DE69635990T2

DE69635990T2 - Bromierte hexahydroxybiphenylderivate

Info

Publication number: DE69635990T2
Application number: DE69635990T
Authority: DE
Inventors: Kuo-Hsiung Chapel Hill LEE; Yoshiki Kashiwada; Lan Chapel Hill XIE; Mark Louis Springfield COSENTINO; Mark Laurel MANAK; Jing-Xi Institute Of Materia Medica Xie; Yung-Chi Woodbridge Cheng; E. Robert Shrewsbury KILKUSKIE
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Panacos Pharmaceuticals Inc; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Panacos Pharmaceuticals Inc; University of North Carolina System
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: AU6273596A; DK0837677T3; WO1996040111A1; ES2264140T3; US5612341A; ATE321549T1; EP0837677B1; PT837677E; EP0837677A4; DE69635990D1; EP0837677A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die gegenwärtige Erfindung betrifft Verbindungen, welche sich bei der Behandlung viraler Infektionen, wie HIV Infektionen als nützlich erwiesen haben.
Stand der Technik
Retroviren
Retroviren sind kleine, einzelsträngige positivstrangorientierte RNA Viren. Ein retrovirales Partikel weist zwei identische einzelsträngige positivstrangorientierte RNA Moleküle auf. Ihr Genom enthält, unter anderem, die Sequenz der RNA-abhängigen DNA Polymerase, die auch als Umkehrtranskriptase bekannt ist. Viele Umkehrtranskriptase-Moleküle werden in enger Verbindung mit der genomischen RNA in den reifen Viruspartikeln gefunden. Nach dem Eindringen in die Zelle, erzeugt diese Umkehrtranskriptase eine doppelsträngige DNA-Kopie des viralen Genoms, welche dann in das Chromatin der Wirtszelle eingefügt wird. Sobald das Einfügen erfolgt ist, wird die virale Sequenz Provirus genannt. Die retrovirale Integration hängt direkt von den viralen Proteinen ab. Lineare virale DNA Termini (die LTRs) sind die unmittelbaren Vorläufer der integrierten proviralen DNA. Es gibt eine charakteristische Verdoppelung von kurzen Abschnitten der Wirts-DNA an der Integrationsstelle.
Abkömmlinge viraler Genome und mRNAs werden von der eingefügten Sequenz durch die Wirtszellen RNA Polymerase als Reaktion auf transkriptionale, regulatorische Signale in den terminalen Regionen der proviralen Sequenz, den langen terminalen Wiederholungen, oder LTRs (long terminal repeats) transkribiert. Es wird der Proteinproduktionsmechanismus der Wirtszelle verwendet, um virale Proteine zu erzeugen, von denen viele inaktiv sind, bis sie durch viral kodierte Proteasen verarbeitet werden. Typischerweise, knospen Abkömmlinge viraler Partikel von der Zelloberfläche in einer nicht-lytischen Art und Weise. Retrovirale Infektion beeinträchtigen nicht notwendigerweise den normalen Lebenszyklus einer infizierten Zelle oder Organismus. Sie sind jedoch in Bezug auf die Wirtszelle nicht immer gutartig. Während die meisten DNA Viren-Klassen mit der Tumorigenese in Verbindung gebracht werden, sind die Retroviren die einzige taxonomische Gruppe von RNA Viren die onkogen sind. Verschiedene Retroviren, wie das humane Immundefizienzvirus (HIV), welches das verantwortliche ätiologische Agens für das erworbene Immundefekt-Syndrom (AIDS: acquired immune deficiency syndrome) in Menschen darstellt, sind für mehrere sehr ungewöhnliche Krankheiten des Immunsystems in höheren Tieren verantwortlich.
HIV Infektion und AIDS
Das humane Immundefizienzvirus (HIV) ist ein Mitglied der Lentiviren, einer Unterfamilie der Retroviren. Viele Retroviren sind bekannte Karzinogene. Es ist nicht bekannt, dass HIV per se Krebs in Menschen oder anderen Tieren verursacht, aber es stellt eine beachtliche Herausforderung für die Wirtszelle dar. Das virale Genom enthält viele regulatorische Elemente, welche dem Virus ermöglichen, seine Replikationsrate sowohl in ruhenden als auch teilenden Zellen zu kontrollieren. Besonders wesentlich ist, dass HIV diese Zellen des Immunsystems infiziert und eindringt; es zerstört das Immunsystem des Körpers und macht den Patient gegenüber opportunistischen Infektionen und Neoplasmen empfänglich. Der Immundefekt scheint progressiv und irreversibel zu sein, mit einer hohen Mortalitätsrate die über die Jahre annähernd 100% erreicht.
HIV-1 ist trophisch und zytopathisch für T4 Lymphozyten, Zellen des Immunsystems, welche das Zelloberflächen-Differenzierungsantigen CD4, das auch als OKT4, T4 und leu3 bekannt ist, exprimieren. Der virale Tropismus beruht auf der Interaktion zwischen dem viralen Hüllenglycoprotein, gp 120, und dem Zelloberflächen CD4-Molekül (Dalgleish et al., Nature 312: 763–767 (1984)). Diese Interaktionen vermitteln nicht nur die Infektion von anfälligen Zellen durch HIV, sondern sind auch für die Virus-induzierte Fusion von infizierten und nicht-infizierten T Zellen verantwortlich. Diese Zellfusion resultiert in der Bildung von riesigen mehrkernigen Synzyten, dem Zelltod, und der progressiven Depletion von CD4 Zellen in AIDS Patienten. Diese Vorkommnisse resultieren in der HIV-induzierter Immununterdrückung und ihrer nachfolgenden Folgekrankheiten, opportunistischen Infektionen und Neoplasmen.
Zusätzlich zu CD4+ T Zellen, schließt der Wirtsbereich für HIV Zellen des mononukleärer phagozytärer Abstammung ein (Dalgleish et al., supra), einschließlich Blutmonozyten, Gewebe Makrophagen, Langerhanszellen der Haut und dendritische Retikulumzellen innerhalb von Lymphknoten. HIV ist auch neurotrop, d.h. in der Lage Monozyten und Makrophagen des zentralen Nervensystems zu infizieren, wodurch schwere neurologische Schäden hervorgerufen werden. Markophagen/Monozyten sind ein bedeutender Speicher für HIV. Sie können mit CD4-tragenden T Zellen interagieren und fusionieren, die T Zellen Depletion hervorrufen und somit zu der Pathogenese von AIDS beitragen.
Anti-HIV Arzneimittel
Derzeit werden intensive Anstrengungen unternommen, um Therapien zu entwickeln, um die Entwicklung von klinischen Symptomen in HIV-infizierten Individuen zu verhindern oder in diese einzugreifen. Größtenteils haben sich die Anstrengungen auf die Verwendung von Nukleosid-analogen Arzneimitteln wie AZT (Azidothymidin) und anderen Dideoxynukleosid-Derivate wie ddA, ddT, ddI, und ddC konzentriert. Diese Arzneimittel inhibieren das virale Enzym Umkehrtranskirptase dadurch wird die de novo Infektion von Zellen inhibiert. Sobald die virale Infektion in Zellen etabliert wurde, nutzt die virale Replikation die Enzyme der Wirtszelle. Somit tendieren Arzneimittel, die nur die Umkehrtranskriptase inhibieren, eine eingeschränkte Wirkung zu haben. Während die Ausbreitung von freiem Virus innerhalb des Organismus blockiert werden kann, bleibt der Mechanismus der Synzyten-Bildung und Pathogenese durch direkte interzelluläre Ausbreitung aufrecht. Es gibt dementsprechend einen Bedarf, um neue Anti-HIV Arzneimittel bereitzustellen, die nicht auf die Inhibierung der Umkehrtranskriptase als ihren Wirkungsmechanismus beschränkt sind.
In dem Bestreben neue und effektivere Arzneimittel für die Behandlung von HIV Infektion zu finden, wurde die Aufmerksamkeit auf Verbindungen, die in Pflanzen gefundenen werden oder auf Verbindungen, die aus natürlichen Produkten modifiziert wurden, gerichtet. Besonders Tannine sind auf ihren medizinischen Nutzen untersucht worden, und mehrere Elagitannine zeigen eine gewisse Antitumor- und Anti-HIV-Aktivität (Okuda et al., Planta Med. 55: (2)117–122 (1989); Bokesch et al., J. Nat. Prod. 56(7): 1123–1129 (1993)). Unglücklicherweise zeigen die Berichte für die Inhibierung der Umkehrtranskriptase durch die Tannine, dass viele dieser Tannine eine geringe bis keine Aktivität gegenüber der Umkehrtranskriptase aufweisen, und es gibt nach wie vor keine verlässlichen Mittel um vorherzusagen, welche dieser Verbindungen wirksam sein werden (Kakiuchi et al., J. Nat. Prod. 48(4): 614–621 (1985); Nonaka et al., J. Nat. Prod. 53(3): 587–595 (1990); Nakashima et al., Antiviral Res. 18(1): 91–103 (1992); Weaver et al., Biochem. Pharmacol. 43(11): 2479–2489 (1992); Kilkuskie et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2(12): 1529–1534 (1992)).
Viele der Tannin-basierenden Verbindungen sind Biphenyl-Derivate. Historisch gesehen, wurden Biphenyl-Derivate auf ihren Nutzen zum Behandeln einer Vielzahl von Leberkrankheiten untersucht. Es wurde ein antivirales Mittel für die Behandlung von Hepatitis in China verwendet (Liu et al., Hepato-pharmacology of Fructus Schizandrae in Advances in Chinese Medical Materials Research, herausgegeben von Chang et al., pp. 257–267). Eine darin offenbarte Verbindung, 4,4'-Dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonylbiphenyl (DDB), zeigte eine gewisse Anti-HIV-Aktivität, mit einem ED₅₀-Wert von 5 Mikrogramm/ml und einem TI von >20.
Schinsandra chinensis (chinesischer Name: Wu-Wei-Zi) wird seit Langem in China als Adstringens und Tonikum verwendet. In den 1970ern wurde herausgefunden, dass es gegen virale Hepatitis, zum Senken erhöhter SGPT-Konzentrationen, und als schützender Wirkstoff für die Leber, wenn sie durch Chemikalien wie Kohlenstofftetrachlorid verletzt wurde, wirksam ist. Weitere Studien wiesen darauf hin, dass Schisandrin C, welche aus den Samen von Schinsandra chinensis isoliert wurde, ein aktiver Grundbestandteil ist. Während der Gesamtsynthese von Schisandrin C wurde ein neues anti-hepatisches Arzneimittel, 4,4'-Dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonylbiphenyl, entdeckt.
Shi-jie offenbart im U.S. Patent Nr. 4.868.207 Bis(methylendioxy)biphenyl-Verbindungen der Formel:
wobei R eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Phenylgruppe ist, und R' ist ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Iwasaki et al., offenbaren in den U.S. Patent Nrn. 5.103.023, 5.182.404, und 5.233.057 Biphenyl-Derivate der Formel:
wobei R¹ ein substituiertes oder unsubstituiertes Aminocarbonyl, Aminothiocarbonyl, substituiertes oder unsubstituiertes niederes Alkoxycarbonyl, Cyano, oder eine Gruppe ist, der folgenden Formel:
wobei ein oder zwei von R² bis R⁷ Wasserstoff sind, und die restlichen Gruppen sind die gleichen oder unterschiedliche und sind niedere Alkoxy, Phenyl(nieder)Alkoxy oder Hydroxy, oder zwei benachbarte Gruppen davon schließen sich zusammen, um eine niedere Alkylendioxy-Gruppe zu bilden, und Alk¹ ist eine niedere Alkylen-Gruppe, oder ein pharmazeutische akzeptables Salz davon. Es wird vermutet, dass die Verbindungen für die Prophylaxe und Behandlung von hepatischen Krankheiten nützlich ist. Beispiel 19 offenbart 5,6,5',6'-Dimethylendioxy-2,2'-biphenylbis(thiocarboxamid).
Kimura et al. offenbaren in den U.S. Patent Nrn. 4.849.448, 4.996.331, und 5.264.594 Biphenyl-Derivate, die verwendet werden können, um Hepatitis zu behandeln. Die Biphenyl-Derivate haben die Formel:
Wobei R₀ und R₁ unabhängig für niederes Alkyl stehen, oder R₀ und R₁ stellen zusammen eine Gruppe O=C< dar, R₂ ist eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und R₃ und R₄ sind unabhängig Wasserstoff oder niederes Alkyl.
Matsuoka et al. offenbaren in den U.S. Patent Nrn. 4.904.694 und 4.987.240 Biphenyl-Derivate die für das Mildern von Leberbeschwerden und das Behandeln von Hepatitis nützlich sind. Diese Verbindungen haben die Formel:
wobei R₁ und R₂ Wasserstoff oder Methyl sind.
Hirayama et al. offenbaren in U.S. Patent Nr. 5.159.069 sulfatierte Tannine, welche eine antivirale Aktivität und eine Umkehrtranskriptase Inhibition aufweisen, die verwendet werden können, um mit Viren, wie HIV infizierte Patienten zu behandeln.
Gustafson et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 2809–2811 offenbaren die aus Pothomorphe peltata isolierten Peltatole A, B und C und ihre inhibitorische Aktivität gegenüber HIV-1.
Zusammenfassung der Erfindung
Die gegenwärtige Erfindung ist geplant, den einen oder die mehreren Mängel des Standes der Technik zu überwinden. Die gegenwärtige Erfindung ist ebenso geplant, Verbindungen, welche eine antivirale Aktivität und/oder anti-retrovirale Aktivität, wie Anti-HIV-Aktivtät, in vitro, in situ, und/oder in vivo aufweisen, bereitzustellen sowie diese Verbindungen herzustellen.
Die gegenwärtige Erfindung erzeugt Biphenyl-Derivate, die verwendet werden können, um retrovirales Wachstum, Replikation, Bindung und/oder Metabolismus zu inhibieren und/oder um eine retrovirale Infektion oder verwandte Symptome zu behandeln.
Ein erster Aspekt der gegenwärtigen Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die zumindest eine Verbindung der Formel:
oder
aufweist,
wobei R¹ und R² ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Brom, mit der Bedingung, dass R¹ und R² nicht beide Wasserstoff sein können.
R³ und R⁴ sind unabhängig Hydroxy C_1-6alkoxy, -O(CH₂)₂N⁺(CH₃)Cl^–,
oder ein pharmazeutisch akzeptabler Ester, Ether, Sulfat, Carbonat, Glucoronid oder Salz davon, und ein pharmazeutisch akzeptabler Träger.
R³ und R⁴ können beide Methoxy sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiters zumindest ein Arzneimittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus antiviralem Mittel und immunstimulierendem Mittel aufweisen. Besagtes antivirales Mittel kann aus der Gruppe bestehend aus gamma Globulin, Amantadin, Guanidin, Hydroxybenzimidazol, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-gamma, Thiosemicarbazonen, Methisazon, Rifampin, Ribvirin, Pyrimidin-Analoga, Purin-Analoga, Foscarnet, Phosphonoessigsäure, Acyclovir, Dideoxynukleosiden, und Ganciclovir ausgewählt sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Verwendung zum Inhibieren einer retroviralen Infektion in Zellen oder Geweben eines Tieres, wie Säugetier oder Vogel sein. Das Säugetier kann ein Mensch sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Verwendung zum Behandeln einer retroviralen Pathologie, wie HIV Infektion sein.
In einem zweiten Aspekt der gegenwärtigen Erfindung wird eine Verbindung mit folgender Formel
Bereitgestellt,
worin R¹ und R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Brom, mit der Bedingung, dass R¹ und R² nicht beide Wasserstoff sein können, und der weiteren Bedingung, dass 3,3'-Dibrom-4,4'dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl ausgeschlossen ist,
R³ und R⁴ unabhängig voneinander Hydroxy C_1-6Alkoxy, -O(CH₂)₂N⁺(CH₃)Cl^–,
sind.
R³ und R⁴ können beide Methoxy sein. Die Verbindung kann 3-Brom-4,4'-dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl sein.
Insbesondere ist die Verbindung, die die wirksamste Anti-HIV-Aktivität aufweist, 3-Brom-4,4'-dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl.
Die gegenwärtige Erfindung enthält ebenfalls ein Konjugat einer Verbindung für die Verwendung bei der Inhibierung einer retroviralen Infektion in Zellen oder Geweben eines Tieres, mit löslichem CD4, CD4 Derivaten, für CD4-spezifischen Antikörpern, oder HIV-kodierte Glycoproteine wie gp120 und gp41, oder Antikörper dazu.
Andere Merkmale, Vorteile, Ausführungsformen, Aspekte und Ziele der gegenwärtigen Erfindung werden für den Fachmann auf dem entsprechenden Gebiet, basierend auf der Beschreibung, Lehre und Anleitung hierin, klar sein.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Inhibierung der HIV Umkehrtranskriptase assoziierten RNase H Aktivität durch zwei Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung.
2 stellt Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung dar.
3 beschreibt das Reaktionsschema 1.
4 stellt Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
5 beschreibt das Reaktionsschema 2.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, von welche entdeckt worden ist, dass sie in der Inhibierung retroviraler Infektion und/oder Replikation in eukaryotischen Zellen und/oder für die Behandlung retroviraler Infektionen, wie HIV Infektionen, nützlich sind, sowie Verfahren zum Herstellen der Verbindungen.
4,4'-Dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl-Derivate (3, DDB) wurden synthetisiert und auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der HIV-1 Replikation in akut infizierten H9 Zellen evaluiert. Vier Verbindungen zeigten eine besonders wirksame Anti-HIV-Aktivtät mit EC₅₀-Werten von <0,8 bzw. 0,3 μg/ml und therapeutischen Indexwerten von >100 bzw. >333. Ein Vergleich der Anti-HIV-Aktivität dieser Verbindungen deutet an, dass eher die Arten der Substituenten der phenolischen Hydroxy-Gruppen sowie das Vorhandensein von zumindest einem Brom-Substituenten als die Anzahl der Bromreste auf dem aromatischen Ring wichtig sind, um die Anti-HIV-Aktivität zu erhöhen. Die Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung zeigten ebenfalls wirksame inhibitorische Aktivitäten gegenüber der HIV-1 Umkehrtranskriptase in einer Matrizen-Primer abhängigen Art.
Von den Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung ist unerwarteterweise gefunden worden, dass sie eine antiretrovirale Aktivität aufweisen, und somit geeignete Verbindungen und Zusammensetzungen zum Behandeln retroviraler Infektionen bereitstellen, gegebenenfalls mit zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoffen, wie antiretroviral, Anti-HIV, und/oder immunostimulierende Verbindungen oder antivirale Antikörper oder Fragmente davon.
Mit dem Ausdruck „antiretrovirale Aktivität" oder „Anti-HIV-Aktivität" ist die Fähigkeit gemeint, zumindest eines von Folgendem zu inhibieren:

(1) Retrovirale Anheftung an Zellen;
(2) Viral Eintritt in die Zellen;
(3) Zellulärer Metabolismus, welcher die virale Replikation ermöglicht;
(4) Inhibierung oder interzelluläre Ausbreitung des Virus;
(5) Synthese und/oder zelluläre Expression des viralen Antigens;
(6) Aktivität virus-kodierter Enyzme (wie Umkehrtranskriptase und Protease); und/oder
(7) Jegliche bekannte retrovirale oder HIV pathogene Wirkung, wie z.B. Immununterdrückung. Somit ist jede Aktivität, die dazu neigt einen beliebigen dieser Mechanismen zu inhibieren, eine „antiretrovirale Aktivität" oder „Anti-HIV-Aktivität".

Synthese
DDB (4,4'-Dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (Verbindung 3 in Schema 1) wurde nach dem Verfahren von Xie et al., Acta Pharmaceutica sinica 17: 23–27 (1982)) synthetisiert. Wie in Schema 1 (3) gezeigt ist, wurde DDB mit einem und zwei molaren Äquivalenten an Brom in CHCl₃ behandelt, um das Mono-(4) bzw. Di-(5) Bromid zu erhalten. Verbindung 5 widerstand einer nachfolgenden Hydrolyse mit Basen, wahrscheinlich aufgrund der sterischen Hinderung der sperrigen Bromatome ortho zu der Hydroxy-Gruppe. Die Hydrolyse wurde unter Verwendung von relativ strengen Bedingungen erreicht, um die Dicarbonsäure zu ergeben (6). Verbindung 6 wurde mit Acetanhydrid behandelt, um ein intramolekulares Anhydrid zu ergeben (8). Die Behandlung von 8 mit Alkohol ergab den Monoester (9), während die Reaktion mit Aminen Monoamide (12 und 13) lieferte. Das wasserlösliche Trimehtylaminocarboxylatsalz (11) wurde durch Behandeln von 8 mit Cholinchlorid in Pyridin erhalten. Reaktion von 8 mit Aminen lieferte Monoamide (12 und 13). Eine ähnliche Behandlung von 8 mit 1-(2-Hydroxyethyl)pyrrolidin ergab jedoch ein Dicarbonsäuresalz (14). Die Verbindung 14 zeigte in ihrem ¹H NMR Spektrum das Vorhandensein von zwei Pynolidinium-Ethanol-Reste [δ 1,95 (8H, m), 3,19 (4H, t, J = 5 Hz), 3,26 (8H, m), 3,75 (4H, t, J = 5 Hz)] zusammen mit den Signalen aufgrund von zwei Methoxy [δ 3,9 (6H, s)] und zwei Methylendioxy [(δ 5,83 und 5,88 (jede 2H, s)] Gruppen. Die chemische Verschiebung [δ 3,75 (4H, t, J = 5 Hz)] der Hydroxymethyl-Gruppen der Pynolidinium-Ethanol-Reste deutet darauf hin, dass diese Positionen nicht verestert waren. Weiters zeigte das IR Spektrum von 14 keine zusätzliche Carbonyl-Absorption bei etwa 1700 cm^–1, zeigte aber anstelle Absorptionsbanden aufgrund eines Carboxylats (1580 und 1370 cm^–1), was darauf hinweist, dass 14 das Dipyrrolidinium-Ethanolsalz von 6 ist. Behandlung von 6 mit 1-Hexanol unter sauren Bedingungen ergab den entsprechenden Diester 15. Verbindungen 6 und 9 wurden mit entsprechenden molaren Äquivalenten behandelt, um Di-(7) und Mono-(10) Natriumsalze zu ergeben.
Ähnliche Mono-(16 und 18) und Di-(17 und 19) Brom-Derivate von früher berichteten Biphenyl-Verbindungen (Kashiwada et al., Bioorg., Med. Chem. Lett. 2: 234–238 (1992); Kashiwada et al., J. Med. Chem. 37: 195–200 (1994)) wurden ebenfalls mit dem oben beschriebenen Verfahren erzeugt.
DDB hat in jedem Benzylring drei unterschiedliche Gruppen, und durch Verändern der relativen Positionen dieser Gruppen kann eine Reihe von Isomeren erhalten werden. Während der Gesamtsynthese aus Gallussäure als Ausgangsmaterial, wurden zwei Isomere, 6,6'-Dimethoxy-4,5,4',5'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (114) und 4,6'-Dimethoxy-5,6,4',5'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (115) beide durch die Ullmann-Reaktion erhalten. Zusätzliche Isomere von DDB, 116 und 117, wurden gemäß der in Schema 2 (5) gezeigten Route synthetisiert.
Das Folgende ist eine Beschreibung des in Schema 2 darlegten Reaktionschemas. Das Ausgangsmaterial, 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure wurde zuerst verestert, um Methyl 2,3,4-Trihydroxybenzoat 120 zu erhalten. Die Monoethylierung der 4-OH-Gruppe in Verbindung 120 wurde durch das Verfahren von Scheline erreicht. Die IR Spektren des Produkts zeigten den Absorptionspeakt der Ester Carbonylgruppe bei 1660 cm^–1, was auf das Vorhandensein von internen Wasserstoffbindungen hinweist. In seinen ¹H NMR wurde ein Signal bei δ 10,98 ppm beobachtet, welches der chelatgebundenen OH Gruppe zuzuschreiben ist. Diese spektroskopischen Daten deuten an, dass die Monomethylierung an der 4-OH Gruppe auftritt, und nicht an der 2-Position. Somit wurde die Struktur des Monomethylethers der Verbindung 120 zu Methyl 2,3-Dihydroxy-4-Methoxybenzoat 121 umgeschrieben. Die Methylenierung der Verbindung 121 mit CH₂Cl₂ in DMF ergab Methyl 2,3-Methylendioxy-4-Methoxybenzoat 122 mit einer guten Ausbeute (19%). Die IR Absorptionsbanden der Ester Carbonylgruppen in 122 verschoben sich von 1660 cm^–1 zu 1710 cm^–1. Bromierung der Verbindung 122 mit Dioxan-Dibromid-Reagens in Ethylenoxid ergab Methyl 2,3-Methylendioxy-4-Methoxy-5-Bromobenzoat 123 mit einer guten Ausbeute (>80%). Die bromierte Verbindung 123 wurde auch durch Reagieren der Verbindung 122 mit trockenem Brom in CHCl₃ erhalten. Die Position des eingeführten Bromatoms wurde eindeutig auf Basis des 2D-NOE Spektrums bestimmt. Eine starke NOE-Antwort wurde zwischen dem aromatischen Proton und den Methyl-Protonen der Methoxycarbonyl-Gruppe beobachtet. Deshalb muss die Bromierung an der 5-Position stattgefunden haben, was mit der erwarteten Orientierung für elektrophile aromatische Substitution übereinstimmt. Ullman Reaktion der Verbindung 123 mit aktivem Kupferpulver in DMF ergab nur geringe Mengen des Biphenyl-Derivats 117. Diese Verbindung ergab ein molekulares Ion bei m/z 418 als Basispeak in seinem MS Spektrum. Die IR und ¹H NMR Spektren stimmten mit der zugeteilten Struktur gut überein. Die neue Verbindung 111 wurde δ-DDB bezeichnet.
Vier Isomere von DDB (114–117) wurden auf verschiedenen Wegen erhalten. Die Dibromierung von drei dieser Biphenyl-Verbindungen wurde leicht bei Raumtemperatur mit einem molaren Verhältnis von Brom zu Biphenyl von etwa 2:1 erreicht. Die Strukturen der dibromierten Biphenyl-Derivate 118, 119 und 110, die aus 114, 115 bzw. 116 erzeugt wurden, wurden durch ihre ¹H NMR, MS, IR und EA Daten identifiziert. Die Verbindung 117 konnte jedoch aufgrund der Wirkungen von anderen funktionellen Gruppen in dem Biphenyl-System nicht bromiert werden.
Untersuchung der Anti-HIV-Aktivität in vitro
Die Folgenden sind Beispiele von Verfahren, die verwendet werden können, um die Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung, zum Bestimmen zumindest eines therapeutischen Nutzens und/oder Wirkungsmechanismus als eine antivirale Verbindung, wie eine Anti-HIV- Verbindung, ohne unnötige Experimentation, basierend auf der hierin dargestellten Lehre und Anleitung, zu durchsuchen.
Zuerst können verschiedene Konzentrationen der Verbindungen mit einer chronisch HIV-1 infizierten T Zelllinie, z.B., ACH-2, und einer chronisch HIV-1 infizierten monozytischen Zelllinie, z. B. U1, inkubiert werden. Diese Zelllinien sind für das Vorhersagen nützlich, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Virusexpression in vivo induzieren könnten, wenn sie einem Individuum, das latent mit HIV infiziert ist und nicht aktiv Virus exprimiert, verabreicht werden. Außerdem wird die HIV-1 Expression erhöht, wenn diese zwei Zelllinien mit dem Phorbolester, PMA, inkubiert werden. Da die Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung die Virusreplikation während einer akuten HIV-1 Infektion von H9 Zellen inhibieren können, wird es von Interesse sein, zu bestimmen, ob diese Verbindungen auch die HIV-1 Expression von diesen zwei chronisch infizierten Zelllinien, nachdem sie mit PMA stimuliert wurden, unterdrücken können.
Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung können mit anderen Zellarten (z. B., frisch isolierte Zellen und/oder Zelllinien), die mit HIV infiziert sind, getestet werden. Frisch isolierte Monozyten/Makrophagen und periphere Blut mononukleäre Zellen (PBMCs) können mit einem monotropen HIV-1 Isolat, Ba-L und/oder einem laboratorischen HIV-1 Isolat (z.B., IIIB) infiziert werden. Außerdem kann die Virus-Unterdrückung evaluiert werden, wenn ein Biphenyl-Derivat zu einer akut HIV-1 (IIIB Isolat) infizierten monozytischen Zelllinie, U937, und/oder der HIV-2 (dl94 Isolat) infizierten T Zelllinien, HUT-78 hinzugefügt wurde. Diese Studien werden untersuchen, ob die unterdrückende Wirkung der Biphenyl-Derivate für einen bestimmten Zell-Phänotyp oder ein Virus-Isolat spezifisch sind.
Andere Studien können verwendet werden, um die Verbindung der gegenwärtigen Erfindung auf ihre Wirkungsmechanismen zu durchsuchen, durch:

(a) Bestimmen, ob die Verbindung in der Lage ist, HIV-1 durch Kultivierung der Verbindungen mit HIV-1 für eine Stunde bevor der Virus zu H9 Zellen hinzugefügt wird, zu inaktivieren.
(b) Bestimmen, ob es sich beim Wirkungsmechanismus der Verbindung um eine Konkurrenz mit HIV um den selben Rezeptor (CD4) auf der Zelloberfläche handelt. Dies kann durch Zusammengeben von HIV-1, Biphenyl-Derivat und H9 Zellen und dann Überwachen der in der Gegenwart oder Abwesenheit des Biphenyl-Derivates produzierten Virusmenge getestet werden.
(c) H9 können ebenfalls mit den Verbindungen vorbehandelt werden, um zu bestimmen, ob das Arzneimittel auf die Zellen oder den Virus wirkt.
(d) Molekularbiologische Studien, in welchen DNA und/oder RNA Konzentrationen gemessen werden können, die mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindungen behandelt wurden. Dies wird bevorzugt, wo negative Ergebnisse von einem oder mehreren Verfahren (a)–(c) erhalten wurden. Es können sowohl zelluläre und/oder regulatorische Element untersucht werden.

Die Verbindungen können ebenfalls in der Gegenwart von Nukleosidanaloga (AZT, ddI, ddC) oder anderen akzeptierten Anti-HIV-Mittel, getestet werden, um zu bestimmen, of die Biphenyl-Derivate synergistisch mit einem beliebigen der derzeitig lizenzierten antiretroviralen Mitteln sind, welche schließlich ihre individuelle unterdrückende Fähigkeit, speziell bei niederen Konzentrationen, zu erhöhen.
Zumindest eine Verbindung der gegenwärtigen Erfindung kann für die Behandlung retroviraler (z.B., HIV) Infektionen entweder alleine, oder in Kombination mit anderen im Stand der Technik bekannten Therapiearten, verwendet werden. Solche Therapiearten können die Chemotherapie mit Arzneimittel, wie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, zumindest eines von AZT, ddC, ddA, ddT, ddI, oder jedes beliebige andere antiretrovirale Mittel, in Kombination miteinander, oder in Verbindung mit einem biologisch-basierenden Therapeutikum, wie, zum Beispiel, lösliches CD4, Antikörper zu CD4, und Konjugate zu CD4 oder Anti-CD4, oder wie zusätzlich hierin dargestellt, beinhalten.
Da die Verbindungen der gegenwärtigen Erfindungen relativ weniger toxisch oder im Wesentlichen nicht-toxisch für normale Zellen sind, ist ihr Nutzen nicht auf die Behandlung etablierter retroviraler Infektion beschränkt. Zum Beispiel kann ein Biphenyl-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung, zum Behandeln von Blutprodukten, wie z. B., jene die in der Blutbank aufbewahrt werden, verwendet werden. Die nationale Blutversorgung wird derzeit auf Antikörper gegen HIV getestet. Der Test ist jedoch nach wie vor mangelhaft und Proben, die einen negativen Test ergeben, können immer noch HIV Virus enthalten. Behandeln des Bluts und der Blutprodukte mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann einen zusätzlichen Sicherheitsbereich hinzufügen, indem jeder Retrovirus, der nicht nachgewiesen worden war, abgetötet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen der gegenwärtigen Erfindung können zumindest eine Verbindung der gegenwärtigen Erfindung aufweisen. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können weiters andere antivirale Mittel wie, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, AZT, ddI, 2'-β-Fluoro-ddI, ddA, ddG, ddC, 2'-β-Fluoro-ddC, d4T, AzddU, Phosphonylmethoxyethyl-Adenin, oder lösliches CD4, oder Immunomodulatoren, z. B. wie unten dargestellt, aufweisen. Für einen Überblick über therapeutische Mittel in HIV Infektionen, siehe, z.B., Mitsuya et al., FASEB J. 5: 2369–2381 (1991), welche Referenz durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
Zusätzlich geeignete antivirale Mittel für die optimale Verwendung mit zumindest einer Verbindung der gegenwärtigen Erfindung, können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, einschließen, A1-721 (Lipid-Mischung, hergestellt von Ethigen Corporation und Matrix Research laboratories; Amphotericin B Methylester; Ampligen (unstimmige RNA) entwickelt von DuPont/HEM Research; Anti-AIDS Antikörper (Nisshon Food); AS-101 (Schwermetall-basierendes Immunostimulant); AZT (Azidothymidine/Retrovir/Zidovudin), hergestellt von Burroughs Wellcome; Betseron (β-Interferon) hergestellt von Triton Biosciences (Shell Oil); butyliertes Hydroxytoluen; Carrosyn (Polymannoacetat) Castanospermin; Contracan (Stearinsäure-Derivat); Creme Pharmatex (enthält Benzalkoniumchlorid) hergestellt von Pharmalec; CS-87 (5-unsubstituierte Derivate von Zidovudin); Cytovene (Ganciclovir) hergestellt von Syntex Corproation; ddC (Dideoxycytidin) hergestellt von Hoffmann LaRoche, und andere Nukleosid-Analoga; Dextransulfat; D-Penicillamin (3-Mercapto-D-valin) hergestellt von Carter Wallace und Degussa Pharmaceutical; Foscarnet (Trinatriumphophonoformat) hergestellt von Astra AB; Fusidinsäure hergestellt von Leo Lovens, Glycyrrhizin (ein Bestandteil der Lakritzenwurzel); HPA-23 (Ammonim-21-wolfram-9-antimonat) hergestellt durch Rhone-Poulenc Santé; humanes immunes Virus Viruzid entwickelt von Porton Products International; Ornidyl (Eflornithin) hergestellt von Merrell-Dow; Nonoxinol; Pentamidin Isethionat (PENTAM-300) hergestellt von Lypho Med; Peptid T (Octapeptid Sequenz) hergestellt Peninsula Laboratories; Phenytoin (Warner-Lambert); Ribavirin; Rifabutin (Ansamycin) hergestellt von Adria Laboratories; rsT4 (rekombinantes lösliches T4) hergestellt von Biogen, Genentech und Smith Kline Beecham; Trimetrexat hergestellt von Warner-Lambert Company; SK-818 (Germanium-abgeleitetes Viruzid) hergestellt von Sanwa Kagaku; Suramin und Analoga davon hergestellt von Miles Pharmaceuticals; UA001 hergestellt von Ueno Fine Chemicals Industry; Wellferon (α-Interferon) hergestellt von Burroughs Wellcome; Zovirex (Acylovir) hergestellt von Burroughs Wellcome.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der gegenwärtigen Erfindung können weiters Immunmodulatoren aufweisen. Zu geeigneten Immunmodulatoren für die optimale Verwendung mit zumindest einer Verbindung der gegenwärtigen Erfindung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, AEPP (Bropririmin); Ampligen (unstimmige RNA) DuPont/HEM Research; Anti-human Interferon-α-Antikörper (Advance Biotherapy and Concepts); Anti-AIDS-Antikörper (Nisshon Food); A-101 (Schwermetall-basierende Immunstimulanzien; Ascorbinsäure und Derivate davon; Interferon-β; Carrosyn (Poymannoacetat); Ciamexon (Boehringer-Mannheim); Cyclosporin; Cimetidin; CL-246,738 (American Cyanamid); Koloniestimulierende Faktoren, einschließlich GM-CSF (Sandoz, Genetics Institute); Dinitrochlorobenzen; Interferon-β, Interferon-gamma; Glucan; Hyperimmun gamma-Globulin (Bayer); IMREG-1 (Leukozyt Dialysat) und IMREG-2 (IMREG Corp.); Immuthiol (Natriumdiethylthiocarbamat) (Institut Merieux); Interleukin-1 oder Interleukin-2 (Cetus Corporation; Hoffmann-LaRoche; Immunex); Isoprinosin (Inosinpranobex); Krestin (Sankyo); LC-9018 (Yakult); Lentinan (Ajinomoto/Yamanouchi); LF-1695 (Fournier); Methioninenkaphalin (TNI Pharmaceuticals; Sigma Chemicals); Minophagen C; Muramyltripeptid, MTP-PE (Ciba-Geigy); Naltrexon („Trexan", DuPont); Neutropin; PNA Immunmodulator (Nippon Shingaku); Shosaikoto und Ginseng; Thymus-Humoral-Faktor; TP-05 (Thymopentin, Ortho Pharmaceuticals); Thymosin Faktor 5 und Thymosin 1; Thymostimulin; TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) hergestellt von Genentech; und Vitamin B Zubereitungen.
Die bevorzugten tierischen Lebewesen der gegenwärtigen Erfindung sind Säugetiere und Vögel, wobei Säugetiere mehr bevorzugt werden. Mit dem Ausdruck „Säugetier" wird ein Individuum gemeint, das zu der Klasse Säugetiere (Mammalia) gehört. Die Erfindung ist besonders für die Benhandlung von humanen Patienten nützlich.
Ein Medikament wird als in „Kombination" mit einem anderen bereitgestellt betrachtet, wenn sie einem Patienten gleichzeitig bereitgestellt werden oder wenn die Zeit zwischen der Verabreichung jedes Medikamentes so ist, dass eine Überlappung zwischen den biologischen Aktivitäten zugelassen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest eine Verbindung der vorliegenden Erfindung in einer einzigen pharmazeutischen Einzelzusammensetzung vorhanden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verabreichung gemäß der vorliegenden Erfindung können zumindest eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer pharmazeutisch akzeptablen Form aufweisen, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Diese Zusammensetzungen können durch jedes Mittel, welches ihr beabsichtigtes Ziel erreicht, verabreicht werden. Mengen und Regeln für die Verabreicherung eines Biphenyl-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung können leicht durch einen Fachmann auf dem Gebiet der klinischen Behandlung einer retroviralen Pathologie bestimmt werden.
Zum Beispiel, kann die Verabreichung parenteral, wie auf subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, transdermalem, oder bukkalem Weg erfolgen. Die Verabreichung kann alternativ, oder gleichzeitig, auf oralem Weg erfolgen. Die verabreichte Dosierung hängt vom Alter, der Gesundheit, und Gewicht des Empfängers ab. Art der vorherigen oder gleichzeitigen Behandlung, wenn überhaupt, der Häufigkeit der Behandlung, und der Natur der gewünschten Wirkung ab.
Zusammensetzungen innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung beinhalten alle Zusammensetzungen, die zumindest eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um ihren beabsichtigten Zweck zu erfüllen, aufweisen. Während sich individuelle Bedürfnisse ändern, ist die Bestimmung des optimalen Bereichs der wirksamen Mengen innerhalb des Fachkönnens. Typische Dosierungen weisen etwa 0,1 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht auf. Die bevorzugten Dosierungen weisen etwa 1 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht des Wirkstoffes auf. Die am meisten bevorzugten Dosierungen weisen etwa 10 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht auf.
Die therapeutische Verabreichung kann ebenfalls eine frühere, gleichzeitige, spätere oder adjunktive Verabreichung von zumindest einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines anderen therapeutischen Wirkstoffs, wie ein antivirales oder immunstimulierendes Mittel beinhalten. Bei einem solchen Ansatz, kann die Dosierung des zweiten Arzneistoffes gleich wie oder unterschiedlich zu der Dosierung des ersten therapeutischen Wirkstoffes sein. Vorzugsweise wird der Arzneistoff auf alternativen Wegen in den empfohlenen Mengen jedes Arzneimittels verabreicht.
Verabreichung der Verbindung der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls auch eine frühere, gleichzeitige, spätere oder adjunktive Therapie unter Verwendung von Immunsystem-Verstärkern oder Immunmodulatoren enthalten. Zusätzlich zu den pharmakologisch-aktiven Substanzen, kann eine pharmakologische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger, welche Exzipienten und Hilfsstoffe aufweisen, die die Verarbeitung des Wirkstoffes in eine pharmazeutisch verwendbare Zubereitung fördern, enthalten. Vorzugsweise enthalten die Zubereitungen, insbesondere jene Zubereitungen, die oral verabreicht werden können und die für die bevorzugte Art der Administration verwendet werden können, wie Tabletten, Dragees, und Kapseln, und auch Zubereitungen, die rektal verabreicht werden können, wie Suppositorien, sowie geeignete Lösungen für die Verabreichung durch Injektion oder oral, von etwa 0,01 bis 99 Prozent, vorzugsweise von etwa 20 bis 75 Prozent Wirkstoff, zusammen mit dem Exzipienten.
Pharmazeutische Zubereitungen der vorliegenden Erfindung werden auf eine Art hergestellt, die an sich bekannt ist, zum Beispiel, mittels herkömmlicher Misch-, Granulier-, Drageeerzeugungs-, Auflösungs- oder Lyophilisierungsverfahren hergestellt. Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können somit durch Kombinieren des Wirkstoffes mit festen Exzipienten, gegebenenfalls Vermahlen der resultierenden Mischung, und Verarbeiten der Granulatmischung erhalten werden, nachdem, wenn gewünscht oder notwendig, geeignete Hilfsstoffe hinzugefügt wurden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten.
Geeignete Exzipienten sind, z.B. Füllstoffe wie Saccharide, zum Beispiel, Lactose oder Sucrose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulose-Zubereitungen und/oder Calciumphosphate, wie Tricalciumphophat oder Calciumhydrogenphosphat; sowie Bindemittel wie Stärkepaste, unter Verwendung zum Beispiel von, Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragant, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, und/oder Polyvinylpyrrolidon. Wenn gewünscht, können Sprengmittel hinzugefügt werden, wie die oben genannten Stärken und auch Carboxymethyl-Stärke, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
Hilfsstoffe sind, vor allem, fließregulierende Mittel und Gleitmittel, zum Beispiel, Siliziumdioxid, Talk, Stearinsäure und Salze davon, wie Magnesiumstearat oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglykol. Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen, welche, wenn gewünscht, gegenüber dem Magensaft resistent sind. Für diesen Zweck können konzentrierte Saccharidlösungen verwendet werden, welche gegebenenfalls Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten. Um gegenüber dem Magensaft resistente Überzüge herzustellen, werden Lösungen geeigneter Zellulose-Zubereitungen wie Acetylzellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylzellulosephthalat verwendet. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Dragee-Überzüge hinzugefügt werden, zum Beispiel, für die Identifikation oder um Kombinationen von Wirkstoffdosen zu charakterisieren.
Andere pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, schließen Steckkapseln aus Gelatine, sowie, weiche, versiegelte Kapseln ein, die aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerol oder Sorbitol hergestellt sind. Die Steckkapseln können den Wirkstoff in Form von Granulaten enthalten, welche mit Füllstoffen wie Lactose, Bindemittel wie Stärken, und/oder Schmiermittel wie Talk oder Magnesiumstearat und, gegebenenfalls, Stabilisatoren vermischt sein können. In Weichkapseln sind die Wirkstoffe vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert, wie Fettöle oder flüssiges Paraffin. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugefügt sein.
Mögliche pharmazeutische Zubereitungen, die rektal verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Suppositorien, die aus einer Kombination des aktiven Wirkstoffs und einer Zäpfchenbasis bestehen. Geeignete Zäpfchenbasen sind, zum Beispiel, natürliche oder synthetische Triglyceride, oder Paraffin-Kohlenwasserstoffe. Zusätzlich ist es möglich rektale Gelatinekapseln zu verwenden, welche aus einer Kombination des Wirkstoffs und einer Basis bestehen. Mögliche Basismaterialen umfassen, zum Beispiel, flüssige Triglyceride, Polyethylenglykole, oder Paraffin Kohlenwasserstoffe.
Geeignete Formulierung für eine parenterale Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlöslicher Form, zum Beispiel, wasserlösliche Salze. Zusätzlich können Suspensionen des Wirkstoffs als entsprechende ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen, welche Substanzen enthalten können, die die Viskosität der Suspension erhöhen, enthalten Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol, und/oder Dextran. Die Suspension kann gegebenenfalls auch Stabilisatoren enthalten.
Eine pharmazeutische Formulierung für die systemische Verabreichung gemäß der Erfindung kann für eine enterale, parenterale oder topische Verabreichung formuliert sein. In der Tat können alle drei Formulierungsarten gleichzeitig verwendet werden, um eine systemische Verabreichung des Wirkstoffes zu erreichen.
Geeignete Formulierungen für die orale Verabreichung umfassen Hart- oder Weichgelatinekapseln, Dragees, Pillen, Tabletten, einschließlich überzogene Tabletten, Elixiere, Suspensionen, Sirups oder Inhalationen und verzögerte Freisetzungsformen davon.
Feste Dosierungsformen umfassen zusätzlich zu jenen für die orale Verabreichung formulierte Formen rektale Suppositorien.
Die Verbindungen der gegenwärtigen Verbindung können ebenfalls in der Form eines Implantats verabreicht werden, wenn sie mit einem biologisch-abbaubaren langsamfreisetzenden Träger verbunden sind. Alternativ kann zumindest eine Verbindung der vorliegenden Erfindung als transdermales Pflaster für die kontinuierliche Freisetzung des Wirkstoffes formuliert werden.
Geeignete Formulierungen für die topische Verabreichung beinhalten Cremen, Gele, Gelee, Schleime, Pasten und Salben. Geeignete injizierbare Lösungen schließen intravenös subkutan und intramuskulär injizierbare Lösungen ein. Alternativ kann zumindest eine Verbindung in der Form einer Infusionslösung oder als eine nasale Inhalation oder Spray verabreicht werden.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden, welche nur als Erklärung vorgesehen sind, und nicht beabsichtig sind, die vorliegende Erfindung, außer wenn angegeben ist, einzuschränken.
Beispiele
Allgemeine experimentelle Verfahren
Alle Schmelzpunkte wurden mit einer Fischer-Johns-Schmelzpunk-Apparatur bestimmt und sind nicht korrigiert. IR Spektra wurden mit einem Perkin-Elmer Spektrometer Modell 1320 aufgezeichnet. ¹H NMR Spektra wurden unter Verwendung eines Bruker AC-300 Instruments mit TMS oder Trimethylsilylpropionat-d4 (für D₂O Lösungsmittel) als internen Standard erhalten, und die chemischen Verschiebungen werden in 6 (ppm) angegeben. Massenspektra werden mit einem VG Trio-1000 gemessen. Elementaranalysen wurden durch Atlantic MicroLab Inc. Norcross, GA durchgeführt. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf vorbeschichteten Kieselgel 60 F₂₅₄ Platten (0,20 mm, Merck) ausgeführt und die Punkte (spots) wurden durch UV Beleuchtung nachgewiesen. EM Kieselgel 60 (70–230 mesh ASTM) wurde für die Säulenchromatographie verwendet. Eine wässrige 0,0982N NaOH Lösung wurde von Aldrich gekauft. Alle neuen Verbindungen wurden durch ¹H NMR und IR Spektralanalysen und Elementaranalysen charakterisiert.
Beispiel 1
Bromierung von Biphenyl-Verbindungen.
Die folgenden Biphenyl-Verbindungen wurden als Ausgangsmaterial eingesetzt: 4,4'-Dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl, 4,4',5,5'-Tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl, 4,4',5,5'-Tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-2,2'-dihydroxymethyl-biphenyl. Eine Lösung des Biphenyls (300–500 mg, 0,66–1 mmol) in Chloroform (8–10 ml) wurde tropfenweise zu Brom (1 oder 2 Moläquilvalent) in Chloroform (5–8 ml) bei 0–5°C hinzugefügt. Die Temperatur wurde auf Raumtemperatur erhöht und die Mischung wurde 3 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eine 20% wässrige Natriumbisulfit-Lösung (40–50 mL) geschüttet, die mit Chloroform extrahiert wurde. Die Chloroform-Schicht wurde nacheinander mit 5% wässrigem Natriumbicarbonat, Wasser, und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rückstand wurde aus EtOH kristallisiert oder durch Kieselgel-Chromatographie [Hexan-Ethylacetat (7:1 oder 4:1)] gereinigt um Mono- oder Dibromid zu ergeben.
3-Brom-4,4'-Dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (4). Ausbeute: 85%; Schmelzpunkt 157–159°C; IR (KBr) 1720 (CO)cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,62 (s, 3h, 2'-COOCH₃) 3,71 (s, 3H, 2-COOCH₃), 3,97 (s, 3H, 4'-OCH₃), 4,08 (s, 3H, 4-OCH₃), 6,01, 6,04 (m, 4H gesamt, -OCH₂O-), 7,33 (s, 1H, H-3'). Analyse: (C₂₀H₁₇O₁₀Br) C, H.
3,3'-Dibrom-4,4'-Dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (5). Ausbeute: 98%; Schmelzpunkt 227–229°C; IR (KBr) 1710 (CO)^–1; ¹H NMR(CDCl₃) δ 6,01, 6,03 (jedes s, 2H-OCH₂O). Analyse: (C₂₀H₁₆O₁₀Br₂) C, H, Br.
2,2'-Dimethoxycarbonyl-3-Brom-4,4',5,5'-tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-biphenyl (16). Ausbeute: 85%; Ein weißes amorphes Pulver, ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,51, 3,60, 3,73, 3,74 (jedes s, 3H, OCH₃), 5,10 – 5,16 (m, 8H gesamt, PhCH₂O), 7,27–7,53 (m, 21H gesamt, aromatisches-H und H-3'). Analyse: (C₄₆H₄₁O₁₀Br) C, H.
2,2'-Dimethoxycarbonyl-3,3'-Dibrom-4,4',5,5'-tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-biphenyl (17). Ausbeute: 90%; Ein weißes amorphes Pulver, ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,61, 3,79 (jedes s, 6H, OCH₃), 5,10–5,12 (m, 8H gesamt, PhCH₂O), 7,33–7,50 (m, 20H gesamt, aromatisches-H). Analyse (C₄₆H₄₀O₁₀Br₂) C, H, Br.
2,2'-Dihydroxymethyl-3-Brom-4,4',5,5'-tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-biphenyl (18). Ausbeute: 76%; Ein weißes amorphes Pulver, ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,60, 3,67 (jedes s, 3H, OCH₃), 4,09, 4,17, 4,25, 4,50 (jedes d, J = 12 Hz, 1H, CH₂OH), 5,09–5,16 (m, 8H gesamt, PhCH₂O), 7,00 (s, 1H, H-3'), 7,28–7,55 (m, 20H gesamt, aromatische-H). Analyse (C₄₄H₄₁O₈Br) C, H.
2,2'-Dihydroxymethyl-3,3'-Dibrom-4,4',5,5'-tetrakis(benzyloxy)-6,6'-dimethoxy-biphenyl (19). Ausbeute: 78%; Ein weißes amorphes Pulver, ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,61 (jedes s, 3H, OCH₃), 4,50, 4,56 (jedes d, J = 12 Hz, 1H, CH₂OH), 5,11 (s, 4H, PhCH₂O), 5,13, 5,18 (jedes d, J = 12 Hz, 2H, PhCH₂O), 7,32–7,55 (m, 20H gesamt, aromatische-H). Analyse (C₄₄H₄₀O₈Br) C, H.
Beispiel 2
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dicarboxy-biphenyl (6)
Eine Lösung von 3 (500 mg, 0,87 mmol) in wässriger 40% Kaliumhydroxid-Lösung (12 ml) und Ethanol (20 ml) wurde für 4,5 Stunden rückflussgekocht. Nach dem Kühlen, wurde die Reaktionsmischung mit 37% Salzsäure neutralisiert. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, und getrocknet, um die Dicarbonsäure (6) zu ergeben. Ausbeute: 90%; Schmelzpunkt 230°C (Zersetzung); IR (KBr) 3000 – 2500 (COOH), 1690 (CO) cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 4,03 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 5,95, 6,0 (jedes s, 2H, -OCH₂O-), MS m/z (%) 546 (M)⁺(24) 548 (M + 2)⁺(48) 550 (M + 4)⁺(23). Analyse (C₁₈H₁₂O₁₀Br₂) C, H, Br.
Beispiel 3
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dicarboxy-biphenyl-dinatriumsalz (7)
Eine Lösung von 6 (107,2 mg, 0,1963 mmol) in wässriger 0,0892N Natriumhydroxid-Lösung (4 ml, 0,3928 mmol) wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, um das Dinatriumsalz (7) als einen weißen Feststoff (114 mg) zu erhalten. Ausbeute: 98%; Schmelzpunkt 153°C (Zersetzung); IR (KBr) 1585, 1380 (COO^–) cm^–1; ¹H NMR (D₂O) δ 3,93 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 5,85, 5,90 (jedes s, 2H, -OCH₂O-); Analyse (C₁₈H₁₀Br₂Na₂·2H₂O) C, H.
Beispiel 4
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-biphenyl-2,2'-dicarbonsäureanhydrid (8).
Eine Lösung von 6 (200 mg, 0,36 mmol) in Essigsäureanhydrid (3 ml) wurde unter Rühren für 24 Stunden rückflussgekocht. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, und der Rückstand in Wasser geschüttet. Der resultierende cremefarbige Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Die Kristallisation aus Ethylacetat ergab 8 (179 mg) als weißen Feststoff. Ausbeute 93%; Schmelzpunkt 258°C, IR 1800, 1770 (CO-O-CO) cm^–1; MS (%) m/z 528 (M)⁺(31), 530 (M + 2)⁺(59), 532 (M + 4)⁺(29); ¹H NMR (CDCl₃) δ 4,11 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 6,06, 6,11 (jedes s, 2H, -OCH₂O-); Analyse (C₁₈H₁₀Br₂)C, H, Br.
Beispiel 5
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2-ethoxycarbonyl-2'-carboxy-biphenyl (9)
Eine Lösung von 8 (150 mg, 0,284 mmol) in Ethanol (25 ml) wurde unter Rühren für 3 Stunden rückflussgekocht. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Abdampfen, wurde der Rückstand mit einer wässrigen 5% Natriumhydroxid-Lösung (20 ml) behandelt, mit Ethylacetat gewaschen, mit 10% wässriger Salzsäure angesäuert, und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Schicht wurde bis zur Trockenheit konzentriert um 9 (134 mg) als weißes Pulver zu erhalten. Ausbeute: 84%; Schmelzpunkt 239°C (Zersetzung); IR (KBr) 3000–2500 (COOH), 1725 (CO) cm^–1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 0,98 (t, J = 7 Hz, 3H, CH₃), 3,99, 4,00 (jedes s, 3H, 4,4'-OCH₃), 3,99–4,06 (m, 2H, OCH₂), 6,00–6,12 (m, 4H, 2x-OCH₂O-); Analyse. (C₂₀H₁₆O₁₀Br₂·1,5H₂O) C, H, Br.
Beispiel 6
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2-ethoxycarbonyl-2'-carboxy-biphenyl-Mononatriumsalz (10)
Eine Lösung von 9 (56 mg, 0,0982 mmol) in 0,0982 N wässriger Natriumhydroxid Lösung (1 ml, 0,0982 mmol) wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen. Die Aufarbeitung wie für 7 ergab das Mononatriumsalz (10) (52 mg) als einen weißen Feststoff. Ausbeute: 90%, Schmelzpunkt 227°C; IR (KBr) 1725 (CO) 1590, 1380 (COO^–) cm^–1; ¹H NMR (D₂O) δ 0,92 (t, J = 7 Hz, 3H, CH₃), 3,93, 3,94 (jedes s, 3h, 4,4'-OCH₃), 4,09 (q, J = 7 Hz, 2H, OCH₂), 5,91 (m, 4H, 2x-OCH₂O-); Analyse. (C₂₀H₁₅O₁₀Br₂Na) C, H, Br.
Beispiel 7
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2-carboxy-2'-(β-N,N,N-trimethylamino)ethoxycarbonyl-biphenylchlorid (11)
Eine Mischung aus 8 (950 mg, 1,8 mmol) und Cholinchlorid (250 mg, 1,8 mmol) in Pyridin (3 ml) und DMF (2 ml) wurde bei Raumtemperatur für 5 Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockenheit konzentriert, um einen cremefarbigen Feststoff zu ergeben. Die Kristallisation aus Methanol ergab 11 (1,028) als farblose Prismen. Ausbeute: 85%; mp 210°C (Zersetzung); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 3,11 (br s, 9H, N-CH₃), 3,40 (t, J = 6 Hz, 2H, N-CH₂), 3,82 (m, 2H, CH₂O), 3,97 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 5,96, 6,03 (jedes s, 2H, -OCH₂O-); Analyse. (C₂₃H₂₄N₁₀Br₂Cl) C, H.
Beispiel 8
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2-carboxy-2'-(β-N-piperazin)ethylcarbonyl-biphenyl (12)
Eine Mischung aus 8 (528 mg, 1,1 mmol) und 1-(2-Aminoethyl)piperazin (0,15 ml, 1,1 mmol) in Benzen (25 ml) wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockenheit konzentriert, um einen cremefarbigen Feststoff zu erhalten. Die Kristallisation aus Methanol ergab 12 (693 mg) als einen cremefarbigen Feststoff. Ausbeute: 99%; Schmelzpunkt 184°C (Zersetzung); ¹H NMR (CD₃OD) δ 2,52 (4H, m, 2xNHCH₂ von Piperazin), 2,84 (2H, t, J = 6 Hz, 2'CONHCH₂), 2,88 (6H, m, 3xNCH₂), 3,98 (6H, s, 4,4'-OCH₃), 5,86, 5,93 (jedes 2H, s, -OCH₂O-); Analyse. (C₂₄H₂₅N₃O₉Br₂·2H₂O) C, H.
Beispiel 9
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2-carboxy-2'-(β-N-pyrrolidinyl)ethylcarbonyl-biphenyl Hydrobromid (13)
Eine Mischung von 8 (150 mg, 0,284 mmol) und 1-(2-aminoethyl)piperazin (0,3 ml, 2,3 mmol) in Benzen (10 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockenheit konzentriert, um einen cremefarbigen Feststoff zu erhalten. Die Kristallisation aus 2% HBr enthaltendem Ethanol ergab 13 (122 mg) als weißes Pulver. Ausbeute: 58%; Schmelzpunkt 188°C (Zersetzung); IR (KBr) 1710 (CO) 1610, 1590 (Amid) cm^–1; ¹H NMR (CD₃OD) δ 2,04, 2,52 (jedes m, 2H, CH₂), 3,16 (t, J = 6 Hz, 2H, 2'-CONHCH₂), 3,41 (m, 4H, 2xNCH₂), 3,58 (m, 4H, 2xNCH₂), 3,58 (m, 4H, 2xNCH₂ von Pyrrolidin), 4,00, 4,11 (jedes s, 3H, 4,4'-OCH₃), 6,02, 6,08 (jedes s, 2H, -OCH₂O-); Analyse. (C₂₄H₂₅N₂O₉Br₃·H₂O) C, H.
Beispiel 10
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dicarboxy-biphenyl-di-1-(2-hydroxyethyl)pyrrolidiniumsalz (14)
Eine Mischung aus 6 (528 mg, 1 mmol) und 1-(2-Hydroxyethyl)pyrrolidin (0,2 ml) in Pyridin (2 ml) und DMF (2 ml) wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bis zu Trockenheit konzentriert, und der Rückstand wurde mit Aceton gewaschen, um 14 (363 mg) als weißen Feststoff zu erhalten. Ausbeute: 49%; Schmelzpunkt: 149–151°C; IR (KBr) 1580, 1370 (COO^–) cm^–1; 1 ¹H NMR (D₂O) δ 1,95 (m, 8H, 4xCH₂ von Pyrrolidin), 3,19 (t, J = 5 Hz, 4H, 2xNCH₂), 3,26 (m, 8H, NCH₂ von Pyrrolidin), 3,75 (t, J = 5 Hz, 4H, CH₂O), 3,93 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 5,83, 5,88 (jedes s, 2H, OCH₂O); Analyse. (C₃₀H₃₈N₂O₁₂Br₂) C, H.
Beispiel 11
3,3'-Dibrom-4,4'-dimethoxy-5,6,5'6'-bimethylendioxy-2,2'-dihexanoxycarbonyl-biphenyl (15)
Zu einer Lösung von 6 (273 mg, 0,5 mmol) in 1-Hexanol (7 ml) wurde tropfenweise Thionylchlorid (2 ml) hinzugefügt, und die Mischung wurde für 3 Stunden rückflussgekocht. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockenheit konzentriert, und der Rückstand wurde einer Silicagel-Chromatographie unterzogen. Elution mit Cyclohexan-Ethylacetat (4:1) ergab 15 (134 mg) als weißes Pulver. Ausbeute: 37%, Schmelzpunkt 115–117°C; IR (KBr) 2960, 2930, 2860 (CH₂), 1730 (CO) cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H, 2xCH₃), 1,25 (m, 12H, 6xCH₂), 1,47 (m, 4H, 2xCH₂), 4,07 (s, 6H, 4,4'-OCH₃), 4,07–4,17 (m, 4H, 2xCH₂O), 5,99, 6,01 (jedes s, 2H, OCH₂O); Analyse. (C₃₀H₃₆O₁₀Br₂) C, H, Br.
Beispiel 12
Gesamtsynthese von DDB Derivaten aus Gallussäure
Methyl 2,3,4-trihydroxybenzoat (120)
6 Gramm (94 mmol) 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure in 200 ml Methanol wurde in der Gegenwart eines Molekularsiebes und 2 ml Schwefelsäure für fünf Tage rückflussgekocht. Nach der üblichen Aufbereitung, wurden 16,92 Gramm Methylester 111 mit einer Ausbeute von 98%, Schmelzpunkt 150–152°C (Rekristallisation aus Ethylacetat) erhalten.
IR cm^–1 3345 (br, s, OH), 1645 (chelatgebundenes Ester C=O) und 1260 (Ester C-O); ¹H NMR δ ppm 3,92 (s, 3H, OCH₃), 5,46 und 5,79 (jedes 2, 1H, OH austauschbar mit D₂O), 10,98 (s, 1H, chelatgebundenes OH), 6,51 und 7,35 (jedes d, J = 9Hz, 1H, ArH). Analyse: (C₈H₈O₅) C, H.
Methyl 2,3-dihydroxy-4-Methoxybenzoat (121)
Verbindung 120 (18,4 g, 0,1 mol) in einer 5% wässrigen Boraxlösung wurde mit 47 ml Methylsulfat und 100 ml 20% Natriumhydroxid-Lösung bei 30°C behandelt. Die Mischung wurde für fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Mischung in einem Eisbad gekühlt und mit Hydroxylchlorid (37%) auf pH 2 neutralisiert. Es entstand ein Niederschlag und dieser wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral war. Das getrocknete Produkt 121 wog 16,19 g (Ausbeute 86%) und wurde aus verdünntem wässrigem Ethanol als Nadeln rekristallisiert. Schmelzpunkt 100–101°C. IR cm^–1 3330 und 3420 (OH), 1660 (chelatgebundenes Ester C=O) und 1255 (Ester C-O); ¹H NMR δ ppm 3,94 und 3,95 (jedes, s, 3H, OCH₃), 5,51 (s, 1H, OH), 6,51 und 7,42 (jeweils d, J = 9 Hz, 1H, ArH), 10,84 (s, 1H, chelatgebundenes OH). Anal (C₉H₁₀O₅) C, H.
Methyl 2,3-Methylendioxy-4-methoxybenzoat (122).
Verbindung 121 (16,12 g, 0,081 mol) wurde in 500 ml DMF aufgelöst. Dann wurden 100 ml Methylenchlorid und 26 g (0,464 mol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Mischung wurde unter kräftigem Rühren für 6 Stunden auf 105°C erhitzt. Das Kaliumcarbonat wurde filtriert und das DMF im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Eiswasser geschüttet und über Nacht stehen gelassen. Das ausgefällte Produkt 122 wurde filtriert und mit Wasser gewaschen bis es neutral war. Der getrocknete grau-weiße Feststoff wog 15,60 g (Ausbeute 91%) und wurde aus Methanol als glänzende lange Nadeln rekristallisiert, Schmelzpunkt 122–124°C. IR cm^–1 1710 (Ester C=O); ¹H NMR δ ppm 3,90 (s, 3H, OCH₃), 3,95 (s, 3H, ArOCH₃), 6,11 (s, 2H, OCH₂O), 6,57 und 7,4 (each d, J = 9 Hz, 1H, ArH), Analyse (C₁₀H₁₀O₅) C, H.
Methyl 2,3-methylendioxy-4-methoxy-5-brombenzoat (123)
Verbindung 122 (5,56 g, 25,6 mmol) wurde in wasserfreiem Chloroform gelöst. Brom (4,5 g, 28,5 mmol) wurde über 2 Stunden bei 5–8°C tropfenweise hinzugefügt. Dann wurde die Mischung für zwei zusätzliche Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach der üblichen Aufarbeitung, wurden 6,9 g des weißen Feststoffs 123 erhalten (88% Ausbeute). Schmelzpunkt 165–6°C (Kristallisation aus Ethylacetat). IR cm^–1 1710 (s, C=O), 1425, 1400 (s, C-O); MS m/z (%): 288 (M⁺, 100), 290 (M + 2,96); ¹H NMR δ ppm 3,91 (s, 3H, OCH₃), 4,14 (s, 3H, ArOCH₃), 6,10 (s, 2H, OCH₂O), 7,65 (s, 1H, 6-ArH); Analyse (C₁₀H₉O₅Br) C, H, Br.
Methyl 2,3-methylendioxy-4-methoxy-5-iodbenzoat (124)
Eine Mischung aus trockenem Silbertrifluoracetat (442 mg, 2 mmol) und Verbindung 122 (420 mg, 2 mmol) wurden in einen Reaktionskolben platziert. Dann wurde eine Iod-Lösung (506 mg, 2 mmol) in wasserfreiem Methylenchlorat (8 ml) unter Rückfluss über eine Periode von 2 Stunden hinzugefügt. Zu dieser Reaktionsmischung wurde mehr Silbertrifluoracetat (40 mg) und Iod (59 mg) hinzugefügt und der Rückfluss wurde solange fortgesetzt, bis das Ausgangsmaterial in der Dünnschichtchromatographie nicht mehr zu sehen war. Die Mischung wurde dann filtriert und das Filtrat wurde konzentriert. Der resultierende gelbliche Feststoff wurde aus DMA als kurze Nadeln kristallisiert (190 mg, Ausbeute 28%). Schmelzpunkt 162–4°C. IR cm^–1 1706 (Ester C=O), 1390 (C-O); ¹H NMR δ ppm 3,90 (s, 3H, OCH₃), 4,13 (s, 3H, ArOCH₃), 6.10 (s, 2H, OCH₂O), 7,88 (s, 1H, ArH). Analyse (C₁₀H₉O₅I) C, H; I berechnet: 37,90, gefunden 37,80.
Methyl 2,3-methylendioxy-4-methoxy-5- und -6-nitrobenzoat (125 und 126)
Zu einer gerührten Suspension der Verbindung 122 (442 mg, 2 mmol) in Acetatanhydrid (5 ml), wurde über eine Periode von 20 Minuten tropfenweise konzentrierte Salzpetersäure (1 ml) hinzugefügt. Die Reaktionstemperatur wurde auf 10–22°C gehalten. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 30 Minuten gerührt und dann in Eiswasser geschüttet. Ein gelblicher Feststoff (437 mg) wurde gesammelt. Die Gesamtausbeute war 86%. Er wurde an einer Silicagel-Säulenchromatographie getrennt, um die 5-Nitroverbindung 125 und die 6-Nitroverbindung 126 (Verhältnis 1:10) zu erhalten.
125: Schmelzpunkt 162–4°C, ¹H NMR δ ppm 3,93 (s, 3H, OCH₃), 4.19 (s, 3H, AROCH₃), 6,23 (s, 2H, OCH₂O), 8,11 (s, 1H, 6-ArH). Analyse (C₁₀H₉NO₇) C, H, N.
126: Schmelzpunkt 145–7°C (gelbliche Nadeln aus Ethylacetat); IR cm^–1 1735 (s, C=O); MS m/z (%): 255 (M⁺, 100); ¹H NMR (CD₃COCD₃) δ ppm 3,86 (s, 3H, OCH₃), 4.04 (s, 3H, ArOCH₃), 6,31 (s, 2H, OCH₂O), 7,48 (s, 1H, 5-ArH). Analyse (C₁₀H₉NO₇) C, H, N.
Methyl 2,3-methylendioxy-4-methoxy-6- und 5-Aminobenzoat (127 und 128)
Eine Lösung von 126 (225 mg, 1 mmol) in Ethanol (10 ml) und Ethylacetat (5 ml) wurde in eine Reaktionsflasche gegeben und 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator (54 mg) wurde hinzugefügt. Wasserstoff wurde unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur und 1 Atmosphäre Druck für 4 Stunden hinzugefügt. Dann wurde der Katalysator filtriert, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die Amino-Verbindung 128 (148 mg) wurde dadurch mit einer Ausbeute von 93% erhalten. Schmelzpunkt 163–4°C. IR cm^–1 3450, 3320 (NH), 1665 (chelatierter Ester C=O); MS m/z (%): 225 (M⁺, 100); ¹H NMR (CD₃COCD₃) δ ppm 3.77 (s, 3H, OCH₃), 3,82 (s, 3H, ArOCH₃), 5,88 (s, 3H, OCH₂O), 6,02 (s, IH, 5-ArH), 6,21 (br. s, 1H, NH austauschbar mit D₂O), 10,72 (s, 1H, chelatiertes NH), Analyse (C₁₀H₁₁O₅N) C, H, N.
129 wurde aus 125 gemäß dem obigen Verfahren mit einer Ausbeute von 84% erhalten. Schmelzpunkt 139–40°C, ¹H NMR δ ppm 3,67 (br. s, 2H, NH₂), 3,89 (s, 3H, OCH₃), 4,09 (s, 3H, ArOCH₃), 5,99 (s, 2H, OCH₂O), 6,78 (s, 1H, 6-ArH), Analyse (C₁₀H₁₁O₅N·1/2H₂O) C, H.
Methyl 2,3-methylendioxy-4-methoxy-6-iodbenzoat (128)
Eine Suspension der Verbindung 127 (400 mg, 1,78 mmol) in 20% Schwefelsäure (2 ml) wurde auf 0–5°C gekühlt und anschließend wurde eine Natriumnitrit-Lösung (127 mg, 1,78 mmol) in Wasser (4 ml) hinzugefügt. Nach der Bildung des Diazoniumsalzes, wurde eine gekühlte Kaliumiodid-Lösung (332 mg, 2 mmol) in Wasser (2 ml) unter Gasentwicklung hinzugefügt. Kupferpulver (340 mg) wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 20 Minuten gerührt, und dann in einem Wasserbad für 1 Stunde auf 80–90°C erwärmt. Stickstoff entwich lebhaft. Sobald die Reaktion abgeklungen war, wurde die Mischung mit Chloroform extrahiert. Ein tiefrotes Öl (2,43 g) wurde erhalten und wurde durch Silikagel-Säulenchromatographie (Eluent Hexan:Chloroform = 4:1) gereinigt, und ergab 150 mg von 128 (25% Ausbeute). Schmelzpunkt 146–147°C (weißer Feststoff). IR cm^–1 1705 (C=O), 1285 und 1265 (s, C-O); MS m/z (%): 336 (M+, 100): ¹H NMR δ ppm 3,93 (s, 6H, 2xOCH₃), 6,07 (s, 2H, OCH₂O), 7,11 (s, 1H, ArH). Analyse (C₁₀H₉O₅I) C, H.
5,5'-Dimethoxy-3,4,3',4'-bismethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (ω-DDB) (116)
Verfahren A (Ullmann-Reaktion):
Eine Mischung aus Verbindung 128 (1 g, 2,85 mmol), aktiviertem Kupferpulver (1 g), einem wasserfreiem DMF (3,5 ml) wurde unter Rückfluss für 2,5 Stunden unter kräftigem Rühren erwärmt. Nach dem Kühlen auf 100°C, wurde die Mischung in Eiswasser geschüttet und der Niederschlag gesammelt und an Aluminiumoxid chromatographiert. Elution mit Hexan, dann Hexan-Chloroform ergab ω-DDB 116 (280 mg, 446 Ausbeute). Schmelzpunkt 253–5°C. IR cm^–1 1730 (C=O), 1175 und 1150 (s, C-O); MS m/z (%): 418 (M⁺, 100); ¹H NMR δ ppm 3,68 (s, 6H, 2xOCH₃), 3,92 (s, 6H, 2xOCH₃), 6,13 (s, 4H, 2xOCH₂O), 6,36 (s, 2H, 2xArH). Analyse (C₂₀H₁₈O₁₀) C, H.
Verfahren B:
Kupfer(II)sulfat (1,25 g) wurde in 5 ml 2.5 ml Ammoniumhydroxid (konzentriert) enthaltendem Wasser gelöst. Die Mischung wurde in einem Eisbad auf unter 10°C abgekühlt und eine Lösung aus 0,4 g Hydroxylaminchlorid in 2 ml Wasser und 1 ml Natriumhydroxid (6N) wurde hinzugefügt. Das Diazoniumsalz der Verbindung 127 (225 mg), hergestellt gemäß dem obigen Verfahren, das bei der Synthese von 128 oben angegeben ist, wurde unter kräftigem Rühren langsam zu der Kupfer(II)-Lösung hinzugefügt und unter <10°C behalten. Die blaue Farbe verblasste graduell. Die Mischung wurde für einige Minuten auf 80–90°C erwärmt, dann auf Raumtemperatur gekühlt und mit Salzsäure auf pH 2–3 neutralisiert. Nach der üblichen Aufarbeitung wurden 86 mg der reinen Verbindung 116 erhalten (41% Ausbeute).
2,2'-Dimethoxy-3,4,3',4'-bismethylendioxy-5,5'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (δ-DDB) (117)
Verfahren A (Ullmann Reaktion):
Verbindung 117 wurde unter Verwendung des Verfahrens 1, das in dem vorigen Beispiel beschrieben wurde, aus 123 mit einer Ausbeute von 10% erhalten. Schmelzpunkt 195–200°C. IR cm^–1 1700 8s, Ester C=O), 1430, 1270 und 1210 (s, C-O); MS m/z (%): 418 (M⁺, 100); ¹H NMR δ ppm 3,90 und 4,00 (jedes s, 3H, OCH₃), 6,13 (s, 4H, OCH₂O), 7,30 (s, 2H, ArH). Analyse (C₂₀H₁₈O₁₀) C, H.
Verfahren B:
Verbindung 117 wurde mit einer Ausbeute von 40% aus 129 unter Verwendung des im vorigen Beispiel beschriebenen Verfahrens erhalten.
Beispiel 13
Bromierung von Biphenyl-Derivaten
Eine Biphenyl-Verbindung in Chloroform wurde langsam in zwei Moläquivalente Brom bei 0–5°C getropft. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt und unter Rühren in Natriumdisulfid enthaltenes Eiswasser geschüttet bis die orange-rote Farbe vollständig verblasste. Die organische Phase wurde getrennt und nacheinander mit wässrigem Natriumbicarbonat, Wasser und Salzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Kristallisation gereinigt.
3,3'-Dibrom-6,6'-dimethoxy-4,5,4',5'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (118). Erhalten mit einer Ausbeute von 87% aus 123. Kristalle aus Chloroform und Methanol (2:1). Schmelzpunkt 181–2°C; MS m/z (%): 574 (M⁺, 48), 576 (M + 2, 100), 578 (M + 4, 51); ¹H NMR δ ppm 3,67 (s, 6H, 2,2'-OCH₃), 3,90 (s, 6H, 6,6'-OCH₃), 6,12 (s, 4H, 2xOCH₂O), Analyse (C₂₀H₁₆O₁₀Br₂) C, H.
3,3'-Dibrom-4,6'-dimethoxy-5,6,4',5'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (119). Erhalten mit einer Ausbeute von 82% aus 115. Kristalle aus Chloroform und Methanol (2:1). Schmelzpunkt 166–9°C; MS m/z (%): 574 (M⁺, 45), 576 (M + 2, 90), 578 (M + 4, 45), 59 (100); ¹H NMR δ ppm 3,68 und 3,69 (jedes s, 3H, 2,2'-OCH₃), 3,91 (s, 3H, 4-OCH₃), 4,09 (s, 3H, 6'-OCH₃), 5,98–6,08 (m, 4H, 2xOCH₂O), Analyse (C₂₀H₁₆O₁₀Br₂) C, H.
6,6'-Dibrom-5,5'-dimethoxy-3,4,3',4'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl (110). Erhalten mit einer Ausbeute von 98% aus 116. Schmelzpunkt 187–8°C (Kristalle aus Ethylacetat); MS m/z (%): 574 (M⁺, 50), 576 (M + 2, 100), 578 (M + 4, 50); ¹H NMR δ ppm 3,69 (s, 6H, 2,2'-OCH₃), 4,14 (s, 6H, 5,5'-OCH₃), 6,10 und 6,13 (jedes s, 4H, 2xOCH₂), Analyse (C₂₀H₁₆O₁₀Br₂·1/2H₂O) C, H.
ELEMENTARANALYSE
ELEMENTARANALYSE-fortgesetzt
Beispiel 14
Pharmakologische Aktivität
HIV Wachstumsinhibitionsuntersuchung
Die H9 T Zelllinie wurde in einer kontinuierlichen Kultur mit Komplettmedium (RPMI 1640 und 10% fötales Kälberserum), pharmakologischer Aktivität bei 5% CO₂ und 37°C geführt und in Experimenten nur dann verwendet, wenn sie in der log-Wachstumsphase war. Die Zellen wurden mit HIV-1 (IIIB Isolate, TCID₅₀ 10⁴ IU/ml), bei einer Infektionsdosis (multiplicity of infection) von 0,1–0,01 IU/Zelle) für 1 Stunde bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen, um unabsorbierte Virionen zu entfernen und bei 4 × 10⁵ Zellen/ml in Komplettmedium resuspendiert. Aliquote (1 ml) wurden in Kammern einer 24-Kammer-Kulturschale, welche das gleiche Volumen der Testverbindung (verdünnt in Kulturmedium) enthalten, platziert. Nach einer viertägigen Inkubation bei 37°C wurde die Zelldichte der uninfizierten Kulturen durch Zählen der Zellen in einem Coulter-Zähler bestimmt, um die Toxizität der Testverbindung zu bewerten. Eine p24-Antigen ELISA-Untersuchung wurde verwendet, um die Konzentration des von den HIV-infizierten Kulturen in das Medium freigesetzte Virus zu bestimmen. Die p24 Antigen-Untersuchung verwendet einen HIV-1 anti-p24 spezifischen monoklonalen Antikörper als Einfangantikörper, mit dem eine 96-Kammer-Platte beschichtet wurde. Im Anschluß an eine Probeninkubationsperiode wurde Kaninchenserum, welches Antikörper für HIV-1 p24 enthält, verwendet um jedes auf der Mirkoliter-Kammeroberfläche „gefangene" p24 zu markieren. Peroxidase konjugiertes Ziegen Anti-Kaninchen-Serum wird dann verwendet, um HIV-1 p24 spezifische Kaninchenantikörper, die mit dem gefangenen p24 komplexiert wurden, zu markieren. Das Vorhandensein von p24 in der Testprobe wird durch die Zugabe eines Substrats offenbart. p24 in dem Kulturmedium wurde mittels einer Standardkurve, die bekannte Menge an p24 enthält, quantifiziert. Die wirksamen (EC₅₀) und inhibitorischen (IC₅₀) Konzentrationen (für Anti-HIV-Aktivität bzw. Cytotoxizität) wurden bestimmt.
Zubereitung der HIV-1 Umkehrtranskriptase
HIV-1 Umkehrtranskriptase wurde unter Verwendung von PKRT 2 enthaltendem Escherichia coli J-M 109, welcher freundlicherweise von W.C. Summers (Yale University) zur Verfügung gestellt wurde, gereinigt.
Enzymuntersuchung
Alle Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl, welches 50 mM Tris HCl pH 7,8, 2 mM MgCl₂, 100 μg/ml Nuklease-freies BSA, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 O.D.₂₆₀ Einheiten/ml Matrizen-Primer, und 330 nM [³H]dNTP enthält, in Übereinstimmung mit Cheng et al. entwickelt.
Chronische HIV-infizierte Zelllinien.
Mit HIV-1 chronisch infizierte T-Zelllinie, ACH-2, und mit HIV-1 chronisch infizierte promonozytische Zelllinie, Ul¹⁶, wurden kontinuierlich in RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) geführt. Für alle Experimente wurden die Zellen nur dann verwendet, wenn sie in der log-Wachstumsphase waren. Zellen (1 × 10⁶ Zellen/Kammer) und entweder verschiedene 4,5, AZT-Konzentrationen oder Medium alleine wurden zu einer 24-Kammer-Platte in der Gegenwart oder Abwesenheit von PMA (10^–8 M) hinzugefügt. Nach 72 Stunden bei 37°C und 5% CO₂, wurde ein Aliquot des zellfreien Überstandes gesammelt und auf p24 Antigen mittels ELISA analysiert.
Ergebnisse
Die Anti-HIV-Aktivitäten der Biphenyl-Derivate werden in Tabelle IA gezeigt. Unter diesen Verbindungen, zeigte 3,3'-Dibrom-DDE (5) eine wirksame Anti-HIV-Aktivität mit einem EC₅₀ von 0,23 μg/ml und TI von >480. Ein Vergleich der Anti-HIV-Aktivitäten dieser Verbindungen weist darauf hin, dass eher die relative Position und Arten der Substituenten an den phenolischen Hydroxygupppen als die Anzahl der Brom-Atome an den aromatischen Ringen am wichtigsten sind. Die 2- (oder 2'-) Methoxycarbonyl- und 4- (oder 4') Methoxy-Gruppen am Biphenylring, wie sie in den Verbindungen 111 und 115 gefunden werden, bildeten ein essentielles Anti-HIV-Strukturmerkmal. Die Aktivität konnte dann, durch das Einführen eines Broms an der 3- oder 3'-Position, wie in den Verbindungen 4, 5, und 119 gefunden wird, verstärkt werden. Tabelle IA zeigt diese Struktur-Aktivitäts-Beziehung mit einer Reihenfolge der Aktivität von 5>4>119>111>115 (basierend auf 4). Die anderen 5 Verbindungen haben keine oder eine geringe Anti-HIV-Aktivität, ungeachtet dessen, ob Brom in dem Molekül vorhanden war. Der Austausch der Methylcarboxylat-Gruppen am C-2 und C-2' oder der Methoxy-Gruppen am C-4 und C-4' durch andere Gruppen führte zu eine Reduktion der Anti-HIV-Aktivität.
Die mit den Verbindungen 4 und 5 durchgeführten vorläufigen Wirkungsmechanismus-Studien haben eine Matrizen-Primer HIV-1 Umkehrtranskriptase inhibitorische Aktivität gezeigt. Diese Art der inhibitorischen Aktivität ist auch für andere nicht-Nukleosid HIV Umkehrtranskriptase-Inhibitoren beobachtet worden. Potente inhibitorische Wirkungen wurden auch mit 4 und 5 gegenüber der HIV-1 Umkehrtranskriptase assoziierten DNA Polymerase und RNase II Aktivitäten unter bestimmten Bedingungen, gefunden.
Die Strukturen von allen oben beschriebenen Biphenyl-Derivaten wurden durch ihre Spektraldaten und Elementaranalysen bestätigt.
Die Anti-HIV-Aktivität der oben beschriebenen Biphenyl-Derivate ist in Tabelle I gezeigt. Unter diesen Verbindungen, demonstrierte 3,3'-Dibrom-DDB, Verbindung 5, eine potente Anti-HIV-Aktivität mit einem EC₅₀ Wert von 0,23 μg/ml. Sie zeigte ebenfalls einen guten therapeutischen Index von >480. Verbindung 4, 3-Brom DDB, zeigte ebenfalls eine wirksame Anti-HIV-Aktivität, mit EC₅₀ und TI-Werten von 0,52 μg/ml bzw. 190. Der Vergleich der Anti-HIV-Aktivitäten der Verbindungen 3–5 deutet darauf hin, dass die Anzahl der Bromatome auf dem aromatischen Ring die Anti-HIV-Aktivität erhöhen könnte. Es wurde deshalb angenommen, dass die Verbindungen 16 und 17 aktiv sind, da die Verbindungen 4 und 16 bzw. 5 und 17 strukturell zueinander ähnlich sind, außer den Substituenten der phenolischen Hydroxy-Gruppen. Jedoch zeigten die Verbindungen 16 und 17 in den durchgeführten Tests keine Anti-HIV-Aktivität. Ähnlicherweise zeigten die Verbindungen 18 und 19 bis heute keine Anti-HIV-Aktivität, obwohl ihre Stammverbindung (2) eine Anti-HIV-Aktivität besitzt, die mit jener von DDB vergleichbar ist.
Das Austauschen der Methylcarboxylat-Gruppen am C-2 und C-2' durch Carbonsäuren (6, 9), Natriumcarboxylat (7), Alkylaminocarboxylate (11) und Alkylaminoamide (12, 13) führten bei allen zu einer Abnahme der Anti-HIV-Aktivität der Verbindungen.
Die inhibitorische Aktivität der Verbindungen 4 und 5 gegenüber HIV-1 rekombinante Umkehrtranskirptase-assoziierte Umkehrtranskriptase (RT) Aktivität wurde als eine Wirkungsmechanismusstudie untersucht. Wie in Tabelle II gezeigt ist, zeigten diese Verbindungen eine Matrizen-Primer abhängige HIV-1 RT inhibitorische Aktivität. Diese Art der inhibitorischen Aktivität wurde auch mit anderen HIV RT Inhibitoren beobachtet. Die Spektra der Matrizen-Primer-Abhängigkeit sind zwischen 4 und 5 verschieden. Im Fall von 4, war das Enzym 2mal sensitiver mit Poly(rC)–Olig(dG) als Matrizen-Primer als mit Poly(rA)–olig(dT). Im Gegensatz war das Enzym etwa 6mal sensitiver zu 5 mit Poly(rA)–Olig(dT) als Matrizen-Primer als mit Poly(rC)–Olig(dG). Nevarapin, ein nicht-Nukleosid RT-Inhibitor, weist eine höhere inhibitorische Aktivität mittels Poly(rC)–Olig(dG) als mit Poly(rA)–Olig(dT) auf. Die Verbindungen 4 und 5 demonstrierten ebenfalls eine potente inhibitorische Wirkung gegenüber HIV-1 Umkehrtranskirptase-assoziierte DNA Polymerase Aktivität unter Verwendung von Poly(dA)–Olig(dT) als Matrizen-Primer mit IC₅₀-Werten von 0,056 bzw. 0,048 μM. Ein Vergleich der inhibitorischen Aktivität gegenüber HIV-1 Umkehrtranskriptase-assoziierte Umkehrtranskriptase und DNA-Polymerase Aktivitäten unter Verwendung von Poly(rA)oligo(dt) bzw. Poly(dA)–Oligo(dT) als Matrizen-Primer offenbarte, dass die Verbindungen 4 und 5 eine etwa 40 bzw. 80fache höhere Wirksamkeit gegenüber DNA Polymerase Aktivität besitzen. Beide Verbindungen 4 und 5 könnten ebenfalls die HIV RT assoziierte RNase H-Aktivität inhibieren. Diese trat nur auf, wenn Poly(rG)poly(dC) als Substrat und Mn⁺² (0,4 nM) als zweiwertiges Kation verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen hatten die zwei Verbindungen beinahe die gleiche Wirksamkeit, wie in 1 gezeigt ist. Wenn Poly(rA)poly(dT) als Substrat, oder Mg⁺² als zweiwertiges Kation verwendet wurde, wurde keine Inhibierung beobachtet. Da HIV-1 RT eine wichtige Rolle in der HIV Replikation spielt, könnte die potentielle inhibitorische Aktivität der Verbindungen 4 und 5 gegenüber dieser Enzym katalysierten DNA-gerichteten DNA Synthese mit ihrer Anti-HIV-Aktivität in Zusammenhang stehen.
Daten die mittels chronisch HIV-1 infizierten Zelllinien erhalten wurden, die mit einem Test-Arzneimittel kultiviert wurden, können eine Richtung angeben, wie diese Verbindungen in vivo funktionieren können, wenn sie einem latent HIV-infizierten Individuum gegeben werden. Deshalb, wurden Verbindungen 4 und 5 getrennt für 72 Stunden zu einer chronisch HIV-1 infizierten T Zelllinie, ACH-2, und zu einer chronisch HIV-1 infizierten prononzytischen Zelllinie, U1, hinzugefügt. Es gab in beiden Zelllinien keine Zunahme der Induktion der Virusexpression. Sogar wenn beide chronisch HIV-1 infizierten Zelllinien in der Gegenwart eines bekannten Virus-Auslösers, wie Phorbolester, PMA (Phorbol 12-myristat 13-acetat) kultiviert wurden, gab es keine Veränderung des Virusexpressionsniveaus, wie in den Tabellen III und IV gezeigt ist. Folglich, erhöhten oder verminderten die Verbindungen 4 und 5 die Virusexpression von chronisch HIV-infizierten Zellen nicht, wenn sie entweder allein oder in der Gegenwart von PMA kultiviert wurden.

^a Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 1 nmol [³H]dTMP in die Poly(rA)–Oligo(dT)₁₀-Matrize in 1,0 Minute bei 37°C einzubauen.
^b Alle Reaktionsraten wurden auf die Reaktionsrate, die unter Verwendung von Poly(rA)–Oligo(dT)₁₀ erhalten wurde, normalisiert.
^c Die Werte stellen den Mittelwert±Standardabweichung von drei getrennten Bestimmungen dar.

*Konzentrationen der Verbindung in μg/ml

*Konzentrationen der Verbindung in μg/ml.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, welche zumindest eine Verbindung der Formel:
worin R¹ und R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Brom, mit der Bedingung, dass R¹ und R² nicht beide Wasserstoff sein können, R³ und R⁴ unabhängig voneinander Hydroxy C_1-6Alkoxy, -O(CH₂)₂N⁺(CH₃)Cl^–
oder ein(en) pharmazeutisch annehmbaren(s) Ester, Ether, Sulfat, Carbonat, Glucuronid oder Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher R³ und R⁴ beide Methoxy sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche weiters wenigstens ein Arzneimittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus antiviralem Mittel und immunstimulierendem Mittel aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei welcher das antivirale Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma Globulin, Amantadin, Guanidin, Hydroxybenzimidazol, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Thiosemicarbazonen, Methisazon, Rifampin, Ribvirin, Pyrimidinanalogen, Purinanalogen, Foscarnet, Phosphonoessigsäure, Acyclovir, Didesoxynucleoside und Ganciclovir.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der Hemmung einer retroviralen Infektion in Zellen oder Geweben eines Tieres.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Tier ein Säugetier oder ein Vogel ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der Behandlung einer retroviralen Pathologie.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die retroviral- verwandte Pathologie eine HIV Infektion ist.
Verbindung der Formel
worin R¹ und R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Brom, mit der Bedingung, dass R¹ und R² nicht beide Wasserstoff sein können, und der weiteren Bedingung, dass 3,3'-Dibrom-4,4'dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl ausgeschlossen ist, R³ und R⁴ unabhängig voneinander Hydroxy C_1-6Alkoxy, -O(CH₂)₂N⁺(CH₃)Cl^–
Verbindung nach Anspruch 10, wobei R³ und R⁴ beide Methoxy sind
Verbindung nach Anspruch 10, welche 3-Brom-4,4'-dimethoxy-5,6,5',6'-bimethylendioxy-2,2'-dimethoxycarbonyl-biphenyl ist.