DE4121468A1 - Antivirale substanzen und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Antivirale substanzen und diese enthaltende arzneimittel

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Gerhard Prof Dr Hunsmann
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Description

Die Erfindung betrifft antiviral wirksame Substanzen aus Streptomyceten, insbesondere zur Behandlung von HIV-Infektionen, und diese enthaltende Arzneimittel.
Das "erworbene Immunschwächesyndrom" ("acquired immunodeficiency syndrome", AIDS) bezeichnet ein Krankheitsbild, dem eine defekte zellgebundene Immunabwehr zugrundeliegt und bei dem eine Infektion mit dem "human immunodeficiency virus" (HIV) nachgewiesen ist. Bei den an AIDS erkrankten Menschen können verschiedene Infektionskrankheiten lebensbedrohend sein, und es wird das Auftreten seltener Tumore beobachtet. Die ersten Fälle von AIDS traten 1981 auf; seitdem hat sich diese Krankheit zunehmend weiter verbreitet, und 1988 wurden weltweit 1 bis 10 Millionen Fälle angenommen.
Die Ursache des AIDS ist die Infektion mit einem Retrovirus, dem HIV, welches vor allem eine bestimmte Gruppe von Lymphozyten befällt. Dadurch wird das Zusammenspiel der am Immunsystem beteiligten Zellen stark gestört, so daß die körpereigene Abwehr von Krankheitserregern zusammenbricht. Die Folge sind schwere und lebensbedrohliche Verläufe von Infektionskrankheiten (z. B. Lungenentzündungen, Darmentzündungen, Hirnhautentzündungen), und auch von solchen, die normalerweise nicht oder in milderer Form auftreten. Es kann auch zur Bildung von Tumoren der Lymphknoten (Lymphome) und der Gefäße in der Haut und inneren Organen (Kaposi-Sarkom) kommen. Ein Befall der Zellen des Zentralnervensystems mit dem Virus führt zu Störungen im zentralen Nervensystem und äußert sich durch Auftreten einer Demenz.
Die Infektion wird durch den Nachweis von Antikörpern gegen das HIV im Blut des Patienten nachgewiesen. Man nimmt an, daß 20 bis 30% der HIV-infizierten Menschen innerhalb von 5 Jahren AIDS entwickeln.
Eine wirksame Vorbeugung und Behandlung beschränkt sich derzeit noch auf die Infektionserkrankungen und Tumoren, während für den zugrundeliegenden Immundefekt bisher keine zuverlässige Therapie bekannt ist. Zur AIDS-Therapie wurden zwar bereits verschiedene antivirale Substanzen in Betracht gezogen, wie z. B. Suramin, Ribavirin; über ihren therapeutischen Wert herrscht jedoch noch Unklarheit (vgl. z. B. Römpp, Chemielexikon, 9. Aufl., 1989, Seite 76).
Bis heute ist das einzig zugelassene Medikament für die Behandlung von AIDS- und ARC-Patienten das nucleosidanaloge Azidothymidin (AZT). Während einer längeren Behandlung mit AZT kann es aber zu starken Nebenwirkungen kommen, wie Auftreten einer Knochenmarksuppresion, Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen und Störungen in der Leberfunktion; ferner wurde bei Patienten das Auftreten AZT-resistenter HIV-Varianten beobachtet.
Es besteht deshalb ein sehr starkes Bedürfnis für weitere therapeutische Substanzen zur Behandlung von HIV-Infektionen, die die Nachteile von Azidothymidin (AZT) nicht aufweisen, und die zur Unterstützung der Behandlung von AZT dienen oder dieses ersetzen können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung weiterer antiviraler Substanzen zur Behandlung von Virusinfektionen, und insbesondere zur Behandlung von HIV-Infektionen. Diese Aufgabe wird mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind antivirale Störungen aus Streptomyceten gemäß Anspruch 1 der Formeln (I), (II) und (III).
worin R₁=OH und R₂=
oder R₁=R₂=H bedeuten (Ib),
worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise eine n-Butylgruppe bedeutet,
Es wurde gefunden, daß die Substanzen der Formel Ia (Actinorhodin), Ib (2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-dihydrobenzo [g] isochroman-3-yl)-essigsäure; sogenanntes "Abbauchinon"), II (Deisovalerylblastmycin) und III (Aureothin) eine ausgeprägte antivirale Wirksamkeit besitzen.
Diese Substanzen sind erhältlich aus Actinoplances sp. hinterlegt als IMET 9243 und INA 1569 (Lit. Terekohova et al. Antibiotiki 22, 1059, 1977) für Substanz Ia, aus Streptomyces arenae DSM 40 737 für Substanz Ib, aus Streptomyces sp. DSM 6567 für Substanz II und aus Streptoverticillium thioluteum DSM 40 027, sowie ATCC 12 310, CSB 64 272, ISP 5027, IFO 13 341, 3364 und RIA 1302 für Substanz III.
Die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II und III wurden im MT-4 Zellsystem (Methode beschrieben von Harada et al. J. Immunol. Meth. 92 (1986) 177 bis 181) auf Anti-HIV-1- Wirkung und Zelltoxizität untersucht. MT-4 ist eine humane T- Zellinie, die durch eine HIV-1-Infektion stark geschädigt wird und abstirbt. In Abwandlung zu dem von Harada et al (1986, 1.c.) beschriebenen MT-4-Zelltest wurden für den im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung auf Anti- HIV-1-Wirkung durchgeführten Zelltest Kulturüberstände aus der HIV-1 produzierenden Jurkat-Zellinie eingesetzt, die durch Infektion lymphozytärer Jurkat-Zellen (Wendler et al, Med. Microbiol. Immunol. 176 (1987) 273-280) mit dem HIV-1 Typ HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Popovic et al, Science 224 (1984) 497-500) entstanden ist.
Die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II und III erhaltenen Ergebnisse (Anti-HIV-1-Aktivität und Zelltoxizität in vitro im MT-4-Zelltest) wurden mit denen des nukleosidanalogen 3′-Azido-3′-deoxythymidin (AZT) verglichen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:
Tabelle 1
Vergleich der Toxizitäten und Anti-HIV-1-Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen I, II und III mit AZT
Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Substanzen zwar einen Selektivitätsindex (SI) besitzen, der geringer ist als der des hochwirksamen AZT (dessen Anwendung bei längerer Behandlung aber mit starken Nebenwirkungen verbunden ist und zum Auftreten AZT-resistenter HIV-Varianten führen kann), daß der Selektivitätsindex (SI) aber für alle erfindungsgemäßen Substanzen zwischen <10¹ und <10³ liegt. Damit werden mit den erfindungsgemäßen Substanzen weitere Substanzen mit Anti-HIV Wirksamkeit bereitgestellt, die sich zur Behandlung von Virusinfektionen, insbesondere HIV-Infektionen eignen, z. B. zur Unterstützung der Therapie mit AZT oder für eine AZT-Ersatztherapie (z. B. beim Auftreten von ATZ-resistenten Stämmen).
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II und/oder III zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, insbesondere von HIV-Infektionen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese erfindungsgemäßen Substanzen als antiviralen Wirkstoff enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten eine erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I), (II), und/oder (III) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoff.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer zur Applikation der Wirkstoffe geeigneten Form vorliegen, vorzugsweise in Form einer oralen oder parenteral verabreichbaren Form, z. B. als Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien; in erster Linie liegen sie in Form einer parenteral, insbesondere intravenös (iv) zu verabreichenden Lösung vor.
Die Art des pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoffs richtet sich dabei nach der Art der Zubereitung, und insbesondere nach der Verabreichungsart; in der Regel entsprechen sie für antivirale Arzneimittel üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen, insbesondere z. B. den für die Applikation von Azidothymidin (AZT) üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen.
Die Menge der erfindungsgemäßen antiviralen Wirksubstanzen in der pharmazeutischen Zusammensetzung kann, insbesondere abhängig von der Applikationsart, in einem weiten Bereich variieren. In der Regel liegen die erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe in der pharmazeutischen Zusammensetzung in Mengen von 1 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 40 Gew.-%, und in erster Linie von 10 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung, vor. Die bevorzugten Mengen entsprechen insbesondere den für entsprechende AZT-Präparate üblichen Mengen an AZT.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I, II und/oder III enthalten. Daneben können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch noch weitere mit den erfindungsgemäßen Wirksubstanzen kompatible Wirkstoffe gleicher oder unterschiedlicher Wirkungsrichtung enthalten, z. B. AZT und/oder die Therapie unterstützende Wirkstoffe, wie z. B. Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Mittel gegen Darmerkrankungen, Antitumormittel, usw.
Die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann auf eine an sich bekannte und für solche Zubereitungen übliche Art und Weise erfolgen, z. B. durch Auflösung in und/oder Mischen der Wirksubstanzen mit entsprechenden Hilfs- und/oder Trägerstoffen unter sterilen Bedingungen und Überführen und/oder Abfüllen in die geeignete Darreichungsform und/oder Dosiseinheit.
Die Applikationsart, Dauer und Menge der Verabreichung richtet sich insbesondere nach der Art und Schwere der Erkrankung und dem Allgemeinzustand des Patienten; in der Regel liegt die Tagesdosis bei 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise bei 1 bis 50 mg/kg, und in erster Linie bei 2 bis 20 mg/kg Körpergewicht des Patienten; sie kann sich aus einer einzigen Tagesdosis, oder aus mehreren, vorzugsweise drei Verabreichungen pro Tag, zusammensetzen.
Die erfindungsgemäßen Substanzen der Formeln I, II und III sind bekannte Verbindungen und sind auf bekannte Weise erhältlich.
Zur Herstellung von Actinorhodin (Ia), siehe H. Brockmann et al, Chem. Ber. 83 (1950) 161-167, H. Brockmann, Liebigs Ann. Chem. 698 (1966) 209, Zeeck, Liebigs Ann. Chem. 724 (1969) 172, Liebigs Ann. Chem. 1983 510 und Floss, J. Org. Chem. 46 (1981) 455.
Zur Herstellung von 2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9- dihydrobenzo [g] isochroman-3-yl)-essigsäure (Ib), siehe D. Hallmann, Diplomarbeit Universität Göttingen, 1977, Liebigs Ann. Chem. 1983, 471 und 510, A. Zeeck und M. Mardin, Liebigs Ann. Chem. 1974, 1063 bis 1099 und A. Zeeck et al, Liebigs Ann. Chem. 1974, 1100 bis 1125.
Zur Herstellung von Deisovalerylblastmycin (II), siehe T. Ishyama et al, J. Antibiotics XXIX (1976), 804 bis 808.
Zur Herstellung von Aureothin (III), siehe K. Maeda, J. of Antibiotics, Ser. A IV (1953), 137 bis 138 (dort als "crystalline toxic substance" beschrieben), Hirata et al, Tetrahedron 14 (1961), 252 (Aureothin ist mit Mycolutein identisch, vgl. J. Antibiotics XXIX (1976), 236, und kann auf bekannten Wegen aus verschiedenen Produzentenstämmen isoliert werden).
Die Streptomycetenstämme aus welchen die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen I, II und III oder deren Ausgangsstoffe gewonnen werden, sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig oder bei IMET (Nationale Sammlung von Mikroorganismen, Jena) hinterlegt unter der Nummer IMET 9243 (Streptomyces coelicolor, bzw. Actinoplanes sp; auch INA 1569; Ia), DSM 40 737 (Streptomyces arenae, Ib), DSM 6567 (Streptomyces spec., II) und DSM 40 027 (Streptoverticillium thioluteum, III; andere Stammsammlungen: ATCC 12 310; CSB 642.72; ISP 5027; IFO 13 341, 3364; RIA 1302).
Die nachfolgenden Beispiele sollen nun die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiele Herstellung von 2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-dihydro-benzo[g]isochroman-3-yl-)-essigsäure (Ib) Herstellung von (Ia) aus α-Naphthocyclinonsäure (1a)
Es wurde wie bei D. Hallmann, Diplomarbeit, Universität Göttingen, 1977, beschrieben, nach dem folgenden Verfahrensschema gearbeitet. Die Herstellung der Verbindung (1a) ist bei A. Zeeck und M. Mardin, Liebigs Ann. Chem. 1974, 1063 bis 1099 und A. Zeeck et al. Liebigs Ann. Chem. 1974, 1100 bis 1125 beschrieben.
(i) Desacetyl-α-naphthocyclinon-säure (17b)
Aus (1a): 2,1 g chromatographisch gereinigte α-Naphthocyclinonsäure (1a) wurde bei Raumtemperatur in 300 ml 2 N NaOH gelöst. Die violette Lösung säuerte man nach 45 Min. an, wusch den abgetrennten Niederschlag mehrmals mit Wasser aus, nahm dann in Ethylacetat auf und schüttelte zur Entfernung von Säureresten mit Wasser aus. Der Rückstand der zur Trockene eingeengten Lösung wurde mit 5 g Seesand verrieben und im Kreisprozeß erst mit Wasser, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die aus dem Ethylacetatextrakt auskristallisierten roten Nadeln wurden mit Chloroform gewaschen und über Calciumchlorid getrocknet.
Ausb. 1,48 g; Schmelzp. 262°C (Zers.)
17b löst sich in Ethylacetat oder Ethanol. Wäßrige Natriumhydrogencarbonat- Lösung und 2 N NaOH lösen 17b unter Blau- bzw. Violettfärbung.
IR 3400 und 2800 (breit, OH); 1715, 1665 (sh), 1640 (sh), 1630-1600 cm-1 (C = O und C = C)
UV (Methanol):
λmax (ε) = 468 (6700), 333 (6200), 266 nm (22 600);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 540 (sh), 520 (sh), 490 (7100), 317 (sh), 272 (sh), 234 nm (25 200);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 590 (sh), 550 (9200), 358 (5600), 261 nm (22 100).
C₃₀H₂₆O₁₄ (610.5)
Ber. C 59.02; H 4,31;
Gef. C 59.07; H 4.34.
(ii) Desacetyl-α-naphthocyclinon-säure-tert-butylether-di-tert-butylester (17e) und Desacetyl-anhydro-α-naphthocyclinon-säure-di-tert-butylester (19c)
Unter Rühren wurden 430 mg Desacetyl-α-naphthocyclinon-säure 17b in 300 g 70% Schwefelsäure gelöst, die sich allmählich violettrot färbende Lösung blieb 4 Tage lang bei Raumtemperatur stehen und wurde anschließend in 4 l Wasser gegossen und der Farbstoff erschöpfend mit Ethylacetat extrahiert. Die auf 400 ml eingeengte organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtriert und zur Trockene eingeengt, lagerte man den pulverisierten Verdampfungrückstand über Kaliumhydroxid.
418 g des rohen Reaktionsproduktes wurde in einem Druckkolben in 150 ml Dichlormethan suspendiert und nach Einkondensieren von 20 g Isobuten mit 0,2 ml konz. Schwefelsäure 4 Tage lang bei Raumtemperatur geschüttelt; anschließend entfernte man das überschüssige Isobuten durch Rühren der Lösung unter Normaldruck. Nach Einengen auf 50 ml wurde mit 300 ml Chloroform verdünnt und mit Wasser ausgeschüttelt. Den getrockneten Verdampfungsrückstand trennte man durch zweimalige Chromatographie an Oxalsäure-Kieselgel (PDC-Platten; 20 × 40 cm) im System III (Chloroform: Ethylacetat; 1 : 1), welches zuvor mit Oxalsäure gesättigt worden war.
Die Inhaltsstoffe der drei Hauptzonen eluierte man mit Aceton, nahm die Verdampfungsrückstände in Chloroform auf, wusch mit Wasser, trocknete über Natriumsulfat und engte zur Trockene ein. Die Substanzen wurden nach Umfällen aus Ethylacetat/ n-Pentan als faserige Feststoffe erhalten:
 52 mg (Zone 1, größter Rf-Wert);
 41 mg (Zone 2);
342 mg (Zone 3).
Das aus Zone 3 isolierte 19c (Diastereomeres B) Ausb. 342 mg (68,9%, bezogen auf 17b), schmolz bei 159°C; 17b ist gut in Chloroform oder Aceton löslich und zeigt in Benzol eine geringe Löslichkeit. Die dunkelblaue alkalische Lösung von 19c wird nach Zugabe von Natriumdithionit gelb.
IR 3420 (breit, OH); 2980, 2940 (CH); 1730 (Ester), 1668 (sh), 1645, 1625, 1600 cm-1 (C=O und C=C).
UV (Methanol):
λmax (ε) = 585 (7000), 516 (sh), 355 (sh), 265 (18 400), 250 nm (sh);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 575 (sh), 528 (6700), 500 (sh), 263 (sh), 234 nm (27 300);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 614 (16 000), 570 (sh), 276 (sh), 250 nm (24 300).
C₃₈H₄₀O₁₃ (704.7)
Ber. C 64.75; H 5.72;
Gef. C 65.37; H 6.04.
(iii) Diazomethan-Abbau von 19c
Die etherische Diazomethanlösung würde wie folgt hergestellt; 55 g N-Tolyl-sulfonyl-N-methylnitrosamid (Merck) in 500 ml Ether versetzte man mit einer eiskalten Lösung aus 25 g KOH in 90 ml Ethylenglycolmonoethylether. Nachdem die Reaktion durch Erwärmen auf 40°C eingeleitet worden war, destillierte man das gelbliche Diazomethan-Ethergemisch in eine eiskalte Vorlage. Die dargestellte etherische Diazomethanlösung (350 ml) war etwa 0.5 M.
Eine Lösung von 240 mg 19c (Diastereomeres B) in 150 ml Chloroform versetzte man bei -30°C mit einem dreifachen Überschuß der etherischen Diazomethanlösung und ließ auf 0°C erwärmen. Die hellgelbe Lösung wurde unter Rühren in 2 l Chloroform (-10°C, gesättigt mit trockenem Chlorwasserstoff) eingetropft und 24 h bei -4°C unter gelegentlichem Durchleiten von trockenem Sauerstoff, stehengelassen.
Die i. Vak. eingeengte Reaktionslösung chromatographierte man an Oxalsäure-Kieselgel (6 PDC-Platten, 20 × 40 cm) mit Chloroform/ 0,5% Aceton.
Die Inhaltsstoffe der ersten vier Zonen (größte Rf-Werte) eluierte man vom Adsorbens mit Chloroform.
Nicht näher untersucht wurden die Zonen 1 (7 mg), 3 (1 mg) und die nahe der Auftragslinie wandernden Zonen.
2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-dihydrobenzo[g]isochroman-3-yl)--essigsäure-tert-butylester (Ic)
Der Inhaltsstoff der gelben Zone (2) lag nach Umfällen aus Chloroform/n-Pentan in öliger Form vor. Ausb. 26 mg (21,3%) Ic.
(iv) 2-(10-Hydroxy-1-methyl-6,9-dioxo-6,9-dihydrobenzo[g]isochroman-3-yl)--essigsäure (Ib)
Eine Lösung von 55 mg (Ic) in 1 ml Trifluoressigsäure rührte man 5 Min. lang bei Raumtemperatur, nach Verdampfen der Trifluoressigsäure im Vakuum wurde der gelbe Rückstand an Oxalsäure- Kieselgel (2 PDC-Platten, System III) chromatographiert.
Bedingungen
Chromatographie
Dünnschichtchromatographie DC)
Kieselgel 60 F 254 (Merck-Fertigplatten)
Oxalsäure DC-Platten:
DC-Fertigkarten (Merck) wurden mit 0,5 N Oxalsäure besprüht und 30 Min. bei 110°C getrocknet.
Präparative DC
Kieselgel MN P UV₂₅₄ (Macherey-Nagel) Oxalsäure PDC-Platten
Für 10 präparative DC-Platten (20 × 40 cm) wurden 600 g Kieselgel in einer aus 30 g Oxalsäure, 5 g Ameisensäure und 1,2 l Wasser bestehenden Lösung suspendiert (150 ml Suspension pro Platte). Nach dem Aufgießen trocknete die etwa 1-2 mm dicke Schicht ca. 12 h bei Raumtemperatur, anschließend wurde 3 h bei 130°C aktiviert.
Säulenchromatographie
2 kg Kieselgel unter 0,08 (Macherey-Nagel) wurden in 4 l 0,5 N Oxalsäure aufgeschlämmt. Die Suspension trocknete in 3-4 cm hoher Schicht bei 110°C; nach 24 h wurde gesiebt und 3 h bei 120°C aktiviert.
Laufmittelsysteme
I: Chloroform/Aceton (95 : 5)
II: Benzol/Ether/Aceton (9 : 9 : 2)
III: Chloroform/Ethylacetat (1 : 1)
Aus der gelben Hauptzone der Chromatographie wurde (Ib) auf folgende Weise isoliert und umkristallisiert:
Extraktion mit Aceton; präparative Dünnschichtchromatographie an Oxalsäure-Kieselgel im Laufmittelsystem Chloroform/Ethylacetat = 1 : 1; Kristallisation aus Ethylacetat/Pentan. Es wurden gelbe Prismen (Ib) erhalten. Ausbeute 36,2 mg (78%); Schmelzpunkt 209°C.
In Aceton, Ethylacetat oder Chloroform ist Ib löslich, von 2 N NaOH wird Ib mit blau-violetter Farbe aufgenommen.
IR 3450, 2750 (breit, OH); 1745, 1660, 1640 cm-1 (C = 0 und C = C).
UV (Methanol):
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (3800), 405 (sh), 254 nm (11 700);
(Methanol/HCl):
λmax (ε) = 455 (sh), 425 (4200), 405 (sh), 354 nm (12 400);
(Methanol/NaOH):
λmax (ε) = 546 (4200), 370 (1400), 290 nm (8000).
¹H-NMR (d-Dioxan):
δ = 12.32 (s; 10-OH), 732 (s; 5-H), 6.89 (s; 7-H, 8-H), 5.12/1.53 (q/d; 1-H-CH₃), 4.36 (mc; 3-H), 2.9-2.5 ppm (komplex. Signal für Aliphat.-H).
MS: m/e = 302 (100%, M⁺), 287 (53%, M-CH₃), 269 (5,9%), 241 (98%, M-61), 227 (35%, M-75), 213 (71,3%), 185 (45%), 157 (33%).
C₁₆H₁₄O₆ (302.3)
Mol.-Masse: 302 (massenspektrometr.)
Test auf Anti-HIV-1-Aktivität und Cytotoxizität im MT-4-Zelltest
In Abwandlung zu dem von Harada et al (1986, 1.c.) beschriebenen MT-4-Zelltest wurden für den hier durchgeführten Zelltest Kulturüberstände aus der HIV-1 produzierten Jurkat- Zellinie eingesetzt, die durch Infektion lymphocytärer Jurkat-Zellen (Wendler et al, 1987, 1.c.) mit dem HIV-1-Typ HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Popovic et al, 1984, 1.c.) entstanden ist.
Als Gewebekulturmedium wurde für Jurkat- und MT-4-Zellen sterilfiltriertes RPMI 1640 Medium (Gibco, Karlsruhe), unter Zusatz von 10% komplementinaktiviertem (30 Minuten, 56°C) fötalem Rinderserum (Seromed, Berlin) sowie Antibiotika verwendet (dem Gewebekulturmedium wurden 50 mg Streptomycin und 10⁵ E Penicillin pro Liter Medium zugefügt). Während der Durchführung des MT-4-Zelltests wurde zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes dem Medium 25 mM HEPES (2-4(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinyl-ethansulfonsäure, Merck, Darmstadt) zugefügt. Die Zellkulturen wurden in einem Inkubator (Heraesus) bei 37°C mit einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 6% CO₂ inkubiert.
Der MT-4 Zelltest wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt. Pro Loch wurden 3 × 10⁴ MT-4-Zellen mit verschiedenen Substanzverdünnungen mit und ohne HIV-1 kultiviert. Die Substanzen wurden in einer Anfangskonzentration von 500 µg/ml, bzw. von 250 µg/ml, gefolgt von Verdünnungen von 1 : 10, austitriert. Für die Virusinfektion wurde eine zuvor austitrierte Virusdosis von etwa 10 TCID₅₀ eingesetzt. Nach drei Tagen Kultivierung wurde frisches RPMI 1640 Medium zugegeben. Vier Tage nach Testansatz wurden 0,1 µCi ³H-Thymidin pro Loch der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Zellen wurden 20 Stunden später auf Glasfiberfiltern geerntet, mit Wasser gewaschen und der ³H-Thymidineinbau in der Zell-DNA nach Zugabe eines flüssigen Szintillators Toluol/POPOP (Roth, Karlsruhe) im β- Zähler (Packard, Frankfurt) gemessen. Niedrige Einbauraten weisen auf einen virusbedingten Zelltod bzw. die Toxizität der Substanz hin, hohe auf eine Hemmung der HIV-1-Infektion. Der ³H-Thymidineinbau wurde für jede Substanz in Abhängigkeit der Substanzkonzentration graphisch dargestellt und die Toxizität sowie die maximale antivirale Wirksamkeit der Substanzen wurde ermittelt.
Die Fig. 1 zeigt die Anti-HIV-1-Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen Ia, Ib, II und III im MT-4-Zelltest. Der ³H- Thymidineinbau (cpm) in die Zell-DNA wurde gegen die Substanzkonzentration (µg/ml) von Ib (Fig. 1A), Ia (Fig. 1B), II (Fig. 1D) und III (Fig. 1C) aufgetragen. Die Zellen wurden mit der Wirksubstanz in Anwesenheit (-) und in Abwesenheit von HIV-1 (---) kultiviert.
Die Toxizität der Verbindung Ib (Fig. 1A) in der Konzentration von 250 µg/ml beruht auf dem toxischen Effekt des im Test verwendeten Lösungsmittels Dioxan. Die Verbindungen Ia (Fig. 1B) und III (Fig. 1C) sind bei 50 µg/ml zelltoxisch. Die Verbindung II (Fig. 1D) ist aufgrund des im Test verwendeten Lösungsmittels Methanol bei einer Konzentration von 500 µg/ml zelltoxisch.
Die Substanz Ib unterdrückte den HIV-1 bedingten Zelltod bei einer Konzentration von 2,5 µg/ml (Fig. 1A). Bei einer Konzentration von 5 µg/ml konnte die Verbindung Ia eine 100%ige Inhibition der HIV-1-Infektion in dem MT-4-Zellen bewirken, bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml nur noch eine 50%ige Inhibitioin (Fig. 1B). Die Substanz II war bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml (Fig. 1D) und die Substanz III bei einer Konzentration bis zu 0,05 µg/ml (Fig. 1C) antiviral wirksam.
Aus der Fig. 1 wurden die für MT-4-Zellen maximalen nicht toxischen Substanzkonzentrationen, sowie die maximalen und therapeutischen Konzentrationen ermittelt, in molare Konzentrationen umgerechnet und in der vorstehend angegebenen Tabelle 1 zusammengefaßt.
In Tabelle 1 werden auch die Selektivitätsindices (SI) der untersuchten Substanzen angegeben. Der Selektivitätsindex (SI) beschreibt das Verhältnis der auf die MT-4 Zellen toxisch wirkenden Substanzkonzentration zu der Substanzkonzentration, bei der eine HIV-1-Infektion zu 100% verhindert wird. Alle untersuchten Substanzen haben einen Selektivitätsindex (SI) zwischen <10¹ und <10³.

Claims (9)

1. Antivirale Substanz aus Streptomyceten der Formeln (I), (II) und (III) worin R₁=R₂=H oder R₁=OH und R₂= worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise eine n-Butylgruppe bedeutet zur Anwendung als therapeutischer Wirkstoff.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung der Formeln (I), (II) und/oder (III) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoff.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer oral oder parenteral verabreichbaren Form vorliegt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer intravenös applizierbaren Form vorliegt.
5. Verwendung einer Verbindung der Formel (I), (II) oder/und (III) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen.
6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HIV-Infektionen.
7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
8. Verwendung einer Verbindung der Formeln (I), (II) oder/und (III) zur Behandlung von Virusinfektionen.
9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Behandlung von HIV-Infektionen.
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