DE69633926T2

DE69633926T2 - Beeinflussung der wirkung von pflanzenwachstumsregulatoren

Info

Publication number: DE69633926T2
Application number: DE69633926T
Authority: DE
Inventors: Maria Wilhelmus VAN DER KRIEKEN; Gerrit Smit
Original assignee: Plant Research International BV
Current assignee: Plant Research International BV
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2016-06-25
Also published as: EP0847241A1; JPH11514846A; EP0847241B1; NL1001620C2; AU6417096A; ES2229279T3; WO1997000614A1; DE69633926D1; US6242381B1; ATE282958T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung und/oder Verlängerung der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren ("plant growth regulators" (PGRs)) nach in vivo- oder in vitro-Anwendung.
Pflanzenwachstumsregulatoren sind natürliche oder synthetische Verbindungen, die eine Rolle bei einer großen Anzahl von Wachstums-, Entwicklungs- und Stoffwechselprozessen in der Pflanze spielen. Die am besten bekannten Pflanzenwachstumsregulatoren sind Auxine, Gibberelline, Zytokinine, Ethylen, Abscisinsäure und Jasmonsäure.
Durch Verabreichung solcher PGRs ist es möglich, in verschiedene physiologische Prozesse, wie die Wurzelbildung in Gewebekultur, bei Stecklingen und Embryos, die Reifung von Früchten oder Gemüsen, Seneszenz (Alterung) von Blüten und Gelbfärbung von Blättern und dergleichen, die Keimung von Samen, die Induktion von Blüten, Früchten, Knospen und dergleichen, einzugreifen.
Zusätzlich zur Beeinflussung dieser natürlichen Prozesse können auch Effekte, die natürlicherweise nicht auftreten, erzielt werden, beispielsweise die Entwicklung von samenlosen Früchten, größeren Früchten, die Regulation der Ernte, indem das Fallen von Früchten verhindert wird, das Ausdünnen von Früchten in Obstbäumen, eine regulierte Wachstumsverzögerung von Bäumen und Zweigen oder Trieben und jungen Pflanzen, eine regulierte Zweigbildung, die Induktion der Bildung von Trieben beispielsweise bei Gerste, um Malz zu produzieren, eine Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber Herbiziden, eine Hemmung des Rauhwerdens oder Schrumpelns der Schale von Früchten, wie Äpfeln, Bananen, die Produktion von somatischen Embryos und dergleichen.
Verschiedene PGRs können eine Rolle bei der Beeinflussung von diesen und anderen Prozessen in Pflanzen oder Teilen davon spielen. Obwohl es offensichtlich erscheinen würde, dass eine solche Beeinflussung durch eine Erhöhung der Konzentration eines PGR oder durch Anwendung einer Anzahl von PGRs realisiert werden könnte, wird in der Praxis festgestellt, dass dies nicht der Fall ist.
Die Beeinflussung von Pflanzenprozessen durch Verabreichung von natürlich vorkommenden oder modifizierten PGRs gegebenenfalls in Kombination mit anderen Zusatzstoffen ist beschrieben worden. Die französische Patentanmeldung FR 2 449 664 offenbart die Verwendung von PGRs mit Zuckern als Zusatzstoff in einer Zusammensetzung zur Verbesserung der Wachstumseigenschaften von Pflanzen. Das deutsche Patent DD 128 544 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung von modifizierten PGRs in Form von glykosylierten Gibberellinen. In einem anderen deutschen Patent, DD 124 449 , werden Ester, an die ein Zucker konjugiert ist, um deren biologische Aktivität während eines längeren Zeitraums zu verbessern, offenbart. US 4 169 717 offenbart eine Kombination eines Pflanzenwachstumshormons mit dem Komplexbildungsprodukt eines essentiellen zweiwertigen Metalls mit wenigstens zwei Liganden. Das amerikanische Patent US 4 380 626 offenbart eine Zubereitung von das Pflanzenwachstum regulierenden Zusammensetzungen, umfassend Einschlusskomplexe von 2-Chlorethylphosphonsäure, welche mit α-, β- und/oder γ-Cyclodextrin gebildet werden. Das amerikanische Patent US 3 890 299 offenbart Pflanzenwachstumsregulatoren des Zytokinin-7-nukleosid-Typs. Das Dokument AN: 94-022784 offenbart eine Zusammensetzung, welche Xyloglucanoligosaccharid umfasst, als ein Phytoalexin-Induktionsmittel. AN: 90-144844 offenbart eine Kartoffelknollen induzierende Zusammensetzung, welche Ascorbinsäure, Jasmonsäuren und Zytokinine umfasst. WO 79/00838 offenbart ein verbessertes Verfahren betreffend die Wirksamkeit von landwirtschaftlichen Chemikalien durch gleichzeitige Verabreichung von Zusatzstoffen, wie Kohlenhydraten, organischen Säuren, Vitaminen und Coenzymen, Purin- und Pyrimidinnukleosiden und -nukleotiden, natürlich vorkommenden Fetten und Ölen, Aminosäuren und Pflanzenwachstumsregulatoren. EP 0 270 002 offenbart ein Verfahren zur Verbesserung der Wirkung von landwirtschaftlichen Chemikalien, umfassend die Verwendung von Enzymen als landwirtschaftliche Hilfsstoffe oder Adjuvantien. Ein Verfahren zur Herstellung von liposomalen mikroverkapselten Produkten für eine Verwendung für landwirtschaftliche Formulierungen, speziell Wirkstoffe, wie Pestizide, wird in WO 95/27395 offenbart.
Die meisten PGRs werden, nachdem sie in die Pflanze aufgenommen worden sind, abgebaut, ohne ihren endgültigen Zweck zu erreichen. Zusätzlich haben hohe PGR-Konzentrationen insbesondere eine Wirkung auf eine jegliche zufällig angetroffene Zelle, was nachteilig sein kann, wenn eine sehr stark lokalisierte Aktivität angestrebt wird.
Zusätzlich können auch Probleme mit bestimmten PGRs bei der Verabreichung von diesen auftreten. PGRs werden im allgemeinen zu Wasser, welches der Pflanze durch Bewässerung, Besprengen und dergleichen zugeführt wird, hinzugesetzt. Die Unlöslichkeit von einigen PGRs in Wasser führt zu einer schlechten Absorption durch die Pflanze.
Es ist der Gegenstand der Erfindung, die Aktivität von PGRs in vivo oder in vitro zu erhöhen und/oder zu verlängern und/oder zeitlich abzustimmen, um eine spezifische Beeinflussung von physiologischen und anderen Prozessen im richtigen Moment und an der richtigen Stelle zu ermöglichen.
Dies wird gemäß der Erfindung erreicht durch ein Verfahren zur Erhöhung und/oder Verlängerung der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren ("plant growth regulators" (PGRs)) in vivo oder in vitro, welches umfasst:

a) örtlich die Konzentration von aktiven Pflanzenwachstumsregulatoren in einer Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en) zu erhöhen, indem
1) ein oder mehrere PGR(s), der bzw. die chemisch modifiziert worden ist bzw. sind, indem er (sie), gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Abstandshalter- oder Spacermoleküls, mit einem oder mehreren Trägermolekülen verknüpft worden ist bzw. sind, verabreicht wird bzw. werden; und
2) gegebenenfalls der bzw. die chemisch modifizierte(n) PGR(s) in verkapselter Form verabreicht wird bzw. werden;
b) die Empfindlichkeit der Pflanze und/oder von dem oder den Pflanzenteil(en) gegenüber der Aktivität von Pflanzenwachs tumsregulatoren durch Verabreichung oder Aufbringen von einer oder mehreren Verbindungen, die zu einer Abwehrreaktion in der Pflanze führen, zu erhöhen.

Die Kombination von a und b kann verwendet werden, um die Verfügbarkeit und/oder Wirkung der Pflanzenwachstumsregulatoren zeitlich abzustimmen, wie weiter unten erläutert werden wird.
Die Zunahme der Konzentration von aktiven Pflanzenwachstumsregulatoren in der Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en) wird beispielsweise erreicht, indem die PGRs der Pflanze und/oder dem oder den Pflanzenteil(en) in verkapselter Form verabreicht werden. Eine solche Kapselstruktur kann eine Liposom- oder Micellen-artige Struktur sein. Obwohl Liposome per se bekannt sind, ist die Verwendung von diesen, um Substanzen an Pflanzen zu verabreichen, neu.
Gemäß der Erfindung ist festgestellt worden, dass durch Verabreichung der PGRs in einem Liposom oder einer Micelle ein Pool von (potentiell aktiven) PGRs in dem Pflanzengewebe gebildet wird. Durch Unterschiede bei der Lipophilie und durch Variieren der Größe der Micellen und Liposome kann der Transport in der Pflanze reguliert werden. Zusätzlich können die Liposome und Micellen gegebenenfalls zu einem speziellen Gewebe oder Organ gesandt werden, indem in die Membran sogenannte "Targeting"-Moleküle (Moleküle, die ein zielgerichtetes Ansteuern vermitteln) aufgenommen werden. Die Lokalisierung der Aktivität wird dadurch erhöht.
Die Stabilität der Liposome, die aus einer Doppelschicht von Phospholipiden bestehen, kann reguliert werden, da diese stark von der Zusammensetzung der Lipidmembran abhängt. Es können dementsprechend Substanzen in die Membran aufgenommen werden, die in der Pflanze abgebaut werden. Auf diese Weise wird das Liposom zu lecken beginnen und setzt seinen Inhalt frei. Die Stabilität kann auch durch Enzyme, wie Esterasen, Lipasen und Phospholipasen, die in der Pflanze vorhanden sind, beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu kann die Stabilität durch das Hinzufügen von Sterolen oder durch die Verwendung von gesättigten Phospholipiden erhöht werden. Ferner kann die Zugabe von grenzflächenaktiven Mitteln (Detergentien) die Freisetzung des Inhalts auslösen. In einem solchen Falle werden die Liposome oder Micellen an die Pflanze zuerst verabreicht und später ein Detergens, wodurch sich die Liposome oder Micellen auflösen und ihren Inhalt freisetzen.
Micellen bestehen aus Molekülen mit einer polaren wasserlöslichen und einer nicht-polaren fettlöslichen Seite und sind sehr geeignet, um nicht-polare PGRs in einem polaren Medium, wie Wasser, zu lösen. Wenn nicht-polare PGRs mit den Micellen bildenden Molekülen gemischt werden, werden die nicht-polaren Enden den PGR verkapseln, wonach die polaren Enden das Ganze in dem umgebenden Medium lösen werden. Es ist in gleicher Weise möglich, den PGR zuerst in Öl zu lösen und die kleinen Öltröpfchen dann in Zellen einzuführen. Die Mischung von Micellen und Öl mit PGRs kann mit Wasser gemischt werden. Die so erhaltene Lösung kann in die Pflanze transportiert werden, indem sie durch Beregnung ausgebracht oder auf die Wurzeln oder die durchtrennte Oberfläche des Stamms oder Stengels aufgetragen wird.
Die PGRs können chemisch modifiziert werden, indem ein oder mehrere Trägermoleküle in kovalenter Weise daran geknüpft werden. Solche Trägermoleküle können verschiedene Funktionen erfüllen.
Es gibt dementsprechend Trägermoleküle, die eine Transportfunktion spielen. Es ist bekannt, dass innerhalb einer Pflanze bestimmte Transportsysteme vorhanden sind. Kohlenhydratmoleküle werden beispielsweise zu jungem, sich entwickelndem Gewebe, Blüten oder Wurzeln transportiert. Indem ein PGR mit einem solchen Trägermolekül verknüpft wird, kann ein Transport zu einem gewünschten Gewebe bewirkt werden.
Die transportierbaren Verbindungen können beispielsweise aus der Gruppe, die aus Kohlenhydraten, wie Saccharose, Glucose, Sorbitol, Sterolen, Terpenen, phosphorylierten Kohlenwasserstoffen und dergleichen besteht, ausgewählt werden.
Eine andere Art von Trägermolekülen hat Polaritätsbeeinflussende Eigenschaften. Dies ist wichtig für die Absorption der PGRs.
Wenn ein PGR durch das Blatt hindurch absorbiert werden muss, muss er zuerst durch die Wachsschicht auf dem Blatt hindurchwandern. Dies wird vereinfacht, wenn der PGR mit einer nicht-polaren, fettlöslichen Substanz verknüpft ist. Im Gegensatz dazu erfolgt eine Absorption über den durchtrennten Stamm oder Stengel besser, wenn der PGR polar, wasserlöslich und vorzugsweise negativ geladen ist. Die negative Ladung ist vorteilhaft, da positiv geladene Verbindungen leicht an das vaskuläre Gewebe des Stamms oder Stengels binden.
PGRs sind nahezu allesamt saure Verbindungen und dementsprechend polar. Durch Verknüpfung eines PGRs mit einem Träger, einem Abstandshaltermolekül ("Spacer") oder einem zweiten PGR-Molekül (gegebenenfalls des gleichen Typs) verschwindet die Polarität, da die geladene Gruppe für die Verknüpfung verwendet wird. Eine solche Verknüpfung kann über Ester- oder Peptidbindungen erfolgen. Im Falle eines alkalischen PGR kann ein saurer Träger oder ein saures Abstandshaltermolekül verwendet werden. Wenn jedoch gewünscht wird, den PGR polar zu machen, kann dies beispielsweise erfolgen, indem dieser über eine Esterbindung mit einem Zucker verknüpft wird oder indem aus dem PGR ein Sulfonat hergestellt wird. Solche Verbindungen weisen mehr Ladungen auf als der PGR selbst und machen diesen dementsprechend sogar noch polarer.
Die Aktivität von PGRs wird in der Pflanze oftmals durch Abbauprozesse beendet. Da das Trägermolekül mit der Gruppe, die den (Abbau)Stoffwechsel beeinflusst, an den PGR gebunden ist, wird eine PGR-Verbindung erzeugt, die gegen einen Abbau geschützt ist, und die Lebensdauer des PGR in der Pflanze kann verlängert werden. Es ist hier jedoch wichtig, dass die schützende Gruppe entweder den PGR nicht deaktiviert oder dass die Bindung der schützenden Gruppe reversibel ist, so dass der PGR, der durch Bindung der Gruppe inaktiviert ist, seine Aktivität nach der Abspaltung von der Gruppe wiedererlangt. Eine solche schützende Verbindung wird vorzugsweise mit der Stelle in dem PGR, die an Stoffwechselreaktionen beteiligt ist, verknüpft.
Das Trägermolekül kann direkt oder unter Zwischenschaltung von einem oder mehreren Abstandshaltermolekülen (Spacern) mit den PGRs verknüpft werden, beispielsweise mittels einer kovalenten Ester-, Ether- oder Amidbindung. Die Wahl des Abstandshaltermoleküls und der Umgebungsbedingungen bestimmen die Freisetzungsgeschwindigkeit von freiem PGR aus dem Trägermolekül.
Ein anderer Weg, um einen PGR gegenüber einem Abbau zu schützen, ist die Verwendung eines Abstandshaltermoleküls (Spacers), das zwischen dem Trägermolekül und dem PGR angeordnet ist. Ein solches Abstandshaltermolekül stellt sicher, dass die Freisetzungsgeschwindigkeit des PGRs beeinflusst werden kann. Enzyme, wie Esterasen, Peptidasen und dergleichen, haben eine unterschiedliche Affinität für die verschiedenen Abstandshaltermoleküle.
In einer speziellen Ausführungsform dienen die Verbindungen, die gegen einen Abbau schützen, auch als Abstandshaltermoleküle und werden beispielsweise aus der Gruppe, bestehend aus Bernsteinsäure, Malonsäure, Diaminoalkanen, wie 1,2-Diaminoethan, 1,4-Diaminobutan, 1,6-Diaminohexan und dergleichen, ausgewählt.
Es ist auch möglich, eine Hormon-Vorstufe, die durch Stoffwechselprozesse in ein aktives Hormon umgewandelt wird, anzubieten. Indol-3-hexansäure (I-H-A) wird durch zwei β-Oxidationsschritte (die Enzyme dafür sind in der Pflanze vorhanden) in das Auxin Indol-3-essigsäure (I-A-A) umgewandelt. I-H-A ist dementsprechend eine spezielle Form einer Quelle mit langsamer Freisetzung. Es wurde festgestellt, dass I-H-A bei der Wurzelinduktion bei Äpfeln und Rosen dreißigmal aktiver ist als I-A-A.
Die Aktivität von PGRs kann weiter beeinflusst werden, indem diese zusammen mit sogenannten "Elicitor"-Verbindungen oder "Elicitoren" verabreicht werden. Die Kombination von diesen beiden ist besonders wichtig, wenn sich zur rechten Zeit Gewebeempfindlichkeit entwickeln soll. Das darauf ansprechende Gewebe muss sich zuerst entdifferenzieren, wonach das Gewebe die Kompetenz erwirbt, auf PGRs anzusprechen. "Elicitoren" sind Substanzen, die in der Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en) zu einer Abwehrreaktion führen, und bewirken diese Entdifferen zierung. Ihre natürliche Rolle in Pflanzen zusätzlich zur Induktion der Produktion von Phytoalexinen besteht darin, die Genesung von Pflanzen nach einer Schädigung oder schwerem Stress zu regulieren.
Zellkompartimente (Vakuolen, Vesikel, Plastide), in denen sich katabolische Enzyme (z.B. Peroxidasen, Phospholipasen, Phosphatasen) befinden, werden durch eine Schädigung beschädigt. Diese Enzyme bauen Zellstrukturen ab, wodurch Elicitoren gebildet werden. Peroxidasen können die Zellmembran abbauen, so dass Oligosaccharide, wie sulfonierte Ligninfragmente, und Ligninmonomere, wie Gerbsäure, oder Ferulinsäure gebildet werden. Phospholipasen bauen die Zellmembran zu Fettsäuren, wie Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure, ab. Daraus werden beispielsweise Jasmonsäure (ausgehend von Linolensäure) und Nonansäure (ausgehend von Ölsäure) gebildet. Durch Phosphatasen kann Uridin ausgehend von Uridinmonophosphat (welches sich von Ribonukleinsäure ableitet) gebildet werden. Es wird festgestellt, dass alle diese Substanzen eine Elicitor-Aktivität aufweisen.
Elicitoren, die nicht ursprünglich direkt aus dem Abbau von Zellstrukturen stammen, können ebenfalls verwendet werden, um Gewebeempfindlichkeit zu erhöhen, wie Fusicoccin, Pythium-Extrakt, Cellulase/Pektinase, 4-Acetamidophenol, Lipo(chito)oligosaccharide, Glutathion u.s.w. Zusätzlich können Mittel oder Maßnahmen eingesetzt werden, die zu der Bildung von Elicitoren führen. Solche Mittel oder Maßnahmen sind beispielsweise UV-B (nicht-chemische Induktion von Gewebeempfindlichkeit gegenüber PGRs, Ozon u.s.w. Zwischenprodukte aus der Phytoalexin-Biosynthese sind ebenfalls geeignet. Diese Zwischenprodukte sind beispielsweise Anthocyane, Sterole u.s.w.
Wenn ein Trieb von einer Pflanze abgeschnitten wird, werden an der Stelle der Wunde Elicitoren gebildet werden. In der Spitze des Triebs, in der sich junge Blätter und Meristem befinden, werden auch Auxine produziert, die zu der Wunde über das übliche polare Auxin-Transportsystem transportiert werden. Auxine und Elicitoren sammeln sich folglich an der Wunde an. Die Letztgenannten erhöhen die Gewebekompetenz, wodurch das Gewebe die Fä higkeit entwickelt, auf induzierende Faktoren anzusprechen, während die Auxine die Wurzelbildung induzieren. Auf diese Weise wird ein bewurzelter Trieb gebildet.
Ein ähnlicher Mechanismus tritt im Falle von Zytokininen auf. Sie bewegen sich natürlicherweise ausgehend von ihrer Syntheseposition in den Wurzeln zu der Spitze der Pflanze. Es ist jetzt festgestellt worden, dass, wenn die Spitze abgebrochen wird, Elicitoren gebildet werden, die das Gewebe in der Nähe der wunde empfindlicher gegenüber der Aktivität der Zytokinine machen. Auf diese Weise werden neue Triebe gebildet.
Dieser Mechanismus tritt auch bei der Auxin/Zytokin-induzierten Blütenknospenbildung auf Dünnschicht-Gewebekulturstreifen-Stecklingen ausgehend von Blütenstielen von Tabak auf (siehe Tabelle).
Es ist jetzt gemäß der Erfindung festgestellt worden, dass die Aktivität der Elicitoren nicht nur die Induktion von Abwehrmechanismen (Produktion von Phytoalexinen) betrifft, sondern auch die Induktion von Gewebekompetenz/empfindlichkeit gegenüber PGRs. Die Aktivität der Elicitoren ist nicht spezifisch auf Wurzeln, Blütenknospe oder Trieb gerichtet, sondern beeinflusst sehr generell die Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber anderen Faktoren. Basierend auf diesem Prinzip können Elicitoren verwendet werden, um die Aktivität von PGRs zu verstärken.
Es ist festgestellt worden, dass solche Elicitoren die Aktivität von PGRs verstärken und/oder verlängern können. Dies ist auch bei der Induktion von somatischer Embryogenese und der Verwendung von Herbiziden der Fall.
Dementsprechend können Elicitoren verwendet werden, um Empfindlichkeit des Pflanzengewebes gegenüber PGRs aufzubauen. Im Gegenzug lösen die PGRs die gewünschte Reaktion aus. In den meisten Situationen ist es wünschenswert, zur rechten Zeit Gewebeempfindlichkeit zu entwickeln. Das ansprechende Gewebe muss sich zuerst entdifferenzieren, wonach das Gewebe die Kompetenz erwirbt, auf PGRs anzusprechen. Eine frühe Verfügbarkeit der PGRs ist dann nicht erforderlich oder sogar weniger wünschenswert, da die Hauptmenge des bzw. der verabreichten PGR(s) durch das Stoffwechselsystem der Pflanze abgebaut werden kann, bevor der oder die PGR(s) eine Gelegenheit erhalten, seine bzw. ihre Funktion auszuüben. Eine spätere Verabreichung oder die Verwendung einer Form mit langsamer Freisetzung des bzw. der PGR(s) ist dann die Lösung. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht dementsprechend darin, (chemisch modifizierte) PGRs und Elicitoren zu kombinieren.
Beispielsweise besteht die synergistische Wirkung von IHA und anderen chemisch modifizierten PGRs und Elicitoren auf die Wurzelbildung nicht nur darin, dass die Rate der Inaktivierung durch den Stoffwechsel abnimmt, sondern auch darin, dass das aktive Auxin (IAA) zeitlich später freigesetzt wird. Dies ist sehr wichtig, da das Gewebe nicht sofort auf die PGRs ansprechen kann. Es muss zuerst gegenüber den PGRs empfindlich werden, welche Empfindlichkeit durch die Wirkung von Elicitoren verstärkt wird. Die Entwicklung von Empfindlichkeit gegenüber Auxinen in z.B. Äpfeln oder Tabak erfordert ungefähr 1 bis 1,5 Tage. Während dieses Zeitraums werden jedoch kommerziell erhältliche Auxine in großem Umfang durch die Stoffwechselwirkung der Pflanze inaktiviert.
Es wurde festgestellt, dass die Anwendung von Elicitoren am wirksamsten ist, wenn sie vor der Zugabe eines PGRs angewendet werden. Eine Inkubation in vivo von Apfel-Gewebe während eines Tags auf Pythium-Extrakt (welches eine synergistische Wirkung auf die Wurzelbildung verglichen mit Auxin allein aufweist) enthaltendem Medium, gefolgt von einer eintägigen Inkubation auf Medium mit normalem Auxin führte zu einer zweifachen Zunahme verglichen mit einem Experiment, bei welchem sowohl Pythium-Extrakt als auch Auxin gleichzeitig für einen Tag angewendet worden waren. Die Zugabe eines chemisch modifizierten Auxins mit langsamer Freisetzung zusammen mit einem Elicitor hat die gleiche Wirkung wie eine Anwendung des Elicitors vor dem Hormon, da der Elicitor sofort beginnt, Empfindlichkeit zu induzieren, und die Freisetzungsquelle das PGR abdissoziiert, nachdem das Gewebe Empfindlichkeit erworben hat.
In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass ein chemisch modifiziertes Auxin (z.B. IHA) in Kombination mit einem Elicitor (z.B. Nonansäure) tatsächlich die Wurzelbildung von Pflanzengewebe, welches einer Wurzelbildung Widerstand entgegensetzt (schwierig zu bewurzeln ist), verbessert verglichen mit IHA allein, welches seinerseits bereits eine bessere Wurzelbildung als IBA allein induziert. Ein Experiment, welches ausgeführt wurde, um dies zu veranschaulichen, bestand in der Bewurzelung von der Bewurzelung sehr starken Widerstand entgegensetzenden Pfropfreisen von Apfel (Varietät Elstar). Unter Verwendung von Standard-Bewurzelungspulver, welches 2% IBA (Gew./Gew.) in Talkum = 30%) enthielt, betrug die maximale erzielte Bewurzelungshäufigkeit 30%; unter Verwendung eines Bewurzelungspulvers, welches 1% IHA (Gew./Gew.) und 0,5% Nonansäure (Gew./Gew.) in Talkum enthielt, nahm. die maximale Bewurzelungshäufigkeit auf 93% zu! Um die Tatsache zu verstehen, dass IHA ein derart guter PGR ist, wurde überprüft, ob tatsächlich IBA (ein natürlich vorkommendes Auxin) die Verbindung ist, die die Wurzelbildung induziert. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass nicht IBA, sondern IAA die aktive Komponente zu sein scheint und dementsprechend auch IBA ähnlich wie IHA (welches sich zuerst in IBA umwandelt) über eine Umwandlung zu IAA wirksam wird, so dass IBA in der Tat ebenfalls eine natürliche Quelle mit langsamer Freisetzung ist. Tatsächlich führte eine Kombination von IBA mit einem Elicitor ebenfalls zu einer sehr starken Zunahme bei der Bewurzelungsreaktion verglichen mit der Anwendung von IBA oder IAA allein.
Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Elicitoren in Kombination mit PGRs auch verwendet werden können, um die Häufigkeit von Transformation/Regeneration und die Bildung von Pflanzen ausgehend von Zellen oder Protoplasten zu verbessern. Es wurde auch beobachtet, dass Gewebeexplantate von Rosen, wenn sie mit IBA (normale Zugabe) bzw. IHA behandelt wurden, ungefähr 50-mal mehr Triebe (2 Triebe gegenüber 100 pro 20 Gewebeexplantaten) in dem letztgenannten Falle bildeten.
In den Untersuchungen für neue Anwendungen von PGRs und/oder Elicitoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurden, wurden mehrere neue und unerwartete Beobachtungen gemacht. Es wurde beispielsweise festgestellt, dass Elicitoren tatsächlich die Embryogenese von Mikrosporen beeinflussen. Bei der Anwendung von Nonansäure in Kombination mit einem klassischen chemischen PGR, wie Colchicin, im Rahmen der Embryogenese von Brassica napens wurde eine Zunahme der Embryogenese von Mikrosporen von 125 erhalten. Darüber hinaus ermittelten die Erfinder, dass Elicitoren tatsächlich eine statistisch signifikante Wachstumsverzögerung von allen Geweben verursachen, wie für Rosentriebe veranschaulicht werden kann. Dieser Effekt wurde durch einen oder mehrere PGR(s), in diesem Falle Antigibberelline, d.h. Paclobutrasol, verstärkt. Es wurde auch festgestellt, dass Elicitoren die Pfropfung von Pfropfreisen auf Wurzelstöcken verbessern, welcher Effekt möglicherweise durch Auxine verstärkt wird. Schließlich wurde die Beobachtung gemacht, dass, wenn Gewebeexplantate von Rosen mit IBA (normale Zugabe) bzw. IHA behandelt wurden, in dem letzten Falle ungefähr 50-mal mehr Triebe gebildet wurden (2 Triebe gegenüber 100 pro 20 Gewebeexplantate).
Zusätzlich zu der Verwendung von Elicitoren per se können Pflanzen auch mit Genen, die Elicitoren kodieren, transformiert werden. Die Empfindlichkeit der Pflanze gegenüber den PGRs nimmt dadurch zu. Die Gene, die die Elicitoren kodieren, können unter der Regulation von verschiedenen Arten von Promotoren stehen. Solche Promotoren sind vorzugsweise induzierbar durch beispielsweise einen Kälteschock, Wärmeschock, Verwundung oder Chemikalien, wie Tetracyclin. Tabakpflanzen, in denen NOD-Gene von Rhizobia exprimiert wurden (welche Lipo(chito)oligosaccharide kodieren; siehe Tabelle), bildeten viel mehr Triebe als Wildtyp-Pflanzen. Dies zeigt eine erhöhte Zytokinin-Empfindlichkeit des Gewebes an.
Auf der Grundlage des allgemeinen Prinzips wird ein Fachmann in der Lage sein, verschiedene Ausführungsformen, die allesamt in den Umfang der Erfindung fallen, zu erdenken. Das allgemeine Prinzip der Erfindung besteht darin, die Aktivität von PGRs zu optimieren, indem die Menge von aktiven PGRs an gewünschten Stellen in der Pflanze erhöht wird und/oder indem die Pflanze gegenüber der Aktivität von diesen empfindlicher gemacht wird. Die Erhöhung der aktiven Menge kann erzielt werden, indem chemisch modifizierte und/oder verkapselte PGRs verwendet werden. Eine Sensibilisierung wird durch exogene oder endogene Elicitoren erreicht. Elicitoren können dementsprechend auch chemisch modifiziert oder in Liposome oder Micellen inkorporiert werden, allein oder in Kombination mit den PGRs. Sie können auch chemisch mit einem oder mehreren PGRs verknüpft werden, gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Abstandshaltermoleküls.
Die bevorzugte Kombination der Erfindung ist eine Kombination von Elicitoren mit chemisch modifizierten PGRs. Die Kombination führt zu optimaler Aktivität, da der Elicitor Gewebeempfindlichkeit verleiht, wonach der PGR, der nach der Freisetzung von dem Träger- oder Abstandshaltermolekül Aktivität wiedererlangt hat, maximale Aktivität ausüben kann.
Die Erfindung betrifft des weiteren Zusammensetzungen zur Erhöhung und/oder Verlängerung der in vivo- oder in vitro-Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs), umfassend eine wässrige Lösung von Kapselstrukturen, wie Liposomen, Micellen u.s.w., welche wenigstens einen Pflanzenwachstumsregulator enthalten. Elicitoren und/oder Mittel, die zu der Freisetzung von Elicitoren führen, können gegebenenfalls ebenfalls in die Kapselstrukturen mit aufgenommen werden. Solche Mittel sind beispielsweise Enzyme, Zwischenstufen aus der Phytoalexin-Biosynthese u.s.w.
Die Erfindung stellt auch chemisch modifizierte Verbindungen, die aus wenigstens einem PGR, der mit wenigstens einem Trägermolekül verknüpft ist, bestehen, bereit.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden vegetativ vermehrte Pflanzen, Stecklinge oder somatische Embryos bereitgestellt, die hergestellt werden, indem ein(e) oder mehrere der Verfahren und/oder Zusammensetzungen und/oder chemisch modifizierten Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden.
Auch in den Umfang der Erfindung fallen physiologisch manipulierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos, die hergestellt werden, indem ein(e) oder mehrere der Verfahren und/oder Zusammensetzungen und/oder chemisch modifizierten Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden. Physiologisch manipulierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos sind Blüten, Pflanzen oder Embryos, die andere Eigenschaften als die natürlichen zeigen.
Zusätzlich stellt die Erfindung genetisch modifizierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos bereit, die durch Transformation mit Genen, die Elicitoren und/oder Mittel, die die Bildung von Elicitoren induzieren, kodieren, hergestellt werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Elicitoren oder Mitteln, die zu der Produktion von diesen führen, zur Erhöhung der Empfindlichkeit einer Pflanze und/oder von einem oder mehreren Pflanzenteil(en) gegenüber der Aktivität von PGRs und die Verwendung von chemisch modifizierten Verbindungen zur Erhöhung der Konzentration von aktiven PGRs in einer Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en).
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Beispiele, die nur zur Veranschaulichung aufgeführt werden und die Erfindung in keiner denkbaren Weise einschränken sollen, veranschaulicht.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Einführung eines Farbstoffs in Pflanzengewebe über Liposome und Micellen
Die Technik zur Herstellung von Liposomen ist an sich allgemein bekannt. Für eine Übersicht wird auf Chemistry & Physics of Lipids 64, 35–43 (1993) verwiesen.
Der Durchmesser von Liposomen kann beträchtlich variieren. Die sogenannten "Large Unilamellar Vesicles Through Extrusion-Techniques" (LUVETs; durch Extrusionstechniken erhaltene, große, unilamellare Vesikel) haben beispielsweise einen Durchmesser von 40 bis 500 nm. Die "Multilamellar Vesicles" (MLVs; multilamellare Vesikel) haben einen Durchmesser von 1 bis 10 μm und die "Small Unilamellar Vesicles" (SUVs; kleine unilamellare Vesikel) einen Durchmesser von ungefähr 20 bis 40 nm.
In diesen Beispiel wurde von LUVETs Gebrauch gemacht. Als Testverbindung wurde ein fluoreszierender Farbstoff (Fluorescein) verwendet. Die LUVETs, die in Wasser eine Suspension bilden, wurden an abgeschnittene Rosen-, Alstroemeria- und Gartennelkenblüten verabreicht. Nach 6 Stunden war der fluoreszierende Farbstoff in Blatt- und Blütengewebe dieser Pflanzen mit dem bloßen Auge oder mittels UV-Licht detektierbar. Dies beweist, dass Liposome für die Freisetzung von Substanzen in Pflanzengewebe und in analoger Weise, um einen Pool von PGRs in der Pflanze aufzubauen, verwendet werden können.
Darüber hinaus zeigte die Anwendung von radioaktiv markierten Liposomen (an Lilien), dass die Liposome durch das Stengel- oder Stielgewebe transportiert wurden.
BEISPIEL 2
Schutz von PGRs gegenüber einem metabolischen Abbau mittels eines Abstandshaltermoleküls (Spacers).
In diesem Beispiel wurde Bernsteinsäure als Abstandshaltermolekül bei der Synthese einer Verbindung einer Anti-Ethylen-PGR-Verbindung (welche als A-S-A bezeichnet wird) verwendet. Anti-Ethylene sind neben anderen Dingen an der Verzögerung der Alterung der Pflanze beteiligt. Durch Verhinderung des metabolischen Abbaus dieser Anti-Ethylene kann deren Aktivität verlängert oder verstärkt werden.
Die Verbindung A-S-A besteht aus zwei Aminoisobuttersäure (AIB)-Molekülen, die mit den beiden Enden von Bernsteinsäure verknüpft sind.
Die Verbindung wurde erhalten, indem 5 mM Aminoisobuttersäuremethylether (hergestellt gemäß der Literatur (J. Chem. Soc. (Perkin Transactions I) (1979) 5. 2138) und 2,5 mM Bernsteinsäure in 20 ml Dichlormethan gelöst wurden. Die Lösung wurde auf –5°C abgekühlt. 2,5 mM Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu dieser Lösung hinzugesetzt und die Mischung wurde zwei Stunden bei –5°C und danach 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und die klare Dichlormethanlösung wurde mit Wasser, einer 10%-igen Citronensäurelösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Verdampfen des Dichlormethans wurde die Verbindung A-S-A erhalten.
Wenn A-S-A in Wasser (Konzentration 5 × 10^–5 bis 10^–3 M) an abgeschnittene Blüten (Gartennelken) verabreicht wurde, wurde festgestellt, dass es 50-mal aktiver war, die Alterung der Blüten zu verzögern, als nicht-modifizierte AIB.
BEISPIEL 3
Die Verwendung eines Transportmoleküls
Sorbitol ist ein transportierbares Kohlenhydrat in Rosaceae-Pflanzen (mit Ausnahme von Rosen). Es wurden zwei Verbindungen synthetisiert, die verwendet werden können, um die Aktivität von Auxin zu verstärken. Die erste Verbindung S-I-A besteht aus einem Indolbuttersäuremolekül, welches mit einem Sorbitolmolekül verknüpft ist. Die zweite Verbindung (4-S-N-A). besteht aus 4-Naphthalinessigsäure, welche mit einem Sorbitolmolekül verknüpft ist.
S-I-A wurde hergestellt, indem 2,4 mM Indolbuttersäure und 2,9 mM Sorbitol in 25 ml Dichlormethan suspendiert wurden. Nachdem die Lösung auf 0°C abgekühlt worden war, wurden 2,5 mM Dicyclohexylcarbodiimid und 0,25 mM 4-Pyrrolidinopyridin hinzugesetzt. Diese Lösung wurde 24 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und die klare Dichlormethanlösung wurde mit Wasser, 1 N HCl-Lösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Verdampfen des Lösemittels wurde S-I-A erhalten.
4-S-N-A wurde auf im wesentlichen die gleiche Weise wie S-I-A unter Verwendung von 12 mM 1-Naphthalinessigsäure, 3 mM Sorbitol, 13 mM Dicyclohexylcarbodiimid und 1,2 mM 4-Pyrrolidinopyridin und 75 ml Dichlormethan erhalten. S-I-A wurde mit Talkum (0,1% S-I-A) gemischt, als Bewurzelungspulver verwendet und es wurde festgestellt, dass es in der Lage war, die Wurzelbildung bei Äpfeln, Rosen und Tabak zu induzieren.
Eine Alternative zu einem Auxin-Bewurzelungspulver ist ein Auxin-Bewurzelungsspray. 4-S-N-A ist sehr unpolar und induzierte die Wurzelbildung, wenn es durch Besprühen verabreicht wurde, über die Blätter von Apfeltrieben.
BEISPIEL 4
Die Verwendung eines Transportmoleküls und eines Abstandshaltermoleküls (Spacers).
Um Glucose als Trägermolekül für den Transport und Acetat als Abstandshaltermolekül zu testen, wurde eine Glucose-Acetat-Aminooxyessigsäure (G-A-A)-Verbindung synthetisiert.
Zu diesem Zweck wurde D-Glucose gemäß Standardprozeduren in deren Di-O-isopropylidenderivat überführt. 3 mM von dieser Verbindung wurden in 25 ml Chloroform zusammen mit 0,6 ml Pyridin gelöst. Diese Lösung wurde auf 0°C abgekühlt. 10 ml 4 mM Chloracetylchlorid in Chloroform wurden zu dieser Lösung tropfenweise während fortwährendem Rühren hinzugesetzt. Die Chloroformlösung wurde danach mit 1 N HCl und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Ein Verdampfen des Lösemittels lieferte das Chloracetylglucosid.
1 mM des Chloracetylglucosids wurde in 15 ml Dimethylformamid (DMF) mit 1 ml Wasser, 1 mM Aminooxyessigsäure zusammen mit 1 mM Natriumcarbonat gelöst. Die Mischung wurde auf einem Wasserbad bei 60°C 6 h erwärmt.
Das DMF wurde verdampft und der zurückbleibende Feststoff wurde in Methanol gelöst und filtriert. Zu der methanolischen Lösung wurde verdünnte Salzsäure zugesetzt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel verdampft und es wurde G-A-A erhalten. Nach Verabreichung an Gartennelken wurde festgestellt, dass die Verbindung ein wirksames Mittel gegen die Alterung darstellt.
BEISPIEL 5
Erhöhung der Empfindlichkeit der Pflanze gegenüber PGRs durch Verwendung von Elicitoren
Es wurde die Wirkung der Elicitoren auf die Wurzelbildungsregeneration an Apfelstielschnitten untersucht. Die Stielschnitte wurden auf Medium mit Elicitoren in Kombination mit einer suboptimalen Auxinkonzentration (1 μM Indolbuttersäure oder 1 μM Indolessigsäure), die 1 oder 3 Tage dem Pflanzengewebe für eine Untersuchung zugesetzt wurden, inkubiert. Die Zunahme wurde anhand der Anzahl von regenerierten Wurzeln verglichen mit der Auxin-Kontrolle gemessen.
Der Elicitor Uridin wurde bezüglich der Triebregeneration bei "Saintpaulia"-Pflanzen, der seitlichen Wurzelbildung bei der Erbse, der Zellteilung bei Tabak und der Wurzelinduktion bei Rittersporn und Apfel untersucht. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Die Tabelle zeigt, dass eine große Anzahl von Elicitoren eine signifikante Zunahme bei der Gewebeempfindlichkeit gegenüber der Aktivität von Auxinen bewirkt.
Tabelle 1 Wirkung von Elicitoren auf die Regeneration (A) Elicitoren, welche ausgehend von dem Abbau von Zellstrukturen gebildet werden
(B) Elicitoren, die nicht ausgehend von dem Abbau von Zellstrukturen gebildet werden
BEISPIEL 6
Verknüpfung eines Elicitors mit einem PGR
Indolbuttersäure (I-B-A) wurde mit Jasmonsäure (I-S-A) im wesentlichen mittels des in Beispiel 2 angegebenen Verfahrens verknüpft. I-B-A-J-A erwies sich als ein wirksames Mittel bei der Wurzelinduktion bei der Rose (siehe Tabelle).
BEISPIEL 7
Beispiele von synthetisierten chemisch modifizierten AOA's, die die Bildung von Ethylenaktivität hemmen.
Alle Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit, die Blütenseneszenz bei Gartennelken und Lilien zu verzögern, getestet.
1. Synthese von tert.-Butyloxycarbonylaminooxyessigsäure (t-Boc-AOA)
Tert.-Butyloxycarbonyl (t-Boc) und Benzyloxycarbonyl sind Schutzgruppen für die Aminogruppe von AOA (Aminooxyessigsäure). Dies blockiert die Protonierung der Aminogruppe von AOA, was ei ne Voraussetzung für einen guten Transport der Anti-Ethylen-Verbindung ist.
Die Verbindung wurde, wie folgt, hergestellt. 18 mmol AOA (Aminooxyessigsäure) wird in 30 ml 1 N NaOH gelöst. 20 ml tert.-Butanol werden zugesetzt und die Mischung wird gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wird. 18,5 mmol Di-tert.-Butyldicarbonat werden zugesetzt und die Mischung wird weitere 12 h gerührt. Die Mischung wird mit Pentan (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Pentanphasen werden mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (3 × 20 ml) extrahiert. Alle wässrigen Extrakte werden vereinigt, mit 1,1 M KHSO₄ auf Eis bis pH 1 angesäuert und mit Ether (5 × 40 ml) extrahiert. Die Etherphase wird mit H₂O (2 × 30 ml) gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Verdampfen des Ethers lieferte t-Boc-AOA (tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxyessigsäure).
2. Synthese von N,N'-(Di-tert.-butyloxycarbonylaminooxyessigsäure)ethylendiamin (t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂
2,2 mmol t-Boc-AOA und 2,2 mmol N-Methylmorpholin werden in 30 ml THF (Tetrahydrofuran) gelöst. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und 2,2 mmol Isobutylchlorformiat werden zu der gerührten Lösung hinzugesetzt. Nach 0,5 h wird 1 mmol Ethylendiamin zugesetzt. Nach 12 h wird das Lösemittel verdampft und das Produkt mit Ethylacetat extrahiert. Verdampfen des Ethylacetats lieferte (t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂.
3. Synthese von N,N'-(Diaminooxyessigsäure)ethylendiamin (AOA-NH-CH₂-)₂
10 mmol (t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂ werden in 15 ml Bromwasserstoffsäure (33 Gew.-%-ige Lösung in Eisessig) gelöst. Nach 12 h wird die Mischung in 40 ml Ether (kalt) gegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit weiteren 40 ml Ether gespült. Nach dem Trocknen wird reines (AOA-NH-CH₂-)₂ erhalten.
4. Synthese von Benzyloxycarbonyl-AOA
Zuerst wurde ein AOA-Ethylester synthetisiert, indem 4 g Thionylchlorid zu 75 ml Ethanol hinzugesetzt wurden. Nach 0,5 h werden 25 mmol AOA zugesetzt (bei 0°C). Die Mischung wird bei Raumtemperatur weitere 12 h gerührt. Nach Verdampfen des Lösemittels wird das Rohprodukt zweimal mit einem kleinen Volumen Ether abgestreift.
Dann werden 20 mmol AOA-Ethylester in 40 ml 10%-iger Na₂CO₃-Lösung bei 0°C gelöst. 20 mmol Benzylchlorformiat in 10 ml CH₂Cl₂ werden langsam (ein Tropfen/4 s) zu der kräftig gerührten Lösung getropft. Nach 12 h wird die Mischung mit CH₂Cl₂ extrahiert und nach Verdampfen des Extraktionslösemittels wird Benzyloxycarbonyl-AOA-ethylester erhalten. Ein Verseifen des Ethylesters mit NaOH lieferte Benzyloxycarbonyl-AOA.
5. Synthese von Propionyl-AOA
30 mmol Propionsäure und 33 mmol Hydroxysuccinimid werden in 50 ml THF gelöst. Nach 0,5 h werden 33 mmol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid bei 0°C zu der gerührten Lösung hinzugesetzt. Nach 1 h werden 35 mmol AOA-ethylester und 35 mmol Triethylamin zu der gerührten Lösung hinzugesetzt (bei 0°C) und die Mischung wird über Nacht weiter gerührt. Nach Verdampfen des THF wird das Rohprodukt mit Ethylacetat extrahiert. Ein Verseifen des Propionyl-AOA-ethylesters lieferte Propionyl-AOA.
Alle Verbindungen zeigten eine signifikante Verbesserung bei der Verzögerung der Blütenseneszenz verglichen mit nichtmodifizierter AOA. Im allgemeinen konnte eine geringere Konzentration der modifizierten Verbindungen verwendet werden, um eine vergleichbare Verzögerung zu erhalten.
Die Verbindungen, wie in den Beispielen 2, 4 und 6 beschrieben, haben ähnliche Eigenschaften wie die oben beschriebenen AOA's.
BEISPIEL 8
Chemisch modifizierte Auxine, welche hinsichtlich der Bewurzelung von verschiedenen Pflanzen getestet werden
Die Anheftung von IAA an BSA (Rinderserumalbumin) erfolgt, um die an die Wurzeln verabreichte Menge von IAA zu erhöhen. An BSA können auf zwei verschiedene Weisen bis zu 32 IAA-Moleküle angeheftet werden. Entweder als N-Konjugat von IAA oder als C-Konjugat. Nach der Zugabe des IAA-BSA zu Pflanzenwurzeln wird die IAA in der Wurzel abgespalten und führt zu der Verfügbarkeit von IAA während eines längeren Zeitraums, was es dem Wurzelgewebe erlaubt, empfindlich zu werden.
1. Synthese von Indolessigsäure-N-Konjugat mit BSA (IAA-N-BSA)
500 mg (3 mmol) Indolessigsäure wurden in 10 ml (Endvolumen) 0,05 M Natriumborat gelöst, wobei der pH mit 1 N KOH konstant gehalten wurde. Nachfolgend wurde die Mischung mit 1 N HCl neutralisiert. Als nächstes wurden 500 mg (7,5 μmol) Rinderserumalbumin in 3 ml Wasser gelöst und danach wurden 3 ml 3 M Natriumacetat, 4 ml 7,5% Formaldehyd (Gew./Vol.) und die oben beschriebene IAA-Lösung zugesetzt.
Diese Mischung wurde bei 22°C (unter N₂) im Dunkeln unter fortwährendem Rühren für 13 h inkubiert. Die Mischung wurde dann zweimal 24 h gegen 10 l 0,1 N Natriumhydrogencarbonat dialysiert, gefolgt von fünf Dialysen von 24 h gegen 10 l Wasser. Gereinigtes IAA-N-BSA wurde durch Lyophilisieren dieser Lösung erhalten und wurde bei –80°C aufbewahrt.
Eine ähnliche Vorgehensweise wurde mit IBA anstelle von IAA verfolgt, was zu IBA-N-BSA führte.
2. Synthese von Indolessigsäure-C-Konjugat mit BSA (IAA-C-BSA)
52 mg (0,3 mmol) IAA und 75 μl (0,3 mmol) Tri-n-butylamin werden in 2 ml DMF in einem doppelt verriegeltem Rundbodenbehälter, welcher bei –15°C gehalten wird, unter N₂ bei gedämpftem Licht unter magnetischem Rühren gelöst. Man lässt dies auf –15°C abkühlen. Dann werden 40 μl Isobutylchlorcarbonat zugesetzt und 8 Minuten reagieren gelassen (Lösung A).
Der zweite Teil der Synthese wird bei 4°C ausgeführt. Lösung A wird zu einer eisgekühlten Mischung von i) 121 mg (6,2 μmol) BSA (Globulin-frei) in 22 ml Wasser/DMF (1:1 bezogen auf das Volumen) und ii) 0,42 ml 1 N NaOH unter fortwährendem Rühren hinzugesetzt. Nach Inkubation für 1 h bei gedämpftem Licht wurden 92 ml 1 N NaOH zugesetzt. Diese Reaktionsmischung wurde 5 h gerührt und danach 1 Tag lang gegen 2 l 10% DMF in Wasser und danach 4 Tage gegen Wasser (im Dunkeln) dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurde das gereinigte IAA-C-BSA bei –80°C aufbewahrt.
IAA-C-BSA ist bei der Wurzelinduktion etwas weniger wirksam als IAA-N-BSA, aber nach wie vor besser als IAA allein.
3. Synthese von 1-N-Indol-3-hexansäure (IHA)
Diese Verbindung ist eine erweiterte Form von Indolbuttersäure (IBA). Beide Verbindungen werden zu IAA umgewandelt und es wird angenommen, dass sie durch IAA als aktives Hormon wirken. IBA ist das aus der Natur bekannte Hormon, das auch kommerziell erhältlich ist. IHA wird auf die gleiche Weise wie IBA synthetisiert.
7,5 g Indol und 6,4 g pulverförmiges 85%-iges KOH werden zu 100 ml Tetrahydronaphthalin (Tetralin) in einem 250 ml-Rundkolben, welcher mit einer Dean-Stark-Falle und einem Kühler ausgestattet ist, hinzugesetzt. Die Mischung wird auf 100°C erwärmt und es werden 8,4 g ε-Caprolactam zugesetzt. Nachfolgend wird die Mischung auf einem Siliconölbad auf 230°C erwärmt und 8–16 h unter kräftigem Rühren umgesetzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung mit 300 ml Wasser extrahiert. Die wässrige Phase wird abgetrennt und in einem Erlenmeyer-Kolben gesammelt und auf 0°C abgekühlt und bei jener Temperatur während der Zugabe von konzentrierter HCl, bis ein pH von 2–3 erreicht ist, gehalten. Der Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und in Methanol umkristallisiert. Die Ausbeute variiert von 25% bis 75% abhängig von den Reaktionsbedingungen. Das beschriebene Verfahren basiert auf einer angepassten Form einer Synthese, welche in J. Organic Chem., Band 28, 1384 (1963) veröffentlicht worden ist.
Ein Vergleich zwischen einigen der wirksameren Bewurzelungspulver ist in Tabelle 2 aufgeführt.
In dieser Tabelle wird der Standard Indolbuttersäure (IBA), welche der Wirkstoff in den meisten gegenwärtig verwendeten Bewurzelungspulvern ist, mit Indolhexansäure (IHA) und zwei BSA-Addukten, beide N-gekoppelt, nämlich IBA und Indolessigsäure (BSA-N-IAA) verglichen. Die Wirkung auf die Wurzelbildung und die Pflanzenentwicklung (Stielwachstum, Auswachsen von neuen Trieben, Synchronität des Wachstums einer Population von Pflanzen) waren unter anderem Faktoren, welche den Platz in den Kategorien, die von 1 bis 6 reichten, bestimmten. Die Verbindungen mit der besten relativen Gesamtwirkung auf Wurzelbildung und Entwicklung wurden in Kategorie I eingestuft. Die Wurzelbildung und die nachfolgende Entwicklung von Reisen von unterschiedlichen Arten von krautigen und holzigen Pflanzen unterscheiden sich für jene Art von Pflanzen deutlich. Ein Rosenkultivar, "Enermus stur cinq", wurde als ein Beispiel für eine der Bewurzelung Widerstand entgegensetzende holzige Pflanze verwendet. Die Chrysanthemen-Spezies "Regan" ist ein Beispiel für eine leicht zu bewurzelnde krautige Pflanze.
Tabelle 2
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass IHA sehr allgemein anwendbar und sehr wirksam ist. Die IAA-Variante von BSA ist etwas wirksamer als die IBA-Variante. BSA-N-IAA scheint für der Bewurzelung Widerstand entgegensetzende Pflanzen besonders geeignet zu sein. Bei Apfel kann IAA ein Maximum von 3,5 Wurzeln pro Gewebefragment induzieren, während IAA-N-BSA ein Maximum von 8 Wurzeln pro Gewebefragment induziert. Der Bewurzelung sehr großen Widerstand entgegensetzende Bäume, wie Sommereiche und Korkeiche, können zu einem viel höheren Prozentsatz als mit einem jeglichen der herkömmlicherweise angewandten Bewurzelungspulver bewurzelt werden. Die in Beispiel 3 beschriebenen und zusammen mit Elicitoren in Tabelle 1 verwendeten Verbindungen zeigen ähnliche Wirkungen. Die Konzentration, die benötigt wird, um maximale Wurzelbildung zu erhalten, ist bei allen synthetisierten Verbindungen signifikant geringer als bei entweder IAA oder IBA.
BEISPIEL 9
Modifizierte IBA für verbesserte Wurzelbildung
Die Auxinverbindungen wurden hinsichtlich der Wurzelbildung bei Apfel und Rose getestet.
1. Synthese von IBA-AIB
Indolbuttersäure (IBA) wurde mit Aminoisobuttersäure (AIB) gekoppelt. AIB ist eine Anti-Ethylen-Verbindung, die der Ethylen-induzierten Hemmung der Auxinwirkung (Ethylen hemmt die Wurzelbildung) entgegenwirkt. Aufgrund der chemischen Modifizierung wird die Aktivität von sowohl IBA als auch AIB erhöht. Die Kombination von IBA und AIB erwies sich als wirkungsvoller als die Standard-Hormonbehandlung.
5 mmol Isobutylchlorformiat werden zu einer gekühlten Lösung (–10°C) von 5 mmol Indolbuttersäure (IBA) und 5 mmol N-Methylmorpholin in 30 ml THF zugesetzt. Nach Rühren für eine halbe Stunde wird eine Lösung von 5 mmol Aminoisobuttersäureethylester (AIBOEt) und 5 mmol Triethylamin in 20 ml THF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird weitere zwei Stunden bei –10°C und 40 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Filtration und Eindampfen der Reaktionsmischung wird der Rückstand in 50 ml Ethylacetat (EtO-Ac) gelöst und zweimal mit 1 N HCl-Lösung (2 × 40 ml), zweimal mit 5%-iger (Gew./Gew.) NaHCO₃-Lösung (2 × 40 ml) und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wodurch IBA-AIBOEt erhalten wird.
Ein Verseifen von IBA-AIBOEt in MeOH mit 1 N NaOH lieferte nach Ansäuern mit 1 N HCl bei 0°C und Umkristallisation zu wenigstens 99% reines säurefreies IBA-AIB.
2. Synthese von IBA-Gly-AIB
IBA-Gly-AIB wurde durch die gleiche Vorgehensweise, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Gly-AIBOEt anstelle von AIBOEt synthetisiert.
Tests werden durch die Stielscheiben ("stem-disk")-Methode, wie veröffentlicht von Van der Krieken et al., Plant Cell Reports (1993), Band 12, 203–206, ausgeführt, bei welcher die Anzahl von Wurzeln von einer großen Anzahl von Stielscheiben, welche von einer bestimmten Pflanze geschnitten worden sind, gezählt wird, und welche mit Bewurzelungspulver, welches in diesem Falle die beschriebenen Verbindungen enthält, behandelt worden sind. Die Ergebnisse mit dieser Verbindung bezüglich der Wurzelbildung von Gewebe waren ebenfalls viel besser als mit IBA allein.
BEISPIEL 10
Modifizierte NAA zur Fruchtausdünnung
Naphthalinessigsäure (NAA) ist eine wohlbekannte Verbindung, die zum Ausdünnen von Früchten angewendet wird. Der Nachteil von NAA ist die Tatsache, dass die Verbindung nur in einem sehr engen Konzentrationsbereich wirksam ist. Versprühen und Feuchtigkeit können für die Wirksamkeit der Behandlung von entscheidender Bedeutung sein.
Es wurden zwei Verbindungen synthetisiert, um die von uns gemachte allgemeine Beobachtung, nämlich dass chemisch modifizierte PGRs über einen viel breiteren Konzentrationsbereich als die nicht-modifizierten PGRs wirksam sind, speziell wenn sie mit einem Elicitor kombiniert werden, zu testen. Dies bedeutet, dass modifizierte NAA über einen viel breiteren Konzentrationsbereich als NAA selbst wirksam sein sollte.
Die beiden an insgesamt 40 Bäumen getesteten Verbindungen waren Naphthylessigsäureanhydrid (NAA) und Naphthylessigsäure-Acetamid-Naphthyl (2 NA's, welche durch eine Peptidbindung gekoppelt sind).
Zwei verschiedene Kultivare von Apfel und ein Kultivar von Birne wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Verbindungen besprüht. Anfängliche Beobachtungen zeigen, dass beide Verbindungen hinsichtlich der Ausdünnung wirksam sind und über einen breiteren Konzentrationsbereich funktionieren.

Claims

Verfahren zur Erhöhung und/oder Verlängerung der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren ("plant growth regulators" (PGRs)) in vivo oder in vitro, welches umfasst: a) örtlich die Konzentration von aktiven Pflanzenwachstumsregulatoren in einer Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en) zu erhöhen, indem 1) ein oder mehrere PGR(s), der bzw. die chemisch modifiziert worden ist bzw. sind, indem er (sie), gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Abstandshalter- oder Spacermoleküls, mit einem oder mehreren Trägermolekülen verknüpft worden ist bzw. sind, verabreicht wird bzw. werden; und 2) gegebenenfalls der bzw. die chemisch modifizierte(n) PGR(s) in verkapselter Form verabreicht wird bzw. werden; b) die Empfindlichkeit der Pflanze und/oder von dem oder den Pflanzenteil(en) gegenüber der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren durch Verabreichung oder Aufbringen von einer oder mehreren Verbindungen, die zu einer Abwehrreaktion in der Pflanze führen, zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das eine oder die mehreren Trägermolekül(e) mit dem bzw. den PGR(s) in einer enzymatisch abbaubaren Weise verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermoleküle transportierbare Verbindungen sind, die beispielsweise aus der Gruppe, welche aus Kohlenhydraten, wie Saccharose, Glucose, Sorbitol, Sterolen, Terpenen, phosphorylierten Kohlenwasserstoffen, welche gegebenenfalls mit dem PGR unter Zwischenschaltung eines Abstandshalter- oder Spacermoleküls verknüpft werden, besteht, ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermoleküle Verbindungen sind, die mit einer Gruppe an dem PGR, die an dem metabolischen Abbau des PGR beteiligt ist, verknüpft sind, um diesen Abbau zu verhindern.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Modifizierung des bzw. der PGR(s) daraus besteht, die Polarität des bzw. der PGR(s) zu neutralisieren, indem an den PGR wenigstens ein. Trägermolekül, Abstandshalter- oder Spacermolekül oder ein zweiter PGR gebunden wird, um zu bewirken, dass die Polarität verschwindet, indem die geladene Gruppe für die Verknüpfung, welche beispielsweise über Ester- oder Peptidbindungen erfolgt, verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Modifizierung des bzw. der PGR(s) daraus besteht, die Polarität des PGR zu erhöhen, indem an den PGR ein sehr stark geladenes Molekül, wie ein Zuckermolekül, über beispielsweise eine Esterbindung gebunden wird oder indem ein Sulfonat aus dem PGR hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen, welche gegen einen Abbau schützen, auch als Abstandshalter- oder Spacermoleküle dienen und aus der Gruppe, welche aus Bernsteinsäure, Malonsäure, Diaminoalkanen, wie 1,2-Diaminoethan, 1,4-Diaminobutan, 1,6-Diaminohexan, besteht, ausgewählt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen, welche zu einer Abwehrreaktion führen, sogenannte Elicitor-Verbindungen sind, die aus pflanzenspezifischen Verbindungen, wie Oligosacchariden, Ligninfragmenten, Gerbsäure, Jasmonsäure, Nonansäure, Uridin, und pflanzenfremden Verbindungen, wie Lipo-chito-oligosacchariden, Fusicoccin, Pythium-Extrakt, 4-Acetamidophenol, ausgewählt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen, die zu einer Abwehrreaktion führen, Verbindungen sind, die die Freisetzung von sogenannten Elicitor-Verbindungen induzieren und die aus Enzymen, wie Pectinase, Glu canase, Cellulase, und anderen Mitteln, wie, UV-B, Ozon, ausgewählt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen, die zu einer Abwehrreaktion führen, Zwischenstufen aus der Phytoalexin-Biosynthese sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen, die zu einer Abwehrreaktion führen, durch ein Gen bzw. Gene, welche(s) in die Pflanze eingeführt wird bzw. werden, welche(s) Elicitor-Verbindungen oder Enzyme, die zu einer Zunahme der Konzentration von Elicitor-Verbindungen führen, kodiert bzw. kodieren, gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gen ein NOD-Gen von Rhizobium ist.
Zusammensetzung zur Erhöhung und/oder Verlängerung der in vivo- oder in vitro-Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs), umfassend eine wässrige Lösung von wenigstens einem chemisch modifizierten Pflanzenwachstumsregulator und wenigstens eine Elicitor-Verbindung und/oder Verbindungen, welche zu der Freisetzung von Elicitor-Verbindungen führen, wie Enzyme, wobei der PGR chemisch modifiziert ist, indem er mit einem oder mehreren Trägermolekülen, gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Abstandshalter- oder Spacermoleküls, verknüpft ist, oder der PGR in verkapselter Form vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, welche Zusammensetzung in Kapseln, wie Liposomen und Micellen, enthalten ist.
Kit zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Pflanze und/oder von einem oder mehreren Pflanzenteil(en) gegenüber Pflanzenwachstumsregulatoren, welcher ein oder mehrere Genkonstrukte, welche(s) Elicitor-Verbindungen und/oder Enzyme, die zu einer Zunahme der Konzentration von Elicitor-Verbindungen führen, kodiert bzw. kodieren, und gegebenenfalls Mittel, welche für eine Transformation von Pflanzenmaterial erforderlich sind, umfasst.
Kit nach Anspruch 15, wobei das Genkonstrukt ein oder mehrere NOD-Gene von Rhizobium umfasst.
Chemisch modifizierter Pflanzenwachstumsregulator (PGR), bestehend aus wenigstens einem PGR, welcher mit wenigstens einem Trägermolekül verknüpft ist, mit der Maßgabe, dass, wenn das Trägermolekül ein Zuckermolekül ist, ein Abstandshalter oder Spacer zwischen den PGR und das Trägermolekül zwischengeschaltet ist.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, welches Molekül als A-S-A bezeichnet wird und aus zwei Aminoisobuttersäure-Molekülen, die an beide Enden des Abstandshalters oder Spacers Bernsteinsäure gebunden sind, besteht.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, welches Molekül als G-A-A bezeichnet wird und Glucose-Acetat-Aminooxyessigsäure ist.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, wobei das Trägermolekül eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe ist.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 20, der tert.-Butyloxycarbonylaminooxyessigsäure (t-Boc-AOA) ist.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, wobei das Trägermolekül eine Elicitor-Verbindung ist, welche aus der Gruppe bestehend aus Ligninfragmenten, Gerbsäure, Jasmonsäure, Nonansäure, Uridin, Lipo-chito-oligosacchariden, Fusicoccin, Pythium-Extrakt, 4-Acetamidophenol ausgewählt wird.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 22, welcher als I-B-A-J-A bezeichnet wird und wobei der PGR Indolbuttersäure an die Elicitor-Verbindung Jasmonsäure gebunden ist.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, welcher als IBA-AIB bezeichnet wird und welcher aus Indolbuttersäure, welche an Aminoisobuttersäure gekoppelt ist, besteht.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 24, welcher des weiteren ein Gly zwischen IBA und AIB umfasst, wodurch IBA-Gly-AIB erhalten wird.
Chemisch modifizierter PGR nach Anspruch 17, welcher als Naphthyl-Essigsäure-Acetamid-Naphthyl bezeichnet wird und aus zwei Naphthalinessigsäuremolekülen, welche durch eine Peptidbindung gekoppelt sind, besteht.
Chemisch modifizierter PGR, welcher als S-I-A bezeichnet wird und aus einem Indolbuttersäure-Molekül, welches an ein Sorbitol gebunden ist, besteht.
Chemisch modifizierter PGR, welcher als 4-S-N-A bezeichnet wird und aus einem 4-Naphthalinessigsäure-Molekül, welches an ein Sorbitol gebunden ist, besteht.
Chemisch modifizierter PGR, der 1-N-Indol-3-hexansäure ist.
Chemisch modifizierter PGR, der Naphthylessigsäureanhydrid (NAA) ist.
Vegetativ vermehrte Pflanzen, Stecklinge oder somatische Embryos, welche hergestellt werden, indem eines oder mehrere der Verfahren nach den Ansprüchen 1–12 und/oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 und/oder ein Kit nach Anspruch 15 oder 16 und/oder ein chemisch modifizierter PGR nach den Ansprüchen 17–30 verwendet wird bzw. werden, wobei die Pflanzen andere Eigenschaften als gleichartige Pflanzen, die nicht auf diese Weise behandelt worden sind, aufweisen.
Physiologisch manipulierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos, welche hergestellt werden, indem eines oder mehrere der Verfahren nach den Ansprüchen 1–12 und/oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 und/oder ein Kit nach Anspruch 15 oder 16 und/oder chemisch modifizierte PGRs nach den Ansprüchen 17–30 verwendet wird bzw. werden, wobei die Blüten, Pflanzen oder Embryos andere Eigenschaften als gleichartige Blüten, Pflanzen oder Embryos, die nicht auf diese Weise behandelt worden sind, aufweisen.
Genetisch modifizierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos, die durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 11 oder 12 oder des Kits nach Anspruch 15 oder 16 hergestellt werden.
Genetisch modifizierte Blüten, Pflanzen oder somatische Embryos nach Anspruch 34, wobei die Blüten, Pflanzen oder Embryos andere Eigenschaften als gleichartige Blüten, Pflanzen oder Embryos, die nicht auf diese Weise behandelt worden sind, aufweisen.
Verwendung von Elicitor-Verbindungen oder Mitteln, die zu der Produktion davon führen, wie in einem der Ansprüche 8–12 definiert, zur Erhöhung der Empfindlichkeit einer Pflanze und/oder von einem oder mehreren Pflanzenteil(en) gegenüber der Aktivität von PGRs.
Verwendung von chemisch modifizierten Verbindungen nach Anspruch 17–30 zur Erhöhung der Konzentration von aktiven PGRs in einer Pflanze und/oder einem oder mehreren Pflanzenteil(en).
Verfahren zur Erhöhung und/oder Verlängerung der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) in vivo oder in vitro, welches umfasst, zuerst eine oder mehrere Elicitor-Verbindungen an eine Pflanze oder Pflanzengewebe zu verabreichen, genug Zeit verstreichen zu lassen, um es den Elicitor-Verbindungen zu ermöglichen, die Pflanze oder das Pflanzengewebe gegenüber der Wirkung von einem oder mehreren PGRs zu sensibilisieren, und dann einen oder mehrere chemisch modifizierte(n) PGR(s) nach den Ansprüchen 17–30 zu verabreichen.
Verfahren zur Erhöhung und/oder Verlängerung der Aktivität von Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) in vivo oder in vitro, welches die gleichzeitige Verabreichung von einer oder mehreren Elicitor-Verbindungen und einem oder mehreren PGRs mit langsamer Freisetzung nach den Ansprüchen 17–30 an eine Pflanze oder ein Pflanzengewebe umfasst.