DE69736767T2

DE69736767T2 - Mikrotestplatten

Info

Publication number: DE69736767T2
Application number: DE69736767T
Authority: DE
Inventors: Richard Michael Liverton Ireland
Original assignee: Wallac Oy; Porvair PLC
Current assignee: Wallac Oy; Porvair PLC
Priority date: 1996-11-25
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2017-11-22
Also published as: EP0844025A2; EP0844025B1; EP0844025A3; JPH10221243A; ATE341397T1; GB2319836A; US6051191A; GB2319836B; GB9624436D0; DE69736767D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Multi-Probenbohrungsplatten, allgemein bezeichnet als Mikrotitrationsplatten oder Mikrotestplatten, oder Streifen, die in einem Trägerrahmen zusammen gesetzt werden können, um eine analoge Komponente herzustellen. Diese Mikrostestplatten werden üblicherweise verwendet, um eine große Anzahl von Proben in einem rechteckigen Feld von Bohrungen zu halten (24 Bohrungen (4 × 6) oder 96 Bohrungen (8 × 12) sind typische Beispiele), um unter Verwendung verschiedener Techniken wie Szintillationszählen, Luminometrie, Fluorimetrie und Kinetik analysiert zu werden. Diese Erfindung ist insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, mit Anwendungen befasst, die Mikrotestplatten in Analysetechniken verwenden, die von der Emission von Licht von der Probe abhängig sind, wie dies bei dem Szintillationszählen, der Fluorimetrie oder Luminometrie der Fall ist, oder von der Durchlässigkeit von Licht durch die Probe, wie dies bei der optischen Densitometrie auftritt.
Wenn Mikrotestplatten verwendet werden, um Proben zur Analyse unter Verwendung von Präparattechniken zu halten, die abhängig sind von der Transmission von Licht durch oder von den Proben, ist es wichtig, zu verhindern, dass Licht zwischen benachbarten Proben durchtritt, eine sogenannte „Licht-Kreuzkopplung" sowie dass Licht durch Transmission des Lichtes von den am Rand befindlichen Bohrungen des Feldes verloren geht, was zu sogenannten „Rand-Effekt"-Signalverlusten führt. Die „Licht-Kreuzkopplung" ist äußerst unerwünscht, da sie bedeutet, dass Photonen, die in einer bestimmten Probenbohrung entdeckt worden sind, möglicherweise nicht aus der Probe in dieser bestimmten Bohrung stammen. „Rand-Effekt" ist ähnlich unerwünscht wegen des Verlustes von Photonen von den am Rand befindlichen Probebohrungen, was zu inkonsistenten Resultaten von diesen Bohrungen führt.
Dieser Rand-Effekt kann in einem gewissen Ausmaß kompensiert werden, indem das Software-Paket der analytischen Instrumente entsprechende Einstellungen erfährt.
Es ist der Zweck aller Untersuchungstechniken, eine eindeutige Messung für jede Probe zu erhalten, die völlig repräsentativ für diese Probe ist. Wenn Komponenten mit mehrfachen Bohrungen verwendet werden, ist es deshalb erforderlich, sicher zu stellen, dass die oben erwähnte Kreuzkopplung und der Rand-Effekt reduziert oder sämtlich eliminiert sind.
Bei bestimmten Anwendungen ist es erforderlich, eine transparente Wand an dem Boden der Probenbohrung zu haben. Diese Typen von Mikrotestplatten können in einer Vielzahl von Instrumenten verwendet werden, die Photodetektoren benutzen, die entweder direkt oberhalb des normalerweise offenen Endes der Probenbohrung oder direkt unter der Probenbohrung positioniert sind oder mit Photodetektoren an beiden Positionen zur Koinsidenzmessung. Es ist in den beiden letzten Fällen offensichtlich erforderlich, dass der Boden der Bohrung transparent ist, um einen freien Durchgang von Photonen zuzulassen, die von der Probe emittiert werden.
Bei bestimmten Untersuchungen, die sich auf die Inkubation von biologischem Zellenmaterial innerhalb der Probenbohrungen beziehen, ist es auch wichtig, dass das Material, aus dem die Bohrungen hergestellt sind, für Zellenwachstum förderlich ist. Unter bestimmten Umständen ist es wiederum wünschenswert, dass der Boden der Bohrung transparent ist, um anhaftende Zellen innerhalb der Probenbohrung mikroskopisch betrachten zu können. Die gegenwärtig für beide Typen von Versuchen erhältlichen Mikrotestplatten bestehen üblicherweise aus einer unitären oberen Polymerplatte und einer unitären unteren Polymerplatte. Die zwei Platten sind durch Ultraschallschweißen oder ähnliche Methoden miteinander verbunden. Bei dieser Konstruktion bildet die obere Platte die Seitenwände der einzelnen Probenbohrungen, und die untere Platte bildet die Bodenwände dieser Bohrungen. Die obere Platte ist undurchlässig für Licht, entweder pigmentiert oder transparent, jedoch mit einer opaken Beschichtung wenigstens an den Seitenwänden versehen. Die untere Platte ist transparent für den ersten Typ von Versuchen, bei dem der Durchgang von Licht durch Hindurchsehen überwacht wird, und allgemein opak bei dem zweiten Typ, bei dem eine Emission von oben überwacht wird. In diesem zweiten Fall ist die untere Platte lichtundurchlässig gemacht, durch Pigmentierung oder eine opake Beschichtung.
Es sind auch Mikrotestplatten bekannt, die als ein einziges Formen mit opaken Seitenwänden und opaken Bodenwänden gemacht sind.
EP 5 71 661 im Namen von Packard ist ein Beispiel einer Mikrotestplatte, die „lichtundurchlässige Streifen" enthält, die nach unten in die untere Platte vorstehen, und die dazu vorgesehen sind, Licht zu stoppen, das von einer Bohrung zu einer anderen durchgeht.
US 5,039,860 im Namen von Wallac offenbart Probenbohrungen für Untersuchungen des Emissionstyps, die transparente Bodenwände haben, zur Benutzung in Verbindung mit einer oberen und einer unteren Photoverstärkeranordnung. Diese Probenbohrungen werden typischerweise durch Vakuumthermoformung (Tiefziehen) aus einer transparenten Polymerfolie hergestellt.
US P 5,048,957 verwendet eine Aluminiummatrix mit Durchgangslöchern mit ringförmigen Schultern darin, eine transparente Cuvette, die in jeder Bohrung angeordnet ist und an der Schulter anliegt, die ihre Position in der Durchgangsbohrung bestimmt. Die Cuvetten sind mit der Matrix nicht verbunden.
WO 94/26413 offenbart einen Behälter oder ein Feld von Behältern, wobei jeder Behälter eine Achse, eine offene Oberseite, Seitenwände und eine Basis hat, wobei die Basis eine Szintillationssubstanz enthält und für die Befestigung und/oder Wachstum von Zellen geeignet ist. Die Seitenwände werden als Hauptkörper des Gefäßes bezeichnet und können pigmentiert sein. Die Basis ist durch Verbinden an den Seitenwänden angebracht, wie durch Wärmeschweißen, Spritzgießen oder Ultraschallschweißen. Wenn diese Verbindung einen Fehler aufweist, kann eine Leckage aus dem Gefäß auftreten. Die Pigmentierung der Seitenwände soll angeblich die optische Kreuzkopplung eliminieren. Jedoch sind die transparenten Basisplatten nicht gegeneinander abgedeckt und Strahlung könnte von einer Basisplatte zu einer anderen übertreten.
GB 1 584 589 offenbart eine Platte mit mehreren Behältern, die einen Boden oder eine Matrix mit einer Vielzahl von Abteilungen hat, in denen einzelne Behälter herausnehmbar in einer aufrechten Position angeordnet sind. Der Boden kann aus Silikongummi oder Polymerschaum bestehen, und die Behälter aus Glas oder Polymermaterial.
Die Behälter sind mit dem Boden nicht verbunden.
US 5,496,502 offenbart einen klebenden Kunststoffszintillator, der an einem Tragmedium durch Temperatursteuerung oder Ablagerung von einer Lösung befestigt werden kann. Der Kunststoffszintillator kann zwischen Feststoff- und Flüssigkeitsphasen wechseln und verbleibt in beiden Phasen transparent.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Mikrotestplatte anzugeben, die Behältereinsätze mit einer integralen klaren Basis enthält, die es zulässt, dass die Probe beobachtet und/oder dass Lichtemissionen von der Probe gemessen werden, wobei die Behälter in eine opake Matrix auf solche Weise eingelagert sind, dass eine Kreuzkopplung zwischen benachbarten Behältern reduziert ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Probenbehältern anzugeben, einzeln oder als ein Teil der Mikrotestplatte, wobei das Verfahren sowohl schnell als auch effizient sein soll.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der detaillierten Beschreibung und mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die oben erwähnten Aufgaben durch einen Probenbehälter gelöst, der in der beschriebenen Ausführungsform einen Teil einer Mikrotestplatte bildet und entlang seiner Seiten von einer lichtundurchlässigen Matrix als Teil einer unitären Komponente umgeben ist. In der beschriebenen Ausführungsform bildet eine opake Matrix die Außenstruktur der Mikrotestplatte. Diese opake Matrix enthält ein rechteckiges Feld von vorzugsweise zylindrischen Löchern, die um die zentralen Achsen der Mikrotestplatte angeordnet sind. Ein zylindrischer Querschnitt ist bei den Löchern sehr bevorzugt, jedoch können auch andere Querschnitte verwendet werden. Licht ist nicht in der Lage, durch die Wände der Löcher hindurch zu gehen. Die Probenbehälter selbst sind innerhalb jeder der oben erwähnten Löcher angeordnet und können aus einem Material hergestellt sein, das für biologisches Zellwachstum förderlich ist. Die Basis jedes Probenbehälters ist transparent, um den Durchgang von Licht zuzulassen, und ist bevorzugt vollständig umhüllt von benachbarten Behältern durch Vorsprünge an der Oberseite und der Unterseite der Löcher, die einen Teil der opaken Matrix bilden.
Die Löcher verlaufen senkrecht durch die Ebene der Matrix. Dies kann durch eine kompakte opake Matrix erfolgen oder durch ein Feld von Röhrchen, deren Inneres diese Löcher bildet, wobei die Röhrchen miteinander verbunden sind und in dem gewünschten feststehenden Feld durch verbindende Gewebe von Material gehalten sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Mikrotestplatte mit einem Feld von abgesonderten, getrennten Probenbehältern vorgesehen, bei dem jeder Probenbehälter einen Behälter aus einer ersten Polymerzusammensetzung enthält und der Behälter Seitenwände und eine Basis hat und in einer Matrix aus einer zweiten Polymerzusammensetzung angeordnet ist, die lichtundurchlässig ist, wobei jeder Behälter ein erstes und ein zweites Ende hat, die einander gegenüberliegend angeordnet sind und die Matrix die Seitenwände jedes der Behälter umhüllt und sich über das erste und das zweite Ende der Seitenwände jedes Behälters hinaus erstreckt, wobei ferner jeder Behälter thermisch mit der Matrix der zweiten Polymerzusammensetzung verbunden ist, um so eine integrale Struktur zu bilden, gekennzeichnet dadurch, dass die Seitenwände eine Dicke von wenigstens 0,10 mm haben.
In einer Ausführungsform erstreckt sich die Matrix der zweiten Polymerzusammensetzung über dem gesamten Bereich der Basis jedes Behälters.
Die erste Polymerzusammensetzung kann ein Polymer enthalten, das verschieden von der zweiten Polymerzusammensetzung ist. Bevorzugt ist die erste Polymerzusammensetzung nicht opak, und am meisten bevorzugt ist sie transparent.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Matrix aus pigmentiertem Polystyrol, während die Behälter aus unpigmentiertem Polystyrol hergestellt werden, das somit lichtdurchlässig oder transparent ist, und eine Szintillationssubstanz enthalten kann.
Die Lichtundurchlässigkeit der zweiten Polymerzusammensetzung ist derart, dass die Transmission der Strahlung, die zu messen ist, beispielsweise Licht oder andere Strahlung, von einem Behälter zu einem anderen verhindert ist. Die Lichtundurchlässigkeit kann durch Einschluss von Pigment in der zweiten Polymerzusammensetzung bewerkstelligt werden.
Die erste Polymerzusammensetzung kann Additive wie Szintillationssubstanzen enthalten, deren Wirksamkeit durch das Vorhandensein von Pigmenten in der Zusammensetzung verringert wird. Auf ähnliche Weise kann die erste Polymerzusammensetzung aus Polymeren bestehen, die das Anhaften und Wachsen von Zellen fördern, aber deren Wirksamkeit als ein Substrat für Zellenwachstum durch das Vorhandensein von Pigmenten verringert wird.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Mikrotestplatte mit einem Feld von Probenbehältern, die offene Oberseiten und transparente Basis und Seitenwände haben, in einer feststehenden Relation zueinander, wobei die Probenbehälter in einer Matrix aus opakem Material gehalten und thermisch damit verbunden sind, und wobei sich die Matrix wenigstens zu der Basis jedes Probenbehälters und wenigstens zu der Öffnung jedes Probenbehälters erstreckt und die Behälter und die Matrix eine integrale Struktur bilden.
Da die Struktur integral ist, ist der Herstellungsprozess sehr viel schneller und es besteht nicht die Gefahr, dass die Zellen aus der Matrix herausfallen oder auf falsche Weise während der Herstellung eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Tiefe des Probenbehälters größer ist als seine maximale Breite. Die Matrix erstreckt sich um eine Strecke Y über die Basis des Probenbehälters, und um eine Strecke X über die obere Öffnung des Probenbehälters hinaus. X und Y sind vorzugsweise wenigstens 0,10 mm, jedoch bevorzugt nicht größer als 0,50 mm, am meisten bevorzugt nicht größer als 0,25 mm. Y ist vorzugsweise größer als X oder gleich groß. Bevorzugt ist der Behälter kreisförmig, so dass seine maximale Breite D sein Durchmesser ist. D kann 7,5 mm betragen. Das Verhältnis von Y : D und X : D liegt bevorzugt in dem Bereich von 1 : 10 bis 1 : 100 oder 1 : 30 bis 1 : 100, noch weiter bevorzugt liegt das Verhältnis von Y : D und X : D für eine 96 Behältermikrotestplatte in dem Bereich von 1 : 50 bis 1 : 100, beispielsweise 1 60 zu 1 : 90 oder 1 : 70 zu 1 : 80, beispielsweise etwas 1 : 75.
Bei 384 Behälterplatten ist D kleiner und Y : X liegt vorzugsweise in dem Bereich 1 : 1 bis 2,5 : 1 und X : D und Y : D liegen in dem Bereich von 1 : 10 bis 1 25.
Wahlweise ist die Tiefe des transparenten Probenbehälters kleiner als seine maximale Breite, und die opake Matrix bildet den oberen Teil der Seitenwände der Probenbehälter, wobei die Tiefe des kompletten Probenbehälters größer ist als seine maximale Breite.
Wahlweise enthält das Polymer der Probenbehälter ein funktionales Additiv wie eine Szintillationssubstanz. Bevorzugt hat das Polymer der Probenbehälter eine funktionale Fähigkeit, die für die Untersuchung, die an der Mikrotestplatte ausgeführt wird, relevant ist, wie eine Proteinbindungsfähigkeit.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Mikrotestplatte gemäß der vorliegenden Erfindung.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung enthält ein Verfahren zur Herstellung einer Mikrotestplatte, wie sie oben beschrieben ist, das Formen eines Feldes gesonderter, getrennter Behälter einer ersten Polymerzusammensetzung auf einer Unterlage und dann das Formen einer Matrix einer zweiten Polymerzusammensetzung um die Behälter herum, so dass die Polymerzusammensetzungen thermisch miteinander verbunden sind, und das Trennen der integralen Struktur von der Unterlage, wodurch die Bohrungen offene Enden haben, die durch eine Fläche der Struktur zum Vorschein kommen und ihre anderen Enden geschlossen sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist bei einem Verfahren zur Herstellung einer Mikrotestplatte vorgesehen, dass ein gemeinsamer Kern (oder eine Vielzahl von Kernen die Kernbündel genannt wird) der die innere Form jedes einzelnen Behälters (oder einer Vielzahl von Behältern) bildet, in eine primäre Kavität oder Form (oder Formen) eingesetzt wird, der die äußere Form jedes einzelnen Behälters bildet, dass die Temperatur der primären Form oder der primären Formen in dem Bereich von 10 bis 60°C liegt, dass eine erste geschmolzene Polymerzusammensetzung in die primäre Form oder die primären Formen bei einem Druck von 1000 bis 1500 bar injiziert wird, beispielsweise über 5 bis 10 Sekunden, dass die Temperatur der ersten geschmolzenen Polymerzusammensetzung in dem Bereich 180 bis 260°C liegt, dass die injizierte erste Polymerzusammensetzung abkühlen darf, beispielsweise für weitere 10 bis 20 Sekunden, so dass die erste Polymerzusammensetzung um den gemeinsamen Kern erhärtet, aber noch über der Umgebungstemperatur ist, dass die primäre Form oder Formen geöffnet wird, dass der gemeinsame Kern oder das Kernbündel mit den einzelnen Behältern, die darauf gehalten werden, aus der primären Form oder Formen entfernt wird, dass der gemeinsame Kern oder das Kernbündel und die einzelnen. Behälter in einer zweiten Kavität oder Form angeordnet wird, dass die Fläche des gemeinsamen Kerns oder Kernbündels und die einzelnen Behälter die innere Form der Matrix der zweiten Polymerzusammensetzung bilden, dass die zweite Form die äußere Form der Matrix bildet, dass die Temperatur der zweiten Form in dem Bereich von 10 bis 60°C liegt, dass die zweite geschmolzene Polymerzusammensetzung bei einem Druck von 1000 bis 1500 bar, beispielsweise über 5 bis 10 Sekunden, in die zweite Form injiziert wird, so dass sie thermisch mit den Behältern auf dem zweiten Kern oder Kernbündel verbunden wird, wobei die zweite geschmolzene Polymerzusammensetzung bei einer Temperatur von 160 bis 260°C ist, dass die injizierte zweite Polymerzusammensetzung abkühlen darf, beispielsweise für weitere 10 bis 20 Sekunden, so dass die zweite Polymerzusammensetzung um die einzelnen Behälter herum erhärtet und eine thermische Verbindung damit bildet, dass die zweite Form geöffnet wird, und dass die Mikrotestplatte aus dem gemeinsamen Kern oder Kernbündel ausgestoßen wird.
Bevorzugt ist die erste Polymerzusammensetzung ein transparentes Polystyrol mit einem Schmelzfließindex in dem Bereich von 1,5 bis 20 und einem Schmelzpunkt von 185 bis 210°C, und die zweite Polymerzusammensetzung enthält ein Polystyrol eines Schmelzfließindex in dem Bereich 1,5 bis 20 und einem Schmelzpunkt von 185 bis 210°C und ein Material, das die zweite Polymerzusammensetzung lichtundurchlässig macht, beispielsweise 5 bis 15%, wenn das Licht undurchlässig machende Material weiß ist, beispielsweise TiO₂, und 0,2 oder 0,5 bis 5%, wenn das Licht undurchlässig machende Material schwarz ist, beispielsweise Ruß, wobei die zweite Polymerzusammensetzung einen Schmelzpunkt von 185 bis 210°C hat.
In einer Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die zweite Polymerzusammensetzung sich nicht über die geschlossenen Enden der Behälter erstreckt.
Bei einer anderen Ausführungsform erstreckt sich die zweite Polymerzusammensetzung über den gesamten Bereich der Basis jedes Behälters. Somit ist bei dieser Ausführungsform jeder Behälter vollständig in die Matrix eingeschlossen, wobei nur sein oberes Ende zugänglich bleibt.
Die Erfindung kann auf verschiedene Arten in die Praxis übertragen werden, und eine spezielle Ausführungsform wird beschrieben, um die Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen darzustellen, in denen:
1 eine teilweise geschnittene perspektivische Ansicht einer Mikrotestplatte gemäß der vorliegenden Erfindung ist,
2 eine Aufsicht auf die Mikrotestplatte der 1 ist,
3 eine Unteransicht der Mikrotestplatte der 1 ist,
4 ein Teilquerschnitt entlang der Linie III-III der 1 ist und die Struktur der Mikrotestplatte gemäß 1 zeigt,
5 ein perspektivischer Schnitt eines typischen Probenbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung ist, mit einem transparenten Behälterboden,
6 ein perspektivischer Schnitt eines typischen Probenbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung ist, mit einem Licht undurchlässigen Behälteboden (die Schnittschraffierung in den 5 und 6 ist im Vergleich zu den 4, 7 und 8 vereinfacht),
7 ein Bildausschnitt einer Querschnittsdarstellung des abschließenden Gießvorgangs bei der Herstellung einer Mikrotestplatte gemäß 1 in einem vergrößerten Maßstab ist und
8 eine Darstellung ähnlich wie 7 ist, die einen früheren Schritt bei dem Gießprozess zeigt.
Es wird nun auf die Zeichnungen bezug genommen. 1 zeigt eine Mikrotestplatte gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung. Die dargestellte Mikrotestplatte enthält eine obere Bahn 1, die eine Oberfläche 1a bildet, und Seitenwände 2 (die einen unteren Rand 2a haben), die die Basisstruktur bilden. Bei dem beschriebenen Beispiel sind die Löcher durch ein Feld von opaken zylindrischen Röhrchen 5 gebildet, die offene Enden haben, die von der unteren Fläche der Oberseite 1a herab verlaufen. Diese opaken zylindrischen Röhrchen 5 sind in einem „Industriestandard" 8 × 12 rechtwinkligen Feld auf 9 mm Abstandmittelpunkten um die zentralen Achsen der Mikrotestplatte und senkrecht zu dieser angeordnet. Die opaken zylindrischen Röhrchen 5 sind so angeordnet, dass das obere Ende 6 des Röhrchens 5 so positioniert ist, dass es oberhalb der Ebene der oberen Fläche 1a der oberen Bahn 1 der beschriebenen Mikroplatte liegt, wodurch 96 erhabene Wülste 8 gebildet werden, wie in den 4 und 5 dargestellt ist. Die Länge der opaken zylindrischen Röhrchen 5 ist derart, dass sich das untere Ende 7 der Röhrchen 5 innerhalb der Gesamthöhe der dargestellten Mikrotestplatte befindet. Es ist wünschenswert, jedoch nicht wesentlich, dass ein Abstand Z zwischen der Ebene, in der die unteren Enden 7 der opaken zylindrischen Röhrchen 5 liegen, und derjenigen verbleibt, die den unteren Rand 2a der Umfangswände 2 der dargestellten Mikrotestplatte enthält, wie in 4 gezeigt ist. Die Komponenten 1, 2 und 5 bilden zusammen eine opake Matrix 21. Innerhalb jedes der oben erwähnten opaken zylindrischen Röhrchen 5 ist ein Probenbehälter 10 positioniert (siehe 4). Dieser Probenbehälter ist in der Matrix der dargestellten Mikrotestplatte als ein Ergebnis des einheitlichen Herstellungsprozesses, der angewendet wird, befestigt.
In 2 ist eine Aufsicht auf die Mikrotestplatte gemäß 1 gezeigt. Zusätzlich zu den oben erwähnten Punkten verwendet diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung „Industriestandard"-Merkmale, die von dem Endverbraucher benutzt werden. Dies beinhaltet abgeschrägte Enden 3 bei dem oberen Teil der Seitenwände 2, um die Verwendung von kommerziell erhältlichen Deckeln und den Einschluss von alphanumerischen Behälteridentifikationen 4 zu ermöglichen. Diese zwei Merkmale 3 und 4 bilden selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung, da sie nicht neu sind und weil ihr Einschluss in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht möglich sein kann.
In 3 ist eine Unteransicht der Mikrotestplatte gemäß 1 dargestellt. Diese Zeichnung identifiziert die Beziehung zwischen den opaken zylindrischen Röhrchen 5 und den Probenbehältern 10 mit besonderem Bezug zu dem transparenten Behälterboden oder Basis 11 jedes Probenbehälters und zeigt die Seitenwände 16 der Probenbehälter. Diese Beziehung ist in dem Teilquerschnitt der dargestellten Mikroplatte in 4 weiter dargestellt.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Punkten identifiziert 4 die bevorzugte Beziehung zwischen dem Probenbehälter 10 und dem opaken zylindrischen Röhrchen 5. Es ist bevorzugt, dass der obere Rand 9 der erhabenen Wülste 8 an dem oberen Ende eines opaken zylindrischen Röhrchens 5 in einer Ebene liegt, die signifikant höher ist als die Ebene 12, die durch das Ende 13 des eingeschlossenen Probenbehälters 10 gebildet wird (es verbleibt ein Abstand X). Die Innenfläche des Behälters kann abgeschrägt sein, wie in 4 gezeigt, oder quer verlaufend wie in 5 dargestellt. Die Vorteile einer Schräge bestehen darin, dass Formwerkzeuge für die Form leichter herstellbar sind. Auf ähnliche Weise befindet sich das untere Ende 7 des opaken zylindrischen Röhrchens 5 in einer Ebene, die signifikant niedriger ist, als die untere Fläche 14 des Bodens 11 des Probenbehälters 10 (es verbleibt ein Abstand Y).
Wie oben erwähnt, ist außerdem bevorzugt, dass ein signifikanter Abstand Z zwischen dem unteren Ende 7 der opaken zylindrischen Röhrchen 5 und der Ebene besteht, die durch den unteren Rand 2a der Seitenwände 2 der Mikrotestplatte gebildet ist, so dass die Platte in das analytische Gerät eingesetzt werden kann.
Der Durchmesser der Basis des Behälters 10 ist D. Für eine 96 Behälterplatte gibt die folgende Tabelle 1 bevorzugte, jedoch nicht begrenzende Kombinationen von Werten von Abmessungen in mm für X, Y und D, und die Verhältnisse X : D, Y : D und Y : X. Tabelle 1
Beispiel 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform.
Wenn eine Platte mit mehr Behältern, beispielsweise 384, hergestellt wird, ist D kleiner.
Für eine 384 Behälterplatte gibt die folgende Tabelle 2 bevorzugte, jedoch nicht beschränkende Kombinationen von Werten der Abmessungen in mm für X, Y und D und die Verhältnisse X : D, Y : D und Y : X an. Tabelle 2
In 5 ist ein typischer einzelner Probenbehälter 10 gezeigt, der die Prinzipien der vorliegenden Erfindung widerspiegelt. Mit Bezug auf 6 wird eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, bei der das transparente Probengehäuse 10 in eine umgebende opake Matrix 21 eingekapselt ist, wobei sich die unteren Ränder 7 des opaken zylindrischen Röhrchens 5 horizontal erstrecken, so dass der Boden 11 des Probenbehälters 10 vollständig durch den Bereich 20 eingeschlossen ist.
Mit Bezug auf die obigen Beschreibungen löst die vorliegende Erfindung die Probleme, die mit der sogenannten „Kreuzkopplung" und dem „Randeffekt" verbunden sind. Um Lichtemissionen auf den Behälter, von dem sie stammen, zu beschränken, d.h. um die oben erwähnte Kreuzkopplung und den Randeffekt zu verhindern, wird die Matrix (gebildet durch 1, 2 und 5) der in 1 dargestellten Mikrotestplatte aus einem opaken Polymermaterial hergestellt, das den Durchgang von Licht nicht zulässt.
Es ist normale Praxis bei Produkten, die hergestellt werden, um in Versuchen benutzt zu werden, die die Erfassung von sehr kleinen Lichtmengen erfordern, beispielsweise beim Flüssigkeitsszintillationszählen, dass eine Pigmentierung verwendet wird, um das Polymermaterial lichtundurchlässig zu machen, so dass es weiß oder leicht farbig ist. Diese Auswahl wird so getroffen, um eine hohe Reflektion von den Seitenwänden zu haben, um eine hohe Effektivität beim Zählen zu erreichen. Es ist die gegenwärtig bevorzugte Praxis bei diesen Produkten, weiß zu sein, wegen der Verfügbarkeit von eminent geeigneten Pigmentierungssystemen. Die verwendete Pigmentierung ist allgemein Titandioxid, obwohl andere weiße Pigmente in gleicher Weise anwendbar sind. Das Pigment wird dem Polymer in Mengen von 2 bis 15 Gew.-% hinzugefügt. Ein höherer Prozentsatz führt nicht zu signifikantem Vorteil bezüglich einer erhöhten Lichtundurchlässigkeit und macht das Polymer zu viskos für das Spitzgießen.
Auf ähnliche Weise ist es bei einigen Typen von Lumineszenzuntersuchungen und Fluoreszenzuntersuchungen normale Praxis bei der Matrix, die die Seitenwände der Gehäuse bilden, aus einem opaken Polymermaterial hergestellt zu werden, das durch Zugabe von Ruß, typischerweise in Mengen 0,2 bis 5%, bevorzugt 0,5 bis 5 Gew.-%, schwarz gemacht ist. Pigmente in anderen Farben als weiß und schwarz sowie feine Metallpulver können auch als Licht undurchlässig machende Materialien verwendet werden.
Das obige Verfahren der Herstellung von Licht undurchlässigen Teilen von polymerischen Mikrotestplatten ist gegenwärtige akzeptierte kommerzielle Praxis, sei es für opake Mikrotitrationsplatten oder für die Behältermatrix von Mikrotestplatten mit transparenten Böden für ihre Behälter, wobei verschiedene Typen kommerziell erhältlich sind. Mit Bezug auf diesen letzteren Typ von Platten ist es gegenwärtig Praxis, die transparenten Böden als eine getrennte Komponente herzustellen, groß genug, um die Unterseite aller 69 Behälter zu überdecken. Diese Komponente wird zusammen mit der opaken Behältermatrix zusammengesetzt, unter eigener oder kommerziell erhältlicher Technologie, um das endgültige Produkt herzustellen.
Dieses Verfahren des Zusammensetzens hat mehrere Schwachpunkte:

1. Die meisten gegenwärtigen Techniken des Zusammenbaus, die für Massenproduktion verwendet werden, erfordern, dass beide Komponenten aus allgemein demselben Polymermaterial hergestellt sind.
2. Die Wahl der Materialien, die verwendet werden können, ist auf diejenigen begrenzt, die kosteneffektiv bei Methoden der Massenproduktion verwendbar sind, sei es dass sie technisch korrekt für das Produkt sind oder fördernd für eine biologische Zellkultur (in dem Fall von Produkten, die in Versuchen verwendet werden, die diese Funktion erfordern).
3. Die Materialien müssen allgemein widerstandsfähig gegenüber der Vielzahl von organischen Lösungsmittel sein, mit denen sie in Kontakt geraten können.
4. Wegen der kontinuierlichen Natur der transparenten Komponente (des Teils, der der Boden des Probenbehälters wird) ist es nahezu unmöglich, vollständig eine Lichtkreuzkopplung zwischen benachbarten Behältern zu eliminieren, obwohl alle Hersteller große Anstrengungen unternehmen, um diese Wirkungen zu minimieren.
5. Auf ähnliche Weise gibt es Probleme der Interface-Gestaltung (zwischen der opaken Matrix und der transparenten Basis) und der Qualität und Konsistenz des Zusammenbaus bei dem Versuch eine zuverlässige Verbindung herzustellen, die entweder Probenverluste innerhalb des Interface oder Leckage (Flüssigkeitskreuzkopplung) zwischen Proben in benachbarten Behältern eliminieren.

Die vorliegende Erfindung hilft dabei, diese Nachteile zu überwinden. Beispielsweise kann eine Ausführungsform der Erfindung, die in 1 dargestellte Mikrotestplatte, hergestellt werden unter Verwendung der besten und am meisten ökonomisch verfügbaren Materialien in Abhängigkeit von Kriterien des Endbenutzers sowohl für die Probenbehälter 10 und die opake Matrix 21 (mit der Oberseite 1 der Mikroplatte, den Seitenwänden 2 und den zylindrischen Röhrchen 5). Diese Materialien können polymerisch identisch oder ähnlich sein oder aber nicht, wiederum in Abhängigkeit von den Kriterien der Endbenutzer und von dem Verfahren der Herstellung. Bei der beschriebenen Ausführungsform sind die Probenbehälter 10 in einem rechteckigen Feld innerhalb der opaken Matrix 21 angeordnet, wodurch sie vollständig von benachbarten Behältern isoliert sind.
Eine bevorzugte Methode der Herstellung, obwohl keineswegs das einzige Verfahren zum Erhalten einer solchen Struktur besteht darin, aufeinander folgende Spritzgusstechniken anzuwenden, wodurch die Probenbehälter 10 während des Gießzyklus in der Matrix angeordnet werden. Andere Herstellungsverfahren schließen nicht-aufeinanderfolgendes Einsetzgießen ein, wobei zuvor geformte Probenbehälter 10 als Einsätze innerhalb der Gießform verwendet werden, mit der die opake Matrix 21 hergestellt wird, sowie das Nach-Gieß-Einsetzen der Probenbehälter 10 in die opake Matrix 21. Die angewendeten Techniken müssen jedoch eine Zusammensetzung mit der anderen anwenden, wenn eine oder beide ausreichend heiß ist, bzw. sind, damit eine thermische Verbindung und somit eine integrale Struktur entsteht.
Ein Beispiel des aufeinander folgenden Spritzgussprozesses ist ein Zwei-Schuss-Gießen unter Verwendung einer Multi-Trommelmaschine mit einer Indexform. Ein typischer Gießzyklus würde folgendermaßen sein:

1. Ein gemeinsamer Kern, der die innere Form des ersten Schusses bildet, hier die Innenseite der Behälter 10, wird in die primäre Kavität der Form eingesetzt.
2. Geschmolzenes Polymer zum Ausbilden der transparenten Probenbehälter wird in die primäre Kavität injiziert, die hier die Außenflächen der Behälter 10 begrenzt.
3. Die Form wird auf eine ausreichend niedrige Temperatur gekühlt, damit das Polymer um den gemeinsamen Kern erhärtet, jedoch ist das Produkt noch warm.
4. Die Form wird geöffnet und der gemeinsame Kern und die erste Polymerschicht, die darauf gehalten ist, werden entfernt. Jegliches überschüssiges Polymer wird aus der primären Kavität zum Recycling und/oder Verwerfen entfernt.
5. Die Form dreht sich und präsentiert den gemeinsamen Kern und das primäre Gießen einer zweiten Kavität, die die Form der Matrix 21 hat.
6. In die zweite Kavität wird geschmolzenes Polymer injiziert, um die opake Matrix um die transparenten Probengehäuse zu bilden.
7. Gleichzeitig mit Schritt 6 wird ein neuer gemeinsamer Kern in die primäre Kavität wie bei Schritt 1 oben eingesetzt, und das Verfahren beginnt von Neuem.
8. Das Polymer in der zweiten Kavität kühlt auf eine ausreichende Temperatur ab, damit die Komponente erhärtet.
9. Die zweite Kavität wird geöffnet, und die fertige Komponente wird ausgestoßen.

Das Injizieren des geschmolzenen Polymers in dem zweiten Schritt auf ein noch warmes Produkt des ersten Schritts gewährleistet eine exzellente Adhäsion zwischen den Wänden des Probengehäuses und der opaken Matrix.
Beispiel
Mit Bezug auf die 7 und 8 wird nun ein spezielles Beispiel der Herstellung einer 96 Gehäuse Mikrotestplatte gegeben. 7 zeigt in einem vergrößerten Maßstab die Bahn 1, Seitenwände 2 und zwei Röhrchen 5 der Matrix mit zwei darin angeordneten Behältern 10. Außerdem ist ein Teil eines gemeinsamen Kerns 30 gezeigt, der durch ein rechtwinkliges Feld von 96 Kernen gebildet ist, die ein erstes Kernbündel bilden, auf dem die Behälter 10 angeordnet sind. 7 zeigt auch eine zweite Formkavität 35 zwischen den Formen 46 und 47 mit Injektionsöffnungen 36 und einem Eingusskanalsystem 37. Die Formkomponente 37 ist so ausgebildet, dass sie öffnen kann, so dass der Einguss 36 von dem Hohlraum 35 getrennt werden kann, und der Eingusskanal 37 kann ebenfalls von dem Rest der Form 47 getrennt werden. Dies ermöglicht es, dass Abfallpolymer in dem Eingusskanal 37 und der Eingussstelle 36 an dem Ende jedes Gießzyklus vollständig ausgestoßen werden kann. Die Form wird dann geschlossen, wie 7 zeigt.
8 zeigt in demselben Maßstab wie 7 den gemeinsamen Kern 30 und die primäre Kavität 40 zwischen den Formen 45 und 46 mit ihren Eingussstellen 41 und einem Eingusskanalsystem 42. Die Behälter 10 sind in der Kavität 40 zwischen dem Kern 30 und der Form 45 angeordnet. Die Formkomponente 45 ist ähnlich aufgebaut, wie für die Form 47 beschrieben, und ermöglicht demnach das vollständige Ausstoßen von überschüssigem Polymermaterial in den Eingussstellen 41 und dem Eingusskanal 42.
Der Gießprozess wird auf einer Engel 80 t Mikroprozessor gesteuerten hydraulischen Spritzgussmaschine mit Multicolor oder Multimaterial Fähigkeit ausgeführt, die durch drei unabhängig gesteuerte Injektionszylinder gegeben ist.
Die Form wird in der Maschine unter Verwendung einer Indexformhalterung befestigt. Die Formtemperatur wird veränderlich unter Verwendung von Standardwassersystemen mit geschlossenem Kreislauf gesteuert. In der Praxis werden die festen Bauteile der Form (45 und 47), die zusammen mit der Form 46 die primäre und die sekundäre Kavität (40 und 35) begrenzen, bei einer Temperatur von 40°C gehalten. Das bewegliche Teil 46 der Form wird bei einer Temperatur von 30°C gehalten, und jedes primäre Kernbündel 30, das innerhalb des beweglichen Teils der Form 46 befestigt ist, wird auf 20°C gekühlt.
Das Gießverfahren verläuft folgendermaßen. Die erste Polymerzusammensetzung, bei der es sich um transparentes Polystyrol mit einem Schmelzfließindex von 12 (gemessen durch das Verfahren von ISO/IEC 1133) und einem Schmelzpunkt von 190°C handelt, wird auf 220°C erwärmt und bei einem Druck von 1.200 bar 2 Sekunden lang in die Kavität 40 zwischen dem primären Kern 30 und dem Formteil 45 injiziert. Der Druck wird auf 500 bar reduziert und für weitere 8 Sekunden gehalten. Die gegossenen Teile dürfen dann über weitere 10 Sekunden abkühlen. Die Behälter sind erstarrt, jedoch noch warm. Die Form 45 wird geöffnet wie oben beschrieben ist, und das Abfallpolymermaterial wird aus den Eingusstrichtern 41 und dem Eingusskanal 42 ausgestoßen. Das primäre Kernbündel 30 wird in seine nächste Position getaktet, wie in 7 gezeigt ist, gegenüber dem Formteil 47, wobei die Teile 46 und 47 zwischen sich die Formkavität 35 begrenzen. Ein neuer Satz von Kernen kann dann dem Formteil 45 präsentiert werden, wie in 8 gezeigt ist, so dass der erste Teil des Gießzyklus in einem Formfeld ausgeführt werden kann, während der zweite Teil des Gießzyklus in einem anderen Formfeld ausgeführt wird, wodurch das Verfahren sich in der Reihenfolge fortsetzt.
Mit Bezug auf 7 werden die Formteile 46 und 47 zusammengebracht, so dass eine geschlossene Kavität zwischen ihnen begrenzt ist und das primäre Kernbündel 30 mit den darauf durch das oben mit 8 beschriebene Verfahren geformten Behältern wird nun in die zweite Kavität 35 eingesetzt. Die zweite Polymerzusammensetzung besteht aus demselben transparenten Polystyrol, das oben beschrieben ist, und einen Schmelzfließindex von 12 und einen Schmelzpunkt von 190°C hat und zuvor mit 12 Gew.-% Titandioxid vermischt ist, das die Zusammensetzung opak macht. Die zweite Polymerzusammensetzung wird auf eine Schmelztemperatur von 240°C erwärmt und dann bei einem Druck von 1.250 bar 2 Sekunden lang in die Kavität 35 zwischen die Formteile 46 und 47 injiziert. Der Druck wird auf 800 bar reduziert und für weitere 8 Sekunden gehalten. Die geformten Teile dürfen dann über weitere 10 Sekunden abkühlen. Das Formteil 47 wird dann geöffnet, und das Abfallpolymermaterial in dem Eingusstrichter 46 und dem Eingusskanal 37 wird ausgestoßen, und die fertige Mikrotestplatte wird aus der Form ausgestoßen.
Der Zyklus wird mit gleichzeitiger Ausführung der primären und sekundären Schritte wiederholt und ermöglicht ein vollständig automatisiertes aufeinanderfolgendes Gießen. Bei diesem Beispiel ist die Abmessung D 7,5 mm und die Abmessungen X und Y sind 0,15 mm. Das Produkt, das als Produkt E1 bezeichnet wird, hat niedrige Lichtkreuzkopplungswerte zwischen benachbarten Zellen und eine verbesserte Zelleffektivität.
E1 wurde verglichen mit zwei kommerziell erhältlichen Produkten C1 und C2 im Hinblick auf Kreuzkopplungs- und Zelleffektivitätswerte; die Resultate sind weiter unten in Tabelle 1 angegeben.
C1 ist ein Produkt, das in Übereinstimmung mit USP 0539860 hergestellt ist. Es wird in Europa durch Wallac Oy als „WALLAC 1450-401 Mikrotestplatte" vertrieben. Es besteht aus einer flexiblen PET-Platte, die aus Behältern besteht, die von einer integralen flachen Bahn herabhängen. Schwarze Linien sind auf der Bahn gedruckt, um „Licht leiten" oder die Übertragung von Behälter zu Behälter durch die Bahn zu reduzieren. Der Durchgang von den Seitenwänden des einen Behälters zu benachbarten Behältern wird blockiert, indem die Behälter in eine mit Öffnungen versehene opake Platte eingenistet sind, die ein opakes Rohr um jeden Behälter bildet. Die PET-Platte ist flexibel und kann in automatischen Analysemaschinen nicht vollständig verwendet werden.
C2 ist ein Produkt, das in Europa von Wallac Oy als „WALLAC 1450-511 oder 513 Mikrotestplatte" vertrieben wird – die zwei Platten sind mit Ausnahme davon identisch, dass 513 in einer vorsterilisierten Form vertrieben wird.
C2 ist aus einer oberen weißen opaken 96 Behälterplatte 50 (nicht dargestellt) gemacht, die die Seitenwände 51 (nicht dargestellt) der Behälter 49 (nicht dargestellt) der Platte bildet und die dieselbe Zusammensetzung wie die Matrix hat, die oben für E1 beschrieben ist, d.h. Polystyrol, das 12 Gew.-% Titandioxid enthält. Nuten 53 (nicht dargestellt) sind in der Unterseite 52 (nicht dargestellt) zwischen jedem Behälter ausgebildet. Die Basis der Behälter ist durch eine transparente Polystyrolplatte 55 (nicht dargestellt) aus derselben Zusammensetzung wie die Behälter 10 von E1 ausgebildet. Diese Platte hat dreieckige Rippen 57 (nicht dargestellt), die sich nach oben erstrecken und so positioniert und dimensioniert sind, dass sie in die Nuten 53 passen, wobei ihre Spitzen 59 (nicht dargestellt) die Innenfläche 58 (nicht dargestellt) jeder Nut 53 berühren. Die oberen und unteren Platten sind aneinander befestigt, indem die Rippen 57 in den Nuten 53 positioniert werden und Ultraschallschweißenergie aufgebracht wird, wodurch die Spitzen 59 als Energieleiter wirken und an den Flächen 58 angeschweißt werden.
Die untere Fläche 40 (nicht dargestellt) der unteren Platte ist von einer Licht absorbierenden Rußschicht überdeckt, die durch Heißfoliendrucken eines Films aufgebracht wird, der mit Ruß pigmentiert ist. Der Film überdeckt die gesamte untere Fläche 60, jedoch nicht die Enden der Gehäuse 49.
Kreuzkopplung wird für den zentralen Behälter eines 3 × 3 quadratischen Feldes von Behältern für die Seitenbehälter gemessen, die am nächsten bei dem zentralen Behälter liegen (sogenannte „gerade Kreuzkopplungsmessung") und für die zwei Eckbehälter, die weiter von dem zentralen Behälter sind (sogenannte „diagonale Kreuzkopplungsmessung").
Der Zählwirkungsgrad wird ebenfalls gemessen. Er ist das Verhältnis des tatsächlichen Zerfalls einer bekannten Probe pro Minute (dpm) (d.h. die tatsächliche Aktivität einer bekannten Probe) zu der gemessenen Aktivität der Probe in der Vorrichtung beim Test (d.h. gemessene Zählungen pro Minute (cpm) ausgedrückt als ein Prozentsatz.
Somit
Die untersuchte Probe war eine 10 μl (Mikroliter) Tritium beschriftete biologische Probe gemischt mit 190 μl eines eigenen Szintillationscocktails (Supermix, vertrieben durch Wallac Oy) sowohl abgeschreckt als auch nicht abgeschreckt. Der nicht abgeschreckte Zählerwirkungsgrad wird als (UQ) bezeichnet. Der abgeschreckte Zählerwirkungsgrad wird als (Q) bezeichnet. Die Werte (Q), die in Tabelle 1 angegeben sind, wurden unter Verwendung von Tartrazin als Abschreckmittel erhalten oder gefärbter Empfindlichkeitsregler, um eine kräftige Abschreckung hervorzurufen. Bei der Flüssigkeitsszintillationszählung ist die Farbabschreckung ein unvermeidliches und unerwünschtes Phänomen, da dies zu einem Gesamtverlust des Signals führt. Es ist deshalb wichtig, dass eine Probenplatte einen Zellwirkungsgrad hat, der so hoch wie möglich ist, nicht nur mit einem hohen Wirkungsgrad nicht abgeschreckter Proben, sondern auch mit niedrigem Wirkungsgrad abgeschreckter Proben.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 angegeben, die Zählwirkungsgradmessungen wurden 15 Minuten lang ausgeführt, nachdem die Proben gemischt wurden. Tabelle 1
Die Platten E1 und C2 sind starr und können von automatischen Analysegeräten vollständig gehandhabt werden. Die Unterschiede in den Zählwirkungsgraden (UQ) und (Q) sind sehr gravierend. Die Q-Werte sind besonders wichtig. Der Wert 22,4% ist eine signifikante und vorteilhafte Verbesserung gegenüber dem Wert 20,3 und eine bemerkenswerte Verbesserung gegenüber dem Wert 14,5%.
E1 wurde auch mit C2 hinsichtlich der Stabilität der cpm-Werte über längere Zeitspannen verglichen unter Verwendung des selben Probengemischs wie oben, jedoch einem anderen Szintillationscocktail, nämlich Optiphase HiSafe 2 (vertrieben von Wallac Oy). Die Werte von cpm neigen dazu, abzunehmen, je länger der Test durchgeführt wird. Niedrige Werte reduzieren die Genaugigkeit des Tests und entsprechend ist eine Multibehälterplatte vorteilhaft, bei der die cpm-Werte mit der Zeit weniger abnehmen.
Die folgende Tabelle 2 gibt die Zeitfolge nach dem Mischen und die cpm-Werte für E1 und C2 an. Tabelle 2
Aus Tabelle 2 ist somit zu ersehen, dass die E1 Mikrotestplatte eine Abnahme bei cpm über 14 Stunden von nur 5,5% hat während C2 eine Abnahme von 19,5% hat. Außerdem ist der cpm-Wert nach 1,8 Tagen (2.643 Minuten – 44 Stunden) von E1 nur um 11,4% abgefallen, während der cpm-Wert von C2 um 50,7% abgenommen hat. Dies zeigt einen wesentlichen Vorteil bei der Platte gemäß der vorliegenden Erfindung.
Kreuzkopplungs- und Zählwirkungsgradvergleiche wurden für die E1, C1 und C2 Platten unter Verwendung einer Testprobe höherer Energie ausgeführt, nämlich Jod 125. Der zentrale Behälter enthielt 10 μl Jod-125 bezeichnete biologische Probe und 190 μl des Supermixszintillationscocktails. Die Szintillationsmessungen erfassen Hochenergieelektronen, Gammastrahlen und Niedrigenergieelektronen, und somit sind die Kreuzkopplungswerte höher. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Es ist zu bemerken, dass E1 einen verbesserten Zählwirkungsgrad im Vergleich zu C1 und C2 hat und insgesamt verbesserte Kreuzkopplungswerte.
Wie oben erwähnt, ist dies nicht das einzige Verfahren zur Herstellung der Mikrotestplatten der vorliegenden Erfindung, jedoch ein hochgradig bevorzugtes Verfahren. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass verschiedenes Polymer verwendet werden kann für die transparenten Probenbehälter und die umgebende opake Matrix. Dies ist insbesondere wichtig, wenn die Mikroplatten verwendet werden, um biologische Substanzen wie Proteine, Antikörper und Antigene zu binden. Ein Polymer, das insbesondere für das Binden geeignet ist, beispielsweise Antikörperbinden und/oder Antigenbinden, kann für die transparenten Probenbehälter ausgewählt werden und die opake Matrix der Mikrotestplatte kann aus einem anderen, weniger teuren Polymer bestehen. Dies vermeidet es, das gesamte Produkt aus dem teuren Polymer herzustellen. Außerdem müssen die Seitenwände der Behälter nicht pigmentiert sein. Dies kann vorteilhaft sein, wenn es wünschenswert ist, dass Zellen in den Behältern wachsen oder an den Innenwänden der Behälter anhaften oder dass Antikörper oder Antigene daran anhaften. Polystyrol ist zu diesen Zwecken sehr wirksam. Seine Pigmentierung scheint zu verhindern, dass sich Antikörper und Antigene an die Wände anbinden. Somit ist es von Vorteil, dass eine Pigmentierung der Wände vermieden werden kann.
Ein weiterer Vorteil der 2-Schuß-Methode besteht darin, dass Szintillationssubstanzen dem System hinzugefügt werden können, indem sie in das geschmolzene Polymer vor der Injektion in die primäre Kavität eingebracht werden. Dies vermeidet das Erfordernis nach Lösungsmittel, das Szintillationszusammensetzungen enthält, entweder als Zugabe zu der zu testenden Probe oder als eine Beschichtung der Innenseite des Probenbehälters. Diese Lösungsmittel können das Polymer der Mikrotestplatte angreifen, und die Beschichtung des Probenbehälters ist ein zusätzlicher Schritt und kann zu ungleichförmigen Ergebnissen wegen der Variabilität des Beschichtungsprozesses führen. US 4,568,649 offenbart ein Verfahren, bei dem die Fluoreszenzsubstanz (Szintillationssubstanz) über eine Tragstruktur wie Wülste in das System eingeführt wird. Die Fluoreszenzsubstanz, beispielsweise Diphenyloxazol (PPO) ist in ein Übergangslösungsmittel aufgelöst, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), von dem die Fluoreszenzsubstanz in den Wulst absorbiert wird und mit Wasser vorbehandelt wird.
Bei dem 2-Schuß-Verfahren müssen die Szintillationssubstanzen nur dem transparenten Polymer hinzugefügt werden, das für die Probenbehälter verwendet wird, und nicht dem Polymer für die opake Matrix. Dies führt zu einer wesentlichen Wirtschaftlichkeit bei der Menge von Szintillationssubstanzen, die pro Platte verwendet wird. Es wird ferner angenommen, dass die Szintillationssubstanzen wirksamer sind, wenn sie in ein Polymer aufgenommen sind, das keine Pigmentierung enthalten muss, wie dies bei der vorliegenden Erfindung der Fall ist.
Typische Polymere, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Polystyrol (PS), Polyethylenterephthalatcopolymer (PET), Polyethylen (PE), Styrolacrylnitrilcopolymer (SAN), Polyvinyltoluol (PVT), Polyvinylchlorid (PVC), Polycarbonate (PC), Acryl (PMMA), Polymethylpenthen (PMP), Polypropylen (PP) und andere Polyolefine und Copolymere von solchen Materialien. Polystyrol ist besonders bevorzugt für Zellkulturanwendungen. Polystyrolflächen werden häufig in einer Plasmakammer behandelt (Hochspannungsentladung). Dies modifiziert die Natur der Oberfläche, vergrößert ihre Oberflächenenergie (Flächenspannung) und Polarität und macht sie daher empfänglicher für Zellenwachstum. Die Plasmabehandlung für die Flächenaktivierung kann auch an anderen Polymeren als Polystyrol ausgeführt werden, beispielsweise bei PET.
Wie oben erwähnt ist, müssen die Behälter und die Matrix nicht notwendigerweise aus demselben Polymer hergestellt werden. Wenn jedoch verschiedene Polymere verwendet werden, ist es erforderlich zu prüfen, ob sie eine zufriedenstellende Verbindung miteinander eingehen. Die Adhäsion zwischen den zwei verschiedenen Polymeren ist nicht nur ein Resultat des dichten Anliegens, sondern hängt auch von der Kompatibilität zwischen den jeweiligen Oberflächenenergien, Polaritäten etc. ab. Besonders bevorzugte Kombinationen von Polymeren sind PMP, PP, PE und PET für den Behälter und PP und PS für die Matrix, spezieller PMP für den Behälter mit PP für die Matrix, PP, PE oder PMP für den Behälter mit PS für die Matrix und PET für den Behälter mit PP für die Matrix.
Die Behälter 10 und die Röhrchen 5 bilden eine thermisch verbundene Struktur.
Die Probenbehälter 10 sind vollständig von benachbarten Behältern eingehüllt. Um dies zu erreichen ist die Höhe des Probenbehälters 10 begrenzt, wie in 5 dargestellt ist. Der obere Rand 13 der vertikalen Seitenwände jedes Probenbehälters 10 liegt unter der Ebene, die durch den oberen Rand 9 der erhabenen Wülste 8 der Oberseite 1a der opaken Matrix 21 gebildet ist. Die untere Fläche 14 des transparenten Bodens 11 des Behälters 10 befindet sich oberhalb der Ebene, die durch die unteren Enden 7 der opaken zylindrischen Röhrchen 5 beschrieben ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in 6 dargestellt, wobei jeder transparente Probenbehälter 10 vollständig in die opake Matrix 21 und ihr zugehöriges opakes zylindrisches Rohr 5 eingekapselt ist, abgesehen von der funktional erforderlichen Öffnung 15 am oberen Ende des Behälters. Dies wird dadurch erreicht, dass eine horizontale Verlängerung 20 an dem unteren Ende 7 des zylindrischen Rohres 5 über die untere Fläche 14 des transparenten Bodens 11 des Behälters 10 ausgebildet wird. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gemäß 6 ist von besonderem Interesse für Untersuchungen, die Antikörper/Antigenbindung in Verbindung mit oberen Zählinstrumenten verwenden. Dies wird insbesondere dann der Fall sein, wenn zuvor gezeigt wurde, dass die Antikörper und Antigene sensitiv für Pigmentierungssysteme sind, die in den opaken Seitenwänden der Probenzellen bei existierenden Produkten verwendet werden. Die Verwendung des transparenten Polymers bei den Probenbehältern verhindert den Kontakt zwischen der Probe und den pigmentierten Polymermatrix.
Die vorliegende Erfindung sieht für die Verwendung von „biologischen Zellen oder Antikörper und/oder Antigene probenfreundliche" Behälter vor, die in eine Matrix eingesetzt sind, die für die Instrumentenausrüstung oder bestimmte Untersuchungsmethode optimiert werden kann. Sie ermöglicht auch die Entwicklung von Verbesserung der Untersuchung oder die Optimierung der Chemie, die in die Probenbehälter selbst eingesetzt oder aufgebracht wird, wodurch das Produkt für die Endbenutzer funktional vereinfacht und verbessert wird.
Versuche, bei denen die Emission von Licht gefolgt wird durch Szintillationszählen, Luminometrie oder Fluorometrie erfordern die Anwesenheit von organischen Szintillationssubstanzen, organischem Fluor oder andere Lichtemittierende Systeme in dem zu testenden System. Wie oben erwähnt ist, ist ein Vorteil der 2-Komponentenstruktur das Einsetzen der Szintillationssubstanzen in das Polymer für die transparenten Probenbehälter allein, und nicht in das Polymer für die opake Matrix. Dies verhindert auch, dass die Szintillationssubstanzen in Kontakt mit pigmentiertem Polymer stehen, wodurch der Grad ihrer Leistungsfähigkeit sinkt.
Allgemein können geeignete organische fluoreszierende Verbindungen beispielsweise aus denjenigen ausgewählt werden, die als „organische Fluore" und „organische Szintillationssubstanzen" in Organic Szintillation Detection, E Schram und R Lombaert, Elsevier Publishing Co. 1963 beschrieben sind. Nützliche Wellenlängenverlagerer (d.h. sekundäre Fluore) sind ebenfalls auf dem Gebiet des Szintillationszählens allgemein bekannt. Bevorzugt unter diesen Klassen von Materialien sind 2,5-diphenyloxazol (PPO) als das primäre Fluor und entweder bis (O-methylstyryl) benzen (bis MSB) oder 9,10-diphenylanthracen oder 9,10-dimethylanthracen als sekundäres Fluor. Das primäre Fluor ist vorzugsweise in dem Bereich 0,01 bis 4 Gew.-% vorhanden. Das sekundäre Fluor ist vorzugsweise in dem Bereich 0,001 bis 0,5 Gew.-% vorhanden. Energieübertragungsverbindungen, die die Szintillationseigenschaften verbessern, sind optional und enthalten Verbindungen wie Mono- und Dialkylnaphtalene, Anthracene und Durene. Sie können in dem Bereich von 0,01 bis 10 Gew.-% hinzugefügt werden. Wenn die Fluore in das Behälterpolymer eingeschlossen sind, sind Energieübertragungsverbindungen nicht wesentlich. Die Verwendung von Additiven ist nicht auf Szintillationssubstanzen beschränkt. Andere nützliche Additive können dem transparenten Teil der Mikrotestplatte hinzugefügt werden. Wie oben erwähnt ist, kann das transparente Polymer ausgewählt werden, um die Proteinbindung zu verbessern. Die vorliegende Erfindung erlaubt das Einsetzen eines geeigneten Polymers für die Gehäuse, ohne dass dasselbe Polymer für die opake Matrix verwendet werden muss, was teuer sein könnte.
Hinsichtlich der Behälter 10 ist ausgeführt worden, dass sie transparent sind. Dies ist besonders bevorzugt, jedoch nicht essentiell. Die vorliegende Erfindung sieht in ihren breitesten Aspekten Behälter 10 vor, die eine unterschiedliche Zusammensetzung oder Eigenschaften oder beides im Vergleich zu der opaken Matrix 21 haben.
Die Gesamtheit der Struktur der vorliegenden Erfindung bringt die folgenden Vorteile mit sich. Flüssigkreuzkopplung, nämlich Flüssigkeitsdurchströmung zwischen Behältern wird durch die Behälter verhindert, die mit integralen Seitenwänden und Böden als einzelne Formteile hergestellt werden, anstatt dass zwei Formteile zusammengesetzt werden. Lichtkreuzkopplung, nämlich Signaltransfer zwischen benachbarten Behältern entweder über die Seitenwände oder die Böden wird durch die opake Matrix, die sich zwischen benachbarten Behältern und über ihre Enden hinaus erstreckt, verhindert oder reduziert. Ein Randeffekt, nämlich Verlust von Licht von Behältern an den Rändern der Anordnung wird durch die Matrix, die diese Behälter einhüllt, vermieden oder reduziert.

Claims

Mikrotestplatte mit einem Feld abgesonderter, getrennter Probenbohrungen (10), wobei jede Probenbohrung eine Bohrung (10) einer ersten Polymerzusammensetzung aufweist und Seitenwände (16) und eine Basis (11) hat und in einer Matrix (21) einer zweiten Polymerzusammensetzung angeordnet ist, wobei die zweite Polymerzusammensetzung lichtundurchlässig ist, wobei jede Bohrung (10) ein erstes und ein zweites, einander gegenüber angeordnetes Ende (13, 14) hat und die Matrix (21) die Seitenwände (16) jeder Bohrung (10) einhüllt und sich über das erste und das zweite Ende (13, 14) der Seitenwände (16) jeder Bohrung (10) hinaus erstreckt, wobei ferner jede Bohrung (10) thermisch mit der Matrix (21) der zweiten Polymerzusammensetzung verbunden ist, um so eine integrale Struktur zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenwände (16) eine Dicke von wenigstens 0,10 mm haben.
Mikrotestplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Polymerzusammensetzung geformte Polymerzusammensetzungen sind.
Mikrotestplatte nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (21) wenigstens einen Teil der Basis (1 1) jeder Bohrung (10) uneingehüllt läßt.
Mikrotestplatte nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (21) der zweiten Polymerzusammensetzung sich über den gesamten Bereich der Basis (1 1) jeder Bohrung (10) erstreckt.
Mikrotestplatte nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (21) die Basis (11) gänzlich uneingehüllt läßt.
Mikrotestplatte nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Basis (11) jeder Probenbohrung (10) zu der Außenseite der Matrix (21) in zwei im wesentlichen gegengesetzten Richtungen offen ist.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polymerzusammensetzung ein Polymer enthält, das das selbe ist wie das Polymer in der zweiten Polymerzusammensetzung.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polymerzusammensetzung nicht lichtundurchlässig und vorzugsweise transparent ist.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (21) sich über eine Strecke Y über die Basis (11) der Probenbohrung (10) hinaus und eine Strecke X über die obere Öffnung der Probenbohrung (10) hinaus erstreckt, wobei X und Y jeweils wenigstens 0,1 mm betragen.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die maximale Breite der Bohrung (10) gleich D ist und daß das Verhältnis Y : D und X : D in dem Bereich von 1 : 10 bis 1 : 100 liegt.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (21) eine Oberseite bildet, daß ferner die Oberseite der Matrix (21) erhabene Wülste bildet, wobei jede erhabene Wulst eine zugehörige Probenbohrung (10) umgibt, wobei ein oberer Rand jeder erhabenen Wulst eine zugehörige Probenbohrung (10) umgibt, und wobei ein oberer Rand einer jeden erhabenen Wulst höher ist als ein restlicher Teil der Oberfläche der Matrix (21).
Mikrotestplatte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das erste oder zweite einander gegenüberliegend angeordnete Ende jeder Seitenwand (16) ein oberes Ende ist und daß der restliche Teil der Oberfläche der Matrix (21) niedriger ist als das obere Ende der Seitenwand (16).
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (22) nur die Seitenwände (16) der Bohrungen (10) berührt.
Mikrotestplatte nach jedem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß jede Bohrung (10) thermisch mit der Matrix (21) nur entlang der Seitenwände (16) verbunden ist.
Mikrotestplatte nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jede Probenbohrung (10) aus einem transparenten Material gemacht ist.
Mikrotestplatte nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer der Probenbohrungen (10) eine funktionale Fähigkeit hat, die relevant für die Analyse ist, die bei der Mikrotestplatte ausgeführt wird, beispielsweise eine Protein bindende Fähigkeit.
Verfahren zur Herstellung einer Mikrotestplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Formen eines Feldes abgesonderter, getrennter Bohrungen (10) einer ersten Polymerzusammensetzung auf einer Unterlage und dann das Formen einer Matrix (21) einer zweiten Polymerzusammensetzung um die Bohrung (10), so daß die Polymerzusammensetzungen thermisch miteinander verbunden sind, und das Trennen der integralen Struktur von der Unterlage aufweist, wodurch die Bohrungen (10) offene Enden haben, die durch eine Fläche der Struktur zum Vorschein kommen, und daß ihre anderen Enden geschlossen sind.
Verfahren zur Herstellung einer Mikrotestplatte nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein gemeinsamer Kern (oder eine Vielzahl von Kernen, die Kernbündel genannt wird) der die innere Form jeder einzelnen Bohrung (10) (oder einer Vielzahl von Bohrungen) bildet, in eine primäre Kavität oder Form (oder Formen) eingesetzt wird, welche die äußere Form jeder einzelnen Bohrung (10) bildet, daß die Temperatur der primären Form oder der primären Formen in dem Bereich von 10 bis 60°C liegt, daß eine erste geschmolzene Polymerzusammensetzung in die primäre Form oder die primären Formen bei einem Druck von 1000 bis 1500 bar injiziert wird, daß die Temperatur der ersten geschmolzenen Polymerzusammensetzung in dem Bereich von 180 bis 260°C liegt, daß die injizierte erste Polymerzusammensetzung abkühlen darf, so daß die erste Polymerzusammensetzung um den gemeinsamen Kern erhärtet, aber noch oberhalb der Umgebungstemperatur ist, daß die primäre Form oder die primären Formen geöffnet werden, daß der gemeinsame Kern oder das Kernbündel mit den einzelnen Bohrungen (10), die darauf gehalten werden, aus der primären Form oder den primären Formen entfernt wird, daß der gemeinsame Kern oder das Kernbündel und die Bohrungen (10) in einer zweiten Kavität oder Form angeordnet wird, daß die Fläche des gemeinsamen Kerns oder des Kernbündels und die einzelnen Bohrungen (10) die interne Form der Matrix (21) der zweiten Polymerzusammensetzung bilden, daß die zweite Form die äußere Form der Matrix bildet, daß die Temperatur der zweiten Form in dem Bereich von 10 bis 60°C liegt, daß die zweite geschmolzene Polymerzusammensetzung bei einem Druck von 1000 bis 1500 bar in die zweite Form injiziert wird, so daß sie thermisch mit den Bohrungen (10) auf dem gemeinsamen Kern oder Kernbündel verbunden wird, wobei die zweite geschmolzene Polymerzusammensetzung bei einer Temperatur von 180 bis 260°C ist, daß die injizierte zweite Polymerzusammensetzung abkühlen darf, so daß die zweite Polymerzusammensetzung um die einzelnen Bohrungen (10) herum erhärtet und eine thermische Verbindung damit bildet, daß die zweite Form geöffnet wird und daß die Mikrotestplatte aus dem gemeinsamen Kern oder dem Kernbündel ausgestoßen wird.
Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polymerzusammensetzung ein transparentes Polystyrol mit einem Schmelzfließindex in dem Bereich von 1,5 bis 20 und einem Schmelzpunkt von 185 bis 210°C ist, und daß die zweite Polymerzusammensetzung ein Polystyrol eines Schmelzfließindex in dem Bereich von 1,5 bis 20 und einem Schmelzpunkt von 185 bis 210°C und ein Material aufweist, das die zweite Polymerzusammensetzung lichtundurchlässig macht, wobei die zweite Polymerzusammensetzung einen Schmelzpunkt von 185 bis 210°C hat.
Verfahren nach jedem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Polymerzusammensetzung sich nicht über die geschlossenen Enden der Bohrungen (10) erstreckt.