KR20080070746A

KR20080070746A - 형광 나노입자

Info

Publication number: KR20080070746A
Application number: KR1020087014538A
Authority: KR
Inventors: 스벤 라아르만; 캐서린 젤러; 카린 미트만; 크리스토프 블록; 클라우디아 아른츠
Original assignee: 시그날로믹스 게엠베하
Priority date: 2005-11-16
Filing date: 2006-11-16
Publication date: 2008-07-30
Also published as: JP5537808B2; JP2009516182A; AU2006314773B2; WO2007057182B1; CA2628678A1; CA2628678C; US8974767B2; CN101360515A; ES2627998T3; JP2013079962A; US20090226371A1; HK1129567A1; WO2007057182A3; AU2006314773A1; CN101360515B; WO2007057182A2

Abstract

본 발명은 무기 핵, 보호막 층, 및 특정 리간드를 포함하며, 보호막 층을 가진 15 nm 이하, 바람직하게는 10 nm 이하, 특히 바람직하게는 5 nm 이하의 유체 역학적 직경의 무기 핵을 포함하는, 생체 내 진단 보조제를 제조하기 위한 나노입자의 용도에 있어서, 상기 나노입자가 700 nm 미만의 방출을 보여주는 용도에 관한 것이다.

Description

형광 나노입자{Fluorescent nanoparticles}

본 발명은 생체내 진단 보조제로서, 특히 서로 다른 조직 타입을 구별하기 위한 조영제로서 매우 적당한 형광 나노입자에 관한 것이다.

수많은 질병에서, 가능한 빠르고 유익한 진단은 필요한 의료 절차의 선택 및 조화 및 실행을 위해 매우 중요하다. 특히 수많은 암 타입에 적용하기 위해서는 건강하고 발암성인 조직을 구별하는 측정 및 치료(가능한 절개를 포함하는)가 필수적이다. 따라서, 환자의 회복 또는 생존은 치료 및/또는 수술 임상의가 서로 다른 조직 타입을 구별할 수 있는지, 어떻게 잘 구별하는지에 크게 의존한다.

과거에는, 진단 및 의료 절차를 개선하기 위해, 화상 방법에 의해 신체 내의 기능기 및 구조를 볼 수 있는 보조제인 조영제를 개발하여 왔다. 이들 방법들은 특히 암-회합된 세포 변질의 검출을 목적으로 사용되었다.

따라서, 예를 들어, 문헌[Hsu et al. (2004) ("A far-red fluorescent contrast agent to image epidermal growth factor receptor expression", Photochemistry and Photobiology, 79 (3): 272-279)에서는 초기 발암성 변형에 대한 표지자로서 유기 형광 발색단(fluorophore)을 기재로 하는 분자-특이성 조영제를 개발하여 왔다. 이 경우에, 암-회합된 과다발현 표피성장인자 수용체(EGFR)가 적색 형광 항-EGFR 항체 컨쥬게이트(Alexa660)를 통해 구강 내에서 변형된 조직을 확인하는데 이용되었다.

일반적인 유기 형광 발색단의 단점은 그들이 신체 내에서 대사되어 형광 발색단이 분해되거나 비활성화된다는 점이다. 대사는 따라서 진단을 위해 필요한 높은 표지 세기를 방해한다. 생체 내에서 유기 형광 발색단의 동거 시간(residence time)이 증가함에 따라, 이 문제는, 특히 더 깊은 조직 층 내의 세포의 표지에서 증대되며 심각한 어려움으로 나타난다.

더욱이, 더욱 긴 파장을 방출하는 유기 형광 발색단은 특히 그들의 양자 수율(quantum yield)이 화학적 컨쥬게이션 방법에 의해 감소되는 단점을 갖는다. 게다가, 유기 형광 발색단은 광표백(photobleaching)에 매우 민감하며, 심지어 간단한 발광 후에도 실질적인 형광의 손실을 유도할 수 있다. 이러한 형광 발색단을 기재로 하는 조영제는 따라서 더 깊은 조직 층("깊은 조직 화상") 내 세포의 검출/표지에 사용되기에는 너무 낮은, 장기의 여기 시간(excitation time)을 갖는 형광 세기와 안정도를 가진다. 따라서, 수 등(Hsu et al. (2004))의 연구로부터 Alexa660 컨쥬게이트가 0.5 mm의 최대 침투 깊이를 나타내며, 그 결과 형광의 검출이 이론적으로 가능성이 없다는 것이 분명히 나타난다.

세포성 변형의 형광 표지에 대한 또 다른 가능성은 일명 양자점(QDs)의 사용을 포함하며, 그것은 수 나노미터 크기의 CdSe, CdTe, InP 등과 같은 반도체 물질로 이루어진 핵을 갖는 형광 나노입자이다.

그러나, 공지된 QDs가 생물학적 계에 사용되는 경우, 그들은 일명 깜박임 현 상(blinking phenomenon), 즉, 형광 및 비형광 상태 사이에서 나노입자가 교체하는 현상을 보여준다. 이 현상은 양자점을 특히 생체 내에 적용하는데 쓸모없게 만든다. 또한, "깜박임"은 또한 나노입자 핵의 분해를 나타낼 수 있으며, 이로 인해 독성 카드뮴이 신체 내로 방출될 수 있다. 특히 단점인 것은 양자점이 신체 내, 예를 들어, 간 또는 비장에 축적되기 때문이다.

본 발명은 따라서 진단 보조제로서, 특히 생체 내 조영제로서 사용하기에 매우 적당함을 나타내는 형광 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이 목적은 주요 청구항에 진술된 것으로서 달성된다. 독립항과 분리된 종속항은 유리한 구체예에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 선택된 생체 구조 또는 기능기를 특별히 표지화하는데 사용될 수 있다. 특히, 여기서 선택된 나노입자는 의학적 시술(intervention), 특히 외과적 시술을 돕기 위한 생체 내 조영제로서 도움이 될 수 있다.

본 발명의 나노입자는 셋 이상의 구조, 특히 무기 핵(inorganic core)을 포함하며, 그것은 차례로 특정 리간드를 운반하는 보호막 층(passivating layer)에 의해 싸여 있고, 또한 특정 리간드는 보호막 층의 일부가 될 수 있다. 이들은 생체 계의 표적 분자(target)에 대한 나노입자의 특정 결합을 유도한다. 그것을 둘러싼 보호막 층을 갖는 본 발명의 나노입자의 무기 핵은 15 nm 이하, 바람직하게는 10 nm 이하(8 nm 이하의 열역학적 직경) 또는 특히 바람직하게는 5 nm 이하의 유체 역학적(hydrodynamic) 직경을 가진다.

보호막 층은 특히 형광 세기 및 무기 핵의 화학적 및 물리적 안정성을 증가시키는 일을 한다. 보호막 층에 의해 싸인 무기 핵은 10% 이상, 유리하게는 30, 50 또는 70% 이상의 양자 수율(quantum yield)을 특징으로 한다. 양자 수율은 샘플에 의해 방사되는 광의 양 대 샘플에 의해 흡수되는 광의 양의 비를 의미한다. 유리한 보호막 층은 1 nm 이하의 두께를 갖는다. 보호된 핵의 직경은 이 경우 2 nm 이하으로 증가된다.

각각의 경우에서 나노입자에는 또한, 특히 생물학적 환경에의 적합성을 개선하기 위해 개질제(modifier)가 제공되는 것이 유리하다. 바람직한 개질제의 사용을 통한 유체 역학적 반경의 증가는 2 nm를 초과하지 않는다. 보호막 층 및 개질제의 두께는 개개의 경우에서 서로 간의 구조의 관계 및 무기 핵에 대한 관계에도 의존한다.

본 발명의 나노입자의 크기의 제한 때문에, 그들은 특히 생존하는 환자에게 진단 보조제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 크기의 감소는 분산의 속도 및 조직 내로의 침투의 깊이를 증가시키는 결과를 낳는다. 이것은 생물학적 환경에서 나노입자의 균일하고 빠른 분산 및 국부 투여 후 조직(예를 들어, 종양)을 통해 가능한 먼 침투를 허용한다. 본 발명의 나노입자는 마찬가지로 주사에 의해서도 수행될 수 있는 전신 투여(systemic administration)를 허용한다. 그러나, 국부 투여, 예를 들어, 종양의 치료를 위한 국소 투여 또는 내부 또는 종양주위 투여가 바람직하다.

본 발명의 나노입자의 특히 바람직한 구체예는 8 nm 이하, 특히 바람직하게는 4 nm 이하의 유체 역학적 직경을 갖는다. 이 상태의 크기를 가진 나노입자는 신체 내에서 그들의 축적이 명백히 적어지거나 영이 되도록 신장을 통해 배설될 수 있다. 본 발명의 나노입자는 따라서 공지된 양자점과 관련될 수 있는 장기간(long-term) 독성의 문제점을 크게 감소시킨다.

또한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 나노입자는 600 내지 700 nm, 바람직하게는 600 내지 650 nm, 특히 바람직하게는 620 내지 650 nm의 형광 스펙트럼을 방출한다. 이 방출 스펙트럼은 헤모글로빈 및 생체 계에서 빛을 흡수하는 다른 물질(물을 포함)에 의한 낮은 흡수에 기인하는 최대 조직 전달의 장점을 갖는다. 이들 파장의 광은, 치료하는 임상의가 검출을 위한 더욱 복잡한 기술적 보조장치(예를 들어, CCD 카메라) 없이도 표지된 조직을 확인할 수 있도록, 여전히 눈에 의해 인지된다. 본 발명의 나노입자가 (예를 들어) 발암성 및 건강한 조직을 구별하기 위한 외과적 시술 동안 조영제로서 사용될 때 이점은 특히 장점이 있다.

한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 나노입자는 예를 들어 과학적 문헌으로 참조된(문단 [0006]을 참조) 미국 특허 제2004/0247861호에서 기재하고 있는 바와 같이 예를 들어 CdSe, CdS 또는 CdTe로 구성된 핵을 가진 공지된 나노입자이다. 또한 이 문헌에서 핵 물질의 제조에 대한 증거를 첨부하기 위한 참조문헌이 제공된다([0007] 참조, 예를 들어 미국 특허 제6,179,912호). 이들 공지된 나노입자의 특성 및 그들의 제조의 기재에 대한 그들의 전적인 기재에 있어서 이들 문헌에 대한 참조문헌이 제공된다.

본 발명의 나노입자의 무기 핵은 필수적으로 반도체를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이들 핵은 그들의 개개의 크기 및/또는 조성에 의존하여 다양한 색으로 빛을 방출하지만, 광 스펙트럼(UV 에서 VIS 영역)의 같은 영역에서 모두 폭이 넓은 밴드 흡수를 보여준다. 여기 및 방출 스펙트럼은 멀리 떨어져 놓여 있는데, 이는 서로 다른 양자점의 간단하고도 동시적인 여기를 가능하게 하는 하이 스트로크 시프트(high Stokes shift) 때문이다. 그들은 단지 약간 겹치거나 전혀 겹치지 않는 좁고 대칭적인 방출 스펙트럼을 가진다. 특히 침투의 깊이 및 생체 내 표지를 개선하기 위해 매우 중요한 다른 장점은 80%에 달하는 높은 양자 수율과 높은 광안정성이다.

본 발명의 나노입자의 무기 핵을 나타낼 수 있는 양자점은 문헌(WO 2005/001889)에서 공지되었다. 이 문헌에 따르면, 균일하게 분산되거나 그렇지 않으면 농도가 기울어진 둘 이상의 반도체의 합금으로 구성된 무기 핵은 합금이 포함된 각각의 경우에 존재한다. 이들 양자점의 특성 및 제조의 기재에 관해 인용된 참조문헌(WO 2005/001889)이 제공된다. 핵은 각각의 경우에 크기에서 5%까지 다를 수 있다.

따라서, 본 발명의 나노입자의 무기 핵은 둘 이상의 반도체의 합금을 포함할 수 있으며, 상기 핵은 균질한 조성을 가지며 두 반도체의 몰 비율에 대한 비선형의 밴드-갭 에너지를 특징으로 한다.

택일적으로, 핵은 본질적으로 비균질성이 될 수 있으며, 그 경우 제 1 반도체의 농도가 핵의 중심으로부터 그것의 표면에 이르기까지 점진적으로 증가하고, 제 2 반도체의 농도는 핵의 중심으로부터 그것의 표면까지 점진적으로 감소한다.

하나 이상의 반도체가 II족-VI족 반도체 또는 III족-V족 반도체(족의 정의는 원소의 주기율표의 족에 대응한다)인 핵은 모두 본질적으로 동일하다. 합금은 아래의 합금으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, InGaP, GaAIAs, InGaN. 이들 핵들은 추가적으로 예를 들어, 반도체(예를 들어 ZnS)와 같은 무기 물질의 코팅을 가질 수 있다. 이 추가적인 층은 당업자에게 "캡핑" 또는 "껍질"로서 공지되었다.

II족-VI족 및 III족-V족 반도체는 일반적으로 공지되었으며 예를 들어 CdS₁ _-xSe_x, CdS₁ _- _xTe_x, CdSe₁ _- _xTe_x, ZnSe₁ _- _xTe_x, Zn₁ _- _xCd_xTe, Cd₁ _- _xHg_xS, Cd₁ _- _xHg_xTe, In₁ _- _xGa_xAs, Ga_1-xAl_xAs 및 In₁ _- _xGa_xP를 포함한다. 바람직하게 사용되는 반도체는 CdSe₁ _- _xTe_x, CdS₁ _-xTe_x, ZnSe₁ _- _xTe_x, Zn₁ _- _xCd_xTe, Cd₁ _- _xHg_xS, Cd₁ _- _xHg_xTe, In₁ _- _xGa_xAs, In₁ _- _xGa_xP이며, 여기서 x는 0 내지 1의 분수이다.

반도체의 몰 비율은 어떠한 몰 비율이라도 나타낼 수 있다. 그러나, CdSSe를 포함하는 합금의 예에서, 바람직한 합금은 분자식 CdS₁ _- _xSe_x를 갖는다. CdSTe를 포함하는 합금의 예에서, 바람직한 합금은 분자식 CdS₁ _- _xTe_x를 갖는다. ZnSeTe를 포함하는 합금의 예에서, 바람직한 합금은 분자식 ZnSe₁ _- _xTe_x를 갖는다. ZnCdTe를 포함하는 합금의 예에서, 바람직한 합금은 오로지 CdTe로 구성된 분자식을 갖는다. 이들 상태에서, x는 각각의 경우에 0 내지 1의 분수이다.

이들 바람직한 본 발명의 나노입자의 무기 핵은 다음의 단계로 제조될 수 있다: (i) 나노크리스탈을 형성할 수 있는 조건하에서 제 1 용액을 제조하는 단계, (ii) 나노크리스탈을 형성할 수 없는 조건하에서 몰 비율을 가진 반도체의 전구체를 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계, (iii) 나노입자를 형성할 수 있는 제 1 용액에 제 2 용액을 첨가하는 단계, 및 (iv) 나노크리스탈의 성장 및 그것의 형성을 종결/중단하는 조건을 변경하는 단계. 핵을 제조하는 방법은 문헌(WO 2005/001889)에 기재되었으며, 이 문헌은 본 발명의 나노입자의 무기 핵의 바람직한 구체예의 제조의 기재와 관련하여 참조된다.

택일적인 구체예에서, 무기 핵은 바람직하게 2 내지 27 개의 귀금속 원자를 포함하는 귀금속(noble metal) 클러스터를 필수적으로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 귀금속은 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 오스뮴, 이리듐, 루테늄 및 로듐으로 구성된 군으로부터 선택된다. 클러스터는 다양한 전하를 가질 수 있다.

이들 핵들은, 그들의 강한 흡수 및 방출 때문에, 약한 머큐리 램프 여기(excitation)로 단일의 일명 나노점으로서 쉽게 검출될 수 있다는 장점을 갖는다. 이들 핵을 가진 본 발명의 나노입자는 형광 단일-분자 표지 및 다수의(mass) 표지로서 사용되는데 유리하다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "귀금속"은 금, 은 및 구리 및 백금족 금속(PGM) 백금, 팔라듐, 오스뮴, 이리듐, 루테늄 및 로듐으로 구성된 군으로부터 선택된 원소족을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 귀금속은 금, 은 및 구리로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 귀금속은 은 또는 금이다.

용어 "클러스터"는 2-27개의 금속 원자의 조합을 나타낸다. 클러스터는 특히 화학 촉매, 세라믹, 반도체 기술 및 물질 과학의 분야에서 공지되었다. 당업자는 따라서 그것의 제조에 익숙하다. 문헌(W0 2004/003558)은 특히 귀금속 클러스터의 제조에 대해 기재하고 있으며 추가적으로 그들과 관련하여 광범위하게 참조되는 문헌을 포함한다. 특히 유기 분자에 대한 귀금속 나노클러스터의 제조가 공지되었다. 용어 회합(association)은 결합(예를 들어, 공유, 비공유, 정전기적 또는 반데르발스 결합)의 화학적 또는 물리적 성질과 관련없이 모든 타입의 결합(linkage)으로서 이해되는 연결이다. 본 발명의 나노입자의 핵으로서 나노클러스터의 제조에 관한 문헌(W0 2004/003558)이 참조로 제공된다.

본 발명의 나노입자는 형광 세기를 증가시키고 무기 핵의 화학적 및 물리적 안정성을 개선시키는 보호막 층을 갖는다. 상기 나노입자는 따라서 10% 초과, 바람직하게는 50% 초과의 양자 수율로 광을 방출한다.

본 발명의 나노입자는 바람직하게 12 달 이상 4℃인 수용성 환경에서 저장 안정성을 나타내고, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 10의 영역에 걸쳐 안정하며, 다시 말해 그들은 양자 수율, 방출 최대 위치, 방출 스펙트럼의 절반 너비와 같은 그것들의 특정 스펙트럼 특징에 대한 50% 미만의 편향(deviation)을 보여준다. 바람직한 입자들은 이들 특정 스펙트럼 특징에 대한 10% 미만의 편향을 보여준다.

그것들은 또한 필수적으로 생물학적 조건하에서 또는 생체 내에서 3일 이상의 기간 동안 핵(그것을 둘러싼 보호막 층을 포함하는)의 항구성(constancy)/안정성의 특성을 보여준다. 바람직한 입자는 7 내지 14일 또는 여러 주에 달하는 기간 동안 이러한 항구성/안정성을 보여주며, 여기서 항구성은 본 발명의 문맥에서 50%까지의 전술한 특성의 일부 또는 전부의 편향/변경을 의미한다. 특히 바람직한 입자는 10% 미만의 편향/변경을 보여준다.

보호막 층은 금속 원자 또는 금속 이온(예를 들어, 아연, 수은 또는 카드뮴 이온)과 배위할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 이 화합물은 공유 전자를 갖는 루이스 염기 또는 고리형 또는 선형 불포화 화합물이 될 수 있다. 고리형 불포화 화합물로서, 그것은 헤테로고리 또는 헤테로방향족 화합물이 될 수도 있다. 불포화 또는 컨쥬게이트된 기는, 바람직한 구체예에서, 분자의 구조와 관련하여 말단 자리에 위치된다. 보호막 층은 가교제를 더 포함할 수 있거나, 고리형 또는 선형 불포화 화합물이 가교제로서 기능할 수도 있다.

금속 원자 또는 금속 이온과 배위하는 화합물은 형광 무기 핵에 대한 킬레이션, 배위 또는 루이스 염기의 전자 주게 특성을 통해 기능적으로 결합할 수 있으며 상응하는 컨쥬게이트된 부분/기를 포함할 수 있다. 이들 분자는 게다가 그들이 코팅된 핵 상에서 수용액 내 용해도 또는 습윤성(wettability)을 주는 부분을 포함할 수 있다.

이들 분자 또는 화합물은 하나, 둘 또는 그 이상의 결합(그렇지 않으면 접합된) 고리를 갖는 동종 또는 이종의(헤테로고리) 고리 시스템을 포함할 수 있다. 바람직한 헤테로방향족 시스템의 예들은 티아졸, 티아졸 유도체, 옥사졸, 옥사졸 유도체, 피롤, 도프되거나(doped) 도프되지 않은 폴리 피롤 올리고머를 포함하는 피롤 유도체, 티오펜, 도프되거나 도프되지 않은 폴리티오펜을 포함하는 티오펜 유도체, 푸란, 푸란 유도체, 피리딘 및 피리딘 유도체, 피리미딘 및 그것의 유도체, 피라진, 피라진 유도체, 트리아진 및 트리아진 유도체, 트리아졸, 트리아졸 유도체, 프탈로시아닌 및 프탈로시아닌 유도체, 포피린 및 포피린 유도체이다. 이들 화합물은 아세틸렌, 프로핀 및 알렌을 포함할 수도 있는 불포화(올레핀) 탄화수소 또는 그들의 아민, 인 유도체 또는 산소 유도체를 포함할 수 있지만, 이것에 국한되지 않는다. 분자는 반도체 핵의 표면상에 부가물을 형성하거나 공명하는데 충분한 p 또는 pi 전자 밀도를 가지는 것이 바람직하다.

헤테로방향족 화합물은 이미다졸 구성요소가 바람직하다. 또한 가교제로서 첨가되는 알킬포스핀 화합물이 바람직하다.

용어 "이미다졸 구성요소"는 본 명세서의 문맥에서 하나 이상의 이미다졸 기(이미다졸 유도체를 포함하는)를 포함하는 헤테로고리 또는 헤테로방향족분자를 의미하며, 카드뮴, 아연, 갈륨과 같은 금속 또는 금속 양이온 또는 이러한 양이온을 포함하는 기질에 대한 무기 핵 또는 보호막 층의 결합에 유용하다. 이와 관련하여, 하나 이상의 이미다졸 기는 분자의 구조와 관련하여 말단 자리에 있어야 하는 것이 바람직하다. 이미다졸 구성요소는 형광 나노크리스탈에 대해 비편재화된 분자 오비탈을 포함하는 고리를 통해 그것의 관능적 형태에서 결합한다. 이미다졸 고리의 질소는 관능적 방식에서 보통 카드뮴 또는 아연과 같은 금속 이온에 결합하기 위한 배위 리간드로서 작용한다.

한 구체예에서, 이미다졸 구성요소는 하나 또는 둘의 아미노산(들) 예를 들어, 히스티딘, 카노신, 안세린, 발레인, 호모카노신, 히스티딜페닐알라닌, 싸이클로-히스티딜페닐알라닌, 5-아미노-4-이미다졸카복사미드, 히스티딜루신, 2-머캅토이미다졸, boc-히스티딘, 하이드라자이드, 히스티놀, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 이미다조라이신, 이미다졸-포함 오르니틴(예를 들어, 5-메틸이미다졸), 이미다졸-포함 알라닌(예를 들어, (β)-(2-이미다졸일)-L(α)알라닌), 카지닌, 히스타민과 같은 반응성 작용기를 포함한다. 이들 히스티딘-기재 분자 또는 이미다졸-포함 아미노산은 일반적으로 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다.

용어 "알킬포스핀"은 본 발명의 문맥에서 Se, S 또는 다른 비금속과 같은 비금속과 결합하거나 킬레이션하는 하나 이상의 포스핀 기(그것의 유도체를 포함하는)를 포함하는 분자, 또는 이러한 원자를 포함하고, 인접 분자들과 반응하는 하나 이상의 작용기(예를 들어, 하이드록실-, 아미노-, 티올-, 카복실-, 카복사미드- 등)를 제공하는 기질을 의미한다.

바람직하게 하나 이상의 포스핀 기는 분자의 구조와 관련하여 말단 자리에 위치되어야 한다. 포스핀 부분은 보호막 층으로부터 형광 핵 또는 화합물로의 관능적 형태에서 Se 또는 S와 같은 비금속 또는 이온과 결합하기 위한 배위 리간드로서 작용한다.

바람직한 구체예에서, 알킬포스핀-포함 화합물은 함께 결합하는(예를 들어, 고분자 형태에서) 하나, 둘 또는 그 이상의 포스핀 기를 포함하며 하이드록시메틸포스핀 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이것에 국한되지 않는다. 알킬포스핀-포함 화합물은 일반적으로 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 또한 알려진 바와 같이, 알킬포스핀-포함 화합물은 하나 이상의 추가적인 작용기(예를 들어, 하이드록실-, 아미노-, 티올-, 카복실-, 카복사미드- 등)를 추가적으로 포함할 수 있다. 유도체의 예들은 하이드록시메틸포스핀 유도체, 여기서 언급된 코팅으로서 알킬포스핀의 기능에 적합하게 유도체화된 아미드 또는 에스터이다.

특히 본 발명의 나노입자의 형광 무기 핵을 코팅하는데 바람직한 것은 트리스(하이드록시메틸)포스핀 및 β-[트리스(하이드록시메틸)포스피노]프로판산이다. 일반적으로 가교된 알킬포스핀-포함 화합물은 Zn 또는 Cd와 같은 금속 원자 및/또는 이온에 관능적으로 결합할 추가적인 가능성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이것에 관하여, 작용기화된 이소시아네이트 또는 알킬 시아노아크릴레이트는 형광 핵을 갖는 리간드 및 부가물 형태에 대해 유용한 가교제가 될 수 있다.

본 발명에 따라 존재하는 보호막 층의 보호막 효과는 헤테로방향족 화합물 또는 헤테로고리(바람직하게 이미다졸 구성요소를 갖는)와의 컴플렉스에 의한 표면 카드뮴 또는 아연 원자 등의 보호 및 알킬포스핀-포함 화합물과의 컴플렉스를 통한 카운터 원자 (Se 또는 S 등)의 보호를 근거로 한다.

본 발명의 나노입자의 보호막 층은 미국 특허 제2004/0247861 Al호에 기재되었다. 이 공개된 명세서는, 예를 들어 양자점인 보호막 층으로 둘러싸인 무기 핵의 제조에 대하여 기재한다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 보호막 층 및 그것으로 싸인 무기 핵의 제조를 발표하고자 하는 목적의 미국 특허 제2004/0247861호가 참조문헌으로 제공된다.

보호막 층의 분자는 또한 표적 분자 및 세포(특정 리간드)와 결합하고 가교하기 위한 화학적 기들을 포함하거나 운반할 수 있다. ZnSO₄ 및 Na₂S와 같은 상응하는 보호제(passivating reagent)의 존재에서 이들 화합물은 형광 핵("캡핑" 또는 "껍질") 상에 분자와 함께 보호막층을 형성할 수 있다.

이들 시약은 또한 이 추가적인 보호막 층이 또한 핵의 표면상에서 직접적으로 형성될 수 있도록 형광 나노크리스탈의 표면상의 원자 또는 이온에 관능적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 나노입자는, 바람직한 구체예에서, 추가적으로 유기 및/또는 무기 부분을 포함하는 개질제를 포함할 수 있다.

그들은 액체 또는 현탁된 매질에서, 특히 생리적 환경에서 나노입자의 적합성, 효능 및/또는 용해도를 개선하도록 작용한다. 이 표면 변경은 특히 최소의 비특이적 흡수 및 생물학적 계, 특히 인간의 신체 내에서 증가된 적합성을 달성하기 위해 유리하다.

한 가능성은, 특히 저분자량 형태에서, 나노입자의 전체 크기를 작게 유지하기 위해, 이미 어떤 의학적 적용에 승인된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로의 표면의 변경이다. 이것은 나노입자의 생체적합성 및 그것의 혈액 순환 시간 및 세포 내 흡수의 효율을 모두 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 엽산과 같은 비타민과 같은 물질로 더 조합된 저분자량 PEG 층에 의해서는 대식 세포에서 나노입자의 흡수가 더 적게 달성될 수 있는데, 왜냐하면 나노입자에 흡수되는 단백질은 그것에 의해 감소되고, 따라서 면역계에 의한 나노입자의 인지가 방해되기 때문이다.

하나 또는 다른 단당류로 구성되는 단당류, 저분자량의 다당류인 이당류 또는 삼당류로의 코팅은 개질제의 사용을 통해 표면 변경에 장점을 주는 더한 가능성을 나타낸다. 한 가능한 구체예는, 예를 들어, 폴리글루코오스와 함께 변경되며, 혈액 대신으로서 의학적으로 허용된 덱스트란을 사용하는 것이 가능하다. 그것은 우수한 생체적합성/관용성(tolerability)을 보여준다. 다른 구체예는 가능한 분해를 막기 위한 단당류의 입체이성질 형태(D-/L-)의 사용이다.

다른 구체예는, 예를 들어, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 피리독신, 코발라민, 판토세닉산, 아스코르빈산 및 엽산과 같은 개질제로서 생물학적으로 적합한 친수성 비타민을 사용한다. 따라서, 예를 들어, 엽산은 암 세포에 대한 나노입자의 바람직한 결합을 유도할 수 있다. 이 비타민은 단지 낮은 면역원성 및 따라서 높은 생체적합성을 보여준다. 막-조합된 엽산 수용체에의 결합은 나노입자의 내재화를 촉진한다.

레틴알, 콜레칼시페롤, 토코페롤 및 필로퀴논과 같은 지방친화성 비타민으로의 표면 변경도 마찬가지로 가능하다. 따라서, 예를 들어, 비타민 E는 나노입자의 세포성 흡수를 유도할 수 있다.

예를 들어, 1-옥타데센 또는 18-메틸레이코사노이드산 및 그것의 유도체와 같은 지방산은 콜로이드의 용해도 및 안정성을 증가시킬 수 있으며 특정 리간드의 순차적 결합에 사용될 수 있는 말단 작용기의 카복실기를 갖는다. 따라서 개질제로서 지방산을 포함할만도 하다.

표면 변경의 다른 구체예는, 예를 들어, 비특이적 단백질 흡수를 특히 잘 감소시킬 수 있는 디에틸렌 글리콜(DEG)과 같은 폴리알코올 코팅이다. 단백질 흡수의 감소를 달성할 수 있는 것을 근거로 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE, 테프론)에 대해서도, 특히 그것의 저분자량 형태에서, 동일하게 적용된다. 폴리테트라플루오로에틸렌은 심장 수술 적용에서 빈번히 사용되었다.

표면 변경은 마찬가지로 하나 이상의 천연 발생하는 아미노산과 수행될 수 있으며, 그것은 프로테이노제닉(proteinogenic) 및 비프로테이노제닉 아미노산, 및 합성 아미노산을 모두 포함한다. 그것은 입체이성질체(D 및 L 형태) 모두를 사용할 가능성과 연관된다. 상술한 아미노산으로 구성된 저 폴리펩타이드인 디-, 트리-, 테트라는 거의 면역계를 자극하지 않으며, 따라서 마찬가지로 적합성 박막층에 적당하다. 이것과 연관된 가능성은 합성 아미노산 시퀀스 및 생물학적 단백질로부터의 시퀀스이다. 예를 들어, 피토킬라틴과 같은 천연 아미노산의 펩타이드 유도체도 마찬가지로 표면 변경에 사용될 수 있다. Tat 펩타이드 및 Tat 펩타이드-포함 펩타이드로의 표면 변경은 나노입자를 생체의학적 적용에 사용할 수 있도록 하는 또 다른 가능성이다. Tat 펩타이드는, 예를 들어, 핵 내로의 세포막을 통한 금 나노입자를 운반하는데 효율적인 분자이다.

가능한 개질제의 다른 구체예는 포스포릴콜린 코팅의 형성이다. 포스포릴콜린은, 예를 들어, 콘택트 렌즈 상의 비특이적 단백질 흡수를 가능한 감소시킨다. 포스포릴콜린 변경은, 비-혈전 형성의 특성 때문에, 생물학적 계에서 잘 사용될 수 있으며 높은 장기간 안정성에 의해 차별화된다.

폴리락테이트가 생체적합성이기 때문에, 이 물질은 다양한 의학적 적용에 사용된다. 특히 저분자량 형태의 폴리락테이트는 또한 본 발명의 나노입자의 표면 변경에 대해 가능성이 있다. 생분해 가능성을 감소시키기 위해 모든 입체이성질체(D/L 형태)를 사용하는 것과 연관될 가능성이 있다.

게다가 언급된 표면 변경은 나노입자에 대한 단백질 가수분해성 절단 방식에서 비특이적 단백질과 결합될 수 있다. 이것은 생체적합성/관용성에서 증가된 결과를 낳을 수 있다. 더 큰 단백질의 제거는 표적 위치에서 조직 내로 작은 나노입자를 방출할 수 있다. 마찬가지로 제거는 적당한 동거 시간 후에 일어날 수 있다. 이 목적에 적당하고 바람직하게, 예를 들어, 트랜스페린, 락토페린, 세룰로플라스민, 엘라스틴 및 비특이적 흡수를 감소시키는 다른 단백질과 같은 단백질이 광범위하게 사용된다. 따라서, 예를 들어, 엘라스틴을 갖는 폴리펩타이드의 조합으로 구성된 표면 코팅은 바람직하지 않은 혈전 형성을 방지할 수 있으며, 따라서 나노입자의 생체적합성을 증가시킨다.

주된 세럼 단백질 알부민은 플라즈마 막과의 비특이적 상호작용을 감소시킬 수 있다. 상응하는 변형된 나노입자는 더욱이 입자 표면에 대한 특정 리간드의 동시적인 결합을 통해 표적 세포와 특이적 상호작용을 형성하는 능력을 유지한다. 세럼 알부민과의 코팅은 코팅되지 않은 나노입자의 예에서보다 정맥 투여 후 대식 세포에 의한 빠른 흡수의 억제를 통해 혈액 순환 시간을 실질적으로 더 길게 유도할 수 있다.

게다가 전술한 비특이적 코팅, 본 발명의 나노입자는 표적-세포 특이적 리간드와 함께 선택적인 표지를 운반하는데, 예를 들어 그들은 단백질, 항체, 펩타이드 또는, 특히 바람직하게 작은, 높은 친화력 단백질 도메인, 항체 일부분 또는 예를 들어, 암 페포 특이성 구조 또는 다른 표적에 결합하는 다른 유기 분자에 컨쥬게이트된다.

언급된 확산 및 살포의 더 높은 속도를 유도하는, 이전에 기재된 특성 및 개선 및 특히 빛의 가시광선 적색 영역에서 높은 형광 세기와 함께, 감소된 유체 역학적 직경의 조합은, 본 발명의 나노입자를 생체 내에서 조직 타입의 선택적이고 정확한 구별에 다양하게 사용 가능한 간단한 진단 보조제로 만든다. 조직-특이적 생체 표지자와 함께 조합된 이들 가능성은 특히 정상 조직으로부터 비정상적, (전)발암성 조직을 구별하고, 외과적 시술 동안 좀더 정확히 암을 절제하기 위한 시각적 접근을 돕도록 작용한다. 이것과 연관되어 사용될 수 있는 본 발명의 나노입자는 따라서 조영제로서 작용한다.

본 발명에 따른, 나노입자는 시험관 내 또는 생체내 진단 보조제, 테라노스틱(theranostic) 제제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 그들은 국부적으로(예를 들어, 종양 내, 근육 내 또는 수술적으로 접근 가능한 조직/장기 내로) 또는 그렇지 않으면 전신(예를 들어, 정맥)에 투여될 수 있다. 국부/국소적 투여는 액체, 스프레이 용액, 겔, 폼, 크림, 활성 패치로서 될 수 있다. 이것은 특히 공동(hollow) 장기의 치료/진단에 바람직하게 될 수 있다. 예를 들어, 액체 또는 정제 또는 캡슐의 형태로 경구 섭취도 가능하다. 흡입도 똑같이 가능하다(예를 들어, 스프레이). 좌약에 의한 항문 투여가 가능하다. 한 변형에서, 나노입자는 저장 형태로 이식될 수 있다. 용어 "진단 보조제"는 본 발명의 문맥에서 "조영제"에 대한 유사어로 사용되며, 다시 말해 그것은 생물학적 계, 특히 의학적 시술의 도움을 받는 살아있는 인간에서 형태학적 또는 기능적 구조의 시각화를 구별하는 작용을 한다.

나노입자는 특히 의학적 시술에서 진단 보조제로서 사용될 수 있다. 그들은 마찬가지로 최소한의 침투 방법(예를 들어, 내시경 검사, 복강경 검사)에 사용될 수 있다. PET, MRI, CT 등과 같은 영상 방법들과의 조합은 가치가 있다.

이미 상술한 바와 같이, 국부 투여의 형태에서 본 발명에 따른 사용은 특히 유리하다. 이와 관련하여 국부 투여에서 사용되는 Cd의 양은 바람직하게 전체 노출의 10분의 1을 초과하지 않으며 그것은 보통 고령화된 사람의 간 및 신장에 일생 동안 및 일반적인 생활 양식 동안 어떠한 방식으로든 축적된다. 이들 장기의 전체 노출은 약 18 mg(문헌 [Saturag et al. 2000; "British Journal of Nutrition; 2000, (84), 791-802])이다. 따라서, 공급되는 Cd의 양이 적어도 실질적으로 2 mg의 값을 넘지 않도록 제한되는 나노입자의 양으로 국부 투여하는 장점이 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 암 시각화는 카드뮴의 총량이 0.6 mg, 특히 바람직하게 0.2 mg을 넘지 않는 조영제의 양에서도 가능하다.

특히 이 구체예의 장점은 생존하는 인간에 의학적으로 적용되는 나노입자의 사용이 그것에 의해 처음으로 가능해진다는 점이다. 그렇지 않았더라면 - 즉 전신 투여로서 - 이것은 그것과 함께 조합된 독성 때문에 제한되기 때문이다. 이것은 국부 투여가 시각화에 필요한 나노입자의 복용량을 감소시키기 때문이다.

Cd-포함 조영제는 암 조직 cm³당 0.002 내지 0.02 mg의 Cd의 양에 상응하는 복용량으로 생체 내에서 암을 시각화하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 것이 유리한 것으로 나타났다. 암 조직의 Cd/cm³의 0.002 내지 0.015 mg, 특히 Cd/cm³의 0.002 내지 0.010 mg의 조영제의 복용량이 유리하다. 그것은 그것에 의해 인간에 대해 보통 허용되는 노출의 상한치를 넘지 않고 생체 내에서 약 150 cm³에 달하는 부피를 갖는 암을 시각화하기 위해 유리한 복용량이다.

연구는 모든 접근 가능한 환자의 조직/장기, 특히 피부, 공동 장기(예를 들어, 위장, 비뇨 생식기, 호흡기 내) 또는 그외 감각 기관의 외부에서 접근할 수 있는 영역 및 심장 혈관계와 관련될 수 있다.

예를 들어, 면역조직화학 또는 FAGS, 및 ELISA와 같이 시험관 내에서 진단 보조제로서의 사용도 가능하다. 생체 내 및 시험관 내 진단의 조합(예를 들어, 생체 검사 물질)이 특히 유리하다.

치료 목적을 위해 나노입자가 본 발명에 따라 사용되는 곳에서, 단지 일부의 나노입자의 리간드만이 효과기(effector) 분자 또는 활성 물질(즉, 효과기가 나타내는)을 운반한다. 이에 대한 효과기는 선택된 기능을 갖는 리간드이다. 나노입자는 바람직하게 신체 또는 조직 내에서 나노입자의 표적화된 국부에 대한 특정 리간드 및 효과기 분자를 갖는 리간드 모두를 운반한다.

효과기는 나노입자에 결합되어 남을 수 있거나 제거되거나, 분리되거나 방출될 수 있다. 효과기는 예를 들어 수용체의 활성/비활성, (표면)구조의 마스킹(masking), 면역계의 활성화("점화(priming)"), 신호 경로의 변경, 효소의 활성화 또는 비활성화, 유전자 치료(예를 들어, 플라스미드 또는 siRNA의 표적화된 전달에 의한), 독소/화학치료제/세포증식 억제제의 표적화된 운반 또는 예를 들어, 대사, 특히 호르몬 제조의 자극 효과를 통해 그것의 기능을 발현할 수 있다. 세포, 예를 들어, 인슐린-제조 B 세포의 보호도 가능하다.

1. 방법

a) 비오티닐레이트화 결합된 단일 클론의 항체를 갖는 BP619 - 뉴트라비딘 컨 쥬게이트의 제조

화학물질 및 물질

나노입자

BP619 200 μg/ml

BP619 또는 BP617 나노입자가 본 발명의 나노입자이며, 즉. 그것은 미국 특허 2004/0247861 Al에 기재된 바와 같은 CdS_xS_e 핵("합금 핵") 및 보호막 층을 갖는다.

단백질

정제된 단백질은 포스페이트/NaCl 버퍼(-80℃에서 저장)에 존재한다.

MES 버퍼 물질(시그마), NaCl, KCl, Na₂HPO₄, EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드), S-NHS (N-하이드록시설포숙신이미드), 투석 챔버(슬라이드-A-라이저), 비바스핀(MWCO 50 kDa, 비바사이언스).

버퍼

D-PBS (10x)

1370 mM NaCl (80 g/l)

27 mM KCI (2 g/l)

42 mM Na₂HPO₄*12H₂0(15.4 g/l)/7.652 g/l Na₂HPO₄*2H₂0

14 mM KH₂PO₄ (2 g/l)

1000 ml로 만들고, pH는 약 7.5가 되어야 하며, 오토클레이브하여, 실온에서 보관함.

1xPBS 용액을 위해, 100 ml의 10x 버퍼를 ddH₂O로 희석하며, 완전히 1 l로 만들기 전에, 몇 방울의 2 M NaOH로 원하는 pH (pH 7.4 (Ab) 또는 8.0 (QD))로 조절함.

MES 버퍼 = 활성 버퍼

새로 준비함(유기 버퍼, 오토클레이브될 수 없음)

0.8 l에 대한 식(0.1 M MES, 0.25 M NaCl, pH 6.0):

15.616 g MES

11.688 g NaCl

800 ml가 되게 ddH₂0를 첨가, pH 6.0으로 조절

ddH₂O로 최대 0.7 l로 만든 다음, 2 M 또는 5 M NaOH로 pH를 조절함. 이후에 ddH₂O로 800 ml로 만듬.

1 M 글라이신 용액(여과에 의해 살균된다면 4℃에서 장기간 보관할 수 있음), 알리코트(aliquots) 없음

방법

우선, MES 버퍼(활성 버퍼)를 유리 눈금의 실린더에서 제조하였다. 투석 챔버는 사용하기 전에 1 내지 2분 동안 MES 버퍼에서 수화시켰다. 100 μl의 BP619 (20 μg)를 살균한 에펜도르프 바이알에서 MES 버퍼로 최종 부피가 400 μl에 달하도록 제조하였고 피펫으로 완전히 혼합하였다. BP619를 투석 챔버(3.5 kDa) 내로 운반하였다. 1차 투석에서, BP619를 실온에서 800 ml의 MES 활성 버퍼에 대해 투석하고 연속적으로 혼합하고 1 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 1차 투석 후, BP619를 투석 챔버로부터 제거하고 에펜도르프 바이알 내로 옮겼다. BP619로 EDC 및 S-NHS를 혼합하고, 각각의 경우의 100 mM EDC 및 100 mM S-NHS의 저장 용액을 사용하기 전에 즉시 제조하였다. 1차 투석 후, 33 μl의 100 mM S-NHS 및 13 μl의 100 mM EDC를 BP619 내로 피펫으로 옮기고 실온 및 350 rpm에서 흔들어주고, 15 분간 빛으로부터 차단하였다. 배양 후, BP619를 PBS에 대하여 투석하였다. 이 목적을 위해, BP619를 투석 챔버(MWCO 3.5 kDa) 내로 옮기고 pH 8.0인 PBS에 대해 투석하고, 1 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 2차 투석 후, BP619를 투석 챔버로부터 제거하고 에펜도르프 바이알 내로 옮겼다. 활성화된 BP619를 80 μg의 뉴트 라비딘(10 mg/ml에서 8 μl, D-PBS로 20 μl 최종 부피)과 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 다음에 실온에서 350 rpm에서 흔들어주고 2 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 컨쥬게이션 후, 컨쥬게이션 혼합물을 4℃에서 저장하고, 빛으로부터 차단하였다. 다음날, 1 M 글라이신을 여전히 존재하는 어떠한 반응성 기를 포화하기 위해 10 mM의 최종 글라이신 농도로 피펫으로 가했다.

BP619 컨쥬게이트를 비바스핀 원심분리기 튜브를 사용하여 농축하였다. 컨쥬게이트를 원하는 농도에 이를 때까지 원심분리하였다. 이후 막-회합되고 암-회합된 글루코오스 전달자 1 (GLUT1) 항원에 대해 직접 비오티닐화된 단일 클론의 항체를 화학양론적으로 첨가하였다.

b) EGF - His 로의 BP619 의 컨쥬게이션

화학물질 및 물질

나노입자

BP619 200 μg/ml

단백질

버퍼

D-PBS (10x)

1370 mM NaCl (80 g/l)

27 mM KCI (2 g/l)

42 mM Na₂HPO₄*12H₂0(15.4 g/l)/7.652 g/l Na₂HPO₄*2H₂0

14 mM KH₂PO₄ (2 g/l)

MES 버퍼 = 활성 버퍼

새로 준비함(유기 버퍼, 오토클레이브될 수 없음)

0.8 l에 대한 식(0.1 M MES, 0.25 M NaCl, pH 6.0):

15.616 g MES

11.688 g NaCl

800 ml가 되게 ddH₂0를 첨가, pH 6.0으로 조절

방법

우선, MES 버퍼(활성 버퍼)를 유리 눈금의 실린더에서 제조하였다. 투석 챔버(3.5 kDa)는 사용하기 전에 1 내지 2분 동안 MES 버퍼에서 수화시켰다. 100 μl의 BP619 (20 μg)를 살균한 에펜도르프 바이알에서 MES 버퍼로 최종 부피가 400 μl에 달하도록 제조하였고 피펫으로 완전히 혼합하였다. BP619를 투석 챔버(3.5 kDa) 내로 운반하였다. 1차 투석에서, BP619를 실온에서 800 ml의 MES 활성 버퍼에 대해 투석하고 연속적으로 혼합하고 1 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 1차 투석 후, BP619를 투석 챔버로부터 제거하고 에펜도르프 바이알 내로 옮겼다. BP619로 EDC 및 S-NHS를 혼합하고, 각각의 경우의 100 mM EDC 및 100 mM S-NHS의 저장 용액을 사용하기 전에 즉시 제조하였다. 1차 투석 후, 33 μl의 100 mM S-NHS 및 13 μl의 100 mM EDC를 BP619 내로 피펫으로 옮기고 실온 및 350 rpm에서 흔들어주고, 15 분간 빛으로부터 차단하였다. 배양 후, BP619를 PBS에 대하여 투석하였다. 이 목적을 위해, BP619를 투석 챔버(3.5 kDa) 내로 옮기고 pH 8.0인 PBS에 대해 투석하고, 1 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 2차 투석 후, BP619를 투석 챔버로부터 제거하고 에펜도르프 바이알 내로 옮겼다. 활성화된 BP619를 4.92 μg의 EGF-His(PBS로 20 μl 최종 부피로 희석)와 컨쥬게이트하였다. 이 목적을 위해, 활성화된 BP619를 EGF-His 내로 피펫으로 옮기고 피펫으로 완전히 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 다음에 실온에서 350 rpm에서 흔들어주고 2 시간 동안 빛으로부터 차단하였다. 컨쥬게이션 후, 컨쥬게이션 혼합물을 4℃에서 저장하고, 빛으로부터 차단하였다. 다음날, 1 M 글라이신을 여전히 존재하는 어떠한 반응성 기를 포화하기 위해 10 mM의 최종 글라이신 농도로 피펫으로 가했다.

BP619-EGF-His 컨쥬게이트를 비바스핀 원심분리기 튜브(50 kDa MWCO)를 사용하여 농축하였다. 이 경우 막을 4 ml의 ddH₂O로 미리 한 번 세척하고 다시 4 ml의 PBS로 세척하였다. BP619-EGF-His 컨쥬게이트를 2 ml의 PBS로 희석하고 막 상에 올렸다. 다음에 BP619-EGF-His 컨쥬게이트를 다시 2 ml의 PBS로 세척하였다. 컨쥬게이트를 원하는 농도에 이를 때까지 원심분리하였다.

c) 동물 실험

i) 방법

이 목적을 위해, HT29 셀 라인의 인간의 결장암종 세포를 누드 마우스 내의 피하로 주입(흉선을 제외하고 따라서 면역억제됨)하였으며 약 2 내지 3 주의 성장 기간 후 고형암이 형성되었다.

각 마우스는 주입을 수행하기 위해 힙노미데이트(Hypnomidate)로 마취하였고 25 μl의 나노입자 용액을 종양 내 주입하였고; 이 경우 주입은 종양 내의 한 위치를 중심으로 일어난다.

종양 내에서 물질의 형광의 동역학이 0 내지 5 및 60 분간 기록되었다.

희생 후, 우선 표피의 종양을 제거한 다음 장기인 비장, 간, 신장을 제거하였다.

종양은 표피-진피와 함께 제거되었으며, 한 방울의 OCT와 함께 알루미늄 호일 상에서 냉동하고(외부 포인팅 이상), 알루미늄 호일에 포장하고 N₂하에서 급속-냉동(shock-frozen)하였다. 다음에 운반되는 동안 드라이 아이스 백에서 -80℃, 또한 -80℃에서 저장하였다.

장기인 비장, 간, 신장을 모든 마우스들로부터 제거하고 N₂하에서 급속-냉동하고 백에 옮길 때까진 -80℃에서 저장된다.

ii) 사진 문서

사용된 물질/장치

니콘 쿨픽스 P2 카메라

24W 차가운 광원(일렉트로텍 LB24)

광학 필터:

ㆍ 쇼트패스 필터 50% 컷오프 파장 550 nm (멜레스 제리오트 03SWP408 또는 03SWP608)

ㆍ "그린" 컬러 필터 550 nm (멜레스 제리오트 03F00087/OG550)

ㆍ "오렌지" 컬러 필터 570 nm (멜레스 제리오트 03FCG089/0G570)

ㆍ "레드" 컬러 필터 590 nm (멜레스 제리오트 03FCG098/ OG590)

백그라운드로서 블랙 클레이 보드.

카메라 세팅

형광의 증거 자료로 첨부하기 위한 사진은 상업적으로 유용한 디지털 콤팩트 카메라(니콘 쿨픽스 P2)로 찍었다. 카메라상에 만들어진 세팅을 아래에 요약하였다.

세팅	값
화이트 밸런스(WB)	"직접 햇빛"(고정된)
노출 메터링(Exposure metering)	"스팟 메터링"
연속 슛팅	"단일 이미지"
베스트 샷 셀렉터	"오프"
브래킷팅(Bracketing)	"브래킷팅"
플래쉬 보상	"0"
대조	"노멀"
샤프닝(sharpening)	"오프"
색 포화	"+/-0"
ISO 민감도	64
이미지 질	"파인"
이미지 크기	"2592 x 1944"
압축	"미디움"
오토포커스	"단일 오토포커스"
고정된 조리개	"On"
노이즈 감소	"Off"
노출 보상	배리어블(variable)(std. -2)

각 이미지 세팅은 이미지 파일(예를 들어, 포토샵 또는 픽스뷰(PixVue))에서 EXIF 정보로부터 얻어질 수 있다.

방법

카메라를 삼각대 상에 필터 홀더와 함께 장치하고 렌즈 및 마우스/표면 사이의 거리가 약 20 cm가 되도록 3D 헤드의 보조장치를 조절하였다. 각은 삼각대의 위치에서 수행하는 한, 가능한 위로부터 경사가 급해야 한다. 사진 필터를 렌즈로부터의 거리가 가능한 작아지도록 장치한다.

물질의 조명 및 여기는 차가운 광원에 의해 일어나며 그것의 스펙트럼은 쇼트 패스 필터에 의해 조절하였다(전술 참조). 광원에 의해 생성되는 열 및 조작성의 개선 때문에, 렌즈를 갖는 탄력적인 광 가이드를 광 콘(light cone) 포커스에 사용하였다. 쇼트 패스 필터를 가진 필터 홀더를 이 광 가이드 상에 장치하였다. 광 가이드를 다음에 표면까지의 거리가 약 15 cm가 되도록 실험용 스탠드에 고정하였다. 광 콘은 더욱이 그것의 직경을 약 8 cm가 되도록 조절되어야 한다. 더욱이 위로부터 조명의 각은 그림자를 가능한 한 감소시키기 위해 경사가 급해야 한다.

조명에 대한 마우스 및 실험용 스탠드는 대조를 개선하기 위해 블랙 클레이 보드 상에 위치된다. 마우스는 다음에 광 콘의 중심에 위치된다. 케어(Care)는 종양이 최소의 그림자를 만들고 잘 빛나는 것과 관련하여 찍어야 한다.

오토포커스 디스플레이는 사진을 찍었을 때 주의하여야 한다.

사진은 최대 광각을 갖는 보통 예에서 찍어야 한다. 상대적으로 큰 줌 카메라는 비초점화될 수 있고, 또한, 조리개 세팅이 변할 수 있다.

만약, 사진 필터가 사진 사이에서 변한다면, 비교를 보증하고 이후의 공정을 촉진하기 위해 실험 구성은 가능한 변하면 안된다.

d) 세포-결합 에세이

물질 및 장치

형광 현미경: 레이카(Leica) DMIL, 자이스(Zeiss) LSM510META

신호 인핸서, 프로롱 골드 안티 페이딩 제제(ProLong Gold Antifading Reagent)

버퍼

D-PBS (pH 7.4)(10x)

1370 mM NaCl (80 g/l)

27 mM KCI (2 g/l)

42 mM Na₂HPO₄*12H₂0(15.4 g/l)/7.652 g/l Na₂HPO₄*2H₂0

14 mM KH₂PO₄ (2 g/l)

pH를 7.4로 조절하고 1000 ml로 만들고, 오토클레이브하여, 실온에서 보관함.

트리톤 X-100 용액

D-PBS 내에서 0.1% (v/v)

4℃에서 저장

BSA 용액

D-PBS 내에서 3% (w/v)

새로 준비하거나 -20℃로 저장

4% PFA 용액

5.71 ml의 포름알데히드(35%)

5 ml의 10x D-PBS

조절/체크 pH 7.4

50 ml가 되게 ddH₂O를 첨가, 4℃에서 저장

0.1 M 글라이신 용액

0.375 g의 글라이신

50 ml가 되게 D-PBS 첨가, 조절/체크 pH 7.4, 여과에 의해 살균, 4℃에서 저장

모이올(Mowiol)/DABCO

6 g의 글리세롤(엑스트라 퓨어) 내 2.4 g의 모이올을 혼합한 것에 6 ml의 ddH₂O를 첨가한 다음 실온에서 여러 시간 교반하였다. 여기에 12 ml의 0.2 M 트리스(pH 8.5)를 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하면서 10 분간 50℃에서 가열하였다. 모이올이 용해된 후(10 분 이상 걸림), 혼합물을 5000 x g에서 15 분간 원심분리하고 최종적으로 20 mg/ml DABCO를 첨가하였다.

저장: 알리코트, -20℃에서, 4℃에서는 단지 몇 주만 사용할 수 있으며, 천천히 굳음

항체

제 1 항체: 항-EGFR mAb(마우스) 디아노바 Ab-5 1:100

제 2 항체: Alexa488을 갖는 산양 항-마우스

방법

2 일전에, HT29 세포를 원형 커버슬립(coverslips)에 시드하였다. 시딩을 위해, 5 x 10⁴ 세포를 옮겼으며, 37℃에서 48 시간 동안 성장시킨 후, 면역염색의 시작 단계에서 50-70% 합류하는 단일층(confluent monolayer)이 나타난다.

BP619-EGF-His 컨쥬게이트를 3% BSA를 포함하는 50 μl의 맥코이 미디움에서 실온에서 30 분간 전배양하였다.

HT29 세포가 합류에 도달하면, 미디움을 빨아내고 상기 세포를 한 번 이상 D-PBS로 세척한다.

30 내지 50 μl의 전배양된 BP619-EGF-His 컨쥬게이트를 상기 세척된 세포 상에 피펫으로 옮기고 배양기에서 37℃/7.5% CO₂에서 1 시간 동안 배양하였다.

세포가 BP619-EGF-His 컨쥬게이트로 염색된 후, 상기 세포를 PBS로 한 번 세척하고 300 μl의 4% PFA 용액으로 실온에서 15 내지 20 분간 고정하였다. 고정 후, 세포를 D-PBS로 한 번 세척하고 실온에서 5 분간 0.1 M 글라이신으로 퀀칭(quenching)하였다. 퀀칭 후, 세포를 D-PBS로 한 번 세척하고 실온에서 0.1% 트리톤 X-100-PBS로 10 분간 투과시켰다. 세포를 다음에 실온에서 30 분간 3% BSA로 배양하는 것에 의해 블록(blocked)시켰다.

염색된 세포의 블로킹 후, 세포는 대비염색될 수 있거나 BP619-EGF-His 컨쥬게이트 염색은 현미경하에서 직접 분석될 수 있다. 대비염색은 동일부위(colocalization)를 분석하기 위해 필수적이다.

대비염색은 제 1 항체, 디아노바로부터의 단일 클론의 항체인 항-EGFR로 수행된다. 항-EGFR 항체는 30 μl의 1% BSA-PBS에서 1:100으로 희석하고 피펫으로 세포에 옮겼다. 항-EGFR은 실온에서 60 분간 세포 상에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 3 x 5 분에 대해 D-PBS로 세척하였다. 대비염색하는 형광 색소를 갖는 제 2 항체는 Alexa488을 갖는 산양 항-마우스이다. 이 목적을 위해, 제 2 항체를 30 μl의 1% BSA에서 1:100으로 희석하고 피펫으로 세포에 옮겼다. 산양 항-마우스 Alexa488 제 2 항체를 실온에서 60 분간 세포 상에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 3 x 5 분에 대해 D-PBS로 세척하였다. 세포를 모이올/DABCO에 내장하고 현미경 에서 분석하였다.

e) 냉동 부분의 제조 및 염색

종양을 -80℃에서 저장하고 절개를 위해 냉각기(-80℃로 냉각)를 갖는 스타이로퍼 박스에 옮겼다. 절개는 냉동미세조직절단기(cryomicrotome)으로 수행하였다. 결과적인 절개부분은 10 μm 두께이다.

물질 및 장치

형광 현미경: 레이카 DMIL, 자이스 LSM510META, 세척을 위한 홈통(troughs), 습도 챔버, 조직을 마킹하기 위한 그리스 펜, 4% 세기 파라포름알데히드 용액(셀-바인딩 에세이 참조), PBS(셀-바인딩 에세이 참조), 3% 세기 BSA 용액(셀-바인딩 에세이 참조), 트리톤 X-100 용액(셀-바인딩 에세이 참조), 0.1 M 글라이신 용액(셀-바인딩 에세이 참조)

적당한 제 1 및 제 2 항체, 여기서 대비염색을 위한 적당한 다른 시약

방법

냉동 부분을 실온에서 녹이고 건조시켰다(약 10-20 분). 조직 영역을 그리스 펜으로 표시한 후, 상기 조직을 습도 챔버에서 20 분간 4% 세기 파라포름알데히드 용액으로 고정하였다. D-PBS로 세척한 다음, 0.1 M 글라이신 용액으로 5 분간 퀀칭하였다.

PBS에 세척하고 0.1% 트리톤 X-100으로 투과시킨 다음 3% 세기 BSA 용액으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다.

항-EGFR-A488 다이렉트 컨쥬게이트는 플라즈마 막에서 EGFR을 검출하는데 사 용하였다. 컨쥬게이트를 1% BSA/PBS에서 1:100으로 희석하고, 부분을 습도 챔버에서 1 시간 동안 그것으로 배양시켰다. D-PBS로의 세척은 하나 이상의 버퍼를 변경하며 15 분 이상 홈통에서 수행하였다.

모이올/DABCO는 내장(embedding)을 위해 사용하였고, 부분(비염색되고 염색된)은 현미경으로 분석하였다.

f) 현미경 분석

견본의 현미경 분석은 자이스 LSM510으로 하였다. 다음의 필터는 이 목적을 위해 사용하였다:

NP 형광 분석을 위해:

FSet 15= FilterSet 15 488015-0000

여기: BP546

빔스플리터: FT580

발광: LP 590

Alexa488 형광 분석을 위해:

FSet 46= FilterSet 46 1196-681

여기: BP500/20

빔스플리터: FT515

발광: BP535/30

공초점의 레이저 분석을 일부의 견본에 대해서도 수행하였다(현미경 사용을 위한 지시 참조).

2. 실시예

실시예 1:

생체내 실험: 동물 실험은 HT29 이종이식 종양을 가진 마우스에서, 본 발명에 따른 뉴트라비딘-항체 컴플렉스를 종양 내 투여

본 발명에 따른 항체 컨쥬게이트의 특정한 종양 표지는 이종이식 종양을 가진 마우스에서의 비바(viva) 실험으로 보여진다. 이 목적을 위해, HT29 셀 라인의 인간의 결장암종 세포를 누드 마우스 내의 피하로 주입(흉선을 제외하고 따라서 면역억제됨)하였으며 3 주의 성장 기간 후 고형암이 형성되었다.

선택적인 종양 마킹을 위해, 본 발명에 따른 항체 컴플렉스나, 비오티닐레이트된 단일 클론의 항체가 결합된 본 발명에 따른 뉴트라비딘 컨쥬게이트를 제조하였다. 이 단일 클론의 항체를 많은 타입의 인간 결장 암종에서 발현되는 막-회합된 종양-회합된 글루코오스 전달자 1 항원 (GLUT1)에 대해 향하도록 하였다.

컴플렉스의 종양 내 주입 후, 종양을 UV 여기를 갖는 적색 형광에 의해 시각적으로 즉시 확인할 수 있다. 주입 후 48 시간 후, 종양의 제조된 냉동 부분에서 본 발명의 컴플렉스를 검출하는 것이 가능하였다.

도 1: 적색 신호(GLUT1 막 단백질에 대한 뉴트라비딘 및 비오티닐레이트된 항체의 컨쥬게이트). 뮤린 세포가 아닌 HT-29 세포에 대한 특정 결합이 증거이다(완전한 종양의 균질성 마킹은 아직 달성되지 않음).

도 2: 적색 신호(GLUT1 막 단백질에 대한 뉴트라비딘 및 비오티닐레이트된 항체의 컨쥬게이트). 뮤린 세포가 아닌 종양 내 도관의 직접 전후에서 HT-29 세포 에 대한 특정 결합이 증거이다(완전한 종양의 균질성 마킹은 아직 달성되지 않음).

실시예 2:

i) 스펙트럼 분석에 의한 바이오픽셀 618(본 발명에 따른 물질)과 크리스탈플렉스 합금 나노입자 630(NC630)의 세기의 비교. NC630 나노입자는 CdS_xS_e1 _-x/Zn5 핵을 가지며 COOH 기로 관능화된 나노입자이다.

다음의 값은 도 3으로부터의 증거이다:

BP618 농도 1.67 μg/ml

NC630 농도 6.70 μg/ml

BP618 여기 360 nm 55 000 cps

NC630 여기 360 nm 22 000 cps

BP618 여기 488 nm 25 000 cps

NC630 여기 488 nm 10 000 cps

4의 인수에 의한 NC630 나노입자의 더 높은 농도가 반영될 때, 본 발명의 BP618 물질의 방출 세기는 10 초과의 인수이다.

직접적인 시각화, 예를 들어, 수술에서 의학적 적용을 위한 조영제의 본 발명에 따른 사용을 위해서는 세기에서 이러한 차이가 매우 필수적이다. 본 발명의 물질로 치료하는 임상의가 단지 형광 필터의 보조장치만으로도 직접적으로 형광을 관찰할 수 있는 반면, NC630 나노입자는 시각화하기 위해 추가적인 전기적 증폭을 필요로 한다.

ii) 겔 여과에 의한 바이오픽셀 619의 분석

도 4는 용출 부피가 16.2 ml임을 보여준다. 이 값은 10.8 nm의 스트로크 직경과 관련된다.

iii) EGF-결화된 바이오픽셀 619, NC630 나노입자의 주입 후 마우스 종양의 비교

EGF-His를 갖는 BP619의 컨쥬게이션은 1b)에 기재된 방법에 의해 수행하였다. 이 경우, 1.4 μM 단백질을 사용하였으며, 40 μg의 나노입자 (= 복제된)가 컨쥬게이트되었다. 비바스핀 원심분리기로 정제/농축한 후, 전체 약 14.3 μg의 나노입자를 종양에 주입하였다.

사진 증거자료는 1c)에 기재된 방법에 의해 수행하였다. NC630 물질이 주입된 종양은 형광을 보여주지 않는 반면(도 5a, 마킹을 참조), 본 발명의 바이오픽셀 619와 결합된 EGF의 사용은 형광을 명확하게 증명한다(도 5b, 마킹을 참조).

iv) 본 발명의 바이오픽셀 619와 결합된 EGF로 종양 내의 조직 마킹의 현미경 검사

제거된 종양은 냉동조직절편기(절단 두께 10 μm)를 사용하여 절개하며 현미경 분석을 위해 상술한 (1e)에 기재된 바와 같이 처리하였다. 분석은 바이오픽셀 형광(1f 참조)을 검출하기 위해 FSet15를 사용하는 자이스 현미경(ILSM510)에서 수행하였다. 종양의 마킹(도 6 참조; 어두운 배경 상에 흰색 영역)은 균질성이지 않다; 일부 영역은 덜 세게 표시되며(도 6a 참조), 여기서 다른 것은 더 강한 마킹을 보인다(도 6b 참조).

실시예 3

바이오픽셀의 세포 내 흡수를 갖는 본 발명의 바이오픽셀 619와 결합된 EGF를 갖는 종양 세포의 마킹

이 예에서, 세포-결합 에세이는 (1d)에 기재된 방법에 의해 HT29 종양 세포로 수행하였다. 도 7a는 BP619 형광을 보여준다. 이 예에서, 형광을 갖는 일부의 신호는 원에 의해 표시된 BP619에 의해서만 나타난다. 항체 A488의 형광은 도 7b에서 검출되었다. 여기서 사용된 제 1 항체는 EGFR 항체였으며 제 2 항체는 산양 항-마우스 A488(1d 참조)였다. 다시 한 번, 형광을 가진 일부의 신호는 원으로 그려진 A488에만 기인한다. 최종적으로, 도 7c는 7a 및 7b로부터 함께 복제된 도면을 나타낸다. 많은 신호는 동일부위를 나타내며, 즉, 그들은 도 7a 및 도 7b 모두에서 발견된다.

Claims

무기 핵(inorganic core), 이미다졸 구성요소를 포함하는 보호막 층(passivating layer), 및 특정 리간드를 포함하며, 보호막 층을 가진 무기 핵의 유체 역학적(hydrodynamic) 직경이 15 nm 이하, 바람직하게는 10 nm 이하, 특히 바람직하게는 5 nm 이하인, 생체 내 조영제를 제조하기 위한 형광 나노입자의 용도에 있어서, 상기 나노입자가 700 nm 미만의 방출(emission)을 보여주며, 상기 조영제가 인간에서 국부적으로 적용하기에 적당함을 특징으로 하는 용도.
제 1 항에 있어서, 방출 스펙트럼이 600 내지 650 nm, 바람직하게는 620 내지 650 nm임을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 나노입자가 전신, 국소 또는 국부적으로 투여 또는 주입됨을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 조영제로서의, 특히 수술(surgical), 내시경(endoscopic), 또는 최소 침습 시술(minimally invasive intervention)에서 조직을 마킹(marking)하는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 추가적으로 하나 이상의 개질제(modifier)를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 핵이 귀금속 원자를 필수적으로 포함하는 클러스터를 포함하며, 바람직하게 클러스터는 2 내지 27 개의 원자를 가짐을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 핵이 합금/반도체 핵을 포함하며, 여기서 상기 핵은 균질한 조성을 가지며 두 반도체의 몰 비율에 대한 비선형의 밴드-갭 에너지를 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 핵이 제 1 반도체 및 제 2 반도체의 합금을 포함하며, 여기서 제 1 반도체의 농도가 핵의 중심으로부터 그것의 표면에 이르기까지 점진적으로 증가하고, 제 2 반도체의 농도는 핵의 중심으로부터 그것의 표면까지 점진적으로 감소함을 특징으로 하는 용도.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 하나 이상의 반도체가 II족-VI족 반도체 또는 III족-V족 반도체임을 특징으로 하는 용도.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵이 CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, GaAIAs, InGaN, InGaP, CdSe 또는 CdTe로 구성된 군으로부터 선택되는 합금을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 보호막 층이 금속 원자 또는 금속 이온과 결합할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하며 루이스 염기 관능기 또는 헤테로방향족계를 가짐을 특징으로 하는 용도.
제 11 항에 있어서, 이미다졸 구성요소가 히스티딘, 카노신, 안세린, 발레인, 호모카노신, 히스티딜페닐알라닌, 싸이클로-히스티딜페닐알라닌, 5-아미노-4-이미다졸카복사미드, 히스티딜루신, 2-머캅토이미다졸, boc-히스티딘, 하이드라자이드, 히스티놀, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 이미다조라이신, 이미다졸-포함 오르니틴(예를 들어, 5-메틸이미다졸), 이미다졸-포함 알라닌(예를 들어, (β)-(2-이미다졸일)-L(α)알라닌), 카지닌, 히스타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하며, 각각은 반응성 작용기(예를 들어 아미노, 티올, 카복실 또는 카복사미드)에 의해 치환될 수 있음을 특징으로 하는 용도.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 보호막 층이 이미다졸 구성요소와 가교하기 위한 가교제를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 13 항에 있어서, 가교 구성요소가 알킬포스핀 및/또는 알킬포스핀 유도체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질제가 폴리에틸렌 글리콜, 단당류, 이당류, 삼당류, 저분자량 다당류, 친수성 비타민, 지방친화성 비타민, 지방산, 폴리알코올, 테프론, 아미노산, 비특이성 펩타이드 또는 단백질, 포스포릴콜린, 폴리락테이트 및 상기 화합물의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
무기 핵, 보호막 층, 및 특정 리간드를 포함하며, 보호막 층을 가진 15 nm 이하, 바람직하게는 10 nm 이하, 특히 바람직하게는 5 nm 이하의 유체 역학적 직경의 무기 핵을 포함하는, 나노입자에 있어서, 상기 나노입자가 600 내지 700 nm, 바람직하게는 620 내지 650 nm의 방출을 보여줌을 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항에 있어서, 나노입자가 추가적으로 하나 이상의 개질제를 포함함을 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 무기 핵이 귀금속 원자를 필수적으로 포함하는 클러스터를 포함하며, 바람직하게 클러스터는 2 내지 27 개이고, 바람직하게는 금, 은 및 구리의 원자를 가짐을 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 무기 핵이 합금/반도체 핵을 포함하며, 여기서 상기 핵은 균질한 조성을 가지며 두 반도체의 몰 비율에 대한 비선형의 밴드-갭 에너지를 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 무기 핵이 제 1 반도체 및 제 2 반도체의 합금을 포함하며, 여기서 제 1 반도체의 농도가 핵의 중심으로부터 그것의 표면에 이르기까지 점진적으로 증가하고, 제 2 반도체의 농도는 핵의 중심으로부터 그것의 표면까지 점진적으로 감소함을 특징으로 하는 나노입자.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 하나 이상의 반도체가 II족-VI족 반도체 또는 III족-V족 반도체임을 특징으로 하는 나노입자.
제 21 항에 있어서, 핵이 CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, GaAIAs, InGaN, InGaP, CdSe 또는 CdTe로 구성된 군으로부터 선택되는 합금을 포함함을 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 보호막 층이 금속 원자 또는 금속 이온과 결합할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하며 루이스 염기 관능기 또는 헤테로방향족계, 바람직하게는 이미다졸 구성요소를 가짐을 특징으로 하는 나노입자.
제 23 항에 있어서, 이미다졸 구성요소가 히스티딘, 카노신, 안세린, 발레인, 호모카노신, 히스티딜페닐알라닌, 싸이클로-히스티딜페닐알라닌, 5-아미노-4-이미다졸카복사미드, 히스티딜루신, 2-머캅토이미다졸, boc-히스티딘, 하이드라자이드, 히스티놀, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 이미다조라이신, 이미다졸-포함 오르니틴(예를 들어, 5-메틸이미다졸), 이미다졸-포함 알라닌(예를 들어, (β)-(2-이미다졸일)-L(α)알라닌), 카지닌, 히스타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하며, 각각은 반응성 작용기(예를 들어 아미노, 티올, 카복실 또는 카복사미드)에 의해 치환될 수 있음을 특징으로 하는 나노입자.
제 24 항에 있어서, 가교 구성요소가 알킬포스핀 및/또는 알킬포스핀 유도체를 포함함을 특징으로 하는 나노입자.
제 17 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 개질제가 폴리에틸렌 글리콜, 단당류, 이당류, 삼당류, 저분자량 다당류, 친수성 비타민, 지방친화성 비타민, 지방산, 폴리알코올, 테프론, 아미노산, 비특이성 펩타이드 또는 단백질, 포스포릴콜린, 폴리락테이트 및 상기 화합물의 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 나노입자.
제 16 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
치료제, 시험관 내 진단 보조제 또는 테라노스틱(theranostic) 제제로서의 제 16 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 나노입자의 용도.