KR101576831B1 - 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실리카 입자 및 은 전구체를 디올 화합물에 분산시킨 후, 지방족 또는 방향족 아민 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 실리카 입자 1 중량부에 대하여 5 내지 50 중량부의 은 전구체가 혼합되는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법, 그방법으로 제조된 나노입자 및 그를 이용한 생체 내 광학 검출방법에 관한 것으로, 본 발명은 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자는 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내, 예를 들어 피하 조직의 광학영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어나므로, 생체 내 다중 광학영상을 얻기 위한 나노 프로브로서 활용될 수 있다.

Description

근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자 및 그의 제조방법{Silica-silver core-shell nano particle for optical imaging in near-infrared region and its preparation method}

본 발명은 생체 내 광학영상을 확인하기 위한 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자, 그의 제조방법 및 그를 이용한 생체 내 진단방법에 관한 것이다.

체내에서 생체리간드를 탐색하기 위한 방법으로 다양한 종류의 신호를 동시에 얻을 수 있는 광학영상(optical imaging) 방법이 적합한 것으로 알려지고 있으며, 최근 들어 금속 나노입자를 이용한 고감도 광학영상 방법이 세포 수준의 영상 또는 의학 진단 분야에서 광범위하게 사용되고 있다.

광학영상을 얻기 위해 종래 사용되어 온 형광 물질의 경우 적절한 조건에서 분자당 수천 개의 광자를 방출할 수 있어 단일분자 수준의 검출까지도 이론적으로 가능하지만, 방사성 동위원소처럼 활성 리간드의 원소를 직접 치환할 수는 없고, 구조 활성관계를 통해 비교적 활성에 영향을 주지 않는 부분을 변형하여 형광물질을 연결해야 하는 제한점이 있다. 또한 이러한 형광 표지물질들은 시간이 지나면서 형광 세기가 약해지며(photobleaching), 여기시키는 빛의 파장이 매우 좁고 발광되는 빛의 파장이 매우 넓어 서로 다른 형광물질 간에 간섭이 있는 단점을 가지고 있으며, 또한 사용할 수 있는 형광물질의 수가 극히 제한되어 있다.

한편 반도체 나노물질인 무기 양자점(inorganic quantum dot; QD)은 CdSe, CdS, ZnS, ZnSe 등으로 구성되어 있으며 크기 및 종류에 따라서 각각 다른 색의 빛을 발광한다. 유기 형광물질에 비하여 넓은 여기 파장을 가지고 있으며 좁은 발광 파장을 나타내기 때문에 구별 가능한 다른 색을 발광하는 가지 수가 유기 형광물질 보다 많다. 이 같은 장점 때문에 최근 들어 유기 형광물질의 단점들을 극복하기 위한 방법으로 양자점이 많이 사용되고 있다. 그러나, 독성이 있고 대량 생산이 힘들다는 단점이 있고, 이론적으로 그 가지 수는 다양하나 실제적으로 사용되고 있는 수는 극히 적어 생물 의학적 활용은 제한되어 있다.

이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로 장기간에 걸쳐서 안정성을 유지하며, 생체 적합성 또한 우수한, 금 또는 은 나노입자에 의해서 표지 분자의 진동 산란 광신호의 세기가 증강된 표면증강 라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS) 방법이 이용되고 있다. 표면증강 라만산란은 광학신호의 밴드 폭이 1 nm 이하로 매우 좁고, 활용 가능한 라만 표지 물질의 수가 매우 많고, 하나의 광원으로 다중 표지를 동시에 검출할 수 있다는 장점이 있어 다수의 표적에 대한 측정에서 활용도가 증가하고 있다.

한국공개특허 제10-2013-0118086호는 실리카 중심 입자; 및 상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있는 할로우 금속 나노입자층;을 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 실리카 중심 입자를 둘러산 은 나노입자 층을 형성하고, 상기 은 나노입자층의 은 나노입자를 갈바니 치환반응을 통해 할로우 금 및 은 나노입자를 형성시켰을 때에만 근적외선 광학영상을 얻을 수 있었다.

또한 한국특허 제10-0845010호는 NIR/MR 이중모드 분자영상용 고분자 입자에 관한 것이지만, 근적외선 영역의 광학영상을 얻기 위하여 NIR 형광물질을 활용하는 점에서 포토블리칭, 형광물질간의 간섭으로 다중 정량 진단에 적용하는데 있어서 한계가 있다.

한편 은 껍질 나노입자는 도 1의 상부와 같이 시드 기반의 다단계 성장 방법(two-step seed mediated growth)이나 도 1의 하부와 같이 고분자 전해질을 이용한 다층 조립 방법을 통해 제조되어 왔다. 상기 방법들에서는 중심 입자에 은 껍질을 입히기 위한 시드로 사용될 금속 나노 입자를 먼저 부착시킨 후, 다음 단계에서 다시 은 전구체 용액을 첨가하가나, 또는 역시 시드로 사용될 금속 나노 입자를 먼저 부착한 후, 다음 단계에서 상보적인 전하를 가지는 고분자 전해질과 은 나노입자를 코어 물질에 쌓아 나감으로써 제조하였다. 상기 방법들은 모두 시드 나노입자를 제작하기 위해 여러 반응 단계가 필요하며, 반복적인 여러 단계의 반응으로 인한 시간 소모적인 점, 비교적 높은 온도에서 반응이 진행된다는 문제점을 가지고, 완전한 은 껍질 구조를 이루지 못하는 경우도 많고, 껍질의 두께를 쉽게 조절하기 어렵다는 한계가 있고, 은 껍질 표면에 나노 요철이 깊게 형성되어 SERS 강도를 증강시킬 수 있는 나노입자를 얻기 어렵다.

본 발명은 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내 광학영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어난 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 상기 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자와 결합할 수 있는 물질의 생체 내 광학 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 실리카 입자 및 은 전구체를 디올 화합물에 분산시킨 후, 지방족 또는 방향족 아민 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 실리카 입자 1 중량부에 대하여 5 내지 50 중량부, 바람직하게는 8 내지 20 중량부의 은 전구체가 혼합되는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법을 제공한다.

실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량부가 상기 상한치를 초과할 경우 은 껍질의 두께가 증가하고 나노 요철의 깊이가 감소하면서 근적외선 영역에서의 표면증강라만 활성이 약화되고, 상기 하한치 미만에서는 실리카 입자를 봉쇄할 정도로 은 껍질의 형성이 완벽하지 못하고, 은 전구체의 함량이 낮아지면서 실리카 입자의 표면에 구멍이 뚫린 네트워크 형태로 연결되거나 은 나노입자가 산발적으로 분포하게 되어, 근적외선 영역에서의 표면증강라만 활성이 약해질 수 있다.

상기 실리카 입자는 크기가 50 내지 500 nm, 바람직하게는 80 내지 300 nm로서, 상기 하한치 미만에서는 라만 표면증강 효과가 떨어지고, 상기 상한치를 초과하면 생물학적 응용시 많은 제약을 받을 수 있다.

상기 실리카 입자는 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate) 및 테트라메틸 오르소실리케이트 (tetramethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로부터 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실리카 중심 입자는 당 업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다(W.Stober et al., Controlled growth of monodisperse silica spheres in micro size range, J.Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62).

상기 실리카 입자는 표면에 은 전구체와 결합가능한 관능기가 도입된 것이 바람직하다. 상기 은 전구체와 결합가능한 관능기는 예를 들어 티올기(-SH), 아민기(-NH₂), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 또는 아자이드기(-N₃) 등일 수 있고, 바람직하게는 티올기이다.

상기 은 전구체는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄, 및 CH₃COCH-COCH₃Ag 중에서 선택되는 은염일 수 있고, 바람직하게는 AgNO₃이다.

본 발명에서 실리카 입자 및 은 전구체는 디올 화합물에 분산되어야 실리카 입자 표면에 은 껍질이 본 발명의 높지 않은 반응 온도에서도 생성이 용이하고, 알코올이나 에테르 등의 용매에 분산시킬 경우 은 껍질 형성이 어려울 수 있다. 상기 디올 화합물은 탄소수 2 내지 8의 선형 디올 화합물일 수 있고, 바람직하게는 대칭형 디올 화합물이고, 더욱 바람직하게는 에틸렌글리콜이다.

상기 지방족 또는 방향족 아민 화합물은 pKa 값이 5 이상인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 범위인 것이 바람직하다. 상기 아민 화합물의 pKa 값이 5 미만인 경우 염기도가 낮아 은 이온의 환원 역할이 미미하고, 반면 15를 초과하는 경우에는 벌크에서의 은 이온 환원이 예상되어 바람직하지 않기 때문이다. 상기 지방족 아민 화합물의 바람직하게는 탄소수 2 내지 20, 더욱 바람직하게는 4 내지 12인 아민 화합물로서, 1급 아민, 2급 아민 또는 3급 아민인 것이 바람직하다. 탄소수가 상기 하한치 미만의 지방족 아민을 사용할 경우 전자공여가 충분치 못하여 환원 효과가 거의 없고, 탄소수가 상기 상한치를 초과하는 지방족 아민의 경우 은 이온과의 용해도 차이 문제로 적절한 용매를 찾기 어렵다. 상기 지방족 아민의 경우 1급, 2급 또는 3급아민일 수 있다.

또한 상기 방향족 아민의 경우 탄소수 5 내지 20의 헤테로사이클 아민 화합물인 것이 바람직하다. 다만 탄소수가 상기 상한치를 초과하는 헤테로사이클 아민 화합물의 경우에는 전술한 입체적 장애도가 높아지기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법은 종래 시드 기반의 다단계 성장 방법이나 고분자 전해질을 이용한 다층 조립 방법과 달리 온화한 조건에서도 은 껍질의 형성이 가능하고, 바람직한 반응온도는 5 내지 50 ℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 ℃, 가장 바람직하게는 별도의 가온 없이 15 내지 30 ℃에서 수행할 수 있다. 이때 반응시간은 특별히 한정할 필요는 없으나 1 내지 200 분, 바람직하게는 10 내지 180 분, 더욱 바람직하게는 30 내지 160 분, 가장 바람직하게는 60 내지 140 분으로, 은 껍질의 형성 여부나 두께는 실리카 입자와 은 전구체의 함량비에 따라 결정되고, 반응시간은 이를 위해 충분한 시간 이상으로 유지할 경우 더 이상의 은 껍질의 두께가 비례해서 증가하는 것은 아니다.

상기 은 껍질의 두께는 실리카 입자와 은 껍질의 계면부터 표면에 형성된 요철의 최외각까지의 길이로서, 20 내지 60 nm, 바람직하게는 30 내지 55 nm, 더욱 바람직하게는 35 내지 45 nm일 때 근적외선 영역에서의 표면증강라만 활성이 가장 증대된다.

상기 은 껍질에 형성된 나노 요철의 평균 깊이는 1 내지 40 nm, 바람직하게는 5 내지 30 nm, 더욱 바람직하게는 10 내지 25 nm인 것이고, 나노 요철의 평균 깊이가 상기 하한치 미만인 경우는 근적외선 영역에서의 표면증강라만 활성이 매우 약하고, 상기 상한치를 초과하는 경우는 실리카 입자 표면에 반구(半球) 형태로 형성되는 요철의 돌기 수가 감소하여 또한 근적외선 영역에서의 표면증강라만 활성이 약해질 수 있다.

상기 은 껍질 표면에는 특정 표지물질로 이루어진 자기조립단층이 코팅될 수 있다. 상기 표지물질은 간단한 구조를 가지면서도 뚜렷한 지문 영역에서 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 나노-표지 입자에 적합한 물질이라고 볼 수 있다.

상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF), 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 은 껍질과 결합력이 높은 화학물질이면 제한되지 않고 사용될 수 있다.

상기 은 껍질과 결합력이 높은 화학물질은 말단에 티올기(-SH), 아민기(-NH₂), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 또는 아자이드기(-N₃)가 존재하는 화학물질을 의미한다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자에서, 상기 은 껍질은 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질 층으로 둘러싸여 있을 수 있다. 껍질 층으로는 실리카뿐만 아니라 고분자나 단백질 등도 포함될 수 있다. 고분자의 경우 친수성 고분자이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올 등이 사용될 수 있고, 단백질로는 알부민, 스트랩타비딘 등이 사용될 수 있다. 상기 껍질 층은 하나 이상의 껍질이 적층된 형태일 수 있다. 상기 껍질로 인하여 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 안정성이 증대되고, 물에 대한 용해성이 증대되며, 비특이적인 결합을 방지하고, 자가 형광을 제거할 수 있으며, 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제어되지 않는 응집을 억제하고, 표지 물질의 누출이나 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자 표면에 원치 않는 화합물의 흡착을 억제할 수 있으며, 특정 물질과 결합하는 리간드나 기능기를 도입할 수 있다.

상기 실리카 껍질은 실리카 전구 물질, 즉 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트로부터 제조될 수 있고, 두께는 5 내지 10 nm인 것이 바람직하다. 상기 실리카 껍질의 두께가 5nm 미만으로 너무 얇게 되면 표지물질이 코팅된 은 껍질을 외부의 환경으로부터 보호해 줄 수 없고, 10 nm를 초과하게 되면 세포나 생체 조직 등의 생물학적 응용시 제약이 될 수 있는 문제점이 있기 때문에 상기 범위의 두께로 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제공한다.

또한 본 발명은 평균 입자크기 50 내지 500 nm인 실리카 중심 입자; 및 상기 실리카 중심 입자가 표면에 드러나지 않도록 코팅된 평균 두께 20 내지 60 nm의 은 껍질;을 포함하여 이루어지고, 상기 은 껍질에 형성된 나노 요철의 평균 깊이는 1 내지 40 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제공한다.

상기 나노입자의 최대 흡광파장이 500 내지 1000 nm이다.

상기 나노입자의 은 껍질은 표지물질로 코팅될 수 있다.

상기 은 껍질 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질층을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 인간 또는 인간을 제외한 동물의 생체 조직에 주입하는 단계; 및 상기 생체 조직에 주입된 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자와 결합할 수 있는 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 검출하는 생체 내 광학 검출방법을 제공한다.

상기 검출방법에서 사용되는 근적외선 영역 광원의 파장은 650 내지 900 nm 범위, 더욱 바람직하게는 750 내지 850 nm인 것이 생체 조직의 광학영상을 얻는데 바람직하다. 상기 근적외선 영역의 파장을 얻기 위한 여기 소스로 2.5 내지 50 mW, 바람직하게는 10 내지 20 mW의 레이저(LASER)인 것이 바람직하고, 상기 하한치 미만에서는 생체조직에서 표면증강 라만산란을 얻기위한 충분한 침투깊이를 얻을 수 없고, 상기 상한치를 초과하면 생체조직에 영향을 주어 세포를 파괴할 수 있기 때문에 생체 내(in vivo) 광학 검출이 어렵다. 상기 검출방법은 특히 피하 조직 내 검출에 적합하고, 이때 표면증강 라만산란을 얻을 수 있는 피하 조직의 침투 깊이는 1 내지 10 mm이다.

특히 본 발명의 검출방법은 서로 다른 물질과 결합하여 라만 산란을 방출하는 2 이상의 표지물질로 코팅된 상기 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 인간 또는 인간을 제외한 동물의 생체 조직에 주입하는 단계; 및 상기 2 이상의 표지물질에 결합되는 2 이상의 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 동시에 검출하는 단계;를 포함하는 생체 내 광학 다중검출방법에 적용할 수 있다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자는 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내, 예를 들어 피하 조직의 광학 영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어나므로, 생체 내 다중 광학영상을 얻기 위한 나노 프로브로서 활용될 수 있다.

도 1은 종래 코어쉘 형태의 은 껍질 나노입자의 제조공정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 은 껍질 표면에 나노 요철이 형성된 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하는 공정의 개략도이다.
도 3은 제조예 1에서 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비를 변화시키기 위해 실리카 입자의 사용량을 50 mg부터 5 mg까지 변화시키면서 제조한 나노입자의 TEM 사진이다.
도 4a는 제조예 1에서 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비를 변화시키기 위해 실리카 입자의 사용량을 4 mg부터 1 mg까지 변화시키면서 제조한 나노입자의 TEM 사진으로, 좌측은 우측 사진을 확대한 것이다. a)는 실리카 입자를 4 mg 사용하여 제조한 나노입자(AgNS-7.5), b)는 3 mg 사용한 나노입자(AgNS-15), c)는 2 mg 사용한 나노입자(AgNS-22.5), d)는 1 mg 사용한 나노입자(AgNS-30)이다. 상기 나노입자 내부의 점선으로 표시한 원은 약 150 nm의 실리카 입자를 나타낸 것이다.
도 4b는 제조예 1에서 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비를 변화시키기 위해 실리카 입자의 사용량을 4 mg부터 1 mg까지 변화시키면서 제조한 나노입자의 SEM 사진이다. a)는 실리카 입자를 4 mg 사용하여 제조한 나노입자(AgNS-7.5), b)는 3 mg 사용한 나노입자(AgNS-15), c)는 2 mg 사용한 나노입자(AgNS-22.5), d)는 1 mg 사용한 나노입자(AgNS-30)이다.
도 5는 실험예 1에서 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 2에서 제조예 1에서 실리카 입자의 사용량을 3 mg 사용하여 제조한 나노입자(AgNS-15)를 에너지 분산형 X-선 분광 분석기를 이용하여 원소 매핑(elemental mapping)한 사진이다.
도 7a는 실험예 3에서 실리카 입자와 은 전구체의 중량비에 따라 제조된 나노입자의 흡광 밴드 그래프이다.
도 7b는 실험예 3에서 실리카 입자와 은 전구체의 중량비에 따라 제조된 나노입자의 현탁액 색깔을 확인할 수 있는 사진이다.
도 8a는 실험예 4에서 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 AgNS-7.5, AgNS-15, AgNS-22.5 및 AgNS-30 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 실험예 4에서 AgNS-15 나노입자를 532, 647 및 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때 각각의 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 9은 실험예 4에서 AgNS-15 나노입자를 532, 647 및 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때의 이산 쌍극자 근사(discrete dipole approximation)를 나타낸 이미지이다.
도 10은 비교예 2의 나노요철이 없이 평탄한 나노입자 및 AgNS-15 나노입자를 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때의 이산 쌍극자 근사(discrete dipole approximation)를 나타낸 이미지이다.
도 11a는 비교예 3에서 에틸렌글리콜 대신 무수 에탄올을 용매로 이용하여 제조한 나노입자의 TEM 사진이다.
도 11b는 비교예 3에서 에틸렌글리콜 대신 에틸렌글리콜 모노에틸 에테르를 용매로 이용하여 제조한 나노입자의 TEM 사진이다.
도 12는 비교예 3에서 용매로 에틸렌글리콜 및 무수 에탄올을 각각 사용했을 때의 싸이클릭 볼타모그램을 나타낸 그래프이다.
도 13a는 실험예 5에서 4-플루오로벤젠티올로 표지된 AgNS-15 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다.
도 13b는 도 13a의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 AgNS-15 나노입자의 표면증강 라만산란 스펙트럼이다.
도 13c는 4 개의 라만 표지 물질, 4-플루오로벤젠티올(4-FBT), 4-브로모벤젠티올(4-BBT), 4-아미노벤젠티올(4-ABT) 및 4-클로로벤젠티올(4-CBT)으로 표지된 AgNS-15 입자의 표면증강라만산란 스펙트럼이다.
도 14a는 실험예 6에서 제조예 2의 나노입자를 정맥으로 투여한 3일 후, 간, 비장, 신장 및 심장에서의 라만 스펙트럼이다.
도 14b는 실험예 6에서 제조예 2의 나노입자를 정맥으로 투여한 3일 후의 간, 비장, 신장 및 심장의 H&E 염색 사진이다.
도 15a는 실험예 7에서 A549 세포만 고정시킨 슬라이드의 표면증강라만산란 활성 강도를 매핑한 이미지이다.
도 15b는 실험예 7에서 A549 세포와 제조예 2의 나노입자를 혼합한 후 A549 세포에 나노입자의 세포내 섭취 여부를 확인하기 위해 슬라이드의 표면증강라만산란 활성 강도를 매핑한 이미지이다.
도 15c는 실험예 7에서 나노입자의 주사 부위 및 라만 프로브에 커플된 광섬유 센서의 사진이다.
도 15d는 실험예 7에서 나노입자 주사 부위의 표면증강라만산란 활성 스펙트럼을 시간의 흐름에 따라 확인한 것이다.
도 15e는 실험예 7에서 나노입자 주사 부위의 표면증강라만산란 활성 스펙트럼을 시간의 흐름에 따라 1075 cm^-1의 피크 강도를 나타낸 그래프이다.

이하 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

제조예 1: 근적외선 분자영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노 입자

먼저 3 ㎖의 27% 암모니아수(NH₄OH)를 40 ㎖의 무수에탄올에 첨가하였다. 다음으로, 1.6 ㎖의 테트라에틸오르소 실리케이트(TEOS)을 상기 암모니아수와 무수에탄올의 혼합용액에 첨가하고, 이를 25 ℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 원심분리 후 에탄올로 5회 세척하여 크기가 평균 150 nm 이하인 실리카 중심 입자를 합성하였다(J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62).

상기 실리카 중심 입자 300 mg을 에탄올 6 ㎖에 분산시킨 후, 300 ㎕의 3-머켑토프로필트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxy silane, MPTS)과 60 ㎕의 27% 암모니아수를 첨가후 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하하였다. 이를 원심분리 후 에탄올로 수회 세척하여 표면에 티올기가 도입된 실리카 입자, 즉 MPTS 처리된 실리카 입자(silica)를 합성하였다.

5 mg의 폴리비닐피롤리돈을 25 ㎖의 에틸렌글리콜과 혼합하고, 여기에 상기 MPTS 처리된 실리카 나노입자를 다양한 농도로 첨가하였다. 한편 AgNO₃가 용해된 25 ㎖의 에틸렌글리콜에 상기 다양한 농도로 조제된 MPTS 처리된 실리카 나노입자 함유 에틸렌글리콜 용액을 첨가하고, 최종 AgNO₃의 농도가 3.5 mM이 되도록 충분히 혼합하였다. 이 혼합용액에 41.37 ㎕의 옥틸아민(octylamine)을 5 mM이 되도록 첨가하고, 이를 25 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리와 에탄올 세척을 통해 표면에 나노 요철이 형성된 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자(bumpy silver nanoshell particles)를 얻었다.

상기 은 껍질 표면에 나노 요철이 형성된 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하는 공정의 개략도를 도 2에 나타내었다.

상기 실리카 입자의 농도를 달리하여 제조한 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 실리카 입자 및 은 전구체의 입자와 그 비율을 표 1에 나타내고, 이때 각각 제조된 나노입자의 TEM 사진을 도 3 및 도 4a에 나타내었다.

도 4a의 a)는 실리카 입자를 4 mg 사용하여 제조한 나노입자(AgNS-7.5), b)는 3 mg 사용한 나노입자(AgNS-15), c)는 2 mg 사용한 나노입자(AgNS-22.5), d)는 1 mg 사용한 나노입자(AgNS-30)이고, 상기 각각의 나노입자의 SEM 사진을 도 4b에 나타내었다.

은전구체/실리카	은전구체 함량	실리카입자 함량	은 껍질의 두께
0.6	30 mg	50 mg	-
1.2	30 mg	25 mg	-
1.5	30 mg	20 mg	-
2	30 mg	15 mg	-
3	30 mg	10 mg	-
6	30 mg	5 mg	25 nm
7.5	30 mg	4 mg	32 nm
10	30 mg	3 mg	39 nm
15	30 mg	2 mg	51 nm
30	30 mg	1 mg	76 nm

상기 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비가 2 이하에서는 은 나노입자가 실리카 중심 입자 표면에 서로 이격되어 산포되어 있거나 몇 개씩 응집되어 있었지만, 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비가 3 인 경우는 은 껍질을 형성하여 실리카 입자를 봉쇄하지는 않았으나 은 나노입자끼리 서로 연결되어 네트워크를 형성하고 있었고, 실리카 입자에 대한 은 전구체의 중량비가 6 이상부터는 은 껍질이 형성되기 시작하였음을 확인할 수 있었다. 또한 도 4a의 a)부터 d)까지의 은 껍질 표면은 20-30 nm 깊이의 나노 요철이 형성되어 있음을 알 수 있었다.

비교예 1: 실리카 중심 입자에 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 나노입자

상기 은 전구체 함량 30 mg 및 실리카 입자 함량 50 mg을 사용하여 제조되어 실리카 중심 입자 표면에 은 나노입자가 산포되어 있는 나노입자 1 mg/㎖를 분자량 40,000의 8 중량%의 폴리비닐피롤리돈 수용액 5 ㎖에 분산시키고, 그 분산용액에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액을 마이크로 펌프를 이용하여 0.75 ㎖/분의 속도로 주입하였다. 상기 HAuCl₄ 수용액의 첨가량에 따라 할로우의 크기가 다른 할로우 금 및 은 나노입자가 형성되므로, HAuCl₄ 수용액의 첨가량을 1.5 ㎖로 제조하였다.

HAuCl₄ 수용액을 주입한 후, 금 및 은 나노입자가 안정화되도록 100 ℃에서 10 분간 교반하고, 이 후 교반하면서 실온으로 냉각하였다. 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자는 암갈색을 나타내지만, HAuCl₄ 수용액이 첨가되면 현탁액은 회색이 된다.

상기 반응 혼합물로부터 AgCl을 제거하기 위해 NaCl 포화용액으로 세척하고, 현탁액을 원심분리한 후 증류수로 3회, 에탄올로 2회 세척하여, 실리카 중심 입자 표면의 은 나노입자가 갈바니 치환반응을 통해 할로우 금 및 은 나노입자를 형성한 실리카 입자를 제조하였다.

실험예 1: 근적외선 레이저원에서의 표면증강 라만산란 강도 비교

제조예 1에서 실리카 입자 함량 50 mg, 10 mg 및 3 mg을 각각 사용하여 제조한 나노입자(AgNS), 비교예 1의 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 나노입자(Au/Ag HSA) 1 mg에 2 mM의 라만 표지 물질인 4-플루오로 벤젠티올 농도의 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하여, 라만 표지 물질의 자기조립 층이 형성된 나노입자를 제조하였다.

상기 나노입자 1 mg을 각각 에탄올 50 ㎖에 첨가하여 분산시키고, 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노입자의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 확인하였다. 이를 위해 4-플루오로벤젠티올의 농도는 일정하게 하였고, 스펙트럼의 강도는 에탄올(882 cm^-1)의 것에 대해 표준화하였다.

도 5는 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.

785 nm의 근적외선 레이저원으로 여기시켰을 때 제조예 1의 실리카 입자 50 mg 및 10 mg을 사용하여 제조한 나노입자는 비교예 1의 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 입자에 비해서 현저히 낮은 표면증강라만산란 강도를 나타내었다.

그러나 실리카 입자의 참량을 3 mg으로 낮춘 경우 별도의 할로우 형성을 위한 갈바니 치환 반응을 하지 않았지만, 실리카 입자 둘레에 나노 요철을 가진 은 껍질이 두껍게 형성되면서 표면증강라만산란 강도가 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 나노입자와 동등한 수준으로 현저히 증가하였다.

실험예 2: 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 원소 분석

도 4a의 b)의 실리카 입자를 3 mg 사용하여 제조한 나노입자(AgNS-15)는 약 400 개의 나노입자를 확인한 결과 은 껍질을 완벽하게 형성하지 못한 것이 1 % 미만임을 확인할 수 있었다. 이를 에너지 분산형 X-선 분광 분석기(Energy dispersive X-ray spectroscopy)를 이용하여 원소 매핑(elemental mapping)을 실시하여 도 6에 나타내었다.

상기 원소 매핑에 따르면 은 원자만이 관찰되고, 중심의 실리콘 원자는 확인되지 않아, 상기 나노입자의 실리카 표면에 빈 공간이 없이 은 껍질이 두껍게 형성되어 봉쇄되어 있음을 알 수 있었다.

실험예 3: 실리카 입자와 은 전구체의 중량비에 따른 나노입자의 흡광밴드

제조예 1에서 실리카 입자의 첨가량을 4, 3, 2 및 1 mg 첨가하여 각각 제조하고, 은 껍질을 형성한 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 흡광밴드 및 최대 흡광파장과 현탁액의 색깔변화를 확인하였다.

도 7a는 상기 나노입자들의 흡광 밴드를 나타낸 그래프로서, 상기 은 껍질이 형성된 나노입자들에서 560 내지 1000 nm의 가시광선부터 근적외선 영역까지 넓은 흡광 밴드를 나타내었다. 상기 플라즈몬 흡광 밴드의 확장은 상기 은 껍질의 나노 요철 구조에 기인할 것으로 예상되었다.

도 7b는 입자 현탁액의 색깔을 확인할 수 있는 사진으로, 은 껍질의 두께가 두꺼워질수록 청색에서 갈색으로 변화되었다.

실험예 4: 실리카 입자와 은 전구체의 중량비에 따른 나노입자의 근적외선 영역의 표면증강라만산란 활성

제조예 1에서 실리카 입자의 첨가량을 4, 3, 2 및 1 mg 첨가하여 각각 제조한 은 껍질의 두께가 다른 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자들의 근적외선 영역에서의 표면증강라만산란 활성을 비교하였다.

실험예 1과 같이 나노입자 1 mg에 2 mM의 4-플루오로 벤젠티올가 용해된 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하여, 라만 표지 물질의 자기조립 층이 형성된 나노입자를 제조하였다.

도 8a는 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노입자의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프로서, 은 껍질의 두께가 39 nm인 AgNS-15 나노입자에서 가장 강한 표면증강라만산란 활성을 나타내었다.

여기 파장과 표면증강라만산란 활성의 관계를 확인하기 위해서 상기 AgNS-15 나노입자를 각각 532, 647 및 785 nm에서 여기시켰을 때의 표면증강라만산란 활성을 도 8b에 나타내었다. AgNS-15의 표면증강라만산란 활성이 모든 파장에서 넓은 흡광밴드를 나타낼 것으로 예상했으나, 가장 강한 표면증강라만산란 활성은 785 nm의 근적외선 여기 레이져원에서 나타났고, 이는 가시광선 영역인 532 nm에 비해서 1.7 배나 높은 것이었다.

표면증강라만산란 활성의 넓은 흡광밴드의 광학적 특성과 가시광선 영역부터 근적외선 영역까지의 파장 사이의 관계를 확인하기 위하여, 각각 532, 647 및 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때의 이산 쌍극자 근사(discrete dipole approximation)를 이용하여 전기장의 증강을 비교하여 도 9에 나타내었다.

이산 쌍극자 근사 계산값은 모든 파장에서 AgNS-15 나노입자 표면 근처에서 증강되었고, 가시광선 영역에서 근적외선 영역으로 이동할수록 더욱 증강되었다. 특히 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때에는 AgNS-15 나노입자의 나노요철의 끝에서 매우 높게 국지화한 전기장을 확인할 수 있었고, 이는 가시광선 영역인 532 nm에 비해서 2.3 배나 높은 것이었다. 이를 통하여 상기 AgNS-15 나노입자는 근적외선 여기 레이져원에서 표면증강라만산란 활성이 가장 강하다는 것을 확인할 수 있었다.

비교예 2: 씨드 입자를 이용하여 제조한 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자

상기 본원발명의 제조예 1의 방법과 조건이 아닌 종래 씨드 입자를 이용하여 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하였다(N.J. Halas, J. Phys. Chem. B2001,105,2743-2746)

1 내지 3 nm의 금 나노입자가 표면에 결합된 실리카 나노입자를 0.15 mM의 질산은 용액과 혼합하여 격렬히 교반하였다. 상기 씨드 입자로 사용되는 금 나노입자 표면에서 은이 환원되기 시작하도록 50 ㎕의 37 % 포름알데히드를 첨가하하고, 2회 증류된 농축 암모니아수 50 ㎕를 첨가하였다. 상기 암모니아수는 상기 용액의 pH를 급속히 상승시켜 은 이온의 환원 및 이로인한 은 껍질의 형성을 유도하여 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하였다.

상기 씨드 입자를 이용해 제조한 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자는 표면에 나노요철이 없이 평탄한 것으로, 이를 제조예 1의 실리카 입자 3 mg을 이용하여 제조한 나노요철이 형성된 나노입자의 785 nm의 레이져원으로 여기시켰을 때의 이산 쌍극자 근사(discrete dipole approximation)를 이용하여 전기장의 증강을 비교하여 도 10에 나타내었다.

도 10의 a)는 제조예 1의 AgNS-15 나노입자이고, b)는 상기 비교예 2의 씨드 입자를 이용하여 제조한 나노입자로서 나노입자의 크기는 220 내지 250 nm로 거의 유사함에도 전기장은 제조예 1의 나노입자에서 3 배 이상 우수하였다.

비교예 3: 분산 용매를 달리하여 제조한 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자

제조예 1에서 실리카 입자를 3 mg 이용하여 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하는 방법과 동일하게 나노입자를 제조하되, 다만 대칭형 디올 화합물인 에틸렌글리콜 대신 각각 무수 에탄올 및 에틸렌글리콜 모노에틸 에테르를 용매로 이용하여 나노입자를 제조하였다.

도 11a는 에틸렌글리콜 대신 무수 에탄올을 용매로 이용하여 제조한 나노입자의 TEM 사진이고, 도 11b는 에틸렌글리콜 모노에틸 에테르를 용매로 이용하여 제조한 나노입자의 TEM 사진이다.

대칭형 디올 화합물이 아닌 무수 에탄올이나 에틸렌글리콜 모노에틸 에테르로 이용했을 때에는 실리카 입자 표면에 은 껍질이 형성되지 않음을 확인할 수 있었다.

AgNO₃의 10 mM, Au 작동전극, Pt 상대전극, Ag/Ag/Cl 기준전극으로, -1.7부터 1.3V까지 스캔하고, 스캔 속도는 50 mVs^-1로 하여 용매로 에틸렌글리콜 및 무수 에탄올을 각각 사용했을 때, AgNO₃의 환원 전위를 싸이클릭 볼타모그램(cyclic voltammogram)으로 비교하여 도 12에 나타내었다.

용매로 에틸렌글리콜을 이용했을 때에는 은 이온과 대칭형 디올 화합물 사이에 착화합물이 형성되어 은 이온의 환원 전위가 증가되어, 실온에서도 은 이온이 빠른 환원 속도를 나타내었으나, 은 이온 및 에탄올은 착화합물을 형성하기 어려워 은 이온의 환원 속도가 상대적으로 느렸다. 이는 은 이온(Ag⁺)은 대칭형 디올 화합물에 분산되어 아민 화합물로부터 하나의 전자를 전달받아 쉽게 환원되고, 실리카 표면 부근에서 은 결정핵(Ag⁰)을 형성하도록 함으로써 실리카 중심 입자의 표면에서 은 껍질을 형성하는 것으로 추정된다.

실험예 5: 근적외선 레이저원에서의 나노입자의 표면증강 라만산란 활성

나노입자의 표면증강 라만산란 활성을 확인하기 위하여, 표면증강 라만활성 매핑(mapping)과 SEM 사진 상관관계 방법을 통해 단일입자 표면증강 라만산란 실험을 실시하였다.

제조예 1의 AgNS-15 나노입자를 에탄올에 0.1 mg/㎖ 현탁하여, 패턴화된 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고 0.5 ㎛ 단위로 785 nm에서 2초 동안, 2.3 mW 광원의 세기로 표면증강 라만산란 강도를 측정하였다.

도 13a는 4-플루오로벤젠티올로 표지된 AgNS-15 나노입자의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다. 상기 나노입자의 표면증강 라만산란 신호는 노이즈에 대한 신호 검출비가 높게 나와 명확히 검출되었고, 증강인자는 약 3.8 ㅧ10⁵ 내지 7.7 ㅧ10⁵이었으며, 검출가능한 나노-표지 입자의 비율 80% 이상이었다.

상기 4-플루오로벤젠티올로 표지된 AgNS-15 나노입자의 표면증강 라만산란 스펙트럼은 도 13b에 나타내었다. 상기 결과로부터 4-플루오로벤젠티올로 표지된 AgNS-15 나노입자는 근적외선 영역에서 검출하기에 충분한 강도, 즉 평균 6.4 ㅧ10⁵ 정도의 증강인자를 가짐을 확인하였다. 이러한 높은 증강인자는 비교예 2에서 확인할 수 있듯이 AgNS-15 나노입자 표면의 나노요철에 기인한 것으로 추정되었다.

도 13c에는 4개의 서로 다른 라만 표지 물질을 이용해 상기 AgNS-15 나노입자를 제조한 후 표면증강라만산란 스펙트럼을 확인한 것으로, 각각은 서로 중첩되지 않고 각각 고유의 스펙트럼을 나타냄을 확인하였고, 이로서 다중검출이 용이한 나노-표지 입자로 사용될 수 있음을 확인하였다.

제조예 2: PEG로 코팅된 실리카 중심 및 은 껍질 나노 입자

AgNS-15 나노입자 1 mg에 2 mM의 4-플루오로 벤젠티올인 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리와 에탄올 세척을 통해, 라만 표지 물질의 자기조립 층이 형성된 나노입자를 제조하였다.

상기 라만 표지 물질의 자기조립 층이 형성된 나노입자 1mg을 2 mM의 메톡시폴리(에틸렌글리콜)설피드릴(m-PEG-SH, 분자량 5000)가 용해된 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리와 증류수 세척을 통해 PEG로 코팅된 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 제조하였다.

실험예 6: 근적외선 광학영상용 나노입자의 생체 내( in vivo ) 독성

상기 제조예 2의 PEG 코팅된 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 생체 내 독성을 확인하였다.

상기 제조예 2의 PEG 코팅된 나노입자 400 ㎕(0.5 nM)을 3 % BSA를 포함하는 pH7.0의 PBS 완충액에 분산시키고, 쥐의 꼬리 정맥을 통해 은 함량 기준으로 50 mg/kg으로 투여하였다. 대조군으로 400 ㎕의 PBS 완충액만 정맥 주사한 군을 이용하였다. 상기 쥐들은 3일 후 희생시키고, 심장에서 혈액을 채취한 후, 간, 비장, 신장 및 심장에서 표면증강라만산란 스펙트럼을 확인하였다. 도 14a는 각 주요 장기에서의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다. 상기 결과 간 및 비장에서 주로 나노입자가 축적되었음을 확인할 수 있었다.

또한 혈액에서 백혈구, 헤모글로빈 및 혈소판 함량을 측정하여 표 2에 나타내고, 간 활성을 확인할 수 있는 효소 함량을 측정하여 표 3에 나타내었다.

구분	대조군	나노입자 투여군
백혈구(개수/㎕)	4600±1800	5600±1900
헤모글로빈(g/㎗)	12.0±1.2	10.9±0.9
혈소판(개수/㎕)	675700±236400	564300±201800

구분	대조군	나노입자 투여군
알카라인 포스파타아제(U/L)	61.7±14.2	81.7±5.9
알라닌 아미노트렌스퍼라제(U/L)	46.7±1.5	49.3±2.4
총 빌리루빈(mg/㎗)	0.3±0.0	0.3±0.0
알부민(g/㎗)	3.1±0.06	2.7±0.15
콜레스테롤(mg/㎗)	97.0±11.5	96.3±11.6
감마글루타밀트렌스퍼라제(U/L)	〈5	〈5

혈액 내 백혈구, 헤모글로빈 및 혈소판은 대조군과 제조예 2의 나노입자 투여군 사이에 큰 차이가 없었고, 간 활성을 나타내는 각종 효소들의 경우에도 차이를 발견할 수 없었다.

또한 도 14 b를 통해 각 장기의 조직 손상, 염증이나 형태적 변화를 살펴본 결과 어느 장기에서도 대조군과 차이를 보이지 않았다. 상기 결과로부터 제조예 2의 나노입자는 상기 시험농도까지는 어떠한 생체 내 독성도 나타내지 않음을 알 수 있었다.

실험예 7: 생체 내 광학 영상(optical imaging) 및 다중 검출 가능성 확인

먼저 제조예 2의 나노입자가 세포 내로 내부화될 수 있는지 확인하였다.

6 ㅧ 10⁵ A549 세포(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)를 Lab-tek 챔버 슬라이드에서 24 시간 배양하고, 제조예 2의 나노입자 함유 용액과 12 시간 혼합하였다. 상기 슬라이드를 PBS 용액으로 수차례 세척하고, 상기 세포들은 4 % 파라포름알데하이드로 37 ℃에서 10 분 동안 고정시켰다. 상기 슬라이드는 다시 세척한 후 건조하여, 31 mW 레이져 전압의 785 nm 광-여기 및 광 획득 시간 1 초로, 라만 스펙트럼 강도 매핑을 실시하였다. 대조군으로 제조예 2의 나노입자를 혼합하는 것을 생략한 슬라이드를 이용하였다.

도 15a는 대조군으로 A549 세포만 고정된 것이고, 도 15b는 A549 세포에 제조예 2의 나노입자를 혼합하여 내부화되었는지를 확인한 것으로, 상기 결과를 통해 제조예 2의 나노입자는 A549 세포의 세포내 섭취를 통해 내부화되었음을 확인할 수 있었다.

상기 실험에서 제조예 2의 나노입자를 함유한 A549 세포를 100 ㎕ PBS로 희석하여 8주령의 누드 마우스 엉덩이 근육 부위에 피하 주사하였다. 도 15c는 나노입자의 주사 부위 및 라만 프로브에 커플된 광섬유 센서의 사진을 나타낸 것이다

또한 휴대용 라만 프로브에 커플된 광섬유 센서로 나노입자 주사 부위의 표면증강라만산란 활성 스펙트럼을 90 mW 레이져 전압의 785 nm 광-여기 및 광 획득 시간 30 초로 실시하여, 시간의 흐름에 따라 스펙트럼 얻어 도 15d에 나타내었다. 또한 1075 cm^-1의 피크 강도를 도 15e에 나타내었다.

주사 직후는 물론 2 일 후까지도 라만 스펙트럼을 확인할 수 있었으나, 3일 째부터는 1075 cm^-1의 피크 강도가 감소되었다.

Claims (24)

1. 실리카 입자 및 은 전구체를 디올 화합물에 분산시킨 후, 지방족 또는 방향족 아민 화합물을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지고,
   상기 실리카 입자 1 중량부에 대하여 5 내지 50 중량부의 은 전구체가 혼합되며,
   상기 은 껍질의 두께는 20 내지 60 nm이고,
   상기 은 껍질에 형성된 나노 요철의 평균 깊이는 1 내지 40 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 실리카 입자 1 중량부에 대하여 8 내지 20 중량부의 은 전구체가 혼합되는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 실리카 입자의 평균 입자크기는 50 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 실리카 입자는 표면에 은 전구체와 결합가능한 관능기가 도입된 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 은 전구체는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄, 및 CH₃COCH-COCH₃Ag 중에서 선택되는 은염인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 디올 화합물은 탄소수 2 내지 8의 선형 디올 화합물인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 디올 화합물은 대칭형 디올 화합물인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 지방족 아민 화합물은 탄소수 4 내지 12의 지방족 아민 화합물인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 반응은 5 내지 50 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 반응은 1 내지 200 분 수행되는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 제 1 항에 있어서, 상기 은 껍질 표면에 표지물질을 고정화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
    
14. 제 13 항에 있어서, 상기 은 껍질 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상 껍질층을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자의 제조방법.
    
15. 삭제
16. 제1항 내지 제10항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되며,평균 입자크기 50 내지 500 nm인 실리카 중심 입자; 및 상기 실리카 중심 입자가 표면에 드러나지 않도록 코팅된 평균 두께 20 내지 60 nm의 은 껍질;을 포함하여 이루어지고, 상기 은 껍질에 형성된 나노 요철의 평균 깊이는 1 내지 40 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자.
    
17. 제 16 항에 있어서, 상기 나노입자의 최대 흡광파장이 500 내지 1000 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자.
    
18. 제 16 항에 있어서, 상기 나노입자의 은 껍질은 표지물질로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자.
    
19. 제 18 항에 있어서, 상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자.
    
20. 제 16 항에 있어서, 상기 은 껍질 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질층을 더 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자.
    
21. 청구항 제 16 항의 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자를 인간을 제외한 동물의 생체 조직에 주입하는 단계; 및
    상기 생체 조직에 주입된 근적외선 광학영상용 실리카 중심 및 은 껍질 나노입자와 결합할 수 있는 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 검출하는 생체 내 광학 검출방법.
    
22. 제 21 항에 있어서, 상기 근적외선 영역의 파장은 650 내지 900 nm 범위인 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
    
23. 제 22 항에 있어서, 상기 근적외선 영역의 파장의 흥분 소스로 2.5 내지 50 mW의 레이저(LASER)를 이용하는 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
    
24. 제 23 항에 있어서, 상기 생체 조직은 피하 조직인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.

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