DE69734683T2 - Phosporeszierende dentrische makromolekül-verbindungen zur bilddarstellung des sauerstoffgehalts von gewebe - Google Patents

Phosporeszierende dentrische makromolekül-verbindungen zur bilddarstellung des sauerstoffgehalts von gewebe Download PDF

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Description

  • Gegenstand der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Sauerstoffmessung in menschlichem und tierischem Gewebe, und insbesondere auf neuartige phosphoreszierende Sondenmoleküle.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die zuverlässige und genaue Messung der Sauerstoffversorgung in Säugetiergewebe ist wichtig um sicherzustellen, dass die Versorgung adäquat ist, da das Kreislaufsystem spezielle Sauerstoff transportierende Moleküle im Blut verwendet, um Sauerstoff von den Lungen zu anderen Geweben im ganzen Körper zu liefern. Daher muss jedes Organ im Körper in jedem Gewebe in ausreichendem Maße Sauerstoff enthalten, um normal zu funktionieren. Unterschiedlicher Sauerstoffgehalt in Geweben kann deshalb Anzeichen für Gewebsanomalien, Defekte, ob durch äußere Einwirkungen oder genetisch verursacht, oder für Krankheit sein.
  • Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration/des Sauerstoffteildrucks im Gewebe durch Messen der Phosphoreszenzminderungswirkung des Sauerstoffs auf molekulare Phosphoreszenz von organischen Verbindungen sind bekannt. Siehe zum Beispiel WO 95/10522.
  • Damit phosphoreszierende Verbindungen für den Einsatz als phosphoreszierende Sauerstoffsonden (nachstehend "Phosphor") zur Bestimmung der Sauerstoffanreicherung im Gewebe geeignet sind, ist es wünschenswert, dass (1) die Verbindungen eine hohe Extinktionsfähigkeit im nahen infraroten Bereich des Spektrums haben, wo natürliche Gewebschromophoren, wie Hämoglobin oder Myoglobin, nur eine sehr schwache Absorption aufweisen, (2) die Verbindungen Phosphoreszenz mit hoher Ausbeute bei Raumtemperatur, am besten höher als 2 %, haben und (3) auch eine geeignete Lebensdauer, am besten von etwa 0,1 bis etwa 1 ms haben.
  • Phosphoreszierende Sonden sollten ansonsten ungiftig oder von zu vernachlässigender Toxizität, chemisch im Wesentlichen inert gegenüber Körperflüssigkeiten und Bestandteilen, leicht auszuscheiden und auch von ausreichender Löslichkeit in physiologischen Körpermedien sein, so dass Sauerstoffmoleküle für effektives Fangen nahe genug herangeführt werden können und zuverlässige und genaue Sauerstoffmessungen liefern.
  • Im Allgemeinen nimmt die nähere Umgebung solcher Sauerstoffsonden Einfluss darauf, ob die Sonde eine oder mehrere der oben genannten wünschenswerten Eigenschaften besitzt. Erfindungsgemäß beinhaltet "die nähere Umgebung" Faktoren wie Atome, verschiedene funktionelle Gruppen, verschiedene Proteine, Enzyme und andere Makromoleküle in der Umgebung des Phosphors, die solche Eigenschaften des Phosphors hinsichtlich der Sauerstoffmessung bestimmen, einschließlich, ohne Einschränkung darauf, Wasserlöslichkeit, Toxizität, der Sauerstoffabfangkonstante von Sauerstoff, Empfindlichkeit gegenüber chemisch aktiven Gewebsteilen, und Leichtigkeit der Ausscheidung aus dem Körper durch die Niere.
  • Es ist wünschenswert, die oben erwähnten unterschiedlichen Faktoren der näheren Umgebung dadurch einzugrenzen, dass man eine reaktionsträge kugelförmige Struktur um den Phosphor herum erzeugt, an die nur kleine unveränderte Moleküle, also Sauerstoff, nahe genug für eine ausreichende Phosphoreszenzminderung gelangen können, und die gleichzeitig die oben genannten wünschenswerten Eigenschaften eines Phosphors besitzt.
  • Über eine neue Klasse von Phosphoren, die für die Sauerstoffmessung geeignet ist, wurde kürzlich in Vinogradov und Wilson, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 103–111, (1995) und in der zuvor erwähnten US-Patentanmeldung Nr. 08/137,624 berichtet; beide sind Komplexverbindungen von Metallen der Gruppe III, wie Pd und Pt, mit erweiterten Porphyrinen, wie zum Beispiel Tetrabenzoporphyrin, Tetranaphthaloporphyrin, Tetraanthraporphrin und verschiedene Derivaten davon. Pd-Komplexe von Tetrabenzoporphyrin und Tetranaphthaloporphyrins sind besonders wünschenswert, da sie eine starke Lichtabsorption im nahen Infrarotbereich (610–650 nm bzw. 700–720 nm) aufweisen, wo Gewebe praktisch durchsichtig ist. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass PD-Tetrabenzoporphyrine (PdTBP) und deren Derivate eine langlebige Phosphoreszenz (~ 250 ms) mit Quantenausbeuten von 8–10 % aufweisen.
  • Ein Ziel der Erfindung ist demnach, die Struktur solcher Verbindungen, wie z.B. phosphoreszierender Sonden, durch Modifizierung mit chemisch aktiven funktionellen Gruppen weiter zu verbessern und eine günstige Umgebung um derartige Phosphore herum zu schaffen, um die Lösbarkeit und die Trennschärfe für Interaktionen mit molekularem Sauerstoff in Säugetiergewebe zu erhöhen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung schafft Phosphore, die metallkomplexierte erweiterte Porphyrin-Verbindungen aufweisen, die mit Dendrimeren zu Komplexen verbunden sind, um den Phosphor mit supramolekularen Strukturen zu umgeben, die in einem weiten pH-Bereich sehr gut wasserlöslich sind, leicht aus dem
    Blut von Säugetieren exkretierbar sind und zusätzliche wünschenswerte Eigenschaften phosphoreszierender Sonden aufweisen, wie z.B. langlebige Phosphoreszenz und entsprechende Quantenausbeuten.
  • Die Erfindung wird in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, in den Zeichnungen und Beispielen näher erläutert, die alle ausschließlich illustrativen Zwecken dienen und in keiner Weise den Umfang der Ansprüche der vorliegenden Erfindung beschränken sollen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform zur Schaffung von PdTBP- und PdTPTPB-funktionalisierten Derivaten zur Initiierung von divergentem Dendrimer-Wachstum.
  • 2 zeigt eine weitere beispielhafte Ausführungsform zur Schaffung von PdTBP- und PdTPTBP-funktionalisierten Derivaten zur Initiierung von divergentem Dendrimer-Wachstum.
  • 3a zeigt die Erzeugung von Dendrimer-Wachstum auf einem kernfunktionalisierten Porphyrin mit funktionellen Gruppen, die sich in den para-Positionen von Meso-Phenyl-Ringen befinden.
  • 3b zeigt die Erzeugung von Dendrimer-Wachstum auf einem kernfunktionalisierten Porphyrin mit funktionellen Gruppen, die sich in den meta-Positionen von Meso-Phenyl-Ringen befinden.
  • 4a zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zur Schaffung eines funktionalisierten PdTBP mit metafunktionellen (bzw. pseudo-meta-funktionellen) Gruppen durch direkte Nitrierung von nicht-substituiertem TBP in meta-Positionen zur Schaffung von (Pd) Teranitrotetrabenzoporphyrin.
  • 4b zeigt die bevorzugte Ausführungsform des funktionalisierten Kern-Porphyrins von 4 durch Transformation von (Pd) TNTBP in das entsprechende Tetraminotetrabenzoporphyrin (TATBP oder PdTATBP).
  • 4c zeigt weiters eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung durch zusätzliche Funktionalisierung von TATBP oder PdTATBP in 4b mit 1-, 3-, 5-Benzoltricarboxylsäure zur Schaffung von (Pd) Metacarboxytetrabenzoporphyrin (MCTBP oder PCTSF).
  • 5 zeigt das Auftreten von Verzweigungen in einem divergenten Dendrimer-Wachstumsmodus durch Amidbindungen, die mit Hilfe von Glutaminsäure gebildet werden.
  • 6 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zum divergenten Dendrimer-Wachstum über zwei Generationen unter Verwendung von MCTBP oder ihrem Derivat PdMCTBP als Kernporphyrin und Diallylglutamat als monomerer Einheit.
  • 7 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zur Modifizierung einer Außenschicht von dendritischem Porphyrin.
  • 8 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zur Modifizierung einer Außenschicht von dendritischem Porphyrin.
  • Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung schafft hoch effiziente und sehr gut lösliche phosphoreszierende Sonden, die für Messungen des Sauerstoffs im Gewebe von Tieren und Menschen geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Sonden sind von einer inerten kugelförmigen Struktur umgeben, zum Beispiel derivatisiertes PdTBD, das von einer als Dendrimer bekannten dreidimensionalen supramolekularen Struktur umgeben ist.
  • Wie bekannt ist, ist dendritisches Polymerwachstum eines der wirkungsvollsten Verfahren zum Aufbau einer dreidimensionalen supramolekularen Struktur um einen funktionalisierten Kern, wie einen derivatisierten Phosphor herum. Dendrimere sind dreidimensionale supramolekulare radialsymmetrische Moleküle, die als einen Initiatorkern, wie Stickstoff, polyfunktionelle Amine, wie Äthylenediamin, oder in der vorliegenden Erfindung die Sauerstoff messenden Phosphore umfassen, mit am Kern angelagerten Innenschichten, die zum Beispiel drei oder vier Arme aufweisen, von denen sich jeder Arm aus sich wiederholenden Einheiten zusammensetzt, und mit der Anzahl an sich wiederholenden Einheiten in jedem Arm, die als eine Generation des Dendrimers angesehen wird. Die äußerste Generation enthält typischerweise terminale funktionelle Gruppen, wie Primäramin, das an die äußerste Generation angelagert ist. Die Größe und Form des Dendrimermoleküls und die darin vorhandenen funktionellen Gruppen lassen sich durch die Wahl des Initiatorkern, die Anzahl von Generationen und die Art der sich wiederholenden Einheiten steuern, die bei jeder Generation verwendet werden. Zum Beispiel kann die chemische Funktionalität der sich wiederholenden Einheiten in den Innenschichten Amidoamine, wie Diethylendiimin, und mit Terminalfunktionalitäten, wie zum Beispiel Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Karboxylsäuregruppen, Karkaoxylaten und dergleichen, sein. Siehe Urdea et al., Science 261: 534 (1993), und Frechet, 263: 1710–1715 (1994). Deshalb sind Dendrimere Kombinationen von monomeren Einheiten, die eine Verzweigung bei jeder Polymerisationsstufe erlauben. Wie zum Beispiel von Blumen et al., Angewandte Chemie, Int., Ed. Eng. 29: 113–125 (1990) gezeigt wurde, tendieren Dendrimere dazu, kugelförmige Strukturen mit wachsender Anzahl monomerer Einheiten zu bilden, die schließlich die zentralisierte funktionelle Einheit oder Verbindung bedecken. Siehe auch zum Beispiel Winnik et al., US-Patent Nr. 5.256.193.
  • Mindestens zwei Verfahren sind bekannt für die Synthese von Dendrimer-polymeren Strukturen: Methode des konvergenten bzw. divergenten Wachstums. Beide kommen für den Gebrauch in der vorliegenden Erfindung in Betracht.
  • In der konvergenten dendrimerischen Syntheseroute wird die Polymersynthese von der Peripherie und den Enden durch Verbinden verzweigter Fragmente mit einem zentralen Kern initiiert. Für eine Detailbeschreibung des konvergenten synthetischen Verfahrens siehe Hawker et al. J. Chem., Soc. 114: 8405–8413 (1992), Wooley et al., J. Clem. Soc. Perkin Transactions 1: 1059–1076 (1991) und Frechet et al., US-Patent Nr. 5.041.516.
  • Kürzlich wurde berichtet, dass die konvergente Synthetisierungsroute nützlich bei der Modifikation von Porphyrinen ist, d.h. ein dendritisches Molekül mit einem Kern produziert, der photochemische Funktionalität hat. Siehe, Jin et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1260–1262 (1993). Diese Quelle beschreibt das Messen des Auslöschens von Fluoreszenz eines in einem dendritischen Käfig verkapselte Zn-Porphyrins und dass die dendrimer-polymere Struktur guten Schutz für den Porphyrinkerns gewährleistet und als Barriere für große Moleküle dient, während kleineren der Zugang ermöglicht wird.
  • Das gebräuchlichere divergenzsynthetische Verfahren nutzt eine umgekehrte Reihenfolge der Synthese, die eine Anfangsreaktion eines Monomers mit einem Initiatorkern einschließt, gefolgt von der sukzessiven Reaktion der entstehenden funktionellen Gruppen mit einer difunctionellen Verbindung, wie einem Diamin, um die nächste Generation reaktiver Aminogruppen zu liefern, so dass Schichten von monomeren Einheiten einem zentralen Kern sequentiell angelagert werden, bis der gewünschte Grad an Verzweigung erreicht ist. Eine detaillierte Erklärung dieses Verfahrens findet sich zum Beispiel bei Tomalia et al., Angewandte Chemie, Int., Ed. Eng. 29: 138–175 (1990) und Tomalia et al., Macromolecules 19: 2466–2468 (1986).
  • Andere Quellen, die sich auf dendritische Makromoleküle beziehen, und deren Herstellungsverfahren finden sich in den US-Patenten der Nummern 5.418.301; 4.568.737; 5.393.795; 5.256.193; 5.393.797; 5.393.795; 5.393.797; 5.098.475; 5.041.516 und 4.568,737.
  • Wie nachstehend beschrieben ergeben in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein-, zwei-, und dreilagige Polyglutamat-dendritische Käfige divergent um neuartiges derivatisiertes metallgestrecktes Porphyrin herum synthetisierte, Sauerstoff messende Phosphorverbindungen Phosphore, die in einem weiten pH-Bereich sehr gut wasserlöslich sind; aus dem Blut von Säugetieren (Mäusen) durch Filterung desselben durch die die Niere ausscheidbar sind; und eine enge Verteilung der Lebenszyklen von Phosphoreszenz in deoxydierten wässrigen Lösungen anzeigen.
  • Wie nachstehend weiters gezeigt wird, schafft die Kombination der neuartigen Phosphorderivate mit Dendrimeren, die als der Phosphorumgebung verwendet werden, eine neuartige Klasse von phosphoreszierenden Sonden für genaue und zuverlässige Sauerstoffmessungen in Säugetiergewebe.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Phosphore sind in WO 95/10522 und bei Vinogradov und Wilson, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2: 103–111 (1995) vollständig beschrieben und haben vorzugsweise folgende Formel:
  • Figure 00080001
  • Worin ist R1 Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl ist; R2 und R3 unabhängig Wasserstoff oder miteinander verbunden sind, um substituiertes oder unsubstituiertes Aryl zu bilden. M H2 oder ein Metall ist.
  • für einen Fachmann ist es naheliegend, wenn R2 und R3 zusammen verbunden werden, um ein Arylsystem zu bilden; das Aryl System ist notwendig in einer kondensierten Beziehung zum jeweiligen Pyrrolsubstrat.
  • M ist vorzugsweise ein aus der aus Lu, Pd, Pt, Zn, Al, Sn, Y und La bestehenden Gruppe gewähltes Metall und Derivaten davon, wobei Pd, Pt und Lu am meisten bevorzugt sind. Nicht-einschränkende Beispiele geeigneter Metallderivate schließen Pd-Tetrabenzoporphyrin (PdTBP), Pd-Tetraphenyltetrabenzoporphyrin (PdTPTBP) und PtTBP, PtTPTBP, LuTBP und LuTPTBP und Naphthaloporphyrine, wie zum Beispiel LuTNP und PdTPTNP ein, von denen alle in WO 95/10522 beschrieben sind.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die Phosphore der gegenwärtigen Erfindung sind Tetrabenzeporphyrin- (nachstehend "TBP")verbindungen, die der Verbindung der Formel I entsprechen, wobei benachbarte R2- und R3-Gruppen miteinander verbunden werden, um Benzolringe zu bilden, die zu den entsprechenden Pyrrolringen konjugiert sind. Bevorzugt sind auch Tetranaphtoporphyrin- (nachstehend "TNP") und Tetraanthraporphyrin- (nachstehend "TAP")Verbindungen, wobei benachbarte R2- und R3-Gruppen miteinander verbunden werden, um Naphthalin beziehungsweise Anthracen-Ringsysteme zu bilden. Wie bei den konjugierten Benzolringen sind die Naphthalin- und Anthracen-Ringsysteme zu den entsprechenden Pyrrolringen verschmolzen.
  • Falls nicht anders angegeben oder aus der Offenlegung ersichtlich ist, sind hier weitere Bezugnahmen auf "TBP"-Verbindungen auch als Bezugnahmen auf TNP- und TAP- Verbindungen zu verstehen.
  • Bevorzugte TBP-Verbindungen haben folgende Formel:
    Figure 00090001
    wobei R1 und M wie oben definiert sind. Besonders bevorzugte TBP-Verbindungen sind Metalltetrabenzoporphyrin (nach stehend "MTBP")-Verbindungen, wobei M ein Metall oder ein Metallderivat, wie hier zuvor beschrieben, ist.
  • Unter den TBP-Verbindungen sind besonders bevorzugt die Verbindungen der Formel II oben, wo mindestens eines der R1 substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl ist. Auf diese Verbindungen wird nachstehend als Phenyltetrabenzoporphyrin (nachstehend "PhTEP")-Verbindungen Bezug genommen. Bevorzugte PhTBP-Verbindungen schließen substituierte oder unsubstituierte Tetraphenyltetrabensoporphyrin-(nachstehend TPTBP)Verbindungen ein, einschließlich Meso-Tetraphenyltetrabenzoporphyrin-(nachstehend "mTPhTBP")Verbindungen ein, die folgende Formel haben:
    Figure 00100001
    wobei R2, R3 und M wie oben definiert sind, R4 eine Substituentengruppe ist, und x eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist. Besonders bevorzugte TPTBP-Verbindungen sind substituierte Verbindungen der Formel V, wo x eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
  • Bezüglich bevorzugter substituierter Verbindungen der Erfindung, sind Substituentengruppen erwünscht, die den Verbindungen solche wünschenswerte Eigenschaften wie Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln einschließlich aprotischen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid (DMF), Azeton und Chloroform (CHCl3), und protische Lösungsmittel, wie Wasser, verleihen. Der Substitutionsgrad und der Charakter der Substituentengruppe lässt sich anpassen, um den gewünschten Grad an Löslichkeit in dem gewünschten Lösungsmittel oder der gewünschten Lösungsmischung zu erhalten.
  • Beispiele für die bevorzugten Ausführungsformen
  • Die Bereitung der phosphoreszierenden Sauerstoffsonden der vorliegenden Erfindung wird nachstehend durch die folgende bevorzugte synthetischen Ausführungsform erläutert. Zuerst wird die Synthese von PdTBP-Derivaten mit chemisch aktiven funktionellen Gruppen ausgeführt, um weitere Addition dendritischer Fragmente zu ermöglichen. Danach wird das eigentliche schichtweise divergierende Wachstum der dendrimeren Polymerstruktur um den Porphyrinkern bewirkt, um die komplette Sonde zu bilden.
  • Eine alternative Ausführungsform der konvergenten Synthese der verzweigten dendritischen Fragmente, gefolgt von der Anlagerung einer Kontroll-Porphyrinhälfte ist gleichfalls in Betracht gezogen.
  • Funktionalisierung von (Pd)-TBP in (Pd) MCTBP
  • TBP und Tetraphenyltetrabenzoporphrine (TPTBP) zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung lassen sich durch Matrizenkondensation von Kaliumphthalimiden mit Phenylacetat in Gegenwart von Zn-Salzen entsprechend dem Verfahren synthetisiert werden, das von Kopranenkov et al., J. Gen. Chem. (Russ). 51: 2165–2168 (1981) und Ichimura et al., Inorg. Chim. Acta. 182: 83–86 (1991) berichtet wird. Tetratoluyltetrabenzoporphyrin kann auch in einer Ausbeute von ca. 10% unter Verwendung von 4-Methylphenylacetat als ein kondensierendes Agens synthetisiert werden. Siehe zum Beispiel Kopra nenkov et al. (1981.). Da jedoch weder TBP- noch TPTBP-Verbindungen funktionelle Gruppen enthalten, die für weitere Modifikation geeignet sind, müssen funktionelle Gruppen den gebildeten TBP- und TPTBP-Strukturen hinzugefügt werden.
  • Allgemeine Ansätze zur Modifikation von TBP und TPTBP entsprechend der vorliegenden Erfindung beinhalten a) elektrophile Substitution (Chlorosulfation, Nitrierung, usw.) von Phenylringen in TPTSPs und b) elektrophile Substitution, wie Nitrierung, von meso- Positionen von nicht-substituiertem TBP, gefolgt von Reduktion und Anlagerung von 1,3,5,- Tricarbonsäurefragmenten.
  • Es ist bekannt, dass Phenylringe von TPTBP und PdTPTBP in elektrophiler Substitutionsreaktion am aktivsten sind. Siehe zum Beispiel Vinogradov und Wilson, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2: 103–111 (1995). Solche Reaktionen sind jedoch nicht immer sehr selektiv und können zu nicht-selektiv modifizierten Sonden führen, bei denen Substitution entweder in ortho- oder in para-Positionen von Phenylsubstituenten mit daraus folgender Produktion verschiedender Regio- und Stereoisomeren auftritt, die in den Reaktionsprodukten anwesend sind. Wie nachstehend in 1 beispielhaft dargestellt ist, führt die Chlorsulfierung von PdTPTBP zu einer Mischung aus Tetra-substituiertem Chlorsulfonat-PdTPBP, wobei jedes mit verschiedenen Aminen reagieren kann, um divergentes Dendrimerwachstum auszulösen.
  • Es wurde auch gezeigt, dass sich PdTFTBP leicht chlorsulfatieren und in das entsprechende Sulfonamid mit Aminopolyethyleneglycolen umwandeln lässt. Siehe Vinogradov und Wilson (1995).
  • Entsprechend dieser Erfindung wird auch in Betracht gezogen, dass die Verwendung von mit Methylgruppen substituierten Phenylringen die Anzahl von in elektrophiler Substitution gebildeten Isomeren signifikant aufgrund sterischer Beschränkungen vermindern wird, besonders wenn sanfte Elektrophile für die Modifikation verwendet werden, wodurch sich die Selektivität erhöht. Deshalb wird entsprechend dieser Erfindung in Betracht gezogen, dass Nitrierung von Pd- Tetratoluyltetrabenzoporphyrin mit Stoffen wie Estern der Salpetersäure in Gegenwart schwacher Lewis-Säuren, wie LnCl3, ZnCl2 oder Zeoliten zu nur einem Regioisomer, Pd-Tetra (4-Methyl-3-nitrophenyl) Tetrabenzoporphyrin führt. Dies kann dann zu dem entsprechende Aminoderivat reduziert werden (2). Die Abtrennung der Stereoisomere lässt sich chromatographisch ausführen, und Verfahren sind zuvor für meta- und ortho-Tetra-aminophenylporphyrine beschrieben worden. Siehe Rose et al. "Large-scale preparation of α, β, α', β'-atropoisomer of meso-tetrakis (0-aminophenyl) porphyrin, J. Org. Chem., 58:5030–5031 (1993).
  • Bei Mohamadi et al., J. Comput. Chem. 11: 440 (1990) berichtete, mit dem MacroModel entsprechend ausgeführte molekulare Mechaniksimulationen (Unix Version 3.5, MM2 force field) zeigen, dass 6–10 Schichten von monomeren Einheiten, wie Glutamate, vorzugsweise einem Porphyrin addiert werden, wenn sich die anfänglichen funktionellen Gruppen in den para-Positionen von meso-Phenylringen befinden, um wünschenswerten guten Schutz des zentralen Porphyrinfragments mit Hilfe des divergenten synthetischen Ansatzes zu erreichen (siehe 3A). Dies führt zu Molekülen mit Molekulargewichten von etwa 14.000–30.000 Dalton. Solche großen Arten dürften jedoch in der Praxis wegen Schwierigkeiten bei der Exkretion aus dem Blutstrom nicht sehr nützlich sein.
  • Weitere experimentelle Daten haben gezeigt, dass drei Schichten die Löschkonstante von Sauerstoff von nahezu 2,67 × 105 Pa–1 sec–1 (2 × 103 Torr–1 sec–1) auf etwa 1,0 × 105 Pa–1 sec–1 (750 Torr–1sec–1) vermindert. Letzterer ist ähnlich dem, der für das an Albumin gebundene Porphyrin beobachtet wurde, und ist für In-vivo-Messungen geeignet. Es ist daher zu bevorzugen, dass bis zu vier Glutamatschichten genügen, um eine optimierte Sauerstoffsonde zu erreichen. Jedenfalls zeigen Molekularmodellierungen, dass, wenn Dendrimerwachstum von den meta-Positionen beginnt, kugelförmige Strukturen sich viel schneller bilden und nur drei bis fünf Monomerschichten für die Erzeugung einer vollen kugelförmigen Struktur benötigt werden (siehe 3b). In diesem Fall wird das Molekulargewicht der Sondenmoleküle zwischen 4.000 und 5.000 Dalton betragen, was eine wünschenswerte Größe für gutes Durchdringen der Nierenfilter ist. Es wird daher bevorzugt, dass funktionelle Gruppen selektiv in die meta-Positionen des meso-Phenylsubstituenten eingeführt werden.
  • Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass der Porphyrinanteil eine elektrophile Substitution zu den para- und ortho-Positionen der Phenylringe hinlenkt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine andere Reaktion zur Bildung von PdTBP mit meta- (oder pseudometa-) funktionellen Gruppen geschaffen. Diese Reaktion basiert auf der direkten Nitrierung von nicht-substituiertem TBP in meso-Positionen (siehe 4a). Wie in 4a gezeigt, zeigen die Pfeile die wahrscheinlichste Richtung des elektrophilen Vorstoßes an. Direkte Nitrierung von Porphyrins ist bekannt. Siehe Drach et al., J. Org. Chem. 39: 3282–3284 (1974) und Bonnet et al. J. Org. Chem. 30: 2791–2798 (1965). Die direkte Nitrierung von ZnTBP ist auch bekannt. Siehe Kopranenkov et al., Chem. Heter. Comp. (Russ), 960–964 (1986). Wie in dieser Literaturangabe gezeigt wurde, lassen sich durch Verwendung von HNO3/Essigsäure und HNO2/Trifluoressigsäure bis zu vier Nitrogruppen in die meso-Positionen des TBP-Rings mit Ausbeuten von bis zu 11% einbringen.
  • Es wurde in der vorliegenden Erfindung auch in Betracht gezogen, dass stark ionisierende Nitriermittel, wie zum Beispiel BF4NO2 oder hoch aktive kovalente Nitrersysteme, wie zum Beispiel AcONO2/BF3. ET2O und RONO2/TiCl4 verwendet werden, um sowohl die Gesamtausbeute der Nitrierung als auch die relative Ausbeute von Tetranitrotetrabenzoporphyrin (TNTBP) zu steigern. Nitrierung lässt sich auch im frühesten Zustand der Transformation ausführen, wenn sie TBP als deren Zn-Komplex anwesend ist.
  • Es wurde auch festgestellt, dass Zn-Tetranitrotetrabenzopophyrine (meso-TNTBP) sich leicht durch Verwendung von AcOH/H3PO4 entmetallisieren lassen und dass die Einbringung von Pd in TNTBP schneller als in nicht-substituiertem TBP erfolgt, was durch gesteigerte Nicht-Planarität des tetranitierten Großrings verursacht ist, was durch Verwendung von molekularmechanischen Kalkulationen (MacroModel V.3.5, MM2 force field) bestätigt ist. Die Reduktion von TNTBP (oder PdTNTBP) zu entsprechendem Tetraaminotetrabenzoporphyrin (TATBP oder PdTATBP) wird in 4b gezeigt. Gemäß der vorliegenden Erfindung lässt sich das resultierende TATBP in guter Ausbeute dadurch produzieren, dass vorzugsweise Systeme mit zunehmender Reduktionswirkung, wie Zn/HCl, SnCl2/AcOH, Na/MeOH, NaBH4/MeOH, LiAlH4/THF, verwendet werden.
  • Nach der Bildung von TATBP lässt sich eine weitere Derivatisierung mittels jegliches der verschiedenen Verfahren, die die hohe Reaktivität der Aminogruppen nutzen, erzielen. Ein bevorzugtes Verfahren ist Amidbildung zwischen 1, 3, 5-Benzoltricarbonsäure und TATBP (oder PdTATBP), vorgenommen in Gegenwart von Dicyclohehyloarbodiimid (DCCD), um ein TBP zu erzeugen, das Pseudo-meso-Phenylsubstituenten mit Metacarboxylgruppen oder, mit dem hier verwendeten Terminus, Metacarboxytetrabenzoporphyrin (MCTBP) enthält. Gemäß dieser bevorzugten illustrativen Ausführungsform kann MCTBP oder dessen Pd-Derivat, wie nachstehend gezeigt, als Kern für dendritisches Polymerwachstum verwendet werden. Siehe 4c.
  • In noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird eine bevorzugte direkte Synthese von functionalisierten Porphrinen geschaffen, was direkt zu substituiertem TPTBP mit chemisch aktiven Funktionalitäten führt und als ein Kern für dendritisches Polymerwachstum geeignet ist. Wie vorstehend erörtert wurde, werden Tetrabenzoporphrine, TBP und Tetraphenyltetrabenzoporphyrine, TPTBP, generell durch Matrizenkondensation des Kaliumphthalimids mit Natriumacetat oder Natriumphenylacetat in Gegenwart von Zn-Salzen synthetisiert. Jedoch überleben funktionelle Gruppen entweder von Phthalimidfragmenten oder phenylessigsauren Fragmenten aufgrund der für die Matrizenkondensation erforderlichen harschen Bedingungen normaler weise nicht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nicht festgestellt, dass sich unter modifizierten Bedingungen meso-P-Br-Phenyltetrabenzoporphyrine (PdTBrPTBP) und meso-p-Cl-Phenyltetrabenzoporphrine (PdTC1PTBP) direkt aus Brom- und Chlorphenylessigsäuren synthetisieren lassen. Diese Verbindungen können dann in reaktive funktionalisierte TPTBPs mittels Pd-katalysierter Querbindung und katalytischer Carbonylierung umgewandelt werden. Zum Beispiel lassen sich mittels Pd-Katalyse PdTPhTBPs enthaltende Br-Substituenten, in entsprechende Carboxylverbindungen wie folgt umwandeln:
  • Figure 00160001
  • Katalytische Reaktionen, einschließlich Carbonylierungen und Querbindung, für die Umwandlung von Aryl-Haliden in mehr reaktive Aryl-Derivate werden bei Colquhoun et al., "Carbonylation: directe synthesis of carbonyl compounds", Plenum Presse, New York (1991) und Heck "Palladium reagents in organic synthesis", Academic. Press, New York, (1985) erörtert.
  • Bau eines Dendrimers um (PD) MCTBP
  • Dendrimere können aus einem mehrfach substituierten Kern, wie z.B. aus mehrfach substituierten Porphyrinen, mit ihren verschiedenen diesbezüglichen Eigenschaften, die mit Zunahme der Polymerschichten zusammenfallen, herangezüchtet werden. Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes divergentes dendritisches Wachstumsschema lässt sich in geeigneter Weise als um einen funktionellen (PD) MCTBP-Kern herum gebautes darstellen. Obwohl auch ein konvergentes Wachstumsschema in Betracht gezogen werden kann, wird divergentes Wachstum bevorzugt, da es für eine wirtschaftlichere Nutzung von PdMCTBP und für eine bessere Messung der optischen Eigenschaften und der Löscheigenschaften bei jedem Modifizierungsschritt als geeigneter erscheint. Wenn der nötige Schutz des Porphyrins erreicht ist, was sich anhand der Löschkonstante von Sauerstoff ermitteln lässt, ist keine Addition zusätzlicher Schichten erforderlich; ein fertiges Sondenmolekül von der gewünschten optimalen Größe lässt sich leicht synthetisieren.
  • In der vorliegenden Erfindung ist jede der zahlreichen bekannten monomeren Einheiten zur Bildung von divergenten Dendrimeren nutzbar, wie sie z.B. in den US-Patenten Nr. 4.507.466; 4.631.337; 4.558.120; 4.568.737 und 4.587.329 sowie in Tomalia et al. Angewandte Chemie, Int. Ed . Eng. 29: 138–175 (1990) und Tomalia et al. Macromolecules, 19:2466–2468 (1986) beschrieben sind. Andere monomere Einheiten, die für die gegenwärtige Erfindung geeignet sind, das Dendrimer-Wachstum um einen Porphyrin-Kern herum zu tragen, sind beispielsweise α, ε-L-Lysine, wie im US-Patent Nr. 4.289.872 beschrieben, und 1, 3-Diaminopropan-2-ol in Verbindung mit einer entsprechenden α, β-ungesättigten Carbonylverbindung, wie bei Twyman et al. Perkins Trans.I, 407–411, (1994) beschrieben, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Glutaminsäurediallylester (Diallylglutamat) als eine monomere Einheit zur Modifizierung von PdMCTBP verwendet. Diallylglutamat besitzt zwei geschützte Carboxylgruppen und eine Aminogruppe, wie in 5 ersichtlich. Verzweigung und dendritische Polymerbildung entstehen durch die Bildung von Amidbindungen bei jedem Schritt der Polymerbildung. Es wird angemerkt, dass das Reaktionsschema in 5 vereinfacht ist und dass darin nur die ungeschützte Glutaminsäure, nicht aber das Diallylglutamat dargestellt ist.
  • Die Reaktion zwischen den Carboxyl-Funktionalitäten des Porphyrins PdMCTBP (Pd-meso-tetra-(4-carboxyphenyl)-Porphyrin) und dem Diallylglutamat erfolgt reibungslos in THF bei Raumtemperatur in Gegenwart eines 1,2-molaren Überschusses von DCCD, um das entsprechende Tetraamid in praktisch quantitativer Ausbeute zu schaffen.
  • Der Allylanteil der eingebrachten Carboxylgruppen lässt sich leicht durch eine Behandlung des Esters mit warmem wäss rigem NaOH entfernen. Amidbindungen sind unter derartigen Reaktionsbedingungen völlig stabil. Auf diese Weise ergibt die Hydrolyse ein Porphyrin mit doppelt so vielen Carboxylgruppen, dem eine neue Glutamatschicht oder eine zweite Generation zugegeben werden kann. Die zwei ersten Schritte des gesamten Reaktionsprozesses sind in 6 dargestellt. In Schritt 1 erfolgt die Bildung von Amidbindungen, während Schritt 2 die grundlegende basenkatalysierte Hydrolyse der Allylesterschutzgruppen betrifft. Die Reinigung der Reaktionsendprodukte kann durch Membranfiltrierung, Dialyse und Größenausschlusschromatographie erfolgen, wie sie erfolgreich zur Reinigung von "eingesperrten" Zn-Porphyrinen verwendet werden (s. Jin et al., J Chem. Soc. Chem. Commun. 1260–1262 (1993.)
  • Wie oben erwähnt, können auch andere monomere Einheiten zur Bildung von Dendrimeren genutzt werden. Diese Einheiten können geschützte funktionelle Gruppen besitzen, die sich zur Bildung von Estern oder Esterbindungen eignen, wie sie häufig in konvergenten Dendrimer-Wachstumsschemata genutzt werden und in Hawker et al. J. Am. Chem. Soc. 112:7683–7647 (1990) und J. Am. Chem. Soc. 114: 8405–8413 (1992), Wooly et. al., J. Chem. Soc. Perkin transactions 1:1059–1075 (1991), (1992) beschrieben sind.
  • Zu einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die Modifizierung der Außenschicht von dendritischem Porphyrin mit verschiedenen hydrophoben Gruppen den Schutz des Porphyrin-Kerns verbessert. Ohne einen Aspekte oder Bestandteile der Erfindung allein auf die Theorie beschränkt zu wollen, wurde daran gedacht, dass die Zugabe von oberflächenhydrophoben Gruppen zur Bildung kompakterer Strukturen in Wasserlösungen führt und dabei die Löschkonstanten von Sauerstoff erhöht. Weiterhin wurde in Betracht gezogen, dass hydrophobe Interaktionen innerhalb relativ locker gepackter Polyamid-Dendrimer ein Schrumpfen derselben zu kleineren, kugelförmigen Strukturen von hoher Dichte bewirken, was die Diffusion von Sauerstoffmolekülen zum Porphyrin-Kern verhindert oder zumindest reduziert. Wie beispielsweise in
  • 7 dargestellt, lässt sich ein wesentlicher Schutz von Porphyrin dadurch erreichen, dass ein zweischichtiges Polyglutamat-Dendrimer mit L-Leucin oberflächenmodifiziert wird. Weiters sind bei zweischichtigem Polyglutamat, das mit sechzehn 11-Aminoundecansäure-Resten modifiziert wurde, niedrigere Löschkonstanten zu beobachten (s. 8).

Claims (18)

  1. Phosphoreszierende Sonde zur Sauerstoffmessung in humanem und tierischem Gewebe, welche einen Porphyrinchromophor, welcher in der Lage ist, absorbierte Energie als phosphoreszierendes Licht freizusetzen, sowie ein Dendrimer aufweist, wobei der Porphyrinchromophor den Kern des Dendrimers enthält.
  2. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 1, wobei das Absorptionsspektrum des Chromophors starke Lichtabsorption im nahen Infrarotbereich des Spektrums zeigt, wo natürliche Gewebechromophore relativ schwache Absorption zeigen.
  3. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 1, wobei das Absorptionsspektrum des Chromophors starke Lichtabsorption zwischen etwa 600 nm bis etwa 720 nm zeigt.
  4. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 1, wobei das Absorptionsspektrum des Chromophors starke Lichtabsorption zwischen etwa 610 nm bis etwa 720 nm zeigt.
  5. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 1, wobei der Porphyrinchromophor ein funktional derivatisiertes Porphyrin aufweist.
  6. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 5, wobei das funktional derivatisierte Porphyrin folgende Formel aufweist:
    Figure 00210001
    wobei: R1 ein Wasserstoffatom oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Aryl ist; R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff sind, oder sie sind miteinander verbunden und bilden substituiertes oder unsubstituiertes Aryl; und M ist H2 oder ein Metall.
  7. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 6, wobei M ein Metall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zn, Al, Sn, Y, La, Lu, Pd, Pt und Derivaten davon ist.
  8. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 5, wobei das Porphyrin aus der Gruppe bestehend aus Tetrabenzoporphyrin, Tetranapthoporphyrin, Tetraanthraporphyrin und Derivaten davon ausgewählt ist.
  9. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 8, wobei das Metall aus der Gruppe bestehend aus Zn, Al, Sn, Y, La, Lu, Pd, Pt und Derivaten davon ausgewählt ist
  10. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 9, wobei das Derivat eine meso-tetra-phenylierte Verbindung ist.
  11. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, wobei das Metalloporphyrin Tetraphenyltetrabenzoporphyrin ist.
  12. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, wobei das Metalloporphyrin (Lu) Tetraphenyltetranapthoporphyrin ist.
  13. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, wobei das Metalloporphyrin Meso-tetra-(4-carboxylphenyl)porphyrin ist.
  14. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, welche Meso-tetraphenyltetrabenzoporphyrin ist.
  15. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, welche Meso-tetraphenyltetranapthoporphyrin ist.
  16. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 8, wobei das Porphyrin Tetrabenzoporphyrin ist.
  17. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 10, wobei das Dendrimer ein Dendrimer der ersten, zweiten, dritten, vierten oder fünften Generation ist.
  18. Phosphoreszierende Sonde nach Anspruch 17, wobei das Dendrimer dendritische Polyglutamatkäfige aufweist.
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