DE69723860T2 - VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON IgE - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis von Epsilon-Immunglobulin (IgE). Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls neue Kits zum Nachweis von IgE ebenso wie Verfahren zur Herstellung des Nachweisreagenz ein.
  • Ausgangspunkt der Erfindung
  • Die Diagnose einer Erkrankung und die Bestimmung der Behandlungseffizienz sind beide bedeutende Werkzeuge in der Medizin. Insbesondere kann der Nachweis der IgE-Produktion in einem Tier auf eine Erkrankung hinweisen. Solche Erkrankungen schließen beispielsweise eine Allergie, eine atopische Erkrankung, ein Hyper-IgE-Syndrom, innere Parasiteninfektionen und eine B-Zell-Neoplasie ein. Zusätzlich weist der Nachweis einer IgE-Produktion in einem Tier im Anschluss an eine Behandlung auf die Leistungsfähigkeit bzw. Effizienz der Behandlung hin, beispielsweise wenn Behandlungen angewendet werden, die zur Störung der IgE-Produktion vorgesehen sind.
  • Bis zur Entdeckung der vorliegenden Erfindung wurde der Nachweis von IgE in Proben, die aus nicht-menschlichen Tieren gewonnen wurden, durch das Fehlen geeigneter Reagenzien zum Nachweis von IgE behindert. Verschiedene Verbindungen wurden dazu verwendet, IgE in IgE-enthaltenden Zusammensetzungen nachzuweisen. Insbesondere Antikörper, die selektiv an Epsilon-Idiotyp-Antikörper (d. h. Anti-IgE-Antikörper) binden, wurden zum Nachweis von IgE verwendet. Diese Anti-IgE-Antikörper jedoch können mit anderen Antikörper-Idiotypen, wie beispielsweise Gamma-Isotyp-Antikörpern kreuzreagieren. Die Entdeckung der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung eines Fcε-Rezeptor (FcεR)-Moleküls zum Nachweis des Vorliegens von IgE in einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung ein. Ein FcεR-Molekül stellt gegenüber beispielsweise Anti-IgE-Antikörpern einen Vorteil zum Nachweis von IgE bereit, weil ein FcεR-Molekül an IgE mit höherer Spezifität (d. h. weniger Idiotyp-Kreuzreaktivität) und höherer Sensititivät (d. h. Affinität) als Anti-IgE-Antikörper binden kann.
  • Patent Abstracts of Japan 095/007, 31. August 1995, offenbart, dass JP 07-092167 die Entfernung von IgE durch Fixieren eines IgE-bindenden Peptids oder eines ModifikationsPeptids, das ein IgE-bindendes Peptid einschließt, an einen wasserlöslichen Träger und Plas Binden des Peptids spezifisch an das IgE beschreibt. Patent Abstracts of Japan 095/006, 31. August 1995 offenbart, dass JP 07-072150 ein Verfahren zum Nachweis oder Messen von IgE beschreibt, das selektiv IgE nachweisen oder messen kann, das zum Induzieren einer allergischen Reaktion in der Lage ist. Das IgE in der Probe wird mit einer Fcε-Rezeptor-Alphakette umgesetzt und die Umsetzung wird nachgewiesen oder gemessen. Das Verfahren wird als bei der Diagnose von Allergien und verschiedener Erkrankungen, wie beispielweise Wurmerkrankungen, schweren Leberstörungen, Ekzem- und IgE-Myelom wirksam beschrieben.
  • Lowenthal et al., 1993, Annals of Allergy, 71: 481–484, beschreiben, dass Hundeserum auf Menschen eine kutane Reaktivität übertragen kann. Während es möglich ist, dass Lowenthal et al. richtigerweise die Bindung von humanen FcεR an Hunde-IgE lehren, stellen Lowenthal et al. jedoch keine Daten bereit, die die speziellen zellulären Proteine definieren, die für die Übertragung einer kutanen Reaktivität verantwortlich sind. Als solches würde der Fachmann schließen, dass die Übertragung einer kutanen Reaktivität, die von Lowenthal et al. gelehrt wird, auf eine Vielzahl unterschiedlicher molekularer Interaktionen zurückzuführen ist und dass der Schluss, der von Lowenthal et al. gezogen wird, lediglich eine Interpretation st. Zusätzlich lehren Lowenthal et al. die Verwendung von gereinigtem humanem FcεR zum Nachweis von Hunde-IgE nicht. Die Untereinheiten von humanem FcεR waren bereits 1 S 88 bekannt und wurden niemals zum Nachweis von Hunde-, Katzen- oder Pferde-IgE verwedet. Tatsächlich offenbart US-Patent Nr. 4 962 035 auf den Namen Leder et al., erteilt am 9. Oktober 1990, humanes FcεR, offenbart jedoch nicht die Verwendung eines solchen humanen FcεRs zum Nachweis von humanem oder nicht-humanem IgE. Die Verwendung von gereinigtem humanem FcεR vermeidet Komplikationen, die durch Verwendung von FcεR, gebunden an eine Zelle, dargestellt werden, wie beispielsweise eine unspezifische Bindung der FcεR-tragenden Zelle aufgrund zusätzlicher Moleküle, die auf der Zellmembran vorliegen Dass gereinigtes humanes FcεR nicht-humanes IgE nachweist, ist deswegen unerwartet, weil eine Inter-Speziesbindung zwischen einem FcεR und einem IgE nicht vorhersagbar ist. Beispielsweise bindet humanes FcεR an Ratten-IgE, jedoch bindet FcεR der Ratte nicht an humanes IgE.
  • Das hoch affinitive FcεR besteht aus drei Proteinketten, nämlich Alpha, Beta und Gamma. Frühere Forscher haben die Nukleinsäuresequenz für die Alpha-Kette (Kochan et al., Nucleic Acids Rs., 16: 3584, 1988; Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1907–1911, 1988; und Pang et al., J. Immunol. 151: 6166–6174, 1993); für die Beta-Kette (Kuster et al., J. Biol. Chem. 267: 12782–12787, 1992); und die Gamma-Kette (Kuster et al., J. Biol, Chem. 265: 6448–6452, 1990) offenbart.
  • Somit sind Verfahren und Kits bzw. Bausätze in der Technik ein Bedarf, die den speziellen Nachweis von nicht-humanem IgE bereitstellen werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung schließt Nachweisverfahren und Kits ein, die IgE nachweisen. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von IgE, das Folgendes umfasst: (a) ein In-Berührung-Bringen eines isolierten humanen Fcε-Rezeptor(FcεR)-Moleküls mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unser Bedingungen, die zur Bildung eines FcεR-Molekül : IgE-Komplexes geeignet sind, wobei das IgE aus der Gruppe ausgewählt ist, das aus Hunde-IgE, Katzen-IgE und Pferde-IgE besteht; und (b) Bestimmen des Vorliegens von IgE durch Nachweisen des FcεR-Molekül : IgE-Komplexes, wobei das Vorhandensein des FcεR-Molekül : IgE-Komplexes auf das Vorhandensein von IgE hinweist. Ein bevorzugtes FcεR-Molekül ist eines, bei dem eine Kohlenhydratgruppe des FcεR-Moleküls an Biotin gebunden ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von IgE, das Folgendes umfasst: (a) In-Berührung-Bringen einer rekombinanten Zelle mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines rekombinanten Zell : IgE-Komplexes geeignet sind, wobei die rekombinante Zelle eine rekombinante Zelle ist, die ein humanes FcεR-Molekül exprimiert; und (b) Bestimmen des Vorhandenseins von IgE durch Nachweisen des rekombinanten Zell : IgE-Komplexes, wobei das Vorhandensein des rekombinanten Zell-IgE-Komplexes auf das Vorhandensein von IgE hinweist. Eine bevorzugte rekombinante Zelle schließt eines RBL-hFcεR-Zelle ein.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Flohallergie-Dermatitis bei Nicht-Menschen, das Folgendes umfasst: (a) Immobilisieren eines Floh-Allergens auf einem Substrat; (b) In-Berührung-Bringen des Floh-Allergens mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines Antigen-IgE-Komplexes geeignet sind, der an das Substrat gebunden ist; (c) Entfernen von ungebundenem Material aus dem Substrat unter Bedingungen, die eine Allergen : IgE-Komplexbindung an das Substrat aufrechterhalten; und (d) Nachweisen des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von IgE durch Nachweisen des Vorliegens des Allergen : IgE-Komplexes durch In-Berührung-Bringen des Allergen : IgE-Komplexes mit einem humanen FcεR-Molekül. Das Floh-Allergen ist vorzugsweise ein Floh-Speichelantigen und besonders bevorzugt Floh-Speichelprodukte und/oder Flohspeichel-Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls einen Kit zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung ein. Eine Ausführungsform ist ein Kit zum Nachweis von IgE, der ein humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Molekül und ein Mittel zum Nachweis von IgE umfasst, einschließlich Hunde-IgE, Katzen-IgE und Pferde-IgE. Eine weitere Ausführungsform ist ein allgemeiner Allergen-Kit, der ein nicht-humanes Allergen, das in allen Bereichen der Vereinigten Staaten üblich ist und ein humanes Fcε-Rezeptor(FcεR)-Molekül umfasst, wobei das Allergen an das IgE bindet. Eine weitere Ausführungsform besteht in einem Kit zum Nachweis einer Flohallergie-Dermatitis in nicht-menschlichen Lebewesen, umfassend ein humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Molekül und ein Flohallergen, wobei das Flohallergen an das IgE bindet.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Alphaketten-Protein, bei dem eine Kohlenhydratgruppe des FcεR-Alpha-Ketten-Proteins an Biotin gebunden ist. Ein bevorzugtes FcεR-Alpha-Ketten-Protein umfasst Ph FcεRα172-BIOT.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 2 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Pflanzenallergen-spezifischen Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 3 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von humanen oder Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 4 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Flohallergen-spezifischen Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 5 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Flohallergen-spezifischen und Herzwum-Antigen-spezifischen Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 6 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Flohspeichel-spezifischen Hunde-IgE-Antikörpern.
  • 7 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Herzwurm-Antigen-spezifischen Katzen-IgE-Antikörpern.
  • 8 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Herzwurm-Antigen-spezifischen Katzen-IgE-Antikörpern.
  • 9 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung einer biotinylierten Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Antigen-spezifischen Pferde-IgE-Antikörpern.
  • 10 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung basophiler Leukämie-Zellen, die die Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Hunde-IgE-Antikörpern in Seren von Herzwurm-infizierten Hunden exprimieren.
  • 11 zeigt ELISA-Ergebnisse unter Verwendung basophiler Leukämie-Zellen, die die Alpha-Kette von humanem FcεR zum Nachweis von Hunde-IgE-Antikörpern in Seren von Flohspeichel-empfindlichen Hunden exprimieren.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass gereinigter humaner Hochaffinitäts-Fcε-Rezeptor (d. h. FcεRI; hierin als FcεR bezeichnet) in bestimmten nicht-humanen, (d. h. caninen, Katzen- oder Pferde-) Epsilon-Immunglobulin (hierin als IgE oder IgE-Antikörper bezeichnet) basierten Nachweis- (beispielsweise Diagnose-, Screening-) Verfahren und Kits verwendet werden kann. Die Verwendung von humanem FcεR zum Nachweis von nichthumanem IgE ist unerwartet, weil Hunde-, Katzen- und Pferde-Immunsysteme vom menschlichen Immunsystem verschieden sind, ebenso wie sie voneinander verschieden sind (d. h. Moleküle, die für das Immunsystem von Bedeutung sind, sind üblicherweise Speziesspezifisch).
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines nicht-humanen IgE unter Verwendung eines isolierten humanen FcεR-Moleküls. Es sollte erwähnt werden, dass der Begriff „ein" Ding auf ein oder mehrere dieser Dinge bezogen sein kann; beispielsweise betrifft ein Protein auch ein oder mehrere Proteine oder zumindest ein Protein. Als solches können die Begriffe „ein" (oder „eine"), „ein oder mehreres" und „zumindest eines" hierin austauschbar verwendet werden. Es sollte ebenfalls erwähnt werden, dass die Begriffe „umfassend", „einschließend" und „aufweisend" austauschbar verwendet werden können. Darüber hinaus betrifft eine Verbindung „ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus" ein oder mehrere der Verbindungen in der Liste, die folgt, einschließkch Gemische (d. h. Kombinationen) aus zwei oder mehreren der Verbindungen.
  • Erfindungsgemäß ist ein isoliertes, oder biologisch reines FcεR-Molekül ein Molekül, das aus seinem natürlichen Milieu bzw. Umgebung entfernt wurde. Als solches widerspiegelt „isoliert" und „biologisch rein" nicht notwendigerweise den Umfang, bis zu dem das Molekül aufgereinigt wurde. Ein isoliertes humanes FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung kann aus seiner natürlichen Quelle gewonnen werden (beispielsweise aus einer humanen Mastzeile) kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden oder kann durch chemische Synthese erzeugt werden.
  • Ein FcεR-Molekül (hierin ebenfalls als FcεR oder FcεR-Protein) der vorliegenden Erfindung kann das Protein in voller Länge sein, ein Teil des Proteins in voller Länge oder irgendein Homolog eines solches Proteins. Wie hierin verwendet, kann ein Protein ein Polypeptid oder ein Peptid sein. Ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung kann ein vollständiges FcεR (d. h. Alpha-, Beta- und Gamma- FcεR-Ketten), eine Alpha- FcεR-Kette. (hierin ebenfalls als FcεRa-Kette) oder Teile hiervon umfassen. Vorzugsweise umfasst ein FcεR-Molekül zumindest einen Teil einer FcεRa-Kette, die an IgE bindet, d. h. die dazu in der Lage ist, mit der konstanten Region eines IgE einen Immunkomplex zu bilden. Vorzugsweise bindet ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung an IgE mit einer Affinität von ungefähr KA ≈ 108, insbesondere mit einer Affinität von ungefähr KA ≈ 109 und besonders bevorzugt mit einer Affinität von ungefähr KA ≈ 1010.
  • Ein isoliertes FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung, einschließlich eines Homologs, kann in einer einfachen Art und Weise durch die Fähigkeit des FcεR-Moleküls identifiziert werden, mit IgE einen Immunkomplex zu bilden. Beispiele für FcεR-Homologe schließen FcεR-Proteine ein, bei denen Aminosäuren deletiert (beispielsweise eine trunkierte Version des Proteins, beispielsweise ein Peptid), invertiert, invertiert, substituiert und/oder derivatisiert wurden (beispielsweise durch Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristoylierung, Prenylierung, Palmitoylierung, Amidierung und/oder Zusatz von Glycerolphosphatidylinositol), so dass das Homolog zumindest ein Epitop einschließt, das zur Bildung eines Immunkomplexes mit IgE in der Lage ist.
  • FcεR-Homologe können das Ergebnis einer natürlichen Allel-Variation oder natürlichen Mutation sein. Die FcεR-Homologe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls unter Verwendung von Techniken erzeugt werden, die in der Technik bekannt sind, einschließead, jedoch nicht beschränkt auf, direkte Modifikationen des Proteins oder Modifikationen des Gens, das das Protein codiert, unter Verwendung von beispielsweise klassischen oder DNA-Rekombinationstechniken, um eine zufällige oder zielgerichtete Mutagenese zu bewirken.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine humane FcεR-α-Kette der vorliegenden Erfindung durch zumindest einen Anteil der Nukleinsäure-Sequenz des codierenden Stranges einer cDNA codiert, die ein volle-Länge FcεRα-Ketten-Protein codiert, das hierin als SEQ ID Nr. 1 repräsentiert ist, wobei der Anteil zumindest die IgE-Bindungsstelle des FcεRα-Ketter-Proteins codiert. Das doppelsträngige Nukleinsäure-Molekül, das sowohl den codierenden Strang mit SEQ ID Nr. 1 als auch den komplementären nicht-codierenden Strang einschließt (dessen Nukleinsäuresequenz in einfacher Weise durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden kann und hierin als SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist), ist hierin als FcεR-Nukleinsäure-Molekül nhFcεRaα1198 bezeichnet worden. Die Translation von SEQ ID Nr. 1 legt nahe, dass das Nukleinsäure-Molekül nhFcεRa1198 ein volle-Länge FcεRα-Ketten-Protein von ungefähr 257 Aminosäuren codiert, das hierin als pHFcεRα257 bezeichnet wird, repräsentiert durch SEQ ID Nr. 2, unter Annahme eines Open-Reading-Frames mit einem Initiations-(Start-)Codon, das sich von Nukleotid 107 bis zu Nukleotid 109 von SEQ ID Nr. 1 erstreckt und eines Terminations-(Stopp-)Codons, das sich von Nukleotid 878 bis zu Nukleotid 880 von SEQ ID Nr. 1 erstreckt. Die codierende Region, die pHFcεRa257 codiert und die das Stopp-Codon einschließt, wird durch das Nukleinsäure-Molekül nhFcεRα774 repräsentiert, das einen codierenden Strang mit der hierin als SEQ ID Nr. 4 dargestellten Nukleinsäuresequenz aufweist. Das Komplement von SEQ ID Nr. 4 wird hierin als SEQ ID Nr. 5 repräsentiert. SEQ ID Nr. 1 codiert ein Signalpeptid von ungefähr 25 Aminosäuren ebenso wie ein reifes Protein von ungefähr 232 Aminosäuren, hierin als PhFcεRα232 bezeichnet, dessen Aminosäuresequenz hierin als SEQ ID Nr. 6 repräsentiert ist. Das Nukleinsäure-Molekül, das das apparente reife Protein codiert, wird als nhFcεRα699 bezeichnet, dessen Nukleinsäuresequenz des codierenden Stranges hierin als SEQ ID Nr. 7 bezeichnet wird. SEQ ID Nr. 1 codiert ebenfalls eine hydrophobe Transmembrandomäne und ein zytoplasmatisches Ende, das eine Gruppe aufweist, die sich von Aminosäure 205 bis Aminosäure 257 von SEQ ID Nr. 2 erstreckt. Die Kenntnis dieser Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen ermöglicht es dem Fachmann auf dem Gebiet, Modifikationen der jeweiligen Nukleinsäure-Moleküle und Proteine durchzuführen, um beispielsweise ein FcεRα-Ketten-Protein mit erhöhter Löslichkeit und/oder ein trunkiertes Protein zu entwickeln (beispielsweise ein Peptid), das zum Nachweis von IgE, beispielsweise PhFcεRα197 und PhFcεRα172, in der Lage ist. Bevorzugte FcεR-Moleküle schließen PhFcεRα197, PhFcεRα232 und PhFcεRα172 ein. Bevorzugte Nukleinsäure-Moleküle zur Codierung eines FcεR-Moleküls schließen PhFcεRα774, nhFcεRα11 98, nhFcεRα612, nhFcεRα591, nhFcεRα699 und/oder nhFcεRα516 ein.
  • Ein isoliertes FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung kann durch Kultivieren einer Zeite, die zum Exprimieren des Proteins unter Bedingungen in der Lage ist, die zur Erzeugung des Proteins wirksam sind, und durch Gewinnung des Proteins, erzeugt werden. Eine bevorzugte Zelle für die Kultur ist eine rekombinante Zelle, die dazu in der Lage ist, das Protein zu exprimieren, wobei die rekombinante Zelle durch Transformieren einer Wirtszelle mit einer oder mehreren Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung erzeugt wird. Die Transformierung des Nukleinsäure-Moleküls in eine Zelle kann durch irgendein Verfahren erreicht werden, durch das ein Nukleinsäure-Molekül in die Zelle eingefügt werden kann. Transformationstechniken schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption und Protoplasten-Fusion. Eine rekombinante Zelle kann unizellulär bleiben oder kann in einem Gewebe, Organ oder in einem multizellulären Organismus wachsen. Transformierte Nukleinsäure-Moleküle der vorliegenden Erfindung können extrachromosomal bleiben oder können sich in eine oder mehrere Stellen innerhalb des Chromosoms der transformierten (d. h. rekombinanten) Zelle in einer solchen Weise integrieren, dass ihr Vermögen, exprimiert zu werden, aufrechterhalten wird: Geeignete und bevorzugte Nukleinsäure-Moleküle, mit denen eine Zelle transformiert wird, sind wie hierin für geeignete und bevorzugte FcεR-Nukleinsäure-Moleküle per se offenbart. Besonders bevorzugte Nukleinsäure-Moleküle, die rekombinante Zellen der vorliegenden Erfindung einschließen sollen, schließen nhFcεRα774, nhFcεRα1198, nhFcεRα612, nhFcεRα591, nhFcεRα669 und/oder nhFcεRα516 ein.
  • Geeignete Wirtszellen zum Transformieren schließen irgendwelche Zellen ein, die mit einem Nukleinsäure-Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert werden können. Wirtszellen können entweder untransformierte Zellen oder Zellen sein, die bereits mit zumindest einem Nukleinsäure-Molekül transformiert wurden. Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können entweder endogen (d. h. natürlich) dazu in der Lage sein, ein FcεR-Molekül-Protein der vorliegenden Erfindung zu produzieren oder können dazu in der Lage sein, solche Proteine zu produzieren, nachdem sie mit zumindest einem Nukleinsäure-Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert wurden. Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können jede Zelle sein, die zum Produzieren zumindest eines Proteins der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, einschließlich bakterieller, Pilz- (einschließlich Hefe-), Parasiten- (einschließlich Protozoen und Ektoparasiten), Insekten- oder anderer Tier- und Pflanzenzellen.
  • Eine rekombinante Zelle, die mit einem rekombinanten Molekül der vorliegenden Erfindung transfiziert wird, ist vorzugsweise ein Molekül, das zumindest eines der Nukleinsäure-Moleküle einschließen kann, die hierin vorstehend beschrieben wurden, funktionell gebunden an zumindest eine der Transkripitions-Kontrollsequenzen, die dazu in der Lage sind, die Expression der Nukleinsäure-Moleküle (des Nukleinsäure-Moleküls) in der Zelle, die transformiert werden soll, wirksam zu regulieren, und Beispiele von diesen sind hierin offenbart. Ein besonders bevorzugtes rekombinantes Molekül schließt pVL-nhFcεRα612 ein. Details bezüglich der Produktion von FcεR-Molekül-Nukleinsäure-Molekül-enthaltenden rekombinanten Molekülen sind hierin offenbart. Eine besonders bevorzugte rekombinante Zelle der vorliegenden Erfindung schließt Trichoplusia ni-pVL-nhFcεRα612 ein.
  • Ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung kann chimäre Moleküle einschließen, die einen Teil eines FcεR-Moleküls einschließen, das an IgE bindet, und ein zweites Molekül, das es dem chimären Molekül ermöglicht, an ein Substrat in einer solchen Weise gebunden zu werden, dass der FcεR-Anteil an IgE im Wesentlichen in derselben Weise wie ein FcεR-Molekül bindet, das nicht an ein Substrat gebunden ist. Ein Beispiel für ein geeignetes zweites Molekül schließt einen Anteil eines Immunglobulin-Moleküls ein.
  • Ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung kann in einer Formulierung enthalten sein, hierin bezeichnet als eine FcεR-Formulierung bzw. -Zusammensetzung. Beispielsweise kann FcεR mit einem Puffer kombiniert werden, in dem FcεR solubilisiert wird und/oder einen Träger. Geeignete Puffer und Träger sind für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Beispiele geeigneter Träger schließen irgendeinen Puffer ein, bei dem ein FcεR dazu dienen kann, selektiv an IgE zu binden, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Phosphatgepufferte Salzlösung, Wasser, Salzlösung, Phosphatpuffer, Hydrogencarbonat-Puffer, HEPES-Puffer (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure gepufferte Salzlösung), TES-Puffer (Tris-EDTA-gepufferte Salzlösung), Tris-Puffer und TAE-Puffer (Tris-acetat-EDTA). Beispiele von Trägern schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polymermatrices, Toxoide und Serumalbumine, wie beispielsweise Rinderserumalbumin. Träger können mit °C R vermischt oder an FcεR konjugiert (d. h. befestigt) werden, in einer solchen Weise, dass diese im Wesentlichen die Fähigkeit des FcεR, selektiv an IgE zu binden, nicht stören.
  • Ein FcεR der vorliegenden Erfindung kann an die Oberfläche einer Zelle gebunden sein, die FcεR exprimiert. Eine bevorzugte FcεR-tragende Zelle schließt eine rekombinante Zelle e in, die ein Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das eine humane FcεR-Alpha-Kette der vorliegenden Erfindung exprimiert. Eine besonders bevorzugte rekombinante Zelle der vorliegenden Erfindung exprimiert ein Nukleinsäure-Molekül, das zumindest eines der folgenden Proteine codiert: PhFcεRα257 und PhFcεRα232. Eine noch mehr bevorzugte rekombinante Zelle exprimiert ein Nukleinsäure-Molekül, das nhFcεRα612, nhFcεRα591, nhFcεRα699 und/oder nhFcεRα516 einschließt, wobei eine rekombinante Zelle, die ein Nukleinsäure-Modell exprimiert, eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die die SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 einschließt, oder ein Nukleinsäure-Molekül, das eine Allel-Variante eines Nukleinsäure-Moleküls umfasst, das SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, die noch mehr bevorzugt sind. Eine noch mehr bevorzugte rekombinante Zelle ist eine RBL-hFcεR-Zelle.
  • Zusätzlich kann eine FcεR-Formulierung der vorliegenden Erfindung nicht nur ein FcεR einschließen, sondern auch ein oder mehrere zusätzliche Antigene oder Antikörper, die beim Nachweis von IgE von Nutzen sind. Wie hierin verwendet, betrifft ein Antigen irgendein Molekül, das dazu in der Lage ist, selektiv durch einen Antikörper gebunden zu werden. Wie hierin verwendet, betrifft eine spezifische Bindung eines ersten Moleküls an ein zweites Molekül die Fähigkeit des ersten Moleküls, vorzugsweise (beispielsweise mit einer höheren Affinität, höheren Avidität) an das zweite Molekül zu binden, im Vergleich zur Fähigkeit eines ersten Moleküls, an ein drittes Molekül zu binden. Das erste Molekül muss nicht notwendigerweise der natürliche Ligand des zweiten Moleküls sein. Beispiele für solche Antikörper schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, die selektiv an die konstante Region einer IgE-schweren Kette (d. h. Anti-IgE-Isotyp-Antikörper) oder von Antikörpern binden, die selektiv an IgE binden, das eine spezifische Antigen-Spezifität aufweist (d. h. Anti-IgE-Idiotyp-Antikörper). Beispiele für solche Antigene schließen irgendein Antigen ein, von dem bekannt ist, dass es die Produktion von IgE einschließt. Bevorzugte Antigene schließen Allergene und Parasiten-Antigene ein. Allergene der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise aus Pilzen, Bäumen, Kräutern, Sträuchern bzw. Büschen, Gräsern, Weizen, Mais, Soja, Reis, Eier, Milch, Käse, Rinder (oder Vieh), Pute, Schwein, Schaf, Hefe, Flöhen, Fliegen, Moskitos, Milben, kleinen Mücken, Stechmücken, Läusen, Bienen, Wespen, Ameisen, Wanzen oder Zecken abgeleitet. Ein geeignetes Flohallergen schließt ein Allergen ein, abgeleitet bzw. gewonnen aus einem Floh, insbesondere ein Floh-Speichelantigen. Ein bevorzugtes Floh-Allergen schließt Floh- Speichelantigen ein. Bevorzugte Floh-Speichelantigene schließen Antigene ein, wie solche, die in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO96/11271, veröffentlicht am 18. April 1996 von Frank et al. (diese Veröffentlichung ist in ihrer Gesamtheit hierin mit aufgenomnen) offenbart sind, wobei Flohspeichel-Produkte und Flohspeichel-Proteine besonders bevorzugt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung schließt ein Floh-Speichelprotein ein Protein ein, das durch DNA-Rekombinations-Verfahren erzeugt wurde, ebenso wie Proteine, die durch andere Verfahren isoliert wurden, offenbart in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO96/ 11271.
  • Bevorzugte allgemeine Allergene schließen solche ein, die aus Gras, Meadow Fescue, Curly Dock, Wegerich, Mexican Firebush, Lamb's Quarters, weißem Gänsefuß, Beifuß-blättriger Ambrosie (Ambrosia artemisifolia), Salbei, Ulme, Klette, Eschenahorn, Walnuss, Papliel, Esche, Birke, Zeder, Eiche, Maulbeerbaum, Kakerlake bzw. Schabe, Dermataphagoiden, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Helminthosporium, Mucor, Penicillium, Pullularia, Rhizopus und/oder Tricophyton, gewonnen werden. Besonders bevorzugte allgemeine Allergene schließen solche ein, gewonnen aus Johnson Grass, Kentucky Blue Grass, Wiesenschwingel (Meadow Fescue), Knaulgras (Orchard Grass), deutsches Weidelgras (Perennial Rye Grass), Redtop Grass, Timothy Grass, Bermudagras, Trespe (Brome Grass), Curly Dock, English Plantain, Mexican Firebush, weissem Gänsefuss (Lamb's Quarters), Rough Pigweed, Short Ragweed, Wormwood Sage, American E. m, Common Cocklebur, Box Elder, Schwarze Walnuss (Black Walnut), Eastern Cottonwood, Grüne Esche (Green Ash), River Birch, Riesenlebensbaum (Red Cedar), Roteiche, Red Mulberry, Kakerlake, Dermataphagoides farinae, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cladosporium herbarum, Fusarium vasinfectum, Helminthosporium sativum, Mucor recemosus, Penicillium notatum, Pullularia pullulans, Rizopus nigricans und/oder Tricophyton spp. ein. Bevorzugte tropische Allergene schließen solche ein, die aus Bermudagras, June Bluegrass, Annual Bluegrass, Knaulgras, Perennial Rye Grass, Timorhy Grass, Wiesenschwingel, Common Cocklebur, Yellow Dock, Sheep Sorrel, English Plantain, Lamb's Quarters, Rough Pigweed, Russian Thistle, Short Ragweed, Riesenlebensbaum, Katzenepithel, Arizona-Zypresse, Sumpf-Zypresse, Dattelpalme, Zimmertanne, Eukalyptus, Mango, Akazie, Grama Grass, Brennessel, Western Cottonwood (Pappel), Saltgrass, Dermataphagoides pteronyssinus, Aurebasidium pullans, Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, Drechslera sorokiniana, Fusarium roseum, Cladosporium sphaerospermum, Aspergillus fumigatus, Alernaria tenuis, Dermataphagoides farinae und Stemphyllium sarciniforme abgeleitet sind. Bevorzugte Wüstenallergene schließen solche ein, die aus Bahia Grass, Smooth Brome, Johnson Grass, Redtop Grass, falscher Ambrosie (False Ragwee J), Carelessweed, Greasewood, Rough Marsh Elder, Kochia, Tall Ragweed, Western Ragweed, Slender Ragweed, Gemeinem Salbei, Prärie-Salbei, Beifuß-Salbei bzw. Mugwort Sage und Shadscale abgeleitet sind. Bevorzugte Parasiten-Antigene schließen ein, sind jedoch beschränkt auf, Wurm-Antigene, insbesondere Herzwurm- bzw. Dirophilaria-emmitis-Antigene wie beispielsweise Di33 (beschrieben in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/715 628, eingereicht am 18. September 1996 auf den Namen Grieve et al.). Der Begriff „abgeleitet von bzw. gewonnen von" betrifft ein natürliches Antigen solcher Pflanzen oder Organismen (d. h. ein Allergen, das direkt aus einer solchen Pflanze oder von Organismen isoliert wurde) ebenso wie nicht-natürliche Allergene solcher Pflanzen oder Organismen, die zumindest ein Epitop besitzen, das zur Hervorrufung einer Immunreaktion gegen ein Allergen in der Lage ist (beispielsweise produziert unter Verwendung einer DNA-Rekombinationstechnologie oder durch chemische Synthese).
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls humane FcεR-Mimetope ein und die Verwendung hiervon, um IgE nachzuweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff „Mimetop" jede Verbindung, die dazu in der Lage ist, die Fähigkeit eines FcεR-Moleküls zur Bindung an IgE nachzumachen. Ein Mimetop kann ein Peptid sein, das so modifiziert wurde, dass es dessen Empfänglichkeit gegenüber einem Abbau senkt, jedoch nach wie vor seine IgE-bindende Aktivität beibehält. Weitere Beispiele von Mimetofen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Kohlenhydrat-basierte Verbindungen, Lipidbasierte Verbindungen, Nukleinsäure-basierte Verbindungen, natürliche organische Verbindungen, synthetisch abgeleitete organische Verbindungen, Anti-Idiotyp-Antikörper und/oder katalytische Antikörper oder Fragmente hiervon. Ein Mimetop kann beispielsweise durch Screening von Bibliotheken synthetischer Verbindungen nach Verbindungen gewonnen werden, die dazu in der Lage sind, an IgE zu binden. Ein Mimetop kann ebenfalls beispielsweise durch rationales Arzneistoff-Design gewonnen werden. Bei einem rational en Arzneistoff-Design-Verfahren kann die dreidimensionale Struktur einer Verbindung der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch Kernmagnetresonanz (NMR) oder Röntgen-Kristallographie analysiert werden. Die dreidimensionale Struktur kann dann dazu verwendet werden, Strukturen potenzieller Mimetope, beispielsweise durch Computer-Modellierung, vorherzusagen. Die vorhergesagten Mimetop-Strukturen können dann beispielsweise durch chemische Synthese, DNA-Rekombinationstechnologie oder durch Isolieren eines Mimetops aus einer natürlichen Quelle produziert werden. Spezielle Beispiele für FcεR-Mimetope schließen anti-Idiotyp-Antikörper, Oligonukleotide, produziert unter Verwendung der Selex-Technologie, Peptide identifiziert durch zufälliges Screening von Peptid-Bibliotheken und Proteine ein, die durch Phasen-Display-Technologie identifiziert wurden.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis von nicht-menschlichem IgE, das die folgenden Schritte einschließt: (a) In-Berührung-Bringen eines isolierten humanen FcεR-Rezeptor-(FcεR-)Moleküls mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines FcεR-Molekül : IgE-Komplexes geeignet sind; und (b) Bestimmen der Konzentrationen an IgE durch Nachweisen des FcεR-Molekül : IgE-Komplexes. Das Vorhandensein eines solchen FcεR-Molekül : IgE-Komplexes zeigt an, dass das Tier IgE produziert. Bevorzugtes, nicht-humanes IgE zum Nachweisen unter Verwendung eines humanen FcεR-Moleküls schließt Hunde-IgE, Katzen-IgE und Pferde-IgE ein. Das vorliegende Verfahren kann weiterhin den Schritt einschließen zu bestimmen, ob ein IgE, komplexiert mit einem FcεR-Molekül, Hitze-labil ist. Verfahren zur Bestimmung der Hitze-Labilität von IgE sind im Abschnitt Beispiele offenbart. Vorzugsweise ist ein IgE Hitze-labil, wenn es bei ungefähr 56°C für ungefähr 4 Stunden inkubiert wird. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, nehmen die Anmelder an, dass Hitze-labile Formen von IgE bestimmte Allergene binden und nicht-Hitze-labile Formen von IgE andere Allergentypen binden. Als solches kann der Nachweis von Hitzelabilem IgE im Vergleich mit nicht-Hitze-labilen IgE dazu verwendet werden, zwischen Allergen-Empfindlichkeiten zu unterscheiden. Beispielsweise nehmen die Anmelder an, dass IgE-Antikörper, die an bestimmte Floh-Allergene und Herzwurm-Allergene binden, Hitzelabil sind, wohingegen IgE-Antikörper, die an bestimmte Pflanzen-Allergene binden, nicht Hitze-labil sind. Somit kann das Vorliegen von nicht-Hitze-labilem IgE anzeigen, dass ein Tier gegenüber bestimmten Pflanzen-Allergenen empfindlich ist, jedoch nicht gegenüber bestimmten Floh- und Herzwurm-Allergenen. Darüber hinaus nehmen die Anmelder an, dass die Identifizierung von Hitze-labilem IgE und nicht-Hitze-labilem IgE unter Verwendung von humanem FcεR das Vorliegen unterschiedlicher Sub-Populationen von IgE nahelegt, die beträchtlich ähnliche Strukturen gegenüber bekanntett IgE aufweisen können. Als solches kann ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Molekülen von Nutzen sein, die durch das FcεR-Molekül gebunden werden, jedoch mit bekannten IgE nicht identisch sind.
  • Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „canin" jedes Mitglied der Hunde-Familie einschließlich Haushunde, wilder Hunde und Zoo-Hunde. Beispiele für Hunde schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Haushunde, wilde Hunde, Füchse, Wölfe, Schakale und Kojoten. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „felin" irgendein Mitglied der Katzen-Familie, einschließlich Hauskatzen, Wildkatzen und Zookatzen. Beispiele für Katzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hauskatzen, Löwen, Tiger, Leoparden, Panther, Puma, Rotluchs, Luchs, Jaguar, Geparden und mehrere andere. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „equin" jedes Mitglied der Pferdefamilie, einschließlich Pferden, Eseln, Maultieren und Zebras.
  • Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „In-Berührung-Bringen" ein Kombinieren bzw. Vereinigen oder Vermischen, in diesem Falle einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung mit einem humanen FcεR-Molekül. Die Ausbildung eines Komplexes zwischen einem FcεR und einem IgE betrifft das Vermögen des FcεR, selektiv an das IgE zu binden, um einen stabilen Komplex zu bilden, der gemessen werden kann (d. h. nachgewiesen werden kann). Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „selektiv an IgE binden" die Fähigkeit eines FcεR der vorliegenden Erfindung, in erster Linie an IgE zu binden, ohne dazu in der Lage zu sein, an irgendeinen anderen Antikörper-Isotypen zu binden. Eine Bindung zwischen FcεR und IgE wird unter Bedingungen bewirkt, die zur Bildung eines Komplexes geeignet sind; solche Bedingungen (beispielsweise geeignete Konzentrationen, Puffer, Temperaturen, Reaktionszeiten) ebenso wie Verfahren zur Optimierung solcher Bedingungen sind für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt und Beispiele hierfür sind hierin offenbart. Beispiele für komplexe Bildungs-Bedingungen sind in beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, offenbart, und die Literaturstelle Sambrook et al., ebd., ist durch Bezugnahme hierin in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen.
  • Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Nachweisen einer Komplexbildung" die Bestimmung, ob irgendein Komplex gebildet wird, d. h. eine Untersuchung auf das Vorhandensein (d. h. Existenz) eines Komplexes. Wenn Komplexe gebildet werden, kann die Menge an Komplexen, die gebildet wird, muss jedoch nicht, bestimmt werden. Die Komplexbildung oder selektive Bindung zwischen FcεR und irgendeinem IgE in der Zusammensetzung kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die in der Technik Standard sind (s. beispielsweise Sambrook et al., ebd.) gemessen (d. h. nachgewiesen bestimmt) werden, und Beispiele hierfür sind hierin offenbart.
  • Bei einer Ausführungsform schließt eine vermeintliche IgE-enthaltende Zusammensetzung des vorliegenden Verfahrens eine biologische Probe von einem Tier ein. Eine geeignete biologische Probe schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine Körperflüssigkerts-Zusammensetzung oder eine zelluläre Zusammensetzung. Eine Körperflüssigkeit betrifft irgendeine Flüssigkeit, die von einem Tier gesammelt (d. h. gewonnen) werden kann, und Beispiele hierfür schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Blut, Serum, Plasma, Urin, Tränen, wässrige Flüssigkeit bzw. wässriger Humor, Zentralnervensystems-Flüssigkeit (ZNF), Speichel, Lymphe, Nasensekrete, Milch und Faeces. Eine solche Zusammensetzung des vorliegenden Verfahrens kann, muss jedoch nicht, vorbehandelt werden, um zumindest einige der nicht-IgE-Isotypen von Immunglobulin und/oder anderer Proteine, beispielsweise Albumin, die in der Flüssigkeit vorliegen, zu entfernen. Eine solche Entfernung kann einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf, das In-Berührung-Bringen der Körperflüssigkeit mit einem Material, wie beispielsweise Protein G, um IgG-Antikörper zu entfernen und/oder die IgE-Antikörper von anderen Bestandteilen der Körperflüssigkeit durch Exponieren der Flüssigkeit beispielsweise gegenüber Concanavalin A aufzureinigen. In einer weiteren Ausführungsform schließt eine Zusammensetzung gesammelte Körperflüssigkeit auf, die so vorbehandelt wird, dass das in der Flüssigkeit enthaltene Immunglobulin konzentriert wird. Beispielsweise kann das in einer Körperflüssigkeit enthaltene Immunglobulin von andern Proteinen unter Verwendung von Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Eine bevorzugte Zusammensetzung des vorliegenden Verfahrens ist ein Serum.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform schließt eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine IgE-produzierende Zelle ein. Eine solche Zelle kann IgE an die Oberfläche der Zelle gebunden aufweisen und/oder kann IgE sezernieren. Beispiele für solche Zellen schließen basophile Zellen und Myeloma-Zellen ein. IgE kann an die Oberfläche einer Zelle entweder direkt an die Membran einer Zelle oder gebunden an ein Molekül (beispielsweise ein Antigen), das an die Oberfläche der Zelle gebunden wird, gebunden sein.
  • Ein Komplex kann auf einer Vielzahl von Wegen nachgewiesen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung einer oder mehrerer der folgenden Assays: ein Enzym-gebundener Immunassay, ein Radioimmun-Assay, ein Fluoreszenzimmun-Assay, ein Chemilumineszenz-Assay, ein lateraler Strömungs-Assay (lateral flow assay), ein Agglutinations-Assay, ein Teilchen-basierter Assay (beispielsweise unter Verwendung von teilchenförmigen Materialien wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, magnetischen Teilchen oder Kunststoffpolymeren wie beispielsweise Latex- oder Polystyrol-Perlen), eines Immunpräzipitations-Assays, eines BioCoreTM-Assay (beispielsweise unter Verwendung von kolloidalem Gold) und eines Immunblotting-Assays (beispielsweise eines Westernblos). Solche Assays sind für den Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt. Assays können dazu verwendet werden, um qualitative oder quantitative Ergebnisse abhängig davon, wie sie verwendet werden, zu liefern. Einige Assays, wie beispielsweise Agglutination, Teilchen-Trennung und Immunausfällung bzw. Immunpräzipitation können visuell beobachtet werden (beispielsweise entweder durch das Auge oder durch eine Vorrichtung wie beispielsweise ein Densitometer oder Spektrophotometer) ohne Bedarf nach einem nachweisbaren Marker. Bei anderen Assays hilft die Konjugation (d. h. Anbindung) eines nachweisbaren Markers an das FcεR oder an ein Reagenz, das selektiv an FcεR bindet oder an das IgE, das nachgewiesen wird (unten ausführlicher beschrieben) beim Nachweis der Komplex-Bildung. Beispiele nachweisbarer Marker schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine radioaktive Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine chemilumineszierende Markierung, eine chromophore Markierung oder einen Liganden. Ein Ligand betrifft ein Molekül, das selektiv an ein anderes Molekül bindet. Bevorzugte nachweisbare Marker schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fluoreszein, ein Radioisotop, eine Phosphatase (beispielsweise alkalische Phosphatase), Biotin, Avidin, eine Peroxidase (beispielsweise Meerrettich-Peroxidase) und Biotin-verwandte Verbindungen oder Avidin-verwandte Verbindungen (beispielsweise Streptavidin oder ImmunoPure®NeutrAvidin). Vorzugsweise wird Biotin an eine Alphakette eines FcεR gebunden. Vorzugsweise wird eine Kohlenhydratgruppe der FcεR-Alpha-Kette an Biotin gebunden. Ein bevorzugtes FcεR-Molekül, konjugiert an Biotin, umfasst PhFcεR172-BIOT (dessen Herstellung im Abschnitt Beispiele beschrieben ist).
  • Bei einer Ausführungsform wird ein Komplex durch In-Berührung-Bringen einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung mit einem FcεR-Molekül nachgewiesen, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist. Ein geeigneter nachweisbarer Marker zur Konjugierung an ein FcεR-Molekül schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine radioaktive Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine chemilumineszierende Markierung oder eine chromophore Markierung. Ein nachweisbarer Marker wird an ein FcεR-Molekül oder ein Reagenz in einer solchen Weise gebunden, dass die Fähigkeit des FcεR oder des Reagenz zur Bindung an das IgE, das nachgewiesen werden soll, nicht blockiert wird. Vorzugsweise wird eine Kohlenhydratgruppe eines FcεR an Biotin konjugiert. Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein FcεR-Molekül : IgE-Komplex durch In-Berührung-Bringen einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung mit einem FcεR-Molekül und darauf In-Berührung-Bringen des Komplexes mit einem Indikator-Komplex nachgewiesen. Geeignete Indikator-Moleküle der vorliegenden Erfindung schließen Moleküle ein, die entweder an das FcεR-Molekül oder an den IgE-Antikörper binden. Als solches kann ein Indikator-Molekül beispielsweise ein FcεR-Molekül, ein Antikörper und ein Lectin umfassen, abhängig davon, welcher Teil des FcεR-Molekül : IgE-Komplexes nachgewiesen werden soll. Bevorzugte identifizierende markierte Verbindungen, die Antikörper sir. d, schließen beispielsweise Anti-IgE-Antikörper und Anti-FcεR-Antikörper ein. Bevorzugte Lectine schließen solche Lectine ein, die an Mannose-reiche Gruppen binden. Bevorzugtere Lectine binden an Mannose-reiche Gruppen, die auf einem FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung vorliegen, die in Insektenzellen produziert werden. Ein Indikator-Molekül selbst kann an einen nachweisbaren Marker der vorliegenden Erfindung gebunden werden. Beispielsweise kann ein Antikörper an Biotin, Meerretich-Peroxidase, alkalische Phosphate se oder Fluoreszein gebunden werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein FcεR-Molekül : IgE-Komplex durch In-Berührung-Bringen des Komplexes mit einem Reagenz nachgewiesen, das selektiv an ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung bindet. Beispiele für ein solches Reagenz schlief en ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, einen Antikörper, der selektiv an das FcεR-Molekül bindet (hierin als ein Anti- FcεR-Antikörper bezeichnet) oder eine Verbindung, die selektiv an einen nachweisbaren Marker bindet, der an ein FcεR-Molekül gebunden ist. FcεR-Moleküle, die an Biotin konjugiert sind, werden vorzugsweise unter Verwendung von Streptavidin nachgewiesen, besonders bevorzugt unter Verwendung von ImmunoPure® NeutrAvidin (erhältlich von Pierce, Rockford, IL).
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein FcεR-Molekül : IgE-Komplex durch In-Berührung-Bringen des Komplexes mit einem Reagenz nachgewiesen, das selektiv an einen IgE-Antikörper bindet (hierin als ein Anti-IgE-Reagenz bezeichnet). Beispiele für ein solches Anti-IgE-Reagenz schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, einen sekundärgen Antikörper, der ein Antisotyp-Antikörper ist (beispielsweise ein Antikörper, der selektiv an die konstante Region eines IgE bindet), ein Antikörper-bindendes bakterielles Oberflächenprotein (beispielsweise Protein A oder Protein G), eine Antikörper-bindende Zelle (beispielsweise eine B-Zelle, eine T-Zelle, eine natürliche Killerzelle, eine polymorphkernige Leukozyten-Zelle, eine Monozyten-Zelle oder eine Makrophagen-Zelle), ein Antikörper-bindendes eukaryontisches Zelloberflächenprotein (beispielsweise ein Pc-Rezeptor), ein Antikörper-bindendes Komplement-Protein. Bevorzugte Anti-IgE-Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, D9 und CMI-Antikörper Nr. 9, CMI-Antikörper Nr. 19, CMI-Antikörper Nr. 59 und CMI-Antikörper Nr. 71 (erhältlich von Custom Monoclonal International, West Sacramento, CA). Insbesondere schließt ein Anti-IgE-Antikörper, wie hierin verwendet, nicht nur einen vollständigen Antikörper, sondern auch eine Untereinheit oder einen Anteil hiervon ein, der dazu in der Lage ist, selektiv an, die an eine konstante Region einer IgE-schweren Kette binden. Beispielsweise kann ein Anteil eines Anti-IgE-Reagenz ein Fab-Fragment oder ein F(ab')2-Fragment einschließen, das ausführlich in Janeway et al., in Immunobiology, the Immune System in Health and Disease, Garland Publishing, Inc., NY, 1996, beschrieben ist (das hierin durch diese Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen ist).
  • Bei einer Ausführungsform kann ein Komplex gebildet und in Lösung nachgewiesen werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein Komplex gebildet werden, bei dem ein oder mehrere Mitglieder des Komplexes auf einem Substrat immobilisiert werden (beispielsweise darauf beschichtet werden). Immobilisierungstechniken sind für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Geeignete Substratmaterialien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Kunststoff, Glas, Gel, Zelluloid, Papier, PVDF (Polyvinylidenfluorid), Nylon, Nitrozellulose und teilchenförmige Materialien, wie beispielsweise Latex, Polystyrol, Nylon, Nitrozellulose, Agarose und Magnetharz. Geeignete Formen für Substratmaterial schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Well bzw. Vertiefung (beispielsweise Mikrotiterschalen-Well), eine Platte, ein Messstab, eine Perle, eine laterale Strömungs-Vorrichtung, eine Membran, ein Filter, eine Röhre, eine Schale, eine Zelluloid-artige Matrix, Magnetteilchen oder anderes teilchenförmiges Material. Ein besonders bevorzugtes Substrat umfasst eine ELISA-Platte, einen Messstab, eine Radioimmunoassay-Platte, Agaroseperlen, Kunststoffperlen, Latexperlen, Immunblot-Membranen und Immunblot-Papiere. Bei einer Ausführungsform kann ein Substrat, beispielsweise ein teilchenförmiges Material, einen nachweisbaren Marker einschließen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von IgE ist ein Immunadsorbtions-Assay. Ein Immunabsorbtions-Assay der vorliegenden Erfindung umfasst ein Einfangmolekül und Ein Indikatormolekül. Ein Einfangmolekül der vorliegenden Erfindung bindet an IgE in einer solchen Weise, dass das IgE an einem Substrat immobilisiert wird. Als solches wird ein Einfangmolekül vorzugsweise an einem Substrat der vorliegenden Erfindung vor Exposition des Einfangmoleküls gegenüber einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung immobilisiert. Ein Indikatormolekül der vorliegenden Erfindung weist das Vorhandensein eines an ein Einfang-Molekül gebundenen IgEs nach. Als solches wird ein Indikatormolekül vorzugsweise nicht am selben Substrat wie ein Einfang-Molekül vor Exposition des Einfang-Moleküls gegenüber einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung immobilisiert.
  • Ein bevorzugtes Immunabsorbtions-Assayverfahren schließt die Schritte ein, entweder: (a) Ein FcεR-Molekül an ein Substrat vor dem In-Berührung-Bringen eines FcεR-Moleküls mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung zu binden, um ein FcεR-Molekülbeschichtetes Substrat zu bilden; oder (b) eine vermeintliche IgE-enthaltende Zusammensetzung an ein Substrat vor dem In-Berührung-Bringen eines FcεR-Moleküls mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung zu binden, um ein mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung beschichtetes Substrat zu bilden. Vorzugsweise schließt das Substrat in nicht-beschichtetes Substrat, ein FcεR-Molekülbeschichtetes Substrat, ein Antigen-beschichtetes Substrat oder ein Antigen-IgE-Antikörperbeschichtetes Substrat ein.
  • Sowohl ein Einfang-Molekül als auch ein Indikator-Modell der vorliegenden Erfindung sind dazu in der Lage, an IgE zu binden. Vorzugsweise bindet ein Einfang-Molekül an einen unterschiedlichen Bereich eines IgE als ein Indikator-Molekül, wodurch ermöglicht wird, da, ein Einfang-Molekül zur selben Zeit wie ein Indikator-Molekül an ein IgE bindet. Die Verwendung eines Reagenz als Einfang-Molekül oder als Indikator-Molekül hängt davon ab, ob das Molekül an einem Substrat immobilisiert wird, wenn das Molekül gegenüber IgE exponiert wird. Beispielsweise wird ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung als Einfang-Molekül verwendet, wenn das FcεR-Molekül an ein Substrat gebunden ist. Alternativ wird ein FcεR-Molekül als Indikator-Molekül verwendet, wenn das FcεR-Molekül nicht an ein Substrat gebunden wird. Ein geeignetes Molekül zur Verwendung als Einfach-Moleküle oder Indikator-Moleküle schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung, ein Antigen-Reagenz oder ein Anti-IgE-Antikörper-Reagenz der vorliegenden Erfindung.
  • Ein Immunabsorbtions-Assay der vorliegenden Erfindung kann weiterhin ein oder mehrere Schichten und/oder Typen von sekundären Molekülen oder anderen bindenden bzw. Bindungs-Molekülen umfassen, die zum Nachweisen des Vorliegens eines Indikator-Moleküls in der Lage sind. Beispielsweise kann ein nicht-markierter (d. h. nicht an einen nachweisbaren Marker gebundener) sekundärer Antikörper, der selektiv an ein Indikator-Molekül bindet, an einen markierten (d. h. an einen nachweisbaren Marker konjugierten) tertiären Antikörper gebunden werden, der selektiv an den sekundären Antikörper bindet. Geeignete sekundäre Antikörper, tertiäre Antikörper und andere sekundäre oder tertiäre Moleküle können vom Fachmann auf dem Gebiet ausgewählt werden. Bevorzugte sekundäre Moleküle der vorliegenden Erfindung schließen ein Antigen, einen Anti-IgE-Idiotyp-Antikörper und einen Anti-IgE-Isotypen ein. Bevorzugte tertiäre Moleküle können durch einen Fachmann aufgrund der Charakteristika des sekundären Moleküls ausgewählt werden. Dieselbe Strategie wird für anschließende Schichten angewendet.
  • Bei einer Ausführungsform wird ein erwünschtes Antigen als Einfang-Molekül verwendet, indem es auf einem Substrat immobilisiert wird, wie beispielsweise einen Mikrotiterplattea-Well oder einen Messstab. Bevorzugte Antigene schließen solche ein, die hierin offenbart sind. Eine biologische Probe, die von einem Tier gesammelt wird, wird auf das Substrat aufgebracht und unter Bedingungen inkubiert, die geeignet sind (d. h. ausreichend sind), um eine Antigen : IgE-Komplexbildung, gebunden an das Substrat, zu ermöglichen (d. h. das IgE in einer Probe bindet an ein Antigen, das an ein Substrat immobilisiert ist). Überschüssiges ungebundenes Material (d. h. Material aus der biologischen Probe, das nicht an das Antigen gebunden wurde), falls vorhanden, wird aus dem Substrat unter Bedingungen entfernt, die dein Antigen : IgE-Komplex, der an das Substrat bindet, erhalten. Bevorzugte Bedingungen sind hierin im Abschnitt Beispiele offenbart und sind im Allgemeinen bei Sambrook et al., ebd., offenbart. Ein Antikörper-Molekül, das selektiv an ein an das Antigen gebundene IgE binden kann, wobei das Indikator-Molekül an einen nachweisbaren Marker gebunden sein kann (vorzugsweise einen Enzym-Marker oder einen colorimetrischen Marker, einen fluoreszierenden Marker, ein Radioisotop oder einen Liganden, wie beispielsweise einen der Biotin- oder Avidin-Familie) wird dem Substrat zugesetzt und zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Indikator-Molekül und dem Antigen : IgG-Komplex inkubieren gelassen. Überschüssiges Indikator-Molekül wird entfernt, ein Entwicklungsmittel wird, falls erforderlich, zugesetzt, und das Substrat einer Nachweisvorrichtung zur Analyse unterworfen. Ein bevorzugtes Indikatormolekül für diese Ausführungsform ist ein FcεR-Molekül, vorzugsweise gebunden an Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder an eine Enzym-Markierung.
  • Bei einer Ausführungsform wird ein FcεR-Molekül als Einfang-Molekül verwendet, indem es an einem Substrat immobilisiert ist, wie beispielsweise an einer Mikotiterschalen-Well oder einem Messstab. Eine biologische Probe, die von einem Tier gesammelt wurde, wird auf das Substrat aufgebracht und unter Bedingungen, die dazu geeignet sind, eine FcεR-Molekül : IgE-Komplexbildung, gebunden an das Substrat, zu ermöglichen, inkubiert. Überschüssiges ungebundenes Material, falls vorhanden, wird aus dem Substrat unter Bedingungen entfernt, die die Bindung des FcεR-Molekül : IgE-Komplexes an das Substrat aufrechterhalten. Ein Indikator-Molekül, das selektiv an IgE, gebunden an das FcεR, bindet, wird dem Substrat zugesetzt und inkubiert, so dass eine Bildung eines Komplexes zwischen dem Indikator-Molekül und dem FcεR-Molekül : IgE-Komplex ermöglicht wird. Vorzugsweise wird das Indikatormolekül an einen nachweisbaren Marken (vorzugsweise eine Enzym-Markierung, eine colorimetrische Markierung oder eine fluoreszierende Markierung, ein Radioisotop oder ein Ligand, wie beispielsweise die Biotin- oder Avidin-Familie) konjugiert. Ein überschüssiges Indikator-Molekül wird entfernt, ein Entwicklungsmittel wird, falls erforderlich, zugesetzt und das Substrat wird einer Nachweisvorrichtung zur Analyse vorgelegt. Ein bevorzugtes Indikator-Molekül für diese Ausführungsform ist ein Antigen, das an IgE in der biologischen Probe oder einen Anti-IgE-Isotyp- oder Idiotyp-Antikörper bindet, der entweder vorzugsweise an Fluoreszein oder Biotin gebunden ist.
  • Bei einer Ausführungsform wird ein Anti-IgE-Antikörper (beispielsweise Isotyp- oder Idiotyp-spezifischer Antikörper) als Einfang-Molekül verwendet, indem er an einem Substrat immobilisiert wird, beispielsweise an einer Mikrotiterschalen-Well oder einem Messstab. Eine biologische Probe, die von einem Tier gesammelt wurde, wird auf das Substrat aufgebracht und unter Bedingungen inkubiert, die eine Anti-IgE-Antikörper : IgE-Komplexbildung ermöglichen, gebunden an das Substrat. Überschüssiges nicht-gebundenes Material, falls vorhanden, wird aus dem Substrat unter Bedingungen entfernt, die die Ariti-IgE-Antikörper : IgE-Komplexbildung an das Substrat aufrechterhalten. Ein FcεR-Molekül wird dem Substrat zugesetzt und inkubiert, um die Bildung eines Komplexes zwischen dem FcεR-Molekül und dem Anti-IgE-Antikörper : IgE-Komplex zu ermöglichen. Vorzugsweise wird das FcεR-Molekül an einen nachweisbaren Marker (vorzugsweise an Biotin, eine Enzym-Markierung oder eine Fluoreszenz-Markierung) gebunden. Überschüssiges FcεR-Molekül wird entfernt, ein Entwicklungsmittel wird, falls erforderlich, zugesetzt und das Substrat wird einer Nachweisvorrichtung zur Analyse unterworfen.
  • Bei einer Ausführungsform verwendet ein Immunabsorbtions-Assay der vorliegenden Erfindung kein Einfang-Molekül. Bei dieser Ausführungsform wird eine biologische Probe, die von einem Tier gesammelt wurde, auf ein Substrat, wie beispielsweise eine Mikrotiterschalen-Well oder einen Messstab aufgebracht und unter Bedingungen inkubiert, die dazu geeignet sind, eine IgE-Bindung an das Substrat zu ermöglichen. Jedes IgE, das in der Körperflüssigkeit vorliegt, wird auf dem Substrat immobilisiert. Überschüssiges ungebundenes Material wird, falls vorhanden, vom Substrat unter Bedingungen entfernt, die die IgE-Bindung am Substrat aufrechterhalten. Ein FcεR-Molekül wird dem Substrat zugesetzt und inkubiert, um die Bildung eines Komplexes zwischen dem FcεR-Molekül und dem IgE zu ermöglichen. Vorzugsweise wird das FcεR-Molekül an einen nachweisbaren Marker konjugiert (vorzugsweise an Biotin, eine Enzym-Markierung oder eine Fluoreszerz-Markierung). Überschüssiges FcεR-Molekül wird entfernt, ein Entwicklungsmittel wird, falls erforderlich, zugesetzt und das Substrat einer Nachweisvorrichtung zur Analyse unterworfen.
  • Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von IgE ist ein lateraler Strömungs-Assay, von dem Beispiele im US-Patent Nr. 5 424 193, erteilt am 13. Juni 1995, von Pronovost et al.; im US-Patent Nr. 5 415 994, erteilt am 16. Mai 1995 von Inrich et al., WO94/29696, veröffentlicht am 22. Dezember 1994 von Miller et al.; und WO94/01775, veröffentlicht am 20. Januar 1994 von Pawlak et al., offenbart wurden, wobei jede dieser Patentveröffentlichungen durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hierin mit aufgenommen ist. Bei einer Ausführungsform wird eine biologische Probe in einem lateralen Strömungs-Apparat angeordnet, der die nachfolgenden Bestandteile einschließt: (a) eine Trägerstruktur, die einen Strömungs-Pfad bzw. -Weg definiert; (b) ein Markierungs-Reagenz, das eine an ein Antigen konjugierte Perle umfasst, wobei das Markierungs-Reagenz mit der Trägerstruktur in einer Markierungszone imprägniert ist; und (c) ein Einfang-Reagenz, das eine IgE-bindenje Zusammensetzung umfasst. Bevorzugte Antigene schließen solche ein, die hierin offenbart sind. Das Einfang-Reagenz ist stromabwärts des Markierungs-Reagenzes in einer Einfangzone angeordnet, die mit der Markierungszone in einer solchen Weise in einer Flüssigkeits-Verbindung steht, dass das Markierungs-Reagenz von der Markierungszone zur Einfangzone strömen kann. Die Trägerstrukur umfasst ein Material, das die Strömung der Perlen von der Markierungszone zur Einfangzone nicht behindert. Geeignete Materialien zur Verwendung als Trägerstruktur schließen ionische (d. h. anionische oder kationische) Materialien ein. Beispiele für ein solches Material schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nitrozellulose (NC), PVDF, Carboxymethylcellulose (CM). Die Trägerstruktur definiert einen Strömungspfad, der lateral ist und der in Zonen unterteilt ist, nämlich eine Markierungszone und eine Einfangzone. Die Vorrichtung kann weiterhin eine Probenaufnahmezone umfassen, die entlang des Strömungspfades angeordnet ist, besonders bevorzugt stromaufwärts des Markierungsreagenzes. Der Strömungsweg in der Trägerstruktur wird durch In-Berührung-Bringen eines Anteils der Trägerstruktur stromabwärts der Einfangzone, vorzugsweise am Ende des Strömungspfades, mit einem absorbierenden Mittel erzeugt, das dazu in der Lage ist, überschüssige Flüssigkeit aus den Markierungs- und Einfangzonen zu absorbieren.
  • Bei dieser Ausführungsform wird die biologische Probe auf die Probeaufnahmezone aufgebracht, die einen Anteil der Trägerstruktur einschließt. Die Markierungszone nimmt die Probe aus der Probeaufnahmezone auf, die durch den Strömungspfad stromabwärts gerichtet ist. Die Markierungszone umfasst das Markierungsreagenz, das an IgE bindet. Bin bevorzugtes Markierungsreagenz ist ein Antigen, das entweder direkt oder durch einen Linker an ein Kunststoffperlen-Substrat gebunden ist, wie beispielsweise an eine Latexperle. Das Substrat schließt ebenfalls einen nachweisbaren Marker, vorzugsweise einen colorimetrischen Marker, ein. Typischerweise wird das Markierungsreagenz an der Trägerstruktur durch Trocknen oder Lyophilisation imprägniert. Die Probenstruktur umfasst ebenfalls eine Einfangzone stromabwärts der Markierungszone. Die Einfangzone nimmt das Markierungsreagenz aus der Markierungszone auf, das stromabwärts durch den Strömungspfad gerichtet ist. Die Einfangzone enthält das Einfang-Reagenz, in diesem Fall ein FcεR-Molekül, wie oben offenbart, das den IgE – komplexiert an das Antigen in der Einfangzone immobilisiert. Das Einfang-Reagenz ist vorzugsweise an der Trägerstruktur durch Trocknen oder Lyophilisieren fixiert. Das Markierungs-Reagenz akkumuliert in c er Einfangzone und die Akkumulation wird visuell oder eine optische Nachweisvorrichtung überprüft.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform schließt eine laterale Strömungsvorrichtung, die zum Nachweis von IgE verwendet wird, Folgendes ein: (a) eine Trägerstruktur, die einen Strömungspfad definiert; (b) ein Markierungs-Reagenz, das ein FcεR-Molekül wie oben beschrieben umfasst, wobei das Markierungs-Reagenz mit der Trägerstruktur in einer Markierungszone imprägniert ist; und (c) ein Einfang-Reagenz, das ein Antigen umfasst, wobei das Einfang-Reagenz stromabwärts des Markierungs-Reagenz innerhalb einer Einfangzone angeordnet ist, in Flüssigkeits-Verbindung mit der Markierungszone in einer solchen Weise, dass das Markierungs-Reagenz von der Markierungszone zur Einfangzane strömen kann. Die Vorrichtung schließt ebenfalls vorzugsweise eine Probeaufnahmezone ein, die entlang des Strömungspfades angeordnet ist, vorzugsweise stromaufwärts des Markierungsreagenzes. Die Vorrichtung schließt ebenfalls vorzugsweise ein Absoptionsmittel ein, das sich am Ende des Strömungspfades befindet.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Hemm-Assay, bei dem das Vorliegen von IgE in einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung durch Zusetzen einer solchen Zusammensetzung zu einem FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung und eines isolierten IgE, von dem bekannt ist, dass es an das FcεR-Molekül bindet, bestimmt wird. Das Fehlen der Bindung des FcεR-Moleküls an das bekannte IgE zeigt das Vorliegen von IgE in der vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung an.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Kits zum Nachweisen von IgE, basierend auf jedem der offenbarten Nachweisverfahren ein. Eine Ausführungsform ist ein Kit zum Nachweis von IgE, umfassend einen humanen Fcε-Rezeptor(FcεR)-Molekül und ein Mittel zum Nachweis eines IgE, einschließlich Hunde-IgE, Katzen-IgE und/oder Pferde-IgE. Geeignete und bevorzugte FcεR-Moleküle sind hierin offenbart. Geeignete Mittel zum Nachweis schließen Verbindungen ein, die hierin offenbart sind, die entweder an das FcεR-Molekül oder an IgE binden. Ein bevorzugter Kit der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin ein Nachweismittel, das ein oder mehrere hierin offenbarte Antigene einschließt, einen Antikörper, der selektiv an IgE bindet, hierin offenbart, und/oder an eine Verbindung, die zum Binden eines nachweisbaren Markers geeignet sind, der an ein FcεR-Molekül gebunden ist (beispielsweise Avidin, Streptavidin und ImmunoPure® NeutrAvidin, wenn der detektierbare Macker Biotin ist). Solche Antigene induzieren vorzugsweise die IgE-Antikörperproduktion in Tieren, einschließlich Hunden, Katzen und/oder Pferden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform eines Kits der vorliegenden Erfindung ist ein Flohallergen-Kit, umfassend ein Flohallergen, wie beispielsweise die hierin offenbarten. Ein besonders bevorzugtes Flohallergen zur Verwendung mit einem Flohallergen-Kit schließt ein Floh-Speichelprodukt oder ein Floh-Speichelprotein ein.
  • Ein weiterer bevorzugter Kit der vorliegenden Erfindung ist ein allgemeiner Allergen-Kit, umfassend ein Allergen, das in allen Regionen der Vereinigten Staaten vorkommt und ein humanes FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung. Wie hierin verwendet, betrifft ein „allgemeiner Allergen-Kit" einen Kit, der Allergene umfasst, die im Wesentlichen in den gesamten Vereinigten Staaten zu finden sind (d. h. im Wesentlichen nicht auf bestimmte Regionen der Vereinigten Staaten beschränkt sind). Ein allgemeiner Allergen-Kit stellt gegenüber regionalen Allergen-Kits einen Vorteil bereit, weil ein einzelner Kit zum Testen eines Tieres verwendet werden kann, das sich in den meisten geographischen Orten der Vereinigten Staaten befindet. Geeignete und bevorzugte allgemeine Allergene zur Verwendung bei einem allgemeinen Allergen-Kit der vorliegenden Erfindung schließen solche allgemeinen Allergene ein, die hierin offenbart sind.
  • Ein weiterer bevorzugter Kit der vorliegenden Erfindung ist ein Nahrungsmittelallergen-Kit, umfassend ein Nahrungsmittelallergen, einschließlich Rind, Huhn, Schweinefleisch, Fischmischung, wie beispielsweise Heilbutt, Kabeljau oder/und Thunfisch, Eier, Milch, Bierhefe, Vollkorn, Mais, Soja, Käse und Reis und ein humanes FcεR-Molekül der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise werden das Rind, Huhn, Schweinefleisch, Fisch, Mais und Reis gekocht.
  • Ein bevorzugter Kit der vorliegenden Erfindung schließt solche ein, bei denen das Allergen an einem Substrat immobilisiert ist. Wenn ein Kit zwei oder mehr Antigene umfasst, kann der Kit ein oder mehrere Zusammensetzungen umfassen, wobei jede Zusammensetzung ein Antigen umfasst. Als solches kann jedes Antigen getrennt getestet werden. Ein Kit kann ebenfalls zwei oder mehr diagnostische Reagenzien für IgE, zusätzlich isolierte IgE-Antigene und/oder Antikörper, wie hierin offenbart, umfassen. Zusätzlich bevorzugt sind Kits, die in einem lateralen Strömungs-Assayformat verwendet werden. Es liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, dass ein laterales Strömungs-Assay bzw. -Kit ein oder mehrere laterale Strömungs-Assayvorrichtungen einschließt. Multiple laterale Strömungs- Vorrichtungen können aneinander am Ende jeder Vorrichtung befestigt werden, wodurch eine fächerartige Struktur erzeugt wird.
  • Insbesondere sind ein Verfahren und ein Kit der vorliegenden Erfindung zum Diagnostizieren abnormaler Bedingungen bei Tieren von Nutzen, die mit wechselnden Konzentrationen an IgE in Verbindung gebracht werden. Besonders bevorzugte Bedingungen zur Diagnose schließen Allergien, parasitäre Infektionen und Neoplasien ein. Beispielsweise sind ein Verfahren und ein Kit der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen einer Flohallergie-Dermatitis (GAD) besonders von Nutzen, wenn ein solches Verfahren oder ein Kit die Verwendung eines Floh-Speichelantigens einschließt. FAD ist als eine hyperempfindliche Reaktion auf Flohbisse definiert. Vorzugsweise wird eine vermeintliche IgE-enthaltende Zusammensetzung aus einem Tier gewonnen, das unter dem Verdacht steht, eine FAD aufzuweisen. Bevorzugte Tiere schließen solche ein, die hierin offenbart sind, wobei Hunde und Katzen bevorzugt werden. Zusätzlich sind Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen einer Wurminfektion, insbesondere Herzwurm-Infektion, besonders von Nutzen, wenn solche Verfahren oder Kits die Verwendung eines helminthischen Antigens, beispielsweise Di33, einschließen. Vorzugsweise wird eine vermeintliche IgE-enthaltende Zusammensetzung von einem Tier gewonnen, das unter dem Verdacht steht, eine Helminthen-Infektion aufzuweisen. Bevorzugte Tiere schließen solche ein, die hierin offenbart sind, wobei Hunde und Katzen bevorzugt werden.
  • Die nachfolgenden Beispiele werden für Veranschaulichungszwecke bereitgestellt und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten Baculovirus, der einen trunkierten Anteil der α-Kette eines menschlichen Fcε-Rezeptors exprimiert.
  • Das rekombinante Molekül pVL-nhFcεRα612-Molekül, das ein Nukleinsäure-Molekül enthält, das die extrazelluläre Domäne der FcεRα-Kette codiert, funktionell gebunden an Baculovirus Polyhedron-Transkriptionskontrollsequenzen, wurde in der nachfolgenden Weise produziert. Ein cDNA-Klon, der die Alpha-Kette (α-Kette) des humanen FcεR-Rezeptors codiert, wurde von Dr. Jean-Pierre Kinet (Harvard University, Cambridge, MA) bezogen. Der cDNA-Klon schloss ein ungefähr 1198-Nukleotid-Insert ein, das hierin als nhFcεRα1198 bezeichnet wird. Die Nukleinsäuresequenz des codierenden Stranges von nhFcεRα1198 wird hierin als SEQ [D Nr. 1 bezeichnet. Die Translation von SEQ ID Nr. 1 zeigt, dass Nukleinsäuremolekül FcεRα1198 einen humanen nhFcεRα-Kettenprotein voller Länge von ungefähr 257 Aminosäuren codiert, hierin als PhFcεRα257 bezeichnet, mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, unter der Annahme eines Open-Reading-Frames (offenen Leserasters), bei dem das Start-Codon sich von Nukleotid 107 bis Nukleotid 109 von SEQ ID Nr. 1 erstreckt und das Stopp-Codon sich von Nukleotid 878 bis Nukleotid 880 von SEQ ID Nr. 1 erstreckt. Das Komplement von SEQ ID Nr. 1 wird hierin durch SEQ ID Nr. 3 repräsentiert. Das vorgeschlagene reife Protein (d. h. die FcεRα-Kette, von der die Signalsequenz abgespaken wurde), hierin als PhFcεRα232 bezeichnet, enthält ungefähr 232 Aminosäuren, die hierin als SEQ ID Nr. 6 repräsentiert sind. Das Nukleinsäuremolekül, das PhFcεRα232 codiert, wird hierin als nhFcεRα699 bezeichnet, wobei der codierende Strang hiervon von SEQ ID Nr. 7 repräsentiert wird.
  • Um eine sezernierte Form der extrazellulären Domäne der FcεRα-Kette zu erzeugen wurde die hydrophobe Transmembran-Domäne und der zytoplasmatische Schwanz der FcεRα-Kerte, codiert von nhFcεRα1198, wie folgt entfernt. Ein Fragment von ungefähr 612 Nukleotiden, das das Nukleinsäuremolekül der extrazellulären Domäne der FcεRα-Kette enthielt, wurde durch PCR aus nhFcεRα1198 unter Verwendung eines Vorwärts-Primers EJH 040, der eine Baml-II-Stelle enthielt und der die Nukleinsäuresequenz 5' CGC GGA TCC TAT AAA TAT GGC TCC TGC CAT GG 3' (als SEQ ID Nr. 8 bezeichnet) aufwies und eines reversen bzw. Rückwärts-Primers IgE-ANTI-SENSE, der eine EcoRI-Stelle enthielt, mit der Nukleinsäuresequenz 5' GGC GAA TTC TTA AGC TTT TAT TAC AG 3' (hierin als SEQ ID Nr. 9 erwähnt), amplifiziert. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI digeriert bzw. verdaut, um nhFcεRα612 zu erzeugen. Das Nukleinsäuremolekül nhFcεRα612 enthielt ein ungefähr 591-Nukleotid-Fragment, das die extrazelluläre Domäne der humanen FcεRα-Kette codierte, die sich von Nukleotid 107 bis Nukleotid 697 von SEQ [D Nr. 1 erstreckte, hierin als Nukleinsäuremolekül nhFcεRα591 bezeichnet, deren codierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die als SEQ ID Nr. 10 bezeichnet wird. Die Translation von SEQ ID Nr. 10 zeigt, dass das Nukleinsäuremolekül nhFcεRα612 ein FcεR-Protein von ungefähr 197 Aminosäuren codiert, hierin als PhFcεRα197 bezeichnet, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11. Das Nukleinsäuremolekül nhFcεRα612 codiert eine sezernierbare Form der humanen FcεRα-Kette, die keine Leader-Sequenz besitzt, und die hierin als PhFcεRα172 bezeichnet wird, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 13. Der codierende Bereich für PhFcεRα172 wird als nhFcεRα516 bezeichnet, wobei der codierende Strang hiervon die Nukleinsäuresequenz aufweist, die als SEQ ID Nr. 12 bezeichnet wird. Das Komplement von SEQ ID Nr. 12 wird hierin durch SEQ ID Nr. 14 repräsentiert.
  • Um ein rekombinantes Baculovirus-Molekül zu erzeugen, das dazu in der Lage ist, die Produktion von PhFcεRα197 zu leiten bzw. zu steuern, wurde das Nukleinsäuremolekül nhFcεRα612, wurde in einzigartiger BamHI- und EcoRI-Stellen des pVL 1392 Baculovirus Shuttle-Plasmids subkloniert (erhältlich von Pharmingen, San Diego, CA), um ein rekombinantes Molekül zu erzeugen, das hierin als pVL-nhFcεRα612 bezeichnet wird. Das sich ergebende rekombinante Protein pVL-nhFFcεRα612 wurde bezüglich einer richtigen Insertausrichtung durch Restriktions-Kartierung verifiziert.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel beschreibt die Produktion des Proteins PhFcεRα172
  • Das rekombinante Molekül pVL-nhFcεRα612 wurde mit einer linearen Baculogold-Baculovirus DNA (erhältlich von Pharmingen) in Trichoplusia ni-Zellen (erhältlich von Invitrogen Corp., San Diego, CA; High FiveTM -Zellen) unter Verwendung des folgenden Verfahrens ko-transfiziert. Ungefähr 1,5 Liter Kulturen von Serum-freiem Ex-Zellmedium (erhältlich von Invitrogen) wurden mit ungefähr 1 × 106 Zellen pro ml Medium besät. Die Trichoplusia ni-Zellen wurden mit dem rekombinanten Molekül pVL-nhFcεRα612 bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von ungefähr 2 bis 5 Teilchenbildenden Einheiten (partielle forming units = pfu) pro Zelle infiziert, um die rekombinante Zelle Trichoplusia ni-pVLnhFcεRα612 zu erzeugen. Man ließ die Infektion bei einer kontrollierten Temperatur von 27°C für 48 Stunden fortschreiten um das rekombinante Protein PhFcεRα172 zu erzeugen. [m Anschluss an die Infektion wurden die Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation abgetrennt und das Medium bei –70°C eingefroren.
  • PhFcεRα172 wurde aus dem Kulturmedium, das unmittelbar oberhalb beschrieben wurde, durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines IgE-Antikörpers aufgereinigt, der durch die Myelom-Zelllinie U 266 DI (American Tissue Type Catalogue Nr. TIB 196) erzeugt wurde, gebunden an Sepharose 4B. Die Aminosäure-Zusammensetzung und Nterminale Aminosäuresequenz des Affinitäts-gereinigten PhFcεRα172 wurde unter Verwendung von Verfahren bestimmt, die in der Technik Standard sind. Die Ergebnisse zeigten, dass PhFcεRα172 durch die Trichoplusia Ni-Zellen in geeigneter Weise prozessiert bzw. verarbeitet wurde.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel beschreibt die Biotinylierung von rekombinantem humanen PhFcεRα-Kettenprotein.
  • Affinitäts-gereinigtes rekombinantes Protein PhFcεRα172, hergestellt wie oben in Beispiel 2 beschrieben, wurde wie folgt biotinyliert. Ungefähr 440 Mikrogramm (μg) PhFcεRα172 wurden in ungefähr 1,5 Milliliter (ml) Acetatpuffer (0,1 M NaAc, pH 5,5), der ungefähr 200 Mikroliter (μl) 0,1 m NaIO4 enthielt, verdünnt. Das Gemisch wurde für ungefähr 20 Minuten auf Eis inkubiert und ungefähr 2 μl Glycerol wurden im Anschluss an die Inkubation zugesetzt. Das Gemisch wurde darauf gegen ungefähr 2 1 Acetatpuffer in einer 3 ml Slight-A-Slicer-Kassette (erhältlich von Peers, Rockford, IL) zweimal für ungefähr 2 Stunden zu jedem Zeitpunkt dialysiert. Ungefähr 3,72 μg Biotin-LC-Hydrazid (erhältlich von Peers) wurden in ungefähr 200 μg Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in die Kassette injiziert. Die Kassette wurde dann bei Raumtemperatur für ungefähr 2 Stunden gerüttelt. Im Anschluss an die Inkubation dialysierte das Gemisch, das rekombinantes Protein und Biotin enthielt, dreimal, ein erstes Mal für ungefähr 18 Stunden und zweimal für ungefähr 2 Stunden, jedes Mal bei 5 °C gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung. Das biotinylierte Protein wurde von der Dialyse wiedergewonnen und wird hierin als PhFcεRα172-BIOT bezeichnet.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Hunde-IgE in einem Festphasen-ELISA unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Wells von 2 Immulon-II-Mikrotiterplatten (erhältlich von Dynatech, Alexandria, VA) wurden mit zweifachen Proben von ungefähr 100 μl/Well verschiedener Konzentrationen an gereinigtem Hunde-IgE wie in 1 erwähnt beschichtet. Das Hunde-IgE wurde von einer Hunde-IgE-erzeugenden Hybridoma gewonnen, wie beispielsweise die Hetero-Hybridoma 2.39 (beschrieben in Gephard et al., Immunology 85: 429–434, 1995) und wurde in einem CBC-Puffer verdünnt (15 mM Na2Co3 und 34,8 mM NaHCO3, pH 9,6). Die beschichteren Platten wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde die Hunde-IgE-enthaltende Lösung von jeder Platte entfernt und die Platten wurden trockengeplottet. Die Platten wurden darauf unter Verwendung ungefähr von 200 μl/Well von 0,25% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, das in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBSB) für ungefähr 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten wurde. Die Platten wurden darauf viermal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBST) unter Verwendung eines automatischen Waschgerätes (erhältlich von Dynatech) gewaschen. Experimentelle Proben, die aus ungefähr 100 μl/Well 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT bestanden (ungefähr 145 μg/ml; beschrieben in Beispiel 3), enthalten in PBSB mit 0,05% Tween 20 (PBSBT) wurden jedem Well einer Platte zugesetzt, die mit Hunde-IgE beschichtet war. Kontrollproben, die aus ungefähr 100 μl biotinyliertem Anti-Hund-IgE monoklonalem Antikörper D9 bestanden (zur Verfügung gestellt von Dr. DeBurgh, U. aus Wisconsin, Medicine, WE) wurden jedem Well der anderen Platte zugesetzt, die mit Hunde-IgE beschichtet war. Die Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefäthr 100 μl von ungefähr 0,25 μg/ml Streptavidin, konjugiert an Meerrettichperoxidase (erhältlich von Kierkegard und Perry Laboratories (CPL), Gatersburg, MD, verdünnt in PBST) wurden jedem Well zugesetzt, das experimentelle oder Kontroll-Proben empfing. Die Platten wurden darauf für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und viermal mit PBST gewaschen.
  • Ungefähr 100 μl TMB-Substrat (erhältlich von KPL), das auf Raumtemperatur vorgewärmt wurde, wurde zugesetzt. Die Platten wurden darauf 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und darauf wurden ungefähr 100 μl/Well Stopp-Solution (erhältlich von KPL) zugesetzt. Die optischen Dichten der Wells wurden auf einem Spectramax Miktotiterplarte-(erhältlich von Molecular Devices Inc.) Lesegerät bei 450 nm innerhalb von 10 Minuten nach Zusatz der Stopp-Lösung abgelesen.
  • Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Alpha-Kette von humanem FcεR das Vorhandensein von Hunde-IgE (geschlossene Kreise) in einem Festphasenassay in einer ähnlichen Weise wie der Kontrollantikörper nachweist, der spezifisch an Hunde-IgE bindet (D9; offene bzw. nicht ausgefüllte Kreise).
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Pflanzenallergen-spezifischem Hunde-IgE unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vierfache Wells einer Immunolon-II-Mikrotiterplatte (erhältlich von Dynatech) wurden entweder mit ungefähr 100 μl/Well 1 μg/ml Kentucky-Bluegrass-Allergen oder ungefähr 100 μl/Well ungefähr 1 μg/ml Green-Ash-Allergen (beide erhältlich von Greer Inc., Lenoir, NC), beide verdünnt in CBC-Puffer, beschichtet. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Zwei unterschiedliche Pools von Hunde-Seren wurden den Antigen-beschichteten Wells zugesetzt. Der erste Pool bestand aus Seren, die aus 8 Hunden isoliert wurden, von denen berichtet wurde, dass sie Allergen-reaktiv sind. Der zweite Pool bestand aus Seren, die aus 8 Hunden isoliert waren, von denen berichtet wurde, dass sie nicht allergen-reaktiv waren. Jeder Pool von Seren wurde 1 : 10 oder 1 : 100 in PBST verdünnt. Ungefähr 100 μl jeder Konzentration jeder verdünnten Serumprobe wurde den Wells zugesetzt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3), das PBST enthielt, wurde den Antigen-beschichteten Wells zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 μg/ml von ungefähr 0,25 μg/ml Neutravidin, konjugiert an Meerrettichperoxidase (erhältlich von Peers), enthalten in PBSBT, wurde zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf gewaschen und das Vorhandensein von Neutravidin, gebunden an die Platte, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Alpha-Kette von humanem FcεR Glas Vorhandensein von Hunde-IgE-Antikörpern nachweist, die spezifisch an ein übliches Gras-Allergen oder ein übliches Baum-Allergen binden. Zusätzlich ist der Nachweis der Hunde-IgE-Antikörper dosisabhängig.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Gesamt-Hunde-IgE unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vielfache Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte (erhältlich von Dynatech) wurden mit ungefähr 100 μl/Well von ungefähr 1 μg/ml CMI-Anti-Hunde-IgE-Antikörper Nr. 6 (erhältlich von Custom Monoclonals International, West Sacramento, CA), verdünnt in CBC-Puffer, beschichtet. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 60-Verdünnung in PBSBT von Serumproben aus einer Vielzahl von Quellen wurden darauf vielfachen Wells, die mit Anti-IgE-Antikörper beschichtet waren, zugesetzt. Die Proben schlossen Folgendes ein: (1) Serum von einem Hund, von dem bekannt war, dass er auf Floh-Speichel allergisch war; (2) Serum von Hunden, die mit D. immitis infiziert waren; (3) und (4) ein Pool von Hunde-Seren von als Hunde-Allergiekalibratoren definierten Hunden (erhältlich von Bioproducts DVM, Tempe, AZ); (5) Pools von Hunde-Seren, die Antikörper enthielten, die eine niedrige Bindung an Kentucky-Bluegrass-Allergen aufwiesen; (6) Pokals von Hunde-Seren, die eine starke Bindung an Kentucky-Bluegrass-Allergen aufwiesen; (7) ein Pool von Hunde-Seren von Hunden, von denen bekannt war, dass sie auf Floh-Speichel allergisch waren, wobei die Probe Hitze-inaktiviert wurde (bei 56°C für 4 Stunden); (8) ein Pool von Hunde-Seren von Hunden, von denen bekannt war, dass sie auf Floh-Speichel allergisch waren; oder (9) ein Pool von Hunde-Seren von Hunden, die in einer Barriere-Einrichtung aufgezogen wurden (d. h. negative Kontrolle). Eine Reihe positiver Kontrollbeispiele, bestehend aus IgE, das aus der in Beispiel 4 beschrieber en Heterohybridoma gewonnen wurde, wurde ebenfalls der Platte zugesetzt, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Das Vorliegen von Hunde-IgE wurde unter Verwendung entweder von ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Lösung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3) oder ungefähr 100 μl/Well ungefähr 1 μg/ml CMI Anti-Hunde-IgE-Antikörper Nr. 19 (erhältlich von Custom Monoclonals Internationa 1), beiden enthalten in PBSBT, nachgewiesen. Die Platte wurde 1 Stunde. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann gewaschen, mit ungefähr 0,25 μg/ml Streptavidin, konjugiert an Meerrettichperoxidase, in Berührung gebracht, erneut gewaschen und das Vorhandensein von Streptavidin, gebunden an die Platte, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen. Die optischen Dichte-Ablesungen, die für die Kontrollproben erzielt wurden, wurden zur Erzeugung einer Standardkurve verwendet, die zur Bestimmung des an die Wells gebundenen Gesamt-IgEs verwendet wurden, die Testproben empfingen.
  • Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hunde-IgE von einer Vielzahl von Hunde-Seren unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR in einer Weise nachgewiesen werden, die derjenigen unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an Hunde-IgE bindet, ähnlich ist. Das Fehlen nachweisbarer Mengen von IgE in der hitzebehandelten Probe (Beispiel 7) zeigt, dass der durch PhFcεRα172-BIOT nachgewiesene Antikörper IgE ist. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse, dass PhFcεRα172-BIOT ein effektives Reagenz zum Nachweis von IgE ist, dass an Allergen Kentucky Bluegrass, bei Proben 5 und 6 bindet) ebenso wie ein Parasiten-Antigen (D. immitis, Probe 2).
  • Beisel 7
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Hunde-IgE in Hunde-Seren, die aus Hunden isoliert wurden, von denen bekannt ist, dass sie gegen Flohspeichel allergisch sind, unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vielfache Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte wurden mit ungefähr 100 μl/Well variierenden Konzentrationen an Flohspeichel-rekombinantem Protein fspN beschichtet (beschrieben in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO96/11271, ebd.; Konzentrationen dargestellt in 4), verdünnt in CBC-Puffer. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde darauf blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen.
  • Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 10-Verdünnung in PBSBT eines Pools von Seren, die aus Hunden isoliert wurden, von denen bekannt war, dass sie IgE produzieren, das spezifisch an Flohspeichel bindet. Einige Wells empfingen keine Hunde-Seren, so dass die Hintergrundbindungs-Konzentrationen bestimmt werden konnten. Diese Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefüähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3), enthalten in PBSBT, wurde zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf gewaschen, mit ungefähr 0,25 μg/ml Streptavidin-konjugierter Meerrettichperoxidase in Berührung gebracht, erneut gewaschen und das Vorhandensein von Streptavidin, das an die Platte gebunden war, wurde unser Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hunde-IgE, das spezifisch an Flcoh-Speichelantigen bindet, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wird.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Gesamt-Hunde-IgE in Hunde-Seren, die von Hunden isoliert wurden, von denen bekannt war, dass sie gegen Flohspeichel allergisch waren, von Herzwurm-infizierten Hunden und spezifischen pathogenfreien (SPF)-Hunden unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vielfache Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte wurden mit ungefähr 100 μl/Well ungefähr 1 μg/ml CMI Anti-Hunde-IgE-Antikörper Nr. 6 (erhältlich von Custom Monoclonals International) in CBC-Puffer beschichtet. Die Platte wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platte wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Ungef ihr 100 μl/Well unterschiedlicher Proben IgE-enthaltender Flüssigkeit in PBSBT wurden vielfachen Wells zugesetzt, die mit dem Anti-Hunde-IgE-Antikörper beschichtet waren. Die Proben schlossen Folgendes ein: (1) 100 μg/ml Hunde-IgE, aufgereinigt aus der Heterohybridoma, beschrieben in Beispiel 4; (2) eine 1 : 10-Verdünnung eines Pools von Seren aus Hunden, von denen bekannt war, dass sie gegen Flohspeichel allergisch waren; (3) eine 1 : 10-Verdünnung desselben Seren-Pools wie in (2), jedoch hitzeinakiviert; (4) eine 1 : 10-Verdünnung von Seren von einem Hund, von dem bekannt war, dass er eine klinische Flohallergie-Dermatitis aufwies (Hund CPO2); (5) eine 1 : 10-Verdünnung von hitzeaktivierten CPO2-Serum; (6) eine 1 : 10-Verdünnung von Serum aus einem Herzwurm-infizierten Hund (Hund 417); (7) eine 1 : 10-Verdünnung von hitzeinaktiviertem 417-Serum; (8) eine 1 : 10-Verdünnung eines Serum-Pools aus Herzwurm-infizierten Hunden; (9) eine 1 : 10-Verdünnung desselben Serum-Pools wie in (8), jedoch hitzeinaktiviert; und (10) ein Pool von Seren aus Hunden, die in einer Barriereeinrichtung aufgezogen wurden. Jede Probe wurde in PBSBT verdünnt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3) in PBSBT wurden zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf gewaschen, mit ungefähr 0,25 μg/ml Streptavidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase in Berührung gebracht, erneut gewaschen und das Vorhandensein von Streptavidin, das an die Platte gebunden war, wurde unter Verwendung des Verfahrens nachgewiesen, das in Beispiel 4 beschrieben war.
  • Die Ergebnisse, die in 5 dargestellt sind, zeigen, dass Hunde-IgE von Hunden, die gegenüber Flohspeichel allergisch waren und von Hunden, die mit Herzwurm infiziert waren, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wurde. Zusätzlich zeigt die Abwesenheit eines colorimetrischen Signals in den Proben hitzeinaktivierter Seren, dass Antikörper gebunden an den Anti-IgE-Antikörper und nachgewiesen durch die FcεRα-Kette ein Epsilon-Isotyp-Antikörper und kein anderer Isotyp ist.
  • Beispiel 9
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von IgE, das spezifisch an Flohspeichel bindet, unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vielfache Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte wurden mit ungefähr 100 μl/Well von ungefähr 0,1 μg/ml Floh-Speichel beschichtet, gesammelt unter Verwendung des in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO96/11271, ebd., beschriebenen Verfahrens in CBC-Puffer, beschichtet. Die Platte wurde inkubiert, blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Die IgE-enthaltenden Proben, die in Beispiel 8 beschrieben waren, wurden auf die Flohspeichel-beschichtete Platte aufgebracht. Die Platte wurde unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens behandelt.
  • Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hunde-IgE, das spezifisch an Flohspeichel bindet, im Serum enthalten ist, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wird. Zusätzlich zeigt das Fehlen eines colorimetrischen Signals in Proben von hitzeinaktiviertem Serum, dass Antikörper, gebunden an Flohspeichel-Proteine und nachgewiesen durch die FcεRα-Kette ein Epsilon-Isotyp-Antikörper ist.
  • Beispiel 10
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Katzen-IgE unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Vielfache Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte wurden mit ungefähr 100 μl/Well ungefähr 10 μg/ml Di33-Protein beschichtet (beschrieben in US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/715 628 ebd.) oder mit 10 μg/ml Rohhomogenat des Herzwurms, beide in CBC-Puffer. Rohhomogenat des Herzwurms ist der geklärte Überstand von adulten Herzwürmern, die in PBS homogenisiert wurden. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Serumproben von zwei mit Herzwürmern infizierten Katzen wurden darauf Di33-beschichteten Wells und Herzwurm-Antigen-beschichteten Wells zugesetzt. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 10-Verdünnung in PBSBT von Seren aus Herzwurm-infizierter Katze Nr. AXH3 oder von Katze Nr. MGC2 wurden der Platte zugesetzt. Negative Kontrollproben, die aus Serum von Vorinfektioris-Blutentnahmen von Katze Nr. AXH3 und Katze Nr. MGC2 bestanden, wurden ebenfalls c er Platte in einer Verdünnung von 1 : 10 in PBSBT zugesetzt. Eine positive Kontrollprobe, die aus einem Pool von Seren aus Herzwurm-infizierten Hunden bestand, wurde ebenfalls c er Platte in einer Verdünnung von 1 : 10 in PBSBT zugesetzt.
  • Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3) in PBSBT wurden zugesetzt. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf gewaschen, mit einer 1 : 4000-Verdünnung einer 0,5 mg/ml Lösung von Streptavidin-konjugiert an Meerrettichperoxidase in Berührung gebracht, erneut gewaschen und das Vorhandensein von Streptavidin, gebunden an die Platte, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Katzen-IgE, das spezifisch an das Rohhomogenat des Herzwurms oder des Di33-Proteins bindet, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wird.
  • Beispiel 11
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von felinem IgE unter Verwendung von PhFcεRα172-BIOT.
  • Multiple Wells einer Immulon-II-Mikrotiterplatte wurden mit Di33 wie in Beispiel 10 beschrieben in CBC-Puffer beschichtet. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Serumproben von zwei Herzwurm-infizierten Katzen wurden Di33-beschichteten Wells zugesetzt. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 10-Verdünnung in PBSBT-Serum aus Herzwurm-infizierter Katze Nr. MGC2 und ein Pool Seren aus Herzwurm-infizierten Katzen ebenso wie hitzeaktivierte Proben jeder dieser Seren wurden der Platte zugesetzt. Eine positive Kontrollprobe, die aus einem Pool von Seren aus Herzwurm-infizierten Hunden bestand, wurde ebenfalls der Platte in einer Verdünnung von 1 : 10 in PBSBT zugesetzt. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und darauf viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα172-BIOT (beschrieben in Beispiel 3) in PBSBT wurden zugesetzt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde darauf gewaschen, mit Streptavidin-konjugiert an Meerrettichperoxidase in Berührung gebracht, erneut gewaschen und das Vorhandensein von Streptavidin, gebunden an die Platte, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 8 dargestellen Ergebnisse zeigen, dass felines IgE aus Herzwurm-infizierten Katzen, das spezifisch an das Herzwurm-Antigen Di33 bindet, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wird. Zusätzlich zeigt das Fehlen eines colorimetrischen Signals in Proben von hitzeinaktivierten Seren, dass Antikörper, gebunden an das Di33-Protein und nachgewiesen durch die FcεRα-Kette ein Epsilon-Isotyp-Antikörper ist.
  • Beispiel 12
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Pferde-IgE in einem Festphasen-ELISA unter Verwendung von PhFcεRα127-BIOT.
  • Pferde-Seren von einem Pferd, von dem bekannt ist, dass es gegenüber bestimmten Allergenen allergisch ist, und Pferde-Seren von einem Pferd, von dem bekannt war, dass es gegenüber denselben Allergenen nicht allergisch war, wurden auf das Vorhandensein von IgE unter Verwendung von PhFcεRα127-BIOT wie folgt untersucht. Eine Nordatlantik/Ohio- Tal Regionaltafelplatte eines CanitecTM Allergen-spezifischen IgE-Kits (erhältlich von BioProducts DVM) wurde blockiert und wie in Beispiel 4 beschrieben gewaschen. Zwei Proben von ungefähr 1 : 10-Verdünnungen der beiden Pferde-Seren wurden unter Verwendung von PBSBT hergestellt. Die beiden Proben wurden der blockierten Platte zugesetzt und die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde wie in Beispiel. 4 beschrieben gewaschen. Ungefähr 100 μl/Well einer 1 : 4000-Verdünnung von 40 μg/ml PhFcεRα127-BIOT (beschrieben in Beispiel 3), enthalten in PBSBT, wurden jeder Vell zugesetzt. Die Platte wurde darauf gewaschen, mit 1 : 4000-Verdünnung einer 0,5 mg/ml Lösung von Streptavidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase in Berührung gebracht, erneut gewaschen, und das Vorhandensein von Streptavidin, gebunden an die Platte, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Pferde-IgE von einem Pferd, von dem bekannt ist, dass es gegenüber bestimmten Allergenen allergisch ist, spezifisch an bestimmte Pflanzen- und Milben-Allergene bindet, unter Verwendung der Alpha-Kette von humanem FcεR nachgewiesen wird.
  • Beispiel 13
  • Dieses Beispiel beschreibt den Nachweis von Hunde-IgE in einem Festphasen-ELISA unter Verwendung von basophilen Zellen, die mit einer humanen FcεRα-Kette transfiziert wurden.
  • Basophile Leukämie-Zellen der Ratte (RBL), die mit einem Nukleinsäuremolekül transfiziert wurden, das eine humane FcεRa-Kette codiert (hierin als RBL-hFcεR-Zellen bezeichnet; beschrieben in Miller et al., Science 244: 334–337, 1989) wurden dazu verwendet, IgE wie folgt nachzuweisen. Ungefähr 4 × 104 RBL-hFcεR-Zellen, die in Earles Modified Eagles Medium enthalten waren und die 10% fötales Rinderserum (EMEM-FBS) enthielten, wurden jedem Well einer 96-Well-Flachboden-Gewebskultur-Platte zugesetzt. Die RBL-hFcεR-Zeken wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Platten viermal mit PBST gewaschen. Die Zellen wurden darauf für ungefähr 2 Minuten unter Verwendung von ungefähr 200 μl pro Well absolutem Alkohol bei Raumtemperatur fixiert. Die Platten wurden darauf achtmal mit PBST gewaschen, um Restalkohol zu entfernen.
  • Reihenverdünnungen in EMEM-FBS (Konzentrationen dargestellt in 10) wurden unter Verwendung eines Pools von Seren aus Hunden hergestellt, die mit Herzwurm infiziert waren. Reihenverdünnungen in EMEM-FBS (Konzentrationen dargestellt in 11) wurden unter Verwendung eines Pools von Seren aus Hunden hergestellt, die gegenüber Flohspeichel sensibilisiert waren. Zusätzliche Proben wurden hergestellt, bei denen beide Seren-Pools für ungefähr 4 Stunden bei 56°C hitzeinaktiviert wurden. Die hitzebehandelten Proben wurden wie oben beschrieben verdünnt.
  • Ungefähr 100 μl jeder Verdünnung jeder Serum-Probe wurde den getrennten Wells zugesetzt, die fixierte RBL-hFcεR-Zellen enthielten und die Platten wurden bei 37°C für ungefähr 1 Stunde inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Platten viermal mit PB 37 gewaschen. Ungefähr 5 μg eines murinen IgG monoklonalen Antikörper wurde Anti-Huncle-IgE-Antikörper (d. h. Custom Monoclonal Antibody Nr. 71; erhältlich von Custom Monoelonal International) in 100 μl EMEM-FBS jedem Well zugesetzt. Die Platten wurden für ungefähr 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Platten viermal mit PBST gewaschen. Ungefähr 100 Nanogramm Meerrettichperoxidasemarkierter Esel-Anti-Maus-IgG (erhältlich von Jackson Laboratories, Westgrove, PA) in 100 μl EMEM-FBS wurden jedem Well zugesetzt und die Platten wurden für ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Platten viermal mit PBST gewaschen. Das Vorliegen von Anti-Maus-IgG, gebunden an die Platten, wodurch die Fähigkeit von RBL-hFcεR-Zellen an canines IgE zu binden, angezeigt wurde, wurden unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
  • Die in 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Hunde-IgE von Herzwurm-infizierten Hunden (♦) unter Verwendung von RBL-hFcεR-Zellen nachgewiesen wird, die die Alpha-Kette von humanem FcεR exprimieren. Zusätzlich zeigt das Fehlen eines colorimetrischen Signals in Proben von hitzeinaktivierten Proben solcher Seren (∎) an, dass Antikörper, nachgewiesen durch die FcεRα-Kette auf den RBL-hFcεR-Zellen ein Epsilon-Isotzp-Antikörper ist. In ähnlicher Weise zeigen die in 11 dargestellten Ergebnisse, dass Hunde-IgE von Hunden, die mit Flohspeichel (♦) sensibilisiert wurden, unter Verwendung von RBLhFcεR-Zellen nachgewiesen wird, die die Alpha-Kette von humanem FcεR exprimieren. Zusätzlich zeigt das Fehlen eines colorimetrischen Signales in Proben von hitzeinaktivierten Proben solcher Seren (∎), dass der Antikörper, nachgewiesen durch die FcεRα-Kette auf den RBL-hFcεR-Zellen, ein Epsilon-Isotyp-Antikörper ist.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (10)

  1. Verfahren zum Nachweis von IgE, das Folgendes umfasst: (a) In Berührung Bringen eines isolierten humanen Fcε-Rezeptor (FcεR)-Moleküls mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines FcεR-Molekül : IgE -Komplexes geeignet sind, wobei das IgE aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hunde-IgE, Katzen-IgE und Pferde-IgE besteht; und (b) Bestimmen der Vorhandenseins von IgE durch Nachweis des FcεR-Molekül : IgE -Komplexes, wobei das Vorhandensein des FcεR-Molekül : IgE -Komplexes auf das Vorhandensein von IgE hinweist.
  2. Verfahren zum Nachweis von nicht-humanem IgE, das Folgendes umfasst: (a) In Berührung Bringen einer rekombinanten Zelle mit einer vermeintlichen nichthumanen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines rekombinanten Zellen : IgE -Komplexes geeignet sind, wobei die rekombinante Zelle eine rekombinante Zelle ist, die ein humanes FcεR-Molekül exprimiert; und (b) Bestimmen des Vorhandenseins von nicht-humanem IgE durch Nachweis des rekombinante Zelle : IgE -Komplexes, wobei das Vorhandensein des rekombinante Zelle : IgE-Komplexes auf das Vorhandensein von IgE hinweist.
  3. Kit zum Nachweis von IgE, der ein humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Molekül und ein Mittel zum Nachweis von IgE umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hunde-IgE, Katzen-IgE und Pferde-IgE besteht.
  4. Allgemeiner Allergen-Kit zum Nachweis von IgE in nicht-menschlichen Lebewesen, der ein nicht-humanes Allergen, das in allen Gebieten der Vereinigten Staaten üblich ist und ein humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Molekül umfasst, wobei das Allergen an das IgE bindet.
  5. Verfahren zum Nachweis einer Flohallergie-Dermatitis in nicht-menschlichen Lebewesen, das Folgendes umfasst: (a) Immobilisieren eines Flohallergens auf einem Substrat; (b) In Berührung Bringen des Flohallergens mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung unter Bedingungen, die zur Bildung eines Allergen : IgE – Komplexes geeignet sind, der an das Substrat gebunden ist, (c) Entfernen von nicht gebundenem Material von diesem Substrat unter Bedingungen, die eine Bindung des Allergen : IgE -Komplexes an das Substrat aufrechterhalten; und (d) Nachweisen des Vorhandenseins von IgE durch Nachweisen des Vorhandenseins des Allergen : IgE -Komplexes, indem der Allergen : IgE -Komplex mit einem humanen FcεR-Molekül in Berührung gebracht wird.
  6. Kit zum Nachweis einer Flohallergie-Dermititis in nicht-menschlichen Lebewesen, der ein humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Molekül und ein Flohallergen umfasst, wobei das Flohallergen an das IgE bindet.
  7. Isoliertes humanes Fcε-Rezeptor (FcεR)-Alphakettenprotein, wobei eine Kohlenhycdratgruppe des FcεR-Alphakettenproteins an Biotin gebunden ist.
  8. Erfindung nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, wobei da FcεR-Molekül zumindesl einen Anteil einer FcεR-Alphakette umfasst, die an IgE bindet.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 5, wobei die vermeintliche IgE-enthaltende Zusammensetzung eine Zusammensetzung umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Blut, Se rum, Plasma, Urin, Tränen, wässriger Körperflüssigkeit, Zentralnervensystemflüssigkeit (CNF), Speichel, Lymphe, Nasensekreten, Milch und Faezes besteht.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Binden des FcεR-Moleküls an ein Substrat vor der Durchführung des Schrittes (a), um ein mit FcεR-Molekül beschichtetes Substrat zu bilden; und aus dem Binden der vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung an ein Substrat vor Durchführung des Schrittes (a), um ein mit einer vermeintlichen IgE-enthaltenden Zusammensetzung beschichtetes Substrat zu bilden, besteht, wobei das Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem unbeschichteten Substrat, einem mit FcεR-Molekül beschichteten Substrat, einem Antigen-beschichteten Substrat und einem anti-IgE-Antikörper beschichteten Substrat besteht.
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