CN101360515A - 荧光纳米微粒 - Google Patents

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Abstract

公开了荧光纳米微粒用于制备体内诊断辅助物的用途，所述纳米微粒包含无机核心、钝化层和特异性配体，所述具有钝化层的无机核心具有最大为15nm，优选10nm，特别优选5nm的水动力学直径。本发明的纳粒微粒显示低于700nm的发射。

Description

荧光纳米微粒
发明领域
本发明涉及具有作为体内诊断辅助物特别是作为用于区分不同组织类型的造影剂的特定适应性的荧光纳米微粒，并要求欧洲专利申请05 025 022.4的优先权，参考其内容。
背景技术
在许多病症中，作为尽可能早和尽可能提供信息的诊断对于必需的医疗方法的选择和协调以及执行是至关重要的。所述诊断特别地应用于大量肿瘤类型，对于所述肿瘤类型的确定和治疗(包括可能的切片)，对于区分健康组织和致癌组织是必需的。因此，患者的恢复或甚至存活决定性地依赖于治疗和/或手术医生是否可以和如何很好地区分不同的组织类型。
在过去，为提高诊断和医疗方法，已发展了造影剂，借助于其可通过成像方法显现体内功能和结构。除其他以外，此类方法用于癌症相关细胞变异的靶向检测。
因此，例如，Hsu等人(2004)(“A far-red fluorescent contrastagent to image epidermal growth factor receptor expression”，Photochemistry and Photobiology，79(3)：272-279)已发展了作为早期致癌性转化标记的基于荧光基团的分子特异性造影剂。在该情况下，通过使用红色荧光抗EGFR抗体缀合物(Alexa660)，表皮生长因子受体(EGFR)的肿瘤相关性过度表达用于鉴定口中改变的组织。
有机荧光基团的一般不利方面是在体内被代谢，荧光色素被降解或失活。因此代谢抵消了诊断所必需的高标记强度。随着体内有机荧光基团的驻留时间增加，该问题加剧并且代表了相当大的困难，特别在标记更深的组织层中的细胞中尤其如此。
此外，在更长的波长上发射的有机荧光基团特别地具有不利方面：化学缀合过程减少它们的量子产量。此外，有机荧光基团对于光漂白作用非常易感，甚至在短暂的辐射之后其可导致荧光的显著损失。因此基于此类荧光基团的造影剂具有拥有延长的激发时间的荧光强度和稳定性，所述强度和稳定性太低以至于不适合用于更深层组织的细胞的检测/标记(“深层组织成像”)。因此，根据Hsu等人(2004)的研究，很明显Alexa660缀合物展示0.5mm的最大穿透深度，从而荧光的检测不再是合理的可能性。
细胞变异的荧光标记的进一步已知的可能性由使用所谓的量子点(QDs)构成，所述量子点是尺寸数纳米的荧光纳米微粒，其核心由半导体材料例如CdSe、CdTe、InP等构成。
然而，当已知的QDs用于生物学系统时，它们显示所谓的闪亮现象，即荧光和非荧光状态之间的纳米微粒交替改变。该现象产生特别地对于体内应用无用的量子点。此外，“闪亮”还可能表明纳米微粒核心的崩解，通过该崩解毒性镉可被释放至体内。这是特别不利的，因为量子点在体内例如肝或脾内积累。
发明内容
本发明因此基于提供荧光纳米微粒的目的，所述纳米微粒展示用作诊断辅助物特别是作为体内造影剂的特别的适合性。
如主权利要求中所示获得本主题。从属权利要求和分开的独立项涉及有利的实施方案。本发明的纳米微粒可在体外和体内用于选择的生物学结构或功能的特异性标记。特别地，此处选择的纳米微粒可用作用于辅助医疗干预特别是外科手术的体内造影剂。
本发明的纳米微粒包含至少3个结构，尤其是无机核心，该核心由具有特异性配体的钝化层包覆，特异性抗体也可能是钝化层的部分。此类配体导致纳米微粒对生物系统的靶分子(靶)的特异性结合。钝化层围绕其的本发明的纳米微粒的无机核心具有不超过15，优选不超过10nm的流体动力学直径。不超过8nm或不超过5nm的热力学直径是特别优选的。
钝化层具有特别是增加无机核心的荧光强度以及化学和物理稳定性的任务。由钝化层包覆的无机核心的特征在于，至少10％，优选至少30、50或甚至70％的量子产量。量子产量就此而言意指由样品发射的光的量对由样品吸收的光的量的比率。钝化层有利地具有不超过1nm的厚度。在该情况下钝化的核心的直径增加不超过2nm。
在各情况下也对纳米微粒提供修饰物，特别地提高与生物环境的相容性是有利的。通过使用修饰产生的水动力学半径的增加优选不超过2nm。钝化层和修饰物的厚度依赖于个体情况，还依赖于两个结构相互之间的关系以及与无机核心的关系。
归因于本发明的纳米微粒的尺寸的限制，它们特别适合用作活患者的诊断辅助物。因此，尺寸的减小导致扩散速度和对组织穿透的深度的增加。这允许纳米微粒在生物环境中的均匀和快速的分布以及在局部施用后尽可能远地穿透通过组织(例如肿瘤)。本发明的纳米微粒同样允许还可通过注射进行的全身性施用。然而，对于肿瘤的治疗，局部施用，例如局部应用或瘤内或肿瘤周围施用是优选的。
本发明的纳米微粒的特别有利的实施方案具有不超过8，特别优选不超过4nm的水动力学直径。具有该级别的尺寸的纳米微粒甚至可通过肾脏分泌，这样它们在体内的积累显著减少或为零。因此本发明的纳米微粒极大地减少了可能与已知的量子点相关的长期毒性的问题。
在进一步有利的实施方案中，本发明的纳米微粒发射600和700nm之间，特别优选600至650nm，特别优选620至650nm的荧光光谱。该发射光谱由于只被血红蛋白和生活系统中的其他光吸收物质(包括水)少量吸收而具有最大的组织穿透的有利方面。这些波长的光仍然可被人眼感觉，从而治疗医生能够鉴定标记的组织而无需使用用于检测的其他精密技术辅助设备(例如CCD照相机)。当本发明的纳米微粒在外科手术过程中用作造影剂以区分(例如)致癌组织和健康组织时，这是特别有利的。
在一个实施方案中，可按照本发明使用的纳米微粒是已知的具有例如由CdSe、CdS或CdTe组成的核心的纳米微粒，这与例如US 2004/0247861(参考科学出版物)(参见段落[0006]))中描述的一样。在也参考关于核心材料的制备的文献(参见[0007])，例如参考US 6,179,912。关于这些已知的纳米微粒的性质和其制备的公开内容以其全文参考这些文献。
如果本发明的微粒的无机核心主要由半导体构成，则其是特别有利的。这些核心，依赖于它们的个体尺寸和/或组成，发射各种颜色的光，但在光谱的相同区域(UV区至VIS区)内全都显示宽谱带吸收。激发和发射光谱分离很远，因为高斯托克斯位移(Stokes shift)的缘故，使得不同量子点的简单的和同时的激发成为可能。它们具有只有稍许重叠或根本不重叠的狭窄和对称的发射光谱。对于提高穿透深度和体内标记特别重要的进一步的正特性是达到80％的高量子产量和高耐光性。
在WO2005/001889中描述了可代表本发明的纳米微粒的无机核心的量子点。根据该申请，涉及由至少两种半导体的合金组成的无机核心，所述两种半导体均匀分散在合金内或在各情况下在合金内存在浓度梯度。参考上面引用的关于这些量子点的性质和制备的公开内容的WO2005/001889。在各情况下核心的尺寸可相差5％。
因此，本发明的纳米微粒的无机核心可包含至少两种半导体的合金，核心具有均匀的组成且特征在于与两种半导体的摩尔比非线性相关的带隙能(band-gap energy)。
可选择地，核心本质上可以是不均匀的，在该情况下第一半导体的浓度从核心的中心开始至核心的表面逐渐增加，而第二半导体的浓度从核心的中心至其表面逐渐减少。
对于两种核心同样真实的是，半导体的至少一种是II族-VI族半导体或III族-V族半导体(族的定义相应于元素周期表的族)。合金可选自例如下列合金：CdSeTe、CdSSe、CdSTe、ZnSeTe、ZnCdTe、CdHgS、CdHgTe、InGaAs、InGaP、GaAIAs、InGaN。这些合金可额外地具有无机材料例如半导体(例如ZnS)的包衣。该额外的层被本领域技术人员称为“保护层”或“壳”。
II族-VI族和III族-V族半导体是普遍已知的，包括例如CdS1-xSex、CdS1-xTex、CdSe1-xTex、ZnSe1-xTex、Zn1-xCdxTe、Cd1-xHgxS、Cd1-xHgxTe、In1-xGaxAs、Ga1-xAlxAs和In1-xGaxP。优选使用的半导体是CdSe1-xTex、CdS1-xTex、ZnSe1-xTex、Zn1-xCdxTe、Cd1-xHgxS、Cd1-xHgxTe、In1-xGaxAs、In1-xGaxP，其中x是0至1的分数。
半导体的摩尔比可假定为任何摩尔比。然而，在其中合金包含CdSSe的情况下，优选合金具有分子式CdS1-xSex。在其中合金包含CdSTe的情况下，优选合金具有分子式CdS1-xTex。在其中合金包含ZnSeTe的情况下，优选合金具有ZnSe1-xTex的分子式。在其中合金包含ZnCdTe的情况下，优选合金具有单独由CdTe组成的分子式。在这些陈述中，x在各情况下是0和1之间的分数。
可通过下列步骤制备本发明的纳米微粒的此类优选无机核心：(i)在使能够形成纳米晶体的条件下制备第一溶液，(ii)在使不能够形成纳米晶体的条件下制备包含一定摩尔比值的半导体的前体的第二溶液，(iii)将第二溶液加入第一溶液，以使纳米微粒能够形成，和(iv)改变终止/停止纳米晶体的生长和其形成的条件。在WO 2005/001889(关于本发明的纳米微粒的无机核心的该优选实施方案的制备的公开内容参考该申请)中描述了用于制备核心的方法。
在可选择的实施方案中，无机核心可主要由优选包含2和27个贵金属原子的贵金属原子簇组成。在优选实施方案中，贵金属选自金、银、铜、铂、钯、锇、铱、钌和铑。原子簇可具有不同的电荷。
此类核心具有有利方面：由于它们的强吸收和发射，通过使用微弱的汞灯激发，它们可作为单个所谓的纳米点(nanodot)被容易地检测到。具有此类核心的本发明的纳米微粒有利地用作荧光单分子标记和团块标记(mass label)。
在本发明的上下文中，术语“贵金属”是指选自金、银和铜的元素族和铂族金属(PGM)铂、钯、锇、铱、钌和铑。在本发明的优选实施方案中，贵金属选自金、银和铜。在特别优选的实施方案中，贵金属是银或金。
术语“原子簇”是指2至27个金属原子的组合。除其他以外，已知原子簇来自化学分析催化领域、陶瓷领域、半导体技术和材料科学领域。因此本领域技术人员熟知其制备。除其他以外，WO2004/003558描述了贵金属原子簇的制备和额外地包括涉及其的许多其他参考文献。特别地存在与有机分子结合的贵金属纳米原子簇的制备的公开内容。术语结合就此而言理解为每一种类型的连接，无论连接的化学或物质性质(例如共价键、非共价键、静电或范德瓦尔斯键连接)是什么。关于作为本发明的纳米微粒的核心的纳米原子簇的制备参考WO2004/003558。
本发明的纳米微粒具有增加荧光强度和提高无机核心的化学和物理稳定性的钝化层。因此纳米微粒发射优选具有大于10％，优选大于50％的量子产量的光。
本发明的纳米微粒优选在4℃下的水环境中展示至少12个月的保存稳定性和优选在pH 5至pH 10的pH范围内是稳定性的，即它们显示与它们特异性光谱特征例如量子产量、发射最大值的位置、发射光谱的半宽度相比低于50％的偏差。优选颗粒显示与这些特异性光谱特征相比低于10％的偏差。
它们还显示基本上在生物条件下或在体内保持至少3天时间的核心(包括围绕其的钝化层)的性质的恒定性/稳定性。优选微粒显示这样的恒定性/稳定性7至14天或达到数周，其中恒定性在本发明的背景中意指一些或所有上述性质的偏差/改变低于50％。特别优选微粒显示低于10％的偏差/改变。
钝化层包含至少一种能够与金属原子或金属离子例如锌、汞或镉离子配位的化合物。该化合物可以是路易斯碱或具有共振电子的环状或线性不饱和化合物。作为环状不饱和化合物，其也可以是杂环或芳香杂环化合物。在优选实施方案中不饱和或缀合基团相对于分子的结构位于末端位置。钝化层可进一步包含交联剂，或环状或线性不饱和化合物也可用作交联剂。
配位金属原子或金属离子的化合物可通过路易斯碱的螯合作用、配位作用或电子供体性质对荧光无机核心功能性结合和相应地包含缀合部分/基团。此类分子此外还可包含对用其包被的核心赋予在水溶液中的溶解性或可湿性。
此类分子或化合物可包含具有1个、2个或更多个连接的(或融合的)环的同素环(homogeneous ring)或杂合环(杂环)系统。优选芳香杂环系统的实例是噻唑、噻唑衍生物、噁唑、噁唑衍生物、吡咯、吡咯衍生物包括掺杂质或未掺杂质的多吡咯寡聚物、噻吩、噻吩衍生物包括掺杂质和未掺杂质的多噻吩、呋喃、呋喃衍生物、吡啶和吡啶衍生物、嘧啶和其衍生物、吡嗪、吡嗪衍生物、三嗪和三嗪衍生物、三唑、三唑衍生物、酞菁和酞菁衍生物、卟啉和卟啉衍生物。此类化合物可包含也可包括乙炔、丙炔和丙二烯的不饱和(烯烃族的)烃或其胺类、磷衍生物或氧衍生物，但不限于其。对于分子优选具有足够的p或pi电子密度以参与半导体核心表面上的加合物形成或共振。
芳香杂环化合物优选是咪唑组分。对于烷基膦化合物，以交联剂的方式加入是进一步优选的。
术语“咪唑组分”在本说明书的上下文中意指杂环或芳香杂环分子，所述分子包含至少一个咪唑基团(包括咪唑衍生物)和可获得用于将无机核心或钝化层与金属例如镉、锌、镓或金属阳离子或包含该阳离子的底物连接。就此而言，至少一个咪唑基团应当相对于分子的结构优选存在于末端位置。咪唑组分以其功能形式通过包含离域分子轨道的环与荧光纳米晶体结合。咪唑环的氮原子通常用作配位配体从而以功能性方式结合金属离子例如镉或锌离子。
在一个实施方案中，咪唑组分包含反应官能团例如一个或两个氨基酸例如组氨酸、肌肽、鹅肌肽、baleine、高肌肽、组氨酰苯丙氨酸、环-组氨酰苯丙氨酸、5-氨基-4-咪唑羧酰胺、组氨酰亮氨酸、2-巯基咪唑、丁氧基肼基甲酸酯-组氨酸、酰肼、histinol、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、咪唑赖氨酸、包含咪唑的鸟氨酸(例如5-甲基咪唑)、包含咪唑的丙氨酸(例如(β)-(2-咪唑基)-L(α)丙氨酸)、carzinine、组胺。此类基于组氨酸的分子或包含咪唑的氨基酸可通过普遍已知的方法合成。
术语“烷基膦”在本发明的背景中意指分子，所述分子包含至少一个用于结合或螯合非金属例如Se、S或其他非金属或包含此类原子的底物的磷化氢基团(包括其衍生物)或提供至少一个用于与邻近分子反应的官能团(例如，羟基、氨基、巯基、羧基、氨甲酰基等)。
优选至少一个磷化氢基团应当相对于分子的结构位于末端位置。磷化氢部分用作配位配体从而以功能形式将非金属或离子例如Se或S与荧光核心或来自屏蔽层的化合物连接。
在优选实施方案中，包含烷基膦的化合物包含1个、2个或更多个偶联在一起(例如，以多聚体形式)并也可包括羟甲基磷化氢化合物等(但不限于其)的磷化氢基团。包含烷基膦的化合物可通过普遍已知的方法合成。如进一步已知的，包含烷基膦的化合物可额外地包含一个或更多个额外的官能团(例如羟基、氨基、巯基、羧基、氨甲酰基等)。衍生物的实例是羟甲基磷化氢衍生物、酰胺或酯，只要衍生物与作为此处描述的包衣的烷基膦的功能相容。
对于包被本发明的纳米微粒的荧光核心，特别优选的是三(羟甲基)膦和β-[三(羟甲基)膦基]丙酸。普遍已知的是包含交联的烷基膦的化合物具有对金属原子和/或离子例如Zn或Cd的功能性结合的另外的可能性。在这一点上，功能化的异氰酸酯或烷基氰丙烯酸酯可以进一步用作用于配体和与荧光核心的加合物形成的交联剂。
根据本发明存在的钝化层的钝化效应基于表面镉或锌原子等的屏蔽(通过与芳香杂环化合物或杂环(优选与咪唑组分)络合进行的)和抗衡原子(Se或S等)的屏蔽(通过与包含烷基膦的化合物络合进行的)。
在US 2004/0247861 A1中公开了本发明的纳米微粒的钝化层。该公开的说明书描述了用钝化层包覆的无机核心例如量子点的制备。因此为了公开按照本发明使用的钝化层和用其包覆的无机核心的制备，参考US 2004/0247861。
为了结合和交联靶分子和细胞(特异性配体)，钝化层的分子可进一步包含或具有化学基团。在相应的钝化层试剂例如ZnSO4和Na2S存在的情况下，此类分子或化合物可与荧光核心上的分子形成钝化层(“保护层”或“壳”)。
此类试剂还可对荧光纳米晶体表面上的原子或离子功能性结合，从而还可在核心的表面上直接形成该额外的钝化层。
本发明的纳米微粒可在有利的实施方案中额外地包含可由有机和/或无机部分构成的修饰物。它们用于提高纳米微粒在液体或悬浮介质特别是在生理环境中的相容性、功效和/或可溶性。为了在生物学统特别是人体中获得最小的非特异性吸附和增加的相容性，该表面修饰是特别有利的。
一种可能性是使用已批准用于某些医疗应用的聚乙二醇(PEG)(特别地以低分子量形式)修饰表面以保持纳米微粒的小的外形尺寸。这可增加纳米微粒的生物相容性和其血液循环时间以及摄入细胞的功效。通过用其他物质例如维生素例如叶酸结合低分子量PEG层，可能使巨噬细胞更少量地吸收纳米微粒，因为蛋白质对纳米微粒的吸附由此减少，从而阻碍了免疫系统对纳米微粒的识别。
使用单糖、二糖或三糖直至由一种或不同的单糖组成的低分子量多糖的包被代表了通过使用修饰物进行的有利的表面修饰的进一步可能性。一个可能的实施方案是使用例如多聚葡萄糖的修饰，其中可能使用在医学上批准用作血液替代品的葡聚糖。其显示良好的生物相容性/耐受性。进一步的实施方案是使用糖的立体异构形式(D-/L-)以抵销可能的降解。
进一步的实施方案是使用生物相容性亲水性维生素作为修饰物例如硫胺素、核黄素、烟酸、吡多辛、钴胺素、泛酸、抗坏血酸和叶酸。因此，例如，叶酸可导致纳米微粒对癌细胞的优选结合。该维生素只显示低免疫原性，从而显示高生物相容性。对膜结合的叶酸受体的结合促进纳米微粒的细胞内摄作用。
使用亲脂维生素例如视黄醇、维生素D3、维生素E和维生素K1的表面修饰同样是可能的。因此，例如维生素E可导致增加的纳米微粒的细胞摄入。
脂肪酸例如1-十八烯或18-甲基二十烷酸和其衍生物可增加胶体的溶解性和稳定性和具有可用于随后特异性配体的结合的末端功能性羧基。因此包含脂肪酸作为修饰物也是值得的。
表面修饰的进一步实施方案是使用多元醇例如二甘醇(DEG)的包衣，所述包衣能够显著地减少非特异性蛋白吸附。基于其可能获得减少的蛋白质吸附的方面，上述也同样适用于(特别地以其低分子形式)聚四氟乙烯(PTFE，特氟隆)。聚四氟乙烯经常用于心脏外科应用。
同样地可使用一种或更多种天然发生的氨基酸(所述氨基酸包括蛋白质生成或非蛋白质生成氨基酸)和合成的氨基酸进行表面修饰。在这一点上可能使用立体异构体(D和L形式)。由上述氨基酸组成的二肽、三肽、四肽至小的多肽几乎不刺激免疫系统，从而同样适合薄的相容性层。在这一点上，可能性是人造氨基酸序列和来自生物蛋白质的序列。天然蛋白质例如植物螯合肽的肽衍生物同样可用于表面修饰。具有Tat肽和包含Tat肽的肽的表面修饰是制造可获得用于生物医学应用的纳米微粒的进一步可能性。Tat肽是将例如金纳米微粒通过细胞膜带入细胞核的有效分子。
可能的修饰物的进一步实施方案是磷酰胆碱包衣的形成。磷酰胆碱减少例如隐形镜片上的可能的非特异性蛋白质吸附。因为无血栓形成特性，磷酰胆碱修饰可很好地用于生物系统且因高度的长期稳定性而引人注意。
因为聚乳酸是生物相容的，该物质用于多种医疗应用。聚乳酸的低分子量形式特别地是用于本发明的纳米微粒的表面修饰的进一步可能性。在这一点上可能使用立体异构体(D/L形式)以减少可能的生物降解。
除了提及的表面修饰外，可能以可蛋白质水解切割的方式将非特异性蛋白质与纳米微粒连接。这可导致生物相容性/耐受性的增加。大的蛋白质的消除可在靶位置发生，从而在组织中释放小的纳米微粒。同样，消除可能在合适的驻留时间后发生。对于该目的，合适的和优选的是广泛使用的蛋白质例如转铁蛋白乳铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、弹性蛋白和白蛋白以及减少非特异性吸附的其他蛋白。因此，例如，由多肽与弹性蛋白的混合物组成的表面包衣可以阻止不希望的血栓形成，从而增加纳米微粒的生物相容性。
主要的血清蛋白白蛋白能够减少与质膜的非特异性相互作用。相应的修饰的纳米微粒此外还保持通过特异性配体对微粒表面的同时结合而与靶细胞形成特异性相互作用的能力。使用血清白蛋白的包衣可通过防止在静脉内施用后被巨噬细胞快速摄入而导致比在使用未包被的纳米微粒的情况下显著更长的血液循环时间。
除了上述的非特异性包衣外，本发明的纳米微粒携带具有靶细胞特异性配体的选择性标记，例如将它们缀合至蛋白质、抗体、肽或特别优选缀合至小的、高亲和力的蛋白质结构域、抗体片段或结合例如肿瘤细胞特异性结构或其他靶的其他有机分子。
导致提及的更高的扩散率和灌注率的减少的水动力学直径与之前描述的性质和改进以及与特别地可见红光区域中的高荧光强度一起使本发明的纳米微粒成为简单的诊断辅助物，所述辅助物具有用于在体内进行选择性和精确地区分组织类型的多种可能用途。这些可能性与组织特异性生物标记一起特别地用于区分异常的、(癌前)致癌组织与正常组织，在手术干预过程中帮助更精确的肿瘤切除的目测评估。就此而言可使用的本发明的纳米微粒从而用作造影剂。
根据本发明，纳米微粒可用作体外或体内诊断辅助物、治疗诊断剂和/或治疗剂。为此，它们可进行局部(例如瘤内、肌内或外科手术可进入的组织/器官内)施用或全身性(例如，静脉内)施用。局域/局部施用可设想为液体、喷雾溶液、凝胶、泡沫、乳膏、活性帖剂。这对于中空器官的治疗/诊断是特别优选的。也可能以例如液体或以片剂或胶囊剂的形式进行口服摄入。吸入(例如，喷雾)同样是可能的。通过栓剂进行肛门施用是可能的。在一种变化形式中，可以以贮库制剂的形式植入纳米微粒。术语“诊断辅助物”在本发明的背景中用作“造影剂”的同意词，即，其用于可视化区分生物系统特别是活人中的形态学或功能结构，从而帮助医疗干预。
纳米微粒可用作，特别是在手术治疗中用作诊断辅助物。同样它们可用于最低限度的侵入性方法(例如，内窥镜检查法、腹腔镜检查法)。与成像方法例如PET、MRI、CT等的组合是值得的。
如上面已提及的，以局部施用的形式进行的本发明的用途是特别有利的。在这一点上用于局部施用的Cd的量有利地不超过总暴露的十分之一，所述总暴露是在生命过程中以任何方式在处于老年和惯常生活方式的人的肝和肾中正常积累的量。此类器官的总暴露大约为18mg(Saturag等人2000；“British Journal of Nutrition；2000，(84)，791-802)。因此，对于局部施用有利地限制纳米微粒的量，以使提供的Cd的量至少不显著地超过2mg的值。在特别优选实施方案中，甚至当造影剂的量不超过0.6mg，特别优选0.2mg的镉的总量时，肿瘤显像也是可能的。
本实施方案的特别有利方面是由此第一次可能在医疗应用中对活人使用纳米微粒，因为以另外的方式，即例如全身性施用，由于与其相关的毒性的原因，该方式被排除。这是因为局部施用减少了足够显像所必需的纳米微粒的剂量。
已出现：按照本发明有利地将包含Cd的造影剂以相应于0.002至0.02mg Cd/cm3的肿瘤组织的量的剂量用于在体内显现肿瘤。0.002至0.015mg Cd/cm3的肿瘤组织，特别是0.002和0.010mg Cd/cm3之间的造影剂的剂量是特别有利的。使用该有利的剂量可能在体内显现具有达到大约150cm3的体积的肿瘤从而不超过人的正常可接受的暴露的上限。
研究可涉及患者的所有可到达的组织/器官，特别是皮肤、中空器官(例如，在胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道中)或感觉器官的外表上可到达的区域以及还有心血管系统。
作为体外诊断辅助物的用途也是可能的，例如免疫组织化学或FACS以及ELISA。体内和体外诊断(例如活组织检查材料)的组合是特别有利的。
当按照本发明将纳米微粒用于治疗目的时，只有一些纳米微粒的配体可具有效应分子或活性物质即代表性效应物。在这一点上效应物是具有选择功能的配体。纳米微粒有利地具有用于纳米微粒在身体内或组织内的被靶向定位的特异性配体和具有效应分子的配体。
效应物可保持与纳米微粒连接或能够被除去或分离或释放。效应物可以例如通过受体的激活/失活、(表面)结构的掩蔽、免疫系统的激活(“启动”)、信号转导途径的调节、酶的激活或钝化、基因疗法(例如通过质粒或siRNA的被靶向递送)、毒素/化学治疗剂/细胞生长抑制剂的被靶向递送或对例如除其他以外代谢、激素生成的刺激效应来发挥其功能。细胞例如产生胰岛素的B细胞的保护作用也是可能的。
1.方法
a)具有连接的生物素化的单克隆抗体的BP619-中性链亲和素(neutravidin)缀合物的制备
化学试剂和材料
纳米微粒
BP619    200μg/ml
BP619或BP617纳米微粒是本发明的纳米微粒，即其具有US 2004/0247861 A1中公开的CdSxSe核心(“合金核心”)和钝化层。
蛋白质
纯化的蛋白质存在于磷酸/NaCl缓冲液中(在-80℃下贮存)
MES缓冲物质(Sigma)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、EDC(1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)，S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、透析室(Slide-A-Lyzer)、Vivaspin(MWCO 50kDa，VivaScience)
缓冲液
D-PBS(10×)
1370mM NaCl(80g/l)
27mM KCl(2g/l)
42mM Na2HPO4*12H2O(15.4g/l)/7.652g/l Na2HPO4*2H2O
14mM KH2PO4(2g/l)
配制成1000ml，pH应当为7.5，高压灭菌，在室温下贮存。
对于1×PBS溶液，用ddH2O稀释100ml 10×缓冲液，在完全配制成11之前，用数滴2M NaOH调整想要的pH(pH 7.4(Ab)或8.0(QD))。
MES缓冲液＝激活缓冲液
配制新鲜的(有机缓冲液，不能进行高压灭菌)
0.81的配方(0.1M MES，0.25M NaCl，pH 6.0)：
15.616g MES
11.688g NaCl
用ddH2O配制成800ml，调整pH 6.0
用ddH2O配制成最大0.71，然后用2M或5M NaOH调整pH。随后用ddH2O配制成800ml。
1M甘氨酸溶液(如果通过过滤灭菌可在4℃下贮存较长时间)，随意等分。
方法
首先，在玻璃量筒中制备MES缓冲液(激活缓冲液)。在使用前在MES缓冲液中水合透析室1至2分钟。用MES缓冲液在无菌Eppendorf瓶中将100μl BP619(20μg)配制成400μl的终体积并且用移液器充分混合。将BP619转移入透析室(3.5kDa)。在第一次透析中，在室温下在避光的条件下通过连续混合对800ml MES激活缓冲液将BP619透析，进行1小时。在第一次透析后，从透析室中取出BP619，然后转移入Eppendorf瓶内。为了将EDC和S-NHS与BP619混合，在各情况下在即将使用前制备100mM EDC和100mM S-NHS的贮存液。在第一次透析后，使用移液器将33μl 100mM S-NHS和13μl 100mM EDC加入BP619中，然后在避光的条件下以350rpm在室温下摇动，进行15分钟。在温育后，将BP619对PBS透析。为此，将BP619转移入透析室(MWCO 3.5kDa)，然后在避光的条件下对pH 8.0的PBS透析，进行1小时。在第二次透析后，从透析室取出BP619，然后转移到Eppendorf瓶内。将激活的BP619与80μg中性链亲和素(8μl 10mg/ml，使用D-PBS的20μl终体积)混合。然后在避光的条件下以350rpm在室温下摇动该反应混合物，进行2小时。在缀合后，在4℃下避光贮存缀合混合物。第2天，用移液器加入1M甘氨酸至10mM的终甘氨酸浓度以饱和任何仍然存在的反应基团。
使用Vivaspin离心管浓缩BP619缀合物。离心缀合物直至达到想要的浓度。之后按化学计量加入抗膜结合性和肿瘤结合性葡萄糖转运蛋白11(GLUT1)抗原的生物素化的单克隆抗体。
b)BP619与EGF-His的缀合
化学试剂和材料
纳米微粒
BP619    200μg/ml
蛋白质
纯化的蛋白质存在于磷酸/NaCl缓冲液中(在-80℃下贮存)
MES缓冲剂物质(Sigma)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、EDC(1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)，S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、透析室(Slide-A-Lyzer)、Vivaspin(MWCO 50kDa，VivaScience)
缓冲液
D-PBS(10×)
1370mM NaCl(80g/l)
27mM KCl(2g/l)
42mM Na2HPO4*12H2O(15.4g/l)/7.652g/l Na2HPO4*2H2O
14mM KH2PO4(2g/l)
配制成1000ml，pH应当为大约7.5，高压灭菌，在室温下贮存。
对于1×PBS溶液，用ddH2O稀释100ml 10×缓冲液和，在完全配制成11之前，用数滴2M NaOH调整想要的pH(pH 7.4(Ab)或8.0(QD))。
MES缓冲液＝激活缓冲液
制成新配制的(有机缓冲液，不可高压灭菌)
0.81的配方(0.1M MES，0.25M NaCl，pH 6.0)：
15.616g MES
11.688g NaCl
用ddH2O加至800ml，调整pH 6.0
用ddH2O配成最大0.71，然后用2M或5M NaOH调整pH。随后用ddH2O配成800ml。
1M甘氨酸溶液(如果通过过滤灭菌可在4℃下保存长时间)，随意等分。
方法
首先，在玻璃量筒中制备MES缓冲液(激活缓冲液)。在使用前在MES缓冲液中水合透析室(3.5kDa)1至2分钟。用MES缓冲液在无菌Eppendorf瓶中将100μl BP619(20μg)配制成400μl的终体积并且用移液器充分混合。将BP619转移入透析室(3.5kDa)。在第一次透析中，在避光的条件下在室温下通过连续混合将BP619对800ml MES激活缓冲液透析，进行1小时。在第一次透析后，从透析室中取出BP619，然后转移入Eppendorf瓶内。对于将EDC和S-NHS与BP619混合，在各情况下在即将使用前制备100mM EDC和100mM S-NHS的贮存液。在第一次透析后，使用移液器将33μl 100mM S-NHS和13μl100mM EDC加入BP619，然后在避光的条件下以350rpm在室温下摇动，进行15分钟。在温育后，将BP619对PBS透析。为此，将BP619转移入透析室(3.5kDa)，然后在避光的条件下对pH 8.0的PBS透析，进行1小时。在第二次透析后，从透析室取出BP619，然后转移到Eppendorf瓶内。用4.92μg EGF-His(用PBS稀释至20μl的终体积)缀合激活的BP619。为此，用移液器将激活的BP619移入EGF-His中，然后用移液器充分混合。然后在避光的条件下以350rpm在室温下摇动该反应混合物，进行2小时。在缀合后，在4℃下避光贮存缀合混合物。第二天，用移液器加入1M甘氨酸至10mM的终甘氨酸浓度以饱和任何仍然存在的反应基团。
使用Vivaspin离心管(50kDa MWCO)浓缩BP619-EGF-His缀合物。在该情况下，用4ml ddH2O预洗涤膜一次，然后用4ml PBS再洗涤。将BP619-EGF-His缀合物稀释在2ml PBS中，然后装载至膜上。然后用2ml PBS再洗涤BP619-EGF-His缀合物。对缀合物离心直至达到想要的浓度。
c)动物实验
i)方法
为了该目的，将HT29细胞系的人结肠癌细胞皮下注射入裸小鼠(无胸腺，从而受到免疫抑制)，在大约2至3周的生长时间后形成实体瘤。
用依托咪酯麻醉各小鼠以便进行注射，使用25μl纳米微粒瘤内注射所述小鼠；在该情况下在肿瘤中的一个位置的中央进行注射。
从0至5分钟和60分钟记录肿瘤内材料的荧光的动力学。
在杀死小鼠后，首先取出具有表皮的肿瘤，然后取出器官脾、肝、肾。
除去肿瘤的表皮-真皮，用一滴OCT在铝箔(外部朝上)上将其冷冻，包裹在铝箔中，然后在N2中快速冷冻(shock-frozen)。然后在-80℃下贮存直至置于干冰上运回，进一步在-80℃下贮存。
从所有小鼠取出器官脾、肝、肾，在N2中快速冷冻，然后在-80℃下冷冻直至运回。
ii)照相文件
使用的材料/设备
Nikon Coolpix P2照相机
24W冷光源(Eltrotec LB24)
滤光片：
●短波段通光滤波片50％截止波长550nm(Melles Geriot03SWP408或03SWP608)
●“绿”色滤光片550nm(Melles Geriot 03FCG087/OG550)
●“橙”色滤光片570nm(Melles Geriot 03FCG089/OG570)
●“红”色滤光片590nm(Melles Geriot 03FCG098/OG590)
黑色粘土板作为背景。
照相机设置
为拍摄照片，使用商购可获得的数字便携相机(Nikon Coolpix P2)拍摄为记录荧光的照片。下面概述对照相机设定的设置。
  设置   值
  白平衡(WB)   “日光直接照射”(固定的)
  曝光表   “点测光”
  连续拍摄   “单映像”
  最佳拍摄选择器   “关”
  包围曝光(Bracketing)   “包围曝光”
  闪光补偿   “0”
  反差   “正常”
  锐化   “关”
  色饱和度   “+/-0”
  ISO灵敏度   64
  图像质量   “良好”
  图像尺寸   “2592×1944”
  压缩   “中等”
  自动聚焦   “单次自动聚焦”
  固定光阑   “开”
  噪声减低   “关”
  曝光补偿   变量(std.-2)
各图像设置可获自图像文件中的EXIF信息(例如使用Photoshop或PixVue)。
方法
带有滤光片座(filter holder)的照相机架被装在三角架上，然后借助3D头像对其进行调整，以使透镜与小鼠/表面之间的距离为大约15-20cm。从上向下的角度应当尽可能陡，达到三角架位置调整所允许的程度。装上照相滤光片，以使与透镜的距离尽可能小。
使用其光谱受短波段通光滤波片(如上述)控制的冷光源进行物质的照明和激发。由于光源产生的热和为了提高可操作性的原因，将具有透镜的挠屈性光导用于聚焦光锥。将具有短波段通光滤波片的滤光片座装在该光导上。然后将光导固定在实验台中以使至表面的距离为大约15cm。此外应当调整光锥以使其直径为大约8cm。此外从上向下的照明角度应当尽可能陡以减少阴影。
将小鼠和用于照明的实验台置于黑色粘土板上以提高反差。然后将小鼠置于光锥中间。在这一点上应当注意，肿瘤产生最小的阴影且被很好地照亮。
当照相时应当注意自动聚焦显示器。
在正常情况下应当使用最大广角进行照相。对于相对大的图象放大，照相机可变成未聚焦状态，此外，孔径设置发生改变。
如果在照相之间改变照相滤光片，如果可能在实验方案中不应当改变其他任何东西以确保可比较性和有助于随后的加工。
d)细胞结合测定法
材料和装置
荧光显微镜：Leica DMIL，Zeiss LSM510META
信号放大器，ProLong Gold Antifading Reagent
缓冲液
D-PBS(pH 7.4)(10×)
1370mM NaCl(80g/l)
27mM KCl(2g/l)
42mM Na2HPO4 *12H2O(15.4g/l)/7.652g/l Na2HPO4 *2H2O
14mM KH2PO4(2g/l)
调整pH 7.4，配制成1000ml
高压灭菌，在室温下贮存
Triton X-100溶液
0.1％(v/v)于D-PBS
在4℃下贮存
BSA溶液
3％(w/v)于D-PBS
配制新鲜的或来自-20℃的贮存液
4％PFA溶液
5.71ml甲醛(35％)
5ml 10× D-PBS
调整/校正pH 7.4
用ddH2O加至50ml，在4℃下贮存
0.1M甘氨酸溶液
0.375g甘氨酸
加至50ml D-PBS，调整/校正pH 7.4，通过过滤灭菌，在4℃下贮存。
Mowiol/DABCO
在6g甘油(特纯)中混合2.4g Mowiol后，加入6ml ddH2O，然后在室温下搅拌数小时。向其中加入12ml 0.2M tris(pH 8.5)，然后在搅拌的条件下在50℃下加热混合物10分钟。在Mowiol已溶解后(花费10多分钟)，以5000×g离心混合物15分钟，最后加入20mg/mlDABCO。
贮存：以等分在-20℃下贮存，在4℃下只可使用数周，慢慢变硬。
抗体
一抗：抗EGFR mAb(小鼠)Dianova Ab-5 1∶100
二抗：山羊抗小鼠，Alexa488
方法
提前2天，将HT29细胞接种在圆形盖玻片上。为进行接种，转移5×104个细胞，以使在37℃下培养48小时后，在免疫染色开始时提供50-70％的汇合单层。
在室温下在50μl包含3％BSA的McCoy培养基中预温育BP619-EGF-His缀合物，进行30分钟。
当HT29细胞达到汇合时，抽吸全部培养基，用D-PBS洗涤细胞至少1次。
用移液器将30至50μl预温育的BP619-EGF-His缀合物移至洗涤的细胞上，然后在培养箱中在37℃/7.5％CO2下温育1小时。
在已用BP619-EGF-His缀合物对细胞染色后，用PBS洗涤细胞1次，然后在室温下用300μl 4％PFA溶液固定15至20分钟。在固定后，用D-PBS洗涤细胞1次，然后在室温下用0.1M甘氨酸淬灭5分钟。在淬灭后，用D-PBS洗涤细胞1次，然后用0.1％Triton X-100-PBS在室温下透化10分钟。通过随后用3％BSA在室温下温育细胞30分钟来封闭细胞。
在封闭染色的细胞后，可复染色细胞或可在显微镜下直接分析BP619-EGF-His缀合物染色。复染色对于分析共区域化是必需的。
使用一抗、抗EGFR、来自Dianova的单克隆抗体进行复染色。将抗EGFR抗体以1∶100在30μl 1％BSA-PBS中进行稀释，然后用移液器转移至细胞上。在室温下将抗EGFR在细胞上温育60分钟。在温育后，用D-PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。用于复染色的具有荧光色素的二抗是具有Alexa488的山羊抗小鼠抗体。为了该目的，将二抗以1∶200在30μl 1％BSA中稀释，然后用移液器转移至细胞上。将山羊抗小鼠Alexa488二抗在室温下在细胞上温育60分钟。温育后，用D-PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。将细胞包埋在Mowiol/DABCO中，然后在显微镜下进行分析。
e)冷冻切片的制备和染色
将肿瘤在-80℃下贮存，然后在具有冷冻装置(被冷冻至-80℃)的Styropo盒中运输以用于切片。使用冷冻切片机进行切片。所得的切片为10μm厚。
材料和装置
荧光显微镜：Leica DMIL，Zeiss LSM510META、用于洗涤的槽、湿盒、用于标记组织区域的油笔(grease pen)、4％的强度的多聚甲醛溶液(参见细胞结合测定法)、PBS(参见细胞结合测定法)、3％强度的BSA溶液(参见细胞结合测定法)、Triton X-100溶液(参见细胞结合测定法)、0.1M甘氨酸溶液(参见细胞结合测定法)
合适的一抗和二抗，其中合适的用于复染色的其他试剂。
方法
在室温下对冷冻切片解冻并且进行干燥(大约10-20分钟)。在用油笔标记组织区域后，用4％的强度的多聚甲醛溶液在湿盒中固定组织，进行20分钟。在用D-PBS洗涤后，随后用0.1M甘氨酸溶液淬灭5分钟。
在PBS中洗涤和使用0.1％Triton X-100进行透化后，用3％的强度的BSA溶液在室温下封闭1小时。
针对缀合物的抗EGFR-A488用于检测质膜中的EGFR。将该缀合物以1∶100在1％BSA/PBS中进行稀释，然后将切片与其在湿盒中在室温下温育1小时。在槽中使用D-PBS洗涤，进行至少15分钟，至少更换一次缓冲液。
Mowiol/DABCO用于包埋，在显微镜下分析切片(未染色和染色的)。
f)显微镜分析
使用Zeiss LSM510进行样品的显微镜分析。下列滤光片用于该目的：
对NP荧光分析：
FSet 15＝FilterSet 15 488015-0000
激发：BP546
分光镜(Beamsplitter)：FT580
发射：LP 590
对于Alexa488荧光分析：
FSet 46＝FilterSet 46 1196-681
激发：BP500/20
分光镜：FT515
发射：BP535/30
也使用一些样品进行共聚焦激光分析(参见关于操纵显微镜的说明书)。
2.示例性实施方案
示例性实施方案1：
体内实验：通过本发明的中性链亲和素-抗体复合物的瘤内注射， 在裸小鼠中使用HT29异种移植肿瘤进行的动物实验
在对具有异种移植肿瘤的小鼠进行的体内实验中显示了本发明的抗体缀合物的特异性肿瘤寻靶。为了该目的，将HT29细胞系的人结肠癌细胞皮下注射入裸小鼠(无胸腺，从而被免疫抑制)，在3周的生长期后形成实体瘤。
为了进行选择性肿瘤标记，制备本发明的抗体复合物，或具有连接至其的生物素化的单克隆抗体的中性链亲和素缀合物。该单克隆抗体抗在许多类型的人结肠直肠癌上表达的膜结合肿瘤相关性葡萄糖转运蛋白1抗原(GLUT1)。
在复合物的瘤内注射后，在UV激发下通过红色荧光可立即可视地鉴定肿瘤。在注射后达48小时后，可能在制备的肿瘤的冷冻切片中检测到本发明的复合物。
图1：红色信号(中性链亲和素与生物素化的抗GLUT1膜蛋白抗体的缀合物)。对HT-29细胞但非对鼠类细胞的特异性结合是明显的(仍未获得完全肿瘤的均一标记)。
图2：红色信号(中性链亲和素与生物素化的抗GLUT1膜蛋白抗体的缀合物)。对瘤内管(intratumoral duct)的直接相邻处的HT-29细胞而非对鼠类细胞的特异性结合是明显的。(仍未获得完全肿瘤的均一标记)。
示例性实施方案2：
i)通过光谱分析进行的Biopixels 618(本发明的材料)与Crystalplex合金纳米微粒630(NC 630)的强度的比较。NC630纳米微粒是具有CdSxSe1-X/Zn5核心和用COOH基团官能化的纳米微粒。
根据图3，下列值是容易理解的：
BP618的浓度           1.67μg/ml
NC630的浓度           6.70μg/ml
BP618激发360nm        55 000cps
NC630激发360nm        22 000cps
BP618激发488nm        25 000cps
NC630激发488nm        10 000cps
当考虑更高浓度(为4倍)的NC630纳米微粒时，本发明的BP618材料的发射强度高出10倍。
该强度上的差异对于根据本发明使用造影剂在例如手术的医疗应用上直接显像是非常必要的。虽然借助于本发明的材料，治疗医生可能直接观察到荧光或只有借助于荧光滤光片后才观察到荧光，但NC630纳米微粒将需要额外的电子放大才可被看见。
ii)通过凝胶过滤进行的BioPixels 619的表征
图4显示洗脱体积是16.2ml。该值与10.8nm的斯托克斯直径相关。
iii)在注射EGF偶联的BioPixels 619 NC630纳米微粒后小鼠肿瘤的比较
使用在1b)下描述的方法进行BP619与EGF-His的缀合。在该情况下，使用1.4μM的蛋白质，缀合40μg的纳米微粒(＝双份)。在用Vivaspin离心机纯化/浓缩后，将总共大约14.3μg的纳米微粒注射入肿瘤。
如在1c)下所描述的，拍摄照相文件。向其内注射了NC630材料的肿瘤没有显示荧光(图5a，参看标记)，然而在使用本发明的EGF偶联的BioPixels 619的情况下，荧光非常明显(图5b，参看标记)。
iv)使用本发明的EGF偶联的BioPixels 619在肿瘤中进行的组织标记的显微镜检查
使用低温切片机(切片厚度10μm)对取出的肿瘤进行切片，然后进行处理以进行上述的显微镜分析(1e)。使用FSet15通过Zeiss显微镜(LSM510)进行分析以检测BioPixel荧光(参见1f)。肿瘤的标记(参见图6；黑色背景上的白色区域)不均匀；一些区域标记较弱(参见图6a)，而其他区域显示更强的标记(参见图6b)。
c)示例性实施方案3
使用本发明的EGF偶联的BioPixels 619通过细胞内吸收biopixel进行的肿瘤细胞的标记。
在该情况下，使用HT29肿瘤细胞通过描述的方法(1d)进行细胞结合测定法。图7a显示BP619荧光。在该情况下，其荧光只由BP619产生的一些信号用圆圈标记。在图7b中检测了抗体A488的荧光。此处使用的一抗是EGFR抗体，二抗是山羊抗小鼠A488(参见1d)。再一次用圆圈表示其荧光只归属于A488的一些信号。最后，图7c显示一起从7a和7b拷贝的图。许多信号显示共区域化，即，在图7a和图7b上都发现了它们。

Claims (28)

1.荧光纳米微粒制备体内造影剂的用途，其特征在于纳米微粒显示低于700nm的发射，且所述造影剂适合局部应用于人，所述纳米微粒包含无机核心、包含咪唑组分的钝化层和特异性配体，所述纳米微粒具有不超过15nm，优选不超过10nm，特别优选不超过5nm的水动力学直径的具有钝化层的无机核心。
2.权利要求1中所述的用途，其特征在于，600至650nm，优选620至650nm的发射光谱。
3.前述权利要求任一项中所述的用途，其特征在于，施用纳米微粒或全身性、局域或局部注射纳米微粒。
4.前述权利要求任一项中所述的用途，作为造影剂特别是用于手术、内窥镜检查或最小侵入性干预中的组织标记。
5.前述权利要求任一项中所述的用途，其特征在于，纳米微粒额外地包含至少一种修饰物。
6.前述权利要求任一项中所述的用途，其特征在于，无机核心，即主要包含贵金属原子，优选具有2至27个原子的原子簇。
7.前述权利要求1至5任一项中所述的用途，其特征在于，无机核心包含合金/半导体核心，其中核心具有均匀的组成且特征在于，与两种半导体的摩尔比呈非线性相关的带隙能。
8.前述权利要求1至5任一项中所述的用途，其特征在于，无机核心包含第一半导体和第二半导体的合金，其中第一半导体的浓度从核心的中心至其表面逐渐增加，而第二半导体的浓度从核心的中心至其表面逐渐减少。
9.权利要求7和8任一项中所述的用途，其特征在于，至少一种半导体是II族-VI族半导体或III族-V族半导体。
10.权利要求7至9任一项中所述的用途，其特征在于，核心包括选自下列合金：CdSeTe、CdSSe、CdSTe、ZnSeTe、ZnCdTe、CdHgS、CdHgTe、InGaAs、GaAlAs、InGaN、InGaP、CdSe或CdTe。
11.前述权利要求任一项中所述的用途，其特征在于，钝化层包含至少一种能够与金属原子或金属离子配位和具有路易斯碱功能或芳香杂环系统的化合物。
12.权利要求11中所述的用途，其特征在于，咪唑组分包含一种或更多种选自：组氨酸、肌肽、鹅肌肽、baleine、高肌肽、组氨酰苯丙氨酸、环-组氨酰苯丙氨酸、5-氨基-4-咪唑羧酰胺、组氨酰亮氨酸、2-巯基咪唑、丁氧基肼基甲酸酯-组氨酸、酰肼、histinol、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、咪唑赖氨酸、包含咪唑的鸟氨酸(例如5-甲基咪唑)、包含咪唑的丙氨酸(例如(β)-(2-咪唑基)-L(α)丙氨酸)、carzinine、组胺的化合物，其各自也可被反应基团(例如氨基、巯基、羧基或氨甲酰基)取代。
13.权利要求11或12任一项中所述的用途，其特征在于，钝化层包含用于交联咪唑组分的交联剂。
14.权利要求13中所述的用途，其特征在于，交联组分包含烷基膦和/或烷基膦衍生物。
15.权利要求5至14任一项中所述的用途，其特征在于，修饰物选自下列化合物：聚乙二醇、单糖、二糖、三糖、低分子量多糖、亲水性维生素、亲脂性维生素、脂肪酸、多元醇、特氟隆、氨基酸、非特异性肽或蛋白质、磷酰胆碱、聚乳酸和所述化合物的衍生物。
16.包含无机核心、钝化层和特异性配体的纳米微粒，其特征在于，它们显示600至700nm，优选620至650nm的发射，所述纳米微粒具有不超过15nm，优选不超过10nm，特别优选不超过5nm的水动力学直径的具有钝化层的无机核心。
17.权利要求16中所述的纳米微粒，其特征在于，它们额外地包含至少一种修饰物。
18.权利要求16至17任一项中所述的纳米微粒，其特征在于，无机核心包含主要包含贵金属原子的原子簇，优选具有2至27个原子的原子簇，所述原子优选来自金、银和铜。
19.权利要求16或17任一项中所述的纳米微粒，其特征在于，无机核心包含合金/半导体核心，其中核心具有均匀的组成且特征在于，与两种半导体的摩尔比呈非线性相关的带隙能。
20.权利要求16或17任一项中所述的纳米微粒，其特征在于，无机核心包含第一半导体和第二半导体的合金，其中第一半导体的浓度从核心的中心至其表面逐渐增加，而第二半导体的浓度从核心的中心至其表面逐渐减少。
21.权利要求19或20任一项中所述的纳米微粒，其特征在于，至少一种半导体是II族-VI族半导体或III族-V族半导体。
22.权利要求21中所述的微粒，其特征在于，核心包括选自下列合金：CdSeTe、CdSSe、CdSTe、ZnSeTe、ZnCdTe、CdHgS、CdHgTe、InGaAs、GaAlAs、InGaN、InGaP、CdSe或CdTe的合金。
23.权利要求16至22任一项中所述的微粒，其特征在于，钝化层包含至少一种能够与金属原子或金属离子配位和具有路易斯碱功能或芳香杂环系统，优选咪唑组分的化合物。
24.权利要求23中所述的纳米微粒，其特征在于，咪唑组分包含一种或更多种选自：组氨酸、肌肽、鹅肌肽、baleine、高肌肽、组氨酰苯丙氨酸、环-组氨酰苯丙氨酸、5-氨基-4-咪唑羧酰胺、组氨酰亮氨酸、2-巯基咪唑、丁氧基肼基甲酸酯-组氨酸、酰肼、histinol、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、咪唑赖氨酸、包含咪唑的鸟氨酸(例如5-甲基咪唑)、包含咪唑的丙氨酸(例如(β)-(2-咪唑基)-L(α)丙氨酸)、carzinine、组胺的化合物，其各自也可被反应基团(例如氨基、巯基、羧基或氨甲酰基)取代。
25.权利要求24中所述的纳米微粒，其特征在于，交联组分包含烷基膦和/或烷基膦衍生物。
26.权利要求17至25任一项中所述的用途，其特征在于，修饰物选自下列化合物：聚乙二醇、单糖、二糖、三糖、低分子量多糖、亲水性维生素、亲脂性维生素、脂肪酸、多元醇、特氟隆、氨基酸、非特异性肽或蛋白质、磷酰胆碱、聚乳酸和所述化合物的衍生物。
27.包含至少一种权利要求16至26任一项中所述的纳米微粒的药物组合物。
28.权利要求16至26任一项中所述的纳米微粒用作治疗剂、体外诊断辅助物或治疗诊断剂的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102366632A (zh) * 2011-08-22 2012-03-07 长春工业大学 顺磁性金属配合物功能化的荧光金纳米簇磁共振和荧光成像造影剂

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2010009526A (es) 2008-02-29 2010-11-26 Signalomics Gmbh Fragmentos de adhesina optimizados y nanoparticulas correspondientes.
WO2010016803A1 (en) * 2008-08-05 2010-02-11 Agency For Science, Technology And Research Methods, compositions, and articles comprising stabilized gold nanoclusters
KR101032307B1 (ko) * 2008-10-02 2011-05-06 전북대학교병원 생체적합성 분자광학영상용 양자점 및 이의 제조방법
CA2764028A1 (en) * 2009-06-05 2010-12-09 Institut National D'optique Hybrid-multimodal magneto-optical contrast marker
US20130099162A1 (en) * 2010-04-30 2013-04-25 Ocean's King Lighting Science & Technology Co.,Ltd Borate based red light emitting material and preparation method thereof
WO2013123390A1 (en) * 2012-02-16 2013-08-22 Qd Vision, Inc. Method for preparing semiconductor nanocrystals
DE102013206077A1 (de) * 2013-04-05 2014-10-09 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Blau-emittierende Leuchtdioden auf Basis von Zinkselenid-Quantenpunkten
PT2886126T (pt) 2013-12-23 2017-09-13 Exchange Imaging Tech Gmbh Nanopartícula conjugada a péptidos de ligação a cd44
EP3028721A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-08 Exchange Imaging Technologies GmbH Nanoparticle formulation having reverse-thermal gelation properties for injection
JP6683571B2 (ja) * 2016-08-10 2020-04-22 トヨタ自動車株式会社 排ガス浄化触媒
JP2019535805A (ja) * 2016-10-04 2019-12-12 ナノコ テクノロジーズ リミテッド 重合可能量子ドットナノ粒子、並びにそれを用いた治療薬、除去剤及び刺青剤
JP2018115315A (ja) * 2017-01-18 2018-07-26 三菱マテリアル株式会社 可視蛍光を発するＣｄを含まないコロイダル量子ドット及びその製造方法
WO2018135434A1 (ja) * 2017-01-18 2018-07-26 三菱マテリアル株式会社 可視蛍光を発するＣｄを含まないコロイダル量子ドット及びその製造方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0979107A1 (en) * 1997-04-29 2000-02-16 Nycomed Imaging As Light imaging contrast agents
US6207392B1 (en) * 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6306610B1 (en) * 1998-09-18 2001-10-23 Massachusetts Institute Of Technology Biological applications of quantum dots
US6179912B1 (en) * 1999-12-20 2001-01-30 Biocrystal Ltd. Continuous flow process for production of semiconductor nanocrystals
US6748259B1 (en) * 2000-06-15 2004-06-08 Spectros Corporation Optical imaging of induced signals in vivo under ambient light conditions
US20050059031A1 (en) 2000-10-06 2005-03-17 Quantum Dot Corporation Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes
US20020127224A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 James Chen Use of photoluminescent nanoparticles for photodynamic therapy
IL157576A0 (en) * 2001-03-08 2004-03-28 Nanosolutions Gmbh Paramagnetic nanoparticle
WO2003054507A2 (en) 2001-09-17 2003-07-03 Biocrystal, Ltd. Nanocrystals
US7205048B2 (en) * 2001-09-17 2007-04-17 Invitrogen Corporation Functionalized fluorescent nanocrystal compositions and methods of making
CN100356984C (zh) 2002-01-24 2007-12-26 巴内斯－朱威胥医院 整联蛋白靶向的影像剂
CN1672052A (zh) 2002-06-27 2005-09-21 佐治亚技术研究公司 纳米级光学荧光标记及其用途
US7939170B2 (en) * 2002-08-15 2011-05-10 The Rockefeller University Water soluble metal and semiconductor nanoparticle complexes
US20040101822A1 (en) * 2002-11-26 2004-05-27 Ulrich Wiesner Fluorescent silica-based nanoparticles
EP2530719B1 (en) * 2003-05-07 2020-08-05 Indiana University Research and Technology Corporation Alloyed semiconductor concentration-gradient quantum dots, use and method of fabricating thereof
US7790473B2 (en) 2003-11-05 2010-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Biofunctionalized quantum dots for biological imaging
JP2005226021A (ja) * 2004-02-16 2005-08-25 Nihon Medi Physics Co Ltd マンノース受容体親和性化合物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102366632A (zh) * 2011-08-22 2012-03-07 长春工业大学 顺磁性金属配合物功能化的荧光金纳米簇磁共振和荧光成像造影剂

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Publication number Publication date
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JP5537808B2 (ja) 2014-07-02
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