DE69315735T2 - Verfahren zur Herstellung von verzweigtem Cyclodextrin - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines verzweigten Cyclodextrins und genauer jenes, bei dem ein Cyclodextrin mit einem entzweigenden Enzym ("debranching enzyme") zusammen mit einem verzweigten Oligosaccharid als Glycosyl-Donor unter Ausnutzung der Transglycosylierungsaktivität des Enzyms behandelt wird.
- Ein Cyclodextrin (hier nachstehend bezeichnet als "CD") ist ein cyclisches Dextrin, das aus Glucoseeinheiten aufgebaut ist, die über eine α-1,4-Bindung dazwischen aneinander gebunden sind, und α-, β- und γ-CDe, die jeweils 6, 7 bzw. 8 Glucoseeinheiten umfassen, sind gut bekannt.
- Diese CDe weisen innerhalb des Moleküls Hohlräume auf und die Innenseite der Hohiräume ist hydrophob. Daher weisen sie ein Einschlußvermögen für die Herstellung von Inklusions(Clathrat-)verbindungen auf, die verschiedene ölige Stoffe darin aufnehmen können. Demgemäß werden unter Ausnutzung ihrer Eigenschaften verschiedene Anwendungen der CDe zur (1) Stabilisierung instabiler Stoffe, (2) zum Festhalten flüchtiger Stoffe, (3) zum Überdecken eines schlechten Geruchs und (4) zur Solubilisierung schwer löslicher oder unlöslicher Stoffe in Betracht gezogen.
- Jedoch weisen α-CD und β-CD den Nachteil auf, daß sie bei niedriger Temperatur eine geringe Löslichkeit (etwa einige % oder weniger) besitzen. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurden vor kurzem verzweigte CDe entwickelt. Verzweigte CDe weisen eine Struktur auf, worin ein Glucosylrest, ein Maltosylrest oder ein Maltooligosylrest über eine α-1,6- Bindung an die Glucoseeinheit im CD-Molekül gebunden ist, und sie sind äußerst gut in Wasser löslich und weisen verschiedene andere Eigenschaften auf, in denen sie sich von unverzweigten Cden unterscheiden.
- Zur Herstellung solcher verzweigter CDe wurden einige Verfahren vorgeschlagen. Unter diesen ist ein Verfahren, das gegenwärtig industriell am häufigsten angewendet wird, bei dem ein verzweigtes CD durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung einer Pullulanase aus einem Gemisch von Maltose und CD in hohen Konzentrationen erhalten wird. Gemäß dem Verfahren wird ein Maltosyl-CD in einer ziemlich großen Ausbeute hergestellt, aber gleichzeitig wird auch ein Dimaltosyl-CD mit einem zusätzlichen Maltosemolekül erzeugt, das über eine α-1,6-Bindung an einen anderen Glycosylrest eines Maltosyl- CDs gebunden ist (vgl. zum Beispiel US-A-4 910 137 und US-A-4 871 840). Deshalb erfordert die Isolierung von nur einem Maltosyl-CD aus dem Reaktionsgemisch ungünstigerweise viel Zeit und einen großen Kostenaufwand.
- Deshalb bestand in Anbetracht der vorstehend erwähnten Eigenschaften der verzweigten CDe ein Bedarf für ein wirksames Verfahren zur Herstellung von Maltosyl-CDen. Als Ergebnis wurde ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten CDen entwickelt, bei dem ein α-Maltosykest von einem verzweigten Oligosaccharid durch die Transglycosylierungsaktivität eines entzweigenden Enzyms an den Glucosylrest eines α-, β- oder γ-CDs gebunden wird.
- Ergänzend hierzu wurde außerdem festgestellt, daß eine aus Pseudomonas amybdelamosa stammende Isoamylase wirksam zur Herstellung eines Maltosyl-CDs oder Maltotriosyl-CDs mit einem Maltosylrest oder Maltotriosylrest, der mittels Transglycosylierung über eine α-1,6-Bindung an den Glycosylrest eines α-, β- oder γ-CDs gebunden ist, verwendet werden kann.
- Insbesondere stellt die vorliegende Erfmdung ein Verfahren zur wirksamen Herstellung eines verzweigten CDs mit einem Maltosylrest oder einem Maltotriosylrest bereit, der über eine α-Bindung an die 6-Hydroxylgruppe des Glucosylrests eines CDs gebunden ist, bei dem eine ein CD und ein verzweigtes Oligosaccharid enthaltende Flüssigkeit mit einem entzweigenden Enzym behandelt wird.
- Figur 1 zeigt Strukturen von verzweigten Cden, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden, wobei (1) ein Maltosyl-α-CD, (II) ein Maltotriosyl-α-CD, (III) ein Maltosyl-β-CD. (IV) ein Maltotriosyl-β-CD, (V) ein Maltosyl-γ-CD und (VI) ein Maltotriosyl-γ-CD anzeigt.
- Figur 2 zeigt ein Hochieistungsflüssigkeitschromatogramm des Reaktionsgemisches von Beispiel 1.
- Figur 3 zeigt ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Transferprodukts von Beispiel 1.
- Figur 4 zeigt ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Hydrolysats des durch Isoamylase erzeugten Transferprodukts von Beispiel 1.
- Figur 5 zeigt ein Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm des Transferprodukts von Beispiel 3.
- Figur 6 ist ein Hochieistungsflüssigkeitschromatogramm des Hydrolysats des durch Isoamylase erzeugten Transferprodukts von Beispiel 3.
- Das erfindungsgemäß verwendete CD kann ein beliebiges α-, β- oder γ-CD oder auch ein Gemisch davon sein.
- Als verzweigtes Oligosaccharid (nachstehend als "Glycosyl-Donor" bezeichnet) für die vorliegende Erfindung sind zum Beispiel β-Maltosyl-(1,6)-maltose (nachstehend bezeichnet als B4) oder α-Maltotriosyl-(1,6)-maltotriose (nachstehend bezeichnet als B6), die durch eine Kondensationsreaktion mit einem entzweigenden Enzym aus Maltose bzw. Maltotriose hergestellt werden, und Isopanose, Pullulan, ein partiell abgebautes Produkt von Pullulan und ein Gemisch davon geeignet.
- Als entzweigendes Enzym für die vorliegende Erfindung kann jedes verwendet werden, das mit einem ein verzweigtes Oligosaccharid und ein CD enthaltenden Gemisch reagiert, wobei der Glycosyl-Donor abgebaut wird, um auf diese Weise den Maltosylrest oder Maltotriosylrest über eine α-Bindung auf das CD zu übertragen, wobei ein verzweigtes CD erhalten wird.
- Das erfindungsgemäß verwendete entzweigende Enzym ist geeigneterweise ausgewählt aus denjenigen, die in der Natur weit verbreitet sind. Als Beispiel werden die als Enzym gut bekannte Pullulanase, die aus Mikroorganismen der Gattung Klebsiella, Aerobacter aerogenes, der Gattung Bacillus und Enterobacter aerogenes stammt, und die als Enzym gut bekannte Isoamylase, die aus Mikroorganismen von Pseudomonas amylodelamosa stammt, erwähnt.
- Für das erfindungsgemäße Reaktionssystem wird bevorzugt, daß die ein CD und einen Glycosyl-Donor enthaltende Flüssigkeit (wäßrige Lösung oder Suspension) eine CD- Konzentration von etwa 1 bis 50% (Gew./Gew.) und eine Glycosyl-Donor-Konzentration von etwa 1 bis 90% (Gew./Gew.) aufweist. Das Verhältnis (bezogen auf das Gewicht) von Glycosyl-Donor zu CD liegt, obwohl es entsprechend der Art des verwendeten Glycosyl-Donors variiert, geeigneterweise im Bereich von 0,1/1 bis 50/1, vorzugsweise 0,3/1 bis 2/1.
- Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Reaktion kann der pH-Wert des Reaktionsgemisches 3 bis 10 vorzugsweise 4 bis 9, betragen und die Temperatur davon kann im Bereich von 20 bis 70ºC, vorzugsweise 30 bis 60ºC, liegen. Die bei der Reaktion zu verwendende Menge des Enzyms und die Reaktionsdauer stehen in enger Beziehung miteinander. Im allgemeinen kann der erstere Faktor in einem solchen Bereich liegen, daß die Reaktion in 5 bis 100 Stunden und vorzugsweise in 5 bis 20 Stunden beendet ist.
- Das durch das vorstehend erwähnte Reaktionsverfahren erhaltene Reaktionsgemisch wird einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unterzogen, woraufhin das CD-Transferprodukt isoliert wird. Anschiießend wird die Verweildauer bei der HPLC mit der einer Standardsubstanz verglichen und die Struktur des Produkts durch ein enzymatisches Verfahren analysiert. Als Ergebnis wurde nachgewiesen, daß das Produkt ein verzweigtes CD ist, wie es durch jede der Formeln I bis VI von Figur 1 dargestellt ist.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.
- 10 g Maltose wurden in 8,5 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) suspendiert und 900 Einheiten Pullulanase, die aus Mikroorganismen der Gattung Klebsiella stammt (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Japan) wurden dazu zugegeben und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 60ºC umgesetzt. Im Hinblick auf die Enzymaktivität der Pullulanase entspricht eine Einheit davon einer Menge, die einen reduzierenden Zucker in einer Menge produziert, die 1,Mol Glucose in einer Minute entspricht, wenn sie mit einem Pullulan bei einem pH- Wert von 6,0 und einer Temperatur von 40ºC umgesetzt wird.
- Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch, worin das verwendete Enzym hitzeinaktiviert wurde, einer Aktivkohlenchromatographie und einer Hochleistungsflüssigkeitshromatographie unterzogen, wobei 2,3 g des Kondensationsprodukts B4 isoliert wurden.
- 500 mg B4, das in dem vorstehenden Schritt (1) hergestellt wurde, und 500 mg α-CD wurden in 1.25 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) gelöst und 95.000 Einheiten Isoamylase, die aus Pseudomonas amylodelamosa stammt (hergestellt von Hayashibara Biological and Chemical Laboratories Co., Japan), wurden dazu zugegeben und das Gemisch wurde 17 Stunden bei 40ºC umgesetzt. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert und das Analyseergebnis ist in Figur 2 dargestellt. Eine verwendete Einheit Isoamylase entspricht einer Menge, die die Extinktion bei 610 nm um einen Wert von 0,1 in einer Stunde erhöht, wenn sie mit löslicher, glutinöser Reisstärke bei einem pH von 3,5 und einer Temperatur von 40ºC umgesetzt wird.
- Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch, worin das verwendete Enzym hitzeinaktiviert wurde, einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, wobei 95 mg eines Transferprodukts isoliert wurden.
- Das Transferprodukt wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert (Figur 3), wobei die Verweildauer der einer Standardsubstanz Maltosyl-CD entsprach. Das Transferprodukt wurde durch die aus Pseudomonas amylodelamosa stammende Isoamylase vollständig zu α-CD und Maltose in gleichen Molmengen hydrolysiert (Figur 4). Aus dem Vorstehenden folgt daß das Transferprodukt Maltosyl-β-CD (mit der Strukturformel 1 von Figur 1) ist.
- 1 g Maltose wurde in 850 µl 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) suspendiert und 90 Einheiten Pullulanase, die aus der Gattung Klebsiella stammt (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Japan), wurden dazu zugegeben und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 60ºC umgesetzt. Anschließend wurden 200 mg cn-CD und 650 µl 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und das Gemisch wurde weitere 8 Stunden umgesetzt.
- Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsflüssigkeit, worin das verwendete Enzym hitzeinaktiviert wurde, einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, worauf die Herstellung von etwa 40 mg Maltosyl-β-CD nachgewiesen wurde.
- 10 g Maltotriose wurden in 8,5 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) suspendiert und 600 Einheiten Pullulanase, die aus der Gattung Klebsiella stammt (hergestellt von Amano Pharmaceutical Co., Japan), wurden dazu zugegeben und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 60ºC umgesetzt.
- Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch, worin das verwendete Enzym hitzeinaktiviert wurde, einer Aktivkohlenchromatographie und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, wobei 2,4 g des Kondensationsprodukts B6 isoliert wurden.
- 500 mg B6, das in dem vorstehenden Schritt (1) hergestellt wurde, und 200 mg β-CD wurden in 1,25 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 6,0) gelöst und 50.000 Einheiten Isoamylase, die aus Pseudomonas amylodelamosa stammt (hergestellt von Hayashibara Biological and Chemical Laboratories Co., Japan), wurden dazu zugegeben und das Gemisch wurde 17 Stunden bei 40ºC umgesetzt.
- Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch, worin das verwendete Enzym hitzeinaktiviert wurde, einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, wobei 45 mg eines Transferprodukts isoliert wurden.
- Das Transferprodukt wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert (Figur 5), wobei die Verweildauer der einer Standardsubstanz Maltotriosyl-β-CD entsprach. Das Transferprodukt wurde durch die aus Pseudomonas amylodelamosa stammende Isoamylase vollständig zu β-CD und Maltotriose in gleichen Molmengen hydrolysiert (Figur 6). Aus dem Vorstehenden folgt, daß das Transferprodukt Maltotriosyl-β-CD ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung, die vorstehend ausführlich erläutert wurde, wird ein verzweigtes CD mit einem Maltosylrest oder Maltotriosylrest, der über eine α- 1,6- Bindung an die Glucoseeinheit eines CD-Moleküls gebunden ist, durch die Transglycosylierungsaktivität eines entzweigenden Enzyms hergestellt. Insbesondere wird ein verzweigtes CD mit nur einem daran gebundenen Maltosyl- oder Maltotriosylrest besonders effizient hergestellt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung eines verzweigten
Cyclodextrins, umfassend die Behandlung einer Flüssigkeit,
die ein Cyclodextrin und ein verzweigtes Oligosaachand
enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
β-Maltosyl-(1,6)-maltose,
β-Maltotriosyl-(1,6)-maltotriose, Isopanose, Pullulan, einem partiell abgebauten
Produkt von Pullulan und einem Gemisch davon, mit einem
entzweigenden Enzym ("debranching enzyme").
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das verzweigte
Cyclodextrin α-Maltosyl-(1,6)-cyclodextrin oder
α-Maltotriosyl-(1,6)-cyclodextrin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das entzweigende
Enzym Pullulanase oder Isoamylase ist, die aus
Mikroorganismen stammen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Konzentration des Cyclodextrins 1 bis 50 % (Gew./Gew.)
ist und die Konzentration des verzweigten
Oligosaccharids 1 bis 90 % (Gew.fgew.) ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die
Reaktion der Flüssigkeit und des entzweigenden Enzyms
bei einem pH-Wert von 3 bis 10 und einer Temperatur von
20 bis 70ºC ausgeführt wird.
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