CN102014870A

CN102014870A - 活性的一氧化氮供体及其制备和应用的方法

Info

Publication number: CN102014870A
Application number: CN2009801148198A
Authority: CN
Inventors: P·J·沙米; K·M·科萨克
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2011-04-13
Also published as: CA2717867C; US9005656B2; CA2717867A1; WO2009114368A2; WO2009114368A3; US9439915B2; US20150290224A1; JP5529762B2; EP2262478B1; KR20110005798A; JP2011513424A; US20110182978A1; EP2262478A2

Abstract

本文描述了用于抗癌治疗和预防的组合物。该组合物包含(a)O²-芳基取代的二醇二氮烯和(b)两亲化合物，其中两亲化合物的数量足以产生脂质体或胶束。本文所述的组合物提供了很多优点，诸如提高O²-芳基取代的二醇二氮烯体内的溶解度和稳定性。该组合物也不引起低血压。本文也描述了在抗癌治疗和预防中使用该组合物的方法。

Description

活性的一氧化氮供体及其制备和应用的方法

相关申请的交叉参照

本申请要求2008年3月7日提交的美国临时申请系列号61/034,617的优先权。在此为了其所有教导引入该申请的全部内容作为参考。

致谢

通往本发明的研究是由国立卫生研究院提供部分资金，授与编号为ROl CA129611。美国政府可能拥有本发明中的某些权利。

背景

癌症，恶性细胞不受控制的生长，是现代医学时代的主要健康问题，且在美国是仅次于心脏病的排在第二位的死亡原因。急性髓性白血病(″AML″)是最常见的成人急性白血病(Greer，J.P.，等.(2004)Wintrobe′s Clinical Hematology，Baltimore pp.2098-2142)。感染这种疾病的大部分患者都屈服于它。70年代初以来，治疗的主要方式是阿糖胞苷(Ara-C)和蒽环类(Greer，J.P.，等.(2004)Wintrobe′s Clinical Hematology，Baltimore pp.2098-2142)。虽然全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病有值得注意的例外，但已经没有新的药物对疾病结果产生过重大的冲击。

由于患者的年龄和适当供体的可用性，干细胞移植有其局限性。此外，最近的试验表明，用干细胞援救的大剂量疗法可能无法提供超过标准剂量化学疗法的生存优势(Cassileth，PA.，等.(1998)New England Journal of Medicine 339(23)：1649-1656)。因此，需要新的具有新作用机制的药物治疗AML和其他类型的癌症是明显的。

一氧化氮(NO)是一种独特的细胞毒性剂，因为它有多个细胞内的靶标。照这样，它为非常有效的抗肿瘤剂。NO的主要问题是产生NO的化合物由于NO的多向性效应诱导的低血压。据了解，NO是重要的生物效应分子，作用于血管、免疫和神经系统(Moncada，S.，等.(1991)Pharmacological Reviews 43：109-142)。NO是由体内一氧化氮合成酶(NOS)产生的(Moncada，S.，等.(1991)Pharmacological Reviews 43：109-142)。例如，NO抑制正常和恶性细胞的生长(Nathan，C.(1992)FASEB Journal 6：3051-3064)。此外，NO在AML细胞中抑制生长和诱导分化(Magrinat，G.，等.(1992)Blood 80：1980-1986；Shami，P.J.，等.(1995)Leukemia Research 19；527-533；Shami，P.J.，等.(1998)Leukemia 12：1461-1466)。体内使用NO普遍的问题是其对非癌性细胞的非特异性作用，包括其对血管组织造成低血压的影响。

概述

本文描述了用于抗癌治疗和预防的组合物。该组合物包含(a)O²-芳基取代的二醇二氮烯

(diazeniumdiolate)和(b)两亲化合物，其中两亲化合物的数量足以产生脂质体或胶束。本文所述的组合物提供了很多优点，诸如提高O²-芳基取代的二醇二氮烯

体内的溶解度和稳定性。该组合物也不引起低血压。本文也描述了在抗癌治疗和预防中使用该组合物的方法。以下所述的优点将通过所附权利要求书中特别指出的元素和组合的方式得以实现并获得。应当理解，上述一般说明和以下详细说明均仅仅是示例性的和解释的，且不受其限制。

附图简述

附图，将其并入并构成本说明书的一部分，说明了下述的几个方面。

图1显示本文所用的几个O²-芳基取代的二醇二氮烯

的结构。

图2是条形图，比较游离的JS-K与在

胶束中的JS-K的透析。

图3是条形图，显示过滤对

胶束中的JS-K稳定性的影响。

图4是条形图，显示游离的JS-K与

胶束中的JS-K对比的细胞毒性。

图5A和图5B显示胶束的特征。

图6是曲线图，显示游离的JS-K与

P123胶束中的JS-K对比的细胞毒性。

图7是曲线图，显示

胶束中的JS-K和全身血压。

图8是曲线图，显示

胶束中的JS-K对体内HL-60细胞生长。

图9显示游离的JS-K和并入

P123中的JS-K的半衰期，并暴露给GSH，血清，和RPMI/10％FBS。

图10说明了GST-激活NO供体的设计方案。

图11说明了JS-K的结构和体内的反应机理。

详述

在本化合物、组合物和/或方法披露和描述前，应当理解下述方面不限于具体的化合物、合成方法、或应用，照这样当然可以变化。也应当理解本文所用的术语仅仅是为了描述特定方面的目的，且不打算受其限制。

在此说明书和所附权利要求书中，将提到许多被定义为具有以下涵义的术语：

必须指出，在说明书和所附权利要求书中使用时，单数形式“a，”“an”和“the”包括复数的指示物，除非文中另有明确规定。因此，例如，提及“药物载体”包括两种或更多种这类载体的混合物，等等。

“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能出现或可能不出现，且这种描述包括事件或情况出现的情形以及事件或情况不出现的情形。例如，短语“任选取代的低级烷基”是指可能被取代或可能未被取代的低级烷基基团，且这种描述包括未被取代的低级烷基和具有取代基的低级烷基。

在说明书和结束的权利要求书中，提及组合物或物品中按重量份的特定元素或组分，表示组合物或物品中的元素或组分和任何其他元素或组分之间的重量关系，其是按重量份表达的。因此，在含有按重量2份的组分X和按重量5份的组分Y的混合物(compound)中，X和Y以2∶5的重量比例存在，且以这样的比例存在是不考虑另外的组分是否包含在该混合物中的。除非明确声明与此相反，组分的重量百分比是基于其中包括组分的制剂或组合物的总重量。

本文使用时，为方便起见，多数的项目、结构元素、组合物元素、和/或材料可以在共同目录中提出。然而，这些目录应当解释为，目录的每个成员是各自确定为单独的和独特的成员。因此，没有相反指示而仅仅基于它们存在于共同组中时，这样目录的个体成员不应当解释为同一目录的实际上等同的任何其他成员。

浓度、数量、和其他数字数据可以在本文中以范围形式表达或提出。应当理解，这样的范围形式只是为了方便和简洁地应用，因此应适应解释为不仅包括明确叙述的作为限制范围的数值，而且还包括所有个体数值或涵盖在该范围内的子范围，如同每个数值和子范围是明确叙述的一样。作为举例说明，数值范围“约1至5”应解释为不仅包括明确叙述的值约1至约5，而且还包括个体值和该指明范围内的子范围。因此，包括在该数值范围内的为个体值诸如2、3、和4与子范围诸如1-3、2-4、3-5等，以及各个1、2、3、4、和5。同样的原则也适用于叙述只有一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，不论范围的宽度或所描述的特征，这种解释应该都是适用的。

本文使用的术语“烷基”是1～24个碳原子的分枝的或未分枝的饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、和二十四基等。“低级烷基”基团是含有一个至六个碳原子的烷基基团。

本文使用的术语“环烷基”是非芳香性的包含至少三个碳原子的碳基环。环烷基的实例包括但不仅限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”是指如上定义的环烷基，其中至少一个环碳原子被杂原子取代，所述杂原子例如但不仅限于氮、氧、硫、或磷。

本文使用的术语“芳基”是任何碳基芳香基团，包括但不限于苯、萘等。术语“芳香”还包括“杂芳基”，其定义为具有至少一个杂原子并入芳香基团环中的芳香基团。杂原子的实例包括但不仅限于氮、氧、硫、和磷。芳基可以是取代的或未取代的。芳基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于卤素、羟基、烷基硫基、芳基硫基、烷氧基、芳基氧基、氨基、单-或双-取代的氨基、铵基或取代的铵基、亚硝基、氰基、磺酸根(sulfonato)、巯基、硝基、氧代、烷基、链烯基、环烷基、苄基、苯基、取代的苄基、取代的苯基、苄基羰基、苯基羰基、糖、取代的苄基羰基、取代的苯基羰基和磷衍生物。芳基可以包括两个或更多个稠合环，其中至少一个环是芳香环。实例包括萘、蒽、和其它稠合的芳香族化合物。

术语“减少”是指降低癌细胞生长或肿瘤生长的速率。例如，当与阳性对照相比时，癌细胞生长的速率可降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％。

术语“预防”是指与阳性对照相比时癌细胞的生长速率或肿瘤生长为零。

术语“低血压”是指不正常的状态，其中受试者的血压足够低以引起症状或干扰健康。例如，受试者血压低于90/60可能经历低血压。

术语“胶束”是指分散在液体胶体中的两亲分子的聚集。一般的胶束在水溶液中形成聚集，其亲水“头”区域接触周围介质，使之与胶束中心的疏水尾区域隔离。胶束的形状和大小是两亲化合物和溶液条件(诸如两亲化合物的浓度、温度、pH值、和离子强度)的分子几何函数。O²-芳基取代的二醇二氮烯

在极大程度上并入胶束的疏水部分。

术语“脂质体”是指由两亲化合物产生的双层系统。含水核心存在于脂质体，是由于两亲化合物的疏水尾排列产生双层的结果。

整个申请所用的变量诸如A、X、Y、R¹-R⁴、a、b、m、n、o、和p是如同先前定义的相同变量，除非有相反说明。

I.组合物及其制备

本文描述了用于抗癌治疗的药物组合物。组合物用于体内递送NO给受试者。NO是有效的细胞毒性剂，有助于宿主对微生物和肿瘤细胞生长的免疫防御(Moncada，S.，等.(1991)Pharmacological Reviews 43：109-142；(Nathan，C.(1992)FASEB Journal 6：3051-3064)。事实上，NO在体外对肿瘤细胞具有强效的细胞毒性(Rangei-Yagui，CO.，等(2005)J.Pharm.Pharma.Sci.8(2)：147-63)。NO在AML细胞中抑制生长和诱导分化和细胞凋亡(Magrinal，G.，等.(1992)Blood 80：1980-1986；Shami，P.J.，等(1995)Leukemia Research 19；527-533；Shami，PJ.，等(1998)Leukemia12：1461-1466)。NO有多个细胞内的靶标，可以抑制细胞生长，因此凭借定向的递送，NO是非常有吸引力的用作抗肿瘤剂的分子(Henry，Y.，等.(1993)FASEB Journal 7：1124-1134)；17-28)。这些机制和靶标包括蛋白质酪氨酸亚硝化(在过氧化物存在下通过生成过氧亚硝酸盐)、蛋白质硫醇亚硝基化、ADP核糖基化、线粒体呼吸抑制、核糖核苷酸还原酶抑制、蛋白质谷胱甘肽化、和诱导DNA链断裂(Henry，Y.，等.(1993)FASEB Journal 7：1124-1134)；17-28)。

虽然NO在癌症治疗和疗法中有很多优点和应用，但它是有效的血管扩张剂，并在脉管系统中通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)/cGMP信号转导途径引起低血压(Moncada，S.，等.(1991)Pharmacological Reviews 43：109-142；(Nathan，C.(1992)FASEB Journal6：3051-3064)。这种性质使得在溶液中自发产生NO的药物(诸如硝普钠)在体内施用于抗肿瘤的目的是不可行的。本文所述的组合物解决了这些限制。

本文所述的组合物包含在脂质体或胶束中的O²-芳基取代的二醇二氮烯，可容易地给受试者施用于治疗癌症。以下详细描述了组合物和方法。

a.O²-芳基取代的二醇二氮烯

二醇二氮烯

是具有N₂O₂官能团的化合物。O²-芳基取代的二醇二氮烯

公开在美国专利号6,610,660中，其制备方法可用于本文，引入其教导作为参考。在一个方面，O²-芳基取代的二醇二氮烯为下式I的化合物

其中X包括有机部分和Y包括芳基，其中芳基的环原子键合到O²-氧，或其药学上可接受的盐或酯。当Y从式I化合物裂解时，NO自发地释放。不希望受理论的约束，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)可裂解Y，并在受试者体内产生NO(通用机制参见图10和使用JSK的具体机制参见图11)。谷胱甘肽-S-转移酶在白血病和实体瘤的多种形式中过表达。因此，将式I化合物递送至癌细胞，随后在体内裂解该化合物以产生NO，是治疗癌症的有效方式。本文所述的组合物提供了有效的方式使诸如式I的那些二醇二氮烯

递送至癌细胞。

在一个方面，式I的X可为取代的或未取代的烷基、环烷基、杂环烷基、或芳基。在另一个方面，X为具有至少1个氮原子并入环内的杂环烷基。这些杂环烷基的实例包括但不限于具有式II、III、或IV的基团

其中A为N、O、或S，m为1-12，o为1或2，P为1-5，R³为氢、烷基(例如C₁-C₈直链或C₃-C₈支链烷基)、环烷基(例如C₃-C₈)、芳基、羧酸基(carboxylato group)，和R⁴为氢、或烷基(例如C₁-C₆直链烷基或C₃-C₆支链)。

在另一个方面，X为具有式V的基团

其中n为1或2且R¹为取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、或具有式-C(O)OR²的酯或具有式-C(O)R²的酮，其中R²包括烷基或芳基。例如，提及式V，n为1且R¹可具有式-C(O)OR²，其中R²为C₁-C₅烷基。在另一个方面，式V中的n为1且R¹具有式-C(O)OEt。

式I中的Y包括芳基，其中芳基的环原子键合至O²-氧。本文所用的芳基的实例包括但不限于吖啶、蒽、苯、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、吲唑、苯并噻唑、咔唑、叶绿素、噌啉、呋喃、咪唑、吲哚、异苯并呋喃、异吲哚、异

唑、异噻唑、异喹啉(isoqumoline)、萘、

唑、菲、菲啶、吩噻嗪、吩

嗪、邻苯二甲酰亚胺、酞嗪、酞菁、卟吩、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、中氮茚(pyrrocoline)、吡咯、喹嗪

离子(quinolizinium ion)、喹啉、喹喔啉、喹唑啉、悉尼酮(sydnone)、四唑、噻唑、噻吩、甲状腺素、三嗪、或三唑。

在另一个方面，Y可与通常在活生物体中发现的分子或其取代基相同或结构上类似。这些生物学有关基团可为维生素或其衍生物、激素或其衍生物、嘧啶或其衍生物、核糖基嘧啶(ribosylpyrimidine)或其衍生物、嘌呤或其衍生物、或核糖基嘌呤(ribosylpurine)或其衍生物。在其他方面，Y可为核苷酸、核苷、和核酸；肽类，包括肽类激素，非肽类激素，维生素和其它酶辅因素如卟啉，和其他。生物学有关芳基的实例为甲状腺素、NAD(或NADH)、叶绿素、次黄嘌呤、尿苷、和维生素K₅。在这些方面，上述确定的化合物具有芳基。

Y中存在的芳基可被多种基团取代。在一个方面，Y具有至少一个硝基。在另一个方面，Y为具有至少一个硝基或两个硝基的苯基。在一个方面，Y具有式VI的结构

在另一个方面，O²-芳基取代的二醇二氮烯

为O²-(2，4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JS-K)，O²-(2，4-二硝基苯基)1-[4-苯基哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JXC-2-40)，O²-(2，4-二硝基苯基)1-[4-嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JXC-2-56)，或O²-(2，4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)-2，4-二氮杂环-庚烷-1-基]二氮烯-1--1，2-二醇(JS-36-25)。这些化合物的结构提供在图1中。

本文所述的任何O²-芳基取代的二醇二氮烯

可为其药学上可接受的盐或酯。药学上可接受的盐是由适量的药学上可接受的碱处理游离酸而制备的。代表性的药学上可接受的碱是氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化亚铁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铝、氢氧化铁、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等等。在一个方面，反应是在水(单独的或联合惰性的与水混溶的有机溶剂)中在温度约0℃至约100℃如在室温下进行的。选择结构式I的化合物与所用碱的摩尔比以提供任何特定盐的所需比例。例如，为了制备游离酸起始原料的铵盐，起始材料可以用大约一个当量的药学上可接受的碱处理，以产生中性盐。

酯衍生物通常作为这些化合物--如下面实施例举例说明--的酸形式的前体而制备并因此可充当前体药物。一般来说，这些衍生物将为低级烷基酯如甲基、乙基等酯。酰胺衍生物-(CO)NH₂、-(CO)NHR和-(CO)NR₂，其中R为如上定义的烷基，可以由含羧酸的化合物与氨或取代的胺起反应而制备。

b.两亲化合物

本文所用的两亲化合物是能够形成胶束或脂质体的具有亲水和亲脂性基团的化合物。两亲化合物应为生物相容性的，以使他们具备最小限度的毒性。本文所用的制备脂质体和胶束的两亲化合物包括由生物相容性和生物可降解材料生产的均聚物、共聚物、嵌段共聚物。这些聚合物的实例包括但不仅限于聚(氨基酸)；聚乳酸；聚(乙烯亚胺)；聚(甲基丙烯酸二甲胺乙酯)，聚乙二醇与羟基烷基丙烯酸酯和丙烯酰胺的共聚物(例如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，PEG-β-聚(α-氨基酸)，聚(L-乳酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物，或聚(L-组氨酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物。

在一个方面，两亲化合物为泊洛沙姆。在一个方面，泊洛沙姆为非离子的三嵌段共聚物，包括中央疏水链的聚氧丙烯(例如(聚(环氧丙烷))，侧面两个亲水链的聚氧乙烯(例如聚(环氧乙烷))。在一个方面，泊洛沙姆具有式

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄O)_bOH

其中a为10～100，20～80，25～70，或25～70，或50～70；b为5～250，10～225，20～200，50～200，100～200，或150～200。在另一个方面，泊洛沙姆具有分子量2,000～15,000、3,000～14,000、或4,000～12,000。本文所用的泊洛沙姆以BASF生产的商业名称

销售。

本文所用的泊洛沙姆的非限制实例包括但不限于表1中的那些。

表1

共聚物	MW	EO单位平均数	PO单位平均数	CMC(M)
					F68	8,400	152.73	28.79	4.8×10^-4
F103	4,950	33.75	59.74	6.1×10^-6
					F105	6,500	73.86	56.03	6.2×10^-6
F123	5,750	39.2	69.4	4.4×10^-6
					F127	12,600	200.45	65.17	2.8×10^-6
F121	4,400	10.00	68.28	1.1×10^-6

在其他方面，两亲化合物可以是脂如磷脂，其有用于制备脂质体。实例包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。在其他方面，两亲化合物包括胆固醇、糖脂、脂肪酸、胆汁酸、或皂甙。

c.组合物的制备

本文所述的组合物可以通过将O²-芳基取代的二醇二氮烯

和两亲化合物以适当的浓度在溶剂中混合以产生胶束或脂质体而容易地制得。在某些方面，O²-芳基取代的二醇二氮烯

和两亲化合物在水中混合，随后加热以产生胶束。O²-芳基取代的二醇二氮烯和两亲化合物的数量可以变化。在一个方面，两亲化合物的数量应足够达到临界胶束浓度(CMC)。临界胶束浓度(CMC)定义为上述表面活性剂自发形成胶束的浓度。表1提供了本文所用的作为两亲化合物的泊洛沙姆的CMC。在某些方面，所用两亲化合物的浓度可以数倍高于该两亲化合物的CMC。应当考虑除了O²-芳基取代的二醇二氮烯

之外的其它生物活性剂也可以并入胶束或脂质体中。例如，下面描述的其他抗癌药物可用于本文的这一方面。

在某些方面，添加剂可以用来增加本文所述的组合物的稳定性。在一个方面，添加剂如白蛋白在加入至两亲化合物和O²-芳基取代的二醇二氮烯

中时，可以稳定所产生的胶束或脂质体。例如，向溶解在2％P123

的1mM JS-K中，加入1％人血清白蛋白导致明显更加稳定的胶束形成。

本文所述的组合物是非常稳定的。换言之，O²-芳基取代的二醇二氮烯

是受保护的，以避免严厉的生理条件如暴露于血清和肽像GSH。此外，组合物是容易处理的，并能经受纯化步骤例如过滤，而没有O²-芳基取代的二醇二氮烯

从组合物中滤出。最后，组合物是水中可溶的。一般而言，O²-芳基取代的二醇二氮烯

是不溶于水的。因此，当O²-芳基取代的二醇二氮烯并入胶束或脂质体中时，给受试者施用O²-芳基取代的二醇二氮烯

是更容易的。

d.药物组合物

在一个方面，本文所述的任何组合物可以结合至少一种药学上可接受的载体，以生产药物组合物。药物组合物可以应用本领域已知的技术制备。在一个方面，该组合物通过组合物与药学上可接受的载体混合而制得。术语“混合”定义为两种组分混合在一起，而没有化学反应或物理相互作用。术语“混合”也包括式I化合物和药学上可接受的载体之间的化学反应或物理相互作用。

药学上可接受的载体是本领域技术人员已知的。最常用的这些应是给人施用的标准载体，包括溶液诸如无菌水、盐水、和在生理pH值的缓冲溶液。

旨在用于药物递送的分子可以制成药物组合物。药物组合物除了选择的分子之外可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、和表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种有效成分如抗微生物剂、抗炎剂、和麻醉剂等。

药物组合物可以以多种方式施用，这取决于是否期望用局部或全身治疗，以及要处理的区域。可经胃肠外、口服、皮下、伤口内(intralesionally)、腹腔内、静脉内、或肌肉内施用。

用于施用的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水载体的实例包括醇/水的溶液、乳液或悬浮液，和缓冲媒介。胃肠外的赋形剂，如果披露的组合物和方法需要并行应用，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格、或不挥发油。静脉的赋形剂，如果披露的组合物和方法需要并行应用，包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。

应认识到，在特定情况下活性化合物实际优选的数量将根据正在使用的具体化合物、所制成的特定组合物、应用的方式、和正在接受治疗的特定部位和哺乳动物而变化。给予宿主的剂量可应用常规的考虑来确定，例如通过惯常的比较主题化合物和已知药物的不同活性，例如通过适当的常规药理学方案的手段。医生和配方者，本领域确定药物化合物剂量的技术人员，根据标准的建议(Physicians Desk Reference，Barnhart Publishing(1999)来确定剂量将不会有困难。

II.应用的方法

本文所述的组合物是有效的抗癌药物。肿瘤细胞抗化疗药物代表临床肿瘤学上的大问题。为了抑制细胞生长、诱导细胞分化、诱导细胞凋亡、抑制MDR表型、抑制转移、抑制血管生成或以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型而应用本发明的方法和组合物，将“靶”细胞与本文所述的一种或多种组合物相接触。在某些方面，可以施用组合物，其包括O²-芳基取代的二醇二氮烯

化合物和至少一种其他药物。本文所述的组合物可以提高化学-和放射治疗的功效。一种方法是涉及与化学-或放射治疗干预相结合地应用本文所述的组合物。这种治疗选择可以随同DNA损伤剂一起提供组合的治疗效果。不同的癌症治疗药物和使用这种药物的治疗方法是本领域众所周知的。

在一个方面，另外的药物可以为抗癌药。这些组合物可以以有效杀死或抑制细胞增殖的组合数量来提供。这个过程可涉及用组合物和药物(们)或因子(们)在同一时间接触这些细胞。这可通过用单一组合物或包括两种药物(例如O²-芳基取代的二醇二氮烯

和化疗药物)的药理学制剂接触这些细胞来实现，或通过用两种不同的组合物或制剂同时接触这些细胞来实现，其中一种组合物包括本文所述的O²-芳基取代的二醇二氮烯

组合物，和另一种包括药物。

替代选择地，任何O²-芳基取代的二醇二氮烯

组合物的治疗可以在其他药物治疗之前或之后，间隔时间为数分钟到数周。在其他药物和本文所述的任何O²-芳基取代的二醇二氮烯

组合物分开应用于细胞的方面，有意义的时间周期不应该在各递送时间之间中断，以致该药物和O²-芳基取代的二醇二氮烯化合物应仍然能够对细胞发挥有利的组合(例如协同)效果。在一个方面，用两种疗法接触细胞可以在大约12～24小时内，或相互约6～12小时，最高达约12小时的延迟时间。在某些情况下，可预期用合理的治疗剂延长治疗的持续时间，例如其中在各自的给药之间推移数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

抗癌药的实例包括但不仅限于铂化合物(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)，烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌、美法仑、白消安、丙卡巴肼、链脲菌素、替莫唑胺、达卡巴嗪、苯达莫司汀)，抗肿瘤抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、博莱霉素、丝裂霉素C、普利霉素、更生霉素)，紫杉烷类（例如紫杉醇和多烯紫杉醇)，抗代谢药物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、培美曲塞(premetrexed)、硫鸟嘌呤、氟尿苷、卡培他滨、和甲氨蝶呤)，核苷类似物(例如氟达拉滨、氯法拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、奈拉滨)，拓扑异构酶抑制剂(例如托泊替康和伊立替康)，去甲基化药物(hypomethylating)(例如阿扎胞苷和地西他滨)，蛋白体抑制剂(例如硼替佐米)，表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊甙)，DNA合成抑制剂(例如羟基脲)，长春花生物碱类(例如长春新碱(vicristine)、长春地辛、长春瑞滨、和长春碱)，酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、索拉非尼、舒尼替尼)，单克隆抗体(例如利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panetumumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、贝伐珠单抗)，亚硝基脲类(例如卡莫司汀、福莫司汀、和洛莫司汀)，酶(例如L-门冬酰胺酶)，生物制剂(例如干扰素和白细胞介素)，六甲蜜胺，米托坦，血管生成抑制剂(例如沙立度胺、来那度胺(lenalidomide))，甾族化合物(例如强的松、地塞米松、和强的松龙)，激素试剂(例如他莫昔芬、雷洛昔芬、亮丙瑞林、比卡鲁胺(bicaluatmide)、格拉司琼、氟他胺)，芳香酶抑制剂(例如来曲唑和阿那曲唑)，三氧化二砷，维甲酸，非选择性环氧合酶抑制剂(例如非甾体抗炎药、水杨酸、阿司匹林、吡罗昔康、布洛芬、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、托美丁、酮洛芬、萘丁美酮、奥沙普秦)，选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂，或其任何组合。

本文所述的方法适用于治疗各种不同类型的癌症。在一个方面，所述癌症包括前列腺癌，白血病(例如急性髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、浆细胞白血病)，骨髓增殖性疾病(例如原发性血小板增多症、真性红细胞增多症(polythemia vera)、原发性骨髓纤维化)，骨髓发育不良综合征，淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)，睾丸癌，头部和颈部癌，食道癌，胃癌，肝癌，小肠癌，胆囊癌，直肠癌，肛门癌，肉瘤，子宫瘤，子宫颈瘤，膀胱癌，骨癌，肾癌，黑色素瘤，结肠癌，卵巢癌，肺癌，中枢神经系统癌，多发性骨髓瘤，皮肤癌，或乳腺癌。本文所述的组合物的众多优点之一是在有效抗癌治疗的同时，组合物不引起低血压。如上所述，体内广泛使用NO的问题是其对非癌性的细胞的非特异性作用，包括对血管组织造成低血压的影响。所述的组合物避免了这个问题，这使得他们在抗癌治疗和预防中更加具有吸引力。

在其他方面，本文所述的组合物可以用作净化剂。例如，干细胞可以从患有癌症(例如白血病或多发性骨髓瘤)的患者那采集，且干细胞可以用本文所述的组合物治疗以杀死任何残余的恶性细胞。这在本文也称为“净化”移植。治疗后的干细胞随后可用于大剂量化疗/辐射病人后的干细胞(骨髓)移植。

实施例

提出以下实施例是为了给本领域普通技术人员提供本文所述和要求保护的化合物、组合物和方法是如何制得和评估的完整公开内容和说明，并纯粹地旨在示例性且不打算限制为发明人视其为发明的范围。就数字(例如数量、温度等)而论已经作出了努力以确保准确性，但一些误差和偏差应是可解释的。除非另有说明，份数为按重量份数，温度为℃或在环境温度，和压力在或接近大气压下。有许多反应条件的变量和组合，例如组分的浓度、所需的溶剂、溶剂的混合物、温度、压力和其它反应范围和条件，可用于优化由所述方法获得的产品纯度和产率。优化这种工艺条件将只需要合理和例行的试验。

实施例1

本实施例说明JS-K在胶束中的负载程度。将JS-K加载在P123和L121聚合物中以形成胶束。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为10％。然后将JS-K胶束制品透析2小时。按照同样的操作，用游离JS-K进行类似的实验作为对照。透析2小时后，经HPLC测量JS-K的水平以评估JS-K保留的百分数。游离JS-K的保留百分数作为对比仅为31％，JS-K在P123和L121胶束中分别为75±10％和78±11％，参见图2。这些结果表明在胶束制剂中的JS-K在透析后是保留的，而游离JS-K在透析中大部分遗失。

实施例2

本实施例说明过滤对

胶束的影响。将JS-K装载在P123胶束中(JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为1.57％)。然后将等分部分的JS-K制品通过0.2μM薄膜滤器过滤并保持在室温下。以固定间隔收集制品的20μL等分部分，经HPLC测量JS-K的水平。对在P123

胶束中没有过滤的类似JS-K制剂进行并行测量。测量的JS-K水平随时间下降。这些结果表明在过滤和未过滤的胶束之间JS-K的浓度没有差异，提示这些胶束可以过滤而没有降解，参见图3。

实施例3

本实施例说明

胶束在GSH存在下能稳定JS-K。在这些实验中，在室温将游离的JS-K和在

P-123胶束中配制的JS-K在10mM的浓度下用4.0mM GSH在pH 7.4PBS中孵育。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为1.57％。在固定的时间间隔，经HPLC测量JS-K的水平。在这些条件下，在GSH存在下游离的JS-K具有6分钟的半衰期。在同样的条件下，在GSH存在下P-123胶束中的JS-K具有37分钟的半衰期。这些结果表明

胶束在由GSH代表的游离巯基的亲核攻击的非常严厉条件下基本上延长了JS-K的半衰期(P-123情况下的6倍)。

实施例4

本实施例说明游离的JS-K与

胶束中的JS-K在血清中对比的稳定性。将JS-K装载在L121和胶束中。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为0.98％。然后在37℃将

JS-K用FBS在总容量8mL中孵育。JS-K的终浓度为100μM。FBS的终浓度为90％v/v。pH为7.6。在相同条件下以相同的浓度应用游离的JS-K，建立对照组。以固定的间隔，取1mL等分部分。在二氯甲烷萃取后，应用上述方案经HPLC测量JS-K的水平。实验一式两份进行，且测量值用于计算不同制剂的JS-K在血清中的半衰期。在这些条件下，游离的JS-K具有1.2分钟的半衰期。L121

胶束中的JS-K具有71分钟的半衰期，而P123胶束中的JS-K具有91分钟的半衰期。这些实验比游离GSH更接近地重现体内条件，在暴露于蛋白质和大分子的非常严厉条件下

胶束显示出稳定JS-K的能力。

实施例5

本实施例测量

胶束中JS-K的粒子大小和pH的影响。应用Malvern 3000 Zetasizer(Malvern Instruments，Worstershire，UK)的动态光散射，在不同pH值条件下测量了含有和不含有JS-K的

P123胶束的粒子大小。对4个分开的样品在3mL体积的PBS中进行了测量。在一组实验中，我们在从4.5至7.4的不同pH条件下制得P123胶束(不含有JS-K)。在室温平衡4小时后，测量粒子大小。没有观察到聚集，表明胶束保持完整性。表2中的结果表明pH值不影响P123

胶束的大小(因此具有稳定性)。

在另一组实验，在pH7.4将JS-K载入P123胶束中，并在不同的时间间隔测量粒子大小。JS-K与聚合物在溶液中的比例按重量计为0.52％。表3中的结果显示在遍及观察期内，装载JS-K的P123胶束是稳定的。

另外，没有观察到聚集，表明胶束保持完整性。从这些测量结果可以得出三个结论。第一，在这些条件下，

胶束在遍及观察期内是非常稳定的。第二，装载JS-K的胶束不影响粒子大小或胶束的稳定性。第三，在研究的范围内，pH不影响胶束的稳定性。

实施例6

在这个实施例中研究了

胶束中的JS-K的体外细胞毒性。将JS-K载入如上所述的F68、P105、或F127胶束中。JS-K与聚合物在溶液中的比例按重量计为4％。然后将游离的JS-K或胶束的JS-K以0.5μM的浓度加入到HL-60细胞中。用不含有JS-K的相等浓度的各种

胶束建立类似的对照实验。在孵育3天后，应用MTS检测测量细胞生长。游离的JS-K抑制了62％的白血病细胞生长(图4)。F68胶束没有增加JS-K的细胞毒性效应，而在P105或F127胶束中配制的JS-K各自抑制了约90％细胞生长(图4)。相等的空胶束在相等浓度(0.08％w/v)时对细胞生长没有显著影响(图中未显示)。

这些结果证明，

胶束制剂可以增加JS-K的功效。正如所料，具有最高的CMC和最低的分配系数的

聚合物(表1和图五)不会改善游离的JS-K的有效性。P105和F127具有相同范围的CMC和分配系数(表2和图3)，增加了JS-K细胞毒性至大约相同的程度。

在其他实验中，将JS-K装入P123胶束中，并比较其与游离的JS-K对HL-60细胞的体外细胞毒性。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为1.97％。这些结果显示，在

P123胶束中配制的JS-K的体外IC₅₀值从0.45μM减少至0.09μM，这表示基本上增加了其细胞毒性的活力(图6)。这些结果很可能是由于JS-K在胶束中的稳定并增加细胞内药物的积累。

实施例7

本实施例说明

胶束中的JS-K对全身血压的效果。将JS-K加载在

P123胶束中，并用于体内实验以确定JS-K的

胶束制剂是否影响JS-K在全身血压上的效果。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为1.53％。

清醒、未麻醉的NOD/SCID和NOD/SCID IL2Rγ^null小鼠用于这些实验中。将小鼠用高的静脉注射剂量的P123胶束中的JS-K或游离的JS-K处理。应用尾套法(tail cuff)每5分钟测量收缩压至1小时，然后在2小时的时间点测量。剂量5μmol/kg游离的JS-K导致收缩压持续下降约20％的基线，而同样剂量的P123胶束中的JS-K没有这种作用(图7)。

P123胶束中的JS-K没有引起低血压而游离的JS-K在同等剂量引起低血压的事实表明以下的间接证据：JS-K的

胶束制剂稳定体内血液中药物。在高剂量下观察到的低血压可能是由于游离药物和胶束中的JS-K之间的动态平衡。

实施例8

本实施例说明

胶束中的JS-K的体内抗白血病活性。将NOD/SCID IL2R γ^null小鼠在各个侧面接种5X10⁶HL-60细胞。当肿瘤变得可触知时，用如下3个变量开始治疗：1-用空白

P123胶束注射的对照组(4只小鼠)；2-注射游离JS-K的小鼠(3只小鼠)；和3-注射在

P123胶束中配制的JS-K的小鼠(3只小鼠)。JS-K与

聚合物在溶液中的比例按重量计为2.0％。静脉注射每周给予3次。游离和胶束-配制的JS-K的剂量为4μmol/kg。与游离药物相比，胶束-配制的JS-K的处理导致更大程度上延迟肿瘤生长。应用SASPROC MIXED线性混合模型拟合图8中的数据，使用随机效应解释相同动物内测量之间的相关性。在此模型中，由时间的线性和二次效应拟合，与用

P123胶束中配制的JS-K处理的动物相比，发现用游离JS-K处理的动物具有显著更高(p＝0.01，F-检验)的肿瘤生长率。

这些结果证实JS-K的体内抗肿瘤活性，并建议在

胶束制剂中的JS-K具有增加的抗肿瘤功效。这很可能是由于胶束的药物稳定作用，因此增加药物递送至肿瘤。

实施例9

对JS-K在不同媒介中的体外稳定性进行了评价。以JS-K与P123的2.25％比例将JS-K加载于

P123胶束中。在37℃将胶束增溶的JS-K或游离的JS-K在不同媒介中分别以50和10微摩尔浓度孵育。使用游离JS-K的低浓度是因为它的溶解度的限制。应用高压液相色谱法(HPLC)在不同时间间隔测量JS-K在不同媒介中的浓度直到60分钟。应用HPLC测量的曲线下面积(AUC)，确定JS-K在不同媒介中的半衰期(T_1/2)和百分比回收率。当添加到含有10％胎牛血清的RPMI媒介中时，游离的JS-K和胶束增溶的JS-K分别具有9.6+/-1.3和53.4+/-1.96分钟的T_1/2(6次单独实验的平均值和SEM，P＝0.00004)(图9)。在RPMI/10％FBS中孵育60分钟后，游离的和胶束增溶的JS-K的百分比回收率是10.53+/-1.42和50.71+/-8.27(6次单独实验的平均值和SEM，P＝0.0001)。当添加到混合的人血浆时，游离的JS-K和胶束增溶的JS-K分别具有26+/-0和80+/-3分钟的T_1/2(2次单独实验的平均值和SEM，P＝0.0353)(图9)。在混合的人血浆中孵育60分钟后，游离的和胶束增溶的JS-K的百分比回收率是39+/-0和59.5+/-1.5(2次单独实验的平均值和SEM，P＝0.05)(图9)。

本文提出的本发明许多修改和其他实施方案将会使本领域技术人员想起这些发明涉及上述描述中存在的教导的利益。因此，应当理解本发明并不限于所披露的具体实施方案，修改和其他实施方案也打算包括在所附权利要求书的范围内。虽然本文应用了具体的术语，它们仅以一般和描述性意义应用，而不是为了限制的目的。

Claims

1.通过以下方法制备的组合物，所述方法包括混合

(a)具有下式I的O²-芳基取代的二醇二氮烯

其中X包括有机部分和Y包括芳基，其中芳基的环原子键合到O²-氧，或其药学上可接受的盐或酯；和

(b)两亲化合物，

其中两亲化合物的数量足够产生脂质体或胶束。

2.权利要求1的组合物，其中X包括取代的或未取代的烷基、环烷基、杂环烷基、或芳基。

3.权利要求1的组合物，其中X包括包含至少1个氮原子并入环内的杂环烷基。

4.权利要求3的组合物，其中杂环烷基包括具有式II、III、或IV的基团

其中A为N、O、或S，m为1-12，o为1或2，P为1-5，R³为氢、烷基、环烷基、芳基、羧酸基，和R⁴为氢、或烷基。

5.权利要求1的组合物，其中X包括具有式V的基团

其中n为1或2且R¹包括取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、或具有式-C(O)OR²的酯或具有式-C(O)R²的酮，其中R²包括烷基或芳基。

6.权利要求5的组合物，其中n为1且R₁包括式-C(O)OR²，其中R²包括C₁-C₅烷基。

7.权利要求5的组合物，其中n为1且R₁包括式-C(O)OEt。

8.权利要求1的组合物，其中Y包括吖啶、蒽、苯、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并

唑、吲唑、苯并噻唑、咔唑、叶绿素、噌啉、呋喃、咪唑、吲哚、异苯并呋喃、异吲哚、异唑、异噻唑、异喹啉(isoqumoline)、萘、

唑、菲、菲啶、吩噻嗪、吩

嗪、邻苯二甲酰亚胺、酞嗪、酞菁、卟吩、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、中氮茚、吡咯、喹嗪

离子、喹啉、喹喔啉、喹唑啉、悉尼酮、四唑、噻唑、噻吩、甲状腺素、三嗪、或三唑。

9.权利要求1的组合物，其中Y包括维生素或其衍生物、激素或其衍生物、嘧啶或其衍生物、核糖基嘧啶或其衍生物、嘌呤或其衍生物、或核糖基嘌呤或其衍生物。

10.权利要求1的组合物，其中芳基Y包括至少一个硝基。

11.权利要求1的组合物，其中芳基Y包括包含至少一个硝基的苯基。

12.权利要求1的组合物，其中芳基Y包括二硝基苯基。

13.权利要求1的组合物，其中O²-芳基取代的二醇二氮烯

为O²-(2，4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JS-K)，O²-(2，4-二硝基苯基)1-[4-苯基哌嗪-1-基]二氮烯-1--1，2-二醇(JXC-2-40)，O²-(2，4-二硝基苯基)1-[4-嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JXC-2-56)，或O²-(2，4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)-2，4-二氮杂环-庚烷-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JS-36-25)。

14.权利要求1的组合物，其中两亲化合物包括聚(氨基酸)；聚乳酸；聚(乙烯亚胺)；聚(甲基丙烯酸二甲胺乙酯)，聚乙二醇与羟基烷基丙烯酸酯和丙烯酰胺的共聚物，PEG-β-聚(α-氨基酸)，聚(L-乳酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物，或聚(L-组氨酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物。

15.权利要求1的组合物，其中两亲化合物包括泊洛沙姆。

16.权利要求15的组合物，其中泊洛沙姆包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的三嵌段共聚物。

17.权利要求1的组合物，其中O²-芳基取代的二醇二氮烯

为O²-(2，4-二硝基苯基)1-[(4-乙氧羰基)哌嗪-1-基]二氮烯-1-

-1，2-二醇(JS-K)和两亲化合物包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯的三嵌段共聚物。

18.权利要求1的组合物，其中组合物进一步包括一种或多种抗癌药。

19.权利要求18的组合物，其中抗癌药包括铂化合物、烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药物、核苷类似物、拓扑异构酶抑制剂、去甲基化药物、蛋白体抑制剂、表鬼臼毒素、长春花生物碱类、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、亚硝基脲类、酶、生物制剂、六甲蜜胺、米托坦、血管生成抑制剂、甾族化合物、激素试剂、芳香酶抑制剂、三氧化二砷、维甲酸、羟基脲、DNA合成抑制剂、非选择性环氧合酶抑制剂、选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、或其任何组合。

20.权利要求1的组合物，其中组合物包括胶束。

21.权利要求1的组合物，其中一种或多种另外的抗癌药与组分(a)和(b)混合。

22.药物组合物，包括权利要求1的组合物和药学上可接受的载体。

23.治疗癌症的方法，包括给受试者施用权利要求1-22任何一项中的组合物。

24.杀死癌细胞的方法，包括用权利要求1-22任何一项中的组合物接触所述癌细胞。

25.预防或减少癌细胞生长的方法，包括用权利要求1-26任何一项中的组合物接触所述癌细胞。

26.权利要求23-25任何一项中的方法，其中癌症包括前列腺癌、白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓发育不良综合征、淋巴瘤、睾丸癌、头部和颈部癌、食道癌、胃癌、肝癌、小肠癌、胆囊癌、直肠癌、肛门癌、肉瘤、子宫瘤、子宫颈瘤、膀胱癌、骨癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、肺癌、中枢神经系统癌、多发性骨髓瘤、皮肤癌、或乳腺癌。

27.权利要求23-25任何一项中的方法，其中组合物不引起低血压。

28.权利要求23-25任何一项中的方法，其中组合物经胃肠外、口服、皮下、伤口内、腹腔内、静脉内、或肌肉内施用。

29.净化患有癌症的受试者干细胞的方法，所述方法包括(a)从受试者那移出干细胞，和(b)用权利要求1-26任何一项中的组合物接触所述细胞。

30.权利要求29的方法，其中干细胞包括骨髓细胞。

31.权利要求29或30的方法，其中在步骤(b)后，将细胞植入所述受试者。