DE69630615T2

DE69630615T2 - Verwendung einer zusammensetzung enthaltend polyether block copolymere

Info

Publication number: DE69630615T2
Application number: DE69630615T
Authority: DE
Inventors: Alexander V. Kabanov; Yu Valery ALAKHOV; Peter G. Sveshnikov; Eugenii S. Severin
Original assignee: Supratek Pharma Inc; Kabanov Alexander V Omaha
Current assignee: Supratek Pharma Inc; Kabanov Alexander V Omaha
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: US5817321A; CA2222776A1; EP0871432B1; BR9609176A; CN1192678A; EP0871432A2; EP1310244A3; JPH11507619A; WO1996040055A3; AU6529796A; JP4167299B2; RU2166934C2; WO1996040055A2; ATE253352T1; AU700021B2; EP1310244A2; NZ313271A; DE69630615D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche chemotherapeutische Wirkstoffe umfassen.
Eine Anzahl chemotherapeutischer Wirkstoffe zeigt geringe Löslichkeit und Stabilität in physiologischen Flüssigkeiten. Häufig werden chemotherapeutische Wirkstoffe schlecht durch Zellmembrane transportiert. Ferner gehen viele dieser Wirkstoffe Bindungen mit Plasmaproteinen ein, als auch andere nicht-spezifische Wechselwirkungen im Blutstrom, bevor sie den Zielkrebs erreichen.
Eine wesentliche Hürde bei wirksamen chemotherapeutischen Behandlungen ist die Resistenz gegenüber biologischen Wirkstoffen, die viele Neoplasmen und mikrobielle Infektionen entwickeln. Die Empfindlichkeit neoplastischer Zellen gegen Antikrebsmittel kann um einen Faktor in der Höhe von 10³ während des Verlaufs eines chemotherapeutischen Regimes abnehmen. Wenn sich eine derartige Resistenz in Bezug auf einen Wirkstoff entwickelt, wird oft gefunden, daß die Zielzellen auch gegenüber einer Anzahl von anderen biologischen Wirkstoffen resistent sind, denen sie zuvor nicht ausgesetzt waren. Siehe Goldstein et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 12: 243–253, 1992; Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Auflage, McGraw-Hill, New York, 1994. Von einem Mechanismus, durch den sich eine solche Resistenz entwickelt, wird angenommen, daß er das Membranpumpprotein gp-170 (ein Glycolprotein P oder P-gp-Protein) einbezieht. Siehe Goldstein et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 12: 243–253, 1992. Wirkstoffreisetzungs-Systeme, basierend auf Mizellen, welche wenigstens ein Blockcopolymer enthalten, sind in der internationalen Patentanmeldung WO94/08564 beschrieben; Kabanov et al., Journal of Controlled Release, Band 22, 1992, 141–158; Paradu et al., International Journal of Oncology, Band 5, 1994, 1305–1308; und Kabanov et al., Macromolecules, Band 28, 1995, 2303–2314.
Es ist nun gefunden worden, daß diese Schwierigkeiten durch Verabreichung des in Frage kommenden biologischen Wirkstoffs in einer Formulierung, welche Mizellen von einem oder mehreren Blockcopolymeren mit den unten beschriebenen Charakteristika enthält, überwunden werden können. Es ist weiterhin gefunden worden, daß eine bestimmte Untergruppe dieser Blockcopolymere besonders wirksam bei der Freisetzung von Wirkstoffen und der Aufhebung der Resistenz gegenüber einem biologischen Wirkstoff ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung wie in Anspruch 1 definiert angegeben.
Das Polyether-Blockcopolymer fällt innerhalb die allgemeine Formel A-B-A' (I)wobei A und A' lineare polymere Segmente vom Typ A sind, und B und B' lineare polymere Segmente vom Typ B.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung Mizellen des Blockcopolymers oder bildet Mizellen des Blockcopolymers während des Verlaufs der Verabreichung oder nachfolgend dazu. Bevorzugt ist wenigstens etwa 0,1% des biologischen Wirkstoffs in den Mizellen aufgenommen, stärker bevorzugt wenigstens ungefähr 1% des biologischen Wirkstoffs, und noch stärker bevorzugt wenigstens ungefähr 5% des biologischen Wirkstoffs.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophobe Molekulargewicht des Copolymers wenigstens 900, stärker bevorzugt wenigstens 1700, noch stärker bevorzugt wenigstens 2 000 und noch stärker bevorzugt wenigstens 2 300.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeigt das Copolymer oder die Copolymere der Zusammensetzung eine kritische mizellare Konzentration („CMC" von nicht mehr als ungefähr 0,5% Gewicht/Volumen bei 37°C in einer isotonen wäßrigen Lösung, bevorzugt nicht mehr als ungefähr 0,05% Gewicht/Volumen; stärker bevorzugt nicht mehr als 0,01 Gewicht/Volumen, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 0,003% Gewicht/Volumen.
Die Copolymere der Zusammensetzung entsprechen Formel (V), die im Text unten angegeben ist. Besonders bevorzugt unter diesen Copolymeren sind solche mit hydrophoben Molekulargewichten zwischen 1500 und 2 000, bevorzugt zwischen 1710 und 1780, und prozentualen hydrophoben Anteilen zwischen 85% und 95%, bevorzugt zwischen 88% und 92%.
Die Zusammensetzung umfaßt einen chemotherapeutischen Wirkstoff.
In einer zweiten Ausführungsform gibt die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an, die ein in polymeren Mizellen solubilisiertes zytotoxisches Medikament umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform gibt die Verbindung die Verwendung der Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors durch Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung der ersten oder zweiten Ausführungsform an.
In noch einer weiteren Ausführungsform gibt die Erfindung die Verwendung der Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines erkrankten Gewebes an, das während des Verlaufs einer Behandlung mit diesem oder einem anderen biologischen Wirkstoff Resistenz gegen einen biologischen Wirkstoff entwickelt hat, wobei das Verfahren die Verabreichung einer Zusammensetzung umfaßt, welche (a) einen zweiten biologischen Wirkstoff umfaßt, der derselbe oder von dem ersten biologischen Wirkstoff verschieden sein kann, gegen den das Gewebe resistent ist und (b) eine mizellenbildende Copolymer-Zusammensetzung wie für die erste oder zweite Ausführungsform der Erfindung beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform gibt die Erfindung die Verbindung der Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung oder Beschränkung von Tumormetastasen durch Verabreichung einer der erfindungsgemäßen Antikrebs-Zusammensetzungen an.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Zytotoxizität für SK-resistente Zellen oder SK-Zellen, welche mit Daunorubicin in freier oder mizellarer Form behandelt wurden.
2 zeigt die Kinetik der Daunorubicin-Akkumulation für SK-resistente Zellen oder für SK-Zellen, welche mit Daunorubicin in freier oder mizellarer Form behandelt wurden.
3A und 3B zeigen die Inhibierung von MCF7-ADR⁰-Zellen, welche mit verschiedenen Konzentrationen Doxorubicin und Pluronic L61 inkubiert worden waren.
3C zeigt die zelluläre Toxizität von Pluronic L61 gegen MCF7-ADR⁰-Zellen.
4 zeigt den Zeitverlauf der Beseitigung von [³H]-Pluronic P85 aus dem Blut und die Anreicherung in der Leber.
5 zeigt einen Vergleich der Blutkonzentration von [³H]-Pluronic P85 bei i.v. oder oraler Verabreichung.
6A zeigt Leberkonzentrationen von Daunorubicin.
6B zeigt Blutkonzentrationen von Daunorubicinol über die Zeit nach Injektion.
6C zeigt Blutkonzentrationen von Daunorubicin über die Zeit nach Injektion.
7 zeigt die Veränderung, während eines Behandlungsverlaufs, in dem Volumen von mehrfach wirkstoffresistenten Sp2/0^dnr-Myelomatumoren in BALB/c-Mäusen. Das Volumen wurde als das mittlere Tumorvolumen an einem gegebenen Tag (V) gegenüber dem mittleren Volumen am ersten Tag der Behandlung (V₀) quantifiziert.
8 zeigt die Veränderung, während eines Behandlungsverlaufs, im Volumen von mehrfach wirkstoffresistenten Sp2/0^dnr-Myelomatumoren in BALB/c-Mäusen.
9 zeigt die Inhibierung von Tumormetastasen in Mäusen, welche mit Doxorubicin mit Pluronic P85 behandelt wurden, gegenüber Mäusen, die mit Doxorubicin alleine behandelt wurden.
DEFINITIONEN

Die unten aufgeführten Ausdrücke oder Wendungen sollen die folgende Bedeutung haben:

biologischer Wirkstoff

Ein Wirkstoff, der zum diagnostizieren oder zum Abbilden verwendet werden kann, oder der auf eine Zelle, ein Organ oder einen Organismus einwirken kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Arzneimittel (Pharmazeutika), um eine Veränderung in der Funktionsweise der Zelle, des Organs oder des Organismus hervorzurufen. Derartige Wirkstoffe können, ohne darauf beschränkt zu sein, Nukelinsäuren, Polynucleotide, antibakterielle Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe, Antipilz-Wirkstoffe, antiparasitäre Wirkstoffe, tumorizidale oder Antikrebsmittel, Proteine, Toxine, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter, Glycoproteine, Immunoglobuline, Immunomodulatoren, Farbstoffe, Radiomarker, Radiokontrastverbindungen, Fluoreszenzverbindungen, Polysaccharide, Zellrezeptor-Bindungsmoleküle, Entzündungshemmer, Antiglaucom-Wirkstoffe, pupillenerweiternde Verbindungen und Lokalanästhetika sein.

chemotherapeutischer Wirkstoff

Ein biologischer Wirkstoff, der das Wachstum von neoplastischen oder pathogenen mikrobiellen Zellen inhibiert oder deren Überlebensfähigkeit herabsetzt, oder die Vermehrung (die ohne Einschränkung Replikation, viralen Aufbau oder zelluläre Infektion umfaßt) eines Virus.

zytotoxisches Arzneimittel	Ein chemotherapeutischer Wirkstoff, der bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann, welcher zytotoxisch ist, insbesondere gegenüber sich schnell teilenden Zellen.
hydrophober Prozentsatz	Prozentsatz des Molekulargewichts eines Blockcopolymers, der aus Blöcken vom Typ B hergestellt ist. Dieser Wert wird auch als der „hydrophobe Gewichtsanteil" bezeichnet.
hydrophobes Gewicht	Der Molekulargewichtsbeitrag der Blöcke vom Typ B eines Blockcopolymers. Dieser Wert wird auch als das „hydrophobe Molekulargewicht" bezeichnet.
IC₅₀	Die Konzentration, bei der 50% Zytotoxizität erhalten wird. Die Zytotoxizität kann nach dem Verfahren von Alley et al., Cancer Res. 48: 589–601, 1988 oder Scudiero et al., Cancer Res., 48: 4827, 1988, gemessen werden. Insbesondere kann sie basierend auf der Arzneimittelkonzentration gemessen werden, bei der eine 50%-ige Reduktion in der Aktivität von Enzymen in den Mitochondrien beobachtet wird.
lipophile Gruppierung	Ein lipophiler Substituent, der an eine Zielgruppierung gebunden ist und in den lipophilen Anteil von Copolymermizellen eindringt, um die Zielgruppierung mit solche Mizellen in Verbindung zu bringen.
Mikrobe	Ein Bakterium, Mycoplasma, eine Hefe oder ein Pilz, ein Virus oder ein Parasit (z. B. ein Malariaparasit)
MDR	Zellen sind mehrfach medikamentenresistent „multidrug resistant" (MDR), wenn sie gegenüber der Aktivität von biologischen Wirkstoffen resistent sind, die auf Zellinien wirken, welche Vorfahren der MDR-Zellen sind.
Zielgruppierung	Eine molekulare Struktur, die durch einen zellulären, Gewebe-, viralen oder Substratumbestandteil erkannt werden, z. B. ein Zelloberflächen-Rezeptor oder -Akzeptormolekül

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Blockcopolymere bei der Verstärkung der Potenz von chemotherapeutischen Arnzeimitteln und bei der Umkehr von MDR stark abhängig ist von (a) dem hydrophoben Prozentsatz und (b) den hydrophoben Gewichtsanteilen. Die Wirksamkeit erhöht sich mit entweder einer Erhöhung des Prozentsatzes (a) oder einer Erhöhung des Gewichts (b), oder von beidem. Diese Zunahme im hydrophoben Prozentsatz und hydrophoben Gewichtsanteil korrelieren auch mit verbesserten Mizellenbildungs-Eigenschaften, wobei eine Mizellenbildung bei diesen Copolymeren bei niedrigeren Konzentrationen auftritt. Siehe Hurter et al., Macromolecules 26: 5030, 1993; Hurter et al., Macromolecules 26: 5592, 1993; Alexandris et al., Macromolecules 27: 2414, 1994. Obwohl es nicht erwünscht ist, auf eine bestimmte Theorie beschränkt zu sein, wird angenommen, daß eine Mizellenbildung als Surrogat für das Messen physikalischer Eigenschaften dient, welche zu verbesserten Bereitstellungseigenschaften eines biologischen Wirkstoffs führt. Sich wiederum nicht auf eine bestimmte Theorie beschränkend, wird angenommen, daß es nicht Mizellen per se sind, welche zu einer verbesserten Effizienz biologischer Wirkstoffe und einer Reversion einer Mehrfach-Medikamentenresistenz führen. Wenn, bei der Verwendung von Doxorubicin als biologischem Modellwirkstoff, das Verhältnis von (a) des IC₅₀ (einer Messung der zytotoxisch wirksamen Konzentration) für eine Copolymer enthaltende Zusammensetzung zu (b) dem IC₅₀ für freies Doxorubicin gegen die Konzentration des Copolymers aufgetragen wird, ist die Auftragung biphasisch, wobei eine schnelle Abnahme des Verhältnisses gesehen wird, wenn sich Copolymerkonzentrationen erhöhen, aber unter dem CMC des Copolymers verbleiben. Oberhalb des CMC wird eine schnelle Einstellung des Verhältnisses beobachtet. Siehe 6B. Eine maximale Verstärkung der Aktivität des biologischen Wirkstoffs tritt oberhalb des CMC's auf, obwohl eine Verstärkungsaktivität, für das Copolymer Pluronic L61, bei Konzentrationen von so niedrig wie 0,0001% Gewicht/Volumen oder weniger zu beobachten ist. Von der mizellaren Form wird auch angenommen, daß sie bei der Verwendung der Copolymere in Arnzeimittel-Zufuhrsystemen aus anderen Gründen wichtig ist, wie unten diskutiert wird.
Das unten angegebene Schema ist hilfreich beim Verständnis des Verhältnisses zwischen dem hydrophoben Prozentsatz und dem hydrophoben Gewichtsanteil eines Copolymers und verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung. In dem Schema ist das Molekulargewicht des hydrophoben (Poly(oxypropylen)) und des Copolymers direkt unter jedem angegebenen Copolymer dargestellt. Neben diesen Werten befinden sich die Werte der hydrophoben Prozentsätze für jedes Copolymer.
Es wurde ermittelt, daß Pluronic F68 nur eine gemäßigte Aktivität bei der Verstärkung der Potenz biologischer Agenzien aufweist. Pluronic F61, welches denselben hydrophoben Gewichtsanteil wie Pluronic F68 besitzt, aber einen wesentlich höheren hydrophoben Prozentsatz, gilt allgemein als das wirksamste der in dem Schema angegebenen Blockcopolymere. Pluronic F108, welches denselben hydrophoben Prozentsatz wie Pluronic F68 besitzt, aber eine wesentlichen höheren hydrophoben Gewichtsanteil, ist auch ein wirksames Copolymer, obwohl viel weniger wirksam als Pluronic L61. Pluronic P85 besitzt einen größeren hydrophoben Gewichtsanteil und einen größeren hydrophoben Prozentsatz als Pluronic F68, aber der Unterschied in jedem Wert ist geringer als er jeweils für Pluronic F108 und L61 ist. Die Wirksamkeit für Pluronic P85 bei der Verstärkung der Potenz biologischer Wirkstoffe liegt zwischen der Wirksamkeit von Pluronic F108 und von Pluronic L61. Diese Unterschiede in der Wirksamkeit werden verdeutlicht, wenn verschiedene Copolymere, bei einer Konzentration oberhalb des CMC, und Doxorubicin in vitro mit arzneimittelresistenten Zellen inkubiert werden.
Das Verhältnis des IC₅₀-Werts für Doxorubicin in der Abwesenheit von Copolymer zu dem Verhältnis in der Gegenwart von Copolymer ist der „Resistenzumkehrindex". Die Werte für den Resistenzumkehrindex für verschiedene Copolymere sind:
Die Bedeutung der mizellaren Form bei der Zufuhr biologischer Wirkstoffe wird auch in in vivo-Versuchen deutlich gemacht. In der mizellaren Form sind biologische Wirkstoffe im hydrophoben Kern der Mizellen angeordnet, wodurch sie durch die hydrophile Hülle (zusammengesetzt aus Segmenten vom A-Typ) maskiert sind, die die Mizellen umgeben. Diese Maskierung verringert die Interaktionen mit Leber, Plasmaproteinen, anderen Nicht-Zielgeweben und anderen Molekülen, welche den Wirkstoff binden oder inaktivieren, oder den Wirkstoff in ein toxisches Metabolit umwandeln. Zum Beispiel führt ein schneller Metabolismus von Anthracyclinantibiotika durch die Leber zur Bildung von cardiotoxischen Metaboliten, welche an der C13-Position modifiziert sind. Siehe Mushlin et al., Br. J. Pharmacol. 110: 975–982, 1993. Bei der Verwendung von Doxorubicin als Modellarzneimittel setzt die Mizellenform die Leberaufnahme herab, verringert die Umwandlung zu Doxorubicinol und setzt die Rate herab, bei der die Konzentration von Doxorubicin im Blut abnimmt. Siehe 4 und 5.
Die Wirksamkeit von Copolymeren bei (a) der Bildung von Mizellen (wo eine größere Wirksamkeit bei verringerten CMCs gemessen wird) und (b), welches das Eindringen verschiedener biologischer Wirkstoffe in die Mizellen gegenüber der freien Form favorisiert, erhöht sich gemäß demselben Muster (d. h. mit Zunahmen im hydrophoben Gewichtsanteil oder hydrophoben Prozentsatz). Die Hierarchie der Wirksamkeit ist somit wiederum L61 > P85 > F108 >> F68. Man nimmt an, daß die Gegenwart von Mizellen bei niedrigen Konzentrationen hilft, unter der Annahme, daß der biologische Wirkstoff mit den Zellen assoziiert bleibt, daß der biologische Wirkstoff und das Copolymer zusammen ein Zielgewebe erreichen. Teilungskoeffizienten, die die Mizellenform begünstigen, helfen sicherzustellen, daß die Annahme, daß der biologische Wirkstoff mit den Mizellen assoziiert bleibt, wahr bleibt. Man nimmt auch an, daß die Mizellenform des biologischen Wirkstoffs denselben von der Aufnahme durch Nicht-Zielgewebe schützt, wobei diese Gewebe den biologischen Wirkstoff in einen unwirksamen oder toxischen Metaboliten metabolisieren können, und vor einer nicht-spezifischen Adsorption an Blutbestandteilen, zellulären Bestandteilen und dergleichen.
Dasselbe Muster von Copolymerwirksamkeit trifft auf die Behandlung von experimentellen Tumoren mit Antikrebs-Arzneimitteln zu, wie in den Beispielen erörtert wird.
Bei hohen Konzentrationen können Blockcopolymere toxisch für die Leber, die Nieren oder andere Zellen eines Subjekts sein. Siehe BASF Corp., Pluronic Material Safety Data Sheet and Drug Master Files. Die Toxizität von Blockcopolymeren erhöht sich mit den Parametern der Hydrophobizität von Blockcopolymeren gemäß demselben Muster, wie es für die Erhöhung der Wirksamkeit bei der Potenzierung biologischer Wirkstoffe zu sehen ist. Glücklicherweise ist die Zunahme der Rate der Potenz bei der Veränderung dieser Hydrophobizitätsparameter viel größer als die Zunahme der Copolymertoxizität. Zum Beispiel ist, wie in Beispiel 8 erläutert, der ID₅₀ von L61 in Balb/c-Mäusen zehnfach niedriger als der ID₅₀ von Pluronic F108. Der Unterschied in der optimalen therapeutischen Doss ist jedoch mehr als 100-fach erhöht für Pluronic L61 gegenüber Pluronic F108 (siehe Beispiel 9B). Der Konzentrationsbereich, über den eine Wirksamkeit bei der Potenzierung der Aktivität von biologischen Wirkstoffen beibehalten werden kann, während eine Toxizität aufgrund des Copolymers vermieden wird, wird somit für Pluronic L61 gegenüber Pluronic F108 erhöht.
Es wird angenommen, daß Mitglieder der Glycoprotein P-Familie von Membranproteinen für die Mehrfach-Medikamentenresistenz vieler der Tumore verantwortlich sind, deren Resistenz durch Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umgekehrt werden kann. Siehe Goldstein et al., Cancer Treatment Res. 57: 101–119, 1991. Man nimmt an, daß diese Proteine als Pumpen fungieren, die den biologischen Wirkstoff, gegen den die Tumore resistent geworden sind, exportieren. Man nimmt an, daß Mitglieder derselben Proteinfamilie in den Membranen der die Blutgefäße auskleidenden Endothelialzellen im Gehirn vorliegen und für die „Blut-Gehirn-Schranke" „blood brain barrier" (BBB) verantwortlich sind, die ein Eintreten von wirksamen Mengen vieler biologischer Wirkstoffe in das Gehirn ausschließen. Siehe z. B. Tatsuta et al., J. Biol. Chem. 267: 20383–20391. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können zur Verbesserung der Wirkstoffpermeabilität in das Gehirn verwendet werden, wie ausführlicher in dem US-Patent Nr. 6153193 diskutiert wird, welches gleichzeitig mit dem vorliegenden Patent am 7. Juli 1995 angemeldet wurde und den Titel „Compositions for Targeting Biological Agents" trägt, Anwaltsakte Nr. 313257-103A. Ferner nimmt man an, daß Mitglieder dieser Proteinfamilie verantwortlich sind für Medikamentenresistenz in bestimmten Candida-, Malaria- und anderen mikrobiellen Infektionen. Ohne sich an eine bestimmte Theorie zu binden, wird angenommen, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durch Mitglieder der Glycoprotein P-Familie vermittelte Austragsmechanismen und andere Mechanismen der Medikamentenresistenz umkehren. Die Erfindung wird mit Bezugnahme auf die von Hansch und Leo entwickelten Fragmentkonstanten beschrieben. Siehe Hansch und Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, 1979; James, Solubility and Related Properties, Marcel Dekker, New York, 1986, Seiten 320–325. Diese Konstanten wurden zur Verwendung bei der Abschätzung des Beitrags eines Molekülteils zur Tendenz des Moleküls, sich zwischen den von Octanol-Wassermischungen gebildeten Phasen einzulagern. Diese Konstanten werden allgemein als fragmentale Hansch-Leo-Teilungskonstanten bezeichnet (nachfolgend „fragmentale Hansch-Leo-Konstanten").
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sollen allgemein entweder vorgebildete Mizellen mit einem wesentlichen Anteil des darin gelösten biologischen Wirk stoffs einschließen oder Copolymer-Zusammensetzungen, welche Mizellen mit einem wesentlichen Anteil des darin gelösten Wirkstoffs während des Verlaufs der Verabreichung des biologischen Wirkstoffs an einen Patienten bilden, oder nachfolgend dazu. Für die Ausführungsformen der Erfindung, bei denen Zielfunktionen mit den Mizellen assoziiert sind, ist die Zielfunktion entweder mit den Mizellen prä-assoziiert oder wird sich während des Verlaufs der Verabreichung mit Mizellen assoziieren. Besonders bevorzugte Blockcopolymere sind solche, die niedrige CMC-Werte in isotonischen Lösungen bei physiologischen Temperaturen besitzen. Solche Blockcopolymere erhalten ein mizellares Zufuhrvehikel für biologische Wirkstoffe sogar nach einer deutlichen Verdünnung in eine physiologische Flüssigkeit, wie das Blut eines behandelten Patienten, aufrecht. Derart niedrige CMC-Werte erlauben die Verwendung verringerter Mengen von Blockcopolymeren in der erfindungsgemäßen Medikamentenzusammensetzung.
Es wird auf das US-Patent 6387406, angemeldet am 17. Januar 1995 Bezug genommen.
Die Anzahl sich wiederholender Einheiten des gesamten hydrophilen (Typ A) Blocks oder des gesamten hydrophoben (Typ B) Blocks eines Polyethercopolymers ist bevorzugt zwischen 4 und 400. Stärker bevorzugt ist die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten zwischen 4 und 200, noch stärker bevorzugt zwischen 5 und 80.
Sämtliche der sich wiederholenden Einheiten, die Blöcke vom Typ A umfassen, besitzen eine fragmentale Hansch-Leo-Konstante von weniger als –0,4, stärker bevorzugt weniger als –0,5, noch stärker bevorzugt weniger als –0,7. Vorzugsweise besitzen sämtliche der sich wiederholenden Einheiten, die Blöcke vom Typ B umfassen, eine fragmentale Hansch-Leo Konstante von –3,0 oder mehr, stärker bevorzugt –0,2 oder mehr.
Erfindungsgemäße Polymere sind als Blockcopolymere mit der folgenden Formel beispielhaft dargestellt:
Solche Poly(oxyethylen)-Poly(oxypropylen) Verbindungen sind beschrieben worden von Santon, Am. Perfumer Cosmet. 72(4): 54–58 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7): 25–30 (1967); Non-ionic Surfactants, Schick, Herausgeber, (Dekker, NY, 1967), Seiten 300–371. Eine Anzahl derartiger Verbindungen sind kommerziell unter solch allgemeinen Handelsnamen wie „Poloxamers", „Pluronics" und „Synperonics" erhältlich. Polyoxypropylen-Polyethylen Blockcopolymere können auch mit hydrophilen Blöcken entwickelt werden, die eine zufällige Mischung von sich wiederholenden Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten aufweisen. Gleicherweise kann der hydrophobe Block aus einer Mischung von sich wiederholenden Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten bestehen. Solche Blockcopolymere sind von BASF unter dem Handelsnamen Pluradot^TM erhältlich.
Eine Anzahl Pluronics werden so gebildet, daß sie der folgenden Formel entsprechen:
Der Durchschnitts-Fachmann wird natürlich erkennen, daß die Werte von m und n gewöhnlich einen statistischen Mittelwert darstellen und daß die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten des ersten Blocks eines gegebenen Moleküls allgemein nicht exakt die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten des dritten Blocks sein wird. Die Charakteristika einer Anzahl von Pluronics, welche unter Bezugnahme auf (II) beschrieben sind, sind wie folgt:
Diese CMC-Werte wurden nach der Oberflächenspannungs-Methode bestimmt, beschrieben in Kabanov et al., Macromolecules 28: 2303–2314, 1995.
Weitere spezifische Poly(oxyethylen)-Poly(oxypropylen)-Blockcopolymere, die für die vorliegende Anwendung relevant sind, schließen die folgenden ein:
Der Durchschnitts-Fachmann wird im Lichte der hierin enthaltenen Diskussion erkennen, daß sogar wenn die Ausführung der Erfindung z. B. auf Poly(oxyethylen)-Poly-(oxypropylen)-Verbindungen beschränkt ist, die obigen beispielhaften Formeln ebenfalls beschränkend sind. Ein wichtiges Merkmal ist, daß die durchschnittliche fragmentale Hansch-Leo-Konstante der Monomere in dem Block vom Typ A ungefähr –0,4 oder niedriger ist. Somit müssen die den ersten Block bildenden Einheiten nicht ausschließlich aus Ethylenoxid bestehen. Gleicherweise müssen nicht sämtliche der Blöcke vom Typ B ausschließlich aus Propylenoxideinheiten bestehen. Statt dessen können die Blöcke andere Monomere als die in Formel II definierte einbeziehen, solange die Parameter der ersten Ausführungsform beibehalten werden. In den einfachsten Beispielen kann somit wenigstens eins der Monomere in Block A wie zuvor beschrieben mit einer Seitenkettengruppe substituiert sein.
Der Durchschnitts-Fachmann wird erkennen, daß die zur Herstellung dieser Polymere erforderlichen Monomere synthetisch erhältlich sind. Siehe Vaughn et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 28: 294, 1951. In einigen Fällen erfordert die Polymerisation der Monomere die Verwendung geeigneter Schutzgruppen, wie der Fachmann verstehen wird. Allgemein bestehen die Blöcke vom Typ A und B zu wenigstens ungefähr 80% aus sich wiederholenden -OR⁵--Einheiten, stärker bevorzugt zu wenigstens ungefähr 90%, noch stärker bevorzugt zu wenigstens ungefähr 95%.
Die Hansch-Leo-Abschätzung des Octanol-Wasser-Teilungskoeffizienten (P) eines organischen Moleküls wird gemäß der folgenden Formel berechnet: Log P = Σanfn + ΣbmFm worin die f_n-Werte die fragmentalen Konstanten für die unterschiedlichen Gruppen in dem Molekül sind, die a_n-Werte die Anzahl eines jeden Gruppentyps in dem Molekül, die F_m-Werte Faktoren für bestimmte molekulare Eigenschaften sind, wie Einfachbindungen oder Doppelbindungen, und die b_m-Werte die Anzahl jeder solcher molekularen Merkmale. Zum Beispiel wäre die fragmentale Hansch-Leo-Konstante für eine sich wiederholende Ethylenoxideinheit (-CH₂CH₂O-): 2fC + 4fH + fO + (4 – 1)Fb = 2(0,20) + 4(0,23) + (–1,82) + 3(–0,12) = 0,86
Die fragmentale Hansch-Leo-Konstante für eine sich wiederholende Propylenoxideinheit (-CH₂CH(CH₃)O-) wäre: 2fC + fCH3 + 3fH + fO + (4 – 1)Fb = 2(0,2) + 0,89 + 3(0,23) + (–1,82) + 3(–0,12) = –0,2
Der Durchschnitts-Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß der Hansch-Leo-Ansatz zur Abschätzung von Teilungskonstanten, wobei in diesem Ansatz die fragmentalen Hansch-Leo-Konstanten angewendet werden, die empirische Teilungskonstante nicht präzise ergibt. Siehe Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, 1979; James, Solubility and Related Properties, Marcel Dekker, New York, 1986, Seiten 320–325. Der Ansatz ist jedoch zur Definition der Hydrophobizitäts-Merkmale des polymeren Freisetzungssystems ausreichend genau.
Die erfindungsgemäß verwendeten Blockcopolymere bilden bevorzugt Mizellen in isotonischen wäßrigen Lösungen bei einer physiologischen Temperatur mit einem Durchmesser von ungefähr 10 nm bis ungefähr 100 nm. Mizellen sind supramolekulare Komplexe bestimmter amphiphiler Moleküle, die sich in wäßrigen Lösungen aufgrund einer Mikrophasentrennung der nicht-polaren Teile der Amphiphile bilden. Mizellen bilden sich, wenn die Konzentration des Amphiphils, für eine gegebene Temperatur, einen CMC erreichen, der für das Amphiphil charakteristisch ist. Durch Veränderung der Größen der hydrophilen und hydrophoben Segmente des Blockcopolymers kann die Tendenz des Copolymers zur Bildung von Mizellen unter physiologischen Bedingungen, als auch die mittlere Größe der unter physiologischen Bedingungen gebildeten Mizellen verändert werden. Diese Tendenzen können auch durch Mischen von Copolymeren mit unterschiedlichen Mischungen von hydrophoben und hydrophilen Blöcken eingestellt werden. Die Mizellen besitzen einen dichten, von den sich wiederholenden wasserunlöslichen Einheiten des Blocks B und lipophilen Teilen eines darin gelösten biologischen Wirkstoffs gebildeten Kern, und eine hydrophile, von den Blöcken A und hydrophoben Teilen des biologischen Wirkstoffs gebildete Hülle. Die Mizellen besitzen Translations- und Rotationsfreiheitsgrade in wäßriger Umgebung und wäßrige, die Mizellen enthaltende Umgebungen besitzen eine niedrige Viskosität ähnlich zu Wasser. Eine Mizellenbildung tritt typischerweise bei Copolymerkonzentrationen von ungefähr 0,0001 bis 5% (Gewicht/Volumen) auf.
Die geringe Größe der durch die erfindungsgemäßen Blockcopolymere gebildeten Mizellen wird als Grund angenommen, der diesen Mizellen das Eindringen in kleine Kapillare und die Aufnahme durch die Zellen erlaubt. Die Mizellen könne auch große Mengen passende biologische Wirkstoffe einlagern. Zum Beispiel können von Pluronic L61 gebildete Mizellen wenigstens 1 mg Doxorubicin pro 2 mg Copolymer einlagern.
Die effektive Retention einer Droge innerhalb der erfindungsgemäßen Mizellen kann als Teilungskoeffizient (P) unter Verwendung der Formel: P = [Wirkstoff]m/[Wirkstoff]aq bestimmt werden, worin [Wirkstoff]_aq die Konzentration des biologischen Wirkstoffs in einer wäßrigen Umgebung außerhalb der Mizellen ist und [Wirkstoff)_m die Konzentration des Wirkstoffs in den Mizellen. In einigen Fällen ist P basierend auf den unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften bestimmter Wirkstoffe, wenn sie in einer wäßrigen gegenüber einer mehr hydrophoben Umgebung vorliegen, abzuschätzen.
Unter einigen Umständen wird es wünschenswert sein zielende Moleküle durch nicht-covalente Assoziation einzulagern. Siehe z. B. Kabanov et al., J. Controlled Release, 22: 141 (1992) und US-Patent Nr. 6153193, gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung am 7. Juni 1995 angemeldet und betitelt „Compositions for Targeting Biological Agents", Anwaltsakte Nr. 313257-103A. Die zielenden Moleküle, die mit der Zusammensetzung assoziiert werden können, besitzen typischerweise eine Zielfunktion mit einer Affinität für eine zelluläre Stelle und eine lipophile Funktion. Die zielenden Moleküle werden sich spontan mit den Mizellen assoziieren und können an diesen durch die lipophile Funktion „verankert" werden. Diese zielenden Moleküle umfassen ungefähr 10% oder weniger der Copolymere in einer Zusammensetzung.
In dem zielenden Molekül kann die lipophile Funktion, unter anderem, eine Lipidgruppe sein, wie eine Fettacylgruppe. in einer bevorzugten Ausführungsform ist die lipophile Funktion ein Kohlenwasserstoff mit von 3 bis 41 Kohlenstoffatomen, stärker bevorzugt ein Kohlenwasserstoff mit von 5 bis 25 Kohlenstoffatomen, noch stärker bevorzugt ein Kohlenwasserstoff mit von 9 bis 17 Kohlenstoffatomen. Andererseits kann sie ein Blockcopolymer oder ein anderes natürliches oder synthetisches Polymer sein. Die zielende Gruppe des zielenden Moleküls umfaßt häufig einen Antikörper, typischerweise mit Spezifität für ein bestimmtes Zelloberflächen-Antigen. Dies könnte z. B. auch ein Hormon mit einer spezifischen Wechselwirkung mit einem Zelloberflächen-Re zeptor sein, oder eine Droge mit einem Zelloberflächen-Rezeptor. Zum Beispiel könnten Glycolipide zum Zielen auf einen Polysaccharid-Rezeptor dienen. Ein nichtbeschränkendes Beispiel einer zielenden Funktion ist der Anti-α2GP-Antikörper gegen Gliazellen des Gehirns (α2-Glycoprotein), der beschrieben ist von Chekhonin et al., FEBS Lett. 287: 149–152, 1991.
Für die Ethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymere stehen die hydrophilen/hydrophoben Eigenschaften und die mizellenbildenden Eigenschaften eines Blockcopolymers mit dem Wert des Verhältnisses, n, in Zusammenhang. Das Verhältnis, n, ist definiert als n = (|B|/|A|) × (b/a) = (|B|/|A|) × 1,32worin |B| und |A| jeweils die Anzahl von sich wiederholenden Einheiten in den hydrophoben und hydrophilen Blöcken des Copolymers sind und b und a die Molekulargewichte für die jeweiligen, sich wiederholenden Einheiten. Der Wert von n wird typischerweise zwischen 0,2 und 9,0 liegen, stärker bevorzugt zwischen 0,2 und 1,5. Wo Mischungen von Blockcopolymeren verwendet werden, wird ein Wert N verwendet werden, wobei dieser Wert den gemittelten Mittelwert von n für jedes der beitragenden Copolymere darstellt, wobei die Mittlung auf den Gewichtsanteilen der Copolymerbestandteile basiert. Der Wert N kann zur Abschätzung der mizellenbildenden Eigenschaften einer Mischung von Copolymeren verwendet werden. Wenn andere Copolymere als Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymere verwendet werden, können ähnliche Ansätze entwickelt werden, um die hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften eines Mitglieds der Klasse der Polymere zu den Eigenschaften eines anderen Mitglieds der Klasse in Beziehung zu setzen.
In der zweiten Ausführungsform werden die polymeren Mizellen bevorzugt von nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Polymeren gebildet.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können über eine Anzahl von Routen verabreicht werden, einschließlich und ohne Beschränkung oral, topisch, rektal, vaginal, über die pulmonale Route, z. B. durch Verwendung eines Aerosols, oder parenteral, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder intravenös. Die Zusammensetzungen können alleine verabreicht werden, oder sie können mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Arnzeimittelträger gemäß pharmazeutischer Standardpraxis kombiniert werden. Für die orale Art der Verabreichung können die Zusammensetzungen in der Form von Tabletten, Kapseln, Pastillen, Pulvern, Sirupen, Elixieren, wäßrigen Lösungen und Suspensionen und dergleichen verwendet werden. Im Fall von Tabletten schließen verwendbare Träger Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure ein. Verschiedene Sprengmittel, wie Stärke, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk, werden gewöhnlicherweise in Tabletten verwendet. Für eine orale Verabreichung in Kapselform verwendbare Verdünnungsmittel sind Lactose und Polyethylenglycole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wäßrige Suspensionen für eine orale Verwendung erforderlich sind, können die Zusammensetzungen mit Emulgations- und Suspensionsmitteln kombiniert werden. Falls gewünscht, können bestimmte Süß- und/oder Aromastoffe zugefügt werden. Für eine parenterale Verabreichung werden gewöhnlich sterile Lösungen des Konjugats hergestellt, wobei die pH-Werte der Lösungen geeigneterweise eingestellt und gepuffert werden. Für eine intravenöse Verwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe so gesteuert werden, daß die Zubereitung isotonisch ist. Für eine okulare Verabreichung können Salben oder tropfbare Flüssigkeiten durch auf dem Gebiet bekannte Okulardosierungssysteme dosiert werden, wie Applikatoren oder Augentropfer. Solche Zusammensetzungen können Mukomimetics enthalten, wie Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Hydroxypropylmethylcellulose oder Poly(vinylalkohol), Konservierungsstoffe, wie Sorbinsäure, EDTA oder Benzylchromchlorid, sowie die üblichen Mengen von Verdünnungsmitteln und/oder Trägern. Zur pulmonalen Verabreichung werden Verdünnungsmittel und/oder Träger geeigneterweise so ausgewählt, daß sie die Bildung eines Aerosols erlauben.
Eine Zäpfchenform der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind verwendbar für vaginale, urethrale und rektale Verabreichungen. Derartige Zäpfchen sind allgemein aus einer Mischung von Substanzen konstruiert, die bei Raumtemperatur fest sind, aber bei Körpertemperatur schmelzen. Die herkömmlicherweise zur Erzeugung solcher Vehikel verwendeten Substanzen schließen Kakaobutter, glycerinierte Gelatine, hydrierte Pflanzenöle, Mischungen von Polyethylenglycolen verschiedener Molekulargewichte und Fettsäureester von Polyethylenglycol ein. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing, Easton, PA, 1980, Seiten 1530–1533, für eine weitere Diskussion der Zäpfchendosierungsformen. Analog können Gele oder Cremes für vaginale, urethrale und rektale Verabreichungen verwendet werden.
Die zur Verwendung im Rahmen dieser Erfindung geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoffe schließen ohne Einschränkung Vincaalkaloide, wie Vincristin und Vinblastin, mitomycinartige Antibiotika, wie Mitomycin C und N–Methyl-Mitomycin C, bleomicynartige Antibiotika, wie Bleomicyn A₂, Antifolate, wie Methotrexat, Aminopterin, und die Deazatetrahydrofolsäure, Colchicin, Demecolin, Etoposid, Taxane, wie Paclitaxel (Taxol^®), Anthracyclinantibiotika und andere ein. Die Anthracyclinantibiotika stellen beispielsweise Drogen mit Zuführproblemen aufgrund einer geringen Stabilität dar, der Entwicklung von Medikamentenresistenz im Zielgewebe oder eines schnellen Metabolismus. Diese Antibiotika enthalten typischerweise ein verbundenes Tetracyclinaglycon-Ringsystem, das an der 7-Position an Daunosamin gebunden ist. Sie schließen z. B. die durch die folgende Formel wiedergegebenen Verbindungen ein:
worin R¹ Hydroxy oder Methoxy ist; R² Wasserstoff oder Hydroxy; und R³ Ethyl, Acetyl, Hydroxyacetyl oder ein Ester von Hydroxyacetyl. Von diesen Tetracyclinantibiotika, wie vielen antineoplastischen Wirkstoffen, wird angenommen, daß sie durch Einschalten zwischen die planaren aromatischen Ringstrukturen der DNA wirken, wodurch sie in die DNA-Replikation eingreifen. Siehe Neidle und Waring, Molecular Aspects of Anti-Cancer Drug Action, Pitman Press, 1983. Neoplastische Zellen sind allgemein besonders empfindlich, da sie aktiv replizieren und somit Replikatkopien ihrer DNA synthetisieren. Derartige Tetracyclinantibiotika schließen ohne Beschränkung Doxorubicin, Daunorubicin, Carminomycin, Epirubicin, Idarubicin, Mithoxoanthron, 4-Dimethoxydaunomycin, 11-Deoxydaunorubicin, 13-Deoxydaunorubicin, Adriamycin-14-benzoat, Adriamycin-14-octanoat oder Adriamycin-14-naphthalinacetat ein.
Bevorzugte Klassen biologischer Wirkstoffe (einschließlich chemotherapeutischer Wirkstoffe) schließen antineoplastische Wirkstoffe, antibakterielle Wirkstoffe, antiparasitäre Wirkstoffe, Antipilz-Wirkstoffe, ZNS-Wirkstoffe, Immunomodulatoren und Cytokine, Toxine und Neuropeptide ein. Biologische Wirkstoffe, gegenüber denen Zielzellen zur Entwicklung von Resistenzmechanismen tendieren, sind ebenfalls bevorzugt. Besonders bevorzugte biologische Wirkstoffe schließen Anthracycline ein, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mithoxanthron oder Carminomycin, Vincaalkaloide, mitomycinartige Antibiotika, bleomycinartige Antibiotika, Azol-Antipilzmittel, wie Fluconazol, Polyen-Antipilzmittel, wie Amphotericin B, mit Taxan verwandte antineoplastische Wirkstoffe, wie Paclitaxel, und Immunomodulatoren, wie Tumornekrosefaktor alpha (TNFα), Interferone und Cytokine. Bevorzugte biologische Wirkstoffe (einschließlich chemotherapeutischer Wirkstoffe) schließen ohne Einschränkung zusätzliche Antipilz-Wirkstoffe ein, wie Amphotericin B, Flucytosin, Ketoconazol, Miconazol, Itraconazol, Griseovulvin, Clotrimazol, Econazol, Terconazol, Butoconazol, Ciclopiroxolamin, Halprogin, Tolnaftat, Naftifin, Nystatin, Natamycin, Undecylsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Propionsäure und Caprylsäure. Derartige Wirkstoffe schließen ferner ohne Beschränkung antivirale Wirkstoffe ein, wie Zidovudin, Acyclovir, Ganciclovir, Vidarabin, Idoxuridin, Trifluridin, Foxcarnet, Amantadin, Rimantadin und Ribavirin. Derartige Wirkstoffe schließen ferner ohne Ein schränkung antibakterielle Wirkstoffe ein, wie zum Penicillin verwandte Verbindungen, einschließlich β-Lactamantibiotika, Breitspektrum-Penicilline und Penicillinase-resistente Penicilline (wie Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Amoxicillin, Ampicillin, Ampicillinsulbactam, Azocillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Carbenicillinindanyl, Cyclacillin, Mezlocillin, Penicillin G, Penicillin V, Piperacillin, Ticarcillin, Imipenem und Aztreonam), Cephalosporine (Cephalosporine schließen Cephalosporine der ersten Generation ein, wie Cephapirin, Cefaxolin, Cephalexin, Cephradin und Cefadroxil; Cephalosporine der zweiten Generation, wie Cefamandol, Cefoxitin, Cefaclor, Cefuroxim, Cefuroximaxetil, Cefonicid, Cefotetan und Ceforanid; Cephalosporine der dritten Generation, wie Cefotaxim, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefoperazon und Ceftazidim), Tetracycline (wie Demeclocytetracyclin, Doxycyclin, Methacyclin, Minocyclin und Oxytetracyclin), beta-Lactamaseinhibitoren (wie Clavulensäure), Aminoglycoside (wie Amikacin, Gentamicin C, Kanamycin A, Neomycin B, Netilmicin, Streptomycin und Tobramycin), Chloramphenicol, Erythromycin, Clindamycin, Spectinomycin, Vancomycin, Bacitracin, Isoniazid, Rifampin, Ethambutol, Aminosalicylsäue, Pyrazinamid, Ethionamid, Cycloserin, Dapson, Sulfoxonnatrium, Clofazimin, Sulfonamide (wie Sulfanilamid, Sulfamethoxazol, Sulfacetamid, Sulfadiazin, und Sulfisoxazol), Trimethoprimsulfamethoxazol, Chinolone (wie Nalidixinsäure, Cinoxacin, Norfloxacin und Ciprofloxacin), Methenamin, Nitrofurantoin und Phenazopyridin. Derartige Mittel schließen ferner gegen Protozoeninfektionen wirksame Wirkstoffe ein, wie Chlorochin, Diloxanidefuroat, Emetin oder Dehydroemetin, 8-Hydroxychinolin, Metronidazol, Chinacrin, Melarsoprol, Nifurtimox, Pentamidin, Natriumstibogluconat und Suramin.
Die Dosierung für einen biologischen Wirkstoff in einer mizellaren Zusammensetzung wird häufig ungefähr die des biologischen Wirkstoffs alleine sein; Dosierungen werden durch den verschreibenden Mediziner unter Berücksichtigung vieler Faktoren einschließlich des Alters, Gewichts und Gesamtzustands des Patienten und die Pharmakokinetik des Wirkstoffs festgelegt. Häufig kann die für eine wirksame Behandlung erforderliche Menge einer mittleren Form eines Wirkstoffs geringer als die bei Verwendung des freien biologischen Wirkstoffs erforderliche Menge sein. Für die Verwendung von Daunorubicin bei der Behandlung von Krebs wird eine typische Dosis ungefähr 1 mg pro kg Körpergewicht sein. Vinblastin wird typischerweise bei einer Dosis von 0,1 bis 0,2 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.
Allgemein werden die in der Erfindung benutzten biologischen Wirkstoffe einem Tier in einer wirksamen Menge verabreicht. Die Wirkung des in der Zusammensetzung verwendeten Copolymers auf die Wirksamkeit muß bei der Bestimmung der wirksamen Menge berücksichtigt werden. Allgemein ist eine wirksame Menge eine Menge, die wirksam ist, um entweder (1) die Symptome der zur Behandlung beabsichtigten Erkrankung verringert oder (2) eine zur Behandlung der zu behandeln getrachteten Erkrankung bedeutende pharmakologische Veränderung induziert. Für Krebs schließt eine wirksame Menge eine wirksame Menge ein zur: Reduktion der Größe eines Tumors; Herabsetzen der Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors; Vorbeugen oder Inhibierung der Bildung von Metastasen; oder Erhöhung der Lebenserwartung des betroffenen Tiers.
In vielen Fällen erzeugen oder verstärken die Metaboliten verschiedener biologischer Wirkstoffe die unerwünschten, von der Verabreichung des Wirkstoffs resultierenden Wirkungen. Dies ist sicherlich der Fall für Medikamente auf Anthracyclinbasis, wo man annimmt, daß Metaboliten zur Cardiotoxizität führen. Siehe Mushlin et al., Br. J. Pharmacol. 110: 975–982, 1993. Die erfindungsgemäßen Copolymer-Zusammensetzungen können die Metabolisierungsrate für biologische Wirkstoffe herabsetzen, wodurch sie das Potential für schädliche Nebeneffekte herabsetzen.
Verschiedene Antipilz-Wirkstoffe behandeln erfolgreich menschliche Pilzinfektionen. Die therapeutische Dosis ist jedoch häufig ein Kompromiß zwischen dem Erzielen wirksamer Arnzeistoffkonzentrationen und der Vermeiden toxischer Nebeneffekte. In den vergangenen Jahren hat das Auftreten von Medikamentenresistenz unter inhärent empfindlichen Spezies, wie Candida albicans, und das verstärkte Auftreten von inhärent medikamentenresistenten Spezies, wie Candida kruset, eine Suche nach neueren Antipilzmitteln veranlaßt.
Obwohl Fluconazol ein geringes Auftreten von Nebenwirkungen besitzt, ist das Auftreten von Resistenz ein zunehmendes Problem. Freisetzungsvehikel, die wirksam bei der Verstärkung der chemotherapeutischen Aktivität und bei der Umkehr von Resistenz gegenüber derartigen Wirkstoffen sind, sind daher für diesen Wirkstoff gewünscht, als auch für andere mikrobielle Wirkstoffe.
Die Erfindung wird in Beispielen durch die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele dargestellt, in denen Pluronics P-85, L-64, F-68 und F108 außerhalb des Rahmens der Ansprüche fallen, aber als Hintergrund und zum Vergleich enthalten sind.
Beispiel 1 – Fettacylkonjugate
Eine Lösung von 50 μl 2 mg/ml Anti-α₂GP-Antikörper spezifisch für das α₂-Glycoprotein von Gliazellen (Chekhomim et al., FEBS Lett. 287: 149–152, 1991) in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) wurde in 2 ml von 0,1 M AOT^® {Natriumbis(2-ethylhexyl)-sulfosuccinat, erhältlich von Serva Chemicals, Deutschland} in Octan gemischt. Eine Reaktion wurde durch Zugabe eines zweifach molaren Überschusses (in Bezug auf das Polypeptid) von Stearinsäurechlorid in 0,2 ml 0,1 M AOT^® in Octan zu der Mischung gestartet. Das Stearinsäurechlorid wurde aus Stearinsäure (erhältlich von Reakhim, Rußland) erhalten, wie beschrieben in Kabanov et al., Molek Biologiya (Russian), 22: 473–484 (engl. Ausgabe: 382–391), 1988. Die Reaktion wurde über Nacht bei 25°C durchgeführt. Das Produkt wird dreimal mit kaltem Aceton ausgefällt, in RPMI 1640-Medium gelöst und steril durch einen 0,22 μm-Filter μmfiltriert. (Der in diesem Experiment verwendete polyklonale Antikörper reagierte ebenfalls mit saurem, fibrillärem Gliaprotein.)
Beispiel 2 – jodierte zielende Funktionen
Anti-α₂GP-Antikörper wurde mit ¹²⁵I unter Verwendung von Bolton-Hunter-Reagens in dem System umgekehrter Mizellen von AOT^® in Octan markiert, wie beschrie ben in Slepnev, V.I., et al., Bioconjugate Chem., 3, 273–274 (1992). Die spezifische Radioaktivität des ¹²⁵I-markierten Proteins reicht von 19 bis 21 Ci/Mol.
Wistar-Ratten (80 g Körpergewicht, 8 Tiere/Gruppe) wurden i. p. (0,1 ml/10 g Körpergewicht) einer Zusammensetzung, hergestellt aus dem ¹²⁵I-markierten Anti-α₂GP-Antikörper (1 mCi/ml), gelöst in einer Mischung von 1,5% (Gewicht/Volumen) Copolymer Pluronic P85 und 2,5% (Gewicht/Volumen) Copolymer Pluronic L64, gelöst in RPMI 1640-Medium, injiziert. Diese Copolymere und sämtliche der in den Beispielen genannten Copolymere wurden von Serva Chemicals, Deutschland, bezogen. ¹²⁵I-markiertes Polypeptid, gelöst in RPMI 1640-Medium, wurde bei derselben Konzentration verabreicht. Nach drei Tagen wurden die Tiere getötet, und Gewebeproben für einen Radioaktivitäts-Assay zur Analyse der Gewebeverteilung entnommen, wie beschrieben von Chekhonin et al., FEBS Lett., 287 149–152 (1991). Die Verteilung der Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationszählung quantifiziert. Die Versuche wurden wenigstens zweimal wiederholt, und die Ergebnisse waren mit einer Variation von weniger als 10% reproduzierbar. Die Ergebnisse, ausgedrückt als das Verhältnis von Gehirnradioaktivität zu der Radioaktivität in einem gegebenen Gewebe (± S.D.) waren wie folgt:
Beispiel 3A – Zytotoxizität gegen resistente Krebszellen
Pluronic P85 wurde in RPMI 1640-Medium (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA) zu einer Endkonzentration von 1% gelöst, wobei die Lösung nachfolgend durch Filtration zur Entfernung einer bakteriellen oder Pilzkontamination sterilisiert wurde. Diese Pluronic P85-Lösung wurde zur Herstellung entsprechender Verdünnungen von sterilen Medikamentenlösungen für die unten beschriebenen Zellkulturexperimente verwendet.
Die Zytotoxizitätsstudien verwendeten die SKOV3-Linie transformierter Zellen (nachfolgend „SK-Zellen") und die davon abstammende SKVLB-Zellinie (nachfolgend „SK-resistente Zellen"). Beide dieser Zellinien wurden von Dr. V. Ling, Universität von Toronto, bereitgestellt. Die SK-resistente Zellinie ist eine mehrfach-arzneimittelresistente Zellinie, die von der SK-Zellinie durch Langzeitkultivation in der Gegenwart von Vinblastin abgeleitet wurde.
Verschiedene Verdünnungen einer Anzahl von Antikrebs-Wirkstoffen wurden in RPMI-Medium oder Pluronic P85-Lösung wie oben beschrieben hergestellt. Zellen wurden zur Verwendung in diesen Experimenten durch Plattieren eines gleichen Volumens einer Zellsuspension (2000 bis 3000 Zellen in die Vertiefungen von 96 Loch-Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA) hergestellt und für 2 Tage kultiviert. Sämtliche Zellkulturen wurden bei 37°C und unter einer 5% CO₂-Atmosphäre durchgeführt. Hiernach wurden 100 μl pro Platte an frischem Medium (RPMI 1630-Medium, ergänzt mit 10% Kalbsfötusserum) zugegeben. Die Verdünnungen des freien Antikrebs-Wirkstoffs oder des Copolymers plus Antikrebs-Wirkstoff wurden auf die Vertiefungen in 100 μl-Volumina angewendet. Die Zellen wurden der freien oder mizellaren Form eines Medikaments für 2 Stunden ausgesetzt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen dreimal mit frischem Medium gewaschen. Nachfolgend wurden die Zellen für weitere 4 Tage unter frischem Medium kultiviert.
Die Anzahl lebensfähiger Zellen für jede Kultur wurde mittels Standard-XTT-Analyse bestimmt, welche die Aktivität von Mitochondrienenzymen mißt. Siehe Scudiero et al., Cancer Res., 48: 4827 (1988). 50 μl pro Vertiefung an sterilem 1 mg/ml XTT (2,3-Bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfonylphenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilid, inneres Salz, Sigma, St Louis, MO) in RPMI-1640 enthaltend 5 μl/ml an 1,54 mg/ml Phenazinmetasulfat (Sigma) in PBS („phosphatgepufferte Salzlösung") wurden zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden für 16 Stunden inkubiert, wonach die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm bestimmt wurde. Das für jeden Wert bestimmte SEM (das Mittel von 3 Bestimmungen) lag immer innerhalb von 10% des Werts. IC₅₀-Werte (d. h. die Konzentration, bei der 50% Inhibierung erzielt wurde) wurde durch Extrapolieren von einer Auftragung der Anzahl lebensfähiger Zellen (d. h. der Mitochondrien-Enzymaktiviät) gegen die auf die Zellen angewendete Medikamentenkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse für SK-resistente Zellen waren wie folgt:
Die Rohdaten, welche die Daunarubicin-Daten in der obigen Tabelle generierten, sind graphisch in 1 dargestellt, wo die Medikamentenkonzentration gegen die prozentuale Inhibierung der Mitochondrienaktivität in SK-resistenten Zellen für das freie Medikament (Linie 1) und die mizellare Form des Medikaments (Linie 2) aufgetragen ist. Die entsprechenden Daten für SK-Zellen sind in 1 für die freien und mizellaren Formen des Daunorubicins dargestellt (jeweils Linien 3 und 4).
Beispiel 3B – mit verschiedenen Wirkstoffen behandelte, SK-resistente Zellen
Die in Beispiel 3A beschriebenen Prozeduren wurden mit SK-resistenten Zellen eingesetzt. Diese Zellen wurden von Dr. V. Ling der Universität von Toronto bereitgestellt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 3C – Kinetik der Daunorubicin-Anreicherung
Die Kinetik der Daunorubicin-Anreicherung in SK-Zellen und SK-resistenten Zellen wurde für mit Daunorubicin bei 10 ng/ml behandelten Zellen durch Messung der in den Zellen akkumulierten Daunorubicin-Fluoreszenz (λex = 471 nm, λem = 556 nm) gemessen. Die Daten der Arzneistoffanreicherung für SK-resistente Zellen ist in 2 dargestellt (Linie 1: freier Arzneistoff; Linie 2: mizellare Form); die Daten für SK-Zellen sind ebenfalls in 2 dargestellt (Linie 3: freier Arzneistoff; Linie 4: mizellare Form).
Beispiel 3D – Doxorubicin-Titrationen unter Verwendung verschiedener Pluronics
In diesen Experimenten wurden die CH' C5-Linie von Eierstockkrebs-Zellen des chinesischen Hamsters verwendet (bereitgestellt von Dr. V. Ling oder der Univ. von Toronto) und die Methodologie von Beispiel 3A. Für Pluronic L61 betrug die Konzentration des auf die Zellen angewendeten Copolymers 0,01% (Gewicht/Volumen); für Pluronic P85 betrug die Konzentration 0,01% (Gewicht/Volumen); für Pluronic F108 betrug die Konzentration 0,01% (Gewicht/Volumen); für Pluronic F68 betrug die Konzentration 5,0% (Gewicht/Volumen). Die IC₅₀-Werte waren:
Beispiel 3E – Copolymertitrationen
Die Verfahrensweise von Beispiel 3A wurde mit Ausnahme von zwei Details verwendet. Der erste Unterschied ist, daß Doxorubicin-resistente MCF7-Zellen (MCF-ADR⁰-Zellen, die näher in Beispiel 21 beschrieben sind) anstelle von SK-Zellen verwendet wurden. Zweitens wurde zusätzlich zu variierenden Doxorubicin-Konzentrationen die Konzentration an Copolymer ebenfalls variiert. Die prozentuale Inhibierung mit Veränderung der Doxorubicin-Konzentrationen ist in für Kulturen dargestellt, die in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Pluronic L61 gehalten wurden. Linie 1 steht für freies Doxorubicin; Linie 2 steht für Doxorubicin in der Gegenwart von 0,61 × 10^–6 M Pluronic L61; Linie 3 ist für Doxorubicin in der Gegenwart von 0,3 × 10^–5 M Pluronic L61; Linie 4 ist für Doxorubicin in der Gegenwart von 0,16 × 10^–4 M Pluronic L61; Linie ist für Doxorubicin in der Gegenwart von 0,8 × 10^–4 M Pluronic L61; Linie 6 ist für Doxorubicin in der Gegenwart von 0,4 × 10^–3 M Pluronic L61; und Linie 7 steht für Doxorubicin in der Gegenwart von 0, 4 × 10^–1 M Pluronic L61. In 3B sind diese Daten konsolidiert, so daß die Figur den IC₅₀-Wert für auf die Zellen angewandtes Doxorubicin in der Gegenwart der angegebenen Konzentration an Pluronic L61 zeigt.
Beispiel 4 – Copolymerzytotoxizität
MCF7-ADR0-Zellen (Doxorubicin-resistente Zellen, beschrieben in Beispiel 21) wurden mit Pluronic L61 bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert und die Zytotoxizität wurde in wie in Beispiel 3A beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3C dargestellt.
Beispiel 5A – Polymerbioverteilung
Radioaktive, Tritium enthaltende Derivate von Pluronic P85-Polymeren wurden vom Kurchatov Atomenergieinstitut, Moskau, Rußland, bezogen. 100 μl pro 20 g Körpergewicht einer 1% Gewicht/Volumen isotonischen Lösung des radioaktiven Copolymers (10⁷ cpm/20 g Körpergewicht) wurden i.v. in (a) BALB/c-Mäuse vom Kriukovo Veterinärdepartement der Russischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Moskau, Rußland) und (b) BALB/c-Mäusen, denen 6 Wochen zuvor 3 × 10⁸ SPC/0^dnr murine Myelomazellen injiziert worden waren (beschrieben in Beispiel 9A), verabreicht. Die Bioverteilung an Polymer zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion des radioaktiven Copolymers wurde durch Opfern behandelter Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen, wobei die in den nachfolgenden Tabellen gelisteten Gewebe herausgetrennt wurden und die Verteilung von Radioaktivität durch die Flüssigszintillationszählung quantifiziert wurde. Zur Herstellung von Gewebeproben zur Flüssigszintillationszählung wurden Proben in 1 ml Gewebeauflöser (erhältlich von Serva Chemicals, Deutschland) gegeben und in der Kälte homogenisiert. Die Homogenisate wurden für 14 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, mit 30 μl 30% Wasserstoffperoxid entfärbt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Für BALB/c-Mäuse, denen injizierte Tumorzellen fehlten, waren die Ergebnisse:
Für BALB/c-Mäuse mit injizierten Tumorzellen waren die Ergebnisse:
Weitere, aus diesem Satz an Experimenten stammende Beobachtungen waren (1) daß Abbauprodukte der Polymere bis 24 Stunden nach Polymeradminstration nicht beobachtet wurden und (2) eine vollständige Entfernung des Polymers von den Mäusen 250 bis 300 Stunden nach der Verabreichung auftrat.
Beispiel 6A – Blutkonzentrationen an Copolymer
100 μl/20 g Körpergewicht des [³H] Pluronic P85 aus Beispiel 4 wurden mittels i.v. Injektion 6 Wochen alten BALB/c-Mäusen verabreicht. 4 zeigt die Menge an im Blut der Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion (dunkle Linie) und in der Leber (gestrichelte Linie) gefundenen Radioaktivität.
Beispiel 6B – Blutkonzentrationen an Copolymer
100 μl/20 g Körpergewicht des [³H] Pluronic P85 aus Beispiel 4 wurden mittels i.v. Injektion oder oral 6 Wochen alten BALB/c-Mäusen verabreicht. Die Menge an in dem Blut der Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gefundenen Radioaktivität ist in 5 dargestellt, wobei der erste Balken in jedem Paar für i.v. injiziertes Polymer steht und der zweite Balken für oral verabreichtes Polymer.
Beispiel 7 – Daunorubicin- und Daunorubicinol-Pharmakokinetik
Der Daunorubicin-Metabolismus wurde mittels HPLC überwacht.
Daunorubicin (Sigma, St. Louis, MO) wurde 7 Wochen alten C57B1/6-Mäusen in einer Konzentration von 10 mg pro kg Körpergewicht unter Verwendung eines Salzlösungsvehikels oder eines 1% Gewicht/Volumen Pluronic P85 enthaltenden Salzlösungsvehikels injiziert. Die Injektionsvolumina betrugen 100 μl pro 20 g Körpergewicht. Zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden die Tiere geopfert und Blut und Leberhomogenisate wurden mit Chloroform : Methanol 9 : 1 extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und in wäßriger 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) wieder aufgelöst. Das gelöste Extrakt wurde auf eine 4,6 × 150 ml C18, Reversphasen HPLC-Säule (15 Micron Ultrasphere, Beckman, CA) injiziert. Die Säule wurde mit einem Acetonitrilgradienten von 0 bis 40 in 0,1% TFA entwickelt und die Spitzen für Daunorubicin und dessen Metabolit Daunorubicinol wurden identifiziert und quantifiziert. 6A zeigt die Konzentration von Daunorubicin in der Leber bei 150 Minuten nach Injektion, wobei Balken A die Konzentration für freies Daunorubicin ( μg pro 10 μg Lebergewebe) und Balken B die Konzentration der Copolymerformulierung zeigt. 6B zeigt den Zeitverlauf der Daunorubicinol-Anreicherung im Blut für Mäuse, denen freies Daunorubicin (Linie 1) oder die Copolymerform (Linie 2) verabreicht wurde. 6C zeigt den Zeitverlauf der Daunorubicin-Anreicherung im Blut für Mäuse, denen freies Daunorubicin (Linie 1) oder die Copolymerform (Linie 2) verabreicht wurde.
Beispiel 8 – akute Toxizität
Die akute Toxizität von Pluronic F108, P85 und L61, wurden in 5 Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen untersucht. Jede Untersuchungsgruppe von Mäusen enthielt 6 Mäuse. Verschiedene Dosen isotoner Pluronic-Lösungen wurden i.p. verabreicht. Die Sterblichkeit der Tiere wurde für 14 Tage täglich aufgezeichnet. Der LD₅₀-Wert und die maximal tolerierte Dosis („MTD", d. h. die maximale Dosis, bei der keine unter den 6 gleichbehandelten Tieren starben) wurde mittels Probitanalyse berechnet. Siehe Chan und Hayes in Principles and Methods of Toxicology, Hayes, A. W., Herausgeber., Raven Press, New York, 1989, Seiten 169–189. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 9A – Tumorbehandlung
Eine mehrfach-medikamentenresistente Tumorzellinie wurde durch mehrfaches Passieren der murinen Myelomazellinie SP2/0 in der Gegenwart von 100 ng/ml Daunorubicin erzeugt. Die resistente Zellinie SP2/0^dnr war zehnfach mehr resistent gegenüber Epirubicin (IC₅₀ = 0,7 μg/ml für die Elternzellinie; IC₅₀ = 8,0 μg/ml für SP2/0^dnr-Linie). Als diese resistenten Zellen zur Bildung von Tumoren in Mäusen verwendet wurden, und, 50 Tage nach der Entwicklung von soliden Tumoren, Zellen von den Tumoren entnommen wurden, zeigten die zurückgewonnenen Zellen dieselbe Resistenz.
Die SP2/0^dnr-Zellen (3 × 10⁶ Zellen) wurden subkutan in 6 Wochen alte BALB/c-Mäuse injiziert. Am Behandlungstag 0, der 14 Tage nach der Injektion von Tumorzellen auftrat, wurden die Mäuse durch i.v. Injektion von 20 μl/20 g Körpergewicht von (1) Salzlösung, (2) einer isotonen Lösung von Epirubicin (5 mg/kg Körpergewicht) oder (3) einer istotonen Lösung von in 1% Pluronic P85 gelöstem Epirubicin (1 mg/kg Körper gewicht) behandelt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als die Veränderung des Verhältnisses der mittleren Volumina der Tumore (V) zu den mittleren Volumina der Tumore am Behandlungstag 0 (V₀) über einen 60-tägigen Verlauf der Behandlung sind in 7 dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Daunorubicin und mit Pluronic L61 und F108 erhalten.
Beispiel 9B – optimale therapeutische Dosis
Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 9A beschrieben wurde verwendet, außer daß die Elternzellinie (SP2/0, eine nicht-resistente Zellinie) verwendet wurde und das verwendete Copolymer und die verwendeten Konzentrationen waren wie folgt:
Für Pluronic F108 wurde die optimale Antitumor-Wirksamkeit unter Verwendung von 10% Copolymer erzielt. Für Pluronic P85 wurde die optimale Antitumor-Wirksamkeit unter Verwendung von 1% Copolymer erzielt. Für Pluronic L61 wurde die optimale Antitumor-Wirksamkeit unter Verwendung von 0,1% Copolymer erzielt. Diese Werte wurden als die optimalen therapeutischen Dosen (OTDs) für die jeweiligen Copolymere bezeichnet.
Beispiel 9C – Zeitverlauf bei Verwendung von OTD-Mengen an Copolymer
Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 9B wurde unter Substitution der OTD-Menge von jedem von Pluronic F108, Pluronic P85 und Pluronic L61 als Vehikel für Epirubicin durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt (Die Ordinate zeigt V/V₀).
Beispiel 10
Pluronic F68 wurde bei 4°C mit RPMI 1640-Medium auf eine Endkonzentration von 2,0% verdünnt. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mittels Filtration durch einen 0,22 μm-Filter sterilisiert. Ein gleiches Volumen einer Lösung von 200 μg Daunorubicin in RPMI 1640-Medium wurde zugegeben, und diese Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Humane Eierstockkrebs-Zellen (CRL157-Zellen) wurden in 1% Lösung des Pluronic F68 in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum, vorkultiviert. Die Daunorubicin-Pluronic-Lösung wurde dreimal mit RPMI 1640 gewaschen und in RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum, für 3 Tage kultiviert. Die Zytotoxizität wurde gemessen, sowohl für diese Zubereitung als auch für eine Parallelzubereitung frei von Daunorubicin, wobei das Verfahren von Alley et al., Cancer Res., 48, 589–601 (1988) verwendet wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Derselben Verfahrensweise folgend wurde die Zytotoxizität gegen humane T-Lymphoma (Jurkat)-Zellen bestimmt
Derselben Verfahrensweise folgend wurde die Zytotoxizität gegen humane Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms (H-69) bestimmt:
Beispiel 11
Blockcopolymere von Poly(oxyethylen)-Poly(oxypropylen) mit den unten angegebenen Verhältnissen von Poly(oxypropylen) zu Poly(oxyethylen) wurden bei den unten angegebenen Konzentrationen in RPMI 1640-Medium dispergiert. Die Mischungen wurden bei 30°C für 40 Minuten inkubiert. Der mittlere Mizellendurchmesser wurde mittels quasi-elastischer Lichtstreuung gemessen. Siehe Kabanov et al., Macromolecules 28: 2303–2314, 1995. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 12
Eine 1 : 1,5-Mischung von Pluronic P85 und Pluronic L64 mit individuellen Verhältnissen (n) von (Oxypropylen)- zu (Oxyethylen)-Blöcken von jeweils 1,00 und 1,50, und einem kombinierten Wert (N) von 1,30 wurde mit RPMI 1640-Medium bei 4°C auf eine Endkonzentration von 2,0% verdünnt. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mittels Filtration durch einen 0,22 μm-Filter sterilisiert. Ein gleiches Volumen einer Lösung von 200 μg Daunorubicin in RPMI 1640-Medium wurde zugegeben, und diese Mischung wurde bei 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Zytotoxizität gegenüber humanen Eierstockkrebs-Zellen (CRL157-Zellen) wurde gemessen, sowohl für diese Zubereitung als auch für eine parallele, von Daunorubicin freie Zubereitung, wie in Beispiel 3A beschrieben. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Die Daunorubicin-Zusammensetzungen wurden hinsichtlich der Zytotoxizität in (i) humanen T-Lymphoma (Jurkat)-Zellen und in (ii) normalen humanen mononuklearen Zellen evaluiert. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 13
Die IC₅₀-Werte für (i) humane T-Lymphoma (Jurkat)-Zellen und (ii) normale humane, mononukleare Zellen wurden für die Daunorubicin-Zusammensetzung aus Bei spiel 12 bestimmt und mit denen für freies Daunorubicin verglichen. Die Messung wurde bei den angegebenen Intervallen des Arzneistoffkontaktes mit der Zelle durchgeführt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 14
Der antineoplastische Wirkstoff Vinblastin wurde in die in Beispiel 12 beschriebene Blockcopolymermischung eingebracht. Der IC₅₀ dieser Zubereitung gegen SK-Zellen wurde zu 0,121 μg pro ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 0,0012 μg/ml. Die IC₅₀-Werte für freies Vinblastin wurden zu 0,095 μg pro ml gegen SK-Zellen und 0,615 μg gegen SK-resistente Zellen bestimmt.
Beispiel 15
Der antineoplastische Wirkstoff Mitomycin C wurde in die in Beispiel 12 beschriebene Blockcopolymermischung eingebracht. Der IC₅₀ dieser Zubereitung gegen SK-Zellen wurde zu 0,265 μg/ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 0,005 μg pro ml. Der IC₅₀ von freiem Mitomycin C gegen SK-Zellen wurde zu 0,320 μg pro ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 1,120 μg pro ml.
Beispiel 16
Der antineoplastische Wirkstoff Methotrexat wurde in die in Beispiel 12 beschriebene Blockcopolymermischung eingebracht. Der IC₅₀ dieser Zubereitung gegen SK-Zellen wurde zu 0,880 μg pro ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 0,0175 μg pro ml. Der IC₅₀ von freiem Methotrexat gegen SK-Zellen wurde zu 1,090 μg pro ml bestimmt; und gegen SK-resistente Zellen betrug er 1,340 μg pro ml.
Beispiel 17
Der antineoplastische Wirkstoff Colchicin wurden die in Beispiel 12 beschriebene Blockcopolymermischung eingebracht. Der IC₅₀ dieser Zubereitung gegen SK-Zellen wurde zu 0,720 μg pro ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 0,045 μg pro ml. Der IC₅₀ von freiem Colchicin gegen SK-Zellen wurde zu 0,950 μg pro ml bestimmt; und gegen SK-resistente Zellen betrug er 7,450 μg pro ml.
Beispiel 18
Der antineoplastische Wirkstoff Daunorubicin wurde in die in Beispiel 12 beschriebene Mischung des Blockcopolymers eingebracht. Der IC₅₀ dieser Zubereitung gegen SK-Zellen wurde zu 0,600 μg pro ml bestimmt; der IC₅₀ gegen SK-resistente Zellen betrug 0,0068 μg/ml. Der IC₅₀ von freiem Daunorubicin gegen SK-Zellen wurde zu 0,620 μg pro ml bestimmt; und gegen SK-resistente Zellen betrug er 5,850 μg pro ml.
Beispiel 19
Zu 30 μl einer 20 ml/ml-Lösung von bovinem Serumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung wurden 30 ml Daunorubicin-Lösung in der in Beispiel 12 beschriebenen Blockcopolymermischung gegeben. Eine zweite Formulierung wurde auf gleiche Weise unter Verwendung von freiem Daunorubicin hergestellt.
Die Zubereitungen wurden für 10 Minuten bei 25°C inkubiert und nachfolgend mittels HPLC an einer TSK-3000 SW-Gelfiltrationssäule in PBS, enthaltend 0,3 M Natriumchlorid und 5% Acetonitril, analysiert. Die Detektion erfolgte bei 280 nm und 470 nm. Der Anteil des an BSA gebundenen Arzneistoffs wurde bestimmt als: DB = SB/Sfworin:
Sb die relative Fläche der 470 nm-Kurve (entsprechend Daunorubicin) ist, welche in der Retentionszeit mit der 280 nm-Spitze (entsprechend BSA) übereinstimmt; und
Sf die relative Fläche der Kurve (oder der Kurven) ist, die dem Daunorubicin entspricht, welches in der Retentionszeit nicht der BSA-Kurve entspricht.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 20
Wie in Beispiel 12 beschrieben erhaltenes Daunorubicin in Mizellenform und freies Daunorubicin wurden im Dunkeln bei 37°C inkubiert und die Zytotoxizität gegenüber CRL157-Zellen (humanen Eierstock-Krebszellen) wurde nachfolgend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise bestimmt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 21
Die Daunorubicin-Zusammensetzung aus Beispiel 12 und freies Daunorubicin wurden gegen Daunorubicin empfindliche humane Brustkrebszellen (MCF7-Zellen) und gegen zwei medikamentenresistente Zellinien evaluiert: Daunorubicin/Verapamil-resistente (MC-7AU), P-170 nicht exprimierend, und Daunorubicin-resistente, Verapamilempfindliche (MCF-7ADR0), PR-170 exprimierend. Diese Zellen wurden durch die Zellbank des Moscow Research Center of Molecular Diagnostics, Moskau, Rußland, bereitgestellt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Freies Daunorubicin zeigt höhere IC50-Werte (ist weniger toxisch) gegen beide resistente Linien. In die Blockcopolymere eingebrachtes Daunorubicin zeigte niedriger IC50-Werte (ist toxischer) gegen beide resistente Linien.
Beispiel 22
Gruppen (6 Tiere/Dosis) von 7 Wochen alten weiblichen C57B1/6-Mäusen wurden i.p. mit freiem oder mizellarem Daunorubicin, erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, geimpft. Die Mäuse wurden über 14 Tage beobachtet. Die Arzneimittelkonzentrationen wurden so eingestellt, daß jeder Maus ein maximales Volumen von 0,5 ml injiziert wurde.
Die MTD wurde als die maximale Dosis definiert, welche zu keinem Daunorubicin-Versterben führt (jede höhere Dose führt zu einem mit Daunorubicin im Zusammenhang stehenden Tod von wenigstens einem Tier pro Gruppe). Das Experiment wurde zweimal wiederholt. Die Ergebnisse waren mit weniger als 10% Variation reproduzierbar.
Die MTD von freiem und mizellärem Daunorubicin wurde jeweils zu 2,0 und 1,0 μg pro kg Kilogramm Körpergewicht bestimmt.
Beispiel 23
Daunorubicin ruft eine Knochenmarksrepression hervor und führt zu reversibler Leukopenie, d. h. einer Abnahme der Zahl weißer Blutzellen (Leukozytenzählung) während der Verabreichung des Arzneistoffs. Eine Knochenmarkssuppression, als auch Antikrebswirkungen von Daunorubicin werden als auf DNA verknüpfender Aktivität beruhend angenommen, wohingegen die schädlichsten Nebenwirkungen von Anthracyclinen, Cardiotoxizität, als Ergebnis hauptsächlich von Metaboliten (welche eine geringe Antikrebsaktivität besitzen und keine signifikanten Wirkungen auf das Knochenmark erzeugen) beruhen. Die Leukozytenzählung während der in vivo-Verabreichung einer MTD von Daunorubicin erlaubt somit die Abschätzung des Verhältnisses zwischen spezifischer (DNA-Einschub) Aktivität des Arzneistoffs und nicht-spezifischer Toxizität.
Gruppen (6 Tiere/Gruppe) von 7 Wochen alten weiblichen C57B1/6-Mäusen wurden i.p. mit wie in Beispiel 12 erhaltenem freiem oder mizellarem Daunorubicin geimpft. Die MTD für die jeweilige Formulierung umfassenden Arzneistofformulierungen wurden so eingestellt, daß ein maximales Volumen von 0,5 ml in jede Maus injiziert wurde. Blutproben wurden gesammelt und lebensfähige Leukozyten wurden gezählt, wie beschrieben in Michisch et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 547–551 (1991). Die Anzahl an WBC (weißen Blutzellen) nach Verabreichung von 0,1 ml PBS wurde als Kontrolle verwendet. Dieser Wert betrug 15 bis 16 Millionen Zellen/ml. Das Experiment wurde zweimal wiederholt. Die Ergebnisse waren mit einer Variation von weniger als 10% reproduzierbar.
Die erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 24
Die Wirkungen von wie in Beispiel 12 beschrieben erhaltenem freiem und mizellarem Daunorubicin auf die Leukozytenzählung wurde 3 Tage nach der Verabreichung wie in Beispiel 23 beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Die in den Beispielen 22 bis 24 dargestellten Daten deuten darauf hin, daß die Lösung von Daunorubicin in den Blockcopolymermizellen die Gesamttoxizität des Arzneistoffs (MTD von 2 mg/kg) und 1 mg/kg jeweils für freien und mizellären Arzneistoff) nicht merklich beeinflußt, wohingegen die Lösung die Knochenmarkssuppression erhöht, was auf eine Erhöhung der Antikrebspotenz deutet.
Beispiel 25
Die antineoplastische Aktivität wurde durch Bewertung der zytotoxischen Aktivität von Säugetierplasma bestimmt, das mit den Testzusammensetzungen geimpft worden war (siehe de Valeriola et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 29, 133–140, 1991).
Gruppen (6 Tiere/Gruppe) von 7 Wochen alten C57B1/6-Mäusen wurden i.v. (über die Schwanzvene mit wie in Beispiel 12 beschriebenem freiem oder mizellarem Daunorubicin geimpft. Die MTD für die jeweilige Formulierung aufweisenden Arzneistoffformulierungen wurden so eingestellt, daß ein maximales Volumen von 0,1 ml in jede Maus injiziert wurde. Das Experiment wurde zweimal wiederholt. Die Ergebnisse waren mit weniger als 10% Variation reproduzierbar.
Zum Erhalt von Plasmaproben wurde Blut (10 μl) eine Stunden nach der Arzneistoffverabreichung von der Schwanzarterie gesammelt, 1 : 10 mit sterilem RPMI 1640-Medium verdünnt und bei 400 g für 15 Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten wurden wie in der Tabelle dargestellt mit Plasma verdünnt, das auf analoge Weise von nicht mit dem Arnzeistoff geimpften Mäusen erhalten wurde (das Plasma von nicht mit dem Arzneistoff geimpften Mäusen erzeugt keinen signifikant zytotoxischen Effekt auf H-69-Zellen), und mit einem gleichen Volumen an einer Suspension von H-69-Zellen in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum, gemischt. Die Zellen wurden für 2 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert und nachfolgend dreimal mit RPMI 1640 gewaschen. Die vorbehandelten Zellen wurden in mit 10% fetalem Kalbsserum ergänztem RPMI 1640 bei 37°C und 5% CO₂ für drei
Tage inkubiert, wonach die Zytotoxizität wie in Beispiel 10 beschrieben bestimmt wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt:
Das Serum von mit der mizellaren Formulierung behandelten Mäusen besaß somit eine größere zytotoxische Potenz.
Beispiel 27
Das Verfahren von Beispiel 25 wurde unter Verwendung von SK-Zellen und SK-resistenten Zellen wiederholt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

a) Wenn eine Dosis entsprechend der MTD einer Formulierung von Daunorubicin in die Mäuse eingeführt und die Zytotoxizität des resultierenden Plasmas gemessen wurde, waren die Ergebnisse folgende:
b) Wenn 10 mg Daunorubicin in jede Maus eingebracht wurde, waren die resultierenden Plasmazytotoxizitäten die folgenden:

Beispiel 27 – Fluconazolbehandlung von Candida
Kulturmedien
Das für die Empfindlichkeitsuntersuchung verwendete Medium war ein hochauflösendes (HR-) Medium. Dieses Medium ist optimal für die Untersuchung von Fluconazol und wird in zwei Teilen wie folgt hergestellt. Teil A umfaßt 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5, hergestellt unter Verwendung von NaHP₂O₄ und mittels Autoklavieren sterilisiert. Teil B umfaßt 2,93 g von HR-Pulver (Unipath) und 0,2 g Natriumbicarbonat, gelöst in 100 ml deionisiertem Wasser, was nachfolgend durch Filtration sterilisiert und bei 4°C gelagert wird. Vor der Verwendung werden gleiche Mengen von Teil A und B gemischt.
Organismen
Die in dieser Untersuchung verwendeten Organismen waren frische klinische Isolate von Candida-Spezies oder Kontrollorganismen, die zur Routine-Empfindlicheitsuntersuchung von Antipilz-Wirkstoffen verwendet werden. Die Isolate wurden so ausgewählt, daß sie einen Bereich von Fluconazol-Sensitivitäten abdecken, der von Fluconazol-empfindlich (minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von 0,2 μg/ml) bis Fluconazol-resistent (MIC von 100 μg/ml) reicht. Sämtliche Isolate wurden auf Sabou rauds Agar subkultiviert und vor der Empfindlichkeitsuntersuchung für 48 Stunden inkubiert.
Herstellung von Hefesuspensionen
Suspensionen der Hefe wurden durch Berühren von fünf Individualkolonien und den Suspensionen in sterilem Wasser hergestellt, um eine leicht trübe Suspension zu ergeben. Diese Suspension wurde dann 1 : 100 in HR-Medium verdünnt, um eine 2 × 10⁴ Organismen pro ml enthaltende Suspension zu ergeben.
Polymer/Fluconazol-Komplexe
Polymere wurden von Serva Chemicals, Deutschland, bezogen. Komplexe von Polymer mit Fluconazol wurden hergestellt. Vor der Verwendung wurde jede Lösung durch einen 0,4 μm-Filter (Sartorius) zum Sicherstellen der Sterilität filtriert.
Herstellung von Fluconazol/Polymer-Verdünnungen.
Fünf Polyether-Blockcopolymere wurden anfänglich zur Untersuchung der Wirksamkeit von Fluconazol in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Polymer bewertet. Verdünnungen von Fluconazol/Polymer-Lösungen wurden mit dasselbe Copolymer enthaltenden Lösungen hergestellt. Durch eine derartige Verdünnung wurden 1250 μg pro ml Fluconazol enthaltende Lagerlösungen hergestellt. Diese Lagerlösungen wurden weiter in Polymer verdünnt, um einen Bereich von Fluconazol-Konzentrationen von 1250 bis 2,5 μg pro ml zu ergeben. Als Kontrolle wurde Fluconazol in Wasser gelöst, um einen Bereich von Konzentrationen von 1250 bis 2,5 μg pro ml zu ergeben.
Untersuchung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)
Zur MIC-Untersuchung wurden 8 μl jeder Verdünnung von Fluconazol in Polymer oder in Wasser in die Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte gegeben. Zwei Kontrollsätze, enthaltend entweder 8 μl Wasser oder 8 μl von Fluconazol freiem Polymer wurden auch angelegt. Die erstgenannte diente als eine Arzneistoff-freie Kontrolle; die letztgenannte vermittelte jede Wirkung des Polymers auf die Hefe. HR-Medium wurde dann zu jeder Vertiefung gegeben, um das Volumen auf 100 μl zu bringen. Schließlich wurden 100 μl jeder Hefesuspension zu der jeweiligen Reihe von Fluconazolverdünnungen gegeben. Jede Hefesuspension wurde auf Blut-Agar und Sabourauds Agar geimpft, um Reinheit sicherzustellen und als eine Überprüfung der Inoculierungsgröße. Jede Hefe wurde daher bei Endkonzentrationen von 50 μl/ml bis 0,1 μl/ml in fünf verschiedenen Polymeren oder in Wasser gegen Fluconazol getestet. Die Polymer-Endkonzentration in jeder Vertiefung betrug 4% und die Hefe-Endkonzentration betrug 1 × 10⁴ Organismen/ml. Die Platten wurden vorsichtig gemischt und nachfolgend für 48 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Die Platten wurden visuell nach 24 Stunden untersucht. Nach 48 Stunden wurden die Platten auf einem Rotationsmixer für 5 Minuten geschüttelt, um die Hefezellen zu suspendieren, wobei nachfolgend das OD490 unter Verwendung von sterilem Kulturmedium als Nullwert gemessen wurde.
Interpretation der MIC
Für jeden Organismus wurde das Wachstum in der Arzneistoff-freien positiven Kontrollvertiefung bestimmt, wobei dies nachfolgend mit der Polymer-Kontrollvertiefung verglichen wurde, wenn das OD490 der Polymer enthaltenden Vertiefung < 90% des OD490 der Kontrollvertiefung war, wurde das Polymer als eine inhärente inhibierende Wirkung auf den Organismus angenommen und das MIC-Ergebnis war ungültig. Wenn der OD490 der Polymerkontrolle > 90% der positiven Kontrolle war, wurde angenommen, daß keine inhibierende Wirkung auftritt und der Rest der Ergebnisse wurde interpretiert.
Für jedes Polymer und jeden Organismus wurde die MIC als die niedrigste Fluconazol-Konzentration genommen, die das Wachstum (OD490) um < 50% der OD490-positiven Kontrolle reduziert. Die folgenden Unterbrechungspunkte wurden für Isolate in dieser Studie verwendet: < 6,2 μg/ml – sensitiv, 6,2 und 12,5 μg/ml – mittlere Sensitivität und > 12,5 μg/ml – resistent. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 28 – die Aktivität von TNFα
Die zytotoxische Aktivität von TNFα in Bezug auf resistente SK-Zellen wurde unter Verwendung des in Beispiel 3A beschriebenen XTT-Assays bestimmt. TNFα wurde bei verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden zu Zellen gegeben: 1) freies TNFα; b) TNFα in 0,1% Pluronic P85 und c) TNFα in 0,01% Pluronic L61. Nach 24 Stunden Inkubation mit TNFα wurden die Zellen mit RPMI 1640 gewaschen und mittels XTT-Assay analysiert. Sämtliche experimentellen Punkte waren dreifach. Die Daten waren Mittelwerte ± SEM. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Beispiel 29 – Behandlung eines experimentellen Gliomatumors
Die Antikörper (Ab) gegen GFAP und α2-Glycoprotein wurden mit Stearinsäureresten wie in Beispiel 1 beschrieben modifiziert. Sie wurden auch kovalent mit Pluronic P85 verbunden, wie beschrieben von Kabanov et al., J. Controlled Release, 22: 141(1992).
Die therapeutische Wirksamkeit von Doxorubicin bei der Behandlung von Glioma wurde untersucht. C6-Gliomazellen wurden intrazerebral in Gruppen (n = 25) von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (280–300 g), erhalten vom Kriukovo Department of Nursery der Russischen Akademie der Wissenschaften, geimpft. 10, 15, 20 und 25 Tage nach dem Impfen wurden (a) 10 mg/ml freies Doxorubicin, (b) Doxorubicin in 1% Pluronic P85, (c) Doxorubicin in 10% Pluronic P85, enthalten 0,1 mg/ml Ab, modifiziert mit Stearinsäurechlorid, und (d) Doxorubicin in 10% Pluronic P85, enthaltend 0,1 mg/ml Ab, verbunden mit Pluronic P85, i.p. verabreicht (Volumen 1 ml/300 Körpergewicht). Kontrollen werden i.p.-Injektionen mit einem gleichen Volumen Salzlösung gegeben. Klinische Beobachtungen wurden täglich durchgeführt. Die Tiere wurden wöchentlich in den ersten 2 Monaten gewogen und danach monatlich. Lebenszeichen werden zur Sicherstellung, daß das Tier tot war, verifiziert und eine Nekropsie innerhalb von 5 Minuten nachdem das Tier starb, begonnen. Überlebensdaten wurden analysiert, um die Arnzeistoffwirkungen auf Tumorinzidenz und -latenz einzuteilen. Die Daten wurden als ein Verhältnis von mittleren Überlebenszeiten in der behandelten Gruppe (T) und (C) präsentiert. Für die Nekropsie wurden sämtliche Hauptorgane gesammelt und in ihrer Gesamtheit fixiert. Der Schwanz (in der Studie während der Lebensphase für die Tieridentifikation verwendet) wurde mit den Tiergeweben in Formalin aufbewahrt. Sämtliche Gehirne wurden entfernt und an drei unterschiedlichen Positionen geschnitten. Drei Abschnitte des Rückenmarks wurden auf dem cervikalen, Thorax- und Lumbal-Level gesammelt. Geschnittene Proben wurden in Tissue Tek-Kassetten gegeben und in einem Gewebeprozessor verarbeitet. Gewebeschnitte wurden auf eine Dicke von 4–6 μm unter Verwendung eines Mikrotoms geschnitten und mit Hämatoxilin-Eosin gefärbt. Histopathologische Untersuchungen des Gehirns bestimmten: (i) die Gesamtanzahl von Tumoren in den Tieren; (ii) die Anzahl tumortragender Tiere; und (iii) die histopathologische Klassifikation und Einteilung der Tumore. Die Ergebnisse der Experimente waren wie folgt:
Die histopathologischen Untersuchungen zeigten ferner, daß 1) freies Doxorubicin keine Wirkung auf Tumorgröße und -anzahl im Vergleich zur Kontrolle bewirkte, 2) alle drei mizellaren Formulierungen signifikant Verringerungen in Tumorgröße und -anzahl bewirkten, 3) die stärkste Wirkung im Falle von mizellarem Doxorubizin + stearoylierten Antikörpern beobachtet wurde, wobei in diesem Fall Tumore praktisch nicht beobachtet wurden.
Beispiel 30 – Inhibierung von metastatischen Prozessen.
Lewis Lungenkarzinom H59-Zellen (2 × 10⁵) wurden subkutan in 6 Wochen alte männliche C57B1/6-Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden mittels Überexponierung mittels CO₂ am Tag 21 geopfert, und die Anzahl und Größe metastatischer Tumore wurde bestimmt wie beschrieben von Wilmanns, C; Fan, D.; O'Brian, C.A., et al. (1992) Int. J. Cancer last. 52, 98–104. Die Krebszelleninjektion resultierte in der Bildung eines soliden Tumors an der Injektionsstelle und metastatischer Tumore in Lunge und Leber. Tumorproben von 2 Mäusen wurden gesammelt und zum Kultivieren adaptiert, wie beschrieben von Dong, Z.; Radinsky, R; Fan, D.; Tsan, R.; Bucana, C. D.; Wilmanns, C., und Fidler, I. J. (1994), Int. J. Cancer Inst. 86, 913–920. Die in vitro-Sensitivität der Zellproben gegenüber freiem und mizellarem Doxorubicin (in 0,01% Pluronic L61) wurde unter Verwendung des XTT-Assays wie in Beispiel 3A beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in 9 wiedergegeben. Die metastatischen Zellen in der Lunge wurden mittels Resistenz gegenüber freiem Doxorubicin charakterisiert. Diese Resistenz wurde im Fall des mizellären Arzneistoffs umgekehrt. Die metastatischen Zellen in der Leber waren empfindlich gegenüber dem freien Arzneistoff, wobei ihr IC₅₀ sich dem in der H59-Vorfahrenzellinie näherte. Die Zytotoxizität des mizellaren Arzneistoffs in Bezug auf die Lebermetastasen-Zellen war immer noch bedeutend höher als die Zytotoxizität des freien Arzneistoffs.
Beispiel 31
Eine zur parenteralen Verabreichung geeignete Zusammensetzung wurde durch Auflösen von 400 mg Pluronic P85 und 600 mg Pluronic L64 in 50 ml RPMI 1640 bei 4°C hergestellt. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und nachfolgend durch Filtration durch ein 0,22 μm-Filter sterilisiert. Die filtrierte Lösung wurde mit einer Lösung von 10 mg von sterilem, lyophilisiertem Daunorubicinpulver, aufgelöst in 50 ml RPMI, gemischt, und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Zusammensetzung kann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 7 Tage ohne Verlust an Aktivität gelagert werden, oder sie kann lyophilisiert und für wenigstens 1 Jahr im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert werden.
Beispiel 32
Eine weiter, zur parenteralen Verabreichung geeignete Zusammensetzung wurde durch Auflösen von 400 mg Pluronic P85 und 600 mg Pluronic L64 in 50 ml PBS bei 4°C hergestellt. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und nachfolgend durch Filtration durch einen 0,22 μm-Filter sterilisiert. Die filtrierte Lösung wurde mit einer Lösung von 1 mg sterilem, lyophilisiertem Daunorubicin-Pulver und 5 mg Glucose, gelöst in 50 ml PPS, gemischt, und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Zusammensetzung kann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 7 Tage ohne Verlust an Aktivität gelagert werden, oder sie kann lyophilisiert und für wenigstens 1 Jahr im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert werden.
Beispiel 33
Eine weitere, zur parenteralen Verabreichung geeignete Zusammensetzung wurde durch Auflösen von 100 mg Natriumascorbat in 100 ml eine 9%-igen wäßrigen Lösung von Natriumchlorid hergestellt. Zu einer Hälfte dieser Lösung wurden bei 4°C 400 mg Pluronic P85 und 600 mg Pluronic L64 gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und nachfolgend durch Filtration durch ein 0,22 μm-Filter sterilisiert. Separat wurden 10 mg steriles, lyophilisiertes Daunorubicin-Pulver und 50 mg Glucose in der verbleibenden Natriumascorbat-Natriumchlorid-Lösung gelöst, und die zwei Lösungen wurden gemischt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Diese Zusammensetzung kann für 30 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur ohne Verlust an Aktivität gelagert werden, oder sie kann lyophilisiert und wenigsten 1 Jahr im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert werden.
Beispiel 34
Eine weitere Zusammensetzung, geeignet für eine parenterale Verabreichung, wird durch Auflösen von 100 mg Natriumascorbat in 100 ml eine 9%-igen wäßrigen Lösung von Natriumchlorid hergestellt. Zu dieser Lösung werden bei 40°C 10 mg Pluronic L61 gegeben. Die Mischung wird für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und nachfolgend durch Filtration durch ein 0,22 μm-Filter sterilisiert. Diese Lösung wird zusammen mit einem Container von 10 mg Doxorubicin verpackt.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung umfassend: (a) ein chemotherapeutisches Antikrebsmittel; und (b) ein Polyether-Block-Copolymer der folgenden Formel:
worin m und n ganze Zahlen zwischen 4 und 400 sind, mit einer kritischen mizellaren Konzentration (critical micellar concentration CMC) von nicht mehr als 0,5% Gewicht/Volumen bei 37°C in einer isotonischen wässrigen Lösung, und wobei die hydrophoben Gewichtsanteile des Polyether-Block-Copolymers mindestens 70% betragen; zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung: (i) Mizellen umfasst, welche das Polyether-Block-Copolymer umfassen, oder (ii) während der Verabreichung an ein Tier oder anschließend daran Mizellen bildet, welche Polyether-Block-Copolymer umfassen.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei sich vor oder während der Verabreichung mindestens 0,1% des Antikrebsmittels in den Mizellen befindet.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei sich vor oder während der Verabreichung mindestens 1% des Antikrebs- oder biologischen Mittels in den Mizellen befindet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe Molekulargewicht des Polyether-Block-Copolymers mindestens 900 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das hydrophobe Molekulargewicht des Polyether-Block-Copolymers mindestens 1700 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die die Zusammensetzung umfassenden Polyether-Block-Copolymere bei 37°C in einer isotonischen wässrigen Lösung eine CMC von 0,05% Gewicht/Volumen oder weniger aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die die Zusammensetzung umfassenden Polyether-Block-Copolymere bei 37°C in einer isotonischen wässrigen Lösung eine CMC von 0,01% Gewicht/Volumen oder weniger aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe Molekulargewicht des Polyether-Block-Copolymers zwischen 1500 und 2000 beträgt und die hydrophoben Gewichtsanteile zwischen 85% und 95% betragen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das chemotherapeutische Antikrebsmittel ein Vinca-Alkaloid, ein Antibiotikum des Mitomycin-Typs, ein Antibiotikum des Bleomycin-Typs, Antifolat, Colchicin, Demecolin, Etoposid, Taxan oder ein Anthracyclin-Antibiotikum ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das chemotherapeutische Antikrebsmittel Doxorubicin, Daunorubicin, Carminomycin, Epirubicin, Idarubicin, Mithoxanthron, 4-Demethoxy-daunomycin, 11-Deoxydaunorubicin, 13-Deoxydaunorubicin, Adriamycin-14-benzoat, Adriamycin-14-octanoat oder Adriamycin-14-naphthalenacetat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, wobei der Patient gegen das Antikrebsmittel resistent ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung oder Verhinderung von Tumormetastasen.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Krebs Leukämie, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungenkrebs, Myolom, Melanom, Gliom oder Astrocytom ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Krebs ein Hodgkins Lymphom, ein Nicht-Hodgkins Lymphom, ein akutes lymphozytisches Lymphom, ein akutes myolocytisches Lymphom, eine nichtlymphatische Leukämie, ein Kaposisarkom, ein Kleinzellen-Lungenkrebs, ein Nicht-Kleinzellen-Lungenkrebs oder ein gliales Astrocytom ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das chemotherapeutische Antikrebsmittel eine wirksame Menge mindestens eines cytotoxischen Arzneimittels umfasst, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Anthracyclin und Arzneimitteln, die mit Mehrfachresistenz gegen Arzneimittel zusammenhängen, zur Überwindung einer Mehrfachresistenz in Krebszellen gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels, um eine Mehrfachresistenz in Krebszellen gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln bei der Behandlung eines Krebses mit diesen cytotoxischen Arzneimitteln zu überwinden.