DE69817594T2

DE69817594T2 - Fibrinschwamm

Info

Publication number: DE69817594T2
Application number: DE69817594T
Authority: DE
Inventors: Thomas Seelich; Edgar Scheel; Johann Odar; Alain Yves DELMOTTE
Original assignee: Baxter AG; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter AG; Baxter International Inc
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2018-09-19
Also published as: EP1017429A2; WO1999015209A3; JP3602441B2; AT407117B; DE69817594D1; BR9812228A; WO1999015209A2; IL134983A0; EP1017429B1; CN1276733A; US6548729B1; KR20010024172A; JP2001517492A; ATA159397A; AU9627098A; CA2303536A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Fibrinschwamm mit einer definierten Restfeuchte, Verfahren zu dessen Herstellung, seine Verwendung zur Blutstillung, Gewebeklebung und Unterstützung der Wundheilung sowie ein Set zu dessen Anwendung.
Im Stand der Technik wurden schon verschiedenste blutstillende Wundabdeckungsmaterialien auch auf Basis von Fibrin, beispielsweise Fibrinschwämme, Fibrinmembranen oder Fibringele beschrieben und teilweise auch verwendet.
Bisher herrschte die Meinung vor, dass zur Blutstillung eine Kombination von Fibrinogen und Thrombin oder entsprechender Prothrombinaktivatoren notwendig ist. So sind beispielsweise aus dem Stand der Technik vliesartige Flachmaterialien auf Basis von Collagen enthaltend Fibrinogen und Thrombin (TachoComb^®( EP 0 059 265 )), Flachmaterialien enthaltend Fibrinogen und aktivierten Faktor X (als Trockenpräparat ( EP 0 748 633 , IMMUNO AG)) bekannt. Während die vliesartigen Flachmaterialien auf Basis von Fibrinogen und aktiviertem Faktor X bereits weich und biegsam sind, ist es bei anderen Flachmaterialien notwendig, sie absolut trocken zu lagern, um eine vorzeitige Reaktion des darin enthaltenen Fibrinogens mit dem Thrombin oder mit anderen Blutgerinnungsaktivatoren auszuschließen.
Bering E.A.jr. (J. Clin. Invest. Bd. 23, 1944, S. 586) diskutiert allgemeine Entwicklungen auf dem Gebiet der Fibrinschäume sowie deren Verwendung als hämostatische Agentien.
Eine Übersicht zu verschiedensten Materialien auf Fibrinbasis, beispielsweise Fibrinpulver, Fibrinfilme und Fibrinschäume, wird beispielsweise in Gerendas M. "Fibrin products as aids in hemostasis and wound healing", S. 277 ff, in K. Laki (Hrsgb.) Fibrinogen, M. Dekker, New York, 1968, gegeben.
Aus dem Stand der Technik sind weiters Fibrinfolien bzw. Fibrinmembranen bekannt (siehe z. B. EP 0485 210-A2 ). Derartige Materialien sind extrem dünn, nicht saugfähig und daher zur Blutstillung nur begrenzt einsetzbar. Im Gegensatz zu Fibrinschwämmen werden diese Materialien bei der Herstellung bewusst komprimiert, beispielsweise durch Auflegen von Gewichten. Daher zeichnen sich diese Materialien v. a. durch ihre, im Vergleich zu Schäumen, hohe Dichte aus.
Die vorliegende Erfindung stellt sich zur Aufgabe, ein Mittel zur Blutstillung, Gewebeklebung und Unterstützung der Wundheilung auf Basis von Fibrin zur Verfügung zu stellen, welches im Vergleich zu herkömmlichen Mitteln eine gute, insbesondere eine verbesserte Wirksamkeit, eine einfache Handhabung bei gleichzeitig einfacher Zusammensetzung, die eine preisgünstige Herstellung erlaubt, sowie ein breites Anwendungsgebiet besitzt. Darüber hinaus soll das Fibrinmaterial leicht mit anderen Wirk- und Hilfssubstanzen versehen werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass ein Fibrinschwamm mit einer Restfeuchte von mindestens 3%, vorzugsweise im Bereich von 3 bis 35%, insbesondere 10 bis 20%, der einen Blutgerinnungsaktivator oder -proaktivator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thrombin, Prothrombin, aktiviertem Prothrombinkomplex, FEIBA und Mischungen davon enthält, zur Verfügung gestellt wird, welcher lagerstabil ist. Dabei wird der Wassergehalt bzw. die Restfeuchte vorzugsweise so eingestellt, dass der Fibrinschwamm eine weiche und anschmiegsame Konsistenz erhält, wodurch seine Handhabung und Wirksamkeit wesentlich verbessert wird.
Aus dem Stand der Technik war zwar die Tatsache bekannt, dass trockene, Fibrin enthaltende Präparate, die von harter, spröder Konsistenz sind, durch Erhöhen der Restfeuchte weich und anschmiegsam (biegsam) werden. Es bestand allerdings ein allgemeines Vorurteil hinsichtlich der Stabilität derartiger Protein-Präparate mit erhöhter Restfeuchte, insbesondere wenn diese ein empfindliches Enzym wie Thrombin oder einen anderen Aktivator oder Proaktivator der Blutgerinnung enthalten.
Nicht umsonst werden derartige empfindliche Proteinpräparate üblicherweise durch Lyophilisieren haltbar gemacht, wobei eine Restfeuchte von weniger als 3%, meistens sogar von weniger als 1% erreicht wird.
Es war deshalb überraschend, dass ein Fibrinschwamm vorzugsweise mit einem Gehalt an Thrombin und einer erhöhten Restfeuchte bzw. einem erhöhten Wassergehalt trotzdem lagerstabil ist.
Unter lagerstabil wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fibrinschwamm verstanden, der auch nach einer Lagerung von 6 Monaten, in der Regel jedoch selbst nach einer Lagerung von 2 oder mehreren Jahren bei Raumtemperatur, immer noch vorzüglich zur Anwendung geeignet ist und die gegebenenfalls enthaltende Thrombinaktivität bzw. Blutgerinnungsaktivator- oder Proaktivator-Aktivität im Wesentlichen erhalten bleibt. Vorzugsweise bleiben mehr als 70% der Aktivität über einen Zeitraum von mindestens 6 Monaten, vorzugsweise 2 oder mehreren Jahren, bei Raumtemperatur erhalten. Sogar bei einer Temperatur von 37°C zeigte sich, dass der erfindungsgemäße Fibrinschwamm bei einer Restfeuchte von 15% für wenigstens 3 Monate, vorzugsweise mehr als 6 Monate, unter Erhaltung der vollen Thrombinaktivität stabil ist.
Das erfindungsgemäße Präparat wird insbesondere den vielfältigen Anforderungen an ein Mittel zur Blutstillung, Gewebeverklebung und Unterstützung der Wundheilung gerecht, beispielsweise können durch das erfindungsgemäße Präparat Eigenschaften wie

– gute und andauernde Wirksamkeit, d. h. rasche Blutstillung bzw. klebende Wirkung, keine Nachblutungen bzw. nachträgliche Loslösung verklebter Gewebeteile,
– gute Verträglichkeit auch bei mehrfacher Anwendung (keine Sensibilisierung)
– vollkommene Resorption während des Wundheilungsprozesses,
– glatte und ungestörte Wundheilung,
– höchstmögliche Sicherheit hinsichtlich der Übertragung viraler oder anderer Krankheitserreger (wie z. B. von Prionen, den Erregern der bovinen spongiformen Enzephalitis, BSE),
– einfache Anwendung sowie die bereits erwähnte
– Lagerstabilität des gebrauchsfertigen Produktes gewährleistet werden.

Der erfindungsgemäße Fibrinschwamm ist vorzugsweise ein Fibrinvlies-artiges Flachmaterial oder ein Fibrinschaum mit einer geringen Dichte und hohen Saugfähigkeit.
Unter einem Fibrinvlies-artigen Flachmaterial ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fibrinschwamm zu verstehen, der eine poröse, insbesondere feinporige, im Wesentlichen nicht mit Luftblasen durchsetzte Struktur aufweist wie sie durch Lyophilisieren von nicht-geschäumten Fibrin-Clots erfindungsgemäß erhalten werden kann. Unter einem Fibrinschaum wird hingegen ein Material verstanden, das erhalten wird durch Aufschäumen einer Fibrinogenlösung, Versetzen mit einer Thrombinlösung, und Lyophilisieren des so erhaltenen aufgeschäumten Fibrin-Clots. Das Aufschäumen kann auch unmittelbar nach Zugabe des Thrombins erfolgen.
Der erfindungsgemäße Fibrinschwamm kann auch als solcher verwendet werden. Er kann im Wesentlichen nur aus Fibrin und dem zur Herstellung des Fibrins aus Fibrinogen benötigtem Thrombin bestehen, wobei überraschenderweise bereits diese einfache Aus führung ausgezeichnete blutstillende und klebende Wirkung zeigt. Er kann aber auch mit weiteren Zusätzen, vorzugsweise einem Blutgerinnungsaktivator oder -proaktivator, imprägniert werden. Derartige Zusätze sind in dem erfindungsgemäßen Präparat vorzugsweise homogen verteilt.
Der Blutgerinnungsaktivator oder -proaktivator ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thrombin, Prothrombin, Prothrombinkomplex, aktiviertem Prothrombinkomplex, FEIBA, vorzugsweise Calciumionen und Mischungen davon.
Insbesondere kann im Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzliches Thrombin vorgesehen werden, vorzugsweise in einer Menge zwischen 1 und 300 E/cm³, mehr bevorzugt zwischen 5 und 100 E/cm³, am meisten bevorzugt zwischen 10 und 50 E/cm³.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäßen Präparate auf Basis von festem Fibrin auch mit einem zusätzlichen Gehalt an Thrombin dennoch über lange Zeit bei Lagerung bei Kühlschrank- oder Raumtemperatur und sogar bei 37°C (in einem beschleunigten Stabilitätstest) stabil sind. Insbesondere bleibt die enthaltene Thrombinaktivität über lange Zeit im Wesentlichen erhalten. Die enthaltene Thrombinaktivität kann beispielsweise nach Extraktion mit 1 M NaCl-Lösung nach an sich bekannten Methoden, z. B. mit einem chromogenen Substrat (Th-1, Pentapharm), bestimmt werden.
Neben Stoffen wie Blutgerinnungsaktivatoren oder -proaktivatoren können in dem erfindungsgemäßen Fibrinschwamm auch Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel, Antibiotika, therapeutische Mittel, antifibrinolytische Mittel, Wachstumsfaktoren, weitere Plasmaproteine, Enzyme, Inhibitoren oder Mischungen derartiger Mittel enthalten sein.
Als Stabilisatoren werden vorzugsweise Thrombinstabilisatoren, insbesondere Polyole, Polysaccharide, Polyalkylenglykole, Aminosäuren oder Mischungen davon, oder den Wassergehalt stabilisierende Substanzen, insbesondere Polysaccharide oder Polyole verwendet. Die Verwendung von Sorbit, Glycerin, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Mono- oder Disacchariden, wie Glukose oder Saccharose oder jeglicher Zucker oder Aminosäuren, die die Thrombinaktivität bzw. die Restfeuchte stabilisieren, ist dabei bevorzugt.
Ebenso kann die gewünschte Weichheit des Präparates durch Inkorporieren von Substanzen, beispielsweise von hydro-stabili sierend wirkenden Stoffen wie Glycerin erreicht bzw. verbessert werden. Nach Lyophilisierung in Gegenwart derartiger Substanzen können erhöhte Restfeuchte-Werte erhalten werden.
Ein bevorzugtes Antifibrinolytikum ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aprotinin, Aprotininderivat, α-2-Makroglobulin, α-2-Plasmin-Inhibitor, α-1-Plasmin-Inhibitor, Plasminogenaktivator-Inhibitor, Inhibitor oder Inaktivator von aktiviertem Protein C, eine Plasmin-bindende Substanz oder Mischungen dieser Substanzen. Es können auch synthetische Substanzen, insbesondere synthetische Fibrinolyse-Inhibitoren, z. B. ε-Aminocapronsäure oder Tranexamsäure, eingesetzt werden. Auch nicht-plasmatische, beispielsweise pflanzliche Antifibrinolytika können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Bevorzugte Wachstumsfaktoren sind beispielsweise Zytokine. Als weitere Plasmaproteine werden vorzugsweise Albumin, Faktor XIII oder Fibronektin vorgesehen.
Weiters können dem erfindungsgemäßen Fibrinschwamm auch spezifische Proenzyme, Enzyme oder Enzym-Inhibitoren zugesetzt werden, z. B. um die Resorption des Fibrinschwammes im Körper zu regulieren, d. h. entweder zu beschleunigen oder zu inhibieren. Zu diesen Stoffen zählen beispielsweise Plasminogene, Collagenase, Plasminogenaktivatoren, Plasminogenaktivator-Inhibitoren, Plasmin-Inhibitoren oder Elastase-Inhibitoren.
Die erfindungsgemäßen Präparate weisen an sich schon eine gute Saugfähigkeit auf. Vorzugsweise wird zusätzlich noch eine geringe Menge eines Tensides, wie Tween^® 80 (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) inkorporiert, wodurch die Saugfähigkeit des erfindungsgemäßen Präparates noch weiter gesteigert werden kann.
Das Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich somit insbesondere durch die folgenden Eigenschaften aus:
Es besitzt eine hohe Weichheit bzw. Anschmiegsamkeit, so dass es problemlos an eine unregelmäßig geformte Wundfläche aufgebracht werden kann. Weiters besitzt es eine hohe Saugfähigkeit, wodurch das austretende Blut verzögerungsfrei aufgenommen werden kann.
Der erfindungsgemäße Fibrinschwamm weist bevorzugterweise eine Flüssigkeitsaufnahmekapazität von mindestens dem 2-fachen, vorzugsweise mehr als dem 4-fachen des Eigengewichtes auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Material eine homogene Verteilung der gerinnungsfördernden Eigenschaften in solcher Stärke auf, dass das aufgesaugte Blut innerhalb weniger Sekunden, vorzugsweise innerhalb weniger als 30 Sekunden, im erfindungsgemäßen Präparat gerinnt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Fibrinschwammes auf Basis von Fibrin, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

– Herstellen eines Fibrin-Clots durch Mischen von Fibrinogen und Thrombin und Inkubieren des Gemisches bei einer Temperatur, vorzugsweise bei 20–37°C, für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Bildung des Fibrin-Clots zu ermöglichen, und insbesondere die Fibrinvernetzung zu vervollständigen, vorzugsweise 10 min–24 h,
– (Tieffrieren und) Lyophilisieren des Fibrin-Clots, und
– Einstellen einer Restfeuchte von mindestens 3%, vorzugsweise 3 bis 35%, insbesondere zwischen 10 und 20%.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Einstellung des Wassergehalts während der Lyophilisierung. Die Restfeuchte kann jedoch auch nach der Lyophilisierung durch Inkubation in einer feuchten Kammer auf den gewünschten Wert eingestellt werden.
Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Präparates ist vorzugsweise auch ein Waschschritt und/oder Inkubationsschritt vorgesehen. Dadurch können insbesondere lösliche Bestandteile wie z. B. Salze entfernt werden, während der Gehalt an Thrombin, der aufgrund des Herstellungsverfahrens gegeben ist, überraschenderweise weitgehend erhalten bleibt.
Das Waschen kann mit destilliertem Wasser durchgeführt werden, es können aber auch Lösungen, die weitere Wirk- oder Zusatzstoffe enthalten, verwendet werden. Somit ist es möglich, die Zusammensetzung des Endproduktes gezielt einzustellen bzw. zu variieren.
Insbesondere wurde gefunden, dass das im Fibrin-Clot enthaltene Thrombin durch Waschen mit einer isotonen Kochsalzlösung praktisch nicht eluierbar ist. Beispielsweise werden nach 4-stündigem Waschen mit dem 10-fachen Volumen isotoner Kochsalzlösung erst etwa 4% des Gesamtthrombins in der Waschlösung gefunden. Hingegen werden andere Plasmaproteine, wie z. B. Albumin, unter den gleichen Bedingungen vergleichsweise rasch (ca. 25% in 4 Stunden, ca. 50% in 8 Stunden) eluiert.
Schließlich kann die an sich erstaunlich hohe Stabilität des im erfindungsgemäßen Präparat vorzugsweise homogen verteilten Blutgerinnungsaktivators oder -proaktivators durch an sich bekannte Stabilisatoren wie z. B. Zucker, Zuckeralkohole, Polyole, Aminosäuren, etc., oder Mischungen davon, noch weiter erhöht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Fibrinschwamm im Zuge der Herstellung mit weiteren Substanzen, wie bereits an früherer Stelle erwähnt, gewaschen und/oder imprägniert. Vorzugsweise wird der Fibrin-Clot vor der Lyophilisierung imprägniert. Es ist aber auch möglich, das Waschen bzw. Inkubieren nach der Lyophilisierung durchzuführen, woran dann ein weiterer Lyophilisationsschritt anschließt.
Der Fibrinschaum kann dadurch hergestellt werden, dass die Fibrinogenlösung vor oder unmittelbar nach dem Mischen mit Thrombin, jedoch vor Eintritt der Gerinnung, aufgeschäumt wird. Für das Aufschäumen können alle hiefür aus dem Stand der Technik gängigen Mittel eingesetzt werden. Beispielsweise handelt es sich dabei um chemische, physikalische und/oder mechanische Mittel oder Methoden. Gase können eingebracht oder generiert werden, insbesondere wird Luft durch intensives, mechanisches Rühren (Ultraturrax-Behandlung oder Ähnliches) eingebracht. Als Beispiel für eine physikalische Methode sei das Anlegen eines Vakuums erwähnt.
Es wurde aber weiters gefunden, dass es im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Methoden zur Herstellung von Fibrinschwämmen nicht unbedingt notwendig ist, die Fibrinogenlösung bzw. das Fibrinogen-Thrombin-Gemisch vor Einsetzen der Gerinnung aufzuschäumen.
Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Methoden zur Herstellung von Fibrinschwämmen werden aus Fibrin-Clots, die ohne Aufschäumen hergestellt worden sind, nach Lyophilisierung ohne wesentliche Schrumpfung besonders feinporige und saugfähige Präparate erhalten.
Bevorzugterweise weist der Fibrin-Clot vor dem Einfrieren und Lyophilisieren einen relativ niedrigen Salzgehalt bzw. eine niedrige Ionenstärke, vorzugsweise weniger als 0,15, auf, vorzugsweise ist er im Wesentlichen frei von Salzen.
Die Vermeidung des Aufschäumens bedeutet eine wesentliche Vereinfachung und Erleichterung des Herstellungsverfahrens, besonders wenn dieses unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden soll.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Fibrinschwamm, d. h. insbesondere das Fibrin-Flachmaterial oder der Fibrinschaum, nach entsprechender Herstellung geschnitten. Vorzugsweise wird er derart geschnitten, dass nach dem Schneiden eine möglichst große Schnittfläche vorliegt, die dann für die Wundabdeckung nutzbar ist. Es zeigte sich überraschenderweise, dass die Saugfähigkeit dieser geschnittenen Flächen noch höher ist als die der ungeschnittenen, sozusagen "nativen" Oberflächen unmittelbar nach der Lyophilisierung.
Die gute Verträglichkeit auch bei mehrfacher Anwendung, insbesondere die Vermeidung allergischer Reaktionen wird vorzugsweise durch die ausschließliche Verwendung von humanen Proteinen sowie durch die Vermeidung von Verfahren, beispielsweise Sterilisierungsverfahren, durch die Proteine denaturiert werden können (wie z. B. durch γ-Bestrahlung), erreicht.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Wundauflage erfolgt in einer besonders bevorzugten Ausführungsform aus einem sterilen Ausgangsmaterial unter Beibehaltung steriler Bedingungen bis zum Endprodukt.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Präparat aus Humanplasmaproteinfraktionen hergestellt, die nach geeigneten Virusinaktivierungsverfahren für empfindliche Plasmaproteine behandelt worden sind.
Die Inaktivierungsbehandlung wird vorzugsweise mit einer Tensid- und/oder Hitzebehandlung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung im festen Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP 0 159 311 , der EP 0 519 901 oder der EP 0 674 531 .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Hitzebehandlung als Dampf-Hitzebehandlung mit einem Restwassergehalt von zwischen 6 und 15%, vorzugsweise etwa 12%. Wenn Thrombin im Schwamm vorhanden ist, wurde überraschenderweise festgestellt, dass selbst unter diesen Bedingungen fast die gesamte Thrombinaktivität erhalten blieb.
Weitere Schritte zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, z. B. mit chaotropen Stoffen gemäß der WO 94/13 329, der DE 44 34 538 oder der EP 0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photoinaktivierung.
Vorzugsweise werden zwei voneinander unabhängige Virusinaktivierungsverfahren durchgeführt.
Die Nanofiltration stellt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Eine andere Möglichkeit, die Virussicherheit zu erhöhen, besteht darin, von vornherein ausschließlich von weitgehend virussicheren Ausgangssubstanzen bei der Herstellung auszugehen und dann im Rahmen des Herstellungsprozesses alle Kontaminationsrisiken auszuschalten. Die höchstmögliche Sicherheit hinsichtlich der Übertragung viraler oder anderer Krankheitserreger wird bei Herstellung aus Humanplasma zusätzlich dadurch gewährleistet, dass eine sorgfältige Auswahl und Überwachung der Plasmaspender erfolgt, das Ausgangsplasma einer Testung auf pathogene Viren unterzogen wird (vorzugsweise Einzelspenden-Testung), insbesondere mit PCR-Methoden.
Das erfindungsgemäße Präparat kann aber grundsätzlich auch aus rekombinantem bzw. transgenem Material hergestellt werden, wobei ebenfalls die dort erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen einzuhalten sind.
Vorzugsweise erfolgt die Herstellung ausgehend von sterilen Zwischenprodukten (sterilfiltrierten Lösungen) bis zum steril verpackten Endprodukt unter sterilen Bedingungen, so dass eine nachträgliche Sterilisierung im Endbehälter, wie beispielsweise durch γ-Bestrahlung, nicht mehr notwendig ist.
Die vollkommene Resorption während des Wundheilungsprozesses, sowie die glatte und ungestörte Wundheilung wird durch die Verwendung von Fibrin und gegebenenfalls weiteren Plasmaproteinen wie beispielsweise Fibronektin als Matrix erreicht, wobei die Bildung des Fibrins vorzugsweise bei etwa physiologischer Ionenstärke, bei etwa physiologischem pH und in Gegenwart von Faktor XIII erfolgt, so dass ein vernetzter Fibrin-Clot mit physiologischer Fibrinstruktur erhalten wird, die für das Einsprossen von Fibroblasten und damit für eine rasche und glatte Wundheilung wesentlich ist (vgl. dazu auch Redl et al, Med. Welt, 36, S. 769–776, 1985).
Die Länge und Breite des erfindungsgemäßen Fibrinschwammes ist je nach Art des Einsatzes frei wählbar. Die Dicke liegt vorzugsweise in einem praktikablen Bereich zwischen 1 und 20 mm je nach Indikation, wobei Dicken zwischen 3 und 15 bzw. 5 und 10 mm bevorzugt sind.
Der erfindungsgemäße Fibrinschwamm kann auch als eine Kombination mit anderen Materialien vorliegen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Schwamm aus mehreren Schichten aufgebaut, so dass ein mehrlagiges Material gebildet wird. Vorzugsweise hat mindestens eine Schicht blutstillende Eigenschaften. Die Schichten können aus demselben Material aufgebaut sein, oder sie können sich im Material und/oder in ihrer Zusammensetzung unterscheiden.
Das Schwammmaterial kann durch das spezifische Gewicht des Materials oder jeder Schicht gekennzeichnet sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das spezifische Gewicht zwischen 0,005 und 0,15 g/cm³, mehr bevorzugt 0,01 bis 0,09 g/cm³, am meisten bevorzugt 0,02 bis 0,05 g/cm³.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Schichten aus demselben Material zusammengesetzt, unterscheiden sich aber in ihren physikalischen Eigenschaften, wie z. B. ihrem spezifischen Gewicht. Durch Variieren der physikalischen Eigenschaften der Schichten ist ein Schwamm erhältlich, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Seite dieses Schwammes glatt ist mit einer hohen Absorptionskapazität, während die andere Seite des Schwammes kompakter und dichter ist. Ein weiterer Weg zur Variierung der Eigenschaften der verschiedenen Schichten kann erreicht werden, indem die Menge oder die Konzentration der die Schicht bildenden Substanzen oder jener Substanzen, mit denen jede Schicht imprägniert ist, variiert werden. So kann beispielsweise die Thrombin-Konzentration in den verschiedenen Schichten verschieden sein.
Die Anwendung des Fibrinschaumes erfolgt beispielsweise derart, dass er auf die blutende Wunde aufgelegt und für kurze Zeit (etwa 30 Sekunden) leicht angedrückt wird. Der Schwamm saugt das Blut sehr rasch auf, wobei das aufgesaugte Blut im Schwamm gerinnt. Dadurch wird eine feste Verankerung des Fibrinschwammes auf der Wundfläche erreicht, worauf letztlich die blutstillende und klebende Wirkung beruht.
Das Präparat kann auch als sogenannter Trockenkleber, vorzugsweise als relativ dünner Schwamm, verwendet werden. Zur Verklebung von zwei (weichen) blutenden Gewebeteilen wird ein passendes Stück des "Trockenklebers" auf eine Wundfläche aufgebracht und anschließend die zweite Wundfläche (der zweite Gewe beteil) adaptiert und kurz angedrückt.
Das medizinische Indikationsgebiet für den erfindungsgemäßen Fibrinschwamm ist ziemlich umfassend. Der Schwamm kann nicht nur zum Stoppen einer Sickerblutung verwendet werden, sondern auch zum Stoppen einer Blutung bei sehr großen blutenden Flächen mit hohem Blutdruck. Folgende innere und äußere chirurgische Eingriffe können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Fibrinschwammes erfolgreich durchgeführt werden: Allgemeine Chirurgie, beispielsweise Operationen parenchymatöser Organe (Leber, Niere, Milz usw.), kardiovaskuläre Operationen, Thoraxoperationen, Transplantationsoperationen, orthopädische Operationen, Operationen in der Knochenchirurgie und plastischen Chirurgie, Ohren-, Nasen- und Halsoperationen, Operationen in der Neurochirurgie, Operationen im urologischen und gynäkologischen Bereich, sowie allgemein zur Hämostase, wie zur Behandlung von herkömmlichen Wunden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch ein Set zum Kleben von Wunden vorgesehen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Fibrinschwamm gemäß der Erfindung und eine einen Blutgerinnungsfaktor enthaltende Komponente umfasst.
Dieser Blutgerinnungsfaktor ist vorzugsweise Fibrinogen, Faktor XIII, Fibronektin, Thrombin oder Mischungen dieser Faktoren, wobei eine Fibrinogenkomponente vorzugsweise in lagerstabiler Form, etwa ein handelsübliches Produkt eines Gewebeklebers auf Basis von Fibrinogen, besonders bevorzugt wird.
Der Schwamm gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch als biologischer Träger für Zellkulturen nützlich sein, insbesondere für Säugerzellen, wie Keratinozyten, Epithelzellen, Epidermis-Zellen, Fibroblasten, Chondrozyten od. dgl..
Daher ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein Set vorgesehen, welches einen erfindungsgemäßen Fibrinschwamm in steriler Form zur Verwendung als biologischen Zellkultur-Träger umfasst.
Weitere Zusatzstoffe, wie Antibiotika, verschiedene Aminosäuren und/oder verschiedene Wachstumsfaktoren können im Schwamm vorhanden sein oder dem verwendeten Medium später zugesetzt werden.
Bei Verwendung des Fibrinschwammes gemäß der vorliegenden Erfindung als Zellkultur-Träger ist es möglich, einen Ersatz von Gewebe, wie z. B. Haut, Knochen, Knorpel bzw. Nerven, zu bilden.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel noch näher erläutert, ohne sie jedoch auf dieses zu beschränken:
Beispiel 1:
Fibrinvlies-artiges Flachmaterial aus vernetztem Fibrin mit einem (relativ niedrigen) Gehalt an Thrombin.
1.1 Herstellung
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer Fibrinogenlösung mit einem Gehalt an Faktor XIII und Fibronektin diente ein käufliches, durch Dampfbehandlung virusinaktiviertes, lyophilisiertes Gewebeklebstoff-Präparat (Tissucol^®, IMMUNO AG). Das Präparat wurde lt. Angabe des Herstellers mit einer wässrigen Aprotininlösung (3000 KIE/ml) gelöst und mit destilliertem H₂O 1 : 4 weiterverdünnt, so dass eine Fibrinogenkonzentration von etwa 20 mg/ml erhalten wurde. 20 ml dieser Lösung wurden mit 20 ml einer Thrombin-CaCl₂-Lösung (Humanes Thrombin, ca. 10 E/ml 5 mM CaCl₂) rasch gemischt und in eine Petrischale (ID = 8,4 cm) ausgegossen, zunächst etwa 30 min in Ruhe bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach noch etwa 16 h in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Der Clot in Form einer runden Scheibe von etwa 7 mm Dicke wurde sodann tiefgefroren und lyophilisiert. Das entstandene Lyophilisat (Vlies-artiges Flachmaterial) hatte ein leichtes, feinporöses Aussehen und im Wesentlichen die Form des Clots vor Lyophilisierung beibehalten. Allerdings war das Material zur optimalen Anwendung noch zu spröde. Zur Verbesserung der gewünschten Weichheit und Biegsamkeit wurde das Flachmaterial für etwa 3 h in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch ein weiches anschmiegsames und sehr saugfähiges Material erhalten wurde.

1.2: Analyse in vitro Testungen:

Restfeuchte:	ca. 15%
Biegsamkeit:	>90° bei einem mittleren Krümmungsradius entsprechend der halben Schichtdicke
Fibrinvernetzung:	γ-Ketten: 100% α-Ketten: ca. 80%
Thrombingehalt:	Bestimmung nach Extraktion mit 1 M NaCl: 1,4 E/cm³
Wasseraufnahmevermögen:	ca. 6-faches Eigengewicht
Wasseraufnahmegeschwindigkeit:	ein auf die Oberfläche des Flachmaterials aufgesetzter Wassertropfen (50 μl) wird in ca. 25 s vollkommen aufgesaugt.

(Auf geschnittenen Flächen des Flachmaterials erfolgt unter sonst gleichen Bedingungen die Wasseraufnahme praktisch sofort, d. h. in weniger als 5 s)
1.3 Wirksamkeit
Die klebende und blutstillende Wirkung des nach 1.1 hergestellten Präparates wurde im sogenannten Nierenpol-Resektionsmodell am Kaninchen getestet.
Dabei wird dem Versuchstier unter Narkose mit Kedamin und Xylazin (Nachdosierung Pentobarbital) eine Niere freigelegt und mit dem Skalpell der Nierenpol entfernt. Es entsteht eine etwa kreisrunde, gleichmäßig stark blutende Fläche von ca. 1 bis 1,5 cm Durchmesser. Das Testpräparat wird auf die blutende Fläche aufgelegt, genau 30 s mit dem Finger leicht angedrückt und danach losgelassen. Die Haftung des Präparates wird beobachtet und die Zeit bis zum vollständigen Stillstand der Blutung gemessen. Etwa ausgetretenes Blut wird mit Gazetupfern aufgenommen und der Blutverlust nach Extraktion mit Ammoniak aus dem Testmaterial und den Gazetupfern kolorimetrisch bestimmt.
Der Test wurde mit dem nach 1.1 erhaltenen Präparat an zwei Kaninchen durchgeführt.
Ergebnisse:
In beiden Fällen haftete das Präparat gut auf der stark blutenden Fläche und wurde ein vollständiger Stillstand der Blutung praktisch sofort (in weniger als 30 s) erreicht. Während einer Nachbeobachtungszeit von 1 h traten keine Nachblutungen auf.
Der totale Blutverlust (im Testmaterial aufgesaugt, sonst kein ausgetretenes Blut) betrug 0,10 bzw. 0,18 ml.
Zum Vergleich beträgt in diesem Modell der Blutverlust bei konventioneller Blutstillung mit Gaze etwa 5 ml bei einer Blutungszeit von 3 min, bzw. ohne Behandlung etwa 27 ml bei einer Blutungszeit von 9 min.
Die gegenüber herkömmlichen Mitteln wesentlich verbesserte Wirksamkeit des nach 1.1 erhaltenen Präparates wurde somit eindrucksvoll demonstriert.

Claims

Lagerstabiler Fibrinschwamm, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Restfeuchte von mindestens 3% aufweist und dass er einen Blutgerinnungsaktivator oder -proaktivator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thrombin, Prothrombin, aktiviertem Prothrombinkomplex, FEIBA und Mischungen davon enthält.
Fibrinschwamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er weiters Calciumionen enthält.
Fibrinschwamm nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Restfeuchte von 3 bis 35%, insbesondere 10 bis 20%, aufweist.
Fibrinschwamm nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass er 1 bis 300 E/cm³ Thrombin, vorzugsweise 5 bis 100 E/cm³, am meisten bevorzugt 10 bis 50 E/cm³, aufweist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Antibiotika, therapeutische Mittel, antifibrinolytische Mittel, Wachstumsfaktoren, weitere Plasmaproteine, Enzyme, Inhibitoren oder Mischungen dieser Mittel aufweist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Flüssigkeitsaufnahmekapazität von mindestens dem 2-fachen, vorzugsweise dem 4-fachen, des Eigengewichts aufweist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er virusinaktiviert ist.
Fibrinschwamm nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusinaktivierung in zwei unabhängigen Virusinaktivierungsschritten bewirkt wurde.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er frei von eluierbaren Plasmaproteinen, insbesondere frei von eluierbarem Thrombin, ist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er aus virussicheren Ausgangssubstanzen hergestellt ist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er in einer aseptischen Verpackung und in gebrauchsfertiger Form vorliegt.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Dicke von mindestens 1 mm, vorzugsweise zwischen 5 und 10 mm, aufweist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass er mehrschichtig aufgebaut ist, wobei mindestens eine Schicht blutstillende Eigenschaften aufweist.
Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass er ein spezifisches Gewicht zwischen 0,005 und 0,15 g/cm³, vorzugsweise 0,01 bis 0,09 g/cm³, am meisten bevorzugt 0,02 bis 0,05 g/cm³, aufweist.
Set zur Wundauflage, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Fibrinschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und eine Komponente, die einen Blutgerinnungsfaktor enthält, umfasst.
Set nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutgerinnungsfaktor Fibrinogen, Faktor XIII, Fibronektin, Thrombin oder eine Mischung dieser Faktoren ist.
Verfahren zur Herstellung eines Fibrinschwammes nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen eines Fibrin-Clots durch Mischen einer Fibrinogenlösung, die vorzugsweise Faktor XIII enthält, mit einer Thrombinlösung, die vorzugsweise Ca²⁺-Ionen enthält, und Inkubieren bei einer Temperatur, vorzugsweise bei 20 bis 37°C, für eine Zeit, die für die Bildung des Fibrin-Clots und gegebenenfalls für die Vernetzung des Fibrins ausreicht, vorzugsweise 10 min bis 24 h, b) Tieffrieren und Lyophilisieren des Fibrin-Clots, und c) Einstellen einer Restfeuchte auf mindestens 3%, vorzugsweise 3 bis 35%, insbesondere auf 10 bis 20%, d) gegebenenfalls Verpacken des Fibrinschwammes in einem geeigneten, insbesondere luft- und oder wasserdichten Behälter.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Plasmaproteine und/oder weitere Wirkstoffe und/oder Zusatzstoffe in der Fibrinogenlösung und/oder in der Thrombinlösung enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Fibrinogenlösung oder deren Mischung mit der Thrombinlösung vor Einsetzen der Gerinnung aufgeschäumt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Fibrin-Clot mit Wasser oder einer wässerigen Lösung gewaschen und/oder mit einer weiteren Lösung, die Thrombin und/oder weitere Plasmaproteine und/oder weitere Wirkstoffe enthält, inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Plasmaproteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fibronektin, Fibrinolyse-Inhibitor, Plasminogen und Albumin, die weiteren Wirkstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus nicht-plasmatischem bzw. synthetischem Fibrinolyse-Inhibitor, Antibiotikum und Wachstumshormon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusatz- oder Hilfsstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zucker, Zuckeralkohol, Polyol, Aminosäure, Tensid, Weichmacher und Feuchthaltemittel, und insbesondere Glycerin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen und/oder die Inkubation mit einer Lösung enthaltend Stoffe nach Anspruch 20 nach der Lyophilisierung erfolgt und anschließend nochmals tiefgefroren und lyophilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das nach dem Lyophilisieren erhaltene Produkt geschnitten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung aus sterilem Ausgangsmaterial unter Beibehaltung steriler Bedingungen bis zum Endprodukt erfolgt.
Verwendung eines Fibrinschwammes nach Anspruch 1 zur Blutstillung, Gewebeklebung, als Zellkultur-Träger und oder zur Wundheilung.
Set umfassend einen Fibrinschwamm nach Anspruch 1 in steriler Form zur Verwendung als biologischer Träger für Zellkulturen.