WO2007057182A2 - Fluoreszenz-nanopartikel - Google Patents

Abstract

Verwendung fluoreszierender Nanopartikel enthaltend einen anorganischen Kern, eine Passivierungsschicht und spezifische Liganden mit einem hydrodynamischen Durchmesser des anorganischen Kerns mit der Passivierungsschicht von nicht mehr als 15 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 10 nm, besonders bevorzugt von nicht mehr als 5 nm zur Herstellung eines in vivo Diagnostikums, wobei die Nanopartikel eine Emission von weniger als 700 nm aufweisen.

Description

"Fluoreszenz-Nanopartikel"

Die Erfindung betrifft fluoreszente Nanopartikel mit einer besonderen Eignung als in vivo Diagnostikum, insbesondere als Kontrastmittel zur Diskriminierung verschiedener Gewebetypen und nimmt die Priorität der europäischen Patentanmeldung 05 025 022.4 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.

Bei einer Vielzahl von Erkrankungen ist eine möglichst frühe und aussagekräftige Diagnose von entscheidender Bedeutung für die Wahl sowie die Abstimmung und Ausführung der notwendigen medizinischen Maßnahmen. Dies gilt vor allem für eine Vielzahl von Tumorarten, für deren Bestimmung und Therapie (einschließlich möglicher Sektionen) die Diskriminierung zwischen gesundem und carcinogenem Gewebe wesentlich ist. Demnach hängt die Genesung oder sogar das Überleben eines Pati- enten entscheidend davon ab, ob und in welcher Güte der behandelnde und/oder operierende Arzt zwischen verschiedenen Gewebetypen unterscheiden kann.

Zur Verbesserung der Diagnose und der medizinischen Maßnahmen wurden in der Vergangenheit bereits Kontrastmittel entwickelt, mit deren Hilfe Funktionen und Strukturen im Körper über bildgebende Verfahren sichtbar gemacht werden können. Diese Verfahren werden unter anderem zur gezielten Detektion krebsassoziierter Zellveränderungen verwendet.

So haben beispielsweise Hsu et al. (2004) ("A far-red fluorescent contrast agent to image epidermal growth factor receptor expression", Photochemistry and Photobio- Ogy. 79 (3): 272-279) ein molekular-spezifisches Kontrastmittel auf der Basis eines organischen Fluorophors als Marker für die frühe carcinogene Transformation entwickelt. Hierin wird die tumorassoziierte Überexpression des epidermalen Wachs- tumsfaktor-Rezeptors (EGFR, epidermal growth factor receptor) ausgenutzt, um verändertes Gewebe in der Mundhöhle über ein rot fluoreszierendes anti-EGFR-Anti- körper Konjugat (Alexa660) zu identifizieren.

Generell ist ein Nachteil organischer Fluorophore deren Metabolisierung im Körper, bei der das Fluorochrom abgebaut oder inaktiviert wird. Die Metabolisierung wirkt damit der für die Diagnostik notwendigen hohen Markierungsintensität entgegen. Mit zunehmender Verweildauer des organischen Fluorophors in vivo verschärft sich diese Problematik und stellt insbesondere bei der Markierung von Zellen in tieferen Gewebeschichten eine erhebliche Schwierigkeit dar.

Des Weiteren haben insbesondere längerwellig emittierende organische Fluorophore den Nachteil, dass sich deren Quantenausbeute durch den chemischen Konjugati- onsprozess reduziert. Zudem sind organische Fluorophore sehr anfällig gegenüber Photobleichung ("photo bleaching"), was schon nach kurzer Bestrahlung zu einem substantiellen Fluoreszenzverlust führen kann. Dadurch weist ein Kontrastmittel auf der Basis dieser Fluorophore eine zu geringe Fluoreszenzstärke und Stabilität bei längerer Anregungsdauer auf, um für die Detektion/Markierung von Zellen in tieferen Gewebeschichten geeignet zu sein ("deep tissue imaging"). So geht aus der Studie von Hsu et al. (2004) hervor, dass die Alexa660-Konjugate eine Eindringtiefe von maximal 0,5 mm aufweisen, so dass eine Detektion der Fluoreszenz nicht mehr sinnvoll möglich ist.

Eine weitere bekannte Möglichkeit zur Fluoreszenzmarkierung zellulärer Verände- rungen besteht in der Verwendung von sog. Quantum Dots (QDs), bei denen es sich um wenige Nanometer große fluoreszente Nanopartikel handelt, deren Kern aus Halbleitermaterialien wie CdSe, CdTe, InP oder ähnlichem besteht.

Die bekannten QD zeigen bei ihrer Verwendung in biologischen Systemen jedoch das sogenannte "blinking"-Phänomen, d.h. die Nanopartikel wechseln zwischen einem fluoreszenten und einem nicht-fluoreszenten Zustand. Dieses Phänomen macht die Quantum Dots insbesondere für die in vivo Anwendung untauglich. Zudem kann das "Blinken" auch einen Zerfall des Nanopartikelkems anzeigen, aufgrund dessen toxisches Cadmium in den Körper freigesetzt werden kann. Dies ist besonders nachteilig, da die Quantum Dots im Körper, so beispielsweise in der Leber oder in der Milz, akkumulieren.

Es liegt demnach der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, fluoreszente Nanopartikel bereitzustellen, die eine besondere Eignung zur Verwendung als Diagnostikum, insbesondere als Kontrastmittel in vivo aufweisen.

Diese Aufgabe wird gemäß dem Hauptanspruch gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprϋche bzw. separater Nebenansprüche. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können sowohl in vitro als auch in vivo zur spezifischen Markierung ausgewählter biologischer Strukturen oder Funktionen eingesetzt werden. Insbesondere können die hier ausgewählten Nanopartikel als in vivo Kon- trastmittel zur Unterstützung medizinischer Eingriffe, vor allem chirurgischer Eingriffe, dienen.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel umfassen mindestens drei Strukturen, nämlich einen anorganischen Kern, der mit einer Passivierungsschicht ummantelt wird, die dann ihrerseits spezifische Liganden trägt, wobei die spezifischen Liganden auch Teil der Passivierungsschicht sein können. Diese führen zu der spezifischen Bindung des Nanopartikels an das Zielmolekül („target") des biologischen Systems. Der anorganische Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel mit der ihn ungebenden Passivierungsschicht weist einen hydrodynamischen Durchmesser von nicht mehr als 15, vorzugsweise nicht mehr als 10 nm auf. Besonders bevorzugt sind thermodynami- sche Durchmesser von nicht mehr als 8 nm oder nicht mehr als 5 nm.

Der Passivierungsschicht kommt vor allem die Aufgabe zu, die Fluoreszenzintensität sowie die chemische und physikalische Stabilität des anorganischen Kerns zu erhö- hen. Die mit der Passivierungsschicht ummantelten anorganischen Kerne sind gekennzeichnet durch eine Quantenausbeute von mindestens 10 %, vorteilhafterweise mindestens 30, 50 oder sogar 70 %. Als Quantenausbeute wird dabei das Verhältnis der Menge des von einer Probe emittierten Lichts zu der Menge des von der Probe absorbierten Lichts verstanden. Die Passivierungsschicht weist vorteilhafterweise eine Dicke von nicht mehr als 1 nm auf. Der Durchmesser des passivierten Kerns erhöht sich in diesem Fall um nicht mehr als 2 nm.

Vorteilhafterweise werden die Nanopartikel jeweils noch mit Modifikatoren, insbesondere zur Verbesserung der Kompatibilität mit der biologischen Umgebung versehen. Die Zunahme des hydrodynamischen Radius durch die Verwendung von Modifikatoren überschreitet vorzugsweise 2 nm nicht. Die Dicke der Passivierungsschicht und der Modifikatoren hängt im Einzelfall auch von den Verhältnissen beider Strukturen untereinander und im Verhältnis auf den anorganischen Kern ab.

Aufgrund der Größenbeschränkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen sie eine besondere Eignung zur Verwendung als Diagnostikum im lebenden Patienten auf. So wird durch die Größenreduktion eine Erhöhung der Diffusionsgeschwindigkeit und der Eindringtiefe in das Gewebe erreicht. Dies erlaubt eine gleichmäßige und schnelle Ausbreitung der Nanopartikel in der biologischen Umgebung sowie eine möglichst weitgehende Durchdringung eines Gewebes (z.B. eines Tumors) nach einer lokalen Applikation. Ebenso erlauben die erfindungsgemäßen Nanopartikel eine systemische Applikation, die auch über eine Injektion erfolgen kann. Die lokale Applikation, z.B. eine topische Applikation oder eine intra- bzw. peritumorale Applikation bei der Behandlung von Tumoren ist aber bevorzugt.

Besonders vorteilhafte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen einen hydrodynamischen Durchmesser von nicht mehr als 8, besonders bevorzugt von nicht mehr als 4 nm auf. Nanopartikel dieser Größenordnung können bereits über die Niere ausgeschieden werden, so dass sie nicht oder deutlich weniger im Körper akkumulieren. Somit vermindern die erfindungsgemäßen Nanopartikel das mit den bekannten Quantum Dots voraussichtlich verbundene Problem der Langzeittoxizität erheblich. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform emittieren die erfindungsgemäßen Nanopartikel ein Fluoreszenzspektrum zwischen 600 und 700 nm, besonders bevorzugt von 600 bis 650 nm, insbesondere bevorzugt 620 bis 650 nm. Dieses Emmissi- onspektrum hat den Vorteil der möglichst hohen Gewebetransmission aufgrund einer nur geringen Absorption durch Hämoglobin und anderer lichtabsorbierende Substanzen im lebenden System (einschließlich Wasser). Licht dieser Wellenlängen ist für das menschliche Auge noch wahrnehmbar, so dass die Identifizierung des markierten Gewebes durch den behandelnden Arzt ohne weitere aufwändige technische Hilfsmittel zur Detektion (z.B. CCD-Kameras) möglich ist. Dies ist insbesondere bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel als Kontrastmittel während eines chirurgischen Eingriffs zur Diskriminierung des (beispielsweise) carcinogenen und gesunden Gewebes vorteilhaft.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäß einsetzbaren Nanopartikeln um bekannte Nanopartikel mit einem Kern beispielsweise aus CdSe, CdS oder CdTe, wie sie z.B. in der US 2004/0247861 unter Bezugnahme auf wissenschaftliche Publikationen beschrieben werden (siehe Absatz [0006]). In dieser Druckschrift wird auch auf Dokumente zur Herstellung der Kernmaterialien verwiesen (siehe [0007]), so z.B. auf die US 6,179,912. Diese Dokumente werden zur Offenba- rung der Eigenschaften dieser bekannten Nanopartikel sowie deren Herstellung vollumfänglich in Bezug genommen.

Es ist von besonderem Vorteil, wenn der anorganische Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel im wesentlichen aus Halbleitern besteht. Diese Kerne emittieren je nach ihrer individuellen Größe und/oder Zusammensetzung Licht in verschiedenen Farben, absorbieren aber alle breitbandig im selben Bereich des Lichtspektrums (UV bis VIS Bereich). Die Anregungs- und Emissionsspektren liegen aufgrund des hohen „Stokes shift" weit auseinander, was eine einfache und gleichzeitige Anregung verschiedener Quantum Dots ermöglicht. Sie weisen schmale und symmetrische Emis- sionsspektren auf, die sich nicht bzw. nur geringfügig überlappen. Weitere positive Eigenschaften, die insbesondere für die verbesserte Eindringtiefe und die in vivo Markierung von großer Bedeutung sind, stellen die hohe Quantenausbeute von bis zu 80% und die hohe Photostabilität dar.

Quantum Dots, die den anorganischen Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel darstellen können, sind aus der WO2005/001889 bekannt. Danach handelt es sich um einen anorganischen Kern aus einer Legierung aus mindestens zwei Halbleitern, die entweder homogen verteilt sind oder aber für die innerhalb der Legierung jeweils ein Konzentrationsgradient vorliegt. Hinsichtlich der Offenbarung der Beschaffenheit und der Herstellung dieser Quantum Dots wird auf oben zitierte WO2005/001889 verwiesen. Die Kerne können in ihrer Größe um jeweils 5 % abweichen.

Demnach kann der anorganische Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel eine Legierung aus mindestens zwei Halbleitern umfassen, wobei der Kern eine homogene Zusammensetzung aufweist und durch eine „Band-Gap-Energie" charakterisiert ist, die nicht-linear zu dem molaren Verhältnis der zwei Halbleiter ist.

Alternativ kann der Kern nicht-homogen beschaffen sein, wobei die Konzentration des ersten Halbleiters graduell ansteigt ausgehend vom Zentrum des Kerns bis zur Oberfläche des Kerns und die Konzentration des zweiten Halbleiters graduell ab- nimmt vom Zentrum des Kerns bis zu dessen Oberfläche.

Es gilt für beide Kerne gleichermaßen, dass mindestens einer der Halbleiter ein Gruppe Il-Gruppe Vl-Halbleiter oder ein Gruppe Ill-Gruppe V-Halbleiter ist (die Gruppendefinition korrespondiert mit den Gruppen des Periodensystems der Elemente). Die Legierung kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe folgender Legierungen: CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, InGaP, GaAIAs, InGaN. Diese Kerne können zudem eine Beschichtung aus anorganischem Material wie z.B. Halbleitern (z.B. ZnS) tragen. Diese zusätzliche Schicht ist dem Fachmann als "capping" oder "shell" bekannt.

Gruppe Il-Gruppe VI und Gruppe Ill-Gruppe V Halbleiter sind allgemein bekannt und beinhalten z.B. CdSi_-xSe_x, CdSi_-xTe_x, CdSei_-xTe_x, ZnSe-ι_-xTe_x, Zni_-xCd_xTe, Cdi. _xHg_xS, Cdi_-xHg_xTe, lni_-xGa_xAs, Gai_-xAl_xAs und lni_-xGa_xP. Vorzugsweise werden die Halbleiter CdSei_-xTe_x, CdSi_-xTe_x> ZnSe_1-xTe_x, Zni_-xCd_xTe, Cd_1-xHg_xS, Cd_1-xHg_xTe, lni_-xGa_xAs, ln-ι_-xGa_xP verwendet, wobei x eine Fraktion von 0 bis 1 ist.

Das molare Verhältnis der Halbleiter kann jedes molare Verhältnis annehmen. Allerdings ist in dem Fall, dass die Legierung CdSSe umfasst, eine Legierung mit der molekularen Formulierung CdSi_-xSe_x bevorzugt. In dem Fall, dass die Legierung CdSTe umfasst, ist eine Legierung mit der molekularen Formulierung CdSi_-xTe_x bevorzugt. In dem Fall, dass die Legierung ZnSeTe umfasst, ist eine Legierung mit der molekularen Formulierung ZnSe-ι_-xTe_x bevorzugt. In dem Fall, dass die Legierung ZnCdTe umfasst, ist eine Legierung mit der molekularen Formulierung allein aus CdTe bevorzugt. In diesen Angaben ist x jeweils eine Fraktion zwischen 0 und 1.

Diese bevorzugten anorganischen Kerne der erfindungsgemäßen Nanopartikel kön- nen mit folgenden Schritten hergestellt werden: (i) die Herstellung einer ersten Lösung unter Bedingungen, die die Bildung von Nanokristallen ermöglichen, (ii) Herstellung einer zweiten Lösung, die eine Vorstufe der Halbleiter umfasst mit einem molaren Verhältnis unter einer Bedingung, welche keine Bildung von Nanokristallen ermöglicht, (iii) Zugabe der zweiten Lösung zur ersten Lösung, die eine Bildung von Nanopartikeln ermöglicht, und (iv) Veränderung der Bedingungen, die das Wachstum der Nanokristalle und ihrer Bildung anhalten/stoppen. Das Verfahren zur Herstellung der Kerne wird in der WO 2005/001889 dargestellt, auf die hinsichtlich der Offenbarung der Herstellung dieser bevorzugten Ausführungsform des anorganischen Kerns der erfindungsgemäßen Nanopartikel Bezug genommen wird.

In einer alternativen Ausführungsform kann der anorganische Kern im Wesentlichen aus einem Edelmetallcluster bestehen, der vorzugsweise 2 und 27 Edelmetall-Atome umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Edelmetall aus einer Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Osmium, Iridium, Ru- thenium und Rhodium ausgewählt. Das Cluster kann variierende Ladungen aufweisen. Diese Kerne haben den Vorteil, dass sie aufgrund ihrer starken Absorption und Emission leicht als einzelne sogenannte "Nanodots" mit einer schwachen Quecksilber-Lampen-Anregung detektierbar sind. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel mit diesen Kernen sind vorteilhaft als fluoreszentes Einzelmolekül- und Massenlabel zu verwenden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Edelmetall" auf eine Elementengruppe ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Gold, Silber und Kupfer und der Gruppe der Platinmetalle (PGM) Platin, Palladium, Osmium, Iridium, Ruthenium und Rhodium. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Edelmetalle aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber und Kupfer ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Edelmetall Silber oder Gold.

Der Begriff „Cluster" bezieht sich auf eine Verbindung von 2-27 Atomen eines Metalls. Cluster sind u. a. aus den Bereichen der chemische Katalyse, der Keramik, der Halbleitertechnologie und der Materialwissenschaften bekannt. Ihre Herstellung ist dem Fachmann daher geläufig. Die WO2004/003558 beschreibt u.a. die Herstellung von Edelmetallclustern und enthält darüber hinaus umfangreiche weiterführende Lite- raturangaben dazu. Insbesondere ist die Herstellung von Edelmetall-Nanoclustem offenbart, die mit organischen Molekülen assoziiert sind. Der Begriff Assoziation ist dabei zu verstehen als jede Form der Bindung unabhängig von der chemischen oder physikalischen Natur der Bindung (so z.B. kovalente, nicht-kovalente, elektrostatische oder van-der-Waals-Bindung). Hinsichtlich der Herstellung der Nanocluster als Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel wird auf die WO2004/003558 in Bezug genommen.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen eine Passivierungsschicht auf, die die Fluoreszenzintensität erhöht und die chemische und physikalische Stabilität des an- organischen Kerns verbessert. Damit emittieren die Nanopartikel Licht vorzugsweise mit einer Quantenausbeute von mehr als 10 %, vorzugsweise von mehr als 50 %. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen in wässriger Umgebung bei 4 °C vorzugsweise eine Lagerstabilität von mindestens 12 Monaten auf und sind vorzugsweise über einen pH-Bereich von pH 5 bis pH 10 stabil, d.h., sie zeigen Abweichungen von weniger als 50 % in Bezug auf ihre spezifischen spektralen Charakteristika wie Quantenausbeute, Lage des Emissionsmaximums, Halbwertsbreite des Emissionsspektrums. Bevorzugte Partikel zeigen Abweichungen von weniger als 10 % in Bezug auf diese spezifischen spektralen Charakteristika.

Auch zeigen sie unter biologischen Bedingungen bzw. in vivo für einen Zeitraum von mindestens drei Tagen im wesentlichen eine Konstanz/Stabilität der Eigenschaften des Kerns (einschließlich der ihn umgebenden Passivierungsschicht). Bevorzugte Partikel zeigen eine derartige Konstanz/Stabilität für einen Zeitraum von 7 bis 14 Tagen bis hin zu mehreren Wochen, wobei als Konstanz im Sinne der Erfindung eine Abweichung/Veränderung einiger oder aller der oben genannten Eigenschaften um 50 % verstanden wird. Besonders bevorzugte Partikel zeigen eine Abweichung/Veränderung kleiner als 10 %.

Die Passivierungsschicht enthält mindestens eine Verbindung, die in der Lage ist, Metallatome oder Metallionen, z.B. Zink-, Quecksilber- oder Cadmiumionen zu koor- dinieren. Diese Verbindung kann eine Lewis-Base oder eine cyclisch oder linear ungesättigte Verbindung mit resonanten Elektronen sein. Als cyclisch ungesättigte Verbindung kann sie auch ein Heterozyklus bzw. ein Heteroaromat sein. Die ungesättigte oder konjugierte Gruppe befindet sich in einer bevorzugten Ausführungsform in einer terminalen Position bezogen auf die Struktur des Moleküls. Weiterhin kann die Passivierungsschicht einen Quervemetzer aufweisen oder die cyclisch oder linear ungesättigte Verbindung kann auch als Quervemetzer fungieren.

Die Metallatome oder Metallionen koordinierenden Verbindungen können funktional durch Chelatisierung, Koordination oder Elektronen-Donor-Eigenschaften von Lewis- Basen an fluoreszente anorganische Kerne binden und entsprechend konjugierte

Anteile/Gruppen aufweisen. Diese Moleküle können zudem Anteile enthalten, die den Kernen, die mit ihnen beschichtet sind, in wässrigen Lösungen Löslichkeit oder Benetzbarkeit vermitteln.

Diese Moleküle oder Verbindungen können ein homogenes oder heterogenes (hete- rocyclisches) Ringsystem mit ein, zwei oder mehr gebundenen (oder auch kondensierten) Ringen beeinhalten. Bevorzugte heteroaromatische Systeme sind z.B. Thia- zole, Thiazolderivate, Oxazole, Oxazolderivate, Pyrrole, Pyrrolderivate einschließlich dotierter oder nicht-dotierter Polypyrrol-Oligomere, Thiophene, Thiophenderivate einschließlich dotierter und nicht-dotierter Polythiophene, Furane, Furanderivate, Pyridin und -derivate, Pyrimidin und seine Derivate, Pyrazine, Pyrazinderivate, Triazin und - derivate, Triazole, Triazolderivate, Phthalocyanine und -derivate, Porphyrin und Porphyrinderivate. Diese Verbindungen können ungesättigte (olefinische) Kohlenwasserstoffe oder deren Amine, Phosphor- oder Sauerstoffderivate beinhalten, die Acetylen, Propin und Allen mit einschließen können, aber nicht auf diese begrenzt sind. Es ist zu bevorzugen, dass das Molekül eine ausreichende p oder pi-Elektro- nen-Dichte aufweist, um sich an der Adduktbildung oder der Resonanz auf der Oberfläche des Halbleiter-Kerns zu beteiligen.

Die heteroaromatische Verbindung ist vorzugsweise eine Imidazol-Komponente. Vorzugsweise wird weiterhin als Quervernetzer eine Alkylphosphin-Verbindung zugesetzt.

Mit dem Begriff „Imidazol-Komponente" wird im Sinne dieser Beschreibung ein heterozyklisches oder heteroaromatisches Molekül verstanden, das mindestens eine Imi- dazol-Gruppe (einschließlich Imidazol-Derivate) enthält, und das für die Bindung des anorganischen Kerns oder der Passivierungsschicht mit einem Metall wie Cadmium, Zink, Gallium oder einem Metallkation oder einem Substrat, das ein solches Kation enthält, zur Verfügung steht. In diesem Zusammenhang sollte vorzugsweise mindestens eine Imidazol-Gruppe in einer terminalen Position bezogen auf die Struktur des Moleküls sein. Die Imidazol-Komponente bindet in ihrer funktionellen Form über den Ring, der delokalisierte Molekülorbitale enthält, an den fluoreszenten Na- nokristall. Gewöhnlich dienen die Stickstoffe des Imidazolrings als koordinierende Liganden, um in funktioneller Weise ein Metall-Ion wie Cadmium oder Zink zu binden.

In einer Ausführungsform umfasst die Imidazol-Komponente reaktive funktionelle Gruppen wie eine oder zwei Aminosäure(n), z.B. Histidin, Camosin, Anserin, Baiein, Homocamosin, Histidylphenylalanin, cyklo-Histidylphenylalanin, 5-amino-4-lmidazol- carboxamid, Histidylleucin, 2-Mercaptoimidazol, boc-Histidin, Hydrazid, Histinol, 1- Methylhistidin, 3-Methylhistidin, Imidazolysin, Imidazol-enthaltendes Ornithin (z. B. 5- Methylimidazol), Imidazol-enthaltendes Alanin (z. B. (beta)-(2-lmidazolyl)-L(alpha) Alanin), Carzinin, Histamin. Diese auf Histidin basierenden Moleküle oder Imidazol- haltige Aminosäuren können nach allgemein bekannten Methoden synthetisiert werden.

Unter dem Begriff „Alkylphosphin" wird im Sinne der Erfindung ein Molekül verstan- den, das mindestens eine Phosphingruppe (einschließlich ihrer Derivate) für die Bindung oder das Chelatisieren eines Nichtmetalls wie Se, S oder anderer Nichtmetalle aufweist oder von Substraten, die solche Atome enthalten und das mindestens eine funktionelle Gruppe (z.B. Hydroxyl-, Amino-, Thiol-, Carboxyl-, Carboxamid- etc.) zur Reaktion mit benachbarten Molekülen bereitstellt.

Vorzugsweise sollte mindestens eine Phosphin-Gruppierung in einer terminalen Position bezogen auf die Struktur des Moleküls lokalisiert sein. Die Phosphin-Anteile dienen als koordinierende Liganden, um in funktionaler Form mit einem fluoreszenten Kern oder einer Verbindung aus der abschirmenden Schicht ein Nichtmetall oder Ion wie Se oder S zu binden.

In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Alkylphosphin-haltige Verbindung eine, zwei oder mehrere miteinander (z.B. in polymerer Form) gekoppelte Phosphin-Gruppen, die Hydroxymethylphosphin-Verbindungen oder ähnliches mit einschließen können, aber nicht auf diese begrenzt sind. Alkylphosphin-enthaltende Verbindungen können nach allgemein bekannten Methoden synthetisiert werden. Wie weiterhin bekannt ist, können Alkylphosphin-haltige Verbindungen außerdem eine oder mehrere zusätzliche funktionelle Gruppen (z.B. Hydroxyl-, Amino-, Thiol-, Carboxyl-, Carboxamid- etc.) aufweisen. Beispiele für Derivate sind Hydroxy- methlyphosphinderivate, Amide oder Ester, sofern die Derivatisierung mit den hier beschriebenen Funktionen des Alkylphosphins als Coating vereinbar ist.

Besonders bevorzugt sind Tris-(hydroxymethyl-)phosphin und ß-[Tris-(hydroxy- methyl)phosphino-]propansäure, um die fluoreszenten anorganischen Kerne der erfindungsgemäßen Nanopartikel zu beschichten. Allgemein bekannt ist, dass quervernetzte Alkylphosphin-haltige Verbindungen zusätzlich die Möglichkeit haben, funktio- nal an Metallatom und/oder -ionen wie Zn oder Cd zu binden. In dieser Hinsicht funktionalisierte Isocyanate oder Alkylcyanoacrylate können weiterhin als Querver- netzer für Liganden und Adduktbildung mit fluoreszenten Kernen nützlich sein.

Dem passivierenden Effekt der erfindungsgemäß vorhandenen Passivierungsschicht liegt das Abschirmen von oberflächlichen Cadmium- oder Zinkatomen oder ähnlichem durch die Komplexierung mit dem Heteroaromaten oder Heterozyklus (vorzugsweise mit der Imidazol-Komonente) und das Abschirmen der Gegenatome (Se oder S oder Ähnliches) über die Komplexierung mit den Alkylphosphin-haltigen Verbindungen zugrunde.

Die Passivierungsschicht der erfindungsgemäßen Nanopartikel ist aus der US 2004/0247861 A1 bekannt. In dieser Offenlegungsschrift wird die Herstellung von mit der Passivierungsschicht ummantelten anorganischen Kernen, zum Beispiel von Quantum Dots beschrieben. Zu Zwecken der Offenbarung der Herstellung der erfin- dungsgemäß eingesetzte Passivierungsschicht und der damit ummantelten anorganischen Kerne wird die US 2004/0247861 daher in Bezug genommen.

Die Moleküle der Passivierungsschicht können weiterhin chemische Gruppen aufweisen oder tragen, um Zielmoleküle und Zellen zu binden und querzuvernetzen (spezifische Liganden). In der Gegenwart entsprechend passender Reagenzien wie ZnSO₄ und Na2S können diese Moleküle oder Verbindungen mit den Molekülen auf dem fluoreszenten Kern eine Passivierungsschicht bilden ("capping" oder "shell"). Diese Reagentien können auch an Atome oder Ionen auf der Oberfläche des fluo- reszenten Nanokristalls funktional binden, so dass diese zusätzliche Passivierungs- schicht auch unmittelbar auf der Oberfläche des Kerns ausgebildet sein kann.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können in einer vorteilhaften Ausführungsform zusätzlich Modifikatoren aufweisen, die aus organischen und/oder anorganischen Anteilen bestehen können. Sie dienen der verbesserten Kompatibilität, Effektivität und/oder Löslichkeit der Nanopartikel in einer Flüssigkeit oder einem Suspensionsmedium insbesondere in der physiologischen Umgebung. Diese Oberflächenmodifi- kation ist vor allem vorteilhaft, um eine möglichst geringe unspezifische Adsorption und eine erhöhte Verträglichkeit in biologischen Systemen, insbesondere im menschlichen Körper, zu erreichen.

Eine Möglichkeit ist die Modifikation der Oberfläche mit dem für bestimmte medizini- sehe Anwendungen bereits zugelassenen Polyethylenglykol (PEG), insbesondere in niedermolekularen Formen, um eine geringe Gesamtgröße des Nanopartikels beizubehalten. Dies kann sowohl die Biokompatibilität der Nanopartikel sowie deren Blutzirkulationszeit und auch die Aufnahmeeffizienz in Zellen erhöhen. Durch die Kombination einer niedermolekularen PEG-Schicht mit weiteren Substanzen wie Vitaminen wie z.B. Folsäure, kann eine geringere Aufnahme der Nanopartikel in Makrophagen erzielt werden, da aufgrund der damit reduzierten Proteinadsorption an den Nano- partikeln eine Erkennung der Nanopartikel durch das Immunsystem erschwert wird.

Die Beschichtung mit Monosacchariden, Di- oder Trisacchariden bis hin zu nieder- molekularen Polysacchariden aus einem oder verschiedenen Monosacchariden stellt eine weitere Möglichkeit der vorteilhaften Oberflächenmodifikation durch Verwendung von Modifikatoren dar. Als eine Ausführungsart ist eine Modifikation mit z.B. Polyglucose möglich, in der Dextran eingesetzt werden kann, welches als Blutersatzstoff medizinisch zugelassen ist. Es zeigt eine gute Biokompatibilität/Verträglichkeit. Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung von stereoisomeren Formen (D- /L-) der Saccharide, um einer möglichen Degradation entgegenzuwirken. Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung von biologisch kompatiblen hydrophilen Vitaminen als Modifikatoren wie z.B. Thiamin, Riboflavin, Niacin, Pyrido- xin, Cobalamin, Panthothensäure, Ascorbinsäure und Folsäure. So kann z.B. Folsäure zu einer bevorzugten Bindung von Nanopartikeln an Krebszellen führen. Die- ses Vitamin zeigt nur eine geringe Immunogenität und somit eine hohe Biokompatibilität. Durch die Bindung an den membranständigen Folsäurerezeptor wird eine Inter- nalisierung der Nanopartikel erleichtert.

Die Oberflächenmodifikation mit lipophilen Vitaminen wie Retinol, Cholecalciferol, Tocopherol und Phyllochinon ist ebenso möglich. So kann z.B. Vitamin E zu einer erhöhten zellulären Aufnahme von Nanopartikeln führen.

Fettsäuren, wie z.B. 1-Oktadecene oder 18-Methyleicosanoidsäure und deren Derivate, können die Löslichkeit und Stabilität der Kolloide erhöhen und verfügen über eine terminale funktionelle Carboxylgruppe, die zur nachfolgenden Bindung spezifischer Liganden genutzt werden kann. Daher ist es sinnvoll, Fettsäuren als Modifikatoren mit aufzunehmen.

Eine weitere Ausführungsform der Oberflächenmodifikation ist eine Beschichtung mit Polyalkoholen, wie z.B. Diethylenglykol (DEG), die besonders gut unspezifische Proteinadsorption reduzieren können. Gleiches gilt für Polytetrafluoroethylen (PTFE, Teflon), insbesondere in seinen niedermolekularen Formen, aufgrund derer eine reduzierte Proteinadsorption erreicht werden kann. Polytetrafluoroethylen wird häufig in kardiochirurgischen Applikationen eingesetzt.

Eine Oberflächenmodifikation kann ebenfalls mit einer oder mehreren natürlich vorkommenden Aminosäuren, zu denen sowohl die proteinogenen als auch nicht-proteinogenen Aminosäuren zählen, sowie synthetischen Aminosäuren vorgenommen werden. Dabei können beide Stereoisomere (D- und L-Formen) verwendet werden. Di-, Tri-, Tetra- bis hin zu kleinen Polypeptiden aus den oben genannten Aminosäuren stimulieren kaum das Immunsystem und sind somit ebenfalls für eine dünne Kompatibilitätsschicht geeignet. Dabei kann es sich um künstliche Aminosäurese- quenzen als auch Sequenzen aus biologischen Proteinen handeln. Peptidabkömm- linge von natürlichen Proteinen wie z.B. des Phytochelatins können ebenfalls zur Oberflächenmodifikation verwendet werden. Eine Oberflächenmodifikation mit Tat- Peptid und Tat-Peptid enthaltenden Peptiden ist eine weitere Möglichkeit, Nanoparti- kel für den Einsatz in biomedizinischen Applikationen verfügbar zu machen. Das Tat- Peptid ist ein effektives Molekül, um z.B. Goldnanopartikel durch die Zellmembran bis in den Kern zu bringen.

Eine weitere Ausführungsform der möglichen Modifikatoren ist die Ausbildung einer Phosphorylcholin-Beschichtung. Phosphorylcholin reduziert eine mögliche unspezifische Proteinadsorption, wie z.B. auf Kontaktlinsen. Eine Phophorylcholin-Modifika- tion kann aufgrund der nicht-thrombogenen Eigenschaften gut in biologischen Systemen eingesetzt werden und zeichnet sich durch eine hohe Langzeitstabilität aus.

Da Polylactat biokompatibel ist, wird diese Substanz in vielfältigen medizinischen Anwendungen eingesetzt. Insbesondere niedermolekulare Formen des Polylactats sind eine weitere Möglichkeit der Oberflächenmodifikation der erfindungsgemäßen Nanopartikel. Dabei können beide Stereoisomere (D-/L-Form) eingesetzt werden, um eine mögliche Biodegradation zu reduzieren.

Neben den genannten Oberflächenmodifikationen ist eine proteolytisch spaltbare Bindung von unspezifischen Proteinen an die Nanopartikel möglich. Dies kann eine Erhöhung der Biokompatibilität/Verträglichkeit bewirken. Am Zielort kann eine Abspaltung des großen Proteins erfolgen unter Freisetzung der kleinen Nanopartikel im Gewebe. Ebenso kann die Abspaltung nach entsprechender Verweildauer erfolgen. Dazu eignen sich bevorzugt weit verbreitete Proteine wie z.B. Transferrin, Lactofer- rin, Ceruloplasmin, Elastin und Albumin neben anderen Proteinen, die eine unspezifische Adsorption reduzieren. So kann z.B. eine Oberflächenbeschichtung aus Kombinationen von Polypeptiden mit Elastin unerwünschte Thrombenbildung verhindern und somit die Biokompatibilität der Nanopartikel erhöhen. Das Hauptserumprotein Albumin kann nichtspezifische Interaktionen mit Plasmamembranen reduzieren. Desweiteren behält das entsprechend modifizierte Nanopar- tikel die Fähigkeit, spezifische Interaktionen mit Zielzellen durch gleichzeitige Bindung eines spezifischen Liganden an der Partikeloberfläche auszubilden. Eine Be- Schichtung mit Serumalbumin kann zu einer wesentlich längeren Blutzirkulationszeit durch die Verhinderung einer schnellen Aufnahme durch Makrophagen nach intravenöser Gabe führen als dies bei unbeschichteten Nanopartikeln der Fall ist.

Neben den oben skizzierten unspezifischen Beschichtungen tragen die erfindungs- gemäßen Nanopartikel eine selektive Markierung mit Zielzeil-spezifischen Liganden, beispielsweise sind sie konjugiert mit Proteinen, Antikörpern, Peptiden oder, besonders bevorzugt, mit kleinen, hochaffinen Proteindomänen, Antikörperfragmenten oder anderen organischen Molekülen, die z.B. an Tumorzeil-spezifische Strukturen oder andere Targets binden.

Die Kombination aus reduziertem hydrodynamischen Durchmesser, der zu der erwähnten höheren Diffusions- und Perfusionsgeschwindigkeit führt, zusammen mit den bereits beschriebenen Eigenschaften und Verbesserungen und der hohen Fluoreszenzintensität vor allem im sichtbaren roten Bereich des Lichts macht die erfin- dungsgemäßen Nanopartikel zu einem einfachen, vielfältig einsetzbaren Diagnosti- kum für eine selektive und genaue Diskriminierung von Gewebeformen in vivo. Diese Möglichkeiten in Kombination mit gewebespezifischen Biomarkern dienen vor allem der Unterscheidung von abnormem, (prä-)carcinogenem zu normalem Gewebe, was während eines operativen Eingriffes eine visuelle Beurteilung zur präzise- ren Tumorresektion unterstützt. Die hierbei einsetzbaren erfindungsgemäßen Nanopartikel dienen somit als Kontrastmittel.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Nanopartikel entweder als in vitro oder in vivo Diagnostikum, Theranostikum und oder Therapeutikum eingesetzt wer- den. Dazu können sie lokal (z.B. intratumoral, intramuskulös oder in operativ zugängliche Gewebe/Organe) oder aber auch systemisch (z.B. intravenös) verabreicht werden. Die lokale/topische Verabreichung kann als Flüssigkeit, Sprühlösung, Gel, Schaum, Creme, Wirkpflaster vorgesehen sein. Dies kann insbesondere bei der Behandlung/der Diagnose von Hohlorganen bevorzugt sein. Auch ist eine orale Einnahme z.B. als Saft oder in Form von Tabletten oder Kapseln möglich. Gleichermaßen ist eine Inhalation (z.B. Spray) möglich. Eine anale Applikation ist über Zäpfchen vorgesehen. In einer Variante können die Nanopartikel in Depotform implantiert werden. Der Begriff „Diagnostikum" wird im Kontext der vorliegenden Erfindung als Synonym zu „Kontrastmittel" verwendet, d.h. es dient der diskriminierenden Darstellung morphologischer oder funktioneller Strukturen in biologischen Systemen, insbesondere im lebenden Menschen, zur Unterstützung eines medizinischen Eingriffs.

Die Nanopartikel können als Diagnostikum vor allem bei chirurgischen Eingriffen eingesetzt werden. Ebenso können sie bei minimal-invasiven Verfahren (z.B. Endoskopie, Laparoskopie) verwendet werden. Sinnvoll ist eine Kombination mit bildgebenden Verfahren wie PET, MRT, CT etc.

Wie bereits oben ausgeführt, ist die erfindungsgemäße Verwendung in der Form der lokalen Applikation von besonderem Vorteil. Die bei der lokalen Applikation eingesetzte Cd-Menge überschreitet dabei vorteilhafterweise nicht ein Zehntel der Gesamtbelastung, die im Laufe des Lebens üblicherweise in der Leber und Niere eines Menschen in fortgeschrittenem Lebensalter und gewöhnlicher Lebensweise ohnehin akkumulieren. Die Gesamtbelastung dieser Organe liegt bei etwa 18 mg (Saturag et al 2000; „British Journal of Nutrition; 2000, (84), 791-802). Vorteilhafterweise wird demnach bei der lokalen Applikation die Menge an Nanopartikeln so begrenzt, dass die zugeführte Cd-Menge den Wert von 2 mg zumindest nicht wesentlich über- schreitet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Tumorvisualisierung bereits mit einer Menge an Kontrastmittel möglich, die eine Gesamtmenge von 0,6 mg, besonders bevorzugt 0,2 mg Cadmium nicht überschreitet.

Der besondere Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass damit die Verwen- düng der Nanopartikel in der medizinischen Anwendung am lebenden Menschen erst möglich wird, da diese anderenfalls - d.h. als systemischen Gabe - aufgrund der damit verbundenen Toxizität ausgeschlossen ist. Die lokale Applikation reduziert nämlich die für die ausreichende Darstellung erforderliche Dosis der Nanopartikel.

Es hat sich herausgestellt, dass das Cd-haltige Kontrastmittel erfindungsgemäß zur Visualisierung eines Tumors in vivo vorteilhafterweise in einer Dosis eingesetzt wird, die einer Menge von 0,002 bis 0,02 mg Cd pro cm³ Tumorgewebe entspricht. Besonders vorteilhaft sind Dosierungen des Kontrastmittels von 0,002 bis 0,015 mg Cd/cm³ Tumorgewebe, insbesondere zwischen 0,002 und 0,010 mg Cd/cm³. Mit dieser vorteilhaften Dosierung lassen sich Tumoren mit einem Volumen bis zu etwa 150 cm³ in vivo visualisieren, ohne damit die für den Menschen üblicherweise akzeptable Belastungsobergrenze zu überschreiten.

Gegenstand der Untersuchungen können alle zugänglichen Gewebe/Organe des Patienten sein, vor allem die Haut, Hohlorgane (z.B. im Gastrointestinal-, Urogenital-, Respirationstrakt) oder auch äußerlich zugängliche Bereiche der Sinnesorgane und auch das kardiovaskuläre System.

Auch ist der Einsatz als in vitro Diagnostikum möglich, so z.B. die Immunhistochemie oder FACS sowie ELISA. Besonders vorteilhaft ist eine Kombination von in vivo und in vitro Diagnostik (z.B. Biopsie-Material).

Sofern die Nanopartikel erfindungsgemäß zu Zwecken der Therapie eingesetzt werden, können zumindest einige der Liganden des Nanopartikels Effektormoleküle oder Wirkstoffe tragen, d.h. Effektoren darstellen. Dabei ist ein Effektor ein Ligand mit einer ausgewählten Funktion. Vorteilhafterweise trägt der Nanopartikel sowohl spezifische Liganden zur gezielten Lokalisierung des Nanopartikels im Körper bzw. im Gewebe als auch einen Liganden mit Effektormolekül.

Der Effektor kann an dem Nanopartikel gebunden bleiben oder abspaltbar bzw. ab- lösbar oder freisetzbar sein. Der Effektor kann beispielsweise seine Funktion ausüben über eine Aktivierung/Inaktivierung eines Rezeptors, eine Maskierung von (Oberflächen-)strukturen, die Aktivierung des Immunsystems („Priming"), die Modu- lation von Signalwegen, die Aktivierung oder Deaktivierung eines Enzyms, die Gentherapie (z.B. durch zielgerichtete Lieferung von Plasmiden oder siRNA ), die zielgerichtete Lieferung von Toxinen/Chemotherapeutika/Zytostatika oder die stimulierende Wirkung auf z.B. Stoffwechsel, Hormonbildung u.a.. Auch ist der Schutz von Zellen z.B. Insulinproduzierender B-Zellen möglich.

1. Methoden a) Herstellung eines BP619-Neutravidin-Konjugat mit gebundenem biotinylier- ten monoklonalen Antikörper

Chemikalien und Materialien

Nanopartikel

BP619 200 μg/ml Bei den BP619 oder BP 617 Nanopartikel handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nanopartikel, d.h. er weist einen CdS_xS_e-Kern ("Alloy Kern") und eine Passi- vierungsschicht gemäß der US 2004/0247861 A1 auf.

Protein Aufgereinigtes Protein liegt in Phosphat-NaCI-Puffer vor (Lagerung bei -80⁰C)

MES-Puffersubstanz (Sigma), NaCI, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, EDC (1-Ethyl-3-[3-di- methyaminopropyl]carbodiimid Hydrochlorid), S-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid), Dialyse-Kammern (Slide-A-Lyzer), Vivaspin (MWCO 50 kDa, VivaScience)

Puffer D-PBS (IOx)

137O mM NaCI (80 g/l) 27 mM KCl (2 g/l) 42 mM Na₂HPO₄M 2H₂O (15,4 g/l) / 7,652 g/l Na₂HPO₄*2H₂O

U mM KH₂PO₄ (2 g/l) auf 1000 ml auffüllen, der pH sollte bei ca. 7,5 liegen, autoklavieren, Lagerung bei RT.

Für eine 1x PBS-Lösung den 100 ml 10x Puffer mit ddH₂O verdünnen und vor dem vollständigen Auffüllen auf 1 I mit wenigen Tropfen 2 M NaOH den gewünschten pH- Wert (pH 7,4 (AK) oder 8,0 (QD)) einstellen.

MES-Puffer = Aktivierungspuffer frisch ansetzen (organischer Puffer, kann nicht autoklaviert werden) Rezept für 0,8 I (0,1 M MES, 0,25 M NaCI, pH 6.0): 15,616 g MES 11 ,688 g NaCI ad 800 ml ddH₂O, pH 6,0 einstellen

Bis maximal 0,7 I mit ddH₂O auffüllen, dann mit 2 M oder 5 M NaOH den pH-Wert einstellen. Anschließend auf 800 ml mit ddH₂O auffüllen.

1 M Glycin-Lösung (sterilfiltriert bei 4 ⁰C längere Zeit haltbar), Aliquots einfrieren

Durchführung Zuerst wird MES-Puffer (Aktivierungspuffer) in einem Glas-Messzylinder hergestellt. Die Dialysekammer wird vor Gebrauch 1 bis 2 Minuten in MES-Puffer gewässert. 100 μl BP619 (20 μg) werden mit MES-Puffer auf 400 μl Endvolumen in einem sterilen Eppendorfgefäß aufgefüllt und mit der Pipette gut vermischt. Die BP619 werden in die Dialysekammer (3,5 kDa) überführt. Bei der ersten Dialyse werden die BP619 lichtgeschützt eine Stunde bei Raumtemperatur und mit kontinuierlichem Mischen gegen 800 ml MES-Aktivierungspuffer dialysiert. Nach der ersten Dialyse werden die BP619 aus der Dialysekammer entnommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Für die Mischung von EDC und S-NHS mit den BP619 werden Stocklösungen von jeweils 100 mM EDC und 100 mM S-NHS direkt vor Gebrauch hergestellt. Nach der ersten Dialyse wird 33 μl 100 mM S-NHS und 13 μl 100 mM EDC zu den BP619 pipettiert und 15 Minuten lichtgeschützt bei Raumtemperatur und 350 rpm geschüttelt. Nach der Inkubation werden die BP619 gegen PBS dialysiert. Hierfür werden die BP619 in die Dialysekammer (MWCO 3,5 kDa) überführt und eine Stunde lichtgeschützt gegen PBS mit pH 8,0 dialysiert. Nach der zweiten Dialyse werden die BP619 aus der Dialysekammer entnommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die aktivierten BP619 werden mit 80 μg Neutravidin (8 μl bei 10 mg/ml, 20 μl Endvolumen mit D-PBS) versetzt. Anschließend wird dieser Reaktionsansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur und lichtgeschützt mit 350 rpm geschüttelt. Nach der Konjugation wird der Konjugationsansatz lichtgeschützt bei 4 ⁰C gelagert. Am nächsten Tag wird, um noch eventuelle reaktive Gruppen abzusättigen, 1 M Glycin bis zu einer Endkonzentration an Glycin von 10 mM hinzupipettiert.

Die BP619-Konjugate werden mit Vivaspin-Zentrifugationsröhrchen aufkonzentriert. Die Konjugate werden so lange zentrifugiert, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Danach erfolgt die stöchiometrische Zugabe von biotinyliertem monoklonalen Antikörper, der gegen das membranständige Tumor-assoziierte Antigen GIu- cosetransporter 1 (GLUTI ) gerichtet ist.

b) Konjugation von BP619 mit EGF-His

Chemikalien und Materialien

Nanopartikel

BP619 200 μg/ml

Protein

Aufgereinigtes Protein liegt in Phosphat-NaCI-Puffer vor (Lagerung bei -80⁰C)

MES-Puffersubstanz (Sigma), NaCI, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, EDC (1-Ethyl-3-[3-di- methyaminopropyljcarbodiimid Hydrochlorid), S-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid), Dialyse-Kammern (Slide-A-Lyzer), Vivaspin (MWCO 50 kDa, VivaScience)

Puffer D-PBS (IOx)

137O mM NaCI (80 g/l)

27 mM KCl (2 g/l)

42 mM Na₂HPO₄M 2H₂O (15,4 g/l) / 7,652 g/l Na₂HPO₄*2H₂O U mM KH₂PO₄ (2 g/l) auf 1000 ml auffüllen, der pH sollte bei ca. 7,5 liegen autoklavieren, Lagerung bei RT

Für eine 1x PBS-Lösung den 100 ml 1Ox Puffer mit ddH₂O verdünnen und vor dem vollständigen Auffüllen auf 1 I mit wenigen Tropfen 2 M NaOH den gewünschten pH- Wert (pH 7,4 (AK) oder 8,0 (QD)) einstellen.

MES-Puffer = Aktivierungspuffer frisch ansetzen (organischer Puffer, kann nicht autoklaviert werden) Rezept für 0,8 I (0,1 M MES, 0,25 M NaCI, pH 6.0): 15,616 g MES 11 ,688 g NaCI ad 800 ml ddH₂O, pH 6,0 einstellen

Bis maximal 0,7 I mit ddH₂O auffüllen, dann mit 2 M oder 5 M NaOH den pH-Wert einstellen. Anschließend auf 800 ml mit ddH₂O auffüllen.

1 M Glycin-Lösung (sterilfiltriert bei 4 °C längere Zeit haltbar), Aliquots einfrieren

Durchführung Zuerst wird MES-Puffer (Aktivierungspuffer) in einem Glas-Messzylinder hergestellt. Die Dialysekammer (MWCO 3,5 kDa) wird vor Gebrauch 1 bis 2 Minuten in MES-Puffer gewässert. 100 μl BP619 (20 μg) werden mit MES-Puffer auf 400 μl Endvolumen in einem sterilen Eppi aufgefüllt und mit der Pipette gut vermischt. Die BP619 werden in die Dialysekammer (3,5 kDa) überführt. Bei der ersten Dialyse werden die BP619 lichtgeschützt eine Stunde bei Raumtemperatur und mit kontinuierlichem Mischen gegen 800 ml MES-Aktivierungspuffer dialysiert. Nach der ersten Dialyse werden die BP619 aus der Dialysekammer entnommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Für die Mischung von EDC und S-NHS mit den BP619 werden Stocklösungen von jeweils 100 mM EDC und 100 mM S-NHS direkt vor Gebrauch hergestellt. Nach der ersten Dialyse wird 33 μl 100 mM S-NHS und 13 μl 100 mM EDC zu den BP619 pipettiert und 15 Minuten lichtgeschützt bei Raumtemperatur und 350 rpm geschüttelt. Nach der Inkubation werden die BP619 gegen PBS dialysiert. Hierfür werden die BP619 in die Dialysekammer (3,5 kDa) überführt und eine Stunde lichtgeschützt gegen PBS mit pH 8,0 dialysiert. Nach der zweiten Dialyse werden die BP619 aus der Dialysekammer entnommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die aktivierten BP619 werden mit 4,92 μg EGF-His (verdünnt mit PBS zu einem Endvolumen von 20μl) konjugiert. Hierzu werden die aktivierten BP619 zu EGF-His pipettiert und mit der Pipette gut vermischt. Anschließend wird dieser Reaktionsansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur und lichtgeschützt mit 350 rpm geschüttelt. Nach der Konjugation wird der Konjugationsansatz lichtgeschützt bei 4 ⁰C gelagert. Am nächsten Tag wird, um noch eventuelle reaktive Gruppen abzusättigen, 1 M Glycin bis zu einer Endkon- zentration an Glycin von 10 mM hinzupipettiert.

Die BP619-EGF-His Konjugate werden mit Vivaspin-Zentrifugationsröhrchen (50 kDa MWCO) aufkonzentriert. Hierbei wird die Membran einmal mit 4 ml ddH2O vorgewaschen, anschließend mit 4 ml PBS nachgewaschen. Die BP619-EGF-His Konjugate werden in 2 ml PBS verdünnt und auf die Membran aufgetragen. Anschließend werden die BP619-EGF-His Konjugate nochmals mit 2 ml PBS gewaschen. Die Konjugate werden so lange zentrifugiert, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.

c) Tierexperiment

i) Durchführung

Hierzu wurde Nacktmäusen (ohne Thymus und daher immunsupprimiert) humane Dickdarmcarcinomzellen der Zellinie HT29 subkutan injiziert, die nach einer Wachstumszeit von ca. 2 bis 3 Wochen solide Tumoren ausbildeten. Jede Maus wird mit Hypnomidat narkotisiert, um die Injektion vorzunehmen und mit 25 μl einer Nanopartikel-Lösung intratumoral injiziert; dabei erfolgt die Injektion zentral an einer Stelle des Tumors.

Es wird eine Kinetik von der Fluoreszenz des Materials im Tumor von Zeitpunkt 0 bis 5 bzw. 60 min aufgenommen.

Nach der Tötung wird zunächst der Tumor mit Epidermis entnommen und nachfolgend die Organe Milz, Leber, Nieren entnommen.

Der Tumor wird mit Epidermis-Dermis entnommen, mit einem Tropfen OCT auf Alufolie aufgefroren (Außenseite nach oben orientiert), in Alufolie eingepackt und in N₂ schockgefroren. Danach gelagert bei -80⁰C bis Rücktransport auf Trockeneis, weitere Lagerung bei -80⁰C.

Die Organe Milz, Leber, Nieren werden von allen Mäusen entnommen, in N₂ schockgefroren und bei -80⁰C gelagert bei -80⁰C bis Rücktransport.

ii) photographische Dokumentation Verwendete Materialien/Geräte Kamera Nikon Coolpix P2 Kaltlichtquelle 24W (Eltrotec LB24) Optische Filter:

• Shortpass Filter 50% Cut-off Wavelength 550nm (Melles Geriot 03SWP408 bzw. 03SWP608)

• Farbfilter „grün" 550nm (Melles Geriot 03FCG087 / OG550)

• Farbfilter „orange" 570nm (Melles Geriot 03FCG089 / OG570)

• Farbfilter „rot" 590nm (Melles Geriot 03FCG098 / OG590) schwarze Tonpappe als Untergrund

Kameraeinstellungen Die Aufnahmen zur Dokumentation der Fluoreszenz werden mit einer handelsüblichen Digitalkompaktkamera (Nikon Coolpix P2) durchgeführt. Nachfolgend findet sich eine Übersicht über die an der Kamera vorgenommenen Einstellungen.

Die jeweiligen Bildeinstellungen können den EXIF Informationen der Bilddatei entnommen werden (zB. mit Photoshop oder PixVue).

Durchführung Die Kamera wird mit dem Filterhalter auf ein Fotostativ montiert und mit Hilfe des SD- Kopfes so eingestellt, dass die Entfernung zwischen Objektiv und Maus/Oberfläche ca. 15-20 cm beträgt. Der Winkel sollte, soweit die Positionierung des Stativs es zu- lässt, möglichst steil von oben sein. Der Aufnahmefilter wird so montiert, dass der Abstand zum Objektiv möglichst gering ist.

Die Beleuchtung und Anregung der Substanz erfolgt durch eine Kaltlichtquelle, des- sen Spektrum durch einen Shortpass Filter (siehe oben) reguliert wird. Wegen der an der Lichtquelle entstehenden Abwärme und der besseren Handhabbarkeit wird ein flexibler Lichtleiter mit einer Linse zur Fokussierung des Lichtkegels verwendet. Auf diesen Lichtleiter wird der Filterhalter mit dem Shortpass Filter montiert. Der Lichtleiter wird dann in einem Laborstativ so fixiert, das der Abstand zur Oberfläche etwa 15 cm beträgt. Dabei sollte der Lichtkegel so eingestellt sein, dass er etwa 8 cm durch- misst. Auch die Beleuchtung sollte dabei zur Verminderung von Schatten möglichst steil von oben erfolgen.

Die Maus und das Laborstativ für die Beleuchtung werden zur Verbesserung des Kontrastes auf schwarzer Tonpappe positioniert. Die Maus wird dann mittig im Lichtkegel positioniert. Dabei ist zu beachten, dass der Tumor möglichst wenig Schatten wirft und gut ausgeleuchtet ist.

Bei der Aufnahme ist die Autofokusanzeige zu beachten.

Im normalen Fall sollten die Aufnahmen mit maximalem Weitwinkel gemacht werden. Bei größerem Zoom stellt die Kamera möglicherweise nicht mehr scharf und es verändert sich außerdem die Blendeneinstellung.

Wird zwischen den Aufnahmen der Aufnahmefilter gewechselt, darf am sonstigen Versuchsaufbau möglichst nichts geändert werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten und die spätere Nachbearbeitung zu erleichtern.

d) Zell-Bindungsassay

Materialien und Ausstattung

Fluoreszenzmikroskop: Leica DMIL, Zeiss LSM51 OMETA Signal Enhancer, ProLong Gold Antifading Reagent

Puffer

D-PBS (pH 7,4) (1Ox) 137O mM NaCI (80 g/l)

27 mM KCl (2 g/l)

42 mM Na₂HPO₄*12H₂O (15,4 g/l) / 7,652 g/l Na₂HPO₄*2H₂O 14 mM KH₂PO4 (2 g/l) pH 7,4 einstellen und auf 1000 ml auffüllen autoklavieren, Lagerung bei RT

Triton X-100 Lösung 0,1 % (v/v) in D-PBS Lagerung bei 4°C

BSA-Lösung

3 % (w/v) in D-PBS frisch ansetzen oder aus -20⁰C Stock

4% PFA-Lösung

5,71 ml Formaldehyd (35 %) 5 ml 10 x D-PBS pH 7,4 einstellen/kontrollieren ad 50 ml mit ddH₂O, Lagerung bei 4°C

0,1 M Glycin-Lsg.

0,375 g Glycin ad 50 mL D-PBS, pH 7,4 einstellen/kontrollieren, sterilfiltrieren, Lagerung bei 4⁰C

Mowiol/DABCO

Nach Mischen von 2,4 g Mowiol in 6 g Glycerin (reinst) werden 6 ml ddH₂O zugegeben und anschließend mehrere h bei RT gerührt. Dazu werden 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) gegeben und unter Rühren auf 50 ⁰C 10 min erhitzt. Nachdem das Mowiol gelöst ist (dauert länger als 10 min!) wird 15 min bei 5000 x g zentrifugiert und schließlich 20 mg/ml DABCO hinzugefügt.

Lagerung: in Aliquots bei -20°C, nur wenige Wochen bei 4 ⁰C verwendbar, härtet langsam aus

Antikörper

Erstantikörper: Anti-EGFR mAK (mouse) Dianova Ab-5 1 :100

Zweitantikörper: goat-anti-mouse mit Alexa488

Durchführung

2 Tage im Voraus werden HT29 Zellen auf runde Deckgläschen ausgesät. Für die

Aussaat werden 5 x 10⁴ Zellen umgesetzt, damit nach 48 Stunden Wachstum bei

37°C ein 50-70 % konfluentes Monolayer zu Beginn der Immunfärbung vorhanden ist.

Die BP619-EGF-His Konjugate werden 30 Minuten bei Raumtemperatur in 50 μl McCoy Medium, das 3% BSA enthält, präinkubiert.

Bei erreichter Konfluenz der HT29-Zellen wird das Medium abgesaugt und die Zellen werden mindestens einmal mit D-PBS gewaschen.

Es werden 30 bis 50 μl der präinkubierten BP619-EGF-His Konjugate auf die gewaschen Zellen pipettiert und anschließend eine Stunde bei 37°C/7,5% CO₂ im Brut- schrank inkubiert.

Nach der Färbung der Zellen mit den BP619-EGF-His Konjugate werden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann mit 300 μl 4 % PFA-Lösung, 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Fixierung werden die Zellen einmal mit D-PBS gewaschen und mit 0,1 M Glycin, 5 Minuten bei Raumtemperatur gequencht. Nach dem Quenchen werden die Zellen einmal mit D-PBS gewaschen und anschließend mit 0,1 % Triton X-100-PBS, 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Zum Blocken der Zellen werden die Zellen anschließend mit 3% BSA, 30 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert.

Nach der Blockierung der gefärbten Zellen können die Zellen gegen gefärbt werden oder direkt die BP619-EGF-His Konjugat Färbung im Mikroskop analysiert werden. Für die Analyse der Kolocalisation muss eine Gegenfärbung gemacht werden.

Die Gegenfärbung wird gemacht mit dem Erst-Antikörper anti-EGFR, ein monoklonaler Antikörper von Dianova. Der Antikörper anti-EGFR wird 1 zu 100 in 30 μl 1% BSA-PBS verdünnt und anschließend auf die Zellen pipettiert. Anti-EGFR inkubiert 60 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zellen. Nach der Inkubation werden die Zellen 3 mal 5 Minuten lang mit D-PBS gewaschen. Als zweiter Antikörper mit Fluorochrom zu der Gegenfärbung wird goat-anti-mouse mit Alexa488 genommen. Hierfür wird der zweite Antikörper 1 zu 200 in 30 μl 1% BSA verdünnt und anschließend auf die Zellen pipettiert. Der zweite Antikörper goat-anti-mouse Alexa 488 wird 60 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zellen inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen 3 mal 5 Minuten lang mit D-PBS gewaschen. Die Zellen werden in Mowiol/DABCO eingebettet und mit dem Mikroskop analysiert.

e) Präparation und Färbung der Kryoschnitte

Die Tumoren werden bei -80 °C gelagert und in einer Styroporbox mit Kühlaggregaten (auf -80 °C gekühlt) zum Schneiden transportiert. Das Schneiden erfolgt mit einem Kry-Mikrotom. Die entstehenden Schnitte sind 10 μm dick.

Materialien und Ausstattung

Fluoreszenzmikroskop: Leica DMIL, Zeiss LSM51 OMETA, Tröge zum Waschen, feuchte Kammer, Fettstift zur Markierung des Gewebebereichs, 4 %ige Paraformal- dehydlösung (s. Zellbindungsassay), PBS (s. Zellbindungsassay), 3 %ige BSA-Lö- sung (s. Zellbindungsassay), Triton X-100 Lösung (s. Zellbindungsassay), 0,1 M GIy- cin-Lsg. (s. Zellbindungsassay) entsprechende Primär- und Sekundärantikörper, ggf. weitere Reagenzien für Gegenfärbungen

Durchführung Die Kryoschnitte werden bei RT aufgetaut und getrocknet (ca. 10-20 min). Nach der Markierung des Gewebebereichs mit einem Fettstift erfolgt die Fixierung des Gewebes mit 4 %iger Paraformaldehydlösung für 20 min in einer feuchten Kammer. Nach dem Waschen mit D-PBS anschließend 5 min Quenchen mit 0,1 M Glycinlösung.

Nach dem Waschen in PBS und der Permeabilisierung mit 0,1 % Triton-X-100 erfolgt das Blocking für 1 h bei RT mit 3 %iger BSA-Lösung.

Zum Nachweis des EGFR in der Plasmamembran wird ein anti-EGFR-A488-Direkt- konjugat verwendet. Dieses wird 1 :100 in 1 % BSA/PBS verdünnt und die Schnitte damit in einer feuchten Kammer 1 h bei RT inkubiert. Das Waschen mit D-PBS erfolgt in einem Trog für mindestens 15 min und mindestens einem Pufferwechsel.

Für das Einbetten wird Mowiol/DABCO eingesetzt und die Schnitte (ungefärbt und gefärbt) im Mikroskop analysiert.

f) Mikroskopische Analyse

Die mikroskopische Analyse der Präparate erfolgt mit dem LSM510 von Zeiss. Dabei werden folgende Filter eingesetzt:

zur Analyse der NP-Fluoreszenz:

FSet 15= FilterSet 15 488015-0000

Excitation: BP546

Beamsplitter: FT580

Emission: LP 590

zur Analyse der Alexa488-Fluoreszenz:

FSet 46= FilterSet 46 1196-681 Excitation: BP500/20 Beamsplitter: FT515 Emission: BP535/30

Bei einem Teil der Präparate wurde auch eine konfokale Laseranalyse durchgeführt (s. Bedienungsanleitung des Mikroskops).

2. Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiel 1 :

In wVo-Experiment: Tierexperiment mit HT29 xenograft Tumoren in Nacktmäusen mit intratumoraler Injektion von erfindungsgemässen Neutravidin-Antikörper-Komplexen Ein spezifisches "Tumor-targeting" von erfindungsgemässen Antikörper-Konjugaten wurde in einem in wVo-Experiment an Mäusen mit xenograft Tumoren gezeigt. Hierzu wurde Nacktmäusen (ohne Thymus und daher immunsupprimiert) humane Dickdarmcarcinomzellen der Zellinie HT29 subkutan injiziert, die nach einer Wachstumszeit von 3 Wochen solide Tumoren ausbildeten.

Für eine selektive Tumormarkierung wurde ein erfindungsgemässer Antikörper-Kom- plex hergestellt, bzw. ein erfindungsgemässes Neutravidin-Konjugat mit einem daran gebundenen biotinylierten monoklonalen Antikörper. Dieser monoklonale Antikörper ist gegen das membranständige Tumor-assoziierte Antigen Glucosetransporter 1 (GLUTI ) gerichtet, welches auf vielen humanen Colorectal-Karzinomformen expri- miert ist.

Nach intratumoraler Injektion der Komplexe waren die Tumore bereits unter UV-Anregung rot fluoreszent visuell zu erkennen. Nach bis zu 48 h nach Injektion konnten die erfindungsgemässen Komplexe in angefertigten Cryoschnitten der Tumoren nachgewiesen werden.

Fig. 1 : Rotes Signal (Konjugat aus Neutravidin und biotinyliertem Antikörper gegen GLUTI Membranprotein). Spezifische Bindung an HT-29 Zellen jedoch nicht an mu- rine Zellen ist erkennbar (noch nicht homogene Markierung des gesamten Tumors erzielt).

Fig. 2: Rotes Signal (Konjugat aus Neutravidin und biotinyliertem Antikörper gegen GLUTI Membranprotein). Spezifische Bindung an HT-29 Zellen in unmittelbarer Umgebung von intratumoralen Ducti jedoch nicht an murine Zellen ist erkennbar. (Noch nicht homogene Markierung des gesamten Tumors erzielt).

Ausführungsbeispiel 2: i) Vergleich Intensität Biopixels 618 (erfindungsgemäßes Material) mit Crystalplex Alloy Nanoparticles 630 (NC 630) mittels Spektralanalyse. Bei den NC630 Nanopar- tikeln handelt es sich um Nanopartikel, die einen CdS_xS_ei-χ/Zn5-Kem haben und mit COOH-Gruppen funktionalisiert sind.

Folgende Werte ergeben sich aus Fig. 3:

Konzentration BP618 1 ,67 μg/ml

Konzentration NC630 6,70 μg/ml

Anregung 360 nm BP618 55000 cps Anregung 360 nm NC630 22000 cps

Anregung 488 nm BP618 25000 cps

Anregung 488 nm NC630 10000 cps

Unter Berücksichtigung der um den Faktor 4 höheren Konzentration der NC630 Nanopartikel ergibt sich eine um den Faktor 10 höhere Emissionsintensität des erfindungsgemäßen Materials BP618.

Dieser Intensitätsunterschied ist sehr wesentlich für den erfindungsgemäßen Einsatz des Kontrastmittels für die direkte Visualisierung z.B. bei der medizinischen Anwendung in der Chirurgie. Während beim erfindungsgemäßen Material die Fluoreszenz durch den behandelnden Arzt direkt und lediglich unter Zuhilfenahme von Fluores- zenzfiltern beobachtet werden kann, müssten die NC630 Nanopartikel mit zusätzlicher elektronischer Verstärkung sichtbar gemacht werden.

ii) Charakterisierung der BioPixels 619 mittels Gelfiltration Fig. 4 lässt erkennen, dass das Elutionsvolumen 16,2 ml beträgt. Dieser Wert korreliert mit einem Stokes-Durchmesser von 10,8 nm.

iii) Vergleich Maustumor nach Injektion von EGF-gekoppeltem BioPixels 619 NC630 Nanopartikeln

Nach der unter 1 b) beschriebenen Methode wurde die Konjugation von BP619 mit EGF-His durchgeführt. Dabei wurden 1 ,4 μM Protein eingesetzt und 40 μg Nanopartikel (= Doppelansatz) konjugiert. Nach der Aufreinigung/Aufkonzentrierung mit Vi- vaspin-Zentrifugationseinheiten wurden insgesamt ca. 14,3 μg Nanopartikel in den Tumor injiziert.

Die fotografische Dokumentation erfolgte wie unter 1c) beschrieben. Die Tumore, in die das NC630-Material injiziert wurde, zeigen keine Fluoreszenz (Fig. 5 a, s. Markierung), während bei der Verwendung von EGF-gekoppelten erfindungsgemäßen Bio- Pixels 619 deutlich eine Fluoreszenz zu erkennen ist (Fig. 5 b, s. Markierung).

iv) Mikroskopie der Gewebemarkierung im Tumor mit EGF-gekoppelten erfindungsgemäßen BioPixels 619

Die entnommenen Tumore wurden mittels eines Kryotoms geschnitten (Schnittdicke 10 μm) und zur mikroskopischen Analyse wie oben beschrieben (1e) behandelt. Die Analyse erfolgte mit einem Zeiss-Mikroskop (LSM510) unter Einsatz des FSet15 zur Detektion der BioPixel-Fluoreszenz (s. 1f). Die Markierung des Tumors (s. Fig. 6; weiße Bereiche auf dunklem Hintergrund) ist nicht homogen; einige Bereiche sind schwächer markiert (s.Fig. 6 a), während andere eine stärkere Markierung erkennen lassen (s.Fig. 6 b). c) Ausführungsbeispiel 3

Markierung von Tumorzellen mit EGF gekoppelten erfindungsgemäße BioPixels 619 mit intrazellulärer Aufnahme der Biopixels.

In diesem Fall wurde mit HT29-Tumorzellen nach der beschriebenen Methode (1d) ein Zell-Bindungsassay durchgeführt. In Fig. 7 a ist die BP619-Fluoreszenz dargestellt. Hierbei wurden durch Kreise einige der Signale markiert, deren Fluoreszenz ausschließlich durch BP619 verursacht wird. In Fig. 7 b wurde die Fluoreszenz des Antikörpers A488 detektiert. Hier wurde als Erstantikörper ein EGFR-Antikörper und als Zweitantikörper goat-anti-mouse A488 eingesetzt (s. 1d). Auch hier wurden einige der Signale eingekreist, deren Fluoreszenz ausschließlich auf A488 zurückzuführen ist. In Fig. 7 c schließlich ist das aus 7 a und 7 b zusammenkopierte Bild zu sehen. Viele der Signale lassen eine Kolokalisation erkennen, d.h. sie sind sowohl auf der Fig. 7 a als auch der Fig. 7 b zu finden.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung fluoreszierender Nanopartikel enthaltend einen anorganischen Kern, eine eine Imidazolkomponente enthaltende Passivierungsschicht und spezifische Liganden mit einem hydrodynamischen Durchmesser des anorganischen Kerns mit der Passivierungsschicht von nicht mehr als 15 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 10 nm, besonders bevorzugt von nicht mehr als 5 nm zur Herstellung eines in vivo Kontrastmittels, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel eine Emission von weniger als 700 nm aufweisen, und das Kontrastmittel für die lokale Anwendung beim Menschen geeignet ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch ein Emmissi- onsspektrum von 600 bis 650 nm, vorzugsweise von 620 bis 650 nm.

3. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel systemisch, lokal oder topisch appliziert oder injiziert werden.

4. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche als Kontrastmittel, insbesondere zur Gewebemarkierung bei chirurgischen, endoskopischen oder minimal-invasiven Eingriffen.

5. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche , dadurch gekennzeich- net, dass die Nanopartikel zusätzlich wenigstens einen Modifikator aufweisen.

6. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern einen Cluster im wesentlichen umfassend Edelmetallatome, vorzugsweise einen Cluster mit 2 bis 27. Atomen.

7. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern einen Legierungs-/Halbleiterkern ent- hält, wobei der Kern eine homogene Zusammensetzung aufweist und durch eine „Band-Gap"-Energie charakterisiert ist, die nicht-linear zu dem molaren Verhältnis der zwei Halbleiter ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern eine Legierung von einem ersten Halbleiter und einem zweiten Halbleiter umfasst, wobei die Konzentration des ersten Halbleiters graduell ansteigt vom Zentrum des Kerns bis zu dessen Oberfläche und die Konzentration des zweiten Halbleiters graduell abnimmt vom Zentrum des Kerns bis zu dessen Oberfläche.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Halbleiter ein Gruppe Il-Gruppe Vl-Halbleiter oder ein Gruppe I Il-Gruppe V-Halbleiter ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern eine Legierung umfasst ausgewählt aus der Gruppe folgender Legierungen: CdSeTe, CdSSe₁ CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, GaAIAs, InGaN , InGaP CdSe oder CdTe.

11. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Passivierungsschicht mindestens eine Verbindung mit einer Lewis-Base Funktion oder einen Heteroaromaten enthält, die mit einem Metallatom oder Metallion koordinieren kann.

12. Verwendung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Imida- zol-Komponente eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst: Histidin, Carnosin, Anserin, Baiein, Homocarnosin, Histi- dylphenylalanin, Cyklo-histidylphenylalanin, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, Histidylleucin, 2-Mercaptoimidazol, Boc-Histidin Hydrazid, Histinol, 1-Methyl- histidin, 3-Methylhistidin, Imidazolysin, Imidazol-enthaltendes Ornithin (z. B. 5- Methylimidazol), Imidazol-enthaltendes Alanin (z. B. (Beta)-(2-lmidazolyl)- L(alpha) Alanin), Carzinin, Histamin, die ihrerseits mit reaktiven Gruppen (zum Beispiel amino, thiol, carboxyl oder carboxamid) substituiert sein können.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeich- net, dass die Passivierungsschicht einen Quervemetzer zur Quervernetzung der Imidazol-Komponente umfasst.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Querver- netzungskomponente ein Alkylphosphin und/oder ein Alkylphosphinderivat umfasst.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikatoren ausgewählt sind aus der Gruppe folgender Verbindungen: Polyethylenglykol, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, nie- dermolekulare Polysaccharide, hydrophile Vitamine, lipophile Vitamine, Fettsäuren, Polyalkohole, Teflon, Aminosäuren, unspezifische Peptide oder Proteine, Phosphorylcholin, Polylaktat sowie Derivate der genannten Verbindungen.

16. Nanopartikel enthaltend einen anorganischen Kern, eine Passivierungsschicht und spezifische Liganden mit einem hydrodynamischen Durchmesser des anorganischen Kerns mit der Passivierungsschicht von nicht mehr als 15 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 10 nm nm, besonders bevorzugt von nicht mehr als 5 nm, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Emmission von 600 bis 700 nm, vorzugsweise von 620 bis 650 nm aufweisen.

17 Nanopartikel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mindestens einen Modifikator aufweisen.

18. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern einen Cluster im wesentlichen umfassend Edel- metallatome, vorzugsweise einen Cluster mit 2 bis 27, vorzugsweise aus der Gruppe von Gold, Silber und Kupfer enthält.

19. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeich- net, dass der anorganische Kern einen Legierungs-/Halbleiterkern enthält, wobei der Kern eine homogene Zusammensetzung aufweist und durch eine „Band-Gap"-Energie charakterisiert ist, die nicht-linear zu dem molaren Verhältnis der zwei Halbleiter ist.

20. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern eine Legierung von einem ersten Halbleiter und einem zweiten Halbleiter umfasst, wobei die Konzentration des ersten Halbleiters graduell ansteigt von dem Zentrum des Kerns bis zu dessen Oberfläche und die Konzentration des zweiten Halbleiters graduell abnimmt vom Zentrum des Kerns bis zu dessen Oberfläche.

21. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Halbleiter ein Gruppe Il-Gruppe Vl-Halbleiter oder ein Gruppe Ill-Gruppe V-Halbleiter ist.

22. Nanopartikel nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Kern eine Legierung umfasst ausgewählt aus der Gruppe folgender Legierungen: CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, GaAIAs, InGaN; InGaP, CdSe und CdTe.

23. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Passivierungsschicht mindestens eine Verbindung mit einer Lewis- Base Funktion oder einen Heteroaromaten enthält, die mit einem Metallatom oder Metallion koordinieren kann, vorzugsweise eine Imidazol-Komponente.

24. Nanopartikel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Imidazol-Komponente eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst: Histidin, Carnosin, Anserin, Baiein, Homocarnosin, Histidylphenylalanin, Cyklo-histidylphenylalanin, 5-Amino-4- imidazolcarboxamid, Histidylleucin, 2-Mercaptoimidazol, Boc-Histidin Hydrazid, Histinol, 1-Methylhistidin, 3-Methylhistidin, Imidazolysin, Imidazol- enthaltendes Ornithin (z. B. 5-Methylimidazol), Imidazol-enthaltendes Alanin

(z. B. (Beta)-(2-lmidazolyl)-L(alpha) Alanin), Carzinin, Histamin, die ihrerseits mit reaktiven Gruppen (zum Beispiel amino, thiol, carboxyl oder carboxamid) substituiert sein können.

25. Nanopartikel nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Querver- netzungskomponente ein Alkylphosphin und/oder ein Alkylphosphinderivat umfasst.

26. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Modifikator ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe umfassend:

Polyethylenglykol, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, niedermolekulare Polysaccharide, hydrophile Vitamine, lipophile Vitamine, Fettsäuren, Polyalkohole, Teflon, Aminosäuren, unspezifische Peptide oder Proteine, Phosphorylcholin, Polyaktat sowie Derivate der genannten Verbindungen.

27. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens einen Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 bis 26.

28. Verwendung der Nanopartikel nach einem der Ansprüche 16 bis 26 als Thera- peutikum, in vitro Diagnostikum oder Theranostikum.