DE69718244T2 - Chemische Phosphorylierung von Oligonukleotiden und Reagenz dafür - Google Patents
Chemische Phosphorylierung von Oligonukleotiden und Reagenz dafürInfo
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Description
- Oligonukleotide, die 5'-Phosphatgruppen besitzen, sind für viele Zwecke brauchbar. Zum Beispiel sind diese Oligonukleotide wertvolle Werkzeuge für die Genkonstruktion (Modrich et al., J. Biol. Chem., 1973, 248, 7502-7511); das Klonieren (Sambrook et at., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); die Mutagenese (Fritz, DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985, 1, 151-163); die Ligierungs-Kettenreaktion (Barany, PCR Methods and Applications, 1991, I, 5-16); und viele andere biologische Anwendungen. Häufig werden solche Oligonukleotide durch eine T4-Kinase-katalysierte Phosphorylierung hergestellt, bei der Adenosin-5'-triphosphat als Phosphatquelle eingesetzt wird (Sambrook et at., supra.).
- Es ist eine Reihe von Verfahren beschrieben worden, welche eine chemische 5'-Phosphorylierung von vorher zusammengesetzten Oligonukleotid-Vorstufen ermöglichen. Einige von ihnen umfassen die Herstellung von auf modifizierten Nukleosiden basierenden Bausteinen, die in der letzten Stufe der Oligonukleotid-Synthese angelagert werden (Bannwarth et al., Helv. Chim. Acta, 1990, 73, 1139-1147; und Tanaka et al., Nucleic Acid Chem., Wiley: N.Y., 1991, 4, 314-319). Eine andere Strategie, die auf nicht nukleosidischen Bausteinen beruht, scheint allgemeiner zu sein, da ein einziges Reagens eingesetzt werden kann. Es wurde eine Reihe von Vorgehensweisen ausgearbeitet, die mit Phosphotriester (Gorn et al., Bioorg. Khim. (Moskau), 1986, 92, 1054-1063), H-Phosphonat (Gaffney et al., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 2619-2622; und Marsters et al., Nucleosides Nucleotides, 1990, 9, 1079-1086), Methylphosphonamidit (Bhan, Tetrahedron Lett., 1944, 35, 4905-4898), oder Phosphoramidit (Horn et al., DNA, 1986, 5, 421-426; Wosnick et al., Gene, 1987, 60, 115-127; und Robertson et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 9649-9660) -Chemie vereinbar sind.
- Alle diese Vorgehensweisen leiden an dem gleichen Mangel: die Effizienz der abschließenden Kupplung kann nicht durch eine Dimethoxytritylreaktion überwacht werden. Um dieses Problem zu beseitigen, wurde ein Baustein eingeführt, der von (4,4'-Dimethoxytrityloxyethyl)hydroxyethylsulfon abgeleitet ist (Hom et al., Tetrahedron Letters, 1986, 27, 4705-4708). Siehe auch US-Patent Nr. 5,252,760. Nach der Beendigung des letzten Kettenverlängerungsschritts besitzt das 5'-derivatisierte Oligonukleotid eine 5'-terminale Verbindungsgruppe (tether), die eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe enthält. Diese Gruppe kann verwendet werden, um die Kupplungsausbeute durch einen herkömmlichen Dimethoxytrityl-Test zu bestimmen. Eine ammonolytische Entfernung der Schutzgruppe führt jedoch zu einer β-Eliminierung des O-phosphorylierten Hydroxyethylsulfonfragments und folglich geht die Dimethoxytritylgruppe bei der Freisetzung der 5'-Phosphatgruppe verloren. Folglich ist die Durchführung einer Dimethoxytrityl-spezifischen Isolie¬ rung des Oligonukleotids ausgeschlossen.
- Es ist bekannt, dass eine präparative Umkehrphasen ("RP") -Abtrennung von Oligonukleotid-5'-phosphaten von dem entsprechenden nicht phosphorylierten Material häufig nicht erfolgreich ist. Die Verwendung einer effizienteren Ionenaustauschchromatografie ist wiederum durch die Länge des zu isolierenden DNA-Fragments beschränkt. Deshalb wird Vorgehensweisen, welche eine selektive Isolierung des gewünschten Oligonukleotids ermöglichen, besonderes Interesse entgegen gebracht.
- Es wurde eine Gruppe von Verfahren ausgearbeitet, die alle eine "orthogonale" Schutzstrategie des 5'-terminalen Phosphats beinhalten. Nach dem Zusammensetzen der Kette und der ammonolytischen Schutzgruppenentfernung bleibt der orthogonale Schutz des 5'-Phosphats [t-Butyl (Coe et al., Chem. Ind., 1989, 724-725; und Sekine et al., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 395-398), (4-Nitrophenyl)ethyl (Uhlmann et al., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 1023-1026; Uhlmann et al., J. Chem. Scr., 1986, 26, 217-219; Schwarz et al., Nucleosides Nucleotides, 1987, 6, 537-539; und Bower et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3531-3547), 2-(Tritylthio)ethyl (Connolly et al., Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485-4502; und Connolly; Tetrahedron Lett., 1987, 28, 463-466) oder 2-(Triphenylsilyl)ethyl (Celebusky ef al., J. Org. Chem. 1992, 57, 5535-5538)] unverändert. Die t- Butyl- und (4-Nitrophenyl)ethyl-Schutzgruppen, die eine mäßige Hydrophobie aufweisen, ermöglichen eine effiziente Trennung nur für relativ kurze Oligonukleotide. Im Gegensatz dazu sind die 2-(Tritylthio)ethyl- oder 2-(Triphenylsilyl)ethyl-Gruppen hydrophober als die Dimethoxytritylgruppe und folglich können die gewünschten Oligonukleotide durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie ("RP-HPLC") oder Umkehrphasen-Kartuschen-Reinigung sehr selektiv isoliert werden. Nach der Reinigung wird der freie 5'-Phosphatmonoester durch Behandlung mit einem geeigneten Reagenz, wie etwa Trifluoressigsäure oder Trimethylsilylchlorid für t-Bu; starkes Amin (DBU, TBD und andere) für (4-Nitrophenyl)ethyl; oder 2 M Bu&sub4;NF/DMSO bei 70ºC für 2-(Triphenylsilyl)¬ ethyl freigesetzt. In dieser Hinsicht bietet die 2-(Tritylthio)ethylgruppe die mildeste Schutzgruppenentfernungsmethode. Um das 5'-Phosphat zu erhalten, wurde die Trityl- S-Bindung durch wässriges Silbernitrat oder Iod selektiv gespalten. Die nachfolgende Zugabe von Dithiothreitol bei pH 8,5 erzeugt in beiden Fällen ein Mercaptid-Ion, welches rasch zu dem angestrebten Oligonukleotid-5'-phosphat und Ethyfensulfid abgebaut wird.
- Es gibt auf dem Fachgebiet einen Bedarf für Reagenzien und ein effizientes Verfahren zum Herstellen von hochreinen phosphorylierten Oligonukleotiden. Vorzugsweise würde dieses Verfahren Reagenzien verwenden, die allgemein erhältlich sind und in der DNA- Synthese verwendet werden.
- Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, Reagenzien und ein Verfahren für die chemische Phosphorylierung von Oligonukleotiden bereit zu stellen. Die Erfindung umfasst Phosphoramidit-Bausteine gemäß der folgenden Formel 1, welche z. B. zum Phosphorylieren von Oligonukleotiden am 5'- oder 3'-Ende verwendet werden können. Zu geeigneten erfindungsgemäßen Verbindungen gehören Phosphoramidit-Verbindungen gemäß Formel 1
- wobei: DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist,
- R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig eine Amidgruppe sind,
- R&sub3; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, und
- R&sub4; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, welche gleich oder verschieden von der R&sub3;-Gruppe sein kann.
- Der Begriff "Alkylgruppe" bedeutet so, wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, einen geradkettigen oder verzweigten organischen Bestandteil mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise hat die Alkylgruppe zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatomen. Isopropyl- Bestandteile sind besonders bevorzugte Alkylgruppen für R&sub3; und R&sub4;.
- R&sub1; und R&sub2; können die gleichen oder verschiedene Bestandteile sein und können jede geeignete Amidgruppe sein. Zu besonders bevorzugten Amidgruppen gehören -CN- Gruppen, -CON(Me)&sub2;-Gruppen und -CONHMe-Gruppen, wobei Me eine Methylgruppe bedeutet.
- Zu spezifischen erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Bausteinen gehören Phosphoramidite mit den folgenden Strukturen:
- wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist; und
- wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist.
- Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Herstellen von im Wesentlichen reinen Oligonukleotiden mit einer Phosphatgruppe am 3'- oder 5'-Ende. Der Begriff "im Wesentlichen rein" ist in diesem Fachgebiet ein relativer Begriff, der von verschiedenen Faktoren, wie etwa der Oligonukleotid-Kettenlänge abhängt. Das Verfahren der Erfindung kann zum Herstellen von Oligonukleotiden mit hoher Reinheit, wie etwa 75% Reinheit oder höher verwendet werden. Vorzugsweise beträgt die Produktreinheit 80%, 90% oder sogar 95% oder höher bei Verwendung des Verfahrens der Erfindung.
- Das Verfahren der Erfindung umfasst das Umsetzen eines trägergebundenen 4,4'- Dimethoxytrityl-geschützten Oligonukleotids der Formel:
- wobei DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und S ein Trägermaterial ist, mit einem Phosphoramidit der Formel 1:
- wobei: DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist,
- R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig eine Amidgruppe sind,
- R&sub3; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, und
- R&sub4; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, welche gleich oder verschieden von der R&sub3;-Gruppe sein kann,
- um ein phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel zu bilden:
- Phosphoramidit-Materialien wie etwa die vorstehend beschriebenen können in dieser Phosphorylierungsreaktion verwendet werden. Nach der Phosphorylierung wird das phosphorylierte Oligonukleotid von dem Trägermaterial abgespalten, um ein ungebundenes phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel bereit zu stellen:
- Dieses Material wird isoliert, die DMTr-Gruppe wird entfernt, um ein phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel zu bilden:
- anschließend wird die
- Seitenkette an dem phosphorylierten Oligonukleotid entfernt, um ein Oligonukleotid der folgenden Formel bereit zu stellen, das eine Phosphatgruppe am 5'-Ende aufweist:
- Das vorstehend gezeigte ungebundene phosphorylierte Oligonukleotid kann durch jedes geeignete Verfahren isoliert werden, das Fachleuten bekannt ist. Zum Beispiel kann eine Umkehrphasentrennmethode wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie zum Isolieren des ungebundenen phosphorylierten Oligonukleotids verwendet werden.
- Jedes geeignete Trägermaterial, das im Fachgebiet bekannt ist, wie etwa die im US- Patent Nr. 5,252,760 beschriebenen Trägermaterialien können als Träger für das Oligonukleotid-Ausgangsmaterial verwendet werden, ohne von der Erfindung abzuweichen. Zu Beispielen für geeignete Trägermaterialien gehören Siliciumdioxid, Controlled-Pore- Glas, lartgkettiges Alkylamino-Controlled-Pore-Glas und Polystyrol. Außerdem kann jedes geeignete Oligonukleotid gemäß dem Verfahren der Erfindung phosphoryliert werden. Zu geeigneten Oligonukleotiden gehören Oligonukleotide mit einer Nukleotidkette von ungefähr 2 bis ungefähr 200 Nukleotidmonomer-Komponenten, vorzugsweise ungefähr 2 bis ungefähr 100 Monomeren.
- Die vorteilhaften Merkmale der Erfindung wird man besser zu würdigen wissen, wenn sie auf der Grundlage der folgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Abbildungen betrachtet werden, wobei:
- Fig. 1 ein RP-HPLC-Profil von Verbindung 13 in ihrer ungereinigten Form ist;
- Fig. 2 ein RP-HPLC-Profil von Verbindung 14 in ihrer ungereinigten Form ist; und
- Fig. 3 ein Ionenaustauschprofil von Verbindung 11b in ihrer ungereinigten Form ist.
- Diese Erfindung bezieht sich auf eine neue Vorgehensweise zum Herstellen von phosphorylierten Oligonukleotiden unter Verwendung von Phosphoramidit-Bausteinen gemäß der Erfindung. Oligonukleotide, die am 3'- oder 5'-Ende phosphoryliert sind, können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bausteine hergestellt werden. Die Bausteine der Erfindung umfassen Phosphoramidit-Verbindungen der Formel 1:
- wobei: DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist,
- R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig eine Amidgruppe sind, und
- R&sub3; und R&sub4; C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppen sind
- Geeignete Amidgruppen umfassen CN-Gruppen, -CON(Me)&sub2;-Gruppen und -CONHMe- Gruppen, wobei "Me" ein Methylsubstituent ist. Verschiedene Alkylgruppen, wie sie vorstehend beschrieben sind, können als die R&sub3;- und R&sub4;-Gruppen gemäß der Erfindung verwendet werden. Eine geeignete Alkylgruppe ist eine Isopropylgruppe.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nicht auf die in Formel 1 veranschaulichten beschränkt. Wenn auch die 4,4'-Dimethoxytritylgruppe (DMTr) bevorzugt ist, können z. B. andere geeignete Substituentengruppen die DMTr-Gruppe ersetzen. Diese DMTr- Gruppe kann z. B. durch jede der Substituentengruppen ersetzt werden, die durch die Variable "R&sub1;" in US-Patent Nr. 5,252,760 beschrieben sind. Desgleichen können die Varablen R&sub3; und R&sub4; in Formel 1 auf die gleiche Weise wie die Variablen "T¹" und "T²" in US-Patent Nr. 5,252,760 definiert werden. Außerdem kann die "-CH&sub2;CH&sub2;CN"-Gruppe, die in Formel 1 gezeigt ist, durch die Substituenten ersetzt werden, die als Variable "D" in US-Patent Nr. 5,252,760 beschrieben sind. US-Patent Nr. 5,252,760, einschließlich der Definitionen von R&sub1;, T¹, T² und D.
- Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Phosphorylieren eines Oligonukleotids unter Verwendung der Bausteine der Erfindung. Für eine Phosphorylierung am 5'-Ende wird ein 4,4'-Dimethoxytrityl-geschütztes Oligonukleotid auf einem Träger mit dem Phosphoramidit-Baustein von Formel 1 im Anschluss an eine Detritylierung mittels Säure umgesetzt. Nach dieser Reaktion ergibt eine Ammonolyse ein DNA- Fragment, das an der 5'-Phosphatgruppe mit einer dimethoxytritylierten Verbindungs¬ gruppe selektiv geschützt ist. Zu diesem Zeitpunkt kann das modifizierte Oligonukleotid von kürzeren bzw. verkürzten Verunreinigungen durch Umkehrphasen-HPLC leicht abgetrennt werden, so dass ein hochgereinigtes Oligonukleotid-haltiges Produkt erhalten wird. Eine anschließende Detritylierung und kurze Behandlung mit Ammoniak erzeugt die 5'-Phosphatgruppe mit mehr als 98% Ausbeute. Somit ist das Verfahren der Erfindung vorteilhaft, da es nur solche zusätzlichen Reagenzien erfordert, die in der DNA- Synthese jeden Tag verwendet werden, aber dennoch ein phosphoryliertes Oligonukleotid-Produkt mit hoher Reinheit erzeugt. Als alternative erfindungsgemäße Arbeitsweise kann das Produkt der letzten Kupplung durch Detritylierung des Oligonukleotids quantifiziert werden, das noch immer mit dem festen Träger verankert ist. Die Entfernung der Schutzgruppen führt in diesem Fall direkt zu dem angestrebten 5'-phosphorylierten DNA-Fragment.
- Die erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Bausteine können auch für eine Phosphorylierung am 3'-Ende verwendet werden. Bei dieser Arbeitsweise wird der Phosphoramidit- Baustein 1 als erste Addition an einen Nukleosidträger eingeführt, gefolgt von einer normalen Synthese des angestrebten Oligonukleotids. Nach der Synthese des angestrebten Oligonukleotids spaltet eine Standard-Schutzgruppenentfernung mittels Ammoniumhydroxid die Bindung an den Nukleosidträger, so dass das angestrebte Molekül mit einer Phosphatgruppe am 3'-Ende erhalten wird Alternativ kann ein Träger von der Art
- für eine direktere Synthese von 3'-phoshorylierten DNA-Fragmenten direkt hergestellt werden.
- Die Erfindung wird nun genauer beschrieben und zwar mit Hilfe von verschiedenen Reaktionsschemata und Beispielen. Diese spezifischen Schemata und Beispiele sollten so verstanden werden, dass sie die beanspruchte Erfindung erläutern, und nicht, dass sie die Erfindung beschränken.
- Die erfindungsgemäßen Phosphoramidit-Bausteine können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt werden. Im Folgenden sind Methoden zum Herstellen von spezifischen Phosphoramiditen beschrieben. Unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden können Fachleute eine große Zahl von anderen Phosphoramidit-Bausteinen durch routinemäßiges Experimentieren herstellen.
- Ein erstes Schema zum Herstellen eines Phosphoramidit-Bausteins gemäß Formel 1 ist in Schema 1(a) beispielhaft angegeben. Dieser Baustein ist ein Di-ester (d. h., er enthält Estersubstituenten an R&sub1; und R&sub2;). Schema 1 (a):
- i: a) DMTrCl/Py; b) Et&sub3;N/H&sub2;O; ii: a) (2-Cyanoethyl)-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit/1H-Tetrazol; b) NaHCO&sub3;/H&sub2;O. DMTr ist 4,4'- Dimethoxytrityl.
- Das Ausgangsmaterial Diethyl-2,2-bis(hydroxymethyl)malonat, 2(a), ist im Handel erhältlich. Alternativ kann es aus Diethylmalonat mit einer Ausbeute von 75% so hergestellt werden, wie es in Block Jr, P. Org. Synth., 1960, 40, 27-28; oder Coll. Bd. 5, 381- 383 beschrieben ist. Eine der Hydroxygruppen wurden wurde 4,4'-dimethoxytrityliert und das Produkt, 3(a), wurde durch Säulenchromatografie isoliert. Das DMTr-Produkt 3(a) wurde anschließend durch eine Behandlung mit (2-Cyanoethyl)-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (siehe Nielsen et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3626) in Gegenwart von 1H-Tetrazol in den Phosphoramidit-Baustein 1(a) umgewandelt. Nach einer wässrigen Aufarbeitung wurde die Verbindung 1(a) in reiner Form durch Fällung aus Toluol in Hexan erhalten.
- Die Herstellung eines Diamin-enthaltenden Phosphoramidit-Bausteins der Formel 1 ist in diesem Schema beispielhaft angegeben.
- i: (EtO)&sub3;CH/H&sub2;SO&sub4;/Dioxan; ii: 40%iges wässriges Methylamin; iii: a) 80%ige wässrige Essigsäure; b) 10% Triethylamin in MeOH; iv: DMTr-Cl/Pyridin; v: 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit/1H-Tetrazol/Acetonitril.
- Diethyl-2,2-bis(hydroxymethyl)malonat 2(b), das im Handel erhältlich ist oder wie vorstehend in Schema 1(a) beschrieben bereit gestellt wird, wurde wie zuvor in Guzaev et al., Biconjugate Chem., 1966, 7, 240-248 beschrieben mit Triethylorthoformiat in Dioxan in Gegenwart einer katalytischen Menge von Schwefelsäure behandelt, um die Verbindung 3(b) herzustellen. Dieses Produkt 3(b) wurde durch Vakuumdestillation isoliert. Die Verbindung 3(b) wurde mit 40%igem wässrigen Methylamin bei Umgebungstemperatur umgesetzt, um das Di(N-methylamid)-Produkt, Verbindung 4(b), herzustellen, welche durch Umkristallisierung aus einem Gemisch aus Hexan und Isopropanol mit 70% Ausbeute isoliert wurde. Die Verbindung 4(b) wurde mit 80%iger wässriger Essigsäure umgesetzt, gefolgt von einer Behandlung von 10% Ethylamin in Dioxan, um das Diol 5(b) zu erhalten, welches durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in Pyridin in das Mono(4,4'-dimethoxytrityl)-Derivat 6(b) umgewandelt wurde (Schmelzpunkt 162-162,5ºC aus Acetonitril). Schließlich wurde die Verbindung 6(b) mit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'- tetraisopropylphosphordiamidit in Gegenwart von 1H-Tetrazol behandelt, wobei das Phosphoramidit-Reagenz 1(b) mit 95% Ausbeute erhalten wurde. Das Phosphoramidit 1(b) wurde durch Säulenchromatografie an Silicagel als weißer Schaum isoliert.
- Die Kompatibilität des Phosphoramidits 1(a) in der Oligonukleotid-Synthese sowie wie die Brauchbarkeit der resultierenden DNA-Fragmente bei der Erzeugung von Oligonukleotid-5'-phosphaten wurden untersucht. In Schema 2, das nachstehend veranschaulicht ist, wurde festgestellt, dass ein 5'-terminales Phosphat mit einem anderen Molekül unter Verwendung einer Phosphoramiditverbindung gekuppelt werden konnte. Schema 2:
- i. a) DCA/CH&sub2;Cl&sub2;; 1(a)/1H-Tetrazol; c) I&sub2;/Py/H&sub2;O/THF; ii: a) DCA/CH&sub2;Cl&sub2;; b) NH&sub3;H&sub2;O; iii: NH&sub3;H&sub2;O; Base: NH&sub3;-H&sub2;O, MeNH&sub2;, 1,3-Propandiamin. "S" bedeutet einen festen Träger. "T" bedeutet Thymidin.
- Zunächst wurde unter Verwendung eines Standardkupplungsprotokolls (Schritt i) ein im Handel erhältlicher Thymidin-("T")-derivatisierter fester Träger ("S") (0,2 umol) detrityliert, mit Verbindung 1(a) (0,1 M in MeCN) und überschüssigem 1H-Tetrazol behandelt und mit Iodlösung oxidiert, um die Verbindung 4 herzustellen. Die Messung der Kupplungseffizienz durch herkömmliche Schutzgruppenentfernung mit 3% Dichloressigsäure ("DCA") in Methylendichlorid (Schritt ii (a)) zeigte, dass die Detritylierungsreaktion in 5 Minuten beendet war. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Kupplungsausbeute zufriedenstellend war (99%). Eine nachfolgende Ammonolyse (Schritt ii (b)) ergab ein Desoxynukleotid-Derivat, welches mit handelsüblichen Proben von Thymidin und Thymidin- 5'-phasphat durch Ionenaustausch und RP-HPLC verglichen wurde. Diesen Vergleichen zufolge bestand das Reaktionsgemisch aus 99% Thymidin-5'-phosphat, 7, und 1% Thymidin. Das Verhältnis von Ausgangsmaterial und Produkt stimmte mit dem Ergebnis des Dimethoxytrityl-Tests überein.
- Die nächste Frage war, herauszufinden, welcher Schritt des Schutzgruppenentfernungsverfahrens für die Umwandlung des eine 5'-Verbindungsgruppe enthaltenden Desoxynukleotids in das 5'-Phosphat verantwortlich war. Zunächst wurde festgestellt, dass die Produktmuster sich in Abhängigkeit davon, ob das Oligonukleotid eine 5'- terminale Dimethoxytritylgruppe trug, signifikant unterschieden, wenn es einer Ammonolyse unterworfen wurde. Die Bildung von Verbindung 7 wurde nur beobachtet, wenn der feste Träger 4 vor der abschließenden Schutzgruppenentfernung detrityliert wurde. Im Gegensatz dazu wurde das Konjugat 5 erhalten, wenn die Verbindung 4 mit der noch immer dimethoxytritylierten 5'-OH-Gruppe freigesetzt wurde und mit konzentriertem wässrigen Ammoniak, Methylamin oder 1,3-Propandiamin die Schutzgruppe entfernt wurde (Schritt iii). Seine Struktur wurde wie folgt festgestellt: (i) die Behandlung mit allen drei Aminen ergab Produkte, welche an einer RP-Säule koeluierten; und (ii) die Produkte, die durch die Entfernung der Schutzgruppe von Verbindung 4 (10-25 umol) mittels Ammoniak und Methylamin erhalten wurden, wiesen ¹H-NMR-Signale von Thymidin und dem nichtnukleosidischen Bestandteil 3(a) auf. Die Stabilität der Estergruppen in Verbindung 5 gegenüber einer Ammonolyse und Aminolyse ist ziemlich unerwartet und steht im Gegensatz zu dem bekannten Verhalten der Alkylesterfunktion unter ähnlichen Bedingungen (siehe Hovinen et al., Tetrahedron, 1994, 50, 7203-7218; und Ramalingam et al., Tetrahedron 1995, 51, 2875-2894). Die Detritylierung von Verbindung 5 mit 80%iger wässriger Essigsäure ("AcOH") während 30 Minuten führte zu Verbindung 6 mit 91% Ausbeute, welche durch ¹H und ³¹P-NMR charakterisiert wurde.
- Es wurde festgestellt, dass der Phosphodiester 6 unter neutralen Bedingungen stabil war. Wenn er jedoch mit einer verdünnten Base behandelt wurde, verwandelte er sich rasch in Thymidin-5'-phosphat 7. Um die Halbwertszeit dieser Reaktion in dem basischen Medium abzuschätzen, wurden verschiedene Experimente durchgeführt, bei denen abnehmende Konzentrationen von verschiedenen wässrigen Aminen: Ammoniak, Methylamin und n-Butylamin verwendet wurden. Die Reaktion war zu schnell, um durch RP-HPLC in 1,0 und 0,1 M wässrigen Lösungen dieser Amine bei Umgebungstemperatur verfolgt zu werden (> 95% Umwandlung in 15 Minuten). In 0,01 M wässrigem n-Butylamin wurde festgestellt, dass die Halbwertszeit ungefähr 15 Minuten betrug, und es wurde eine Reihe von Zwischenprodukten in dem Reaktionsgemisch nachgewiesen. Keines von ihnen sammelte sich in einem merklichen Ausmaß an und die Reaktion verlief gleichmäßig und war nach 3 Stunden beendet. Unabhängig von dem eingesetzten Amin war die Ausbeute an Verbindung 7 wiederholt größer als 99,5%.
- Alternativ können anstelle von organischen Basen und Aminbasen anorganische Basen wie etwa Natriumhydroxid (z. B. 0,1 M) verwendet werden, um den Phosphodiester 6 in die phosphorylierte Verbindung 7 umzuwandeln.
- Da die Ergebnisse von Beispiel 2 ein bequemes Verfahren für die 5'-terminale Phosphorylierung von Oligonukleotiden anzubieten schienen, wurden sie durch Anwenden des Phosphoramidit 1(a) in einer DNA-Synthese überprüft. Das Gesamtreaktionsschema ist nachstehend veranschaulicht. Schema 3:
- i: a) 1(a)/1H-Tetrazol; b) I&sub2;/H&sub2;O/Py/THF; ii: 3% Dichloressigsäure/CH&sub2;Cl&sub2;. R ist H, CH&sub3; oder n-C&sub4;H&sub9;.
- Ein geschütztes Oligonukleotid 5'-GAACATCATGGTCGT-3' (8) wurde an einem handelsüblichen festen Träger durch im Fachgebiet bekannte herkömmliche Methoden zusammengesetzt. Das Phosphoramidit 1(a) wurde mit Verbindung 8 umgesetzt und an ihrem 5'-Ende gebunden, um Verbindung 9 zu erhalten. Wenn das Standardprotokoll eingesetzt wurde (0,1 M Verbindung 1(a) in Acetonitril, Kupplungszeit 25 Sekunden), wurde festgestellt, dass die Kupplungsausbeute mehr als 98% betrug. Diese Ausbeute war mit der mit herkömmlichen Phosphoramiditen erhaltenen Ausbeute vergleichbar.
- Die Entfernung der Schutzgruppe von dem verankerten Oligonukleotid 9 kann durch zwei Mechanismen erfolgen und führte im Allgemeinen zu den gleichen Ergebnissen, die mit Verbindung 4 beobachtet wurden (Schema 2). In dem einen Reaktionsmechanismus wurde Verbindung 9 mit 3% DCA in Methylendichlorid behandelt (Schritt ü), um die Verbindung 12 zu erhalten, ein Material, dessen DMTr-Gruppe entfernt war. Wenn die Synthese in diesem DMTr-freien Modus durchgeführt wurde (abschließende Detritylierung während 5 Minuten), wandelte sich das teilweise geschützte Oligonukleotid 12 während der Schutzgruppenentfernung mittels Base (z. B. mit wässrigem Ammoniak) in das 5'-phosphorylierte Derivat 11b um.
- Alternativ dazu führte in dem anderen Reaktionsmechanismus die Ammonolyse von Verbindung 9 zu einem stabilen DMTr-haltigen Derivat 13, welches durch RP-HPLC isoliert wurde, wobei ein hoch gereinigtes Produkt erhalten wurde. Das RP-HPLC-Profil von Verbindung 13 ist in Fig. 1 gezeigt.
- Die Detritylierung von Verbindung 13 unter wässrigen Bedingungen unterscheidet sich nicht merklich von der Detritylierung von nichtderivatisierten Oligonukleotiden. Dies steht im Gegensatz zu der außergewöhnlichen Beständigkeit des Dimethoxytrityl-geschützten 9 und seiner Analoga gegenüber einer Behandlung mit Dichloressigsäure in Methylendichlorid, wie sie vorstehend erwähnt ist. Eine herkömmliche Detritylierung (80%ige wässrige AcOH; 20 Minuten) verwandelt die Verbindung 13 in den entsprechenden Alkohol 14, welcher sich unter neutralen oder leicht sauren Bedingungen (pH 5-7) mehrere Tage lang als stabil erwies. Das Oligonukleotid 14 konnte entweder durch RP-HPLC (wie in Fig. 2 gezeigt ist) oder Ionenaustauschchromatografie erneut chromatografiert werden. Diese Arbeitsweise ist jedoch nicht routinemäßig erforderlich.
- Wenn sie mit verdünnter Base behandelt wurde, wurde die Verbindung 14 rasch in 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid 11b umgewandelt. Wiederum führte die Verwendung von wässrigem Ammoniak, Methylamin oder n-Butylamin in einer Konzentration von mehr als 0,1 M zur Bildung der Verbindung 11b mit einer Ausbeute von 98,5 bis 99,5% innerhalb von 15 Minuten. Das Ionenaustauschprofil von Verbindung 11b ist in Fig. 3 gezeigt. Die Reaktionsgemische enthielten 0,5 bis 1,5% eines nichtidentifizierten Oligonukleotids mit niedrigerer negativer Ladung und höherer Hydrophobie.
- Als Kontrollproben wurden nichtphosphoryliertes Oligonukleotid (10) und Oligonukleotid- 5'-phosphat (11a) mit der gleichen Sequenz hergestellt, um ihre Strukturen mit Verbindung 11b zu vergleichen. Um die Verbindung 11a zu synthetisieren, wurde das von Hom et al., (Tetrahedron Letters, 1986, 27, 4705-4708) angegebene Verfahren unter Verwendung von handelsüblichem Phosphoralink -Reagenz (erhältlich von Applied Biosystems, einer Abteilung der Perkin Elmer Corp., User Bulletin, 1994, 86) eingesetzt. Bei der herkömmlichen Schutzgruppenentfernung wurden die ungereinigten Reaktionsgemische durch Ionenaustausch und/oder RP-HPLC analysiert. Die beobachteten Retentionszeiten sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 - HPLC-Retentionszeiten (in Minuten) der hergestellten Oligonukleotide
- a. Was die Strukturen anbelangt siehe Schema 3.
- b. Was die Bedingungen anbelangt, siehe den Experimentalteil
- c. Hergestellt nach dem Verfahren von Horn, oben.
- d. Koeluierten, wenn sie gemeinsam injiziert wurden.
- e. Hergestellt unter Verwendung von Verbindung 1(a).
- Wie man aus dieser Tabelle ersehen kann, war das Oligonukleotid 11b, das durch die beiden Wege der Schutzgruppenentfernung hergestellt wurde, die in Schema 3 gezeigt sind, mit der authentischen Kontrollprobe 11a identisch.
- Somit ist es bei einer routinemäßigen Herstellung von Oligonukleotid-5'-phosphaten mehr als ausreichend, die Verbindung 9 zu reinigen und zu detritylieren, gefolgt von einer Behandlung der ungereinigten Verbindung 14 mit konzentriertem Ammoniak während 15 Minuten. Bei der Eindampfung des Reaktionsgemisches kann das gewünschte Produkt, Verbindung 11b, durch HPLC isoliert werden.
- Die Umwandlung von Verbindung 6 in Verbindung 7 und der Verbindungen 12 und 14 in 11b läuft in wässrigen Aminen sehr leicht ab. Es wurden keine Daten über die basenkatalysierten Reaktionen von Verbindung (2a) oder ihren Monoethern angegeben. Die Versuche der Anmelder, die Reaktivität der Verbindungen 6, 12 und 14 rational zu erklären, zeigten, dass die Verbindungen (2a) und 3(a) für die basischen Bedingungen extrem empfindlich sind. Zum Beispiel verschwand Verbindung 3(a) quantitativ innerhalb von 30 Minuten, wenn sie mit einer katalytischen Menge von n-Butylamin (0,1 Äq.) in wässrigem Pyridin behandelt wurde. Das einzige UV-absorbierende Produkt, das in dem Gemisch nachgewiesen wurde, war 4,4'-Dimethoxytritylalkohol (charakterisiert durch ¹H und ¹³C-NMR). O,O-Alkylidenderivate von Verbindung (2a) sind ihrerseits dafür bekannt, dass sie mit starkem Alkali gleichmäßig zu den entsprechenden Dicarboxylaten hydrolysiert werden, wobei der 1,3-Dioxan-Bestandteil intakt bleibt (siehe MacCorquodale et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. Il, 1991, 1893-1899; Hughes et al., J. Am. Chem. Soc., 1988,110, 7494-7499; und Bosies et al. Lipids, 1987, 22, 947-951). Entsprechend sind Dimercaptoanaloga von Verbindung (2a) sowohl in freier als auch in cyclischer Disulfidform gegenüber einer Behandlung mit 1,2-Ethandiamin beständig (siehe Teuber ef al., Acta Chemica Scand., 1988, B42, 629-634). Diese Beobachtungen veranschaulichen, dass die Gegenwart von mindestens einer ungeschützten Hydroxygruppe das 1,3-Propandiol-Fragment von Verbindung (2a) und ihren Derivaten sehr stark destabilisiert.
- Mechanistisch könnte das Phänomen als zweistufiges Verfahren erklärt werden. Zuerst könnte eine retrograde Aldolreaktion von Verbindung 15, welche ein Zwischenprodukt 16 erzeugt, unter basischen Bedingungen erfolgen (siehe nachstehendes Schema 4) (siehe auch March, Advanced Organic Chemistry-Reactions, Mechanisms and Structure, J. Wiley & Sons, N.Y., dritte Auflage, 1985, 829-834; und Conant, Org. Syntheses, Coll. Bd. 1, 199-201). Schema 4:
- R = H, DMTr oder Oligonukleotid; R' = H, CH&sub3; oder n-Butyl.
- Man kann davon ausgehen, dass das Verfahren, bei dem es sich um eine reversible Reaktion handelt, durch die Anwesenheit von primären Aminen oder Ammoniak gefördert werden sollte, welche in der Lage sind, den freigesetzten Formaldehyd einzufangen. Verbindung 16 sollte ihrerseits die Eliminierungsreaktion äußerst leicht eingehen, die zu Verbindung 17 führt, welche im vorliegenden Fall ein Oligonukleotid-5'-phosphat ist. Das andere Produkt kann dann versuchsweise als Diethylmethylenmalonat 18 bezeichnet werden. Schließlich könnte man davon ausgehen, dass das Amin eine konjugierte nukleophile 1,4-Addition mit Verbindung 18 eingeht unter Bildung der Verbindung 19 (siehe March, Advanced Organlc Chemistry-Reactions, Mechanisms and Structure, J. Wiley & Sons, N.Y., dritte Auflage, 1985, 689-691; und Casy et al., J. Chem. Soc. 1964, 4639-4640).
- Die Stabilität der Verbindungen 6, 12 und 14 unter sauren Bedingungen wird erwartet: es ist bekannt, dass Derivate der Verbindung (2a) schwachen Säuren standhalten. Yanagawa et al., Synthesis, 1973, 607-608; Cassady et al., Org. Syntheses, 1983, 61, 77- 82; Haynes et al., Aust. J. Chem., 1984, 37,1571-1578; und Singh et al., J. Am. Chem. Soc.; 1990, 112, 1190-1197. Nur wenn konzentrierte Lösungen von wässrigen Mineralsäuren angewandt werden, findet eine Hydrolyse der Esterbindung von Verbindung (2a), gefolgt von einer Decarboxylierung statt.
- Entsprechend zeigen die vorstehenden Beispiele, dass der nichtnukleosidische Baustein 1(a) die effiziente Herstellung von Oligonukleotid-5'-phosphaten gestattet, indem lediglich die Arbeitsweisen und zusätzlichen Reagenzien eingesetzt werden, die in der routinemäßigen DNA-Synthese verwendet werden. Die Vorstufe des Oligonukleotid-5'- phosphats enthält eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe und kann somit leicht durch RP- HPLC isoliert werden. Nachfolgende Behandlungen führen in weniger als einer Stunde zu dem angestrebten Oligonukleotid-5'-phosphat mit hoher Ausbeute.
- Die Brauchbarkeit des Dimethylamidphosphoramidit-Reagenzes 1(b) beim Herstellen von Oligonukleotiden, die an ihrem 5'-Ende phosphoryliert sind, wurde durch on-line- Phosphorylierung eines vorher zusammengesetzten synthetischen Oligonukleotids 20 gemäß Schema 5 überprüft. Schema 5
- i: DNA-Kondensationsschritt unter Verwendung von Phosphoramidit 1(b);
- ii: 3% Dichloressigsäure in Methylendichlorid.
- Das trägergebundene Oligonukleotid 20 kann durch Standardmethoden hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind. Als erster Schritt in diesem Reaktionsschema wurde die trägergebundene Verbindung 20 mit Verbindung 1(b) (0,1 M Lösung in Acetonitril) umgesetzt, um Verbindung 21 herzustellen. Es wurde festgestellt, dass das Reagenz 1(b) (0,1 M Lösung in Acetonitril) in der trockenen Acetonitrillösung mindestens eine Woche lang stabil war. Wenn es in dem Standardkupplungsprotokoll des ABI-DNA- Synthesegeräts (erhältlich von Applied Biosystems) verwendet wurde, wurde festgestellt, dass die Kupplungsausbeute von Verbindung 21 (mehr als 98%, bestimmt durch DMTr-Test) im Vergleich zu nukleosidischen Bausteinen unverändert war. Wenn eine abschließende Abspaltung der DMTr-Schutzgruppe von dem derivatisierten Oligonukleotid 21 mit dem Gerät durchgeführt wird, kann eine quantitative Detritylierung durch Verwendung des ABI-Detritylierungsprotokolls für Pyrimidinnukleoside erreicht werden.
- Ausgehend von Verbindung 21 kann einer von zwei unterschiedlichen Reaktionsmechanismen verfolgt werden, wie in Schema 5 gezeigt ist (d. h., die DMTr-haltige Arbeitsweise und die DMTr-freie Arbeitsweise). Die erhaltenen Ergebnisse, welche nachstehend erörtert werden, bestätigten die ausgezeichnete Kupplungseffizienz des Reagenzes 1(b) sowie die Stabilität des gebundenen nichtnukleosidischen Bestandteils in 21 gegenüber zusätzlichen Reagenzien der DNA-Synthese (z. B. die Endgruppenmischung (capping mixture) und Oxidationsmittelösung). Es wurde festgestellt, dass die Struktur in der Umgebung des 5'-Endes des resultierenden Oligonukleotids davon abhängig war, ob der nichtnukleosidische Bestandteil während der Ammonolyse DMTr-geschützt war. Dieses Merkmal geht auch aus der folgenden Erörterung der Reaktionsverfahren bzw. -arbeitsweisen deutlicher hervor.
- Für die DMTr-freie Arbeitsweise wurde die DMTr-Gruppe an dem 5'-derivatisierten Oligonukleotid 21 unter Verwendung von 3% DCA in Methylendichlorid entfernt, um die Verbindung 22 herzustellen. Die Ammonolyse der detritylierten Verbindung 22 (konzentriertes wässriges Ammoniak, 55ºC/8 Stunden) ging einher mit einer quantitativen Abspaltung des nichtnukleosidischen Bestandteils und der Entfernung des festen Trägers S, was direkt zu dem 5'-phosphorylierten Oligonukleotid 23 führt.
- Im Gegensatz dazu wurde in der DMTr-haltigen Arbeitsweise das 5'-derivatisierte Oligonukleotid 21 zunächst von seinem festen Träger S durch Ammonolyse unter Verwendung von konzentriertem wässrigen Ammoniak (55ºC/8 Stunden) abgespalten, um Verbindung 24 herzustellen. Die nichtnukleosidische Verbindungsgruppe blieb intakt, wenn ihre pseudo-5'-terminale Hydroxygruppe DMTr-geschützt blieb. Dies ermöglicht es, selektiv das modifizierte Oligonukleotid 24 durch DMTr-spezifische Chromatografie entweder an einer RP-HPLC-Säule oder manuell an einer RP-Kartusche zu isolieren. Nach der Isolierung kann die DMTr-Schutzgruppe an Verbindung 24 unter Standardbedingungen (80%ige wässrige Essigsäure, 15 Minuten bei Raumtemperatur) abgespalten werden und das Produkt 25 kann, falls dies erforderlich ist, entweder durch Ionenaustausch oder RP-HPLC isoliert werden.
- In basischen Medien ist Verbindung 25 im Stande, das 5'-phosphorylierte DNA-Fragment 23 zu bilden. Um die optimalen Bedingungen für die Abspaltung der nichtnukleosidischen Verbindungsgruppe zu finden, wurde das Oligonukleotid 25 mit einer Reihe von organischen Basen und anorganischen Alkalien behandelt. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Bedingungen für eine routinemäßige DNA-Synthese zweckmäßig sind: Tabelle 2 - Bedingungen der Spaltungsreaktion
- * entweder durch NaOH oder KOH eingestellt oder mit 50 mM K&sub2;CO&sub3; gepuffert auf pH 12.0.
- Aus dieser Tabelle kann man sehen, dass die Bedingungen, welche entweder Methylamin oder Ammoniak einsetzen (Einträge 1-3) für die Spaltungsreaktion in der Lösung gut geeignet sind, da die Reagenzien bequem durch Abdampfen entfernt werden können. Die zunehmende Verwendung von RP-Kartuschen für eine Schnellreinigung von synthetischen Oligonukleotiden erfordert jedoch etwas schnellere Reaktionsgeschwindigkeiten. Dies kann durch Anwendung von anorganischen Alkalien mit hoher bis mäßiger Ionenstärke (Einträge 4 und 5) erreicht werden. Ein weiterer Vorteil dieser Bedingungen ist, dass die hohe Konzentration von anorganischem Salz eine effiziente Aufbringung von relativ hydrophilen 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden auf das Packungsmaterial von RP-Kartuschen gewährleistet, welche eine nahezu quantitative Rückgewinnung des angestrebten Materials ermöglicht.
- Die RP-Kartuschen-Reinigung kann mittels der folgenden Arbeitsweise durchgeführt werden:
- 1. Eine Spritze wird mit dem Aufnahmestutzen der Kartusche verbunden und der Einführstutzen wird in einem weiten Gefäß enden gelassen.
- 2. Die Kartusche wird mit 2 ml Acetonitril, gefolgt von 2 ml 2 M TEAA (Triethylaminacetat, pH 7) gespült.
- 3. Im Anschluss an die Synthese wird die Schutzgruppe des DMTr-haltigen Oligonukleotids wie gewöhnlich in Ammoniumhydroxid entfernt. Für diesen Vorgang ist es nicht erforderlich, die Ammoniumhydroxidlösung zu lyophilisieren.
- 4. Es werden 3 Teile entionisiertes Wasser zu 1 Teil des DMTr-haltigen Oligonukleotids, dessen Schutzgruppe entfernt worden ist, in der Ammoniumhydroxidlösung zugegeben. Es können sich bis zu 10 ml Probenlösungen ergeben.
- 5. Die Probenlösung wird auf die Kartusche aufgegeben. Die eluierte Fraktion wird gesammelt und erneut durch die Kartusche geschickt. Anmerkung: die letzte eluierte Fraktion kann aufbewahrt und auf anderen Poly-Pak-Kartuschen gereinigt werden, bis das gesamte DMTr-haltige Oligonukleotid erschöpft ist.
- 6. Die Kartusche wird mit 3 ml Ammoniumhydroxid (1 : 20) für Oligos ≤ 35-mere oder Ammoniumhydroxid (1 : 10) für Oligos > 35-mere gespült.
- 7. Die Kartusche wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gespült.
- 8. Das trägergebundene Oligonukleotid wird durch Spülen der Kartusche mit 2 ml von 2% TFA (Trifluoressigsäure) detrityliert.
- 9. Die Kartusche wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gespült.
- 10. (Wahlfrei) für Oligos > 50-mere werden die Schritte 6 und 7 wiederholt.
- 11. Die Kartusche wird mit 2 ml Spaltungsreagenz gespült. Das Spaltungsreagenz wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Oligonukleotid auf der Kartusche in Kontakt gelassen.
- 12. Die Kartusche wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gespült.
- 13. Das gereinigte detritylierte Oligonukleotid wird durch Spülen der Kartusche mit 20% Acetonitril eluiert. Die eluierten Fraktionen werden gesammelt. Die ersten 4 Tropfen des Eluents können verworfen werden und das Produkt befindet sich normalerweise in den nächsten 4 bis 6 Tropfen.
- Alternativ können die Schritte 11 und 12 weggelassen werden und das Spaltungsreagenz kann zu dem Oligonukleotid im Anschluss an die Elution im Schritt 13 zugegeben werden.
- Dieser Experimentalteil liefert weitere Einzelheiten, welche bestimmte Reaktionsschemata und Arbeitsweisen betreffen. Die in diesem Abschnitt enthaltene Information sollte so verstanden werden, dass sie die Erfindung veranschaulicht und nicht beschränkt.
- Diethyl-2,2-bis(hydroxymethyl)malonat (Verbindungen (2a) und 2(b)) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (vor der Verwendung umkristallisiert) wurden von Aldrich gekauft. Reagenzien (Lösungsmittel, Aktivatoren usw.) für die Oligonukleotid-Synthese wurden von Cruachem erhalten und {2-[2-(4,4'-Dimethoxytrityloxyethyl)sulfonyl]ethyl}(2-cyanoethyl)- N,N-diisopropylphosphoramidit wurde von Applied Biosystems (unter dem Handelsnamen Phosphoralink ) erhalten. Die Adsorptions-Säulenchromatografie erfolgte auf Silicagel 60 (erhältlich von Merck). NMR-Spektren wurden an einem Jeol GX-400- Spektrometer aufgezeichnet, das bei 399,8 und 161,9 MHz für ¹H bzw. ³¹P betrieben wurde. Entweder CDCl&sub3; oder DMSO-d&sub6; wurden als Lösungsmittel verwendet, wobei entweder Trimethylsilan ("TMS") als interner Standard (¹H) oder H&sub3;PO&sub4; als externer Standard (³¹P) verwendet wurde.
- Die Oligonukleotide wurden durch RP-Chromatografie analysiert und isoliert (Säule: Nucleosil 300-5C18, 4,0 · 250 mm, Macherey-Nagel; Puffer A: 0,05 M NH&sub4;OAc; Puffer B: 0,05 M NH&sub4;OAc in 65% MeCN, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml min&supmin;¹; ein linearer Gradient von 5 bis 60% B in 30 Minuten wurde für Dimethoxytrityl-geschützte Oligonukleotide angelegt, andernfalls von 0 bis 30% B in 30 Minuten). Oligonukleotide, welche keine Dimethoxytritylgruppe enthielten, wurden durch Ionenaustauschchromatografie analysiert (Säule: SynChropack AX-300, 4,6 · 250 mm; 6,5 um, SynChrom, Inc., Puffer A: 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; in 50% Formamid; Puffer B: A + 0,6 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; Fließgeschwindigkeit 1,0 ml min&supmin;¹; ein linearer Gradient von 25 bis 85% B in 35 Minuten). Eine semipräparative RP-HPLC erfolgte an einer Hypersil® ODS-Säule (5 um; 10 · 250 mm) unter Verwendung von 0,05 M wässriger NaOAc als Puffer A, 80%igem wässrigen MeCN als Puffer B und Wasser als C mit einer Fließgeschwindigkeit von 4,5 ml · min&supmin;¹. Verbindung 5 wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 30 bis 90% B in 30 Minuten isoliert. Eine Entsalzung erfolgte an der gleichen Säule, die ursprünglich mit Puffer A (10 Minuten), anschließend mit Wasser (10 Minuten) eluiert wurde. Die entsalzten Produkte wurden durch Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus B und C erhalten (60 : 40% für Verbindung 5 und 30 : 70 für Verbindung 6).
- Die geschützten Oligonukleotide wurden an einem Applied Biosystems 392 DNA- Synthesegerät zusammengesetzt, wobei ein handelsüblicher fester Träger, eine Phosphoramidit-Chemie und die empfohlenen Arbeitsvorschriften bzw. Protokolle für den 0,2 und 10 umol-Maßstab verwendet wurden. Ein modifizierter Synthesezyklus wurde zum Herstellen der Verbindung 4 im 25 umol-Maßstab verwendet. Entsprechend wurde ein Gemisch aus 1H-Tetrazol- und Phosphoramidit-Lösungen 34 Sekunden lang auf die Säule aufgegeben. Alle Schritte, welche die Zufuhr von MeCN, Oxidationsmittel oder Endgruppenmischung zu der Säule betrafen, sowie die umgekehrten Spülschritte wurden für eine längere Zeit, etwa das Zweifache der in dem ABI 10 umol-Protokoll eingesetzten Zeit reprogrammiert. Der Detritylierungsschritt erfolgte unter Verwendung von zwei nachfolgenden "#14 (Säurelösung) auf Säule"-Schritten (2 · 80 Sekunden), getrennt durch einen Tritylspülschritt (7 Sekunden). Phosphoramidit 1(a) wurde als 0,1 M- Lösung in trockenem MeCN mit unveränderter Kupplungszeit verwendet. Von den Oligonukleotiden wurden die Schutzgruppen mit konz. wässrigem NH&sub3;(2 Stunden bei Raumtemperatur, dann 7 Stunden bei 55ºC) entfernt und anschließend wurden die Oligonukleotide durch HPLC analysiert und isoliert. Für 5'-DMTr-10 und Verbindung 13 wurde die Dimethoxytritylgruppe mit 80%iger wässriger AcOH 20 Minuten lang bei Umgebungstemperatur abgespalten, gefolgt von einer Analyse sowohl auf RP-Säulen als auch auf Ionenaustauschsäulen und RP-Isolierung der Verbindungen 10 und 14.
- Aliquots der gereinigten Verbindung 14 (20 AU/ml; 50 ul) wurden mit einer wässrigen Lösung von Ammoniak oder einem geeigneten Amin, welche die folgenden Endkonzentrationen ergab: Ammoniak: 25%, 1,0, 0,1 M; Methylamin: 1,0; 0,1 M; n-Butylamin: 1,0, 0,1, 0,01 M, auf 250 ul verdünnt. Proben (50 ul) der Reaktionsgemische wurden nach 15 und 30 Minuten entnommen, zur Trockne eingedampft, in Wasser (250 ul) gelöst und durch RP-HPLC analysiert, wobei die Retentionszeiten mit denen der Verbindungen 14 und 11a verglichen wurden. Weitere Proben (50 ul) wurden von der Reaktion in 0,01 M wässrigem n-Butylamin nach 60, 120 und 180 Minuten entnommen. Die Aliquots wurden wie vorstehend beschrieben behandelt und analysiert.
- Ein vorher zusammengesetztes Oligonukleotid 9 wurde ammonolysiert, so dass 13 erhalten wurde, welches nach der Entfernung des Ammoniaks durch Abdampfen durch RP-HPLC isoliert wurde (siehe Fig. 1). Die Dimethoxytritylschutzgruppe wurde wie vorstehend angegeben abgespalten, um Verbindung 14 herzustellen, und die Verbindung 14 wurde durch RP-HPLC gereinigt (siehe Fig. 2). Die gesammelte Fraktion (ca. 0,4 ml) wurde mit konzentriertem Ammoniak (2 ml) verdünnt, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, durch Ionenaustauschchromatografie analysiert (Fig. 3) und durch eine RP-Säule geleitet. Reines 11b wurde gesammelt und es wurde festgestellt, dass es homogen und chromatografisch identisch (Tabelle 1) mit dem von Verbindung 11a war, die durch das in der Literatur angegebene Verfahren hergestellt wurde (siehe Hom et al., Tetrahedron Letters, 1986, 27, 4705-4708).
- Diethyl-2,2-bis(hydroxymethyl)malonat (2a) (8,46 g, 38,4 mmol) wurde durch Koevaporation mit Pyridin (3 · 50 ml) getrocknet und in einem Gemisch aus trockenem Pyridin (50 ml) und Dioxan (50 ml) gelöst. 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (7,80 g, 23 mmol, 0,6 Äq.) wurde zu der gerührten Lösung in kleinen Portionen innerhalb von 2 Stunden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden gerührt, wonach die Reaktion durch Zugabe von Methanol (0,5 ml) angehalten wurde. Die resultierende Lösung wurde mit Triethylamin (3,6 ml) neutralisiert und im Vakuum zu einem Öl eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylendichlorid (200 ml) gelöst, mit Wasser (3 · 50 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das erhaltene ungereinigte Gemisch wurde an einer Silicagelsäule (40 · 150 mm) aufgetrennt, wobei mit einem Gradienten von Methanol in CH&sub2;Cl&sub2; von 0 bis 5% eluiert wurde. Die gesammelten Fraktionen wurden zur Trockne eingedampft, wobei 8,77 g (73%) der reinen Verbindung 3(a) als weißer Schaum erhalten wurden.
- ¹H-NMR (δ, ppm), 7,40-7,38 (m, 2H, arom); 7,31-7,18 (m, 7H, arom); 6,84-6,80 (m, 4H, arom); 4,22 (sx, 2H, J²AB = 10,7 Hz, J³HAMe = 7,1 Hz, CH&sub3;-CHAHBO-C=O), 4,17 (sx, 2H, J²AB = 10,7 Hz, J³HAMe = 7,1 Hz, CH&sub3;-CHAHBO-C=O), 4,17 (sx, 2H, J²AB = 10,7 Hz, J³HMe = 7,1 Hz, CH&sub3;-CHAHBO-C=O); 4,13 (br. s., 2H, -CH&sub2;OH); 3,77 (s., 6H, 2 · CH&sub3;O); 3,63 (s., 2H, -CH&sub2;ODMTr); 1,22 (tr., 6H, J³ = 7,1 Hz 2 · CH&sub3;). IR (λ cm&supmin;¹): 3535 (vOH); 1732 (vC=O); 1251 (vC-O-C): 1608, 1582, 1509 (arom.) Analytisch gefunden: C, 68,73; H, 6,50%. Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub4;O&sub8;: C, 68,95; H, 6,56%.
- Alkohol 3(a) (650 mg, 1,25 mmol), der durch Koevaporation mit MeCN vorgetrocknet war, und (2-Cyanoethyl)N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (siehe Nielsen et al., Nucleic Acids Res., 1987, 3626) (563 mg, 1,87 mmol) wurden in trockenem MeCN (1,5 ml) gelöst. 1H-Tetrazol (2,92 ml einer 0,45 M-Lösung in trockenem MeCN; 1,31 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten in trockener Atmosphäre bei Umgebungstemperatur gerührt. Wässriges NaHCO&sub3; (5%; 25 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde mit Methylendichlorid (100 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit ge¬ sättigter NaCl gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem weißen Schaum eingedampft. Der Schaum wurde in Toluol (3 ml) gelöst und tropfenweise zu trockenem Hexan (75 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Um feste Verunreinigungen zu entfernen, wurde die Lösung filtriert und das erhaltene Filtrat wurde 2 Stunden in einer trockenen Atmosphäre bei -25ºC aufbewahrt. Das Lösungsmittel wurde von dem als farbloses Öl ausgefallenen Produkt dekantiert. Eine frische Portion Hexan (50 ml) wurde zu dem Präzipitat zugegeben, das Gemisch wurde geschüttelt und bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet, wobei Verbindung 1(a) (850 mg, 94%) als farbloses Öl erhalten wurde. ³¹P-NMR (δ, ppm): 148,3. Dünnschichtchromatografie (Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;, MeOH-CH&sub2;Cl&sub2;, 1 : 49) Rf 0,7.
- Verfahren A. Phosphoramidit 1(a) (1,0 M in MeCN) wurde mit Thymidin-derivatisiertem Controlled-Pore-Glas in einem 10 umol-Maßstab gekuppelt. Nach dem Beenden der Synthese wurde das auf einen festen Träger aufgetragene Material 4 getrocknet und mit konzentriertem wässrigem NH&sub3; 2 Tage bei Raumtemperatur behandelt. Die flüssige Phase wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand wurde in 30%igem wässrigem MeOH gelöst und durch semipräparative RP-HPLC abgetrennt. Die Fraktion, die das Produkt enthielt, wurde zu einem Öl eingedampft und der Rückstand wurde auf der gleichen Säule entsalzt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, der Rückstand wurde mit MeCN (3 · 5 ml) zusammen eingedampft und schließlich im Vakuum getrocknet, wobei 10,2 mg (80%) der Verbindung 5 (Natriumsalz) als weißes Pulver erhalten wurden. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;); 7,94, 1H, d.J&sup4;HMe = 1,0 Hz (H-6); 7,27-7,37, 4H, m.; 7,17-7,24, 5H, m.; 6,92-6,85, 4H, (m (arom.); 6,22, 1H, dd., J³ = 5,8, 7,8 Hz (H = 1'); 4,35-4,30, 1H; m., J² = 9,8 Hz, J³ = 2,9 Hz, (H-5'); 4,30-4,25, 2H, m. (H-5" und H-3'); 4,01, 4H, q. J³ = 6,9 Hz, (2 · CH&sub2;OH&sub3;); 3,83, 1H, m. (H-4'); 3,73, 6H, s. (2 · CH&sub3;O); 3,65, 2H, m. (CH&sub2;-O-P); 3,48, 1H, d., J²AB = 8,8 Hz (CHAHB-ODMTr); 3,44, 1H, d., J²AB = 8,8 Hz (CHAHB-ODMTr); 2,12, 1H, m., und 2,02, 1H, m., J²2',2" = 13,2 Hz (H-2' und H-2"); 1,84, 3H, d., J&sup4;MeH = 1,0 Hz (C&sup5;-CH&sub3;); 1,06, t., J³ = 7,1 Hz und 1,05, t., J³ = 7,0 Hz, insgesamt 6H (2 · CH&sub2;CH&sub3;).
- Verfahren B. Der feste Träger 4 (25 umol) wurde analog zu dem in Verfahren A hergestellt und anschließend mit 40%igem wässrigem Methylamin (25 ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde aufgearbeitet und das Produkt wurde wie vorstehend beschrieben isoliert, wobei 18,3 mg (86,2%) von Verbindung 5 als weißes Pulver erhalten wurden, welches identisch war mit dem durch Verfahren A hergestellten Pulver, wie durch ¹H-NMR und analytische RP-HPLC bestätigt wurde.
- Verfahren C. Die Entfernung der Schutzgruppe von dem festen Träger 4 (0,2 umol) mit 50%igem wässrigem 1,3-Propandiamin (75 ul) während 12 Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt vom Eindampfen der flüssigen Phase ergab das einzige Produkt, Verbindung 5, welche mit einer authentischen Probe, die durch Verfahren A hergestellt wurde, koeluierte, wenn sie gemeinsam auf eine analytische RP-HPLC injiziert wurden.
- Die Verbindung 5 (23,7 mg, 28 umol) wurde mit 80%iger wässriger AcOH (25 ml) 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingedampft, gemeinsam mit Wasser (3 · 5 ml) abgedampft und zwischen Wasser (5 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (15 ml) verteilt. Die organische Schicht wurde verworfen und die wässrige Phase wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 5 ml) extrahiert. Auf dieser Stufe enthielt die wässrige Phase ein detrityliertes Produkt mit einer Reinheit von mehr als 97%, zusammen mit verunreinigendem 4,4'-Dimethoxytritylalkohol. Das homogene Produkt wurde durch semipräparative RP-HPLC in dem Entsalzungsprotokoll isoliert. Das Eindampfen und abschließende Trocknen im Vakuum ergab das Natriumsalz von Verbindung 6 (13,9 mg, 91%) als weißes Pulver. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,31, 1H, s. (NH); 7,81, 1H, d., J&sup4;HMe = 1,0 Hz, (H-6); 6,22, 1H, dd., J³1'2" = 6,1, J³1'2" = 7,8 Hz (H-1'); 4,28, 1H, m. (H-3') 4,19- 4,06, m., J² = 9,8 Hz, J³ = 2,9 Hz (H-5', H5"), 4,10, q., J³ = 7,1 Hz und 4,09 q., J³ = 7,1 Hz (2 · CH&sub2;CH&sub3;) insgesamt 6H; 3,88, 1H, d., und 3,86, 1H, d., J²AB = 12,1 Hz (CHAH- BOH); 3,79 1H, m. (H-4'); 3,65, 2H, m. (CH&sub2;-O-P); 2,11 1H, m., und 2,04, 1H, m., J²2'2" = 13,3 Hz, J³2'1' = 7,8 Hz, J³2'3' = 5,5 Hz, J³2"1' = 6,1 Hz, J2"3' = 2,7 Hz (H-2' und H-2"); 1,81, 3H, d., J&sup4;MeH = 1,0 Hz (C&sup5;-CH&sub3;); 1,15, t., J³ = 7,1 Hz und 1,14, t., J³ = 7,1 Hz, insgesamt 6H (2 · CH&sub2;CH&sub3;). ³¹P-NMR (DMSO-d&sub6;): -2,20.
- Bei der Beschreibung der Erfindung haben die Anmelder in dem Bemühen, zu zeigen, wie und warum die Erfindung funktioniert, und die Art und Weise zu offenbaren, auf die sie funktioniert, bestimmte Theorien, Reaktionsschemata und Mechanismen angegeben. Diese Theorien, Schemata und Mechanismen sind nur für Informationszwecke angegeben. Die Anmelder sind nicht an spezifische, chemische oder physikalische Mechanismen oder Theorien der Wirkungsweise gebunden.
Claims (30)
1. Verbindung der Formel 1:
wobei:
DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist,
R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig eine Amidgruppe sind,
R&sub3; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, und
R&sub4; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, welche gleich oder verschieden von der R&sub3;-Gruppe
sein kann.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig ausgewählt
werden aus der Gruppe bestehend aus einer -CN-Gruppe, einer -CON(Me)&sub2;-
Gruppe und einer -CONHMe-Gruppe, wobei Me eine Methylgruppe bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei mindestens einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; eine
-CONHMe-Gruppe ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei sowohl R&sub1; als auch R&sub2; -CONHMe-Gruppen
sind.
5. Verbindung nach Anspruch 2, wobei mindestens einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; eine
-CON(Me)&sub2;-Gruppe ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei sowohl R&sub1; als auch R&sub2; -CON(Me)&sub2;-Gruppen
sind.
7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei sowohl R&sub3; als auch R&sub4; Isopropylgruppen sind.
9. Verbindung nach Anspruch 3, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
10. Verbindung nach Anspruch 5, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
11. Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel:
wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist.
12. Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel:
wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist.
13. Verfahren zum Phosphorylieren eines Oligonukleotids, umfassend:
Umsetzen eines trägergebundenen 4,4'-Dimethoxytrityl-geschützten
Oligonukleotids der Formei:
wobei DMTr eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und S ein Trägermaterial ist, mit
einem Phosphoramidit der Formei 1:
wobei:
DMTr eine 4,4'-Dimethoxytrityigruppe ist,
R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig eine Amidgruppe sind,
R&sub3; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, und
R&sub4; eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, welche gleich oder verschieden von der R&sub3;-Gruppe
sein kann, um ein phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel zu bilden:
Abspalten des phosphorylierten Oligonukleotids von dem Trägermaterial, um ein
ungebundenes phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel bereit zu
stellen:
Isolieren des ungebundenen phosphorylierten Oligonukleotids;
Entfernen der DMTrO-Gruppe von dem phosphorylierten Oligonukleotid, um ein
phosphoryliertes Oligonukleotid der folgenden Formel zu bilden:
Entfernen der
-Seitenkette an dem phosphorylierten Oligonukleotid, um ein Oligonukleotid der
folgenden Formel bereit zu stellen, das eine Phosphatgruppe aufweist:
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das ungebundene phosphorylierte
Oligonukleotid durch eine Umkehrphasentrennmethode isoliert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig ausgewählt
werden aus der Gruppe bestehend aus einer -CN-Gruppe, einer -CON(Me)&sub2;-
Gruppe und einer -CONHMe-Gruppe, wobei Me eine Methylgruppe bedeutet.
16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei mindestens einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; eine
-CONHMe-Gruppe ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei sowohl R&sub1; als auch R&sub2; -CONHMe-Gruppen
sind.
18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei mindestens einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; eine
-CON(Me)&sub2;-Gruppe ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei sowohl R&sub1; als auch R&sub2; -CON(Me)&sub2;-Gruppen
sind.
20. Verfahren nach Anspruch 13, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei sowohl R&sub3; als auch R&sub4; Isopropylgruppen sind.
22. Verfahren nach Anspruch 16, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18, wobei mindestens einer der Reste R&sub3; oder R&sub4; eine
Isopropylgruppe ist.
24. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Phosphoramidit gemäß Formel 1 die
folgende Verbindung ist:
wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist.
25. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Phosphoramidit gemäß Formel 1 die
folgende Verbindung ist:
wobei Me eine Methylgruppe ist und iPr eine Isopropylgruppe ist.
26. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Trägermaterial ein Bestandteil,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Siliciumdioxid, Controlled-Pore-Glas,
langkettiges Alkylamino-Controlled-Pore-Glas und Polystyrol ist.
27. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidkette mit 2
bis 200 Nukleotidmonomer-Komponenten einschließt.
28. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Oligonukleotidprodukt ein Oligonukleotid
mit einer Phosphatgruppe am 5'-Ende ist.
29. Verfahren nach. Anspruch 28, wobei das hergestellte Oligonukleotidprodukt im
Wesentlichen rein ist.
30. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Oligonukieotidprodukt die Formel:
aufweist.
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