JPH11514846A

JPH11514846A - 植物生長調節因子の活性を促進する方法

Info

Publication number: JPH11514846A
Application number: JP9503596A
Authority: JP
Inventors: ファン・デル・クリーケン，ウィルヘルムス・マリア; スミット，ヘレット
Original assignee: インスティテュート・フォール・アグロビオロジース・エン・ボデムブルフトバールヘイトソンデルズーク・（アーベー−デーエルオー）; シード・キャピタル・インヴェストメンツ−２・（エスシーアイ−２）・ベスローテン・フエンノートシャップ
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 1999-12-21
Also published as: NL1001620C2; DE69633926T2; ES2229279T3; EP0847241A1; DE69633926D1; WO1997000614A1; US6242381B1; ATE282958T1; AU6417096A; EP0847241B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるための方法に関し、該方法は、植物部中で活性な植物生長調節因子の濃度を局部的に高めること、および／または植物成長調節因子の活性に対する植物部の感度を高めることから成る。局部的な増加は、例えば、カプセル状のPGRを添加することによって生じさせることができる。感度の向上は、エリシターまたはエリシターの形成をもたらす手段を与えることによって生じ得る。エリシターと（変性した、例えば遅い放出の）PGRを添加することにより、誘導される反応のタイミングを調節することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】植物生長調節因子の活性を促進する方法本発明は、植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中または試験官中での添加後に向上させるおよび／または継続させるための方法に関する。植物生長調節因子は、植物内での多数の生長、発育および代謝プロセスに役立つ天然または合成の化合物である。最も知られた植物生長調節因子は、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、アブシシン酸、およびジャスモン酸である。そのようなPGRを添加することにより、細胞培養内、挿し穂および胚芽における根付き、果実や野菜の成熟、花の老朽（エージング）、および葉等の黄色化、種子の発芽、花、果実、蕾み等の誘導のような異なる生理学的プロセスに干渉することができる。これらの自然のプロセスに影響を与えることに加えて、自然には生じない効果（例えば、種子のない果実、より大きな果実の開発、果実の落下を予防することによる収穫の調節、果実の樹木における果実の間引き、樹木および枝または新芽および若い植物の調節された生長遅延、調節された枝の形成、例えばモルトを生産するための大麦における新芽形成の誘導、除草剤に対する感度の向上、リンゴ、バナナのような果実のキメが粗くなるのを抑制すること、胚芽の生成等）も達成することができる。異なるPGRが、植物内で上記プロセスや他のプロセスを促進するのに役立つことがある。そのような促進は、PGRの濃度を高めるかまたは多数のPGRを添加することによって生じると考えられるが、実際にはそうではないことが分かっている。大抵のPGRは、植物中に添加された後、その最終目的を達成せずに分解される。更に、特に高濃度のPGRは、どのような細胞にも効果を発揮するが、非常に局在化した活性を求めようとすると、不利であることがある。また、特定のPGRに関しては、それを投与するときに問題が生じる。PGRは一般に、水に添加して、放水、スプリンクラー等によって植物に与えられる。ある種のPGRの水への不溶性は、植物への吸収を低下させることになる。本発明の目的は、正しい時期および場所で生理学的プロセスや他のプロセスを具体的に促進し得るために、PGRの活性を生物体中または試験官中で向上させるおよび／または継続させるおよび／または時期を調節することである。このことは、植物中での活性な植物生長調節因子の濃度を局部的に増加させること、および／または植物生長調節因子の活性に対する植物の感度を高めることにより本発明によって達成される。これらの組み合わせを使用して、以下に説明するような植物生長調節因子の有効性および／またはその作用の時期を調節することができる。植物中での活性な植物生長調節因子の濃度の向上は、例えば、PGRをカプセル化形状で植物に与えることによって達成される。そのようなカプセルは、リポソームまたはミセル状構造であり得る。リポソームは自体既知であるが、植物に物質を与えるためのその使用は新しい。本発明では、リポソームまたはミセル内にPGRを与えることによって、（潜在的に活性な）PGRの蓄積が植物細胞内に形成されることが分かった。親油性の違いにより、およびミセルやリポソームの寸法を変えることによって、植物内での輸送が調節できる。更に、メンブラン中にいわゆる「目標（targeting）」分子を含むことによって、リポソームやミセルを、任意に特定の細胞または器官に送ることもできる。活性の局在化が、これによって高まる。リン脂質の複層からなるリポソームの安定性は、これが脂質メンブランの組成に非常に依存することにより、調節され得る。すなわち、物質は、植物中で分解するメンブラン中に包含され得る。このようにして、リポソームは、その内容物を漏らし、放出し始める。安定性は、エステラーゼ、リパーゼおよびホスホリパーゼのような植物中に含まれる酵素によっても促進され得る。逆に、安定性は、ステロールの添加により、または飽和リン脂質の使用によって高めることができる。表面活性剤（洗浄剤）の添加が、前記内容物の放出の引き金となることもある。そのような場合、リポソームまたはミセルを最初に植物に与え、後で洗浄剤を与えることにより、リポソームまたはミセルが溶解してその内容物を放出する。ミセルは、極性で水溶性の側面と非極性で油溶性の側面を有する分子から成り、非極性のPGRを、水のような極性媒体中に溶解するのに非常に適している。非極性PGRをミセル形成性分子と混合すると、非極性末端がPGRを封入し、その後、極性が周囲の媒体中にその全体を溶解する。最初にPGRを油に溶解して、次に少量の油滴をミセルに導入することも同様に可能である。PGRとミセルおよび油との混合物は、水と混合することができる。こうしてえられた溶液は、スプリンクラーにより、または根もしくは切断された茎の表面に与えることによって、植物に運ばれる。もう一つの態様において、PGRは、常套の方法でキャリアー分子１個以上と結合することにより、化学変性することができる。そのようなキャリアー分子は、異なる機能を有していることがある。従って、キャリアー分子は輸送機能を有する。植物内には、特別な輸送系が存在することが知られている。炭水化物分子は、例えば、若い発育中の細胞、花または根へ輸送される。PGRをそのようなキャリアー分子と結合することによって、所望の細胞への輸送を行うことができる。輸送可能な化合物は、例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、ステロール、テルペン、リン酸化炭化水素等のような炭水化物から成る群より選ばれる。キャリアー分子の別の種類は、極性化促進性を有する。これは、PGRの吸収には重要である。PGRが葉に吸収されなければならない場合、それは、先ず葉のワックス層を通過しなければならない。これは、PGRが非極性の油溶性物質と結合するときに促進される。逆に、切断された茎からの吸収は、PGRが極性で水溶性であり、好ましくは負に帯電していると、より促進される。負の帯電は、正に帯電している化合物が茎の導管細胞と結合し易いために有利である。 PGRは、ほぼ全て酸性の化合物であり、従って極性である。PGRをキャリアー、スペーサーまたは異なる（場合により、同種の）PGR分子と結合することによって、極性が消失し、それにより、帯電した基が結合するのに使用される。そのような結合は、エステルまたはペプチド結合を介して生じ得る。アルカリ性PGRの場合、酸性キャリアーまたはスペーサーを使用できる。しかしながら、PGRを極性にしたいならば、これは、例えば、エステル結合を介して糖と結合することによって、またはPGRのスルホネートを生成することによって生じ得る。そのような化合物は、PGR自身よりも大きな電荷を有しており、そのため、より大きな極性となる。 PGRの活性は、しばしば、分解プロセスにより、植物の末端にもたらされる。（分解）代謝される基を有するキャリアー分子が、PGRと結合することにより、P GR化合物が生成して分解に対して保護され、それによって植物中のPGRの寿命が伸びることがある。しかしながら、ここでは、保護基がPGRを不活性化しないことや、保護基の結合が可逆的であることが重要であるので、保護基との結合により不活性化されるPGRは、結合後、保護基からその活性を取り戻す。そのような保護基を、代謝反応が生じるPGRの部位と好ましく結合する。キャリアー分子は、例えば、共有エステル、エーテルまたはアミド結合により、直接または１つ以上のスペーサーを介してPGRと結合することができる。スペーサーや周囲条件の選択は、キャリアー分子から遊離するPGRの放出速度を決定する。 PGRを分解から保護するもう一つの方法は、キャリアー分子とPGRの間に配されるスペーサー分子の使用である。そのようなスペーサーは、PGRの放出速度が促進され得ることを確実にする。エステラーゼ、ペプチターゼ等のような酵素は、種々のスペーサー分子とは異なる類似点を有している。具体的な態様において、分解に対して保護する化合物は、スペーサー分子としても供給され、例えば、コハク酸、マロン酸、および1,2-ジアミノエタン、1,4- ジアミノブタン、1,6-ジアミノヘキサン等のようなジアミノアルカン類から成る群より選択される。代謝プロセスによって活性なホルモンに転化されるホルモン前駆体を供給することも可能である。インドール-3-ヘキサン酸（I-H-A）は、２つのβ-酸化工程（すなわち、植物中に存在する酵素）によりオーキシンインドール-3-酢酸（I-A-A）に転化される。従って、I-H-Aは、遅い放出源の特定の形態である。I- H-Aは、リンゴやバラでは、根の誘導における活性がI-A-Aの30倍であることが分かった。 PGRの活性は、それらをいわゆる「エリシター」と一緒に与えることによっても促進できる。２つの組み合わせは、細胞感度をタイミングよく発育させなければならないときに、特に重要である。反応する細胞は、先ず脱分化しなければならず、その後、細胞はPGR'sと反応する能力を必要とする。「エリシター」は、植物内で防御反応をもたして、この脱分化を引き起こす物質である。植物内での上記の自然の役割は、フィトアレキシン類の生成を誘導することに加えて、損傷または苛酷な負荷を与えられた後の植物の回復を調節することである。分解作用性酵素（例えば、パーオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ）が存在する細胞区分（液胞、小細、色素体）は、損傷によってダメージを受ける。上記酵素は、細胞構造物を分解することによって、エリシターを形成する。パーオキシダーゼは、細胞メンブランを分解することができることから、スルホン化リグニンフラグメントのようなオリゴ糖類や、タンニン酸またはフェルラ酸のようなリグニンモノマーを形成する。ホスホリパーゼは、細胞メンブランを、オレィン酸、リノール酸およびリノレン酸のような脂肪酸に分解する。例えば、（リノレン酸からの）ジャスモン酸および（オレイン酸からの）ノナン酸が形成される。ホスファターゼにより、ウリジンが、（リボ核酸から生成される）ウリジンモノホスフェートから形成され得る。上記全ての物質は、エリシター活性を有することが分かっている。細胞構造物の分解から直接生成されないエリシターを使用して、フシコクシン、ピチウム抽出物、セルラーゼ／ペクチナーゼ、4-アセトアミドフェノール、リポ（キト）オリゴ糖類、グルタチオン等のような細胞の感度を高めることもできる。エリシターの形成をもたらす手段を用いることもできる。そのような手段は、例えば、UV-B（PGRに体する細胞感度の非化学的誘導）、オゾン等である。フィトアセキシン生体合成からの中間体も適している。上記中間体は、例えば、アントシアン類、ステロール類等である。植物から新芽を切断すると、エリシターが損傷部に形成される。若葉や分裂組織が位置する新芽の頂点では、オーキシンも生成されて、それが、通常の極性オーキシン輸送系を介して損傷部に輸送される。すなわち、オーキシンとエリシターが損傷部に集まる。エリシターが、細胞能力を高め、それによって、細胞が、誘導因子と反応する能力を発達されると同時にオーキシンは根付きを誘導する。すなわち、根付いた新芽が形成される。サイトカイニン類の場合にも、同様の反応機構が生じる。それは、根の中の合成位置から植物の頂点まで自然に移動する。頂点が破壊されると、エリシターが形成されて、それが損傷部付近の細胞の感度をサイトカイニンの活性に対してより高めることも分かっている。この場合、新しい新芽が形成される。上記機構は、タバコの花の茎から切断した薄層細胞培養片上での、オーキシン／シトキン−誘導された蕾の形成ももたらす（表参照）。本発明によれば、エリシターの活性が、防御反応機構の誘導（フィトアレキシン生成）のみならず、細胞能力／PGRに対する感度の誘導にも関していることが分かっている。エリシターの活性は、具体的には、根、蕾みまたは新芽には存在しないが、通常、他の因子に対する細胞の感度を促進する。この原則によれば、エリシターを使用して、PGRの活性を高めることができる。そのようなエリシターは、PGRの活性を高めるおよび／または継続させることが分かっている。これは、胚芽発生の誘導や除草剤の使用に関する問題でもある。したがって、エリシターを使用して、PGRに対する植物細胞の感度を高めることができる。その結果、PGRは、所望の反応を誘発する。大抵の条件において、細胞感度をタイミングよく発達させることが望ましい。反応する細胞は、最初に脱分化しなければならず、その後、細胞は、PGRに対して反応する能力が必要となる。そのため、PGRの初期有効性は、与えられるPGRの大多数が、機能を発揮する機会を得る前に植物の代謝系で分解できるため、必要ではないかまたはほとんど望まれない。次に、PGRの後者の供給または遅い放出形態の使用は、溶液である。したがって、本発明の好ましい態様は、（化学変性した）PGR とエリシターを組み合わせることである。例えば、IHAおよび他の化学変性したPGRとエリシターの根付きについての相乗効果は、代謝による不活性化の速度が低下することのみならず、活性なオーキシン（IAA）も、後でタイミングよく放出されることである。このことは、細胞がP GRに対して即座に反応できないことから、非常に重要である。それは、先ず、PG Rに敏感にならなければならず、その感度は、エリシターの作用によって高められる。例えば、リンゴまたはタバコでは、オーキシンに対する感度の発達は、約 1〜1.5日かかる。しかしながら、この期間、市販のオーキシンは、植物の代謝作用により大きく不活性化する。エリシターの適用は、PGRの添加前に適用すると最も有効であることが分かった。（オーキシン単独に比べて根付きについての相乗効果を発揮する）ピチウム抽出物を含有する媒体においてリンゴ細胞を生物体中で１日間のインキュベーションした後、通常のオーキシンを含む媒体において１日間インキュベーションすると、ピチウム抽出物とオーキシンの両者を同時に添加して１日間インキュベーションした実験に比べて２倍増加した。エリシターと一緒に化学変性した遅い放出オーキシンを添加しても、ホルモン添加前にエリシターを適用するのと同様の効果を発揮する。それは、エリシターが即座に感度の誘導を開始して、放出源が PGRを分離する前に細胞が必要な感度を有するためである。同様に、エリシター（例えば、ノナン酸）と組み合わせた化学変性オーキシン（例えば、IHA）が、植物細胞の根付き、根付きに対する抵抗（recalcitrant）（根付き難さ）を、IHA単独の場合よりも高め、それ自体、IBA単独の場合よりもより優れた根付きを誘導することが分かった。これを表すために行った実験は、リンゴの非常に抵抗性の高い若い枝の根付きであった［シー・ヴイ・エルスター（c.v.elstar）］。IBA 2％（w/w）（タルク中＝30％）を含有する標準的な根付き粉末を用いると、最大の根付き頻度は、30％であった。IHA 1％（w/w）およびノナン酸0.5％（w/w）を含有する根付き粉末を用いると、最大の根付き頻度は、93％に増加した。IHAがそのような良好なPGRであるという事実を理解するために、実際、IBA（天然起源のオーキシン）が根付きを誘導する化合物であるか否かを調べた。驚くべきことに、IBAではなく、IAAが活性な成分であるように思われることから、（IBAへ先ず転化される）IHAと同様に、IBAもI HAへ転化することによって活性となり、それによってIBAは、事実、自然に遅い放出源でもあることが分かった。実際、エリシターとIBAの組み合わせも、IBAまたはIAA単独の添加に比べて、根付き反応において非常に強い増加をもたらした。更に、PGRと組み合わせたエリシターを使用して、転化／再生の頻度、および細胞または原形質からの植物の形成を高めることができることも分かった。バラの細胞外植体をIBA（通常の添加）またはIHAでそれぞれ処理すると、後者（IHA ）の場合に約50倍の新芽（20個の細胞外植体につき新芽2個（IBA）に対して100 個（IHA））を形成することも分かった。本発明の範疇において行われたPGRおよび／またはエリシターの新しい適用に対する研究では、幾つかの新規で未経験の観察が成された。例えば、エリシターは、小胞子の胚発生を促進することが見い出された。ノナン酸を典型的な化学試薬であるPGR（例えば、コルヒチン）と組み合わせてBrassica napens（アブラナ）の胚発生時に添加すると、小胞子の胚発生が125％増加した。さらに、本発明者らは、バラ新芽について記載したように、エリシターが、統計学上、全ての細胞の顕著な生長遅延を引き起こすことも立証した。この効果は、抗ジベレリン(a ntigibberellins)、すなわち、パクロブトラゾール（paclobutrasol）の場合でも、PGRによって高められた。エリシターは、根茎における若枝のグラフト化を高めることも分かっているが、これはオーキシンによっても高めることができるかもしれない。最後に、バラの細胞外植体をIBA（通常の添加）またはIHAでそれぞれ処理すると、後者の場合の方が、約50倍の新芽（20細胞外植体につき新芽2 個に対して100個）を形成することも観察された。エリシター自体の使用に加えて、植物は、エリシターのために暗号化する遺伝子を用いて転化することもできる。PGRに対する植物の感度が、これによって高まる。エリシターのために暗号化する遺伝子は、別の種類の増進剤によって調節されることがある。そのような増進剤は、例えば、冷衝撃、熱衝撃、損傷またはテトラサイクリンのような化学試薬によって好ましく誘導される。根粒菌の NOD遺伝子が発現された（リポ（キト）オリゴ糖類のための暗号化；表参照）タバコは、野生のものよりも多くの新芽を形成した。これは、細胞の高いサイトカイニン感度を表している。一般則に基づいて、当業者は、別の態様を考え出すであろうが、それら全ては本発明の範疇にある。本発明の根本は、活性なPGRの量を植物内の所望の位置で増加させることによって、および／または植物をPGRの活性に対してより高感度にすることによって、PGRの活性を適正化することにある。活性成分の量の増加は、化学変性したおよび／またはカプセル封入したPGRを用いることで達成できる。外生(exogenous)または内生の(endogenous)エリシターによって増感が達成される。化学変性、カプセル化およびエリシターの考えられる全ての組み合わせも当然、本発明の範疇にある。すなわち、エリシターも、単独であるいはPGRと組み合わせて、化学変性またはリポソームもしくはミセル内にカプセル組み込むことができる。それは、場合によりスペーサーを介して、１つ以上のPGRと化学的に結合することもできる。本発明の好ましい組み合わせは、化学変性したPGRとエリシターとの組み合わせである。その組み合わせは、活性を最適化するように導く。なぜならば、エリシターが、細胞の感度を与える前に、キャリアーまたはスペーサー分子から放出した後で活性を回復するPGRが最大活性まで及ぶためである。本発明は、植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中または試験官中で向上させるおよび／または継続させるための組成物にも関し、前記組成物は、リポソーム、ミセル等のような、少なくとも１つの植物生長調節因子を含有するカプセルの水溶液を含んで成る。場合により、エリシターおよび／またはエリシターの放出をもたらす手段をカプセル中に包含してもよい。そのような手段は、例えば、酵素、フィトアレキシン生体合成からの中間体等である。本発明は、少なくとも１個のキャリアー分子と結合した少なくとも１つのPG Rを含有する化学変性化合物も提供する。本発明の別の観点によれば、生長力を有するように増殖した植物、挿し穂または胚芽が提供され、それらは、本発明の１つ以上の方法および／または組成物および／または化学変性化合物を用いることによって生成される。本発明の１つ以上の方法および／または組成物および／または化学変性化合物を用いることによって生成された生理学的に操作した花、植物または胚芽も、全て、本発明の範疇にある。生理学的に操作した花、植物または胚芽は、天然のものがもつ性質以外の性質を表す花、植物または胚芽である。本発明は通常、エリシターのためにおよび／またはエリシターの形成を誘導する手段のために暗号化する遺伝子で転化することにより生成された変性した花、植物または胚芽も提供する。本発明のもう一つの観点は、PGRの活性に対して植物の感度を高めるための、エリシター、またはその生成をもたらす手段の使用、および活性なPGRの濃度を植物内で高めるための化学変性化合物の使用に関する。以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は説明のためのものであって、本発明は不当に限定されるものではない。実施例実施例１：リポソームおよびミセルを介した植物細胞への染料の導入リポソームを生成する方法は、一般に自体既知である。概説については、ケミストリー・アンド・フィジックス・オブ・リピッズ（Chemistry & Physics of L ipids）64、35〜43頁（1993年）に記載されている。リポソームの直径は、考慮しながら変えることができる。いわゆる押出法による大きな単層小胞（LUVET）は、例えば、直径40〜500nmである。多層小胞(MLV) は、直径1〜10μｍであり、または小さな単層小胞（SUV）は、直径約20〜40nmである。本実施例では、LUVETを使用した。蛍光染料（fluorescein）を試薬として使用した。水中懸濁させたLUVETを、バラ、サルトリイバラ（alstroemeria）およびカーネーションの切り花に与えた。６時間後、上記植物の葉および花細胞の中で、裸眼またはＵＶ光により蛍光染料を検出した。これは、リポソームが、植物中にPGRの蓄積を形成するのに類似の方法で、植物細胞内で物質の放出に使用され得ることを表している。さらに、放射線活性なようにラベルしたリポソームの（ユリへの）添加は、リポソームが茎細胞から輸送されることを表した。実施例２：スペーサーを用いた代謝分解に対するPGRの保護本実施例では、抗エチレンPGR化合物（以下、A-S-Aと呼ぶ。）の化合物合成におけるスペーサーとしてコハク酸を使用した。抗エチレンは、植物のエージングを遅らせる際に、数ある中で必要とされている。上記抗エチレンを代謝分解させないことによって、その活性を継続または引き上げることができる。化合物A-S-Aは、２つのアミノイソ酪酸（AIB）分子から成り、それらはコハク酸の両末端に結合している。前記化合物は、アミノイソ酪酸メチルエーテル［文献：ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ（パーキン・トランサクションＩ）（J.Chem.Soc.(Pe rlin Transactions I)、1979年、2138頁）に従って調製した。］5mMおよびコハク酸2.5mMをジクロロメタン20mL中に溶解することによって得られた。前記溶液を-5℃まで冷却した。ジクロロヘキシルカルボジイミド2.5mMをこの溶液に添加し、混合物を、-5℃で２時間、次いで、室温で２４時間撹拌した。沈殿物を濾別し、透明なジクロロメタン溶液を、水、10％クエン酸溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ジクロロメタン蒸発後、化合物A-S-Aが得られた。水中のA-S-A（濃度5×10^-5〜10^-3Ｍ）を切り花（カーネーション）に与えると、それは、花のエージングを押さえる際に、変性しなかったAIBよりも50倍活性になることが分かった。実施例３：輸送分子の使用ソルビトールは、（バラを除く）バラ科植物中で輸送可能な炭水化物である。オーキシンの活性を高めるのに使用できる２つの化合物を合成した。最初の化合物S-I-Aは、ソルビトールと結合したインドール酪酸分子から成る。第２の化合物（4-S-N-A）は、ソルビトールと結合した4-ナフタレン酢酸から成る。 S-I-Aは、インドール酪酸2.4mMおよびソルビトール2.9mMをジクロロメタン25m L中に懸濁することにより調製した。溶液を0℃まで冷却した後、ジシクロヘキシルカルボジイミド2.5mMおよび4-ピロリジノピリジン0.25mMを加えた。この溶液を周囲温度で２４時間撹拌した。沈殿物を濾別し、透明なジクロロメタン溶液を、水、1N HCl溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。溶媒を蒸発した後、化合物S-I-Aが得られた。 1-ナフタレン酢酸12mM、ソルビトール3mM、ジシクロヘキシルカルボジイミド1 3mMおよび4-ピロリジノピリジン1.2mM、並びにジクロロメタン75mLを用いて、S- I-Aと実質上同様の方法で、4-S-N-Aを調製した。S-I-Aをタルクと混合し（S-I-A 含有量0.1％）、根付き粉末として使用すると、リンゴ、バラおよびタバコにおいて、根付きを誘導できることが分かった。オーキシン根付き粉末の代替品は、オーキシン根付きスプレーである。4-S-N- Aは、全く非極性であり、リンゴの新芽の葉に噴霧によって与えると、根付きを誘導する。実施例４：輸送分子とスペーサーの使用輸送用キャリアー分子としてのグルコースおよびスペーサーとしての酢酸エステルを試験するために、グルコース-酢酸エステル-アミノオキシ酢酸（G-A-A）化合物を合成した。この目的のために、標準的な手法に従って、D-グルコースをそのo-イソプロピリデン誘導体に転化した。この化合物3mMを、ピリジン0.6mLと一緒にクロロホルム25mL中に溶解した。この溶液を0℃まで冷却した。クロロホルム10mL中の塩化クロロアセチル4mMをこの溶液に撹拌しながら滴下した。次に、クロロホルム溶液を、1N HClおよび飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。溶媒を蒸発すると、クロロアセチルグルコシドが得られた。クロロアセチルグルコシド1mMを、水1mLおよびアミノオキシ酢酸1mMを含むジメチルホルムアミド（DMF）15mL中に炭酸ナトリウム1mMと一緒に溶解した。混合物をウォーターバス中、60℃で６時間加熱した。 DMFを蒸発し、残存固体をメタノールに溶解して濾過した。希薄塩酸をメタノール溶液に添加した。室温で２時間後、溶液を蒸発させて、G-A-Aを得た。この化合物は、カーネーションに与えると、エージングに対して有効な手段であることが分かった。実施例５：エリシターを用いたPGRに対する植物の感度の向上リンゴの茎の薄片について根付きの再生におけるエリシターの効果を調べた。茎の薄片を、２番目に適したオーキシン濃度（インドール酪酸1μMまたはインドール酢酸1μM）と組み合わせたエリシターで適度にインキュベートし、試験のために１日または３日間植物細胞に加えた。再生した根の数の増加を測定し、対照であるオーキシンと比較した。セントポーリアにおける根の再生、えんどう豆の側生芽形成、タバコにおける細胞分化、並びにヒエンソウおよびリンゴにおける根付きの誘導について、エリシターウリジンを評価した。結果を表１に示す。表より、多数のエリシターは、オーキシンの活性に対する細胞感度がかなり増加することが分かる。実施例６：PGRとエリシターの結合実施例２に記載の方法と本質的に同様にして、インドール酪酸（I-B-A）をジャスモン酸（I-S-A）と結合した。I-B-A-J-Aは、バラの根の誘導において有効な手段であることが分かった（表参照）。実施例７：エチレン活性の形成を抑制する、合成された化学変性AOAの例化合物はいずれも、カーネーションとユリにおける花の老朽を遅延させる能力について試験した。１．t-ブチロキシカルボニルアミノオキシ酢酸（t-Boc-AOA）の合成 t-ブチロキシカルボニル（t-Boc）およびベンジロキシカルボニルは、AOA（アミノオオキシ酢酸）のアミノ基に対する保護基である。この保護基は、AOAのアミノ基のプロトン化を阻止するものであって、抗エチレン化合物の良好な輸送には必須である。以下のように、化合物を調製した。AOA（アミノオキシ酢酸）18mmoLを1N NaOH 30mL中に溶解する。t-ブタノール20mLを加えて、透明溶液が得られるまで混合物を撹拌する。ジ-t-ブチルジカルボネート18.5mmoLを添加して、混合物を更に１２時間撹拌する。混合物をペンテンで抽出する（2×50mL）。合わせたペンテン相を飽和NaHCO₃（3×20mL）で抽出する。水抽出液全てを合わせて、pH1まで氷上において1.1M KHSO₄で酸性化し、エーテルで抽出する（5×40mL）。エーテル相をH₂Oで洗浄し（2×30mL）、Na₂SO₄によって乾燥する。エーテルを蒸発すると、t-Boc-AOA（t-ブチロキシカルボニル-アミノオキシ酢酸）が得られた。２．N.N'-（ジ-t-ブチロキシカルボニルアミノオキシ酢酸）エチレンジアミン［(t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂］の合成 t-Boc-AOA 2.2mmoLおよびN-メチルモルホリン2.2mmoLをTHF（テトラヒドロフラン）30mL中に溶解する。溶液を0℃まで冷却し、イソブチルクロロホルメート2 .2mmoLを撹拌している溶液中に添加する。0.5時間後、エチレンジアミン1mmoLを加える。12時間後、溶媒を蒸発させて、生成物を酢酸エチルで抽出する。酢酸エチルを蒸発すると、(t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂が得られた。３．N.N'（ジ-ジアミノオキシ酢酸）エチレンジアミン［(AOA-NH-CH₂-)₂］の合成 (t-Boc-AOA-NH-CH₂-)₂10mmoLを臭化水素酸（氷酢酸中33重量％溶液）15mL中に溶解する。12時間後、混合物をエーテル（冷）40mL中に投入する。沈殿物を濾別して、更にエーテル40mLで洗浄する。乾燥後、精製された(AOA-NH-CH₂-)₂が得られる。４．ベンジロキシカルボニル-AOAの合成最初に、エタノール75mLに塩化チオニル4gを加えて、AOA-エチルエステルを合成する。0.5時間後、AOA 25mmolを（0℃で）加える。混合物を室温で更に12時間撹拌する。溶媒蒸発後、粗生成物を少量のエーテルで２回洗浄する。次に、AOA-エチルエステル20mmoLを10％Na₂CO₃40mL中に0℃で溶解する。CH₂Cl₂ 10mL中のベンジルクロロホルメート20mmolを、激しく撹拌している溶液へゆっくりと滴下する（４秒に１滴）。12時間後、混合物をCH₂Cl₂で抽出し、抽出溶媒蒸発後、ベンジロキシカルボニル-AOA-エチルエステルが得られる。エチルエステルをNaOHでケン化することによって、ベンジロキシカルボニル-AOAが得られた。５．プロピオン酸-AOAの合成プロピオン酸30mmolおよびヒドロキシスクシンイミド33mmolをTHF 50mLに溶解する。0.5時間後、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド33mmoLを、撹拌している溶液へ0℃で添加する。1時間後、AOA-エチルエステル35mmoLおよびトリエチルアミン35mmoLを撹拌している溶液へ（0℃で）添加して、混合物を更に一晩撹拌する。THF蒸発後、粗生成物を酢酸エチルで抽出する。プロピオン酸-AOA-エチルエステルのケン化により、プロピオン酸-AOAが得られた。化合物はいずれも、変性していないAOAに比べ、花の老朽の遅延に顕著な向上を示した。一般に、低濃度の変性化合物を使用すると、相対的に遅延できる。実施例２、４および６に記載の化合物は、上記AOAと同様の特性を有している。実施例８：種々の植物の根付きにおける化学変性オーキシンの評価 IAAをBSAに結合することによって、根に与えるIAAの量を増量できる。32個までのIAA分子を、２つの異なる方法でBSAに結合することができる。結合は、N- 共役系でも、C-共役系でもよい。植物の根にIAA-BSAを添加すると、IAAは、根から分離して、より長い時間でIAAの入手を誘導して、根細胞の感受性を良くする。１．BSAとN-共役したインドール酢酸（IAA-N-BSA）の合成インドール酢酸500mg(3mmoL)を、0.05Mホウ酸ナトリウム10mL(限界量)中に溶解して、1N KOHを用いてpHを一定に保持した。その後、混合物を、1N HClで中和した。次いで、ウシ血清アルブミン500mg(7.5μmoL)を水3mL中に溶解した後、3M 酢酸ナトリウム3mL、7.5％ホルムアルデヒド（w/v）4mLおよび上記のIAA-溶液を加えた。この混合物を22℃において（N₂下）暗所において13時間撹拌しながらインキュベートした。次に、混合物を0.1N炭酸水素ナトリウム10Lに対し24時間で２回透析し、その後、水10Lに対して24時間で５回透析した。この溶液を親油性化することにより、精製したIAA-N-BSAが得られ、-80℃で貯蔵した。 IAAの代わりにIBAを用い、同様の手段を行って、IBA-N-BSAを得た。２．BSAとC-共役したインドール酢酸（IAA-C-BSA）の合成２つ口丸底受け器中で、IAA52mg(0.3mmoL)およびトリ-n-ブチルアミン75μL（ 0.3mmoL）をDMF2mLに溶解し、N₂下、ほの暗い光の下で-15℃に保持し、マグネチックスターラーで撹拌した。これを、-15℃に冷却した。次に、イソブチルクロロカーボネート40μLを添加した後、8分間反応させた（溶液Ａ）。合成の第２部は、4℃で行う。溶液Ａを、i)水／DMF（1:1体積比）22mL中、BSA （グロブリンを含まず。）121mg(6.2μmoL)とii)1N NaOH 0.42mLの氷冷却した混合物中に撹拌しながら加える。ほの暗い光の下で１時間インキュベートした後、 1N NaOH 92mLを添加した。この反応混合物を、５時間撹拌した後、水中10％DMF 2Lに対し１日間透析し、その後、（暗所において）水に対して４日間透析した。凍結乾燥した後、精製したIAA-C-BSAを-80℃で貯蔵した。 IAA-C-BSAは、IAA-N-BSAほど根付きの誘導に有効ではなかったが、IAA単独よりは優れていた。３．1-N-インドール-3-ヘキサン酸（IHA）の合成この化合物は、インドール酪酸（IBA）の延長形である。両者の化合物共に、I AAとつながっており、活性ホルモンとしてのIAAを介して作用すると考えられる。IBAは、天然起源の既知のホルモンであり、また、市販されている。IHAは、IB Aと同様の方法で合成される。ディーンースターク（Dean-Stark）トラップと冷却器を備えた250mLの丸底フラスコ中で、インドール7.5ｇおよび85％KOH 6.4gをテトラヒドロナフタレン（テトラリン）100mLに加える。混合物を100℃に加熱し、ε-カプロラクタム8.4g を添加する。その後、混合物をシリコンオイル浴で230℃まで加熱し、激しく撹拌しながら、8〜16時間反応させた。室温まで冷却した後、反応混合物を水300mL で抽出する。水相を分離して、三角フラスコに捕集して、0℃まで冷却させ、その温度でpH2〜3になるまで濃塩酸を添加しながら反応させる。沈殿物を濾別し、乾燥し、メタノールから再結晶させた。収率は、反応条件により25〜75％まで変化する。上記の方法は、刊行物：ジャーナル・オブ・ジ・オーガニック・ケミストー（J.Organic Chem.）、第２８巻、1384頁（1963年）に記載の合成の調節形に基づく。幾つかのより有効な根付き粉末における比較を表２に示す。この表では、最も常用されている根付き粉末中の活性成分である標準的なインドール酪酸（IBA）を、インドールヘキサン酸（IHA）および２種のBSA付加物［いずれもN-カップリングしたもの、すなわちIBAとインドール酢酸（BSA-N-IAA）］と比較している。根付きおよび植物の発育（茎生長、新芽の発芽、植物の固体の生長の同時性）についての効果は、特に、１〜６の区分における位置を決定する因子であった。根付きおよび発育について最も優れた相対的な全体の効果を有する化合物は、区分Ｉに位置していた。草系および樹木系の植物の異なる種類の若枝の根付きおよびその後の発育は、植物の種類によって非常に異なる。バラ栽培品種である"enermus stur cinq"を、抵抗性樹木系植物の例として使用した。キク（chrysanthemum）の品種である"regan"は、根付き易い草系植物の例である。表からは、IHAが特に汎用に適用でき、かつ非常に有効であることが分かる。B SAのIAA-変種は、IBA-変種より有効なものである。BSA-N-IAAは、抵抗性植物に特に適していると考えられる。リンゴでは、IAAが、細胞フラグメント１個につき最大3.5本の根を誘導し得るが、IAA-N-BSAは、細胞フラグメント１個につき最大8本誘導する。夏オーク（summer oak）やコルク材（cork oat）のような非常に抵抗性の高い樹木は、通常与えられている根付き粉末よりも非常に高い率で根付かせることができる。実施例３に記載の化合物並びに表１中のエリシターも、同様の効果を示す。合成した全ての化合物における最大の根付きを得るのに必要な濃度は、IAAやIBAよりもかなり低い。実施例９：根付きを向上させるための変性したIBA リンゴおよびバラにおける根付きについて、オーキシン化合物を試験した。１．IBA-AIBの合成インドール酪酸（IBA）を、アミノイソ酪酸（AIB）とカップリングさせた。AI Bは、オーキシン作用のエチレン誘発抑制（すなわち、エチレンが根付きを抑制すること）を阻止する抗エチレン化合物である。化学変性によって、IBAとAIBの両者の活性が高まる。IBAとAIBの組み合わせは、標準的なホルモン処理よりも活性であることが分かった。イソブチルクロロホルメート5mmoLを、THF 30mL中のインドール酪酸（IBA）5m moLとN-メチルモルホリン5mmoLの冷却（-10℃）した溶液に加える。１時間半撹拌した後、THF 20mL中のアミノイソ酪酸エチルエステル（AIBOEt）5mmoLとトリエチルアミン5mmoLの溶液を加える。反応混合液を、-10℃で更に2時間、および周囲温度で40時間撹拌する。反応混合液を濾過し、蒸発した後、残渣を酢酸エチル（EtOAc）50mLに溶解し、1N HCl溶液で２回洗浄し（2×40mL）、５％（w/w）N aHCO₃溶液で２回洗浄し（2×40mL）、並びに飽和NaCl溶液で１回洗浄し、無水Na₂ SO₄で乾燥し、濾過し、蒸発して、IBA-AIBOEtを得た。メタノール中で、1N NaOHを用いてIBA-AIBOEtをケン化し、0℃において1N HCl で酸性化して、再結晶することにより、少なくとも99％の精製されたIBA-AIBを単離した。２．IBA-G1y-AIBの合成 AIBOEtの代わりにG1y-AIB0Etを用い、上記と同様の方法でIBA-G1y-AIBを合成した。文献：ファン・デル・クリーケン（Van der Krieken）ら著、プラント・セル・リポーツ(Plant Cell Reports)（1993年、第１２巻、203〜206頁）に記載の茎 -ディスク法で試験を行った。これは、特定の植物から切断した多数の茎−ディスクの根の数を数えて、ここに記載の化合物を含有する根付き粉末で処理するものである。この化合物の細胞の根付きについての結果は、IBA単独の場合よりも優れていた。実施例１０：果実を間引くための変性したNAA ナフタレン酢酸（NAA）は、果物の間引きに適用される、周知の化合物である。NAAの欠点は、化合物が非常に狭い濃度範囲においてのみ有効である事実である。噴霧および湿度は、処理の有効性について極めて重要であり得る。２つの化合物を合成して一般的な所見を示した。すなわち、化学変性したPGR は、特に、エリシターと組み合わせたときに、変性していないPGRに比べて非常に広い濃度範囲に亙って有効である。これは、変性したNAAがNAAそのものよりも広い濃度範囲に亙って作用すべきであることを意味する。合計40本の樹木について試験する２つの化合物は、無水ナフチル酢酸（NAA）とナフチル酢酸-アセトアミドナフチル（2個のNAは、ペプチド結合で結合されている。）であった。リンゴの２つの異なる栽培品種および洋なしの１つの栽培品種を、各化合物の３つの異なる濃度で噴霧した。初期の観察では、両方の化合物が、間引きに有効であり、かつより広い範囲に亙って作用することを表している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ０１Ｎ 37/02 Ａ０１Ｎ 37/02 37/06 37/06 43/54 43/54 Ｆ 65/00 65/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・デル・クリーケン，ウィルヘルムス・マリアオランダ、エヌエル−6708エルセー・ウァーヘニンゲン、オウトラーン35番 (72)発明者スミット，ヘレットオランダ、エヌエル−6715ハーエム・エーデ、リヒテンベーク11番

Claims

【特許請求の範囲】１．植物部中で活性な植物生長調節因子（PGR）の濃度を局部的に高めること、および／または植物成長調節因子の活性に対する植物部の感度を高めることから成る植物生長調節因子の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるための方法。２．植物部中で活性な植物生長調節因子の濃度の増加が、カプセル化形状のPG Rを植物部に与えることによって達成されることを特徴とする請求項１記載の方法。３．植物部中で活性な植物生長調節因子の濃度の増加が、化学変性されたPGR を植物部に与えることにより達成されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。４．PGRの化学変性が、キャリアー分子１個以上を酵素分解法でPGRに結合することから成る請求項３記載の方法。５．キャリアー分子が、スペーサー分子を間に挟んでPGRと結合されることを特徴とする請求項４記載の方法。６．キャリアー分子が、例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、ステロール、テルペン、ホスホリル化炭化水素のような炭水化物から成る群から選ばれる輸送可能な化合物である請求項４または５記載の方法。７．キャリアー分子が、PGRの代謝分解をもたらすPGR上の基と、前記代謝分解が生じないように結合させた化合物である請求項４または５記載の方法。８．PGRの化学変性が、PGRの極性化を促すことから成る請求項３記載の方法。９．PGRの極性が、少なくとも１個のキャリアー分子のPGR、スペーサー分子または別のPGRと結合することによって中和されて、電荷を有する基をエステルまたはペプチド結合を介して結合するのに使用して、極性を消失させることを特徴とする請求項８記載の方法。１０．PGRの極性を、例えば、エステル結合を介して糖分子のような非常に帯電した分子をPGRと結合させることにより、あるいはPGRのスルホネートを調製することにより高めることを特徴とする請求項８記載の方法。１１．分解を保護する化合物が、スペーサー分子としても供給され、かつ例えば、コハク酸、マロン酸、および1,2-ジアミノエタン、1,4-ジアミノブタン、1, 6-ジアミノヘキサンのようなジアミノアルカンから成る群より選ばれることを特徴とする請求項５記載の方法。１２．植物生長調節因子に対する植物部の感度の向上が、植物部に防御反応をもたらす手段を植物部に導入することにより行われる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。１３．防御反応をもたらす手段が、オリゴ糖類、リグニンフラグメント、タンニン酸、ジャスモン酸、ノナン酸、ウリジンのような植物に特有の化合物、並びにリポ（キト）オリゴ糖類、フシコクシン、ピチウム抽出物、4-アセトアミドフェノールのような植物とは調和しない化合物から選ばれる、いわゆるエリシターであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。１４．防御反応をもたらす手段が、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼから選ばれるいわゆるエリシターの放出を引き起こす手段、およびUV-B、オゾンのような他の手段であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。１５．防御反応をもたらす手段が、フィトアレクシン生体合成からの中間体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。１６．防御反応をもたらす手段が、エリシターのために、またはエリシターの放出を引き起こす酵素のために、反応情報を暗号化する植物に導入される遺伝子反応性遺伝子によって形成されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。１７．少なくとも１つの植物生長調節因子を含有する、リポソーム、ミセル等のようなカプセルの水溶液を含んで成る、植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるための組成物。１８．エリシターおよび／または酵素のようなエリシターの放出をもたらす手段も、カプセル内に組み込んでいる請求項１７記載の組成物。１９．エリシターに対して、および／またはエリシターの放出をもたらす酵素のために、および場合により植物材料に必要とされる酸の変換のために暗号化する遺伝子構造物１つ以上を含んで成る、植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるためのキット。２０．請求項４〜１１に記載のキャリアー分子少なくとも１つと結合している PGR少なくとも１つを含有する化学変性化合物。２１．請求項１〜１６のいずれかに記載の方法、および／または請求項１７〜１９のいずれかに記載の組成物、および／または請求項２０に記載の化学変性化合物を用いて生成される生長力を有するように増殖した植物、挿し穂または身体的な胚芽。２２．請求項１〜１５のいずれかに記載の方法、および／または請求項１７または１８に記載の組成物、および／または請求項２０に記載の化学変性化合物を用いて生成した生理学的に操作された花、植物または胚芽。２３．花、植物または胚芽が元来の性質以外の性質を表す請求項２２に記載の生理学的に操作された花、植物または胚芽。２４．請求項１６記載の方法および／または請求項１９記載のキットを用いて生成される遺伝子変性された花、植物または胚芽。２５．花、植物または胚芽が元来の性質以外の性質を表す請求項２４記載の遺伝子変性された花、植物または胚芽。２６．PGRの活性に対する植物の感度を高めるための、請求項１２〜１６のいずれかに記載のエリシターまたはその生成をもたらす手段の使用。２７．植物内で活性なPGRの濃度を高めるための請求項２０記載の化学変性化合物の使用。２８．最初に、エリシター１つ以上を植物または植物細胞に与え、１つ以上の PGRの作用に対して植物または植物細胞を感知できるように十分な時間エリシターをパスさせた後、１つ以上のPGRを与えることから成る植物生長調節因子（PGR ）の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるための方法。２９．１つ以上のエリシターと１つ以上の遅い放出のPGRを植物または植物細胞に同時に加えることから成る植物生長調節因子（PGR）の活性を生物体中でまたは試験官中で向上させるおよび／または継続させるための方法。