DE102004040014A1 - HKI 10429005, neue zytostatische Wirkstoffe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft zytostatische Wirkstoffe, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung, neue Aureothin-Derivate mit guter zytostatischer Wirkung bereitzustellen sowie deren Herstellung und Verwendung anzugeben, wird dadurch gelöst, dass Verbindungen der Formel I und/oder der Formel II im Gemisch oder als Reinsubstanz angegeben, verwendet und hergestellt werden.

Description

• Die Erfindung betrifft zytostatische Wirkstoffe, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung.
• Polyketidantibiotika und der Polyketidstoffwechsel sind seit vielen Jahren bekannt (D. O'Hagan, The Polyketide Metabolites, Ellis Horwood, Chichester, 1991).
• Auch ist bekannt, dass Streptomyces thioluteus das Polyketidantibiotikum Aureothin synthetisiert (Y. Hirata, H. Nakata, K. Yamada, K. Okuhara, T. Naito, Tetrahedron, 1961, 14, 252) und dass verschiedene andere Streptomyces-Stämme in der Lage sind, Derivate dieser Verbindung zu synthetisieren.
• Aufgabe der Erfindung ist es, neue Aureothin-Derivate mit guter zytostatischer Wirkung bereitzustellen, sowie deren Herstellung und Verwendung anzugeben.
• Diese Aufgabe wird durch die Aureothin-Derivate folgender Strukturen (Formel I und II) gelöst:

  

  Ausgangspunkt für die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Aureothin-Derivate (Formel I und II) ist die Fermentation eines Streptomyces thioluteus-Stammes, bspw. des Wildstammes Streptomyces thioluteus DSM 40027, in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, üblichen anorganischen Salzen und zuzugebenden Präkursoren, bis sich die neuen Aureothin-Derivate mit guter zytostatischer Wirkung, auch als HKI 10429005 bezeichnet, in der Kultur anhäuft und anschließend HKI 10429005 in reiner Form daraus isoliert werden kann.
• An Stelle der Streptomyces thioluteus-Stämme können auch deren Varianten und Mutanten eingesetzt werden. Als Varianten und Mutanten gelten alle jenen Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Verbindungen zu synthetisieren. Solche Varianten und Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, bspw. Bestrahlung mit UV- oder Röntgenstrahlen, chemischer Mutagene oder durch gezielte Konstruktion und Transformation von Plasmiden, bspw. in Streptomyces lividans, erzeugt werden.
• Das Screening nach Varianten und Mutanten, die die beiden erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität des Kulturüberstandes, insbesondere der Zytotoxizität, anhand der dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.
• HKI 10429005 sind zwei Aureothin-Derivate (Formel I und II), die sich von den bisher bekannten Aureothin-Derivaten durch ihre chemischen Strukturen, deren Neuheit durch physikochemische Messungen zweifelsfrei belegt wird (1), unterscheiden.
• Obwohl aus den Streptomyces thioluteus-Stämmen schon andere Aureothin-Derivate bekannt sind, wurden jetzt die beiden neuen Aureothin-Derivate HKI 10429005 entdeckt, die überraschenderweise eine sehr starke zytostatische Wirksamkeit besitzen (2 und 3).
• HKI 10429005 kann somit u.a. als Zytostatika eingesetzt werden.
• Darüber hinaus besitzt HKI 10429005 auch antifungale und antibakterielle Wirksamkeit (3).
• Die im folgenden beschriebene Fermentationsbedingungen gelten für Streptomyces thioluteus und den hinterlegten Stamm Streptomyces thioluteus DSM 40027 sowie für Varianten und Mutanten und transformierte Streptomyces lividans-spezies.
• Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich Na-Pyruvat und Na-Propionat, assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glucose, Lactose, Maltose, Glycerol und D-Mannitol, oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt oder Melasse.
• Als Stickstoffquellen eignen sich Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone und Peptone, Hefe- und Fleischextrakte, gemahlene Samen sowie Rückstände der Alkoholherstellung.
• An organischen Salzen kann die Nährlösung zum Beispiel Phosphate, Sulfate, Chloride oder Carbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, Mangan, Eisen und Kobalt enthalten.
• Als Präkursoren werden para-cyano-substituierte aromatische Verbindungen, wie bspw. para-Cyanobenzoat, eingesetzt. Alternativ dazu können auch höhermolekulare Verbindungen, aus denen die Stetomycesspezies in der Lage sind, para-Cyano-substituierte aromatische Verbindungen zu gewinnen, eingesetzt werden.
• Die Kultivierung erfolgt aerob, zum Beispiel submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Zuführung von Luft oder Sauerstoff.
• Die Fermentation kann bei einer Temperatur von 15 bis 37°C, vorzugsweise bei 20 bis 35°C, insbesondere bei 26 bis 31 °C durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 4,0 und 8,0 liegen, vorteilhaft zwischen 6,5 und 7,5.
• Man kultiviert die Streptomyces-Stämme unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 2 bis 10 Tagen, bevorzugt 3 bis 6 Tage.
• Vorteilhaft kultiviert man in aufeinanderfolgenden Stufen, in dem man eine oder mehrere aufeinanderfolgende Vorkulturen mit flüssigem Nährmedium kultiviert und dann in das eigentliche Produktionsmedium (Hauptkultur) überimpft.
• Die Präkursoren werden bspw. jeweils am 1. 2. und 3. Tag zugesetzt, wobei sechs Tage nach der ersten Präkursor-Zugabe die Fermentorlösung mit Salzsäure neutralsiert wird.
• Das Volumenverhältnis von Vor- und Hauptkultur beträgt beispielsweise 1:10. Das Mycel für die Vorkultur kann zum Beispiel erhalten werden, in dem man aus der Stammhaltung Biomasse steril separiert.
• Der Fermentationsverlauf kann anhand der Biomassezunahme, der Kohlenstoffquellenabnahme und der Kontrolle der Produktbildung, bspw. Enzyme, durch chromatographische Methoden, wie zum Beispiel durch Dünnschicht- oder Hochdruckflüssigchromatographie, bzw. Tests der enzymatischen oder biologischen Aktivitäten überwacht werden.
• Besonders vorteilhaft wird für die Fermentation eine M10 Nährlösung folgender Zusammensetzung verwendet:
  4g Hefeextrakt
  10g Malzextrakt
  4g Glucose
  gelöst in 1 Liter H₂O
  mit eingestelltem pH-Wert von 7,3.
• Die beimpften Bakterienkulturen, je 100 ml Nährlösung in 500 qml-Erlenmeyerkolben, werden bei 28°C mit 200 rpm für 5 Tage auf einem Schüttler bewegt, wobei der Nährlösung am 1. Tag mit 0,012 mmol Präkursor (bspw. para-Cyanobenzoat), am 2. Tag mit 0,006 mmol Präkursor und am 3. Tag mit 0,003 mmol zugesetzt wird.
• Nach 6 Tagen wird die Fermentationsflüssigkeit (der Kulturüberstand) geerntet, und aus diesem wird mit bekannten Methoden des Essigsäureextraktion ein Rohextrakt gewonnen.
• Dieser Rohextrakt wird bis zur Trockenheit eingeengt und anschließend in Methanol aufgenommen, um bekannten chromatographischen Methoden (bspw. Kieselgelsäulenchromatographie: NP CHCl₃-Gradient: CHCl₃ : McOH = 9:1; Gelchromatographie: Sephatex LH-20, McOH, präparative HPLC: RP, AcCn:H₂O) zugeführt zu werden.
• Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie unter Verwensdung von polaren organischen Lösungsmitteln wird schließlich reines HKI 10429005 erhalten.
• Die chemische Identität des Wirkstoffs HKI 10429005 wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektroskopie (FAB-MS, Quadrupol-Electrospray-MS; CID-MS/MS) sowie durch hochauflösende H- und ¹³C-NMR-Korrelations-Spektroskopie bewiesen.
• Die beiden erfindungsgemäßen Aureothin-Derivate HKI 10429005 (Formel I und II) eignen sich einzeln sowie in Mischung aufgrund ihrer sehr wertvollen zytostatischen und antifungalen Wirkung sehr gut zur Anwendung als Therapeutikum, insbesondere bei der Bekämpfung von schnell wachsenden eukaryontischen Zellen und von verschiedenen Pilzerkrankungen.
• Die beiden erfindungsgemäßen Aureothin-Derivate HKI 10429005 (Formel I und II) können als solche einzeln, in Mischung oder als pharmazeutische Zubereitung mit geeigneten, dem Fachmann bekannten Hilfstoffen oder Trägermaterial verabreicht werden (Tabletten, Kapseln, Dragees, Salben, Sprays. TTS oder Gele).

Claims (10)

1. Verbindung der Formel I und/oder der Formel II:

   

   im Gemisch oder als Reinsubstanzen.
2. Verfahren zur Herstellung des Gemisches oder einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces thioluteus in einem Nährmedium kultiviert, bis sich eine Verbindung der Formel I und/oder II in dieser ansammelt und aus dieser isoliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces thioluteus DSM 40027 in einem Nährmedium kultiviert wird.
4. Verfahren zur Herstellung des Gemisches oder einer Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man einem Nährmedium Präkursoren zusetzt.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Präkursoren para-Cyano-substituierte aromatische Verbindungen sind.
6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die para-Cyano-substituierte aromatische Verbindungen para-Cyanobenzoat sind.
7. Verwendung einer Verbindung der Formel I und/oder II nach Anspruch 1 als biologisch wirksamen Stoff.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I und/oder II als Zytostatika eingesetzt wird.
9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I und/oder II als Fungizid eingesetzt wird.
10. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel I und/oder II als Antibiotikum eingesetzt wird.