DE69720604T2 - Verfahren zur Herstellung von verzweigten Cyclodextrinen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von verzweigten Cyclodextrinen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten Cyclodextrinen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetylglucosaminyl-cyclodextrinen, wobei die N-Acetylglucosaminylgruppe an eine Hydroxylgruppe des Cyclodextrin-Ringes (Cyclodextrin wird hier nachstehend als CD bezeichnet) durch β- Bindung dazwischen gebunden ist; von Glucosaminyl-CDen, wobei die Glucosamiriylgruppe an eine Hydroxylgruppe des CD-Ringes durch β-Bindung dazwischen gebunden ist, und seiner Salze; von N-Acetylgalactosaminyl-CDen, wobei die N-Acetylgalactosaminylgruppe an eine Hydroxylgruppe des CD-Ringes durch β-Bindung dazwischen gebunden ist; von Galactosaminyl-CDen, wobei die Galactosaminylgruppe an eine Hydroxylgruppe des CD- Ringes durch β-Bindung dazwischen gebunden ist, und seiner Salze, durch eine enzymatische Reaktion.
  • CD ist ein cyclisches Dextrin, das Glucosegruppen umfasst, die über eine α-1,4-Bindung verbunden sind; und wobei α-, β-, und γ-CDe, die jeweils 6 beziehungsweise 7, beziehungsweise 8 Glucosegruppen umfassen, gut bekannt sind. Kürzlich sind verzweigte CDe mit verbesserter Löslichkeit hergestellt worden, bei denen ein Substituent, wie z. B. eine Glucosyl- oder eine Maltosylgruppe, an den CD-Ring über eine α-1,6-Bindung gebunden ist.
  • Da sich in diesen Cyclodextrinen intrainolekulare hydrophobe Hohlräume befinden, sind diese CDe und verzweigten CDe in der Lage, Einschlusskomplexe zu bilden, und haben daher die Eigenschaft, verschiedenartige ölige Substanzen in sich aufzunehmen. Da sie die vorstehend erwähnte Eigenschaft besitzen, werden solche CDe und verzweigte CDe auf dem Gebiet der Nahrungsmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und der medizinischen Industrie häufig verwendet.
  • Insbesondere wird besonders auf dem Gebiet der medizinischen Industrie beobachtet, dass schwer lösliche Arzneistoffe mit verzweigten CDs komplexiert werden, um damit ihre Löslichkeit zu erhöhen, um eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit der Arzneistoffe zu erreichen.
  • Um schädigende Nebenwirkungen von Arzneistoffen zu vermindern, sind verschiedenartige Untersuchungen über die Eigenschaften von Sacchariden, die spezifische Zellen erkennen, durchgeführt worden, um sie als Sensoren für Arzneimittelträger an die Zielzellen in Arzneistoftbeförderungssystemen zu nutzen. Insbesondere ist gut bekannt, dass Galactose eine starke Affinität für Lebergewebe und dass Mannose eine starke Affinität für Leberparenchymzellen, Leber-Nonparenchymzellen, und Makrophagen besitzt.
  • Durch die Nutzung einer enzymatischen Transglycolisierungs- und Kondensationsreaktion sind wir schon bei der Herstellung von Galactosyl-CDen und Mannosyl-CDen, die eine Galactosyl- oder Maimosylgruppe an die Glucosylgruppe des CD-Ringes gebunden haben, erfolgreich gewesen. Darüber hinaus sind wir auch bei der Herstellung von Galactosyl-verzweigten CDen und Mannosyl-verzweigten CDen, die eine Galactosyl- oder eine Mannosylgruppe an die Glucosylgruppe in der Seitenkette des verzweigten CD-Ringes gebunden haben, erfolgreich gewesen.
  • Andererseits sind N-Acetylglucosamin und sein deacetyliertes Derivat Glucosamin Saccharide, die Chitin ausmachen, das die notwendige Komponente in der Schale von Muscheln oder Hummern ist. Dies sind die zu Grunde liegenden Saccharidgruppen, welche die Glycoketten von verschiedenen Sacchariden ausmachen, die eine wichtige Rolle bei der Zellerkennung spielen.
  • Auf ähnliche Weise ist ein Analoges von N-Acetylglucosamin, das N-Acetylgalactosamin auch die zu Grunde liegende Saccharidgruppe, welche die Glycoketten von verschiedenartige Sacchariden ausmacht, die eine wichtige Rolle bei der Zellerkennung spielen.
  • Durch die Nutzung der Bildung von Einschlusskomplexen der CDe und der vorstehend erwähnten Eigenschaften von N-Acetylglucosamin und Glucosamin, haben wir, die Erfinder, mehrere Versuche unternommen, um N-Acetylglucosaminyl-CDe, die eine N-Acetylglucosaminylgruppe an den CD-Ring gebunden haben, herzustellen, um sie für Arzneistoffbeförderungssysteme anzuwenden und auch für das Löslichmachen von schwer löslichen Arzneistoffen anzuwenden.
  • Wir haben früher herausgefunden, dass Lysozym und andere N Acetylglucosaminidasen effizient für die Herstellung von N-Acetylglucosaminyl-verzweigten CDen, die eine N- Acetylglucosaminylgruppe an eine Hydroxylgruppe in der verzweigten Seitenkette des verzweigten CD-Ringes gebunden haben, durch eine transferierte β-Bindung aus N-Acetylchitooligosacchariden verwendet werden (siehe japanisches Patent Kokai Nr. 8-325304 (325304/1996)).
  • Jedoch ist das vorstehend erwähnte Verfahren insofern problematisch, als dass die N-Acetylchitooligosaccharide, die als die Saccharid-Donatoren verwendet werden, teuer sind.
  • Obwohl Lysozym und andere N-Acetylglucosaminidasen, die hier verwendet werden, auf den Akzeptor (verzweigte CDe) wirken können, um die N-Acetylglucosaminylgruppe an die verzweigte Seitenketteneinheit davon zu binden, konnten sie nicht bewirken, eine solche N- Acetylglucosaminylgruppe direkt an α-, β- und γ-CDe, die keine verzweigte Kette haben, zu binden.
  • JP-A-8-173 181 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten Hetero-CDen durch Umsetzung eines CDs und eines Heterooligosaccharides in Anwesenheit eines zweigabspaltenden Enzyms. EP-A-0565105 beschreibt eine Verfahren zur Herstellung von Galactosyl- CD.
  • In der gegebenen Situation haben wir, die Erfinder, weitere Studien durchgeführt und haben nun herausgefunden, dass N-Acetylhexosaminidasen beim effizienten Herstellen eines N- Acetylglucosaminyl-CDs oder eines N-Acetylgalactosaminyl-CDs aus einem Gemisch, das aus einem N Acetylglucosamin oder einem N-Acetylgalactosamin und einem CD besteht, wirksam ist. Basierend auf dieser Entdeckung haben wir die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten CDen mit einer beliebigen Gruppe aus einer N-Acetylglucosaminyl-, Glucosaminyl-, N- Acetylgalactosaminyl- und Galactosaminylgruppe, die an eine Hydroxylgruppe des CD- Ringes durch β-Bindung gebunden ist, und seinen Salzen; wobei das Verfahren die Umsetzung einer N-Acetylhexosaminidase mit einer Lösung, die ein CD und eine N- Acetylglucosamin oder ein N-Acetylgalactosamin enthält, und gegebenenfalls die Deacetylierung des so erhaltenen Produkts umfasst.
  • Fig. 1 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 1, das durch eine Säule vom Amidtyp durchgelaufen ist.
  • Fig. 2 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 1, das durch eine Umkehrphasensäule durchgelaufen ist.
  • Fig. 3 ist ein FAB-MS Spektrum des Reaktionsprodukts A von Beispiel 1.
  • Fig. 4 ist ein ¹³C-NMR Spektrum des Reaktionsprodukts A von Beispiel 1.
  • Fig. 5 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 2, das durch eine Säule vom Amidtyp durchgelaufen ist.
  • Fig. 6 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 3, das durch eine Säule vom Amidtyp durchgelaufen ist.
  • Fig. 7 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 4, das durch eine Säule vom Amidtyp durchgelaufen ist.
  • Fig. 8 ist ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches aus Beispiel 4, das durch eine Umkehrphasensäule durchgelaufen ist.
  • Fig. 9 ist ein ¹³C-NMR Spektrum des Reaktionsprodukts G aus Beispiel 4.
  • Nachstehend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Die verzweigten CDs, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, schließen zum Beispiel 6-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-α-CD, 6-O-β-D-N-Acetylglucosaminylβ-CD, 6-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-γ-CD, 6-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-α-CD, 6-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-β-CD, 6-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-γ-CD, 6-O- β-D-Glucosaminyl-α-CD, 6-O-β-D-Glucosaminyl-β-CD, 6-O-β-D-Glucosaminyl-γ- CD, 6-O-β-D-Galactosaminyl-α-CD, 6-O-β-D-Galactosaminyl-β-CD, 6-O-β-D-Galactosaminyl-γ-CD, 3-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-α-CD, 3-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-β-CD, 3-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-γ-CD, 3-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-α-CD, 3-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-β-CD, 3-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-γ-CD, 3-O-β-D-Glucosaminyl-α-CD, 3-O-β-D-Glucosaminyl-β-CD, 3-Q-β-D- Glucosaminyl-γ-CD, 3-O-β-D-Galactosaxninyl-α-CD, 3-O-β-D-Galactosaminyl-β-CD, 3-O-β-D-Galactosaminyl-γ-CD, 2-O-β-D-N-Acetylglucosarninyl-α-CD, 2-O-β-D-N- Acetylglucosaminyl-β-CD, 2-O-β-D-N-Acetylglucosaminyl-γ-CD, 2-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-α-CD, 2-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-β-CD, 2-O-β-D-N-Acetylgalactosaminyl-γ-CD, 2-O-β-D-Glucosaminyl-α-CD, 2-O-β-D-Glucosaminyl-β-CD, 2-O- β-D-Glucosaminyl-γ-CD, 2-O-β-D-Galactosaminyl-α-CD, 2-O-β-D-Galactosaminyl-β- CD und 2-O-β-D-Galactosaminyl-γ-CD ein.
  • Nachstehend werden von diesen Beispielen die Strukturformeln (Nr. 1 bis 12) von typischen Verbindungen gezeigt, wobei n 5 bis 7 bedeutet. Strukturformel 1: Strukturformel 2: Strukturformel 3: Strukturformel 4: Strukturformel 5: Strukturformel 6: Strukturformel 7: Strukturformel 8: Strukturformel 9: Strukturformel 10: Strukturformel 11: Strukturformel 12:
  • Die verzweigten CDe der vorliegenden Erfindung können durch Umsetzung einer N- Acetylhexosaminidase mit einer Lösung, die ein CD und ein N-Acetylglucosamin oder ein N-Acetylgalactosamin enthält, und danach gegebenenfalls durch Deacetylierung des so erhaltenen Produkts, hergestellt werden.
  • Die Deacetylierung kann mit jeder beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel einschließlich einer Verfahren, in der das Produkt mit einer alkalischen Lösung (siehe Sannan, T., Kurita, K., Iwakura Y.; Makromol. Chem., 177, 3589-3600, 1976) umgesetzt wird, und einer Verfahren, in der das Produkt mit einen Ionenaustauscherharz bearbeitet wird.
  • Ein beliebiges α-CD, β-CD oder γ-CD wird im Wesentlichen als die Ausgangsverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet. Ein Gemisch von diesen ist auch anwendbar.
  • Es ist wünschenswert, dass N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, von hoher Reinheit sind. Jedoch sind auch solche, die Oligosaccharide enthalten, anwendbar.
  • In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine N-Acetylhexosaminidase verwendet, die auf die Lösung, die ein N-Acetylglucosamin oder ein N-Acetylgalactosamin und ein CD enthält, wirkt, während sie die Kondensation zwischen den beiden enzymatisch katalysiert, oder das heißt, die Reaktion dazwischen, entgegengesetzt einer Hydrolyse, wobei die N-Acetylglucosaminyl- oder die N-Acetylgalactosaminylgruppe an das CD durch β- Bindung dazwischen gebunden wird, um das beabsichtigte N-Acetylglucosaminyl-CD oder das N-Acetylgalactosaminyl-CD zu geben.
  • Solch ein Enzym für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in der Natur weit verbreitet. Zum Beispiel ist eine aus Pflanzen gewonnene N-Acetylhexosaminidase, die aus der Jackbohne (canavalia ensiformis) extrahiert werden kann, bekannt.
  • Im Reaktionssystem der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, dass die Konzentration des CDs in der Lösung (wässrige Lösung oder Suspension), die ein CD und ein N- Acetylglucosamin oder ein N-Acetylgalactosamin enthält, von 1 bis 40% (Gew.-%) reicht, während die Konzentration von N-Acetylglucosamin oder N Acetylgalactosamin darin von 5 bis 50% (Gew.-%) reicht. Es ist passend, dass das Gewichtsverhältnis von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin zum CD zwischen 1/10 und 50/1 liegt, aber vorzugsweise zwischen 1/1 und 5/1.
  • Der pH-Wert des Reaktionssystems kann zwischen 3 und 10 liegen, vorzugsweise zwischen 4 und 7; und die Reaktionstemperatur kann zwischen 20ºC und 70ºC liegen, vorzugsweise zwischen 40ºC und 60ºC.
  • Dadurch, dass eine enge Beziehung mit der Reaktionszeit besteht, kann die Menge des zu verwendenden Enzyms so sein, dass die Reaktion innerhalb einer Zeitdauer von 5 bis 200 Stunden beendet wird, vorzugsweise innerhalb von 10 bis 50 Stunden, was jedoch nicht begrenzend ist.
  • Die Deacetylierung kann gemäß jeder beliebigen gewöhnlichen Verfahren durchgeführt werden, so wie hier vorstehend erwähnt. Zum Beispiel kann das N Acetylglucosaminyl-CD oder das N-Acetylgalactosaminyl-CD mit einer alkalischen Lösung behandelt werden. Bezüglich der Bedingungen dieser Behandlungen wird auf die in gewöhnlichen Verfahren genannten, bezug genommen. Zum Beispiel kann im Reaktionssystem für die Deacetylierung die Konzentration des N-Acetylglucosaminyl-CDs oder des N-Acetylgalactosaminyl-CDs von 0,1 bis 50% (Gew./Vol.) reichen, vorzugsweise von 0,5 bis 10% (Gew./Vol.).
  • Eine bevorzugte alkalische Lösung, die für die Deacetylierung anwendbar ist, ist eine Lösung aus Natriumhydroxid, deren Anwendung jedoch nicht begrenzend ist. Jede Lösung mit der die beabsichtigte Deacetylierung bewirkt wird, ist hierfür anwendbar.
  • Die Reaktionstemperatur und die Konzentration und die Art der verwendeten alkalischen Lösung stehen in enger Beziehung zueinander. Im allgemeinen ist es daher passend, jedoch nicht begrenzend, dass die Konzentration der zu verwendenden Natriumhydroxidlösung 0,1 bis 50% (Gew./Vol.) beträgt, dass die Temperatur zwischen 10ºC und 100ºC liegt und dass die Reaktionszeit zwischen 0,1 Stunde und 120 Stunden liegt.
  • Nach der Deacetylierung wird das Reaktionssystem mit einer Säure, die hineingetropft wird, neutralisiert, dann entsalzt und danach gegebenenfalls gereinigt, um das beabsichtigte Produkt zu erhalten.
  • Das Reaktionsgemisch, wie es gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren erhalten wurde, wird einer Säulenchromatographie und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterworfen, um dabei das Produkt, von dem das Molekulargewicht durch FAB-MS gemessen wird und dessen Struktur durch Kernmagnetresonanz (NMR) analysiert wird, zu fraktionieren und zu isolieren. Es wurde bestätigt, dass die Produkte, die so erhalten wurden, verzweigte CDe, wie z. B. typischerweise solche der vorstehend erwähnten Struktuformeln 1 bis 12 sind.
  • Nun wird die vorliegende Erfindung konkret mittels der folgenden Beispiele, die jedoch nicht beabsichtigen, den Umfang der Erfindung zu beschränken, beschrieben.
    • Beispiel 1 (1) Kondensation
  • Zu 5 ml eines 20 mM Citratpuffers (pH-Wert 5,0), der 1,11 g N-Acetylglucosamin und 1,22 g α-CD enthält, wurden 50 Einheiten N-Acetylhexosaminidase, aus Jackbohne gewonnen, zugegeben und bei 45ºC 72 Stunden lang umsetzen gelassen.
  • Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule vom Amidtyp (Amid-80, hergestellt von Toso Corp.) und einer Umkehrphasensäule (ODS-AQ303, hergestellt von YMC Co.) analysiert. Die erhaltenen Daten werden in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt.
  • Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Wärme inaktiviert, und die so erhaltene Lösung wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule unterworfen, von der 100 mg eines Hauptprodukts A und 5 mg eines Nebenprodukts B fraktioniert wurden.
    • (2) Strukturanalyse
  • Durch FAB-MS Analyse wurde festgestellt, dass das Hauptprodukt A, das wie im vorstehend erwähnten Schritt (1) isoliert wurde, ein Molekulargewicht von 1175 hat, wie in Fig. 3 gezeigt wird. Die ¹³C-NMR Analyse des Produkts A deckte auf, dass dies 6-O-β- D-N-Acetylglucosaminyl-α-CD (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 1, wobei n = 5) ist, bei dem die N-Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des α-CD-Ringes dazwischen gebunden ist (siehe Fig. 4).
  • Andererseits wurde durch FAB-MS Analyse festgestellt, dass das Produkt B ein Molekulargewicht von 1175 hat. Eine kleine Menge des Produkts B wurde in 20 mM Citratpuffer (pH-Wert 5,0) aufgelöst, dann mit N-Acetylhexosaminidase bearbeitet, und danach durch HPLC analysiert.
  • Als Ergebnis wurde das Produkt B in N-Acetylglucosamin und α-CD in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zersetzt. Dies verifiziert, dass das Produkt B ein Isomer (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 5 oder 9, wobei n = 5) ist, bei dem die N- Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die sekundäre Hydroxylgruppe des α- CD-Ringes gebunden ist.
    • Beispiel 2 (1) Kondensation
  • Zu 5 ml eines 20 mM Citratpuffers (pH-Wert 5,0), der 1,11 g N Acetylglucosamin und 0,567 g β-CD enthält, wurden 50 Einheiten, der gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten, N Acetylhexosaminidase zugegeben und bei 45ºC 72 Stunden lang umsetzen gelassen. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule vom Amidtyp analysiert. Die erhaltenen Daten werden in Fig. 5 gezeigt.
  • Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Wärme inaktiviert, und die so erhaltene Lösung wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule unterworfen, von der 40 mg eines Hauptprodukts C und 3 mg eines Nebenprodukts D fraktioniert wurden.
    • (2) Strukturanalyse
  • Durch FAB-MS Analyse wurde festgestellt, dass das Hauptprodukt C, das wie im vorstehend erwähnten Schritt (1) isoliert wurde, ein Molekulargewicht von 1337 hat. Folglich wurde, bezugnehmend auf die Daten in Beispiel 1, bestätigt, dass dieses Produkt C eine Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 1, wobei n = 6) ist, bei dem die N Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des β-CD-Ringes gebunden ist.
  • Andererseits wurde durch FAB-MS Analyse festgestellt, dass das Produkt D ein Molekulargewicht von 1337 hat. Eine kleine Menge des Produkts D wurde in 20 mM Citratpuffer (pH-Wert 5,0) aufgelöst, dann mit N-Acetylhexosaminidase bearbeitet, und danach durch HPLC analysiert.
  • Als Ergebnis wurde das Produkt D in N-Acetylglucosamin und β-CD in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zersetzt. Folglich wurde, bezugnehmend auf die Daten in Beispiel 1, vermutet, dass dieses Produkt D eine Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 5 oder 9, wobei n = 6) ist, bei dem die N-Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die sekundäre Hydroxylgruppe des β-CD-Ringes gebunden ist.
    • Beispiel 3 (1) Kondensation
  • Zu 5 ml eines 20 mM Citratpuffers (pH-Wert 5,0), der 1,11 g N-Acetylglucosamin und 1,62 g γ-CD enthält, wurden 50 Einheiten, der gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten, N-Acetylhexosaminidase zugegeben und bei 45ºC 72 Stunden lang umsetzen gelassen. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule vom Amidtyp analysiert. Die erhaltenen Daten werden in Fig. 6 gezeigt.
  • Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Wärme inaktiviert, und die so erhaltene Lösung wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterworfen, von der 200 mg eines Hauptprodukts E und 6 mg eines Nebenprodukts F fraktioniert wurden.
    • (2) Strukturanalyse
  • Durch FAB-MS Analyse wurde festgestellt, dass das Hauptprodukt E, das wie im vorstehend erwähnten Schritt (1) isoliert wurde, ein Molekulargewicht von 1499 hat. Folglich wurde, bezugnehmend auf die Daten in Beispiel 1, bestätigt, dass dieses Produkt E eine Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 1, wobei n = 7) ist, bei dem die N-Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des γ-CD-Ringes gebunden ist.
  • Andererseits wurde durch FAB-MS Analyse festgestellt, dass das Produkt F ein Molekulargewicht von 1499 hat. Eine kleine Menge des Produkts F wurde in 20 mM Citratpuffer (pH-Wert 5,0) aufgelöst, dann mit N-Acetylhexosaminidase bearbeitet, und danach durch HPLC analysiert.
  • Als Ergebnis wurde das Produkt F in N-Acetylglucosamin und γ-CD in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zersetzt. Folglich wurde, bezugnehmend auf die Daten in Beispiel 1, vermutet, dass dieses Produkt F eine Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 5 oder 9, wobei n = 7) ist, bei dem die N-Acetylglucosaminylgruppe durch β-Bindung an die sekundäre Hydroxylgruppe des γ-CD-Ringes gebunden ist.
    • Beispiel 4 (1) Kondensation
  • Zu 5 ml eines 20 mM Citratpuffers (pH-Wert 5,0), der 1,11 g N-Acetylgalactosamin und 1,22 g α-CD enthält, wurden 50 Einheiten, der gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten, N-Acetylhexosaminidase zugegeben und bei 45ºC 72 Stunden lang umsetzen gelassen. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule vom Amidtyp und einer Umkehrphasensäule analysiert. Die erhaltenen Daten werden in Fig. 7 und Fig. 8 gezeigt.
  • Nach der Reaktion wurde das Enzym durch Wärme inaktiviert, und die so erhaltene Lösung wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule unterworfen, von der 83 mg eines Hauptprodukts G und 5 mg eines Nebenprodukts H fraktioniert wurden.
    • (2) Strukturanalyse
  • Durch FAB-MS Analyse wurde festgestellt, dass das Hauptprodukt G, das wie im vorstehend erwähnten Schritt (1) isoliert wurde, ein Molekulargewicht von 1175 hat. Die ¹³C- NMR Analyse des Produkts G deckte auf, dass dies 6-O-β-D-N-Acetylgalactosaminylα-CD (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 2, wobei n = 5) ist, bei dem die N- Acetylgalactosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des α-CD-Ringes gebunden ist.
  • Andererseits wurde durch FAB-MS Analyse festgestellt, dass das Produkt H ein Molekulargewicht von 1175 hat. Eine kleine Menge des Produkts H wurde in 20 mM Citratpuffer (pH-Wert 5,0) aufgelöst, dann mit N-Acetylhexosaminidase bearbeitet, und danach durch HPLC analysiert. Als Ergebnis wurde das Produkt H in N Acetylgalactosamin und α-CD in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zersetzt. Dies verifiziert, dass das Produkt H eine Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 6 oder 10, wobei n = 5) ist, bei dem die N Acetylgalactosaminylgruppe durch β-Bindung an die sekundäre Hydroxylgruppe des α-CD-Ringes gebunden ist.
    • Beispiel 5
  • 25 mg N-Acetylglucosaminyl-α-CD (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 1, wobei n = 5), das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in einer 20% Natriumhydroxidlösung aufgelöst, um davon eine Konzentration von 1% zu erreichen, die Lösung wurde dann bei 80ºC 3 Stunden lang umgesetzt.
  • Nach der Reaktion wurde konzentrierte Salzsäure tropfenweise dem Reaktionsgemisch zugegeben, um es zu neutralisieren. Dann wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer Entsalzungsvorrichtung (Microacilizer Gl. hergestellt von Asashi Chemical Industry Co.) entsalzt, dabei wurden 20 mg eines deacetylierten Produkts, oder das heißt einer Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 3, wobei n = 5) erhalten, bei der die Glucosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des α-CD-Ringes gebunden ist.
    • Beispiel 6
  • 25 mg N-Acetylgalactosaminyl-α-CD (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 2, wobei n = 5), das in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde in einer 20% Natriumhydroxidlösung aufgelöst, um davon eine Konzentration von 1% zu erreichen, die Lösung wurde dann bei 80ºC 3 Stunden lang umgesetzt wurde.
  • Nach der Reaktion wurde konzentrierte Salzsäure tropfenweise dem Reaktionsgemisch zugegeben, um es zu neutralisieren. Dann wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer Entsalzungsvorrichtung (Microacilizer Gl. hergestellt von Asashi Chemical Industry Co.) entsalzt, dabei wurden 20 mg eines deacetylierten Produkts, oder das heißt einer Verbindung (mit der vorstehend erwähnten Strukturformel 4, wobei n = 5) erhalten, bei der die Galactosaminylgruppe durch β-Bindung an die primäre Hydroxylgruppe an der Stelle 6 des α-CD- Ringes gebunden ist.
  • Wie im Detail, unter Bezugnahme der Ausführungsformen davon, vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung unter Nutzung einer enzymatischen Kondensation effizient verzweigte CDs mit einer Glucosaminylgruppe oder einer Galactosaminylgruppe, die an eine Hydroxylgruppe des CD-Ringes durch β-Bindung gebunden ist, her. Die Deacetylierung von diesen verzweigten CDen gibt effizient verzweigte CDe mit einer Glucosaminylgruppe oder einer Galactosaminylgruppe, die an eine Hydroxylgruppe des CD-Ringes durch β-Bindung gebunden ist.
  • Diese verzweigten CDe der vorliegenden Erfindung sind häufig verwendbar, nicht nur auf dem Gebiet der Medizin, auch auf dem Gebiet der Nahrungsmittel und Kosmetik.

Claims (7)

1. Eine Verfahren zur Herstellung von verzweigten Cyclodextrinen mit jeweils einer N- Acetylglucosaminylgruppe, einer Glucosaminylgruppe, einer N-Acetylgalactosaminylgruppe oder einer Galactosaminylgruppe, die an eine Hydroxylgruppe des Cyclodextrinringes durch β-Bindung dazwischen gebunden ist, wobei die Verfahren eine Umsetzung von einer Lösung, die α, β, oder γ-Cyclodextrin und ein N-Acetylglucosamin oder ein N-Acetylgalactosamin enthält, mit einer N-Acetylhexosaminidase und gegebenenfalls eine Deacetylierung des so erhaltenen Produkts umfaßt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration des Cyclodextrins in der Lösung von 1 bis 40% (Gew.-%) reicht.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration des N-Acetylglucosamins oder des N-Acetylgalactosamins in der Lösung von 5 bis 50% (Gew.-%) reicht.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gewichtsverhältnis des N-Acetylglucosamins oder des N-Acetylgalactosamins zum Cyclodextrin in einen Bereich zwischen 1/10 und 50/1 fällt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der pH-Wert des Reaktionssystems auf einen Wert zwischen 3 und 10 fällt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Reaktionstemperatur auf einen Wert zwischen 20ºC und 70ºC fällt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei eine Deacetylierung ausgeführt wird.
β. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Deacetylierung durch ein Behandeln von N- Acetylglucosaminyl-cyclodextrin oder N-Acetylgalactosaminyl-cyclodextrin mit einer alkalischen Lösung ausgeführt wird.
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