kohlenwasserstoffe,
wie Chloroform.
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Ebenso kann man anstelle des Ethylacetats
Lösungsmittel
mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen verwenden, wie Aceton, Methylethylketon,
Methylisobutylketon, Methyltertbutylketon.
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Es können auch andere Alkohole als
Ethanol in der oben definierten Mischung eingesetzt werden, wie beispielsweise
Methanol, n-Propanol, Propan-2-ol, n-Butanol, Butan-2-ol. Das Wasser
kann mindestens teilweise oder vollständig durch Acetonitril ersetzt
werden.
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Der Fachmann wird also das oder die
am besten geeigneten Lösungsmittel
je nach der Art des der CPC unterworfenen gereinigten Extrakts wählen.
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Erfindungsgemäß erhält man so Rohextrakte und angereicherte
Fraktionen, die als Hauptbestandteile Resveratrol und/oder dessen
Oligomere enthalten, wie die Chromatogramme zeigen, auf die in den
Beispielen Bezug genommen wird. Diese verschiedenen Extrakte, nämlich Rohextrakte
oder angereicherte Extrakte liegen also ebenfalls als solche im
Rahmen der Erfindung.
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Die Durchführung von zusätzlichen
Trennstufen des CPC ermöglicht,
aus diesen angereicherten Extrakten einerseits das Resveratrol-Monomer
und andererseits das Resveratrol in Form von Oligomeren zu isolieren.
Diese Trennungen können
an den aus einem Rohextrakt erhaltenen angereicherten Fraktionen
oder am Rohextrakt selbst ausgeführt
werden, indem man Mischungen geeigneter Lösungsmittel entsprechend den
für die
gewünschte
Trennung geeigneten Anteilen verwendet.
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Durch die Herstellung von Derivaten
der OR gemäß der Erfindung
yerfügt
man über
Produkte von großem
Interesse in zahlreichen Gebieten.
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Die Anwesenheit der eingeführten Estergruppen
verleiht den Resveratrol-Strukturen eine Stabilität an der
Luft und gegen Licht. In vorteilhafter Weise sind diese Gruppen
nur entfernbar, wenn sie in Bedingungen gebracht werden, wo diese
Kompositionen wirken sollen, was ermöglicht, die Eigenschaften,
besonders die Antiradikal- und antioxydativen Eigenschaften des
Resveratrols unter optimalen Bedingungen zu nutzen.
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Die Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Derivate
macht sie besonders interessant für alle Anwendungen, die eine
Verabreichung an oder einen Gebrauch durch den Menschen oder das
Tier beinhalten.
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Die Erfindung sieht daher die Verwendung
der oben definierten Esterkompositionen zur Herstellung von Medikamenten
vor.
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Diese Medikamente können auch
andere Wirkstoffe enthalten, insbesondere Produkte mit Schutzwirkung
gegen Oxydationsreaktionen. Besonders erwähnt seien beispielsweise β-Karotin oder Vitamin
E.
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Die erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen
Präparate
sind besonders verwendbar bei Antitumor- oder Vasoprotektor-Behandlungen.
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Als Verabreichungsform benutzt man
geeignete Formen für
die orale Verabreichung, wie Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln
oder Tropfen. Diese Präparate
enthalten vorteilhafterweise etwa 50 bis 200 mg des Äquivalents
der Komposition pro Dosiseinheit, vorzugsweise etwa 100 bis 150
mg.
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Andere galenische Formen werden hergestellt
für eine
Verabreichung auf kutanem, subkutanem, intradermalem, intramuskulären oder
intravenösem
Weg, besonders Gele, Lösungen
und andere.
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Die erfindungsgemäßen Kompositionen sind auch
mit Vorteil verwendbar zur Herstellung von kosmetischen Präparaten.
Diese Präparate
sind dadurch gekennzeichnet, daß sie
auch mindestens eine erfindungsgemäße Komposition in einem Anteil
enthalten, der eine wirksame Menge von OR liefert und zusammen damit die
Exzipienten (Vehikel) enthält,
die deren Anwendung ermöglichen.
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Die diesen Präparaten durch die Anwesenheit
von Estergruppen verliehenen fettlöslichen Eigenschaften ermöglichen,
sie ohne Schwierigkeiten in die klassisch in der Kosmetik verwendeten
Produkte einzuarbeiten.
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Die erfindungsgemäßen Präparate liegen in Form von Creme,
Pommade, Emulsion, Gel, Liposomen, Lösung vor. Sie enthalten etwa
0,2 bis 5% des aktiven Produkts.
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Die erfindungsgemäßen Kompositionen sind auch
im Nahrungsmittelbereich verwendbar. Die Antiradikal-Eigenschaften
der OR, die sie enthalten, gewährleisten
eine bessere Konservierung der Nahrungsmittel Sie sind als Additive
für verschiedene
Produkte, wie Getränke
oder Milchprodukte verwendbar.
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Man kann sie auch in Form von Teig,
Körnern
oder Gel in verschiedenen Süßwarenprodukten
verwenden.
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In diesen verschiedenen Anwendungen
sind die erfindungsgemäßen vernetzten
Kom positionen auch verwendbar als Vektoren der aktiven Prinzipien.
Diese sind in der schwammartigen Masse der vernetzten Kompositionen
zurückgehalten
oder in den Mikrokapseln enthalten.
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Die Mikrokapseln können Produkte
einschließen,
die in der Human- oder Tiertherapie wirksam sind, oder im Nahrungsmittelbereich,
besonders in der Diät
verwendbar sind.
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Die Verkapselung ermöglicht,
sich vom fettlöslichem
oder wasserlöslichem
Charakter des Produkts und von verschiedenen Nachteilen zu befreien,
die bei den gewünschten
Anwendungen vorliegen können.
Sie erleichtert auch den Zugang zu den Wirkungsplätzen und
ermöglicht
die Verabreichung der aktiven Prinzipien, was bisher in dieser Hinsicht
Probleme aufwarf und/oder deren provisorischen Schutz bis zu ihrer
Ankunft an der Wirkungsstelle.
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Die Erfindung wird im folgenden durch
Beispiele der Herstellung von OR-Estern und die Verwendung zur Herstellung
von Medikamenten und kosmetischen Präparaten erläutert. Die Beispiele beziehen
sich auf die 1 bis 5, worin
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die 1 bis 4 die Kurven der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(CLHP) von erfindungsgemäßen OR-Extrakten
zeigen;
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5 das
NMR-Spektrum 1H des Resveratrol-Perhexanoats
zeigt.
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Beispiel 1: Extraktion
von OR aus Rebenranken
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Man arbeitet nach den folgenden Protokollen:
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– Extraktion durch Ultraschallbehandlung
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Man sammelt die einer bestimmten
Rebsorte entsprechenden Rebenranken, wäscht und trocknet sie und zerkleinert
sie dann zu einem Granulat.
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Zu 100 g des Weinrankengranulats
gibt man 400 bis 1000 ml, beispielsweise 800 ml destilliertes Wasser
und/oder ein oder mehrere organische Lösungsmittel.
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Man verwendet beispielsweise Wasser;
Wasser/Aceton: 3/2 oder 1/1; Methanol; Ethanol; Wasser/Ethanol:
1/1; Wasser/Ethylacetat: 1/1; Ethanol/Aceton: 1/1; Wasser/Ethanol/Aceton:
2/1/1, 1/2/1 oder 1/1/2.
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Das Gemenge wird mit Ultraschall
behandelt, indem man allgemein während
30 Minuten bis 3 Stunden behandelt.
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Anschließend filtriert man das Gemisch
und trocknet es dann.
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Eine Entfettung wird vor oder nach
dieser Extraktionsstufe durchgeführt.
Zu diesem Zweck extrahiert man mit einem Lösungsmittel wie Petrolether,
Hexan oder Chloroform. Dieser Extrakt wird seinerseits mindestens
einer Extraktionsstufe unterworfen. Man verwendet Ethylacetat oder
Ethylether im Verhältnis
3 bis 5 Mal 100 ml.
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Das erhaltene Produkt wird anschließend konzentriert,
in Wasser aufgenommen, lyophilisiert und in Form von Pulver konserviert.
Man verfügt
so über
ein Rohextrakt von OR.
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Man verifiziert die Antiradikal-
und Antioxydanzien-Aktivität
der erhaltenen Extrakte, um die geeigneten Verarbeitungsbedingungen
auszuwählen.
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In 1 ist
das CLHP-Chromatogramm eines Ethylacetat-Extrakts dargestellt, das
nach 2 Stunden Behandlung mit Ultraschall aus 100 g zerkleinerten
Rebenranken (Rebsorte Merlot) in 800 ml Wasser/Aceton: 3/2 und Entfetten
mit Petrolether erhalten wurde. Die Elution wurde mit A: H2O/TFA; 100/0,0025 (TFA = Trifluoressigsäure) und
B: MeOH/TFA 100/0,0025 nach dem folgenden Gradienten durchgeführt:
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– Extraktion durch Behandlung
mit Mikrowellen (200 bis 900 W maximum)
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Als Variante arbeitet man wie oben,
ersetzt jedoch die Ultraschallbehandlung durch die mit Mikrowellen.
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– Extraktion durch Mazerierung-Auslaugen
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Man führt eine Entfettung unter den
unten angegebenen Bedingungen vor oder nach der Mazerierungs-Auslaugungstufe
durch.
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In eine offene Säule gibt man 100 g der zerkleinerten
Rebenranken, die wie oben hergestellt wurden und dann etwa 1 bis
2 Liter Lösungsmittel.
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Man verwendet Gemische von destilliertem
Wasser/organischem Lösungsmittel,
wie beispielsweise die Mischung Wasser/Aceton: 3/2. Man läßt das Gemisch
Granulat/Lösungsmittel
10 bis 20 Stunden stehen und gewinnt dann den Extrakt, den man im
Fall eines mindestens 100 ml Wasser enthaltenen Extrakts bis auf 100
ml konzentriert oder bis zur Trockene, wenn es sich um einen ausschließlich ein
oder mehrere organische Lösungsmittel
enthaltenen Extrakt handelt, wobei der Rückstand in 100 ml Wasser wieder
aufgenommen wird.
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Eine Entfettung wird vor oder nach
dieser Extraktionsstufe wie oben beschrieben vorgenommen.
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Der erhaltene Extrakt wird anschließend einer
Extraktionsstufe mit Ethylacetat oder Ethylether unterworfen, wie
oben für
die Herstellung von Extrakten durch Ultraschall oder Mikrowellen
beschrieben.
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Die Ausbeuten an gewonnenen Rohextrakten
sind im allgemeinen zumeist höher
als 0,5% des Trockengewichts der Ausgangsrebenranken und können 1 bis
1,5% erreichen, je nach den angewandten Extraktionsbedingungen und
der Herkunft der Rebenranken.
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Beispiel 2: Gewinnung
von an OR angereicherten Fraktionen durch CPC
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1 zeigt
das CLHP-Chromatogramm eines Rohextrakts, wie er nach Beispiel 1
erhalten wurde, der hauptsächlich
Resveratrol und Katechin in praktisch äquivalenten Anteilen enthält.
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1 g dieses Extrakts gelöst in 4
ml stationärer
Phase wird in CPC injiziert.
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Man verwendet ein Gerät SANKI
Modell LLB-M hergestellt und vertrieben von Sanki Engineering (Kyoto,
Japan).
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Hauptmerkmale dieses Geräts:
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- – Umdrehungsgeschwindigkeit:
0–2000
UpM
- – Kapazität der Säule: 230
ml
- – Maximaler
Druck: 60 × 105 Pa
- – Rotormaterial:
Polyphenylensulfid (PPS)
- – Verteilungsscheibe:
Reihe von Scheiben
- – Verteilungszelle:
2136
- – Länge der
Zellen: 15 mm.
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Die stationären und mobilen Phasen sind
jeweils die unteren und oberen Phasen, die nach Rühren und
Dekantieren des Gemisches Hexan/Ethylacetat/Ethanol/Wasser: 6/48/11/42
gewonnen wurden, wobei in diesem Beispiel die aufsteigende Methode
durchgeführt
wird.
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Die Umdrehungsgeschwindigkeit ist
auf 1100 UpM, der Durchsatz auf 2 ml/Min und der Druck auf 30 × 105 Pa festgelegt.
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Unter diesen Bedingungen wird die
an Resveratrol und Oligomeren angereicherte Fraktion rasch aufgefangen,
dann werden die OR in den ersten 30 Minuten eluiert. 2 zeigt das mit dieser an
OR angereicherten Fraktion registrierte CLHP-Chromatogramm. Man
gewinnt so 120 mg OR, d. h. eine Anreicherung in der Größenordnung
von 8.
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Beispiel 3: Gewinnung
von einerseits Resveratrol-Monomer und andererseits oligomeren Formen
durch CPC
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Die in Beispiel 2 gewonnenen 120
mg OR gelöst
in 2 ml stationärer
Phase werden in aufsteigendem Modus getrennt. Die stationäre Phase
bildet die untere Phase des Gemisches Hexan/Ethylacetat/Ethanol/Wasser:
4/5/3/3 und die mobile Phase die obere Phase dieser gleichen Mischung.
Die Umdrehungsgeschwindigkeit beträgt 1100 UpM, der Durchsatz
2 ml/Min und der Druck 44 × 105 Pa. Unter diesen Bedingungen gewinnt man
die an Resveratrol angereicherte Fraktion nach 150 Minuten Elution
und die an Oligomeren des Resveratrols angereicherte nach 240 Minuten.
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Die Anreicherungen der Fraktion von
einerseits Resveratrol-Monomer (7 mg) und andererseits Oligomeren
(20,5 mg) betragen so jeweils in der Größenordnung von 17 und 6. Man
leitet daraus eine neue Anreicherung an OR in der Größenordnung
von 4,5 ab.
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Die Anreicherung mit Bezug auf den
Ausgangs-Rohextrakt beträgt
so etwa 36.
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Die CLHP-Analyse zeigt eine Resveratrol-Prozentgehalt
in der Größenordnung
von 81 % (tR = 55,6 Min), d. h. 5,7 mg reines
Resveratrol, sowie die Prozentanteile an Resveratrol-Oligomeren in der
Größenordnung
von 31% (tR = 48,5 Min) und 53% (tR = 63,8 Min), d. h. 17,2 mg gereinigte Oligomere.
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Beispiel 4:
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Indem man direkt die im Beispiel
3 beschriebene Methode (Dauer von 4 Stunden) auf den Ausgangs-Rohextrakt
anwendet, der im Beispiel 2 verwendet wurde, gelangt man zur Reinigung
des Resveratrols (8 mg) und der Resveratrol-Oligomeren (30 mg) in
der gleichen Weise.
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Die Ergebnisse am Ausgang der CLHP-Chromatogramme
sind befriedigend. Tatsächlich
erhält
man zwei Fraktionen, die eine stark angereichert an Resveratrol
(tR = 56,1 Min) mit einem Prozentgehalt
von 74,0, die andere sehr angereichert an Resveratrol-Oligomeren
(tR = 48,9 Min und tR =
64,2 Min) mit einem Prozentgehalt von 65, 6.
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Beispiel 5: Variante der
Gewinnung von an OR angereicherten Fraktionen durch CPC, wie im
Beispiel 1 erhalten, ausgehend von einem hauptsächlich Resveratrol enthaltenden
Rohextrakt
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3 zeigt
das CLHP-Chromatogramm des OR Rohextrakts vor seiner Untersuchung
mit CPC.
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Die Bedingungen der Trennung sind
identisch mit den im Beispiel 2 beschriebenen.
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Ausgehend von 1 g des Ausgangs-Rohextrakts
werden 200 mg angereicherte OR am Ende von 40 Minuten gewonnen,
d. h. ein Anreicherungsfaktor gleich 5.
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Die CLHP-Analyse der entsprechenden
angereicherten Fraktion zeigt einen Prozentsatz an Resveratrol (tR = 54,6 Min) von 88%, d. h. 176 mg reines
Resveratrol (Anreicherungsfaktor in der Größenordnung von 6).
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Beispiel 6:
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Die Fraktionierung des gleichen Ausgangs-Rohextrakts
(Beispiel 5) nach dem im vorangehenden Beispiel 3 angewandten experimentellen
Protokoll führt
zu einer besseren Anreicherung an reinem Resveratrol.
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Tatsächlich zeigt das CLHP-Chromatogramm
(4) eine Reinheit des
so erhaltenen Resveratrols von 99% (tR =
54,4 Min).
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Beispiel 7: Synthese von
Resveratrol-Perhexanoat
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Zu 15 mg Resveratrol (6,58 × 10–5 Mol)
gelöst
in 2,5 ml Pyridin werden unter Rühren
tropfenweise 0,09 ml Hexanoylchlorid (88 mg; 6,58 × 10–4 Mol;
10 Äqu.)
zugesetzt.
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Das Reaktionsmilieu wird bei Raumtemperatur
unter Luftabschluß (unter
einem leichten Stickstoffstrom) und Lichtausschluß während 12
Stunden gerührt.
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Nach Konzentration unter verringertem
Druck wird der Rückstand
in 20 ml Chloroform aufgenommen.
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Die organische Phase wird anschließend zweimal
mit 50 ml einer 0,1 M HCl-Lösung,
zweimal mit 50 ml destilliertem Wasser, zweimal mit 50 ml einer
Na2CO3-Lösung und
dann zweimal mit 50 ml destilliertem Wasser gewaschen.
-
Diese Phase wird über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet,
durch eine Glasfritte Nr. 4 filtriert, im Rotationsverdampfer konzentriert
und durch präparative
Chromatographie an einer dicken Siliziumdioxidschicht gereinigt.
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5 zeigt
das NMR 1H-Spektrum.
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Die Analysen der IR-, NMR 1H- und 13C-Spektren
bestätigen,
daß der
gewünschte
Ester erhalten wurde.
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Beispiel 8: Synthese von
OR-Perpalmitat
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Ein lyophilisierter Extrakt von OR
(30 mg; 1,32 × 10–4 Mol),
der nach Beispiel 1 hergestellt wurde, wird in 5 ml Pyridin gelöst. Zu dieser
Lösung
werden tropfenweise 0,40 ml Palmitoylchlorid (0,36 g; 1,32 × 10–3 Mol; 10 Äqu.-Resveratrol)
gegeben.
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Man beläßt das Reaktionsgemisch 3 Stunden
unter Rühren
bei 70°C
unter einem schwachen Stickstoffstrom und unter Ausschluß von Licht.
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Nach Konzentration unter verringertem
Druck wird der Rückstand
wie im Beispiel 7 behandelt. Das erhaltene Druck wird durch Spektrometrie
kontrolliert.
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Beispiel 9: Synthese von
OR-Perhexanoat
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Das im Beispiel 8 beschriebene Protokoll
wird angewandt unter Verwendung von 200 mg lyophilisiertem OR-Extrakt
(8,77 × 10–4 Mol)
und 1,23 ml Hexanoylchlorid (1,18 g; 8, 77 × 10–3 Mol;
10 Äqu.-Resveratrol).
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Eine Analyse durch IR- und NMR 1H-Spektrometrie bestätigt, daß der gewünschte Ester erhalten wurde.
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Beispiel 10: Synthese
von OR-Perbutyrat
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Zu 250 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten
lyophilisierten Extrakts von OR (1,10 × 10–3 Mol)
gelöst in
5 ml destilliertem Wasser werden unter kräftigem Rühren 25 ml Dichlormethan zugesetzt.
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Anschließend fügt man 25 ml einer mit 5% Natriumhydrogenphosphat
gepufferten wäßrigen Lösung (pH
#10), 37 mg Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (1,10 × 10–4 Mol;
1/10 Äqu.-Resveratrol)
und 0,57 ml Butyrylchlorid (0,58 g; 5,48 × 10–3 Mol;
5 Äqu.-Resveratrol) zu.
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Man beläßt das Reaktionsgemisch 45
Minuten unter kräftigem
Rühren.
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Am Ende der Reaktion wird die organische
Phase gewonnen und zweimal mit 15 ml destilliertem Wasser gewaschen,
dann unter verringertem Druck verdampft und durch präparative
Chromatographie an einer dicken Siliziumdioxidschicht gereinigt.
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Das so erhaltene Produkt wird durch
Spektrometrie kontrolliert.
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Beispiel 11: Synthese
des OR-Perlaurats
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Zu einem nach Beispiel 1 hergestellten
lyophilisierten Extrakt von OR (250 mg; 1,10 × 10–3 Mol)
werden 1,32 g Laurinsäure
(6,58 × 10–3 Mol;
6 Äqu.-Resveratrol)
gelöst
in 20 ml 1,2-Dichlorethan zugesetzt.
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Dann werden 1,36 g Dicyclocarbodiimid
(DCC) (6,58 × 10–3 Mol;
6 Äqu.-Resveratrol)
in 5 ml 1,2-Dichlorethan gelöst
und so zu der zuvor bereiteten Lösung
zugesetzt. Anschließend
fügt man
97 mg 4-Pyrrolidinopyridin (6,58 × 10–4 Mol;
6/10 Äqu.-Resveratrol)
gelöst
in 1 ml 1,2-Dichlorethan zu.
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Man beläßt das Reaktionsgemisch unter
Rühren
während
2 Stunden bei Raumtemperatur unter einem schwachen Stickstoffstrom
und unter Ausschluß von
Licht.
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Die organische Phase wird anschließend filtriert
und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wird dann in
25 ml Hexan aufgenommen. Die Hexanlösung wird filtriert, dann zweimal
mit 50 ml einer 0,1 M Natriumhydroxidlösung und dann zweimal mit 50
ml destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird dann
im Drehverdampfer konzentriert.
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Das so erhaltene Produkt wird durch
Spektrometrie analysiert.
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Beispiel 12: Synthese
des Persorbinats von OR
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Das im Beispiel 11 beschriebene Protokoll
wird angewandt, indem man 250 mg des lyophilisierten Extrakts von
OR (1,10 × 10–3 Mol)
und 0,74 g Sorbinsäure
(6,58 × 10–3 Mol;
6 Äqu.-Resveratrol)
und Cloroform als organisches Lösungsmittel
verwendet.
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Beispiel 13: Herstellung
von Mikrokapseln von durch Terephthaloylchlorid vernetzten OR
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Ein nach Beispiel 1 hergestellter
lyophilisierter Extrakt von OR (50 mg; 2,19 × 10–4 Mol)
wird in 5 ml einer 5%-igen Natriumhydrogenphosphatlösung (pH
#10) gelöst.
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Diese Lösung wird in 20 ml einer Lösung von
5% Sorbitantrioleat (Span 85®) in Chloroform durch
Rühren
mit 3000 UpM während
5 Minuten emulgiert.
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Dann wird das Vernetzungsmittel,
das Terephthaloylchlorid (89 mg; 4,39 × 10–4 Mol;
2 Äqu.-Resveratrol)
gelöst
in 15 ml Chloroform der Emulsion zugesetzt.
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Das Rühren wird während 30 Minuten fortgesetzt.
Am Ende der Reaktion wird die Reaktionsmischung zentrifugiert.
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Die feste Grenzfläche wird gewonnen, in 30 ml
Chloroform wieder suspendiert und erneut zentrifugiert.
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Der Arbeitsgang wird einmal mit Chloroform
und zweimal mit destilliertem Wasser wiederholt. Der Bodensatz beim
Zentrifugieren wird gewonnen und in 5 ml destilliertem Wasser wieder
suspendiert. Die so hergestellten Mikrokapseln werden durch Lyophilisierung
getrocknet und durch optische Mikroskopie kontrolliert.
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Beispiel 14: Herstellung
von Mikrokapseln von durch Sebacoylchlorid vernetzten OR
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Das im Beispiel 13 beschriebene Protokoll
wird angewandt, indem man 50 mg des lyophilisierten Extrakts von
OR (2,19 × 10–4 Mol)
und 0,09 ml Sebacoylchlorid (0,10 g; 4,38 × 10–4 Mol;
2 Äqu.-Resveratrol)
verwendet.
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Beispiel 15: Herstellung
von Mikrokapseln von durch Adipoylchlorid vernetzten OR
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Das im Beispiel 13 beschriebene Protokoll
wird angewandt, indem man 50 mg des lyophilisierten Extrakts von
OR (2,19 × 10–4 Mol)
und 0,06 ml Adipoylchlorid (80 mg; 4,38 × 10–4 Mol;
2 Äqu.-Resveratrol)
verwendet.
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Beispiel 16: Herstellung
eines kosmetischen Sonnenschutzpräparats
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Eine Sonnenschutzemulsion mit Wirkung
gegen die Hautalterung wird hergestellt, indem man ein Sonnenlichtfilter
mit einem erfindungsgemäß hergestellten
Ester und Exzipienten für
eine Creme mischt. Rezepturbeispiel:
| Neo
Heliopan E 1000® (Isopropylmethoxycinnamat und
Ethyldiisopropylcinnamat) | 3% |
| Perlaurat
von OR nach Beispiel 6 | 3% |
| Exzipienten
für einen
Creme E/H | qs |
Zusammensetzung
der Exzipienten (Vehikel):
| Propylenglykoldicaprylat/Dicarat
+ Stearalkonium hektorit + Propylencarbonat (Miglycol 840 gel B®) | 20% |
| Bis-Diglycerylcaprylat/Caprat/Isostearat/
Hydroxystearatadipat (Softisan 649®) | 5,0% |
| Isostearyldiglycerylsuccinat
(Imwitor) 780 K® | 5,0% |
| Paraffinöl | 8% |
| Festes
Paraffin | 3% |
| Magnesiumsulfat | 2% |
| Wasser | qsp
100% |
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Beispiel 17: Herstellung
von Gelatinekapseln für
Diätverwendung
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Nach Beispiel 11 hergestelltes Perlaurat
von OR wird mit Selen und Vitamin E gemischt;
- – Perlaurat
von OR: 85 mg (entsprechend 25 mg OR)
- – DL-α-Tocopherolacetat:
40 mg;
- – Selen:
50 mg.
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Beispiel 18: Herstellung
eines Medikaments als Venentonikum und Gefäßschutz
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Gelatinekapseln werden hergestellt
ausgehend von 230 mg Perhexanoat von OR (entsprechend 100 mg OR),
das nach Beispiel 9 hergestellt wurde, und Exzipienten für eine Gastro-resistente
Umhüllung,
wie Zelluloseacetophthalat.
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Beispiel 19: Herstellung
eines in der Radiotherapie verwendbaren Mundgels
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Man formuliert die folgende Komposition:
| Carbopol® 934
P-Gel mit 2% | 89,85
g |
| Natrium-Methylparahydroxybenzoat | 0,13
g |
| Natrium-Propylparahydroxybenzoat | 0,02
g |
| Labrafil® | 5
g |
| Perhexanoat
von OR, hergestellt nach Beispiel 9 (entsprechend 2,2 g OR) | 5
g |
