JPH07275698A - クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体 - Google Patents
クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体Info
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- JPH07275698A JPH07275698A JP6090732A JP9073294A JPH07275698A JP H07275698 A JPH07275698 A JP H07275698A JP 6090732 A JP6090732 A JP 6090732A JP 9073294 A JP9073294 A JP 9073294A JP H07275698 A JPH07275698 A JP H07275698A
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- glucan
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- acetylglucosamine
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は医薬品，化成品，食品などの様々な
産業分野における特定成分の分離・精製工程または化
学、生化学等の実験における分離・精製操作に用いられ
るクロマトグラフィー用担体または蛋白質固定化用担体
を提供する。 【構成】 分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基ま
たはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−アセチ
ルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカンを含
有してなるクロマトグラフィー用担体または蛋白質固定
化用担体並びに分子中にグルコサミン残基またはグ
ルコサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用
担体または蛋白質固定化用担体。
産業分野における特定成分の分離・精製工程または化
学、生化学等の実験における分離・精製操作に用いられ
るクロマトグラフィー用担体または蛋白質固定化用担体
を提供する。 【構成】 分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基ま
たはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−アセチ
ルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカンを含
有してなるクロマトグラフィー用担体または蛋白質固定
化用担体並びに分子中にグルコサミン残基またはグ
ルコサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用
担体または蛋白質固定化用担体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はクロマトグラフィー用ま
たは蛋白質固定化用担体に関し、詳しくは医薬品，化成
品，食品などの様々な産業分野における特定成分の分離
・精製工程または化学、生化学等の実験における分離・
精製操作に用いられ、分子中にＮ−アセチルグルコサミ
ン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有してなるクロマトグラフィー用担体または蛋白
質固定化用担体に関する。さらに、本発明は、同様の用
途に使用できる、分子中にグルコサミン残基またはグル
コサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用担体
または蛋白質固定化用担体に関する。
たは蛋白質固定化用担体に関し、詳しくは医薬品，化成
品，食品などの様々な産業分野における特定成分の分離
・精製工程または化学、生化学等の実験における分離・
精製操作に用いられ、分子中にＮ−アセチルグルコサミ
ン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有してなるクロマトグラフィー用担体または蛋白
質固定化用担体に関する。さらに、本発明は、同様の用
途に使用できる、分子中にグルコサミン残基またはグル
コサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用担体
または蛋白質固定化用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】化合
物の分離、精製手段として、各種クロマトグラフィーが
汎用されている。このうち、薄層クロマトグラフィー，
ペーパークロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラ
フィーや電気泳動においては、セルロース系の担体や支
持体が用いられている。従来のセルロース系の担体や支
持体は、すべて植物セルロースを原料としたものであ
り、安価で、安全で扱いやすい反面、分離能が十分でな
いという欠点がある。このため、植物セルロース系の担
体よりも分離能、吸着能に優れた担体を開発することが
望まれている。
物の分離、精製手段として、各種クロマトグラフィーが
汎用されている。このうち、薄層クロマトグラフィー，
ペーパークロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラ
フィーや電気泳動においては、セルロース系の担体や支
持体が用いられている。従来のセルロース系の担体や支
持体は、すべて植物セルロースを原料としたものであ
り、安価で、安全で扱いやすい反面、分離能が十分でな
いという欠点がある。このため、植物セルロース系の担
体よりも分離能、吸着能に優れた担体を開発することが
望まれている。
【０００３】上記の課題を解決するために、微生物セル
ロースの利用が検討されている。微生物セルロースはミ
クロフィブリルが互いに絡み合っているために、植物由
来のセルロースよりも隙間が大きく、またフィブリルの
径が細いため、単位重量当りの表面積が大きく、処理能
力が高いという利点がある。また、物理的強度も高いた
め、分離用担体として使用する場合、速い流速での分離
が可能になる。しかし、分子的には、水酸基が専ら分離
や固定化に関与するだけで、特異的な分離や強固な固定
化は困難であり、実用化を阻んでいた。
ロースの利用が検討されている。微生物セルロースはミ
クロフィブリルが互いに絡み合っているために、植物由
来のセルロースよりも隙間が大きく、またフィブリルの
径が細いため、単位重量当りの表面積が大きく、処理能
力が高いという利点がある。また、物理的強度も高いた
め、分離用担体として使用する場合、速い流速での分離
が可能になる。しかし、分子的には、水酸基が専ら分離
や固定化に関与するだけで、特異的な分離や強固な固定
化は困難であり、実用化を阻んでいた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するための手段として、蛋白質と強い相互作用を
持つＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクト
サミン、また蛋白質を化学的結合により固定化できるア
ミノ基を有するグルコサミンやガラクトサミンを分子中
に含有するように微生物セルロースを改変し、それを用
いて蛋白質吸着能や固定化能の高いクロマトグラフィー
用担体や蛋白質固定化用担体が開発できると考えた。本
発明者らは、すでに分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基を含む新規βー１，４─グルカンを見出している
（特開平４−２６８３０１）。また、新たにＮ−アセチ
ルグルコサミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン
残基を含む新規β−１，４−グルカンを見出し、特許出
願している（特願平６−５１０３８）。これらのβ−
１，４−グルカンについて、蛋白質吸着能や蛋白質固定
化能を鋭意検討したところ、通常の微生物セルロースよ
りも高い能力を有していることが判明した。さらに、上
記２つのβ−１，４−グルカンを脱アセチル化したもの
でも、同様に高い蛋白質吸着能や蛋白質固定化能を有し
ており、クロマトグラフィー用担体や蛋白質固定化用担
体として優れていることを見出し、本発明を完成したの
である。
を解決するための手段として、蛋白質と強い相互作用を
持つＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクト
サミン、また蛋白質を化学的結合により固定化できるア
ミノ基を有するグルコサミンやガラクトサミンを分子中
に含有するように微生物セルロースを改変し、それを用
いて蛋白質吸着能や固定化能の高いクロマトグラフィー
用担体や蛋白質固定化用担体が開発できると考えた。本
発明者らは、すでに分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基を含む新規βー１，４─グルカンを見出している
（特開平４−２６８３０１）。また、新たにＮ−アセチ
ルグルコサミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン
残基を含む新規β−１，４−グルカンを見出し、特許出
願している（特願平６−５１０３８）。これらのβ−
１，４−グルカンについて、蛋白質吸着能や蛋白質固定
化能を鋭意検討したところ、通常の微生物セルロースよ
りも高い能力を有していることが判明した。さらに、上
記２つのβ−１，４−グルカンを脱アセチル化したもの
でも、同様に高い蛋白質吸着能や蛋白質固定化能を有し
ており、クロマトグラフィー用担体や蛋白質固定化用担
体として優れていることを見出し、本発明を完成したの
である。
【０００５】すなわち、本発明は分子中にＮ−アセチ
ルグルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン
残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用
担体に関し、また分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有してなる蛋白質固定化用担体に関する。さら
に、本発明は分子中にグルコサミン残基またはグル
コサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用担体
並びに分子中にグルコサミン残基またはグルコサミ
ン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グ
ルカンを含有してなる蛋白質固定化用担体に関する。
ルグルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン
残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用
担体に関し、また分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有してなる蛋白質固定化用担体に関する。さら
に、本発明は分子中にグルコサミン残基またはグル
コサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用担体
並びに分子中にグルコサミン残基またはグルコサミ
ン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グ
ルカンを含有してなる蛋白質固定化用担体に関する。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を含む
β−１，４−グルカン並びにＮ−アセチルグルコサミン
残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンの製造法については既に本発明者らに
よって確立されている。すなわち、これらβ−１，４−
グルカンは、分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基ま
たはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−アセチル
ガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン生産能
を有する微生物を用いて生産することができる。かかる
能力を有する微生物としては、アセトバクター・キシリ
ナム１０５１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０００）株、同ＡＴ
ＣＣ１０２４５株、同ＩＦＯ１３７７２株などが挙げら
れる。なお、これらの微生物から誘導される変異株も該
能力を有する限り用いることができる。さらに、これら
の微生物をＮ−アセチルグルコサミンを炭素源として含
む培地で継代培養することにより、該物質の生産能を向
上させた菌株は一層好適に使用できる。
使用する分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基を含む
β−１，４−グルカン並びにＮ−アセチルグルコサミン
残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンの製造法については既に本発明者らに
よって確立されている。すなわち、これらβ−１，４−
グルカンは、分子中にＮ−アセチルグルコサミン残基ま
たはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−アセチル
ガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン生産能
を有する微生物を用いて生産することができる。かかる
能力を有する微生物としては、アセトバクター・キシリ
ナム１０５１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０００）株、同ＡＴ
ＣＣ１０２４５株、同ＩＦＯ１３７７２株などが挙げら
れる。なお、これらの微生物から誘導される変異株も該
能力を有する限り用いることができる。さらに、これら
の微生物をＮ−アセチルグルコサミンを炭素源として含
む培地で継代培養することにより、該物質の生産能を向
上させた菌株は一層好適に使用できる。
【０００７】また、分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基を含むβ−１，４−グルカンを生産させるために用
いる培地は、炭素源としてＮ−アセチルグルコサミンお
よび／またはグルコサミンを単独で、もしくは他の炭素
源と組み合わせて使用するものであればよく、またグル
コースに無機窒素および／またはグルタミン酸を組み合
わせたものも使用できる。一方、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む
β−１，４−グルカンを生産させるための培地は、炭素
源としてＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラ
クトサミンを単独で含む培地を用いる。
残基を含むβ−１，４−グルカンを生産させるために用
いる培地は、炭素源としてＮ−アセチルグルコサミンお
よび／またはグルコサミンを単独で、もしくは他の炭素
源と組み合わせて使用するものであればよく、またグル
コースに無機窒素および／またはグルタミン酸を組み合
わせたものも使用できる。一方、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む
β−１，４−グルカンを生産させるための培地は、炭素
源としてＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラ
クトサミンを単独で含む培地を用いる。
【０００８】Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチル
ガラクトサミン，グルコサミン，グルコース等の炭素源
の培地への添加濃度は、微生物の培養に影響しない範囲
に適宜設定すればよく、通常0.１〜５％の範囲が望まし
い。培地中には、上記炭素源および窒素源，無機塩類，
その他必要に応じてアミノ酸，ビタミンなどが含まれて
いる。特にアセトバクター属に属する微生物を用いる場
合は、ヘキソサミンを単一炭素源として含むHestrin-Sc
hramm 培地が好適である。
ガラクトサミン，グルコサミン，グルコース等の炭素源
の培地への添加濃度は、微生物の培養に影響しない範囲
に適宜設定すればよく、通常0.１〜５％の範囲が望まし
い。培地中には、上記炭素源および窒素源，無機塩類，
その他必要に応じてアミノ酸，ビタミンなどが含まれて
いる。特にアセトバクター属に属する微生物を用いる場
合は、ヘキソサミンを単一炭素源として含むHestrin-Sc
hramm 培地が好適である。
【０００９】培養条件は、用いる菌株が生育し、上記の
β−１，４−グルカンを生産する条件であればよく、通
常ｐＨ５〜９，温度は２０〜４０℃，期間は２〜１０日
である。また、培養方法は制限がなく、通気攪拌培養で
も静置培養でもよいが、静置培養によると、新規β−
１，４−グルカンは培養液表面にゲル状物質として生産
され、容易に回収できる。上記の方法で生産された分子
中にＮ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチル
グルコサミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残
基を含むβ−１，４−グルカンは、培養終了後、通常は
アルカリ溶液に浸漬するなどの方法で菌体蛋白質を除去
した後、水洗して使用する。
β−１，４−グルカンを生産する条件であればよく、通
常ｐＨ５〜９，温度は２０〜４０℃，期間は２〜１０日
である。また、培養方法は制限がなく、通気攪拌培養で
も静置培養でもよいが、静置培養によると、新規β−
１，４−グルカンは培養液表面にゲル状物質として生産
され、容易に回収できる。上記の方法で生産された分子
中にＮ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチル
グルコサミン残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残
基を含むβ−１，４−グルカンは、培養終了後、通常は
アルカリ溶液に浸漬するなどの方法で菌体蛋白質を除去
した後、水洗して使用する。
【００１０】上記の方法で得た新規β−１，４−グルカ
ンはシート状やフロック状のゲルのまま、あるいは高圧
ホモゲナイザーやパルプ離解機やワーリングブレンダー
などによって機械的に離解してから用いる。また、希酸
などで部分分解し、低分子化した新規β−１，４−グル
カンも使用することができる。さらに、所望により、風
乾や凍結乾燥などの一般的方法で乾燥させたものも使用
できる。
ンはシート状やフロック状のゲルのまま、あるいは高圧
ホモゲナイザーやパルプ離解機やワーリングブレンダー
などによって機械的に離解してから用いる。また、希酸
などで部分分解し、低分子化した新規β−１，４−グル
カンも使用することができる。さらに、所望により、風
乾や凍結乾燥などの一般的方法で乾燥させたものも使用
できる。
【００１１】このようにして得た分子中にＮ−アセチル
グルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基
およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンは、アルカリ溶液中で煮沸する等の方法で
Ｎ−アセチルグルコサミン残基やＮ−アセチルガラクト
サミン残基のアセトアミド基を脱アセチル化し、グルコ
サミン残基やガラクトサミン残基とし、分子中にグルコ
サミン残基またはグルコサミン残基およびガラクトサミ
ン残基を含むβ−１，４−グルカンを調製することがで
きる。具体的には、上記β−１，４−グルカンを２０％
（容量）水酸化ナトリウム水溶液中で１時間程度煮沸す
るか、または該β−１，４−グルカンの２０％（容量）
水酸化ナトリウム水溶液をオートクレーブなどの加圧容
器に入れ、１〜２気圧程度の加圧下で、例えば１２１
℃，１５分間の条件で処理すればよい。
グルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基
およびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，
４−グルカンは、アルカリ溶液中で煮沸する等の方法で
Ｎ−アセチルグルコサミン残基やＮ−アセチルガラクト
サミン残基のアセトアミド基を脱アセチル化し、グルコ
サミン残基やガラクトサミン残基とし、分子中にグルコ
サミン残基またはグルコサミン残基およびガラクトサミ
ン残基を含むβ−１，４−グルカンを調製することがで
きる。具体的には、上記β−１，４−グルカンを２０％
（容量）水酸化ナトリウム水溶液中で１時間程度煮沸す
るか、または該β−１，４−グルカンの２０％（容量）
水酸化ナトリウム水溶液をオートクレーブなどの加圧容
器に入れ、１〜２気圧程度の加圧下で、例えば１２１
℃，１５分間の条件で処理すればよい。
【００１２】上記の方法で得た分子中にＮ−アセチルグ
ルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基お
よびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４
−グルカンや、分子中にグルコサミン残基またはグルコ
サミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４
−グルカンをクロマトグラフィー用担体または蛋白質固
定化用担体とする場合、その形状は特に問わない。例え
ば該β−１，４−グルカンを高圧ホモゲナイザーやワー
リングブレンダーなどで処理してスラリー状にした離解
物をガラス板等に引き延ばして薄層プレートにしたり、
離解物を抄紙して紙状とし、ペーパークロマトグラフィ
ーに用いることができる。また、カラムに詰めてカラム
クロマトグラフィーに用いることができる。さらには、
別の態様として、上記β−１，４−グルカンを離解処理
しないで膜状あるいはフロック状のゲル状該物質を、そ
のままクロマトグラフィー用担体や電気泳動担体に用い
ることも可能である。
ルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基お
よびＮ−アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４
−グルカンや、分子中にグルコサミン残基またはグルコ
サミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４
−グルカンをクロマトグラフィー用担体または蛋白質固
定化用担体とする場合、その形状は特に問わない。例え
ば該β−１，４−グルカンを高圧ホモゲナイザーやワー
リングブレンダーなどで処理してスラリー状にした離解
物をガラス板等に引き延ばして薄層プレートにしたり、
離解物を抄紙して紙状とし、ペーパークロマトグラフィ
ーに用いることができる。また、カラムに詰めてカラム
クロマトグラフィーに用いることができる。さらには、
別の態様として、上記β−１，４−グルカンを離解処理
しないで膜状あるいはフロック状のゲル状該物質を、そ
のままクロマトグラフィー用担体や電気泳動担体に用い
ることも可能である。
【００１３】本発明の分子中にＮ−アセチルグルコサミ
ン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンや分子中にグルコサミン残基またはグルコサミン残基
およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン
からなるクロマトグラフィー用担体で分離される化合物
としては、例えば重金属，単糖，少糖，多糖，アミノ
酸，ペプチド，有機酸，アミン類，アルコール類，ビタ
ミン類，アルカロイド，核酸，リン酸エステル，脂質な
どがある。
ン残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−
アセチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンや分子中にグルコサミン残基またはグルコサミン残基
およびガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン
からなるクロマトグラフィー用担体で分離される化合物
としては、例えば重金属，単糖，少糖，多糖，アミノ
酸，ペプチド，有機酸，アミン類，アルコール類，ビタ
ミン類，アルカロイド，核酸，リン酸エステル，脂質な
どがある。
【００１４】これら化合物の担体への吸着条件や溶出条
件については、主鎖のβ−１，４結合の加水分解が生じ
ないように設定することが必要であり、他の制限は特に
なく、通常ｐＨ１〜８、好ましくはｐＨ３〜７で行うこ
とが適当である。
件については、主鎖のβ−１，４結合の加水分解が生じ
ないように設定することが必要であり、他の制限は特に
なく、通常ｐＨ１〜８、好ましくはｐＨ３〜７で行うこ
とが適当である。
【００１５】また、本発明のβ−１，４−グルカンを蛋
白質の固定化に使用する場合は、ビーズ状やシート状等
に成形したものが好適に使用される。固定化の方法は、
目的物質を含有する溶液と該β−１，４−グルカンとを
接触させることにより、アセトアミド基またはアミノ基
との電気的チャージにより吸着させる方法やアミノ基と
化学的に結合させる方法などが採用される。ここで、蛋
白質固定化用担体に固定化される蛋白質としては、どの
ようなものであってもよく、上記方法で固定化すること
ができる。
白質の固定化に使用する場合は、ビーズ状やシート状等
に成形したものが好適に使用される。固定化の方法は、
目的物質を含有する溶液と該β−１，４−グルカンとを
接触させることにより、アセトアミド基またはアミノ基
との電気的チャージにより吸着させる方法やアミノ基と
化学的に結合させる方法などが採用される。ここで、蛋
白質固定化用担体に固定化される蛋白質としては、どの
ようなものであってもよく、上記方法で固定化すること
ができる。
【００１６】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ アセトバクター・キシリナムＩＦＯ１３７７２株を、He
strin-Schramm 培地（グルコース2.０ｇ，バクトペプト
ン（ディフコ社製）0.５ｇ，酵母エキス（ディフコ社
製）0.５ｇ，クエン酸0.１１５ｇ，リン酸水素二ナトリ
ウム0.２７ｇ，蒸留水１００ｍｌ，ｐＨ6.０) の組成の
うち、グルコース2.０ｇをグルコース1.４ｇとＮ−アセ
チルグルコサミン0.６ｇに変更した培地に植菌し、２８
℃で７日間静置培養した。
る。 実施例１ アセトバクター・キシリナムＩＦＯ１３７７２株を、He
strin-Schramm 培地（グルコース2.０ｇ，バクトペプト
ン（ディフコ社製）0.５ｇ，酵母エキス（ディフコ社
製）0.５ｇ，クエン酸0.１１５ｇ，リン酸水素二ナトリ
ウム0.２７ｇ，蒸留水１００ｍｌ，ｐＨ6.０) の組成の
うち、グルコース2.０ｇをグルコース1.４ｇとＮ−アセ
チルグルコサミン0.６ｇに変更した培地に植菌し、２８
℃で７日間静置培養した。
【００１７】培養終了後、培養液表面に生成した微生物
セルロースを含有する生成物を含まない培養液の一部を
種培養液とし、Hestrin-Schramm 培地の組成のうち、グ
ルコース2.０ｇをグルコサミン塩酸塩2.０ｇに変更した
培地に植菌し、通気攪拌培養を行った。なお、種培養液
は培地容量の１０％相当量とし、培養装置（特願平５−
１６５９０６号明細書）は、容量５リットル、液量３リ
ットル、株式会社東京理化製、発酵槽内径１４３ｍｍ、
高さ３４４ｍｍの円筒形で、発酵槽内の攪拌軸に支持体
として直径１２ｃｍのステンレス製円板（メッシュサイ
ズ６）を液面から４ｃｍ，６ｃｍ，８ｃｍ，１０ｃｍ，
１２ｃｍの各位置に一枚ずつ合計五枚を固定しており、
攪拌軸の回転と連動して３０ｒｐｍの速度で回転させな
がら培養した。また、通気は攪拌軸の最下部に取り付け
た支持体の下1.５ｃｍの位置にある攪拌軸の先端に設置
した円板状の空気吹き出し口（長さ６ｃｍ，直径1.２ｃ
ｍ，口径0.５ｃｍ）から行い、除菌フィルターを通した
空気をエアーポンプにて毎分約0.４リットルの速度で供
給した。
セルロースを含有する生成物を含まない培養液の一部を
種培養液とし、Hestrin-Schramm 培地の組成のうち、グ
ルコース2.０ｇをグルコサミン塩酸塩2.０ｇに変更した
培地に植菌し、通気攪拌培養を行った。なお、種培養液
は培地容量の１０％相当量とし、培養装置（特願平５−
１６５９０６号明細書）は、容量５リットル、液量３リ
ットル、株式会社東京理化製、発酵槽内径１４３ｍｍ、
高さ３４４ｍｍの円筒形で、発酵槽内の攪拌軸に支持体
として直径１２ｃｍのステンレス製円板（メッシュサイ
ズ６）を液面から４ｃｍ，６ｃｍ，８ｃｍ，１０ｃｍ，
１２ｃｍの各位置に一枚ずつ合計五枚を固定しており、
攪拌軸の回転と連動して３０ｒｐｍの速度で回転させな
がら培養した。また、通気は攪拌軸の最下部に取り付け
た支持体の下1.５ｃｍの位置にある攪拌軸の先端に設置
した円板状の空気吹き出し口（長さ６ｃｍ，直径1.２ｃ
ｍ，口径0.５ｃｍ）から行い、除菌フィルターを通した
空気をエアーポンプにて毎分約0.４リットルの速度で供
給した。
【００１８】培養終了後、支持体に付着した分子中にＮ
−アセチルグルコサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有する生成物を物理的に剥離し、該剥離物を２％
ＳＤＳ溶液に浸漬し、１００℃で３時間煮沸して菌体成
分や培地由来の蛋白質などを除去した後、２％ＮａＯＨ
水溶液に浸漬し、１００℃で1.５時間処理した。その
後、１％酢酸溶液に浸漬し、室温で３時間中和処理し、
水で十分に洗浄して不純物を除去し新規β−１，４−グ
ルカンを得た。このＮ−アセチルグルコサミン残基を含
む新規β−１，４−グルカンを凍結乾燥させ、乾燥品を
得た。本品のＮ−アセチルグルコサミン残基含量は、特
開平４−２６８３０１号公報に開示した方法により測定
したところ、1.７６モル％であった。なお、対照とし
て、前記Hestrin-Schramm 培地（グルコース2.０ｇ，バ
クトペプトン（ディフコ社製）0.５ｇ，酵母エキス（デ
ィフコ社製）0.５ｇ，クエン酸0.１１５ｇ，リン酸水素
二ナトリウム0.２７ｇ，蒸留水１００ｍｌ，ｐＨ６.0 )
で上記と同様な方法で培養し、生成物を同様にして精製
し、凍結乾燥した微生物セルロース（通常のβ−１，４
−グルカン）を得た。
−アセチルグルコサミン残基を含むβ−１，４−グルカ
ンを含有する生成物を物理的に剥離し、該剥離物を２％
ＳＤＳ溶液に浸漬し、１００℃で３時間煮沸して菌体成
分や培地由来の蛋白質などを除去した後、２％ＮａＯＨ
水溶液に浸漬し、１００℃で1.５時間処理した。その
後、１％酢酸溶液に浸漬し、室温で３時間中和処理し、
水で十分に洗浄して不純物を除去し新規β−１，４−グ
ルカンを得た。このＮ−アセチルグルコサミン残基を含
む新規β−１，４−グルカンを凍結乾燥させ、乾燥品を
得た。本品のＮ−アセチルグルコサミン残基含量は、特
開平４−２６８３０１号公報に開示した方法により測定
したところ、1.７６モル％であった。なお、対照とし
て、前記Hestrin-Schramm 培地（グルコース2.０ｇ，バ
クトペプトン（ディフコ社製）0.５ｇ，酵母エキス（デ
ィフコ社製）0.５ｇ，クエン酸0.１１５ｇ，リン酸水素
二ナトリウム0.２７ｇ，蒸留水１００ｍｌ，ｐＨ６.0 )
で上記と同様な方法で培養し、生成物を同様にして精製
し、凍結乾燥した微生物セルロース（通常のβ−１，４
−グルカン）を得た。
【００１９】上記２種類の乾燥品５０ｍｇをそれぞれ蒸
留水２５ｍｌに５時間程度室温で浸漬した後、卵白リゾ
チーム（生化学工業製）水溶液を最終濃度0.１ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、浸漬量を５０ｍｌにした後、浸
漬液をマグネティックスターラーで攪拌しながら４℃で
保存した。保存開始時、３時間後および２４時間後に液
の一部をサンプリングし、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ
ｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて液中の
蛋白質量を測定し、吸着したリゾチーム量を求めた。
留水２５ｍｌに５時間程度室温で浸漬した後、卵白リゾ
チーム（生化学工業製）水溶液を最終濃度0.１ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、浸漬量を５０ｍｌにした後、浸
漬液をマグネティックスターラーで攪拌しながら４℃で
保存した。保存開始時、３時間後および２４時間後に液
の一部をサンプリングし、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ
ｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて液中の
蛋白質量を測定し、吸着したリゾチーム量を求めた。
【００２０】結果を第１表に示す。なお、吸着率（％）
は液中の蛋白質吸着量／保存開始前の総蛋白質量×１０
０とした。表から明らかなように、Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基を含む新規β−１，４−グルカンは微生物セ
ルロースよりも著しくリゾチーム吸着能が高く、３時間
で平衡に達しており、短時間で吸着が完了することが分
かった。
は液中の蛋白質吸着量／保存開始前の総蛋白質量×１０
０とした。表から明らかなように、Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基を含む新規β−１，４−グルカンは微生物セ
ルロースよりも著しくリゾチーム吸着能が高く、３時間
で平衡に達しており、短時間で吸着が完了することが分
かった。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２ アセトバクター・キシリナムＩＦＯ１３７７２株を実施
例１と同様な方法で培養し、精製処理を行って、Ｎ−ア
セチルグルコサミン残基を含む新規β−１，４−グルカ
ンのゲルを得た。本品のＮ−アセチルグルコサミン残基
含量は、特開平４−２６８３０１号公報に開示した方法
により測定したところ、1.７３モル％であった。上記の
ゲルを蒸留水に懸濁し、ワーリング・ブレンダー７０１
２型，ミクロコンテナー＃８５７５（Ｅｂｅｒｂａｃｈ
社製）で１５，０００ｒｐｍ，５分間処理し、機械的に
離解した後、処理液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ，２
０分間）にかけて該β−１，４−グルカンの沈澱物を分
離し、このものを凍結乾燥して乾燥品を得た。
例１と同様な方法で培養し、精製処理を行って、Ｎ−ア
セチルグルコサミン残基を含む新規β−１，４−グルカ
ンのゲルを得た。本品のＮ−アセチルグルコサミン残基
含量は、特開平４−２６８３０１号公報に開示した方法
により測定したところ、1.７３モル％であった。上記の
ゲルを蒸留水に懸濁し、ワーリング・ブレンダー７０１
２型，ミクロコンテナー＃８５７５（Ｅｂｅｒｂａｃｈ
社製）で１５，０００ｒｐｍ，５分間処理し、機械的に
離解した後、処理液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ，２
０分間）にかけて該β−１，４−グルカンの沈澱物を分
離し、このものを凍結乾燥して乾燥品を得た。
【００２３】上記乾燥品１０ｍｇをマクイルベイン氏緩
衝液（ｐＨ6.０）５ｍｌに５時間浸漬した後、アルコー
ル脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）を総活性で５０
ユニット（Ｕ）になるように添加し、浸漬液量を５０ｍ
ｌにした後、浸漬液をマグネティックスターラーで攪拌
（５０ｒｐｍ）しながら４℃で保存した。保存開始時、
３日後および５日後に液の一部をサンプリングし、液中
のＡＤＨ活性を測定した。なお、活性の測定は、Agric.
Biol. Chem., ４２巻，２３３１〜２３４０頁、１９７
８年記載の方法で行った。また、ＡＤＨはアセトバクタ
ー・アセチＩＦＯ３２８４株からAgric. Biol. Chem.，
４２巻，２３３１〜２３４０頁、１９７８年記載の方法
で精製し、比活性１９０Ｕ／ｍｇ蛋白質のものを用い
た。また、対照として、上記Hestrin-Schramm 培地（グ
ルコース2.０ｇ，バクトペプトン（ディフコ社製）0.５
ｇ，酵母エキス（ディフコ社製）0.５ｇ，クエン酸0.１
１５ｇ，リン酸水素二ナトリウム0.２７ｇ，蒸留水１０
０ｍｌ，ｐＨ６.0 )で上記と同様な方法で培養し、生成
物を同様にして精製し、さらにホモゲナイズ処理した
後、凍結乾燥した微生物セルロース（通常のβ−１，４
−グルカン）を調製した。
衝液（ｐＨ6.０）５ｍｌに５時間浸漬した後、アルコー
ル脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）を総活性で５０
ユニット（Ｕ）になるように添加し、浸漬液量を５０ｍ
ｌにした後、浸漬液をマグネティックスターラーで攪拌
（５０ｒｐｍ）しながら４℃で保存した。保存開始時、
３日後および５日後に液の一部をサンプリングし、液中
のＡＤＨ活性を測定した。なお、活性の測定は、Agric.
Biol. Chem., ４２巻，２３３１〜２３４０頁、１９７
８年記載の方法で行った。また、ＡＤＨはアセトバクタ
ー・アセチＩＦＯ３２８４株からAgric. Biol. Chem.，
４２巻，２３３１〜２３４０頁、１９７８年記載の方法
で精製し、比活性１９０Ｕ／ｍｇ蛋白質のものを用い
た。また、対照として、上記Hestrin-Schramm 培地（グ
ルコース2.０ｇ，バクトペプトン（ディフコ社製）0.５
ｇ，酵母エキス（ディフコ社製）0.５ｇ，クエン酸0.１
１５ｇ，リン酸水素二ナトリウム0.２７ｇ，蒸留水１０
０ｍｌ，ｐＨ６.0 )で上記と同様な方法で培養し、生成
物を同様にして精製し、さらにホモゲナイズ処理した
後、凍結乾燥した微生物セルロース（通常のβ−１，４
−グルカン）を調製した。
【００２４】測定結果を第２表に示す。なお、保存期間
中の酵素の自然失活をＡＤＨ５０Ｕ／５０ｍｌ溶液の相
対活性で示した。微生物セルロースは酵素溶液と同様の
相対活性の経時変化を示す。ＡＤＨの固定化は殆どなさ
れていない。一方、分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基を含むβ−１，４−グルカンの場合は、３日後にＡ
ＤＨの１5.８％を固定化しており、５日後においても２
7.６％という高い固定化率を示した。このことから、一
旦吸着した酵素は担体から溶出せず、安定して固定化し
ていることが分かる。
中の酵素の自然失活をＡＤＨ５０Ｕ／５０ｍｌ溶液の相
対活性で示した。微生物セルロースは酵素溶液と同様の
相対活性の経時変化を示す。ＡＤＨの固定化は殆どなさ
れていない。一方、分子中にＮ−アセチルグルコサミン
残基を含むβ−１，４−グルカンの場合は、３日後にＡ
ＤＨの１5.８％を固定化しており、５日後においても２
7.６％という高い固定化率を示した。このことから、一
旦吸着した酵素は担体から溶出せず、安定して固定化し
ていることが分かる。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【発明の効果】本発明の新規β−１，４−グルカンを含
有する担体は、従来の微生物セルロースに比べて蛋白質
固定化能、吸着能が優れており、クロマトグラフィー用
担体並びに蛋白質固定化用担体として有効に利用するこ
とができる。
有する担体は、従来の微生物セルロースに比べて蛋白質
固定化能、吸着能が優れており、クロマトグラフィー用
担体並びに蛋白質固定化用担体として有効に利用するこ
とができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｔ 30/88 Ｊ // Ｃ０７Ｋ 17/12 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:02） (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132 (72)発明者 戸倉 清一 北海道札幌市西区八軒５条西４丁目１番地 の13
Claims (4)
- 【請求項１】 分子中にＮ−アセチルグルコサミン残
基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−ア
セチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン
を含有してなるクロマトグラフィー用担体。 - 【請求項２】 分子中にＮ−アセチルグルコサミン残
基またはＮ−アセチルグルコサミン残基およびＮ−ア
セチルガラクトサミン残基を含むβ−１，４−グルカン
を含有してなる蛋白質固定化用担体。 - 【請求項３】 分子中にグルコサミン残基またはグ
ルコサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなるクロマトグラフィー用
担体。 - 【請求項４】 分子中にグルコサミン残基またはグ
ルコサミン残基およびガラクトサミン残基を含むβ−
１，４−グルカンを含有してなる蛋白質固定化用担体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6090732A JPH07275698A (ja) | 1994-04-06 | 1994-04-06 | クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6090732A JPH07275698A (ja) | 1994-04-06 | 1994-04-06 | クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07275698A true JPH07275698A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=14006746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6090732A Pending JPH07275698A (ja) | 1994-04-06 | 1994-04-06 | クロマトグラフィー用または蛋白質固定化用担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07275698A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818469A2 (en) * | 1996-07-11 | 1998-01-14 | Ensuiko Sugar Refining Company, Limited | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| WO1999061482A1 (en) * | 1998-05-28 | 1999-12-02 | Trustees Of Tufts College | Production of chitosan- and chitin-like exopolymers |
-
1994
- 1994-04-06 JP JP6090732A patent/JPH07275698A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0818469A2 (en) * | 1996-07-11 | 1998-01-14 | Ensuiko Sugar Refining Company, Limited | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| EP0818469A3 (en) * | 1996-07-11 | 1998-08-05 | Ensuiko Sugar Refining Company, Limited | Branched cyclodextrins and method for producing them |
| WO1999061482A1 (en) * | 1998-05-28 | 1999-12-02 | Trustees Of Tufts College | Production of chitosan- and chitin-like exopolymers |
| US6534294B1 (en) | 1998-05-28 | 2003-03-18 | Trustees Of Tufts College | Production of chitosan-and chitin-like exopolymers |
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