DE4121468A1 - Antivirale substanzen und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents
Antivirale substanzen und diese enthaltende arzneimittelInfo
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Description
Die Erfindung betrifft antiviral wirksame Substanzen aus
Streptomyceten, insbesondere zur Behandlung von HIV-Infektionen,
und diese enthaltende Arzneimittel.
Das "erworbene Immunschwächesyndrom" ("acquired immunodeficiency
syndrome", AIDS) bezeichnet ein Krankheitsbild, dem
eine defekte zellgebundene Immunabwehr zugrundeliegt und bei
dem eine Infektion mit dem "human immunodeficiency virus"
(HIV) nachgewiesen ist. Bei den an AIDS erkrankten Menschen
können verschiedene Infektionskrankheiten lebensbedrohend
sein, und es wird das Auftreten seltener Tumore beobachtet.
Die ersten Fälle von AIDS traten 1981 auf; seitdem hat sich
diese Krankheit zunehmend weiter verbreitet, und 1988 wurden
weltweit 1 bis 10 Millionen Fälle angenommen.
Die Ursache des AIDS ist die Infektion mit einem Retrovirus,
dem HIV, welches vor allem eine bestimmte Gruppe von Lymphozyten
befällt. Dadurch wird das Zusammenspiel der am Immunsystem
beteiligten Zellen stark gestört, so daß die
körpereigene Abwehr von Krankheitserregern zusammenbricht.
Die Folge sind schwere und lebensbedrohliche Verläufe von
Infektionskrankheiten (z. B. Lungenentzündungen, Darmentzündungen,
Hirnhautentzündungen), und auch von solchen, die
normalerweise nicht oder in milderer Form auftreten. Es kann
auch zur Bildung von Tumoren der Lymphknoten (Lymphome) und
der Gefäße in der Haut und inneren Organen (Kaposi-Sarkom)
kommen. Ein Befall der Zellen des Zentralnervensystems mit
dem Virus führt zu Störungen im zentralen Nervensystem und
äußert sich durch Auftreten einer Demenz.
Die Infektion wird durch den Nachweis von Antikörpern gegen
das HIV im Blut des Patienten nachgewiesen. Man nimmt an, daß
20 bis 30% der HIV-infizierten Menschen innerhalb von 5
Jahren AIDS entwickeln.
Eine wirksame Vorbeugung und Behandlung beschränkt sich
derzeit noch auf die Infektionserkrankungen und Tumoren,
während für den zugrundeliegenden Immundefekt bisher keine
zuverlässige Therapie bekannt ist. Zur AIDS-Therapie wurden
zwar bereits verschiedene antivirale Substanzen in Betracht
gezogen, wie z. B. Suramin, Ribavirin; über ihren therapeutischen
Wert herrscht jedoch noch Unklarheit (vgl. z. B. Römpp,
Chemielexikon, 9. Aufl., 1989, Seite 76).
Bis heute ist das einzig zugelassene Medikament für die
Behandlung von AIDS- und ARC-Patienten das nucleosidanaloge
Azidothymidin (AZT). Während einer längeren Behandlung mit
AZT kann es aber zu starken Nebenwirkungen kommen, wie
Auftreten einer Knochenmarksuppresion, Übelkeit, Erbrechen,
Kopfschmerzen und Störungen in der Leberfunktion; ferner wurde
bei Patienten das Auftreten AZT-resistenter HIV-Varianten
beobachtet.
Es besteht deshalb ein sehr starkes Bedürfnis für weitere
therapeutische Substanzen zur Behandlung von HIV-Infektionen,
die die Nachteile von Azidothymidin (AZT) nicht aufweisen,
und die zur Unterstützung der Behandlung von AZT dienen oder
dieses ersetzen können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung
weiterer antiviraler Substanzen zur Behandlung von
Virusinfektionen, und insbesondere zur Behandlung von HIV-Infektionen.
Diese Aufgabe wird mit dem Gegenstand der vorliegenden
Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind antivirale Störungen aus
Streptomyceten gemäß Anspruch 1 der Formeln (I), (II) und
(III).
worin R₁=OH und R₂=
oder R₁=R₂=H bedeuten (Ib),
worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise
eine n-Butylgruppe bedeutet,
Es wurde gefunden, daß die Substanzen der Formel Ia (Actinorhodin),
Ib (2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-dihydrobenzo
[g] isochroman-3-yl)-essigsäure; sogenanntes "Abbauchinon"),
II (Deisovalerylblastmycin) und III (Aureothin) eine ausgeprägte
antivirale Wirksamkeit besitzen.
Diese Substanzen sind erhältlich aus Actinoplances sp. hinterlegt
als IMET 9243 und INA 1569 (Lit. Terekohova et al.
Antibiotiki 22, 1059, 1977) für Substanz Ia, aus Streptomyces
arenae DSM 40 737 für Substanz Ib, aus Streptomyces sp. DSM
6567 für Substanz II und aus Streptoverticillium thioluteum
DSM 40 027, sowie ATCC 12 310, CSB 64 272, ISP 5027, IFO 13 341,
3364 und RIA 1302 für Substanz III.
Die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II und III
wurden im MT-4 Zellsystem (Methode beschrieben von Harada et
al. J. Immunol. Meth. 92 (1986) 177 bis 181) auf Anti-HIV-1-
Wirkung und Zelltoxizität untersucht. MT-4 ist eine humane T-
Zellinie, die durch eine HIV-1-Infektion stark geschädigt
wird und abstirbt. In Abwandlung zu dem von Harada et al
(1986, 1.c.) beschriebenen MT-4-Zelltest wurden für den im
Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung auf Anti-
HIV-1-Wirkung durchgeführten Zelltest Kulturüberstände aus
der HIV-1 produzierenden Jurkat-Zellinie eingesetzt, die
durch Infektion lymphozytärer Jurkat-Zellen (Wendler et al,
Med. Microbiol. Immunol. 176 (1987) 273-280) mit dem HIV-1
Typ HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Popovic et al, Science 224
(1984) 497-500) entstanden ist.
Die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II
und III erhaltenen Ergebnisse (Anti-HIV-1-Aktivität und Zelltoxizität
in vitro im MT-4-Zelltest) wurden mit denen des
nukleosidanalogen 3′-Azido-3′-deoxythymidin (AZT) verglichen.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:
Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen
Substanzen zwar einen Selektivitätsindex (SI) besitzen, der
geringer ist als der des hochwirksamen AZT (dessen Anwendung
bei längerer Behandlung aber mit starken Nebenwirkungen verbunden
ist und zum Auftreten AZT-resistenter HIV-Varianten
führen kann), daß der Selektivitätsindex (SI) aber für alle
erfindungsgemäßen Substanzen zwischen <10¹ und <10³ liegt.
Damit werden mit den erfindungsgemäßen Substanzen weitere
Substanzen mit Anti-HIV Wirksamkeit bereitgestellt, die sich
zur Behandlung von Virusinfektionen, insbesondere HIV-Infektionen
eignen, z. B. zur Unterstützung der Therapie mit AZT
oder für eine AZT-Ersatztherapie (z. B. beim Auftreten von
ATZ-resistenten Stämmen).
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II und/oder III
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen,
insbesondere von HIV-Infektionen, sowie pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese erfindungsgemäßen
Substanzen als antiviralen Wirkstoff enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
enthalten eine erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I),
(II), und/oder (III) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Hilfs- und/oder Trägerstoff.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer zur
Applikation der Wirkstoffe geeigneten Form vorliegen, vorzugsweise
in Form einer oralen oder parenteral verabreichbaren
Form, z. B. als Tabletten, Dragees, Kapseln,
Suppositorien; in erster Linie liegen sie in Form einer
parenteral, insbesondere intravenös (iv) zu verabreichenden
Lösung vor.
Die Art des pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoffs
richtet sich dabei nach der Art der Zubereitung,
und insbesondere nach der Verabreichungsart; in der Regel
entsprechen sie für antivirale Arzneimittel üblichen Hilfs-
und/oder Trägerstoffen, insbesondere z. B. den für die Applikation
von Azidothymidin (AZT) üblichen Hilfs- und/oder
Trägerstoffen.
Die Menge der erfindungsgemäßen antiviralen Wirksubstanzen in
der pharmazeutischen Zusammensetzung kann, insbesondere
abhängig von der Applikationsart, in einem weiten Bereich
variieren. In der Regel liegen die erfindungsgemäßen antiviralen
Wirkstoffe in der pharmazeutischen Zusammensetzung in
Mengen von 1 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 40 Gew.-%, und
in erster Linie von 10 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die gesamte
pharmazeutische Zusammensetzung, vor. Die bevorzugten Mengen
entsprechen insbesondere den für entsprechende AZT-Präparate
üblichen Mengen an AZT.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine oder
mehrere der erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II
und/oder III enthalten. Daneben können die pharmazeutischen
Zusammensetzungen auch noch weitere mit den erfindungsgemäßen
Wirksubstanzen kompatible Wirkstoffe gleicher oder unterschiedlicher
Wirkungsrichtung enthalten, z. B. AZT und/oder
die Therapie unterstützende Wirkstoffe, wie z. B. Antibiotika,
entzündungshemmende Mittel, Mittel gegen Darmerkrankungen,
Antitumormittel, usw.
Die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann auf
eine an sich bekannte und für solche Zubereitungen übliche
Art und Weise erfolgen, z. B. durch Auflösung in und/oder
Mischen der Wirksubstanzen mit entsprechenden Hilfs- und/oder
Trägerstoffen unter sterilen Bedingungen und Überführen
und/oder Abfüllen in die geeignete Darreichungsform und/oder
Dosiseinheit.
Die Applikationsart, Dauer und Menge der Verabreichung richtet
sich insbesondere nach der Art und Schwere der Erkrankung
und dem Allgemeinzustand des Patienten; in der Regel liegt
die Tagesdosis bei 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise bei 1 bis
50 mg/kg, und in erster Linie bei 2 bis 20 mg/kg Körpergewicht
des Patienten; sie kann sich aus einer einzigen Tagesdosis,
oder aus mehreren, vorzugsweise drei Verabreichungen
pro Tag, zusammensetzen.
Die erfindungsgemäßen Substanzen der Formeln I, II und III
sind bekannte Verbindungen und sind auf bekannte Weise erhältlich.
Zur Herstellung von Actinorhodin (Ia), siehe H. Brockmann et
al, Chem. Ber. 83 (1950) 161-167, H. Brockmann, Liebigs Ann.
Chem. 698 (1966) 209, Zeeck, Liebigs Ann. Chem. 724 (1969)
172, Liebigs Ann. Chem. 1983 510 und Floss, J. Org. Chem. 46
(1981) 455.
Zur Herstellung von 2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-
dihydrobenzo [g] isochroman-3-yl)-essigsäure (Ib), siehe D.
Hallmann, Diplomarbeit Universität Göttingen, 1977, Liebigs
Ann. Chem. 1983, 471 und 510, A. Zeeck und M. Mardin, Liebigs
Ann. Chem. 1974, 1063 bis 1099 und A. Zeeck et al, Liebigs
Ann. Chem. 1974, 1100 bis 1125.
Zur Herstellung von Deisovalerylblastmycin (II), siehe T. Ishyama
et al, J. Antibiotics XXIX (1976), 804 bis 808.
Zur Herstellung von Aureothin (III), siehe K. Maeda, J. of
Antibiotics, Ser. A IV (1953), 137 bis 138 (dort als "crystalline
toxic substance" beschrieben), Hirata et al, Tetrahedron
14 (1961), 252 (Aureothin ist mit Mycolutein
identisch, vgl. J. Antibiotics XXIX (1976), 236, und kann auf
bekannten Wegen aus verschiedenen Produzentenstämmen isoliert
werden).
Die Streptomycetenstämme aus welchen die erfindungsgemäß
verwendeten Verbindungen I, II und III oder deren Ausgangsstoffe
gewonnen werden, sind bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM), Braunschweig oder bei IMET (Nationale
Sammlung von Mikroorganismen, Jena) hinterlegt unter der
Nummer IMET 9243 (Streptomyces coelicolor, bzw. Actinoplanes
sp; auch INA 1569; Ia), DSM 40 737 (Streptomyces arenae, Ib),
DSM 6567 (Streptomyces spec., II) und DSM 40 027 (Streptoverticillium
thioluteum, III; andere Stammsammlungen: ATCC
12 310; CSB 642.72; ISP 5027; IFO 13 341, 3364; RIA 1302).
Die nachfolgenden Beispiele sollen nun die Erfindung näher
erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.
Es wurde wie bei D. Hallmann, Diplomarbeit, Universität
Göttingen, 1977, beschrieben, nach dem folgenden Verfahrensschema
gearbeitet. Die Herstellung der Verbindung (1a) ist
bei A. Zeeck und M. Mardin, Liebigs Ann. Chem. 1974, 1063 bis
1099 und A. Zeeck et al. Liebigs Ann. Chem. 1974, 1100 bis
1125 beschrieben.
Aus (1a): 2,1 g chromatographisch gereinigte α-Naphthocyclinonsäure
(1a) wurde bei Raumtemperatur in 300 ml 2 N NaOH
gelöst. Die violette Lösung säuerte man nach 45 Min. an,
wusch den abgetrennten Niederschlag mehrmals mit Wasser aus,
nahm dann in Ethylacetat auf und schüttelte zur Entfernung
von Säureresten mit Wasser aus. Der Rückstand der zur Trockene
eingeengten Lösung wurde mit 5 g Seesand verrieben und im
Kreisprozeß erst mit Wasser, dann mit Ethylacetat extrahiert.
Die aus dem Ethylacetatextrakt auskristallisierten roten
Nadeln wurden mit Chloroform gewaschen und über Calciumchlorid
getrocknet.
Ausb. 1,48 g; Schmelzp. 262°C (Zers.)
17b löst sich in Ethylacetat oder Ethanol. Wäßrige Natriumhydrogencarbonat- Lösung und 2 N NaOH lösen 17b unter Blau- bzw. Violettfärbung.
Ausb. 1,48 g; Schmelzp. 262°C (Zers.)
17b löst sich in Ethylacetat oder Ethanol. Wäßrige Natriumhydrogencarbonat- Lösung und 2 N NaOH lösen 17b unter Blau- bzw. Violettfärbung.
IR 3400 und 2800 (breit, OH); 1715, 1665 (sh), 1640 (sh),
1630-1600 cm-1 (C = O und C = C)
UV (Methanol):
λmax (ε) = 468 (6700), 333 (6200), 266 nm (22 600);
λmax (ε) = 468 (6700), 333 (6200), 266 nm (22 600);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 540 (sh), 520 (sh), 490 (7100), 317 (sh), 272 (sh), 234 nm (25 200);
λmax (ε) = 540 (sh), 520 (sh), 490 (7100), 317 (sh), 272 (sh), 234 nm (25 200);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 590 (sh), 550 (9200), 358 (5600), 261 nm (22 100).
C₃₀H₂₆O₁₄ (610.5)
Ber. C 59.02; H 4,31;
Gef. C 59.07; H 4.34.
λmax (ε) = 590 (sh), 550 (9200), 358 (5600), 261 nm (22 100).
C₃₀H₂₆O₁₄ (610.5)
Ber. C 59.02; H 4,31;
Gef. C 59.07; H 4.34.
Unter Rühren wurden 430 mg Desacetyl-α-naphthocyclinon-säure
17b in 300 g 70% Schwefelsäure gelöst, die sich allmählich
violettrot färbende Lösung blieb 4 Tage lang bei Raumtemperatur
stehen und wurde anschließend in 4 l Wasser gegossen und
der Farbstoff erschöpfend mit Ethylacetat extrahiert. Die auf
400 ml eingeengte organische Phase wurde mit Wasser gewaschen
und über Natriumsulfat getrocknet. Filtriert und zur Trockene
eingeengt, lagerte man den pulverisierten Verdampfungrückstand
über Kaliumhydroxid.
418 g des rohen Reaktionsproduktes wurde in einem Druckkolben
in 150 ml Dichlormethan suspendiert und nach Einkondensieren
von 20 g Isobuten mit 0,2 ml konz. Schwefelsäure 4 Tage lang
bei Raumtemperatur geschüttelt; anschließend entfernte man
das überschüssige Isobuten durch Rühren der Lösung unter
Normaldruck. Nach Einengen auf 50 ml wurde mit 300 ml Chloroform
verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Den getrockneten
Verdampfungsrückstand trennte man durch zweimalige Chromatographie
an Oxalsäure-Kieselgel (PDC-Platten; 20 × 40 cm) im
System III (Chloroform: Ethylacetat; 1 : 1), welches zuvor mit
Oxalsäure gesättigt worden war.
Die Inhaltsstoffe der drei Hauptzonen eluierte man mit Aceton,
nahm die Verdampfungsrückstände in Chloroform auf, wusch
mit Wasser, trocknete über Natriumsulfat und engte zur
Trockene ein. Die Substanzen wurden nach Umfällen aus Ethylacetat/
n-Pentan als faserige Feststoffe erhalten:
52 mg (Zone 1, größter Rf-Wert);
41 mg (Zone 2);
342 mg (Zone 3).
41 mg (Zone 2);
342 mg (Zone 3).
Das aus Zone 3 isolierte 19c (Diastereomeres B) Ausb. 342 mg
(68,9%, bezogen auf 17b), schmolz bei 159°C; 17b ist gut in
Chloroform oder Aceton löslich und zeigt in Benzol eine
geringe Löslichkeit. Die dunkelblaue alkalische Lösung von
19c wird nach Zugabe von Natriumdithionit gelb.
IR 3420 (breit, OH); 2980, 2940 (CH); 1730 (Ester), 1668
(sh), 1645, 1625, 1600 cm-1 (C=O und C=C).
UV (Methanol):
λmax (ε) = 585 (7000), 516 (sh), 355 (sh), 265 (18 400), 250 nm (sh);
λmax (ε) = 585 (7000), 516 (sh), 355 (sh), 265 (18 400), 250 nm (sh);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 575 (sh), 528 (6700), 500 (sh), 263 (sh), 234 nm (27 300);
λmax (ε) = 575 (sh), 528 (6700), 500 (sh), 263 (sh), 234 nm (27 300);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 614 (16 000), 570 (sh), 276 (sh), 250 nm (24 300).
λmax (ε) = 614 (16 000), 570 (sh), 276 (sh), 250 nm (24 300).
C₃₈H₄₀O₁₃ (704.7)
Ber. C 64.75; H 5.72;
Gef. C 65.37; H 6.04.
Gef. C 65.37; H 6.04.
Die etherische Diazomethanlösung würde wie folgt hergestellt;
55 g N-Tolyl-sulfonyl-N-methylnitrosamid (Merck) in 500 ml
Ether versetzte man mit einer eiskalten Lösung aus 25 g KOH
in 90 ml Ethylenglycolmonoethylether. Nachdem die Reaktion
durch Erwärmen auf 40°C eingeleitet worden war, destillierte
man das gelbliche Diazomethan-Ethergemisch in eine eiskalte
Vorlage. Die dargestellte etherische Diazomethanlösung (350 ml)
war etwa 0.5 M.
Eine Lösung von 240 mg 19c (Diastereomeres B) in 150 ml
Chloroform versetzte man bei -30°C mit einem dreifachen
Überschuß der etherischen Diazomethanlösung und ließ auf 0°C
erwärmen. Die hellgelbe Lösung wurde unter Rühren in 2 l
Chloroform (-10°C, gesättigt mit trockenem Chlorwasserstoff)
eingetropft und 24 h bei -4°C unter gelegentlichem Durchleiten
von trockenem Sauerstoff, stehengelassen.
Die i. Vak. eingeengte Reaktionslösung chromatographierte man
an Oxalsäure-Kieselgel (6 PDC-Platten, 20 × 40 cm) mit Chloroform/
0,5% Aceton.
Die Inhaltsstoffe der ersten vier Zonen (größte Rf-Werte)
eluierte man vom Adsorbens mit Chloroform.
Nicht näher untersucht wurden die Zonen 1 (7 mg), 3 (1 mg) und
die nahe der Auftragslinie wandernden Zonen.
Der Inhaltsstoff der gelben Zone (2) lag nach Umfällen aus
Chloroform/n-Pentan in öliger Form vor. Ausb. 26 mg (21,3%)
Ic.
Eine Lösung von 55 mg (Ic) in 1 ml Trifluoressigsäure rührte
man 5 Min. lang bei Raumtemperatur, nach Verdampfen der Trifluoressigsäure
im Vakuum wurde der gelbe Rückstand an Oxalsäure-
Kieselgel (2 PDC-Platten, System III) chromatographiert.
Chromatographie
Dünnschichtchromatographie DC)
Kieselgel 60 F 254 (Merck-Fertigplatten)
Oxalsäure DC-Platten:
Dünnschichtchromatographie DC)
Kieselgel 60 F 254 (Merck-Fertigplatten)
Oxalsäure DC-Platten:
DC-Fertigkarten (Merck) wurden mit 0,5 N
Oxalsäure besprüht und 30 Min. bei 110°C
getrocknet.
Präparative DC
Kieselgel MN P UV₂₅₄ (Macherey-Nagel) Oxalsäure PDC-Platten
Für 10 präparative DC-Platten (20 × 40 cm) wurden 600 g Kieselgel in einer aus 30 g Oxalsäure, 5 g Ameisensäure und 1,2 l Wasser bestehenden Lösung suspendiert (150 ml Suspension pro Platte). Nach dem Aufgießen trocknete die etwa 1-2 mm dicke Schicht ca. 12 h bei Raumtemperatur, anschließend wurde 3 h bei 130°C aktiviert.
Kieselgel MN P UV₂₅₄ (Macherey-Nagel) Oxalsäure PDC-Platten
Für 10 präparative DC-Platten (20 × 40 cm) wurden 600 g Kieselgel in einer aus 30 g Oxalsäure, 5 g Ameisensäure und 1,2 l Wasser bestehenden Lösung suspendiert (150 ml Suspension pro Platte). Nach dem Aufgießen trocknete die etwa 1-2 mm dicke Schicht ca. 12 h bei Raumtemperatur, anschließend wurde 3 h bei 130°C aktiviert.
Säulenchromatographie
2 kg Kieselgel unter 0,08 (Macherey-Nagel) wurden in 4 l 0,5 N Oxalsäure aufgeschlämmt. Die Suspension trocknete in 3-4 cm hoher Schicht bei 110°C; nach 24 h wurde gesiebt und 3 h bei 120°C aktiviert.
2 kg Kieselgel unter 0,08 (Macherey-Nagel) wurden in 4 l 0,5 N Oxalsäure aufgeschlämmt. Die Suspension trocknete in 3-4 cm hoher Schicht bei 110°C; nach 24 h wurde gesiebt und 3 h bei 120°C aktiviert.
Laufmittelsysteme
I: Chloroform/Aceton (95 : 5)
II: Benzol/Ether/Aceton (9 : 9 : 2)
III: Chloroform/Ethylacetat (1 : 1)
I: Chloroform/Aceton (95 : 5)
II: Benzol/Ether/Aceton (9 : 9 : 2)
III: Chloroform/Ethylacetat (1 : 1)
Aus der gelben Hauptzone der Chromatographie wurde (Ib) auf
folgende Weise isoliert und umkristallisiert:
Extraktion mit Aceton; präparative Dünnschichtchromatographie
an Oxalsäure-Kieselgel im Laufmittelsystem Chloroform/Ethylacetat = 1 : 1;
Kristallisation aus Ethylacetat/Pentan. Es
wurden gelbe Prismen (Ib) erhalten. Ausbeute 36,2 mg (78%);
Schmelzpunkt 209°C.
In Aceton, Ethylacetat oder Chloroform ist Ib löslich, von 2
N NaOH wird Ib mit blau-violetter Farbe aufgenommen.
IR 3450, 2750 (breit, OH); 1745, 1660, 1640 cm-1 (C = 0 und
C = C).
UV (Methanol):
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (3800), 405 (sh), 254 nm (11 700);
UV (Methanol):
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (3800), 405 (sh), 254 nm (11 700);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (4200), 405 (sh), 354 nm (12 400);
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (4200), 405 (sh), 354 nm (12 400);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 546 (4200), 370 (1400), 290 nm (8000).
λmax (ε) = 546 (4200), 370 (1400), 290 nm (8000).
¹H-NMR (d-Dioxan):
δ = 12.32 (s; 10-OH), 732 (s; 5-H), 6.89 (s; 7-H, 8-H), 5.12/1.53 (q/d; 1-H-CH₃), 4.36 (mc; 3-H), 2.9-2.5 ppm (komplex. Signal für Aliphat.-H).
δ = 12.32 (s; 10-OH), 732 (s; 5-H), 6.89 (s; 7-H, 8-H), 5.12/1.53 (q/d; 1-H-CH₃), 4.36 (mc; 3-H), 2.9-2.5 ppm (komplex. Signal für Aliphat.-H).
MS: m/e = 302 (100%, M⁺), 287 (53%, M-CH₃), 269
(5,9%), 241 (98%, M-61), 227 (35%, M-75),
213 (71,3%), 185 (45%), 157 (33%).
C₁₆H₁₄O₆ (302.3)
Mol.-Masse: 302 (massenspektrometr.)
Mol.-Masse: 302 (massenspektrometr.)
In Abwandlung zu dem von Harada et al (1986, 1.c.) beschriebenen
MT-4-Zelltest wurden für den hier durchgeführten Zelltest
Kulturüberstände aus der HIV-1 produzierten Jurkat-
Zellinie eingesetzt, die durch Infektion lymphocytärer
Jurkat-Zellen (Wendler et al, 1987, 1.c.) mit dem HIV-1-Typ
HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Popovic et al, 1984, 1.c.) entstanden
ist.
Als Gewebekulturmedium wurde für Jurkat- und MT-4-Zellen
sterilfiltriertes RPMI 1640 Medium (Gibco, Karlsruhe), unter
Zusatz von 10% komplementinaktiviertem (30 Minuten, 56°C)
fötalem Rinderserum (Seromed, Berlin) sowie Antibiotika
verwendet (dem Gewebekulturmedium wurden 50 mg Streptomycin
und 10⁵ E Penicillin pro Liter Medium zugefügt). Während der
Durchführung des MT-4-Zelltests wurde zur Aufrechterhaltung
des pH-Wertes dem Medium 25 mM HEPES (2-4(2-Hydroxyethyl)-1-
piperazinyl-ethansulfonsäure, Merck, Darmstadt) zugefügt. Die
Zellkulturen wurden in einem Inkubator (Heraesus) bei 37°C
mit einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 6% CO₂
inkubiert.
Der MT-4 Zelltest wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt.
Pro Loch wurden 3 × 10⁴ MT-4-Zellen mit verschiedenen Substanzverdünnungen
mit und ohne HIV-1 kultiviert. Die Substanzen
wurden in einer Anfangskonzentration von 500 µg/ml, bzw.
von 250 µg/ml, gefolgt von Verdünnungen von 1 : 10, austitriert.
Für die Virusinfektion wurde eine zuvor austitrierte
Virusdosis von etwa 10 TCID₅₀ eingesetzt. Nach drei Tagen
Kultivierung wurde frisches RPMI 1640 Medium zugegeben. Vier
Tage nach Testansatz wurden 0,1 µCi ³H-Thymidin pro Loch der
Mikrotiterplatte zugegeben. Die Zellen wurden 20 Stunden
später auf Glasfiberfiltern geerntet, mit Wasser gewaschen
und der ³H-Thymidineinbau in der Zell-DNA nach Zugabe eines
flüssigen Szintillators Toluol/POPOP (Roth, Karlsruhe) im β-
Zähler (Packard, Frankfurt) gemessen. Niedrige Einbauraten
weisen auf einen virusbedingten Zelltod bzw. die Toxizität
der Substanz hin, hohe auf eine Hemmung der HIV-1-Infektion.
Der ³H-Thymidineinbau wurde für jede Substanz in Abhängigkeit
der Substanzkonzentration graphisch dargestellt und die
Toxizität sowie die maximale antivirale Wirksamkeit der
Substanzen wurde ermittelt.
Die Fig. 1 zeigt die Anti-HIV-1-Wirkung der erfindungsgemäßen
Substanzen Ia, Ib, II und III im MT-4-Zelltest. Der ³H-
Thymidineinbau (cpm) in die Zell-DNA wurde gegen die Substanzkonzentration
(µg/ml) von Ib (Fig. 1A), Ia (Fig. 1B), II
(Fig. 1D) und III (Fig. 1C) aufgetragen. Die Zellen wurden
mit der Wirksubstanz in Anwesenheit (-) und in Abwesenheit
von HIV-1 (---) kultiviert.
Die Toxizität der Verbindung Ib (Fig. 1A) in der Konzentration
von 250 µg/ml beruht auf dem toxischen Effekt des im Test
verwendeten Lösungsmittels Dioxan. Die Verbindungen Ia (Fig. 1B)
und III (Fig. 1C) sind bei 50 µg/ml zelltoxisch. Die
Verbindung II (Fig. 1D) ist aufgrund des im Test verwendeten
Lösungsmittels Methanol bei einer Konzentration von 500 µg/ml
zelltoxisch.
Die Substanz Ib unterdrückte den HIV-1 bedingten Zelltod bei
einer Konzentration von 2,5 µg/ml (Fig. 1A). Bei einer Konzentration
von 5 µg/ml konnte die Verbindung Ia eine 100%ige
Inhibition der HIV-1-Infektion in dem MT-4-Zellen bewirken,
bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml nur noch eine 50%ige
Inhibitioin (Fig. 1B). Die Substanz II war bei einer Konzentration
von 0,5 µg/ml (Fig. 1D) und die Substanz III bei
einer Konzentration bis zu 0,05 µg/ml (Fig. 1C) antiviral
wirksam.
Aus der Fig. 1 wurden die für MT-4-Zellen maximalen nicht
toxischen Substanzkonzentrationen, sowie die maximalen und
therapeutischen Konzentrationen ermittelt, in molare Konzentrationen
umgerechnet und in der vorstehend angegebenen Tabelle 1
zusammengefaßt.
In Tabelle 1 werden auch die Selektivitätsindices (SI) der
untersuchten Substanzen angegeben. Der Selektivitätsindex
(SI) beschreibt das Verhältnis der auf die MT-4 Zellen toxisch
wirkenden Substanzkonzentration zu der Substanzkonzentration,
bei der eine HIV-1-Infektion zu 100% verhindert
wird. Alle untersuchten Substanzen haben einen Selektivitätsindex
(SI) zwischen <10¹ und <10³.
Claims (9)
1. Antivirale Substanz aus Streptomyceten der Formeln (I),
(II) und (III)
worin R₁=R₂=H oder R₁=OH und R₂=
worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise
eine n-Butylgruppe bedeutet
zur Anwendung als therapeutischer Wirkstoff.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung
der Formeln (I), (II) und/oder (III) zusammen mit
einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoff.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie in einer oral oder parenteral verabreichbaren
Form vorliegt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie in einer intravenös applizierbaren Form vorliegt.
5. Verwendung einer Verbindung der Formel (I), (II)
oder/und (III) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen.
6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von HIV-Infektionen.
7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Arzneimittel eine pharmazeutische Zusammensetzung
nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
8. Verwendung einer Verbindung der Formeln (I), (II)
oder/und (III) zur Behandlung von Virusinfektionen.
9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Behandlung von HIV-Infektionen.
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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