DE69629399T2 - Die Synthese und Verwendung von Retinoid-Verbindungen mit negativer hormonischer oder antagonistischer Aktivität - Google Patents

Die Synthese und Verwendung von Retinoid-Verbindungen mit negativer hormonischer oder antagonistischer Aktivität Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit Retinoid-negativen Hormonund/oder Retinoid-Antagonisten-artigen biologischen Aktivitäten. Die Erfindung betrifft insbesondere 4-Aryl-substituiertes Benzopyran, 4-Aryl-substituiertes Benzothiopyran, 4-Aryl-substituiertes 1,2-Dihydrochinolin und 8-Aryl-substituierte 5,6-Dihydronaphthalin-Derivate, die ebenfalls von einer substituierten 3-Oxo-1-propenyl-Gruppe substituiert sein können. Diese neuen Verbindungen weisen eine Retinoid-Antagonisten-artige Aktivität auf und sind zur Behandlung oder Vorbeugung einer durch Retinoide und Vitamin A und Vitamin-A-Vorläufer induzierten Toxizität bei Säugetieren und als Hilfsmittel zur Behandlung von Säugetieren mit Retinoiden, um unerwünschte oder nicht erwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden oder zu lindern, von Nutzen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung Retinoid-negativer Hormone zur Erhöhung der biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Steroidhormone und zur Hemmung der Basisaktivität von nicht-ligierten bzw. nicht mit Liganden versehenen bzw. nicht-ligandierten Retinsäure-Rezeptoren.
  • Ausgangspunkt der Erfindung
  • Verbindungen, die eine Retinoid-artige Aktivität aufweisen, sind in der Technik wohl bekannt und sind in zahlreichen US-Patenten und anderen Patenten und wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben worden. Es ist allgemein bekannt und in der Technik akzeptiert, dass eine Retinoid-artige Aktivität zur Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, von Nutzen ist, um die Symptome, die mit zahlreichen Erkrankungen und Zuständen bzw. Leiden verbunden sind, zu heilen oder zu lindern.
  • Es ist bekannt, dass Retinoide (Vitamin A und dessen Derivate) breite Aktivitäten bzw. Wirksamkeiten aufweisen, einschließlich Wirkungen auf die Zellproliferation und -Differentiation bzw. Differenzierung in einer Vielzahl biologischer Systeme. Diese Aktivität hat Retinoide in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich dermatologischer Störungen und Krebs, brauchbar gemacht. Der Stand der Technik hat eine große Anzahl chemischer Verbindungen entwickelt, die eine Retinoid-artige biologische Aktivität aufweisen, und es existiert eine umfangreiche Patent- und Chemie-Literatur, die solche Verbindungen beschreibt. Die relevante Patentliteratur schließt US-Patent-Nr. 4 980 369, 5 006 550, 5 015 658, 5 045 551, 5 089 509, 5 134 159, 5 162 546, 5 234 926, 5 248 777, 5 264 578, 5 272 156, 5 278 318, 5 324 744, 5 346 895, 5 346 915, 5 348 972, 5 348 975, 5 380 877, 5 399 561, 5 407 937 (übertragen auf denselben Anmelder wie in der vorliegenden Anmeldung) und die darin genannten Patente und Veröffentlichungen ein, die insbesondere Chroman-, Thiochroman- und 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-Derivate beschreiben oder sich auf diese beziehen, die eine Retinoidartige biologische Aktivität aufweisen. Zusätzlich sind mehrere Anmeldungen anhängig, die auf den Anmelder der vorliegenden Anmeldung angemeldet sind und die weiterhin auf Verbindungen mit einer Retinoid-artigen Aktivität gerichtet sind.
  • US-Patent-Nr. 4 740 519 (Shroot et al.), 4 826 969 (Maignan et al.), 4 326 055 (Loeliger et al.), 5 130 335 (Chandraratna et al.), 5 037 825 (Klaus et al.), 5 231 113 (Chandraratna et al.), 5 324 840 (Chandraratna), 5 344 959 (Chandraratna), 5 130 335 (Chandraratna et al.), die veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 176 034 A (Wuest et al.), 0 350 846 (Klaus et al.), 0 176 032 A (Frickel et al.), 0 176 033 A (Frickel et al.), 0 253 302 A (Klaus et al.), 0 303 915 A (Bryce et al.), die UK-Patentanmeldung GB 2190378 A (Klaus et al.), die deutschen Patentanmeldungen-Nr. DE 3715955 A1 (Klaus et al.), DE 3602473 A1 (Wuest et al.) und die Artikel J. Amer. Acad. Derm. 15: 756–764 (1986) (Sporn et al.), Chem: Pharm. Bull. 33: 404–407 (1985) (Shudo et al.), J. Med. Chem. 31: 2182–2192 (1988) (Kagechika et al.), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids CRC Press Inc. 1990, Seiten 334–335, 354 (Dawson et al.), beschreiben oder betreffen Verbindungen, die eine Tetrahydronaphthyl-Gruppierung einschließen und eine Retinoid-artige oder verwandte biologische Aktivität aufweisen. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 661 259 A beschreibt Dihydronaphthalinderivate mit einer Retinoid-artigen Aktivität. US-Patent-Nr. 4 391 731 (Boiler et al.) beschreibt Tetrahydronaphthalin-Derivate, die in Flüssigkristallzusammensetzungen von Nutzen sind. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 478 787 A beschreibt Verfahren zur Herstellung von Tetrahydronaphthalin-Derivaten.
  • Ein Artikel von Kagechika et al. in J. Med. Chem. 32: 834 (1989) beschreibt bestimmte 6-(3-Oxo-1-propenyl)-1,2,3,4-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-Derivate und verwandte Flavon-Verbindungen mit einer Retinoid-artigen Aktivität. Die Artikel von Shudo et al. in Chem. Pharm. Bull. 33: 404 (1985) und von Jetten et al. in Cancer Research 47: 3523 (1987) beschreiben oder betreffen weitere 3-Oxo-1-propenyl-Derivate(Chalkon-Verbindungen) und deren Retinoid-artige oder verwandte biologische Aktivität.
  • Leider verursachen Verbindungen mit einer Retinoid-artigen Aktivität (Retinoide) in therapeutischen Dosis-Konzentrationen ebenfalls mehrere unerwünschte Nebenwirkungen, einschließlich Kopfschmerzen, Teratogenese, Schleimhauttoxizität, Muskelskelett-Toxizität, Dyslipidämien, Hautirritation bzw. -reizung, Kopfschmerzen und Hepatotoxizität. Diese Nebenwirkungen schränken die Akzeptanz und Nützlichkeit der Retinoide zur Behandlung von Erkrankungen ein.
  • Es ist allgemein bekanntes Wissen auf dem einschlägigen Fachgebiet, dass zwei Haupttypen von Retinoid-Rezeptoren in Säugetieren (und anderen Organismen) existieren. Die beiden Haupttypen oder Familien von Rezeptoren werden jeweils als die RARs und RXRs bezeichnet. Innerhalb jedes Typs liegen Subtypen vor: In der RAR-Familie werden die Subtypen als RAR-α, RAR-β und RAR-γ bezeichnet, in der RXR-Familie sind die Subtypen: RXR-α, RXR-β und RXR-γ. Beide Rezeptorfamilien sind Transkriptionsfaktoren, die voneinander auf Grundlage ihrer Liganden-Bindungsspezifitäten unterschieden werden können. All-trans-RA (RA = retinoic acid = Retinsäure) (ATRA) bindet und aktiviert eine Klasse von Retinsäure-Rezeptoren (RARs), die RAR-α, RAR-β und RAR-γ einschließt. Ein anderer Ligand, 9-cis-RA (9C-RA) bindet und aktiviert sowohl die RARs als auch Mitglieder der Retinoid-X-Rezeptor (RXR)-Familie.
  • Es wurde in der Technik ebenfalls etabliert, dass die Verteilung der beiden Haupt-Retinoid-Rezeptortypen und der mehreren Untertypen in den verschiedenen Geweben und Organen von Säugetierorganismen nicht gleichförmig ist. Es ist darüber hinaus im Allgemeinen in der Technik akzeptiert, dass viele unerwünschte Nebenwirkungen der Retinoide durch ein oder mehrere der RAR-Rezeptorsubtypen vermittelt werden. Demgemäß wird unter den Verbindungen mit einer Agonisten-artigen Aktivität an Retinoid-Rezeptoren eine Spezifität oder Selektivität für eine der Haupttypen oder Familien und sogar eine Spezifität oder Selektivität für eine oder mehrere Subtypen innerhalb einer Familie von Rezeptoren als eine wünschenswerte pharmakologische Eigenschaft betrachtet.
  • Relativ neue Verbindungen wurden in der Technik entwickelt, die an RAR-Rezeptoren binden, ohne die Reaktion oder Reaktionen auszulösen, die durch Agonisten derselben Rezepto ren ausgelöst werden. Die Verbindungen oder Mittel, die an RAR-Rezeptoren binden, ohne eine "Retinoid"-Reaktion auszulösen, sind somit dazu in der Lage, die Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Assays und Systemen zu blockieren (in einem kleineren oder größeren Umfang). Insbesondere beschreibt hinsichtlich der wissenschaftlichen und Patentliteratur auf diesem Gebiet die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO94/14777 bestimmte heterozyklische Carbonsäure-Derivate, die an RAR-Retinoid-Rezeptoren binden und von denen behauptet wird, dass sie in ihrer Anwendung zur Behandlung bestimmter Krankheiten oder Zustände wie beispielsweise Akne, Psoriasis, rheumatoide Arthritis und Virusinfektionen von Nutzen sind. Eine ähnliche Offenbarung wird im Artikel von Yoshimura et al., J. Med. Chem. 38: 3163–3173 (1995) vorgenommen. Kaneko et al., Med. Chem. Res. 1: 220–225 (1991); Apfel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129–7133, Augusty 1992 Cell Biology; Eckhardt et al., Toxicology Letters 70: 299–308 (1994); Keidel et al., Molecular and Cellular Biology 14: 287–298 (1994); und Eyrolles et al., J. Med. Chem. 37: 1508–1517 (1994) beschreiben Verbindungen, die an einem oder mehreren der RAR-Retinoid-Subtypen eine Antagonistenartige Aktivität aufweisen.
  • Zusätzlich zu den unerwünschten Nebenwirkungen der Therapie mit Retinoid-Verbindungen tritt gelegentlich ein ernsthafter medizinischer Zustand ein, der durch Vitamin-A- oder Vitamin-A-Vorläufer-Überdosierungen verursacht ist, der sich entweder aus einer exzessiven Einnahme von Vitamin-Nahrungsergänzungsmitteln oder der Nahrungsaufnahme der Leber bestimmter Fische und Tiere, die hohe Konzentrationen des Vitamins enthalten, ergeben kann. Die chronischen oder akuten Toxizitäten, die bei einem Hypervitaminose-A-Syndrom beobachtet werden, schließen Kopfschmerzen, Hautabschuppung bzw. -abschälung, Knochentoxizität, Dyslipidämien etc. ein. In den letzten Jahren wurde klar, dass die bei Vitamin-A-Analogen beobachteten Toxizitäten, d. h. Retinoiden, im Wesentlichen diejenigen des Hypervitaminose-A-Syndroms zusammenfassen, was eine gemeinsame biologische Ursache nahelegt, d. h. eine RAR-Aktivierung. Diese Toxizitäten werden gegenwärtig hauptsächlich durch unterstützende Maßnahmen behandelt und durch Abstinenz vor einer weiteren Exposition gegenüber dem verursachenden Mittel, gleichgültig ob Leber, Vitamin-Nahrungsergänzungsmittel oder Retinoide. Während einige der Toxizitäten sich mit der Zeit erübrigen, sind andere (beispielsweise vorzeitiger Epiphysenfugenverschluss) dauerhaft.
  • Allgemein gesprochen, sind spezifische Antidote die beste Behandlung bei einer Vergiftung durch pharmakologische Wirkstoffe, jedoch weisen nur ungefähr zwei Dutzend Chemikalien oder Klassen von Chemikalien von Tausenden, die existieren, spezifische bekannte Antidote auf. Ein spezifisches Antidot würde bei der Behandlung der Hypervitaminose A und der Retinoidtoxizität klarerweise von Wert sein. Tatsächlich werden zunehmend wirksame Retinoide klinisch verwendet, und ein spezielles Antidot für eine Retinoid-Vergiftung könnte lebensrettend sein.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel 101
    Figure 00050001
    Formel 101 bei der X S, O, NR' ist, wobei R'H oder Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist oder X[C(R1)2]n ist, wobei R1 unabhängigH oder Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und n eine ganze Zahl zwischen 0 und 2 ist;
    R2 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br, I, CF3, fluorsubstituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkylthio von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
    R3 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F ist;
    m eine ganze Zahl mit dem Wert 0–3 ist;
    o eine ganze Zahl mit dem Wert 0–3 ist;
    Y eine Phenyl- oder Naphthyl-Gruppe oder ein Heteroaryl ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl besteht, wobei die Phenyl- und Heteroaryl-Gruppen wahlweise mit einer oder zwei R2-Gruppen substituiert sind;
    A(CH2)q ist, wobei q 0–5, niederes verzweigtkettiges Alkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen oder 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen oder 1 oder 2 Dreifachbindungen ist;
    B Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O oder tri-niederes Alkylsilyl ist, wobei R7 eine Alkyl-, Cycloalkyloder Alkenyl-Gruppe ist, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, wobei R8 eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl ist, wobei die Alkyl-Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder R8 Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, wobei R9 und R10 unabhängig Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, wobei R11 niederes Alkyl, Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R12 niederes Alkyl ist und R13 ein zweiwertiges Alkylradikal von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, und
    R14(R15)r-Phenyl, (R15)r-Naphthyl oder (R15)r-Heteroaryl ist, wobei die Heteroaryl-Gruppe 1 bis 3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 0, S und N besteht, wobei r eine ganze Zahl mit den Werten von 0–5 ist, und
    R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine fluorsubstituierte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxy-Gruppe ist, wobei die Alkyl-Gruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen;
    R16H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
    R17H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH oder OCOR11 ist, und p Null ist.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind zur Vermeidung bestimmter unerwünschter Nebenwirkungen von Retinoiden von Nutzen, die zur Behandlung oder Vorbeugung bestimmter Erkrankungen oder Zustände verabreicht werden. Zu diesem Zweck können die Verbindungen der Erfindung mit Retinoiden gleichzeitig verabreicht bzw. co-administriert werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls bei der Behandlung einer akuten oder chronischen Toxizität von Nutzen, die sich aus einer Überdosis oder einer Vergiftung durch Retinoidarzneistoffe oder Vitamin A ergibt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich die Verwendung von RAR-Antagonisten zur Blockierung aller oder einiger RAR-Rezeptorstellen in biologischen Systemen, einschließlich Säugetieren, um die Wirkung von RAR-Agonisten an diesen Rezeptorstellen zu verhindern oder zu vermindern. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von RAR-Antagonisten (a) zur Vorbeugung und (b) zur Behandlung einer chronischen oder akuten Retinoid-(einschließlich Vitamin A oder Vitamin-A-Vorläufer) Toxizität und Nebenwirkungen einer Retinoid-Therapie.
  • In einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines pathologischen Zustands in einem Säugetier vorgesehen. Die Zustände, die behandelt werden, sind mit einer Retinsäure-Rezeptor-Aktivität assoziiert. Dieses Verfahren schließt die Verabreichung eines Retinoid-Antagonisten oder negativen Hormons ein, das zur Bindung an einen der nachfolgenden Retinsäure-Rezeptorsubtypen in der Lage ist: RAR-α, RAR-β und RAR-γ. Der Antagonist oder das negative Hormon wird in einer Menge verabreicht, die pharmazeutisch wirksam ist, um einen therapeutischen Vorteil gegenüber dem pathologischen Zustand in dem Säugetier bereitzustellen.
  • Als Antidot für eine akute oder chronische Retinoid- oder Vitamin-A-Vergiftung kann der RAR-Antagonist einem Säugetier enteral verabreicht werden, d. h. durch intragastrische Intubation oder Nahrungs-/Wasser-Beimischung, oder parenteral, beispielsweise intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, topisch etc. Das einzige Erfordernis für den Verabreichungsweg besteht darin, dass er den Transport bzw. die Abgabe des Antagonisten an das Zielgewebe ermöglichen muss. Der RAR-Antagonist kann selbst oder in Kombination mit Trägerstoffen formuliert werden. Der RAR-Antagonist muss in der Formulierung nicht in Lösung sein, beispielsweise im Fall einer enteralen Verwendung.
  • Als Hilfsmittel zur Therapie mit Retinoiden oder um eine oder mehrere Nebenwirkungen des Retinoidarzneistoffs zu vermeiden, der verabreicht wird, kann der RAR-Antagonist in ähnlicher Weise enteral oder parenteral verabreicht werden. Der RAR-Antagonist und der RAR-Agonist brauchen nicht auf demselben Verabreichungsweg verabreicht zu werden. Der Schlüssel liegt darin, dass ausreichende Mengen des RAR-Antagonisten kontinuierlich im interessierenden Gewebe während der Exposition gegenüber dem RAR-Agonisten vorliegen. Zur Vermeidung einer Retinoidtoxizität ist es das Beste, dass der RAR-Antagonist gleichzei tig oder vor der Behandlung mit dem RAR-Agonisten verabreicht wird. In vielen Situationen wird der RAR-Antagonist auf einem anderen Weg als der Agonist verabreicht werden. Beispielsweise können unerwünschte Hautwirkungen eines enteral verabreichten Retinoids durch einen RAR-Antagonisten, der topisch verabreicht wird, vermieden oder gelindert werden.
  • Ein weiterer Grundgedanke der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Identifizieren Retinoid-negativer Hormone. Das Verfahren schließt die nachfolgenden Schritte ein: Gewinnung transfizierter Zellen, die ein Reportergen enthalten, das transkriptionell auf eine Bindung eines rekombinanten Retinoid-Rezeptors anspricht, wobei der rekombinante Retinoid-Rezeptor zumindest Proteindomänen aufweist, die C-terminal einer DNA-Bindungsdomäne eines intakten Retinoid-Rezeptors lokalisiert sind, Messen einer Basiskonzentration bzw. eines Basisniveaus einer Reportergen-Expression in unbehandelten transfizierten Zellen, wobei die unbehandelten transfizierten Zellen bei Fehlen eines zugesetzten Retinoids vermehrt werden, Behandeln der transfizierten Zellen mit einer Retinoid-Verbindung, die auf eine negative Hormonaktivität getestet werden sollen, Messen des Niveaus der Reportergen-Expression in behandelten Zellen, Vergleichen der Niveaus der Reportergen-Expression, die in behandelten Zellen und in unbehandelten Zellen gemessen wurde, und Identifizieren derjenigen Retinoid-Verbindungen, die ein niedrigeres Niveau einer Reportergen-Expression in behandelten Zellen im Vergleich mit dem Basisniveau der Reportergen-Expression, die in unbehandelten Zellen gemessen wird, erzeugen, als Retinoid-negative Hormone. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens ist der intakte Rezeptor ein RAR-α-, RAR-β- oder RAR-γ-Subtyp. Bei anderen Ausführungsformen ist der intakte bzw. vollständige Rezeptor ein RXR-α-, RXR-β- oder RXR-γ-Subtyp. Der rekombinante Rezeptor kann ebenfalls entweder ein rekombinanter RAR- oder RXR-Rezeptor sein. In einigen Ausführungsformen ist der rekombinante Rezeptor ein chimärer Retinoid-Rezeptor mit einer konstituiven Transkriptionsaktivatordomäne. Eine solche konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne kann eine Vielzahl von Aminosäuren mit einer negativen Nettoladung aufweisen oder kann eine Aminosäuresequenz einer viralen Transkriptionsaktivatordomäne aufweisen wie beispielsweise die Herpessimplex-Virus-VP-16-Transkriptionsaktivatordomäne. In Ausführungsformen, bei denen die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne eine negative Nettoladung aufweist, kann der Retinoid-Rezeptor rekombinant sein und es kann aus diesem eine DNA-Bindungsdomäne deletiert sein, wie beispielsweise eine DNA-Bindungsdomäne, die für andere cisregulatorische Elemente als ein Retinsäure-responsives Element spezifisch ist. Diese Elemente schließen ein Östrogen-responsives Element ein. Die transfizierte Zelle wird vorzugs weise in einem Wachstumsmedium vermehrt, das im Wesentlichen von endogenen Retinoiden depletiert ist, wie beispielsweise eines, das Aktivkohle-extrahiertes Serum aufweist. Bei diesem Verfahren kann das Reportergen das Luciferasegen sein, und in diesem Fall können die Messschritte eine Luminometrie einschließen. Das Reportergen kann ebenfalls das β-Galactosidase-Gen sein, und in diesem Fall würden die Messschritte einen β-Galactosidase-Assay einschließen. Die transfizierte Zelle kann eine transfizierte Säugetierzelle, wie beispielsweise eine Grüne Meerkatzen-Zelle oder eine humane Zelle sein.
  • Ein weiterer Grundgedanke der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Potenzieren bzw. Verstärken einer pharmakologischen Aktivität eines Rezeptoragonisten der Steroid-Superfamilie, der einem Säugetier verabreicht wird. Dieses Verfahren schließt das gleichzeitige Verabreichen einer Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Dosis eines Retinoid-negativen Hormons zum Verstärken der pharmakologischen Aktivität des Rezeptoragonisten der Steroid-Superfamilie umfasst, mit dem Rezeptoragonisten der Steroid-Superfamilie an das Säugetier ein. Die pharmakologische Aktivität ist in einem Reportergen Trans-Aktivierungsassay in vitro messbar, wie beispielsweise durch Messung der anti-AP-1-Aktivität. Die pharmakologische Aktivität, die potenziert werden soll, kann eine antiproliferative Aktivität sein, wie beispielsweise eine Aktivität des Typs, die in retinalem bzw. Netzhaut-Pigmentepithel messbar ist. Der Rezeptoragonist der Steroid-Superfamilie kann einer der Nachfolgenden sein: ein Retinoid-Rezeptoragonist, ein Vitamin-D-Rezeptoragonist, ein Glukokortikoid-Rezeptoragonist, ein Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonist, ein Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptoragonist oder ein Östrogen-Rezeptoragonist. Der Retinoid-Rezeptoragonist kann ein RAR-Agonist sein, wie beispielsweise all-trans-Retinsäure oder 13-cis-Retinsäure. Der Retinoid-Rezeptoragonist kann ebenfalls ein RXR-Agonist sein. Ein bevorzugter Vitamin-D-Rezeptoragonist ist 1,25-Dihydroxyvitamin D3. Ein bevorzugter Glucocorticoid-Rezeptoragonist ist Dexamethason. Ein bevorzugter Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonist ist 3,3',5-Triiodthyronin. Das Retinoid-negative Hormon ist ein RARspezifisches Retinoid-negatives Hormon, das vorzugsweise eine Dissoziationskonstante von weniger als oder ungefähr gleich 30 nM aufweist. Beispiele des RAR-spezifischen Retinoidnegativen Hormons schließen AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871 ein. Die Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Dosis eines Retinoidnegativen Hormons umfasst, kann zur selben Zeit wie der Steroid-Superfamilien-Agonist coverabreicht werden und kann vor der Co-Verabreichung kombiniert werden. Diese können ebenfalls als getrennte Zusammensetzungen co-verabreicht werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die chemische Struktur von AGN 193109.
  • Die 2A bis 2F sind eine Reihe von graphischen Darstellungen, die zeigen, dass AGN 193109 die ATRA-abhängige Transaktivierung an den RARs hemmte. Die 2A und 2B repräsentieren die Aktivität am RAR-α-Rezeptor; die 2C und 2D repräsentieren die Aktivität am RAR-β-Rezeptor; die 2E und 2F repräsentieren die Aktivität am RAR-γ-Rezeptor. In den 2A, 2C und 2E repräsentieren offene bzw. nicht ausgefüllte Quadrate eine Retinsäure-Behandlung und ausgefüllte Kreise repräsentieren eine AGN 193109-Behandlung. In den 2B, 2D und 2F repräsentieren die einfachen Linien die Luciferase-Aktivität, die nach Behandlung mit 10–8 M ATRA und variablen Konzentrationen an AGN 193109 gemessen wurden.
  • Die 3A und 3B sind graphische Liniendarstellungen, die die Luciferase-Aktivität repräsentieren, nachgewiesen in CV-1-Zellen, die mit dem Reporterplasmid ERE-tk-Luc und dem Expressionsplasmid ER-RAR-α transfiziert und mit ATRA (3A) oder AGN 193109 ( 3B) in unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert wurden. Die Datenpunkte repräsentieren den Durchschnitt ± Standardabweichung (standard error of mean = SEM) dreier unterschiedlicher Luciferase-Bestimmungen. Die Ergebnisse der Transfektionen, die unter Verwendung verschiedener Mengen von co-transfiziertem ER-RAR-α durchgeführt wurden (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Well) sind in jeder Figur angezeigt.
  • 4A und 4B sind graphische Liniendarstellungen, die die Luciferase-Aktivität in CV-1-Zellen repräsentieren, die mit Reporterplasmid ERE-tk-Luc und Expressionsplasmid ER-RAR-β transfiziert und mit ATRA (4A) oder AGN 193109 (4B) in verschiedenen Konzentrationen stimuliert wurden. Datenpunkte repräsentieren den Durchschnitt ± SEM dreier unterschiedlicher Luciferase-Bestimmungen. Die Ergebnisse der Transfektionen, die unter Verwendung verschiedener Mengen co-transfiziertem ER-RAR-β durchgeführt wurden (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Well) sind in jeder Figur angezeigt.
  • Die 5A und 5B sind graphische Liniendarstellungen, die die Luciferase-Aktivität repräsentieren, die in CV-1-Zellen nachgewiesen wurde, die mit Reporterplasmid ERE-tk-Luc und Expressionsplasmid ER-RAR-γ transfiziert und mit ATRA (5A) oder AGN 193109 ( 5B) in verschiedenen Konzentrationen stimuliert wurden. Datenpunkte repräsentieren den Durchschnitt ± SEM dreier unterschiedlicher Luciferase-Bestimmungen. Die Ergebnisse der Transfektionen, die unter Verwendung verschiedener Mengen an co-transfiziertem ER-RAR-γ durchgeführt wurden (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Well) sind in jeder Figur angezeigt.
  • 6 zeigt ATRA und AGN 193109 Dosis-Reaktionen bzw. Dosis-Wirkungen von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder dem chimären ER-RXR-α Rezeptorexpressionsplasmid alleine oder in Kombination mit dem RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmid co-transfiziert wurden. ER-RXR-α co-transfizierte Zellen wurden mit ATRA (Quadrat) und AGN 193109 (Raute) behandelt. Zellen, die mit der Kombination von ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 co-transfiziert wurden, wurden mit ATRA (Kreis) oder AGN 193109 (Dreieck) behandelt.
  • 7 zeigt eine graphische Liniendarstellung, die Luciferase-Aktivitätsmessungen darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporter und dem ER-RAR-γ-Expressionskonstrukt transfiziert und dann mit ATRA zu 10–8 M und den Testverbindungen in den auf der horizontalen Achse angezeigten Konzentrationen behandelt wurden. Die Testverbindungen waren AGN 193109 (Quadrat), AGN 193357 (offene bzw. nichtausgefüllte Raute), AGN 193385 (Kreis), AGN 193389 (Dreieck), AGN 193840 (schraffiertes Quadrat) und AGN 192870 (ausgefüllte Raute).
  • 8 zeigt eine graphische Liniendarstellung, die die Luciferase-Aktivitätsmessungen darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Reporter und RAR-γ-VP-16 und ER-RXB-α-Expressionskonstrukten transfiziert und dann mit den Restverbindungen in Konzentrationen behandelt wurden, die auf der horizontalen Achse angezeigt sind. Die Testverbindungen waren ATRA (offenes bzw. nicht-ausgefülltes Quadrat), AGN 193109 (offener bzw. nicht-ausgefüllter Kreis), AGN 193174 (nicht ausgefülltes Dreieck), AGN 193199 (schraffiertes Quadrat), AGN 193385 (schraffierter Kreis), AGN 193389 (umgekehrtes Dreieck), AGN 193840 (diagonal ausgefülltes Quadrat) und AGN 193871 (halbgefüllte Raute).
  • Die 9A, 9B und 9C zeigen schematisch einen Mechanismus, bei dem AGN 193109 die Interaktion bzw. Wechselwirkung zwischen dem RAR (schraffierte Box) und den negativen Co-Aktivator-Proteinen (–), dargestellt im Kontext eines Transaktivierungs-Assays, modulieren kann. 9A zeigt, dass negative Co-Aktivator-Proteine und positive Co-Aktivator-Proteine (+) im Bindungsgleichgewicht mit dem RAR befindlich sind. In Abwesenheit eines Ligaeden ergibt sich eine Transkription des Reportergens auf Basisniveau. Wie in 9B veranschaulicht, fördert der Zusatz eines RAR-Agonisten die Verbindung der positiven Co-Aktivator-Proteine mit dem RAR und hat die nach oben regulierte Reportergen-Transkription zur Folge. Wie in 9C dargestellt, fördert der Zusatz von AGN 193109 die Bindung der negativen Co-Aktivator-Proteine mit dem RAR und verhindert die Reportergen-Transkription.
  • 10 ist ein Balkendiagramm, das die Hemmung der TPA-induzierten Str-AP1-CAT-Expression als eine Funktion der AGN-191183-Konzentration (10–10 bis 10–12 M) zeigt, wobei die AGN-193109-Konzentration konstant bei 10–8 M gehalten wird. Ergebnisse von Versuchen, die mit AGN 191183 alleine durchgeführt wurden, sind als schraffierte Balken dargestellt, wobei gestreifte Balken Ergebnisse aus einer Behandlung mit einer Kombination von AGN 193109 und AGN 191183 darstellen.
  • 11 zeigt schematisch einen Mechanismus, wobei AGN 193109 die Aktivitäten von RARs und anderen Kernrezeptor-Familienmitgliedern potenzieren kann. Wie im Diagramm dargestellt, haben eingebrachte RARs (offene Rechtecke mit AB-C-DEF-Domänen) die Sensititivät gegenüber RAR-Liganden im Anti-AP1-Assay erhöht, weil das negative Co-Aktivator-Protein (ncp), vorliegend in begrenzender Zufuhr, auf RARs abgesondert wird, was zu zwei Populationen führt: RAR+ncp und RAR–ncp. RAR–ncp weist gegenüber Ligaeden eine erhöhte Empfindlichkeit auf. Nicht-RAR-Kernfaktoren (schraffierte Rechtecke mit AB-C-DEF-Domänen) weisen eine erhöhte Empfindlichkeit auf, Ligaeden zu erkennen, weil ncp durch die Aktivität von AGN 193109 zum RAR abgesondert wurde. Die modularen Domänen der Kernrezeptoren werden unter Verwendung einer Standardnomenklatur als "AB" (Ligandenunabhängige Transaktivierungsdomäne), "C" (DNA-Bindungsdomäne) und "DEF" (Liganden-regulierte Transaktivierungsdomäne und Dimerisierungsdomäne) bezeichnet.
  • 12 ist eine graphische Liniendarstellung, die die Wirkung von AGN 193109 auf die 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Dosisreaktion in CV-1-Zellen darstellt, die mit dem MTV-DR3-Luc-Reporterplasmid transfiziert wurden. Transfektanten wurden mit 1,25-Dihydroxyvitamin-D3 (ausgefülltes Quadrat), 1,25-Dihydroxyvitamin-D3 und 10–8 M AGN 193109 (ausgefülltes Dreieck), und 1,25-Dihydroxyvitamin-D3 und 10–7 M AGN 193109 (ausgefüllter Kreis) behandelt.
  • 13 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung einer AGN 193109 (10 nM) Coadministration auf eine 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelte Hemmung einer TPA induzierten Str-AP1-CAT Aktivität zeigt. Ausgefüllte Balken repräsentieren eine Hemmung der CAT Aktivität in transfizierten Zellen, die mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 alleine behandelt wurden. Nicht ausgefüllte Balken repräsentieren eine Hemmung der CAT Aktivität in transfizierten Zellen, die mit der Kombination von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and AGN 193109 behandelt wurden.
  • 14 ist ein graphische Liniendarstellung, die die Wirkung von AGN 193109 alleine und in Kombination mit AGN 191183 auf HeLa-Zellen zeigt, die mit RAR-γ und dem RARresponsivem MTV-TREp-Luc-Reporterkonstrukt co-transfiziert wurden. Arzneistoffbehandlungen, die in der graphischen Darstellung dargestellt sind, sind wie folgt: AGN 193109 alleine (Quadrat), AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 zu 10–10 M (Raute) und AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 zu 10–9 M.
  • 15 ist eine graphische Liniendarstellung, die zeigt, dass die ECE16-1-Zellen in Reaktion auf EGF (ausgefülltes Quadrat), jedoch nicht in Reaktion auf definiertes Medium alleine (offener Kreis) proliferierten. Zellen, die mit AGN 193109 alleine behandelt wurden, werden durch das ausgefüllte Dreieck repräsentiert. Die ausgefüllten Kreise repräsentieren die Ergebnisse, die für Zellen erzielt wurden, die mit 10 nM AGN 191183 und 0–1000 nM AGN 193109 behandelt wurden.
  • 16 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von AGN 193109 auf die Proliferation von CaSki-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit des AGN 191183 Retinoid-Agonisten zeigt. Alle Probengruppen empfingen 20 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor = EGF) mit der Ausnahme der Probe, die in definiertem Medium (DM) alleine (nicht ausgefüllter Balken) vermehrt wurde. Gestreifte Balken repräsentieren Proben, die in Abwesenheit von AGN 193109 vermehrt wurden. Ausgefüllte Balken repräsentieren Proben, die in Gegenwart von 1000 nM AGN 193109 vermehrt wurden. Die in dem Verfahren verwendeten Konzentrationen an AGN 191183 sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
  • 17 ist eine Dosiswirkungskurve, die darstellt, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von ATRA auf retinale Pigmentepithel (RPE)-Zellen verstärkte. Proben, die mit ATRA alleine behandelt wurden, sind durch ausgefüllte Quadrate repräsentiert. Proben, die mit der Kombination aus ATRA und AGN 193109 (10–7 M) behandelt wurden, sind durch ausgefüllte Kreise dargestellt. Die ATRA-Konzentration, die zur Behandlung der verschiedenen Proben verwendet wurde, ist auf der horizontalen Achse angegeben.
  • 18 ist eine Dosiswirkungskurve, die darstellt, dass sowohl 13-cis-RA als auch ATRA das Wachstum von RPE-Zellen hemmten und dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis-RA potenzierte bzw. steigerte bzw. verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosiswirkungskurve dargestellt sind, schlossen 13-cis-RA alleine (ausgefülltes Quadrat), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (ausgefüllter Kreis), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (ausgefülltes Dreieck) und ATRA (ausgefüllte Raute), ein. Die Konzentrationen an 13-cis-RA und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
  • 19 ist eine Dosiswirkungskurve, die darstellt, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Dexamethason in primären RPE-Zellkulturen verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosiswirkung dargestellt sind, schlossen ATRA (ausgefülltes Quadrat), Dexamethason alleine (ausgefüllter Kreis), Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (ausgefülltes Dreieck) und Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (ausgefüllte Raute) ein. Die Konzentrationen an Dexamethason und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
  • 20 ist eine Dosiswirkungskurve, die darstellt, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von Thyroidhormon bzw. Schilddrüsenhormon (T3) in primären RPE-Zellkulturen verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosiswirkung dargestellt sind, schlossen ATRA (ausgefülltes Quadrat), T3 alleine (ausgefüllter Kreis), T3 in Kombination mit AGN 193109 (10–8 M) (ausgefülltes Dreieck), T3 in Kombination mit AGN 193109 (10–6 M) (ausgefüllte Raute) ein. Die Konzentrationen an T3 und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein RAR-Antagonist als eine Chemikalie definiert, die an eine oder mehrere der RAR-Subtypen mit einem Kd von weniger als 1 mikromo- lar (Kd < 1 μM) bindet, die jedoch kein signifikante transkriptionelle Aktivierung der von RAR-Subtypen regulierten Genen in einem Rezeptor-Cotransfektions-Assay verursacht. Herkömmlicherweise sind Antagonisten chemische Mittel, die die Aktivitäten der Agonisten hemmen. Somit wird die Aktivität eines Rezeptor-Antagonisten herkömmlicherweise mittels seiner Fähigkeit gemessen, die Aktivität eines Agonisten zu hemmen.
  • Ein RAR-Agonist ist als ein chemisches Mittel definiert, das an einen oder mehrere RAR-Rezeptorsubtypen mit einem Kd von weniger als ein Mikromol (Kd < 1 μM) bindet und eine Transkriptionsaktivierung der RAR-Subtyp-regulierten Gene in einem Rezeptor-Cotransfektions-Assay verursacht. Der Begriff "RAR-Agonist" schließt Chemikalien ein, die zusätzlich zu RARs andere Rezeptoren, beispielsweise RXR-Rezeptoren, binden und/oder aktivieren können.
  • Wie hierin verwendet, ist ein negatives Hormon oder ein inverser Agonist ein Ligand für einen Rezeptor, der verursacht, dass der Rezeptor bezüglich eines Grundzustandes, der bei Fehlen irgendeines Ligaeden eintritt, einen inaktivierten Zustand annimmt. Somit ist ein negatives Hormon, während ein Antagonist die Aktivität eines Agonisten hemmen kann, ein Ligand, der die Konformation des Rezeptors bei Fehlen eines Agonisten verändern kann. Das Konzept eines negativen Hormons oder eines inversen Agonisten wurde durch Bond et al. in Nature 374: 272 (1995) erforscht. Insbesondere haben Bond et al. vorgeschlagen, dass nichtligandierte β2-Adrenorezeptoren in einem Gleichgewicht zwischen einer inaktiven Konformation und einer spontan aktiven Konformation vorliegen. Es wird vorgeschlagen, dass Agonisten den Rezeptor in einer aktiven Konformation stabilisieren. Im Gegensatz hierzu wird angenommen, dass inverse Agonisten eine inaktive Rezeptorkonformation stabilisieren. Somit kann ein negatives Hormon, während ein Antagonist eine Aktivität mittels der Hemmung eines Agonisten manifestiert, zusätzlich seine Aktivität bei Fehlen eines Agonisten durch Hemmen der spontanen Umwandlung eines nicht ligandierten Rezeptors in eine aktive Konformation manifestieren. Nur eine Untergruppe von Antagonisten fungiert als negative Hor mone. Wie hierin offenbart, ist AGN 193109 sowohl ein Antagonist als auch ein negatives Hormon. Bis jetzt wurde noch nicht gezeigt, dass andere Retinoide eine negative Hormonaktivität aufweisen.
  • Wie hierin verwendet, betrifft die Co-Administration bzw. gleichzeitige Verabreichung zweier pharmakologisch aktiver Verbindungen die Abgabe bzw. den Transport zweiter getrennter chemischer Einheiten, gleichgültig, ob in vitro oder in vivo. Co-Administration betrifft die gleichzeitige Abgabe getrennter Mittel; betrifft die gleichzeitige Abgabe eines Gemisches von Mitteln; ebenso wie die Abgabe eines Mittels, gefolgt von der Abgabe des zweiten Mittels. In allen Fällen ist vorgesehen, dass Mittel, die co-administriert bzw. gleichzeitig verabreicht werden, in Verbindung miteinander arbeiten.
  • Der Begriff Alkyl betrifft jede und alle Gruppen und deckt diese ab, die als normales bzw. unverzweigtes Alkyl, verzweigtkettiges Alkyl und Cycloalkyl bekannt sind. Der Begriff Alkenyl betrifft und deckt ab unverzweigte bzw. normale Alkenyl-, verzweigtkettige Alkenyl und Cycloalkenyl-Gruppen mit einer oder mehreren Stellen einer Unsättigung. In ähnlicher Weise betrifft der Begriff Alkinyl und deckt ab unverzweigte Alkinyl- und verzweigtkettige Alkinyl-Gruppen mit einen oder mehreren Dreifachbindungen.
  • Niederes Alkyl bedeutet die oben definierte breite Definition von Alkyl-Gruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen im Falle von unverzweigtem bzw. normalem niederen Alkyl und falls anwendbar, 3–6 Kohlenstoffatomen für niedere verzweigtkettige und Cycloalkyl-Gruppen. Niederes Alkenyl ist in ähnlicher Weise als 2–6 Kohlenstoffatome für unverzweigte niedere Alkenyl-Gruppen aufweisend definiert und als 3–6 Kohlenstoffatome für verzweigtkettige und Cycloalkenyl-Gruppen. Niederes Alkinyl ist ebenfalls in ähnlicher Weise definiert, mit 2–6 Kohlenstoffatomen für niedere normale Alkinyl-Gruppen und 4–6 Kohlenstoffatomen für verzweigtkettige niedere Alkinyl-Gruppen.
  • Der Begriff "Ester", wie hierin verwendet, betrifft und deckt ab jede Verbindung, die in die Definition dieses Begriffes fällt, wie er klassischerweise in der organischen Chemie verwendet wird. Er schließt organische und anorganische Ester ein. Wenn B (aus Formel 1 oder Formel 101) COOH ist, deckt dieser Begriff die Produkte ab, die aus der Behandlung dieser Funktion mit Alkohol oder Thiolen abgeleitet sind, vorzugsweise mit aliphatischen Alkoholen mit 1–6 Kohlenstoffatomen. Wenn der Ester aus Verbindungen gewonnen wird, bei/denen B CH2OH ist, deckt dieser Begriff Verbindungen ab, die aus organischen Säuren gewonnen werden, die zur Bildung von Estern in der Lage sind, einschließlich Säuren auf Phosphor- und Schwefel-Basis oder Verbindungen der Formel CH2OCOR11, wobei R11 irgendeine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder aliphatisch aromatische Gruppe ist, vorzugsweise mit 1–6 Kohlenstoffatomen in den aliphatischen Anteilen.
  • Soweit in dieser Anmeldung nichts anderes dargestellt ist, werden bevorzugte Ester aus den gesättigten aliphatischen Alkoholen oder Säuren von 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den zyklischen oder gesättigten aliphatischen zyklischen Alkoholen und Säuren von 5–10 Kohlenstoffatomen gewonnen. Besonders bevorzugte aliphatische Ester sind solche, die aus niederen Alkylsäuren und Alkoholen gewonnen werden. Ebenso bevorzugt sind die Phenyloder niederen Alkylphenylester.
  • Amide weisen die Bedeutung auf, die diesem Begriff in der organischen Chemie klassischerweise zugeordnet werden. In diesem Falle schließt er die unsubstituierten Amide und alle aliphatischen und aromatischen mono- und disubstituierten Amide ein. Soweit in dieser Anmeldung nichts anderes angegeben ist, sind bevorzugte Amide die mono- und disubstituierten Amide, die aus den gesättigten aliphatischen Radikalen aus 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den zyklischen oder gesättigten aliphatisch zyklischen Radikalen von 5–10 Kohlenstoffatomen gewonnen werden. Besonders bevorzugte Amide sind solche, die aus substituierten und unsubstituierten niederen Alkylaminen stammen. Ebenso bevorzugt sind monound disubstituierte Amide, die aus den substituierten und unsubstituierten Phenyl- oder niederen Alkylphenylaminen gewonnen wurden. Unsubstituierte Amide sind ebenfalls bevorzugt.
  • Acetale und Ketale schließen die Radikale der Formel -CK ein, wobei K(-OR)2 ist. Hier ist R niederes Alkyl. Weiterhin kann K -OR7O sein, wobei R7 ein niederes Alkyl von 2–5 Kohlenstoffatomen, verzweigtkettig oder geradkettig ist.
  • Ein pharmazeutisch verträgliches Salz kann für jede Verbindung in dieser Erfindung hergestellt werden, das eine Funktionalität aufweist die zur Bildung eines Salzes in der Lage ist, beispielsweise eine saure Funktionalität. Ein pharmazeutisch verträgliches Salz ist jedes Salz, das die Aktivität der Mutter- bzw. Stammverbindung aufrechterhält und keine schädlichen oder nachteiligen Wirkungen auf das Subjekt, dem es verabreicht wird, und in dem Kontext, in dem es verabreicht wird, ausübt.
  • Pharmazeutisch verträgliche Salze können aus organischen oder anorganischen Basen gewonnen werden. Das Salz kann ein ein- oder mehrwertiges Ion sein. Von besonderem Interesse sind die anorganischen Ionen Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium. Organische Salze können mit Aminen hergestellt werden, insbesondere Ammoniumsalze, wie beispielsweise Mono-, Di- und Trialkylamine oder Ethanolamine. Salze können ebenfalls mit Koffein, Tromethamin und ähnlichen Molekülen gebildet werden. Wenn ein Stickstoff existiert, der ausreichend basisch ist, um zur Bildung von sauren Additionssalzen bzw. sauren Anlagerungssalzen in der Lage zu sein, kann solches mit anorganischen oder organischen Säuren oder Al-kylierungsmitteln, wie beispielsweise Methyliodid, gebildet werden. Bevorzugte Salze sind solche, die mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, gebildet werden. Irgendeine von mehreren einfachen organischen Säuren wie beispielsweise Mono-, Di- oder Trisäuren, können ebenfalls verwendet werden.
  • Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können trans- und cis- (E und Z) Isomere aufweisen. Zusätzlich können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Chiralitätszentren enthalten und deswegen in enantiomeren und diastereomeren Formen existieren. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll alle solchen Isomere per se einschließen, ebenso wie Gemische von cis- und trans-Isomeren, Gemische von Diastereomeren oder ebenso razemische Gemische von Enantiomeren (optische Isomere). In der vorliegenden Erfindung ist, wenn keine spezielle Erwähnung der Konfiguration (cis, trans oder R oder S) einer Verbindung (oder eines asymmetrischen Kohlenstoffatoms) vorgenommen wurde, dann ein Gemisch solcher Isomere oder jedes der Isomere gemeint.
  • Aryl- und [3-oxo-1-propenyl]-substituierte Benzopyran-, Benzothiopyran-, 1,2-Dihydrochinolin und 5,6-Dihydronaphthalen-Derivate mit einer Retinoid-Antagonistenartigen biologischen Aktivität
  • Bezüglich des Symbols Y in Formel 101 sind die bevorzugten Verbindungen der Erfindung solche, bei denen Y Phenyl, Pyridyl, Thienyl oder Furyl ist. Noch mehr bevorzugt sind Verbindungen, bei denen Y Phenyl oder Pyridyl ist und noch mehr bevorzugt, bei denen Y Phenyl ist. Soweit es Substitutionen an den Y-(Phenyl) und Y-(Pyridyl)-Gruppen anbetrifft, sind Verbindungen bevorzugt, bei denen die Phenyl-Gruppe von den -CR16-CR17- und A-B-Gruppen 1,4 (para) substituiert ist, und bei denen der Pyridin-Ring durch die -CR16-CR17- und A-B-Gruppen 2,5 substituiert ist (eine Substitution in den 2,5-Positionen in der "Pyridin"-Nomenklatur entspricht einer Substitution in der 6-Position in der "Nikotinsäure"-Nomenklatur). Bei den bevorzugten Verbindungen der Erfindung existiert kein optionaler R2-Substituent an der Y-Gruppe.
  • Die A-B-Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist (CH2)n-COOH oder (CH2)n-COOR8, wobei n und R8 wie oben definiert sind. Noch mehr bevorzugt ist n Null und R8 ein niederes Al-kyl, oder ist n Null und B COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon.
  • In den gegenwärtig bevorzugten Beispielen von Verbindungen der Erfindung ist X [C(R1)2]n, wobei n 1 ist. Nichtsdestoweniger sind Verbindungen, bei denen X S oder 0 (Benzothiopyran und Benzopyran-Derivate) sind, ebenfalls bevorzugt. Wenn X[C(R1)2]n und n 1 ist, dann ist R1 vorzugsweise Alkyl von 1–6 Kohlenstoffatomen, noch mehr bevorzugt Methyl.
  • Die R2-Gruppe, die an den aromatischen Anteil der Tetrahydronaphthalin-, Benzopyran-, Benzothiopyran- oder Dehydrochinolin-Gruppierung der Verbindungen von Formel 101 gebunden ist, ist vorzugsweise H, F oder CF3. R3 ist vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, noch mehr bevorzugt Wasserstoff.
  • Nunmehr Bezug nehmend auf die R14-Gruppe sind Verbindungen bevorzugt, bei denen R14 Phenyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 2-Thienyl und 2-Thiazolyl ist. Die R15-Gruppe (Substituent der R14-Gruppe) ist vorzugsweise H, niederes Alkyl, Trifluormethyl, Chlor, niederes Alkoxy oder Hydroxy.
  • Bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 2 unter Bezugnahme auf Formel 102 dargestellt.
  • Figure 00200001
    Formel 102
  • Tabelle 2
    Figure 00200002
  • Biologische Aktivität, Verabreichungsarten
  • Wie oben erwähnt, sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindungen Antagonisten eines oder mehrerer RAR-Rezeptorsubtypen. Dies bedeutet, dass die Verbindungen der Erfindung an einen oder mehrere RAR-Rezeptorsubtypen binden, jedoch die Reaktion nicht auslösen, die durch Agonisten derselben Rezeptoren ausgelöst wird. Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Antagonisten aller dreier RAR-Rezeptorsubtypen (RAR-α, RAR-β und RAR-γ) und diese werden als "RAR-Panantagonisten" bezeichnet. Einige andere sind Antagonisten nur eines oder zweier RAR-Rezeptorsubtypen. Einige Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind Teilagonisten eines oder zweier RAR-Rezeptorsubtypen und Antagonisten der verbleibenden Subtypen. Die Verbindungen der Erfindung binden nicht an RXR-Rezeptoren, deswegen sind sie weder Agonisten noch Antagonisten von RXR.
  • Abhängig von der Stelle und Natur unerwünschter Nebenwirkungen, von denen erwünscht ist, dass sie unterdrückt oder gelindert werden, können Verbindungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, Antagonisten von nur einem oder zwei RAR-Rezeptorsubtypen sein. Einige gemäß der Erfindung verwendete Verbindungen können Teilagonisten eines oder zweier RAR-Rezeptorsubtypen und Antagonisten der verbleibenden Subtypen sein. Solche Verbindungen sind allgemein gesprochen gemäß der Erfindung verwendbar, wenn die Antagonistenwirkung auf denjenigen RAR-Rezeptorsubtyp (oder Subtypen) stattfindet, der in erster Linie für die Vergiftung durch Überdosierung oder für die unerwünschte Nebenwirkung oder Nebenwirkungen verantwortlich ist (sind). Es sei in dieser Verbindung angemerkt, dass allgemein gesprochen eine Verbindung als Antagonist eines gegebenen Rezeptorsubtyps betrachtet wird, wenn die Verbindung im unten beschriebenen Co-Transfektionsassay keine signifikante transkriptionelle Aktivierung des Rezeptor-regulierten Reportergens verursacht, jedoch nichtsdestotrotz an den Rezeptor mit einem Kd-Wert von weniger als ungefähr 1 μM bindet.
  • Ob eine Verbindung ein RAR-Antagonist ist und deswegen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann in den nachfolgenden Assays getestet werden.
  • Ein chimärer Rezeptor-Transaktivierungsassay, der auf eine Agonisten-artige Aktivität in den RAR-α-, RAR-β-, RAR-γ-, RXR-α-Rezeptorsubtypen testet und der auf einer Arbeit basiert, die von Feigner P. L. und Holm M. Focus Bd. 11, Nr. 2, (1989) veröffentlicht wurde, ist ausführlich in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO94/17796 beschrieben worden, veröffentlicht am 18. August 1994. Die letztere Veröffentlichung ist das PCT-Gegenstück der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/016404, eingereicht am 11. Februar 1993, die als US-Patent Nr. 5 455 265 erteilt wurde. Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen gegebenen Rezeptorsubstyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) in diesem Assay verursachen, um sich als ein RAR-Antagonist mit einer Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren.
  • Ein Holorezeptor-Transaktivierungsassay und ein Ligandenbindungsassay, der die Antagonisten/Agonisten-artige Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren Fähigkeit, an mehrere Retinoid-Rezeptorsubtypen jeweils zu binden misst, sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO93/11755 (insbesondere auf Seiten 30–33 und 37–41) veröffentlicht am 24. Juni 1993 beschrieben worden. Eine Beschreibung des Holorezeptor-Transaktivierungsassays ist auch nachstehend vorgesehen.
  • Holorezeptor-Transaktivierunsassay
  • CV1-Zellen (5000 Zellen/Well) wurden mit einem RAR-Rezeptorplasmid MTV-TREp-LUC (50 ng) zusammen mit einem der RAR-Expressionsvektoren (10 ng) in einem automatisierten 96-Well-Format durch das Kalziumphosphatverfahren von Heyman et al, Cell 68: 397–406, transfiziert. Für RXR-α- und RXR-γ-Transaktivierungsassays wurde ein RXR-responsives Reporterplasmid CRBPII-tk-LUC (50 ng) zusammen mit den geeigneten RXR-Expressionsvektoren (10 ng) im Wesentlichen wie von Heyman et al., s. o., und Allegretto et al., 7. Biol, Chem. 268: 26625–26633, beschrieben, verwendet. Für RXR-β-Transaktivierungsassays wurde ein RXR-responsives Reporterplasmid CPRE-tk-LUC (50 mg) zusammen mit RXR-β-Expressionsvektor (10 mg) wie oben beschrieben verwendet. Diese Reporter enthalten DRI-Elemente aus humanen CRBPII bzw. bestimmte DRI-Elemente vom Promotor (s. Mangelsdorf et al., The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, Seiten 319–349, Raven Press Ltd. New York und Heyman et al, oben erwähnt). Ein β-Galactosidase- (50 ng) Expressionsvektor wurde als innere bzw. interne Kontrolle in den Transfektionen verwendet, um bezüglich Variationen in der Transfektionsleistungfähigkeit zu normalisieren bzw. auszugleichen. Die Zellen wurden dreifach für 6 Stunden transfiziert, gefolgt von einer Inkubation mit Retinoiden für 36 Stunden, und die Extrakte wurden bezüglich ihrer Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten untersucht. Das ausführliche experimentelle Verfahren für Holorezeptortransaktivierungen wurde bei Heyman et al., oben, und Allegretto et al., oben erwähnt, beschrieben. Die in diesem Assay erzielten Ergebnisse sind in EC50-Zahlen ausgedrückt, wie dies ebenfalls im chimären Rezeptor-Transaktivierungsassay der Fall ist. Die Ergebnisse des Ligandenbindungsassays sind als Kd-Zahlen ausgedrückt. Siehe Cheng et al., Biochemical Pharmacology 22: 3099–3108.
  • Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen vorgegebenen Rezeptorsubtyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) im Holorezeptor-Transaktivierungsassay verursachen, um sich als ein RAR-Antagonist mit Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren. Nicht zuletzt sollte eine Verbindung an zumindest einen der RAR-Rezeptorsubtypen im Ligandenbindungsassay mit einem Kd von weniger als ungefähr 1 Mikromolar (Kd < 1 μM) binden, um dazu in der Lage zu sein, als Antagonist des gebundenen Rezeptorsubtyps zu fungieren, vorausgesetzt, dass derselbe Rezeptorsubtyp durch die Verbindung nicht signifikant aktiviert wird.
  • Tabelle 3 nachstehend zeigt die Ergebnisse des Holorezeptor-Transaktivierungsassays und Tabelle 4 offenbart die Leistungsfähigkeit (in Prozent) in diesem Assay der Testverbindung bezüglich all-frans-Retinsäure, für bestimmte beispielhafte Verbindungen der Erfindung. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse des Ligandenbindungsassays für bestimmte beispielhafte Verbindungen der Erfindung.
  • Tabelle 3
    Figure 00230001
  • 0,0 in Tabelle 3 zeigt an, dass die Verbindung in diesem Assay weniger als 20% aktiv (leistungsfähig) wie all-trans-Retinsäure ist.
  • Tabelle 4
    Figure 00240001
  • Tabelle 5
    Figure 00250001
  • 0,0 in Tabelle 5 zeigt einen Wert größer als 1000 nM
  • Wie aus den in Tabellen 3, 4 und 5 zusammengefassten Ergebnissen ersichtlich ist, sind die darin angegebenen beispielhaften Verbindungen der Erfindung Antagonisten der RAR-Rezeptorsubtypen, weisen jedoch keine Affinität zu RXR-Rezeptorsubtypen auf (andere Verbindungen der Erfindung können Antagonisten einiger, jedoch nicht aller RAR-Rezeptorsubtypen und Agonisten der verbleibenden RAR-Subtypen sein). Aufgrund dieser Eigenschaft können die Verbindungen der Erfindung dazu verwendet werden, die Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Assays zu blockieren. In Säugetieren, einschließlich Menschen, können die Verbindungen der Erfindung mit RAR-Agonisten gleichzeitig verabreicht werden und mittels einer pharmakologischen Selektivität oder ortsspezifischen Abgabe vorzugsweise die unerwünschten Wirkungen der RAR-Agonisten vermeiden. Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, eine Vitamin-A-Überdosis, akut oder chronisch, zu behandeln, die sich entweder aus einer exzessiven Einnahme von Vitamin-A-Nahrungsergänzungsmitteln oder aus der Nahrungsaufnahme von Leber von bestimmtem Fisch und Tieren ergibt, die hohe Konzentrationen an Vitamin A enthält. Noch weiter können die Verbindungen der Erfindung ebenfalls dazu verwendet werden, eine akute oder chronische Toxizität zu behandeln, die durch Retinoidarzneistoffe verursacht ist. Es ist in der Technik bekannt, dass die bei einem Hypervitaminose-A-Syndrom beobachteten Toxizitäten (Kopfschmerzen, Hautabschälung, Knochentoxizität, Dyslipidämien) mit Toxizitäten ähnlich oder sogar identisch sind, die bei anderen Retinoiden beobachtet wurden, was eine gemeinsame biologische Ursache nahelegt, d. h. eine RAR-Aktivierung. Weil die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine RAR-Aktivierung blockieren, sind sie zur Behandlung der vorhergehenden Toxizitäten geeignet.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind dazu in der Lage, eine durch RAR-Agonistenretinoide induzierte Hautreizung im Wesentlichen zu verhindern, wenn die Verbindung gemäß der Erfindung der Haut gleichzeitig verabreicht wird. In ähnlicher Weise können die Verbindungen der Erfindung topisch zur Blockierung eine Hautreizung der Haut verabreicht werden, in Patienten oder Tieren, denen RAR-Agonistenverbindungen systemisch verabreicht werden. Die Verbindungen der Erfindung können die Erholung von einer vorexistierenden Retinoidtoxizität beschleunigen, können eine Hypertriglyceridämie, die durch gleichzeitig verabreichte Retinoide verursacht wurde, blockieren und können die Knochentoxizität blockieren, die durch einen RAR-Agonisten induziert wurde (Retinoid).
  • Allgemein gesprochen, können die Antagonistenverbindungen für therapeutische Anwendungen in Säugetieren gemäß der vorliegenden Erfindung enteral oder topisch als ein Antidot gegen Vitamin A, Vitamin-A-Vorläufer oder Antidote gegenüber einer Retinoidtoxizität verabreicht werden, die sich aus einer Überdosis oder verlängerten Exposition ergibt, nachdem die Einnahme des verursachenden Faktors (Vitamin-A-Vorläufer oder anderes Retinoid) unterbrochen wurde. Alternativ werden die Antagonistenverbindungen mit Retinoidarzneistoffen gemäß der Erfindung gleichzeitig in Situationen verabreicht, in denen das Retinoid einen therapeutischen Vorteil bereitstellt, und in denen der gleichzeitig verabreichte Antagonist eine oder mehrere unerwünschte Nebenwirkungen des Retinoids lindert oder ausschaltet. Für diesen Anwendungstyp kann der Antagonist in einer ortsspezifischen Weise verabreicht werden, beispielsweise als eine topisch aufgebrachte Creme oder Lotion, während das gleichzeitig verabreichte Retinoid enteral verabreicht wird.
  • Für therapeutische Anwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Antagonistenverbindungen in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebaut, wie beispielsweise Tabletten, Pillen, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Cremes, Salben, Gels, Salben- bzw. streichfähige Zubereitungen, Lotionen und dergleichen unter Verwendung pharmazeutisch verträglicher Trägerstoffe und Träger, die in der Technik per se wohl bekannt sind. Beispielsweise ist die Herstellung topischer Zubereitungen in Remington's Pharmaceutical Science, Ausg. 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, wohl beschrieben. Zur topischen Verabreichung könnten die Antagonistenverbindungen ebenfalls als ein Pulver bzw. Puder oder Spray, insbesondere in Aerosol-Form, verabreicht werden. Wenn der Arzneistoff systemisch verabreicht werden soll, kann er als Pulver bzw. Puder, Pille, Tablette oder dergleichen oder als ein Sirup oder Elixier konfektioniert werden, das zur oralen Verabreichung geeignet ist. Zur intravenösen oder intraperitonealen Verabreichung wird die Antagonistenverbindung als eine Lösung oder Suspension verabreicht werden, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist. Es kann in bestimmten Fällen von Nutzen sein, die Antagonistenverbindungen durch Injektion zu formulieren. Es kann in bestimmten Fällen nützlich sein, die Antagonistenverbindungen in Suppositorien-Form oder als Zubereitung mit verlängerter Freisetzung zur Ablagerung unter der Haut oder als intramuskuläre Injektion zu formulieren.
  • Die Antagonistenverbindungen werden in einer therapeutisch wirksamen Dosis gemäß der Erfindung verabreicht werden. Eine therapeutische Konzentration ist diejenige Konzentration, die die Reduktion des speziellen Zustands (wie beispielsweise eine Toxizität aufgrund einer Retinoid- oder Vitamin-A-Exposition oder Nebenwirkung eines Retinoidarzneistoffes) bewirkt oder deren Ausbreitung verlangsamt. Es sollte klar sein, dass, wenn die Antagonistenverbindungen zur Blockierung einer Retinoid-induzierten Toxizität oder von Nebenwirkungen gemäß der Erfindung co-verabreicht werden, die Antagonistenverbindungen in einer prophylaktischen Weise verwendet werden, um das Ausbrechen eines speziellen Zustands bzw. Leidens, wie beispielsweise eine Hautreizung, zu vermeiden.
  • Eine nützliche therapeutische oder prophylaktische Konzentration variiert von Zustand zu Zustand, und in bestimmten Fällen kann sie mit dem Schweregad des zu behandelnden Zustands und der Empfänglichkeit des Patienten gegenüber der Behandlung variieren. Demgemäß ist keine einzige Konzentration gleichmäßig von Nutzen, sondern erfordert eine Modifikation abhängig von den Einzelheiten der chronischen oder akuten Retinoidtoxizität oder dem verwandten Zustand, der behandelt wird. Solche Konzentrationen können durch Routineexperimente erreicht werden. Es sei jedoch vorweggenommen, dass eine Zubereitung, die zwischen 0,01 und 1,0 Milligamm Antagonistenverbindung pro Milliliter Zubereitung enthält, eine therapeutisch wirksame Konzentration zur topischen Verabreichung darstellen wird. Wenn sie systemisch verabreicht wird, wird eine Menge zwischen 0,01 und 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag als ein therapeutisches Ergebnis bewirkend angesehen werden.
  • Die Basis der Nützlichkeit von RAR-Antagonisten zur Vorbeugung oder Behandlung einer RAR-Agonisten-induzierten Toxizität ist die kompetitive Hemmung der Aktivierung von RAR-Rezeptoren durch RAR-Agonisten. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Anwendungen von RAR-Antagonisten ist die Gegenwart oder Abwesenheit einer vorher existierenden Retinoidtoxizität. Die meisten der unmittelbar nachstehend beschriebenen Beispiele beziehen sich auf die Verwendung von Retinoiden zur Vermeidung einer Retinoidtoxizität, jedoch sind die hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren auch auf die Behandlung einer präexistierenden Retinoidtoxizität anwendbar.
  • Beschreibung von Experimenten, die die Anwendung von RAR-Antagonisten zur Vermeidung oder Behandlung einer Retinoidtoxizität und/oder von Nebenwirkungen von Retinoidarzneistoffen demonstrieren.
  • Beispiel 1: Eine durch topisch verabreichten Agonisten induzierte Hautirritation wird mit topisch aufgebrachtem Antagonisten behandelt
  • Die Verbindung 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalen-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure, die als AGN 191183 bezeichnet wird, ist in der Technik als potenter RAR-Agonist bekannt (s. beispielsweise den Beschreibungsteil und 2b von US-Patent Nr. 5 324 840). (Die "AGN"-Zahl ist eine willkürlich bezeichnete Bezugsziffer, die durch den Mitanmelder der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wurde).
  • 4[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869, ebenfalls als Verbindung 60a bezeichnet) ist eine Verbindung, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist. Die Verbindung ist ein RAR-Antagonist. Eine durch einen RAR-Agonisten, nämlich AGN 191183, topisch verabreicht, induzierte Hautirritation kann durch einen RAR-Antagonisten, nämlich AGN 192869, blockiert werden, das ebenfalls topisch haarlosen Mäusen verabreicht wurde.
  • Genauer gesagt wurde die Hautreizung auf einer semiquantitativen Skala durch tägliche subjektive Evaluation der Hautabschälung und Abrasionen gemessen. Eine einzige Zahl, der topische Reizungs-Score, fasst die bei einem Tier während des Verlaufs eines Experimentes induzierte Hautreizung zusammen. Der topische Reizungs-Score wird wie folgt berechnet. Der topische Reizungs-Score ist die algebraische Summe eines zusammengesetzten Abschälungs-Scores und eines zusammengesetzten Abrasions-Scores. Die zusammengesetzten Scores bewegen sich von 0–9 und 0–8 jeweils für das Abschälen und die Abrasionen und berücksichtigen den maximalen Schweregrad, den Zeitpunkt des Ausbruches und den durchschnittlichen Schweregrad des Abschälens und der Abrasionen, die beobachtet wurden.
  • Der Schweregrad des Abschälens ist auf einer 5-Punkteskala eingeteilt, und die Ernsthaftigkeit bzw. der Schweregrad der Abrasionen ist auf einer 4-Punkteskala dargestellt, wobei höhere Scores einen größeren Schweregrad widerspiegeln. Der maximale Schweregrad-Bestandteil der zusammengesetzten Scores würde der höchste tägliche Schweregrad-Score sein, der einem gegebenen Tier während des Verlaufs der Beobachtung zugeordnet werden würde.
  • Für den Zeitpunkt zu Beginn-Bestandteil des zusammengesetzten Scores wurde ein Score im Bereich von 0–4 wie folgt zugeordnet:
  • Tabelle 6
    Figure 00300001
  • Der durchschnittliche Schweregrad-Bestandteil des zusammengesetzten Scores ist die Summe der täglichen Abschälungs- oder Abrasionsscores, geteilt durch die Anzahl an Beobachtungstagen. Der erste Tag der Behandlung wird nicht gezählt, weil die Arzneistoffverbindung bis dahin noch keine Gelegenheit hatte, eine Wirkung zum Zeitpunkt der ersten Behandlung aufzunehmen.
  • Um die zusammengesetzten Abschälungs- und Abrasions-Scores zu berechnen, werden die durchschnittlichen Schweregrad- und Zeitpunkt des Beginn-Scores zusammengezählt und durch 2 geteilt. Das Ergebnis wird dem maximalen Schweregrad-Score hinzugefügt. Die zusammengesetzten Abschälungs- und Abrasions-Scores werden dann zusammengezählt, um den topischen Gesamtimtations-Score zu ergeben. Jedes Tier empfängt einen topischen Irritations-Score und die Werte werden als Durchschnitt ± Standardabweichung der individuellen Scores einer Gruppe von Tieren ausgedrückt. Die Werte werden auf die nächste ganze Zahl gerundet.
  • Weibliche haarlose Mäuse [Cr1: SKH1-hrBR] (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden topisch für 5 aufeinanderfolgende Tage mit Aceton, AGN 191183, AGN 192869 und einer bestimmten Kombination von AGN 192869 und 191183 behandelt. Die Dosen der jeweiligen Verbindungen sind in Tabelle 7 angegeben. Die Behandlungen werden auf die dorsale Haut in einem Gesamtvolumen von 4 ml/kg (~0,1 ml) aufgebracht. Die Mäuse wurden täglich beobachtet und bezüglich einer Abschälung und Abrasionen bis zu und einschließlich 3 Tagen nach der letzten Behandlung, d. h. am Tag 8, beurteilt.
  • Tabelle 7
    Figure 00310001
  • Die topischen Reizungs-Scores für Beispiel 1 sind in Tabelle 7 angegeben. Weder Aceton (Träger) noch AGN 192869 (Antagonist) verursachten in einer Dosis von 1,5 mg/kg/Tag (Gruppe F) eine beobachtbare topische Irritation. AGN 191183, der RAR-Agonist, verursachte eine bescheidene topische Irritation in einer Dosis von 0,025 mg/kg/Tag. Jedoch wurde eine AGN 191183 induzierte topische Irritation in einer Dosis-abhängigen Weise durch AGN 192869 mit einer nahezu vollständigen Aushebung der Irritation in Gegenwart eines 50fachen molaren Überschusses von AGN 192869 gehemmt. Dies zeigt, dass ein topischer RAR-Antagonist die durch einen topischen RAR-Agonisten verursachte Hautreizung blockiert. Eine vollständige Blockade einer RAR-Agonisten-induzierten Hautreizung kann mit niedrigeren molekularen Verhältnissen von Antagonist zu Agonist erreicht werden, wenn die RAR-Antagonisten wirkungsvoller sind, wie beispielsweise die Verbindung 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, in dieser Anmeldung ebenfalls als Verbindung 60 bezeichnet):
  • Beispiel 2: Durch oral aufgebrachten Antagonisten induzierte Hautreizung wird durch topisch verabreichten Antagonisten blockiert
  • Der wirkungsvolle RAR-Agonist AGN 191183 (4-[(E)-2-(5,8,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylriaphthalen-2-yl)propen-1-yl)benzoesäure) und der wirkungsvolle RAR-Antagonist 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]-benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) wurden in diesem Beispiel verwendet, und das Körpergewicht experimenteller Tiere (Mäuse) wurde als Marker einer systemischen RAR-Agonistenexposition verwendet.
  • Gruppen von weiblichen haarlosen Mäusen (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden mit einer intragastrischen Intubation mit Maisöl oder AGN 191183 (0,26 mg/kg), suspendiert in Maisöl (5 ml/kg) behandelt. Die Mäuse wurden gleichzeitig topisch auf der dorsalen Haut mit Vehikulum (97,6% Aceton/2,4% Dimethylsulfoxid) oder mit Lösungen aus AGN 193109 in Vehikulum (6 ml/kg) behandelt. Spezielle Dosen für die unterschiedlichen Behandlungsgruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Die Behandlungen wurden täglich für 4 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die Mäuse wurden gewogen und bezüglich ihrer topischen Irritation täglich wie in Beispiel 1 bis zu und einschließlich 1 Tag nach der letzten Behandlung eingeteilt. Die prozentuale Veränderung des Körpergewichts wird durch Subtrahieren des endgültigen Körpergewichts (Tag 5) vom anfänglichen Körpergewicht (Tag 1), durch Teilen des anfänglichen Körpergewichts und durch Multiplizieren mit 100% berechnet. Die topischen Irritations-Scores werden wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.
  • Die topischen Irritations-Scores und der Gewichtsverlust für die unterschiedlichen Gruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Die kombinierte Behandlung mit den topischen und oralen Vehikeln, d. h. Aceton, bzw. Maisöl, verursachten keine topische Irritation oder Gewichtsverlust. In ähnlicher Weise hat eine kombinierte Behandlung mit dem oralen Vehikulum und dem topischen Antagonisten AGN 193109 keine topische Irritation oder Gewichtsverlust zur Folge. Eine orale Behandlung mit AGN 191183 selbst induzierte einen beträchtlichen Gewichtsverlust und eine Hautreizung. Eine AGN 191183 induzierte Hautirritation wurde im Wesentlichen reduziert, wenn sie mit der niedrigeren Dosis von AGN 193109 kombiniert wurde, und wurde bei der höheren Dosis von AGN 193109 vollständig blockiert. Ein AGN-193183-induzierter Gewichtsverlust wurde ebenfalls in einer Dosis-abhängigen Weise durch topisches AGN 193109 blockiert, jedoch war die Blockade nicht vollständig. Somit blockierte topisches AGN 193109 vorzugsweise die dermale Toxizität von AGN 191183. Schätzungsweise wurden die niedrigen Konzentrationen von AGN 193109 systemisch absorbiert und blockierten somit teilweise den durch AGN 191183 induzierten Gewichtsverlust. Jedoch wäre eine derartige Absorption sogar noch geringer in einer Spezies mit wenig permeabler Haut, wie beispielsweise Menschen. Alternativ könnte eine Gewichtsverlusthemmung durch AGN 193109 auf eine Linderung der durch AGN 191183 verursachten Hautreizung zurückzuführen sein.
  • Tabelle 8
    Figure 00330001
  • Somit zeigt Beispiel 2, dass topisch verabreichte RAR-Antagonisten in erster Linie zur Blockierung der durch einen RAR-Agonisten, der oral verabreicht wurde, induzierten Hautirritation verwendet werden können.
  • Beispiel 3: Ein topisch verabreichter Antagonist beschleunigt die Erholung von einer präexistierenden Retinoidtoxizität
  • In diesem Beispiel wird ein Gewichtsverlust durch topische Behandlung mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 induziert und dann werden die Testtiere topisch mit entweder Vehikulum oder dem RAR-Antagonisten AGN 193109 behandelt.
  • Weibliche haarlose Mäuse (8–12 Wochen alt, n = 5) wurden topisch mit AGN 191183 (0,13 mg/kg/Tag) in Vehikulum (97,6% Aceton/2,4% DMSO, 4 ml/kg) täglich für 2 Tage behandelt. Gruppen dieser gleichen Mäuse (n = 5) wurden dann topisch entweder mit Vehikulum oder AGN 193109 in Vehikulum (4 ml/kg) täglich für 3 aufeinanderfolgende Tage, beginnend am Tag 3, behandelt. Die Mäuse wurden an den Tagen 1–5 und am Tag 8 gewogen. Die Körpergewichte sind als Durchschnittswert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Mittelwerte wurden statistisch unter Verwendung eines ungepaarten, zweiseitigen t-Tests verglichen. Die Unterschiede wurden auf p < 0,05 als signifikant erachtet.
  • Tabelle 9
    Figure 00340001
  • Der Zeitverlauf der Körpergewichte in Beispiel 3 ist in Tabelle 9 angegeben. Die Körpergewichte beider Mausgruppen wurden parallel an den Tagen 2 und 3 als Folge einer AGN-191183-Behandlung an den Tagen 1 und 2 gesenkt. Die Körpergewichte in den beiden Gruppen waren an den Tagen 1, 2 oder 3 nicht signifikant verschieden. Jedoch erhöhte eine AGN-193109-Behandlung das Körpergewicht bezüglich der Vehikulum-Behandlung an den Tagen 4 und 5 signifikant. Diese Daten zeigen an, dass eine Erholung von einem AGN-191183-induzierten Körpergewichtsverlust durch anschließende Behandlung mit AGN 193109 beschleunigt wurde. Die Körpergewichte waren zwischen den beiden Gruppen der Mäuse am Tag 8 nicht signifikant verschieden, was anzeigt, dass eine volle Genesung in beiden Gruppen; denen ausreichend Zeit gegeben wurde, erreichbar war. Somit sind RAR-Antagonisten in der Linderung einer RAR-Agonisten-induzierten Toxizität sogar dann effektiv, wenn eine RAR-Agonisten-induzierte Toxizität einer RAR-Antagonistenbehandlung vorangeht, d. h. in dem RAR-Agonisten-Vergiftungsszenario.
  • Beispiel 4: Oral verabreichter Antagonist blockiert eine Hypertrigliceridämie, die durch oral co-administrierten Retinoidagonisten induziert wurde
  • 5-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphthalen-2-yl)propen-1-yl]-2-thiophencarbonsäure ist ein bekannter RAR/RXR-Panagonist (s. US-Patent Nr. 5 324 840, Spalte 32) und wird als AGN 191659 bezeichnet. Diese Verbindung wurde oral dazu verwendet, eine akute Hypertriglyceridämie in Ratten zu induzieren und AGN 193109, Verbindung 60, wurde oral gleichzeitig verabreicht, um die durch AGN 191659 induzierte Hypertriglyceridämie zu blockieren.
  • Männliche Fischer-Ratten (6–7 Wochen alt, n = 5) wurden durch intragastrische Intubation mit Maisöl (Träger), AGN 191659, AGN 193109 oder durch eine Kombination von AGN 19.1659 und AGN 193109 behandelt. AGN 191659 und AGN 193109 wurden als feine Suspensionen in Maisöl verabreicht. Das experimentelle Design einschließlich der Dosierungen ist in Tabelle 10 angegeben.
  • Blut wurde von der Vena cava inferior unter Kohlendioxid-Narkose gewonnen. Das Serum wurde aus dem Blut durch Niedergeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt. Die Gesamtserumtriglyceride (Triglyceride + Glycerol) wurden mit einem standardspektrophotometrischen Endpunktassay gemessen, der als ein Kit im Handel erhältlich ist und an ein 96-Well-Plattenformat angepasst ist. Die Serumtriglycerid-Konzentrationen werden als Durchschnitt ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Durchschnitte bzw. Mittelwerte wurden durch einseitige Varianzanalyse gefolgt von Dunnetts Test statistisch verglichen, wenn signifikante Unterschiede gefunden wurden. Die Unterschiede wurden bei p < 0,05 als signifikant erachtet.
  • Wie in Tabelle 10 dargestellt ist, verursachte AGN 191659 selbst eine signifikante Anhebung der Serumtriglyceride bezüglich der Vehikulum-Behandlung. AGN 193109 erhöhte die Serumtriglyceride selbst nicht signifikant. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Kombination von AGN 193109 und AGN 191659 in den Molverhältnissen von 1 : 1 und 5 : 1 die Serumtriglyceride auf Konzentrationen reduziert, die von der Kontrolle nicht signifikant verschieden waren.
  • Tabelle 10
    Figure 00350001
  • Beispiel 4 zeigt, dass ein RAR-Antagonist zur Blockierung einer durch gleichzeitig verabreichtes Retinoid induzierten Hypertriglyceridämie verwendet werden kann.
  • Beispiel 5: Ein parenteral angewendeter Antagonist blockiert die Knochentoxizität, die durch parenteral gleichzeitig verabreichten Retinoidagonisten induziert worden ist
  • Beispiel 5 zeigt, dass RAR-Antagonisten die durch einen RAR-Agonisten induzierte Knochentoxizität blockieren können. In diesem Beispiel wird AGN 193109 dazu verwendet, einen frühreifen bzw. vorzeitigen Epiphysenfugen-Verschluss zu blockieren, der durch einen gleichzeitig verabreichten RAR-Agonisten, nämlich AGN 191183, in Meerschweinchen verursacht wurde.
  • Der Gruppe von männlichen Hartley-Meerschweinchen (~3 Wochen alt, n = 4) wurden intraperitoneal osmotische Pumpen implantiert, die Vehikulum (20% Dimethylsulfoxid/80% Polyethylenglycol-300), AGN 191183 (0,06 mg/ml) oder AGN 191183 (0,06 mg/ml) in Kombination mit AGN 193109 (0,34 mg/ml) enthielten. Die osmotischen Pumpen wurden durch den Hersteller so entwickelt, dass sie ungefähr 5 μl Lösung pro Stunde kontinuierlich 14 Tage lang abgaben.
  • Die Tiere wurden durch Kohlendioxid-Erstickung 14 Tage nach Implantation getötet. Das linke Schienbein wurde entfernt und in 10%-gepuffertem Formalin angeordnet. Die Schienbeine wurden durch Exposition gegenüber einer Ameisensäure/Formalin-Lösung 34 Tage lang entkalzifiziert und Paraffinschnitte wurden hergestellt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin durch Standardverfahren angefärbt. Die proximale Schienbein-Epiphysenfizge wurde untersucht und als geschlossen oder nicht geschlossen gescored. Der Epiphysenfugenverschluss ist für diesen Zweck als jede Störung der Kontinuität des Wachstums von Epiphysenfugenknorpel definiert, d. h. Ersatz durch Knochen- und/oder fibroblastisches Gewebe.
  • Keines der 4 Vehikulum-behandelten Meerschweinchen zeigte einen Epiphysenfugenverschluss am Ende des Experimentes. Dies war zu erwarten, weil die proximale Epiphysenfuge des Meerschweinchen-Schienbeins sich normalerweise nicht schließt, bis die Tiere zumindest 10 Monate alt sind. Alle vier AGN-191183-behandelten Meerschweinchen zeigten einen teilweisen oder vollständigen Epiphysenfugenverschluss. Jedoch zeigte keines der mit der Kombination aus AGN 191183 und AGN 193109 behandelten Meerschweinchen einen Epiphysenfugenverschluss. Somit blockierte AGN 193109 in einem 5fachen molaren Über schuss eine AGN-191183-induzierte Knochentoxizität vollständig, wenn diese Verbindungen gleichzeitig parenteral verabreicht wurden.
  • RAR-Antagonistenverbindungen
  • Die Verbindungen 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl] benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) und 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869), Verbindung 60a) sind Beispiele für RAR-Antagonisten, die in den oben beschriebenen Tiertests zur Blockierung von RAR-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Die Verbindungen der nachfolgenden Formel (Formel 1) dienen als weitere und allgemeine Beispiele für zusätzliche RAR-Antagonistenverbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Figure 00370001
    Formel 1
  • In Formel 1 ist XS,O,NR', wobei R'H oder Alkyl aus 1–6 Kohlenstoffatomen ist, oder
    ist X [C(R1)2]n, wobei R1H oder Alkyl von 1–6 Kohlenstoffatomen ist und n eine ganze Zahl zwischen 0 oder 1 ist;
    ist R2 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1–6 Kohlenstoffatomen, F, CF3, Fluor-substituiertes Alkyl von 1–6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy von 1–6 Kohlenstoffatomen oder Al-kylthio von 1–6 Kohlenstoffatomen;
    ist R3 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1–6 Kohlenstoffatomen oder F;
    ist m eine ganze Zahl mit dem Wert von 0–3;
    ist o eine ganze Zahl mit dem Wert von 0–3;
    ist Z -C≡C-, -N=N-, -N=CR1-, -CR1=N, -(CR1=GR1)n' wobei n' eine ganze Zahl mit dem Wert von 0–5 ist, -CO-NR1-, -CS-NR1-, -NR1-CO, -NR1-CS, -COO-, -OCO-, -OCS-, is-CSO-, t Y eine Phenyl- oder Naphthyl-Gruppe oder ein Heteroaryl, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl besteht, wobei die Phenyl- und Heteroaryl-Gruppen wahlweise mit einer oder zwei R2-Gruppen substituiert sind, oder
    wenn Z-(CR1=CR1)n' ist und n' 3, 4 oder 5 ist, dann Y eine direkte Valenzbindung zwischen der (CR2=CR2)n'-Gruppe und B ist;
    ist A (CH2)q, wobei q 0–5 ist, niederes verzweigtkettiges Alkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Doppelbindungen ist, Alkinyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Dreifachbindungen ist;
    ist B Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O, oder niederes Trialkylsilyl ist, wobei R7 eine Alkyl-, Cycloalkyloder Alkenyl-Gruppe, die 1–5 Kohlenstoffatome enthält, wobei R8 eine Alkyl-Gruppe von 1-10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl ist, wobei die Alkyl-Gruppe 1–10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5–10 Kohlenstoffatomen, oder R8 Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R9 und R10 unabhängig Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe von 1–10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5–10 Kohlenstoffatomen ist, oder Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R11 niederes Alkyl, Phenyl oder niederes Al-kylphenyl ist, R12 niederes Alkyl und R13 zweiwertiges Alkylradikal von 2–5 Kohlenstoffatomen ist, und
    ist R14(R15)r-Phenyl, (R15)r-Naphthyl oder (R15)r-Heteroaryl, wobei die Heteroaryl-Gruppe 1–3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 0, S und N besteht, wobei r eine ganze Zahl mit den Werten von 0–5 ist, und
    R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, eine Alkyl-Gruppe mit 1–10 Kohlenstoffatomen, eine Fluor-substituierte Alkyl-Gruppe mit 1–10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyl-Gruppe mit 1–10 Kohlenstoffatomen und 1–3 Doppelbindungen, eine Alkinyl-Gruppe mit 1–10 Kohlenstoffatomen und 1–3 Dreifachbindungen, oder eine Trialkylsilyl oder Trialkylsilyloxy-Gruppe ist, wobei die Alkyl-Gruppen unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweisen.
  • Syntheseverfahren – Aryl-substituierte Verbindungen
  • Die beispielhaften RAR-Antagonistenverbindungen nach Formel 1 können durch die hierin dargestellten chemischen Synthesewege hergestellt werden. Der Synthesechemiker wird leicht verstehen, dass die hierin dargestellten Bedingungen spezielle Ausführungsformen sind, die auf jede und alle der durch Formel 1 repräsentierten Verbindungen verallgemeinert werden können.
  • Reaktionsschema 1
    Figure 00400001
  • Reaktionsschema 1 (Fortsetzung)
    Figure 00410001
  • Reaktionsschema 1 stellt die Synthese der Verbindungen von Formel 1 dar, wobei die Z-Gruppe eine Ethinyl-Funktion(-C≡C) ist und X [C(R1)2]n ist, wobei n 1 ist. In anderen Worten stellt Reaktionsschema 1 die Synthese von Ethinyl-substituierten Dehydronaphthalenderivaten der vorliegenden Erfindung dar. Gemäß dieses Schemas wird eine Tetrahydronaphthalen-1-on-Verbindung von Formel 6 bromiert, um das Bromderivat von Formel 7 bereitzustellen. Die Verbindungen der Formel 6 tragen bereits die erwünschten R1-, R2- und R3-Substituenten, wie diese oben in Verbindung mit Formel 1 definiert sind. Ein bevorzugtes Beispiel der Verbindung nach Formel 6 ist 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalenon, das in der chemischen Literatur beschrieben ist (Arnold, et al., J. Am. Chem. Soc. 69; 2322-2325 (1947)). Ein gegenwärtig bevorzugter Weg zur Synthese dieser Verbindung aus 1-Brom-3-phenylpropan ist ebenfalls im experimentellen Abschnitt der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
  • Die Verbindungen der Formel 7 werden dann mit (Trimethylsilyl)acetylen umgesetzt, um die (Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten 3,4-Dihydro-naphthalen-1(2H)-on-Verbindungen der Formel 8 bereitzustellen. Die Umsetzung mit (Trimethylsilyl)acetylen wird typischerweise unter Wärme bzw. Hitze (ungefähr 100°C) in Gegenwart von Kupferiodid, eines geeigneten Katalysators, der typischerweise die Formel Pd(PPh3)2Cl2 aufweist, eines Säureakzeptors (wie beispielsweise Triethylamin) unter einer Inertgas(Argon)-Atmosphäre durchgeführt. Die typische Umsetzungszeit beträgt ungefähr 24 Stunden. Die (Trimethylsilyl)ethinyl-substituierte 3,4-Dihydro-naphthalen-1(2H)-on-Verbindungen von Formel 8 werden dann mit einer Base (Kaliumhydroxid oder Kaliumcarbonat) in einem alkoholischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol umgesetzt, um die Ethinyl-substituierten 3,4-Dihydro-1-naphthalen-1(2H)-one der Formel 9 bereitzustellen. Die Verbindungen der Formel 9 werden dann mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagenz X1-Y(R2)-A-B' (Formel 10) in Gegenwart von Kupferiodid, einem geeigneten Katalysator, typischerweise Pd(PPh3)2Cl2, einem Säureakzeptor, wie beispielsweise Triethylamin, unter einer Inertgas (Argon)-Amosphäre gekoppelt bzw. gebunden. Alternativ kann ein Zinksalz (oder ein anderes geeignetes Metallsalz) der Verbindungen der Formel 9 mit den Reagenzien der Formel 10 in Gegenwart von Pd(PPh3)4 oder eines ähnlichen Komplexes gebunden werden. Die Kopplungsreaktion mit dem Reagenz X1-Y(R2)-A-B' (Formel 10) wird typischerweise bei Raumtemperatur oder moderat erhöhten Temperaturen durchgeführt.
  • Allgemein gesprochen, ist das Koppeln zwischen einem Ethinylaryl-Derivat oder dessen Zinksalz und einer Halogen-substituierten Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung, wie beispielsweise dem Reagenz von Formel 10, im US-Patent Nr. 5 264 456 beschrieben. Die Verbindungen der Formel 11 sind Vorläufer beispielhafter Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder von Derivaten hiervon, die bezüglich der B'-Gruppe geschützt sind, von denen die Schutzgruppe in einfacher Weise durch in der Technik bekannte Reaktionen entfernt werden kann. Die Verbindungen der Formel 11 können ebenfalls in weitere Vorläufer der beispielhaften Verbindungen durch solche Reaktionen und Transformationen umgewandelt werden, wie sie in der Technik wohl bekannt sind. Solche Reaktionen sind in Reaktionsschema 1 durch Umwandlung in "Homologe und Derivate" angezeigt. Eine solche, für die Synthese mehrerer beispielhafter Verbindungen verwendete Umwandlung ist eine Verseifung einer Ester-Gruppe (wenn B oder B' ein Ester ist), um die freie Carbonsäure oder deren Salz bereitzustellen.
  • Die Halogen-substituierten Aryl oder Heteroaryl-Verbindungen von Formel 10 können allgemein gesprochen durch in der Technik wohl bekannte Reaktionen bzw. Umsetzungen gewonnen werden. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist Ethyl-4-iodbenzoat, das beispielsweise durch Veresterung von 4-Iodbenzoesäure gewinnbar ist. Ein weiteres Beispiel ist 6-Iodnicotinat, das durch Durchführung einer Halogen-Austauschreaktion mit 6-Chlornicotinsäure, gefolgt von Veresterung, gewonnen werden kann. Noch allgemeiner gesprochen, kann hinsichtlich der Derivatisierung der Verbindungen von Formel 11 und/oder der Synthese von Aryl- und Heteroaryl-Verbindungen von Formel 10, die danach mit den Verbindungen von Formel 9 behandelt werden können, die nachfolgenden wohl bekannten und veröffentlichten allgemeinen Prinzipien und Synthesemethodologien verwendet werden.
  • Carbonsäuren werden typischerweise durch Rückflusskühlung der Säure in einer Lösung des geeigneten Alkohols in Gegenwart eines sauren Katalysators wie beispielsweise Salzsäure oder Thionylchlorid verestert. Alternativ kann die Carbonsäure mit dem geeigneten Alkohol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodümid und Dimethylaminopyridin kondensiert werden. Der Ester wird gewonnen und durch herkömmliche Mittel gereinigt. Acetale und Ketale werden in einfacher Weise durch die in March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company, Seite 810, beschriebenen Verfahren hergestellt. Alkohole, Aldehyde und Ketone können durch Bildung von jeweils Ethern und Estern, Acetalen oder Ketalen durch bekannte Verfahren wie beispielsweise solche, die bei McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 und Protecting Groups, Hg. Greene, John Wiley & Sons, 1981, beschrieben sind, geschützt werden.
  • Um den Wert n in den Verbindungen der Formel 10 zu erhöhen, bevor die Kopplungsreaktion von Reaktionsschema 1 bewirkt wird (wobei solche Verbindungen, die Formel 10 entsprechen, nicht aus kommerzieller Quelle verfügbar sind), werden aromatische oder heteroaromatische Carbonsäuren einer Homologisierung durch aufeinanderfolgende Behandlung unter Arndt-Eistert-Bedingungen oder anderen Homologisierungs-Verfahren unterworfen. Alternativ können Derivate, die nicht Carbonsäuren sind, ebenfalls durch geeignete Verfahren homologisiert werden. Die homologisierten Säuren können dann durch allgemeine Verfahren verestert werden, die im vorhergehenden Absatz beschrieben wurden.
  • Verbindungen der Formel 10 (oder andere Zwischenprodukte oder beispielhafte Verbindungen), bei denen A eine Alkenyl-Gruppe mit einer oder mehreren Doppelbindungen ist, können beispielsweise durch Syntheseschemata hergestellt werden, die dem praktizierenden organischen Chemiker wohl bekannt sind; beispielsweise durch Wittig und dergleichen Reaktionen oder durch Einführung einer Doppelbindung durch Eliminierung von Halogen aus einer alpha-Haloarylalkylcarbonsäure, -ester oder dergleichen Carboxaldehyd. Verbindungen von Formel 10 (oder andere Zwischenprodukte oder beispielhafte Verbindungen, bei denen die A-Gruppe eine Dreifach(Acetylen)bindung aufweist, können durch Umsetzung eines entsprechenden aromatischen Methylketons mit einer starken Base, wie beispielsweise Lithiumdiisopropylamid, durch Umsetzung mit Diethylchlorphosphat und anschließendem Zusatz bzw. Addition von Lithiumdiisopropylamid hergestellt werden.
  • Die aus den Verbindungen von Formel 11 (oder anderen Zwischenprodukten oder beispielhaften Verbindungen) abgeleiteten Säuren und Salze sind aus den entsprechenden Estern leicht erhältlich. Eine basische Verseifung mit einer Alkalimetallbase wird die Säure bereitstellen. Beispielsweise kann ein Ester von Formel 11 (oder andere Zwischenprodukte oder beispielhafte Verbindungen) in einem polaren Lösungsmittel wie beispielsweise einem Alkanol, vorzugsweise unter Inertatmosphäre bei Raumtemperatur, mit einem ungefähr dreimolaren Überschuss an Base, beispielsweise Lithiumhydroxid oder Kaliumhydroxid, gelöst werden. Die Lösung wir für eine ausgedehnte Zeitspanne zwischen 15 und 20 Stunden gerührt, abgekühlt, angesäuert und das Hydrolysat durch herkömmliche Mittel gewonnen.
  • Das Amid kann durch irgendwelche geeigneten Amidierungsmittel gebildet werden, die in der Technik bekannt sind, aus den entsprechenden Estern oder Carbonsäuren. Ein Weg, solche Verbindungen herzustellen, besteht darin, eine Säure in ein Säurechlorid umzuwandeln und dann diese Verbindung mit Ammoniumhydroxid oder einem geeigneten Amin zu behandeln.
  • Alkohole werden durch Umwandlung der entsprechenden Säure zum Säurechlorid mit Thionylchlorid oder anderen Mitteln hergestellt (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company), und indem dann das Säurechlorid mit Natriumborhydrid (March, s. oben, Seite 1124) reduziert wird, was die entsprechenden Alkohole ergibt. Alternativ können Ester mit Lithiumaluminiumhydrid bei reduzierten Temperaturen reduziert werden. Eine Alkylierung dieser Alkohole mit geeigneten Alkylhalogeniden unter Williamson-Reaktionsbedingungen (March, ebd., Seite 357) ergibt die entsprechenden Ether. Diese Alkohole können zu Estern umgewandelt werden, indem diese mit geeigneten Säuren in Gegenwart von sauren Katalysatoren oder Dicyclohexylcarbodümid und Dimethylaminopyridin umgesetzt werden.
  • Aldehyde können aus den entsprechenden primären Alkoholen unter Verwendung milder Oxidationsmittel, wie beispielsweise Pyridiniumdichromat in Methylenchlorid (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979) oder Dimethylsulfoxid/Oxalylchlorid in Methylenchlorid (Omura, K., Swem, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)) hergestellt werden.
  • Ketone können aus einem geeigneten Aldehyd durch Behandlung des Aldehyds mit einem Alkyl-Grignard-Reagenz oder einem ähnlichen Reagenz, gefolgt von Oxidation, hergestellt werden.
  • Acetale oder Ketale können aus dem entsprechenden Aldehyd oder Keton durch das in March, ebd., Seite 810, beschriebene Verfahren hergestellt werden.
  • Verbindungen der Formel 10 (oder andere Zwischenprodukte oder beispielhafte Verbindungen), bei denen BH ist, können aus den entsprechenden halogenierten aromatischen oder heteroaromatischen Verbindungen hergestellt werden, bei denen vorzugsweise das Halogen I ist.
  • Um auf das Reaktionsschema 1 zurückzukommen, werden die Verbindungen von Formel 11 mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, bei niedrigen Temperaturen (–78°C und 0°C) umgesetzt. Dies ist in Reaktionsschema 1 dargestellt, wo das gewöhnlich unisolierte Natriumsalz-Zwischenprodukt in Klammern als Formel 12 dargestellt ist. Die Umsetzung hat die in Formel 13 dargestellten Trifluormethylsulfonyloxy-Derivate zur Folge (Tf-SO2CF3). Die Verbindungen der Formel 13 werden dann in die beispielhaften Verbindungen der Erfindung, dargestellt in Formel 14, durch Umsetzung mit einem organometallischen Derivat, das aus der Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung R14H gewonnen wird, umgewandelt, so dass die Formel des organometallischen Derivates R14Met ist (Met steht für einwertiges Metall), vorzugsweise R14Li (R14 ist wie in Verbindung mit Formel 1 definiert). Die Reaktion mit dem organometallischen Derivat, vorzugsweise Lithiumderivat der Formel R14Li wird üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ (wie beispielsweise Tetrahydrofuran) in Gegenwart von Zinkchlorid (ZnCl2) und Tetrakis(tiphenylphosphin)-palladium (0) (Pd(PPh3)4) durchgeführt. Das Organolithiumreagenz R14Li kann, falls es nicht im Handel erhältlich ist, aus der Verbindung R14H (oder dessen Halogenderivat R14-X1, wobei X1 Halogen ist) in einem Lösungsmittel vom Ether-Typ gemäß der in der Technik bekannten Praxis hergestellt werden. Der Temperaturbereich für die Umsetzung zwischen dem Reagenz R14Li und den Verbindungen der Formel 13 ist allgemein gesprochen im Bereich von ungefähr –78°C bis 50°C. Die Verbindungen von Formel 14 können in weitere Homologe und Derivate gemäß der oben diskutierten Umsetzungen umgewandelt werden.
  • Die 7-Brom-tetrahydronaphthalen-1-on-Zwischenproduktverbindungen von Formel 7, die in Reaktionsschema 1 dargestellt sind, können ebenfalls mit einem Grignard-Reagenz der Formel R14MgBr(R14 ist wie in Verbindung mit Formel 1 definiert) umgewandelt werden, um den tertiären Alkohol von Formel 15 zu gewinnen. Der tertiäre Alkohol wird durch Behandlung mit einer Säure dehydriert, um die 3,4-Dihydro-7-bromnaphthalen-Derivate von Formel 16 bereitzustellen, die als Zwischenprodukte für die Synthese zusätzlicher Verbindungen der vorliegenden Erfindung dienen (s. Reaktionsschemen 6, 7 und 8).
  • Reaktionsschema 2
    Figure 00470001
  • Nunmehr Bezug nehmend auf Reaktionsschema 2, ist ein Syntheseweg für solche Verbindungen offenbart, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1 X S, 0 oder NR' ist und die Z-Gruppe eine Ethinyl-Funktion (-C≡C-) ist. Ausgangsmaterial für diese Reaktionsfolge ist ein Bromphenol, Bromthiophenol oder Bromanilin der in Formel 17 dargestellten Struktur. Um die vorliegende Beschreibung zu vereinfachen, kann in der vorliegenden Beschreibung X in erster Linie als Schwefel wie für die Herstellung von Benzothiopyran-Derivaten betrachtet werden. Es sollte jedoch daran gedacht werden, dass das hierin beschriebene Schema ebenfalls zur Herstellung von Benzopyran (X=O) und Dihydrochinolin (X=NR')-Verbindungen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, mit solchen Modifikationen, wie sie sich für den Fachmann auf dem Gebiet in einfacher Weise ergeben. Somit wird die Verbindung von Formel 17, vorzugsweise Parabromthiophenol, Parabromphenol oder Parabromanilin unter basischen Bedingungen mit einer 3-Bromcarbonsäure der Formel 18 umgesetzt. In diesem Reaktionsschema weisen die Symbole die in Verbindung mit Formel 1 beschriebene Bedeutung auf. Ein Beispiel für das Reagenz der Formel 18, bei dem R3 Wasserstoff ist, ist 3-Brompropionsäure. Die Umsetzung der 3-Bromcarbonsäure von Formel 18 hat die Verbindung der Formel 19 zur Folge. Die Letztere wird durch Behandlung mit einer Säure zyklisiert, so dass sich ein 6-Bromthiochroman-4-on-Derivat (wenn X S ist) oder ein 6-Bromchroman-Derivat (wenn X O ist) der Formel 20 ergibt. Die Bromverbindungen der Formel 20 werden dann im Wesentlichen derselben Reaktionsfolge unter analogen Bedingungen unterworfen, die im Reaktionsschema 1 zur Umwandlung der Brom-Verbindungen von Formel 7 zu den Verbindungen der Erfindung beschrieben sind. Somit werden, kurz hier zusammengefasst, die Brom-Verbindungen von Formel 20 mit (Trimethylsilyl)acetylen umgesetzt, um die 6-(Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten Thiochroman-4-on- oder Chroman-4-on-Verbindungen von Formel 21 bereitzustellen. Die 6-(Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten Thiochroman-4-on-Verbindungen von Formel 21 werden dann mit einer Base (Kaliumhydroxid oder Kaliumcarbonat) umgesetzt, um die Ethinyl-substituierten 6-Ethinyl-substituierten Thiochroman-4-one von Formel 22 bereitzustellen. Die Verbindungen von Formel 22 werden dann mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagenz X1-Y(R2)-A-B' (Formel 10) unter Bedingungen gekoppelt, die den für die analogen Reaktionen von Reaktionsschema 1 beschriebenen Bedingungen analog sind, um die Verbindungen der Formel 23 zu gewinnen.
  • Die Verbindungen von Formel 23 werden dann noch unter Bedingungen, die zu den ähnlichen Reaktionen, beschrieben in Reaktionsschema 1, analog sind, mit Natriumbis (trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin umgesetzt, um die 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzothiopyran- oder Benzopyran-Derivate zu gewinnen, die in Formel 24 dargestellt sind. Die Verbindungen der Formel 24 werden dann zu den in Formel 25 gezeigten Verbindungen umgewandelt, durch die Reaktion mit einem Organometall-Derivat, gewonnen aus der Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung R14H, wie in Verbindung mit Reaktionsschema 1 beschrieben ist.
  • Ähnlich zur Verwendung der 7-Bromtetrahydronaphthalen-1-on Zwischenverbindungen von Formel 7 aus Reaktionsschema 1 können die 6-Bromthiochroman-4-on Zwischenverbindungen von Formel 20 ebenfalls zur Herstellung weiterer Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend beschrieben, in Reaktionsschemata 6, 7 und 8, verwendet werden. Die Verbindungen von Formel 25 können ebenfalls zu weiteren Homologen und Derivaten in Reaktionen umgewandelt werden, die denjenigen in Verbindung mit Reaktionsschema 1 analog sind.
  • Reaktionsschema 3
    Figure 00500001
  • Reaktionsschema 3 offenbart einen Syntheseweg zu Verbindungen, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 1, X[C(R1)2]n' ist, wobei n 0 ist und die Z-Gruppe eine Ethinyl-Funktion (-C≡C-) ist. Gemäß dieses Schemas wird ein 6-Brom-2,3-dihydro-1H-inden-1-on-Derivat der Formel 26 in einer Reaktionsfolge (startend mit der Reaktion mit Trimethylsilylacetylen) umgesetzt, die den oben in Verbindung mit Reaktionsschemata 1 und 2 beschriebenen Reaktionen analog ist, um durch die Zwischenprodukte der Formel 27–30 die Inden-Derivate von Formel 31 bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform innerhalb des Umfangs von Reaktionsschema 3 ist das Ausgangsmaterial 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on, das gemäß der chemischen Literatur erhältlich ist (s. Smith et al., Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123–131). Die Verbindungen der Formel 26, wie beispielsweise 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on, können ebenfalls zur Synthese noch weiterer beispielhafter Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie nachstehend beschrieben wird.
  • Reaktionsschema 4
    Figure 00510001
  • Nunmehr Bezug nehmend auf Reaktionsschema 4 ist ein Syntheseweg für beispielhafte Verbindungen offenbart, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 1, Z-(CR1=CR1)n'- ist, wobei n' 3, 4 oder 5 ist und Y eine direkte Valenzbindung zwischen der (CR1=CR1)n'-Gruppe und B ist. Dieser Syntheseweg ist für Beispiele beschrieben, bei denen die X-Gruppe [C(R1)2]n ist und n 1 ist (Dihydronaphthalen-Derivate). Es sollte nichtsdestoweniger klar sein, dass die Reaktionen und die Synthesemethodologie, die in Reaktionsschema 4 beschrieben ist und weitere darauf folgende Schemata, ebenfalls mit solchen Modifikationen, die für den Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennbar sind, auf Derivate anwendbar ist, bei denen X S, O, NR' (Benzothiopyran, Benzopyran oder Dihydrochinolin-Derivate) oder [C(R1)2]n ist und n 0 ist (Inden-Derivate).
  • Gemäß Reaktionsschema 4 wird ein 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalen-Derivat von Formel 32 mit einem Säurechlorid (R1COCl) unter Friedel-Crafts-Bedingungen umgesetzt und das sich ergebende acetylierte Produkt wird oxidiert, beispielsweise in einer Jones-Oxidationsreaktion, um ein Gemisch isomerer 6- und 7-acetyl-1(2H)-naphthalenon-Derivate der Formel 33 zu ergeben. In einem speziell bevorzugten Beispiel dieser Umsetzung ist die Ausgangsverbindung der Formel 32 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen (eine bekannte Verbindung), die gemäß eines Verfahrens hergestellt werden kann, das im experimentellen Abschnitt der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist. Das 7-Acetyl-1(2H) naphthalenon-Derivat von Formel 33 wird mit einem Ethylenglycol in Gegenwart einer Säure umgesetzt, um die Oxo-Funktion der exozyklischen Keton-Gruppierung zu schützen, als ein Ketal-Derivat der Formel 34. Das Ketal der Formel 34 wird danach mit einem Grignard-Reagenz der Formel R14MgBr (die Symbole sind wie in Verbindung mit Formel 1 definiert) umgesetzt, um den tertiären Alkohol von Formel 35 zu gewinnen. Danach wird die Dioxolan-Schutzgruppe entfernt und der tertiäre Alkohol wird durch Behandlung mit einer Säure dehydriert, um die 3,4-Dihydro-7-acetylnaphthalen-Derivate der Formel 36 zu ergeben. Die Keton-Funktion der Verbindungen von Formel 36 wird einer Horner-Emmons- (oder einer analogen) Reaktion unter stark alkalischen Bedingungen mit einem Phosphonat-Reagenz der Formel 37 unterworfen, um nach Reduktion, die Aldehyd-Verbindungen der Formel 38 zu gewinnen. Eine noch weitere Horner-Emmons- (oder eine analoge) Reaktion unter stark alkalischen Bedingungen mit einem Reagenz der Formel 39 ergibt Verbindungen der Formel 40. Die Letzteren können gemäß der oben beschriebenen Umsetzungen zu weiteren Homologen und Derivaten umgewandelt werden. Ein spezielles Beispiel für das Horner-Emmons-Reagenz von Formel 37, das zur Herstellung einer bevorzugten Verbindung verwendet werden kann, ist Diethylcyanomethylphosphonat; ein Beispiel für das Horner-Emmons-Reagenz von Formel 39 ist Diethyl-(E)-3-ethoxycarbonyl-2-methylallylphosphonat.
  • Reaktionsschema 5
    Figure 00530001
  • Reaktionsschema 5 offenbart ein Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen, bei denen die Z-Gruppe eine Azo-Gruppe (-N=N-) ist. Wie in Reaktionsschema 4 ist dieses Verfahren für Beispiele beschrieben, bei denen die X-Gruppe [C(R1)2]n ist und n 1 ist (Dihydronaphthalen-Derivate). Es sollte nichtsdestoweniger klar sein, dass die beschriebene Synthesemethodologie ebenfalls mit solchen Modifikationen, wie sie sich für den Fachmann auf dem Gebiet leicht ergeben, auf alle Azo-Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung anwendbar sind, nämlich auf Derivate, bei denen X S, O, NR' (Benzothiopyran, Benzopyran oder Dihydrochinolin-Derivate) oder [C(R1)2]n ist und n 0 ist (Inden-Derivate). Somit wird eine Nitro-Gruppe in die Ausgangsverbindung der Formel 6 unter im Wesentlichen Standardbedingungen der Nitrierung eingeführt, um das 3,4-Dihydro-7-nitro-1(2H)-naphthalenon-Derivat von Formel 41 zu gewinnen. Die letztere Verbindung wird zum 3,4-Dihydro-7-amino-1(2H)-naphthalenon-Derivat der Formel 42 reduziert und wird danach mit einer Nitroso-Verbindung der Formel ON-Y(R2)-A-B (Formel 43) unter Bedingungen umgesetzt, die normalerweise zur Herstellung von Azo-Verbindungen (Eisessig) verwendet werden. Die Nitroso-Verbindung von Formel 43 kann gemäß der in der Technik bekannten Umsetzungen gewonnen werden. Ein spezielles Beispiel für eine solche Verbindung, die zur Synthese einer bevorzugten Verbindung verwendet wird, ist Ethyl-4-nitrosobenzoat. Die Azo-Verbindung von Formel 44 wird danach mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,Nbis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin umgesetzt werden, um die in Formel 45 dargestellten 4-Trifluormethylsulfonyloxy-Derivate zu gewinnen. Die Verbindungen der Formel 45 werden dann zu der in Formel 46 dargestellten Azo-Verbindung umgewandelt, durch Reaktion mit einem organometallischen Derivat, das aus der Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung R14H gewonnen wird. Diese letzteren beiden Reaktionen, nämlich die Umwandlung zu den 4-Trifluormethylsulfonyloxy-Derivaten und die anschließende Umsetzung mit dem Organometallderivat wurden oben in Verbindung mit den Reaktionsschemata 1, 2 und 3 beschrieben und werden in mehreren gegenwärtig bevorzugten Syntheseverfahren verwendet, die zu den beispielhaften RAR-Antagonistenverbindungen führen.
  • Reaktionsschema 6
    Figure 00550001
  • Reaktionsschema 6 offenbart ein gegenwärtig bevorzugtes Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 1, die Z-Gruppe COO- oder CONR1 ist (R1 ist vorzugsweise H). Diese Ester- und Amid-Derivate werden aus den 3,4-Dihydro-7-bromnaphthalen-Derivaten von Formel 16 hergestellt, die wie in Reaktionsschema 1 beschrieben gewonnen werden können. Somit werden die Verbindungen der Formel 16 mit einer starken Base, wie beispielsweise t-Butyllithium in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ umgesetzt, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, bei kalter Temperatur und Kohlendioxid (CO2) wird zugesetzt, um die 5,6-Dihydro-2-naphthalencarbonsäure-Derivate der Formel 47 bereitzustellen. Die Verbindungen der Formel 47 werden dann mit Verbindungen der Formel XY2(R2)-A-B (Formel 48) umgesetzt, wobei X2 eine OH- oder eine NR1-Gruppe repräsentiert, wobei R1 vorzugsweise Wasserstoff ist. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die Verbindungen der Formel 48 Aryl- oder Heteroarylhydroxyoder Amino-Derivate sind, die gemäß des Standes der Technik gewonnen werden können. Die Umsetzung zwischen den Verbindungen der Formel 47 und Formel 48 kann unter verschiedenen bekannten Ester- und Amid-Bildungsbedingungen durchgeführt werden, wie beispielsweise einer Kopplung der beiden in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümidhydrochlorid und 4-Dimethylaminopyridin. Alternativ können die Verbindungen der Formel 47 in das entsprechende Säurechlorid zur Kopplung mit den Verbindungen der Formel 48 in Gegenwart einer Base umgewandelt werden. Die Amid- oder Ester-Verbindungen der Formel 49 können in weitere Homologe und Derivate, wie oben beschrieben, umgewandelt werden. Obwohl das Reaktionsschema 6 für das Beispiel beschrieben und dargestellt ist, bei dem die X-Gruppe von Formel 1 [C(R1)2]n ist und n 1 ist (Dihydronaphthalen-Derivate), kann das hierin beschriebene Verfahren zur Herstellung von Benzopyran, Benzothiopyran, Dihydrochinolin und Inden-Derivaten ebenfalls adaptiert werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 1, Z -OCO-, NR1CO ist, ebenso wie die entsprechenden Thioester- und Thioamid-Analoge, können aus den Zwischenprodukten hergestellt werden, die aus den Verbindungen von Formel 16 gewonnen werden, bei denen die Brom-Funktion durch eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe ersetzt ist und gemäß der Lehren von US-Patent Nr. 5 324 744.
  • Reaktionsschema 7
    Figure 00560001
  • Reaktionsschema 7 offenbart ein gegenwärtig bevorzugtes Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 1, Z-(CR1=CR1)n'- ist und n' 0 ist. Diese Verbindungen der Formel 50 können in einer Kopplungsreaktion zwischen den Verbindungen von Formel 16 und einem Grignard-Reagenz gewonnen werden, das aus den Halo-Verbindungen der Formel 10 gewonnen wurde. Die Kopplungsreaktion wird typischerweise in Gegenwart eines Zinksalzes und eines Nickel (Ni(O))Katalysators in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, durchgeführt werden. Die Verbindungen der Formel 50 können zu weiteren Homologen und Derivaten umgewandelt werden, wie oben beschrieben ist.
  • Reaktionsschema 8
    Figure 00570001
  • Nunmehr Bezug nehmend auf Reaktionsschema 8 wird ein gegenwärtig bevorzugtes Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen offenbart, bei denen Z-(CR1=CR1)n'ist und n' ist. Insbesondere offenbart Reaktionsschema 8 das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen, die Dihydronaphthalen-Derivate sind, und bei denen die Z-Gruppe eine Vinyl (-CH=CH-) Funktion ist. Jedoch kann die hierin offenbarte allgemeine Methodologie unter solchen Modifikationen, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl vertraut sind, auf die analogen Benzopyran-, Benzothiopyran-, Dihydrochinolin-Verbindungen und auf Verbindungen ausgedehnt werden, bei denen die Vinyl-Gruppe substituiert ist. Somit wird gemäß Reaktionsschema 8 das 7-Brom-1(2H)- naphthalenon-Derivat von Formel 7 mit einem Vinyl-Derivat der Struktur -CH2=CH-Y(R2)-A-B (Formel 51) in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, der typischerweise die Formel Pd(PPh3) aufweist, eines Säureakzeptors (wie beispielsweise Triethylamin) unter einer Inertgas(Argon)-Atmosphäre, umgesetzt. Die Bedingungen für diese Reaktion sind der Kopplung der Acetylen-Derivate von Formel 9 mit dem Reagenz von Formel 10 analog (s. beispielsweise Reaktionsschema 1), und dieser Reaktionstyp ist im Allgemeinen in der Technik als Heck-Reaktion bekannt. Das Vinyl-Derivat von Formel 51 kann gemäß des Stands der Technik gewonnen werden, und ein Beispiel für ein solches Reagenz, das für die Synthese einer bevorzugten Verbindung, die in dieser Erfindung verwendet werden soll, verwendet wird, ist Ethyl-4-vinylbenzoat.
  • Das Produkt der Heck-Kopplungsreaktion ist ein Ethenyl-Derivat der Formel 52, das danach zu Verbindungen umgewandelt wird, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch Behandlung mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl) amino]-5-chlorpyridin, um die 4-Trifluormethylsulfonyloxy-Derivate der Formel 53 zu gewinnen und eine anschließende Reaktion mit einem Organometallderivat, das aus der Aryl-oder Heteroaryl-Verbindung R14H, wie oben beschrieben, gewonnen wurde. Die sich ergebenden Verbindungen der Formel 54 können zu weiteren Homologen und Derivaten umgewandelt werden.
  • Die Verbindungen von Formel 54 können ebenfalls durch Syntheseschemata gewonnen werden, die Wittig- oder Horner-Emmons-Reaktionen verwenden. Beispielsweise kann das Zwischenprodukt der Formel 33 (s. Reaktionsschema 4) mit einem Triphenylphosphoniumbromid (Wittig)-Reagenz oder besonders bevorzugt mit einem Diethylphosphonat (Homer Emmons)-Reagenz der Struktur (EtO)2PO-CH2-Y(R2)-A-B, wie für analoge Homer-Emmons-Reaktionen im US-Patent Nr. 5 324 840 beschrieben, umgesetzt werden. Die gerade erwähnte Horner-Emmons-Reaktion stellt Zwischenproduktverbindungen bereit, die in ihrer Struktur zur Formel 52 analog sind, und können zu Verbindungen der Formel 54 durch Reaktionsfolgen umgewandelt werden, die in Reaktionsschema 8 für die Verbindungen der Formel 52 beschrieben sind.
  • Syntheseverfahren – Aryl- und (3-Oxy-1-propenyl)-substituierte Verbindungen
  • Die beispielhaften RAR-Antagonistenverbindungen der Formel 101 können durch die hierin veranschaulichten chemischen Synthesewege hergestellt werden. Der Synthesechemiker wird leicht erkennen, dass die hier dargelegten Bedingungen spezielle Ausführungsformen sind, die auf jede und alle der durch Formel 101 repräsentierten Verbindungen verallgemeinert werden können.
  • Reaktionsschema 101
    Figure 00590001
  • Reaktionsschema 101 (Fortsetzung)
    Figure 00600001
  • Reaktionsschema 101 veranschaulicht die Synthese von Verbindungen der Formel 101, bei denen X[C(R1)2]n' ist, n 1 ist, p Null ist und R17H oder niederes Alkyl ist. In anderen Worten veranschaulicht Reaktionsschema 101 die Synthese von Verbindungen der Erfindung, die 3,4-Dihydronaphthalen-Derivate sind. Gemäß dieses Schemas dient eine Tetrahydronaphthalen-Verbindung der Formel 103, die in geeigneter Weise mit den R3- und R2-Gruppen substituiert ist (wie diese in Verbindung mit Formel 101 definiert sind) als Ausgangsmaterial. Ein bevorzugtes Beispiel einer Verbindung der Formel 103 ist 1,3,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen, das in der chemischen Literatur beschrieben ist (Mathur et al., Tetrahedron, 1985, 41: 1509). Ein gegenwärtig bevorzugter Weg zur Synthese dieser Verbindung aus 1-Brom-3-phenylpropan ist ebenfalls im experimentellen Abschnitt der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
  • Die Verbindung der Formel 103 wird in einer Reaktion vom Friedel-Crafts-Typ mit einem Säurechlorid umgesetzt, das die Struktur R16CH2COCl aufweist (R16 ist wie in Verbindung mit Formel 101 definiert) und wird danach mit Chromtrioxid in Essigsäure oxidiert, um die isomeren 6- und 7-Acy1-3,4-dihydro-1(2H)-naphthalenon-Derivate bereitzustellen. Nur das 6-Acyl-Derivat ist unter dem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung von Interesse und ist durch eine Strukturformel (Formel 104) in Reaktionsschema 101 dargestellt. Bei der Herstellung der gegenwärtig bevorzugten Verbindungen dieser Erfindung repräsentieren die R1-Gruppen Methyl, repräsentieren R2, R3 und R16H und deswegen ist das bevorzugte Zwischenprodukt entsprechend Formel 104 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalenon.
  • Die exozyklische Keto-Funktion der Verbindung nach Formel 104 wird danach als ein Ketal geschützt, beispielsweise durch Behandlung mit Ethylenglycol in Säure, um das 1,3-Dioxolanyl-Derivat der Formel 105 bereitzustellen. Die Verbindung der Formel 105 wird dann mit einem Grignard-Reagenz der Formel R14MgBr (R14 ist wie in Verbindung mit Formel 101 definiert) umgesetzt, so dass das 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-naphthalen-Derivat von Formel 106 gewonnen wird. Die exozyklische Keton-Funktion der Verbindung von Formel 106 wird dann durch Behandlung mit einer Säure deprotektiert bzw. der Schutz wird entzogen und dehydriert, um die Verbindung der Formel 107 zu ergeben.
  • Ein alternatives Verfahren zur Gewinnung der Verbindungen von Formel 107 aus den Verbindungen der Formel 105 besteht in der Umsetzung der Verbindungen der Formel 105 mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin (Tf-SO2CF3) in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, bei niedrigen Temperaturen (–78°C und 0°C). Diese Reaktion schreitet über ein Natriumsalz-Zwischenprodukt voran, das üblicherweise nicht isoliert wird und im Reaktionsschema 101 nicht dargestellt ist. Die Gesamtreaktion hat ein Trifluormethylsulfonyloxy-Derivat zur Folge, das danach mit einem Organometall-Derivat umgesetzt wird, das aus der Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung R14H gewonnen wird, so dass die Formel des Organometall-Derivats R14Met ist (Met steht für einwertiges Metall), vorzugsweise R14Li. (R14 ist wie in Verbindung mit Formel 101 definiert). Die Umsetzung mit dem Organometall-Derivat, vorzugsweise dem Lithium-Derivat der Formel R14Li wird üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel vom Ether-Typ (wie beispielsweise Tetrahydrofuran) in Gegenwart von Zinkchlorid (ZnCl2) und Tetrakis(triphenylphosphin) palladium(0) (Pd(PPh3)4) durchgeführt. Das Organolithium-Reagenz R14Li kann, falls es nicht kommerziell erhältlich ist, aus der Verbindung R14H (oder dessen Halogen-Derivat R14-X1, wobei X1 Halogen ist) in einem Lösungsmittel vom Ether-Typ hergestellt werden, gemäß bekannter Praxis auf dem Gebiet. Der Temperaturbereich für die Reaktion zwischen dem Reagenz R14Li und dem Trifluormethylsulfonyloxy-Derivat ist allgemein gesprochen im Bereich von ungefähr –78°C bis 50°C.
  • Die Verbindungen der Erfindung werden als Folge einer Kondensation zwischen der Keton-Verbindung von Formel 107 und einem Aldehyd oder Keton der Formel 108 gebildet. Bei der Herstellung der bevorzugten beispielhaften Verbindungen der Erfindung ist das Reagenz der Formel 108 4-Carboxybenzaldehyd (R17-H). Beispiele für andere Reagenzien innerhalb des Umfangs der Formel 108, die für eine Kondensationsreaktion und für die Synthese von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung geeignet sind (Formel 101) sind: 5-Carboxypyridin-2-aldehyd, 4-Carboxy-pyridin-2-aldehyd, 4-Carboxy-thiophen-2-aldehyd, 5-Carboxy-thiophen-2-aldehyd, 4-Carboxy-furan-2-aldehyd, 5-Carboxy-furan-2-aldehyd, 4-Carboxyacetophenon, 2-Acetylpyridin-5-carbonsäure, 2-Acetyl-pyridin-4-carbonsäure, 2-Acetyl-thiophen-4-carbonsäure, 2-Acetyl-thiophen-5-carbonsäure, 2-Acetylfuran-4-carbonsäure und 2-Acetyl-furan-5-carbonsäure. Die letzteren Verbindungen sind gemäß der chemischen Literatur erhältlich; siehe beispielsweise Decroix et al., J. Chem. Res. (S), 4: 134 (1978); Dawson'et al., J. Med. Chem. 29: 1282 (1983); und Queguiner et al., Bull Soc. Chimique de France Nr. 10, Seiten 3678–3683 (1969). Die Kondensationsreaktion zwischen den Verbindungen der Formel 107 und 108 wird in Gegenwart einer Base in einem alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt. Vorzugsweise wird die Umsetzung in Ethanol in Gegenwart von Natriumhydroxid durchgeführt. Der Fachmann auf dem Gebiet wird diese Kondensationsreaktion als eine Aldol-Kondensation erkennen und im Falle der hierin beschriebenen bevorzugten Beispiele (Kondensieren eines Ketons der Formel 107 mit einem Aldehyd der Formel 108) als eine Claisen-Schmidt-Reaktion. (Siehe March: Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Seiten 694–695, McGraw Hill (1968). Die Verbindungen der Formel 109 liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung und können ebenfalls weiteren Transformierungen unterworfen werden, die zusätzliche Verbindungen der Erfindung zur Folge haben. Alternativ kann die A-B-Gruppe der Formel 108 eine Gruppe sein, die im Umfang der Erfindung liegt, wie sie in Formel 101 definiert ist, nur nach einer oder mehreren Synthesetransformationen einer solchen Art, wie sie innerhalb des Fachwissens des praktizierenden organischen Chemikers liegen. Beispielsweise kann die bezüglich der A-B-Gruppe durchgeführte Reaktion ein Schutzentziehungs- bzw. Entschützungsschritt, eine Homologisierung, eine Veresterung, eine Verseifung, eine Amid-Bildung oder dergleichen sein.
  • Allgemein gesprochen können hinsichtlich der Derivatisierung der Verbindungen von Formel 109 und/oder der Synthese von Aryl- und Heteroaryl-Verbindungen von Formel 108, die danach mit Verbindungen der Formel 107 umgesetzt werden können, die nachfolgenden wohlbekannten und veröffentlichten allgemeinen Prinzipien und Synthesemethodologien angewendet werden.
  • Wie oben angegeben, werden Carbonsäuren typischerweise durch Rückflusskühlung der Säure in einer Lösung des geeigneten Alkohols in Gegenwart eines sauren Katalysators wie beispielsweise Salzsäure oder Thionylchlorid verestert. Alternativ kann die Carbonsäure mit dem geeigneten Alkohol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodümid und Dimethylaminopyridin kondensiert werden. Der Ester wird gewonnen und durch herkömmliche Mittel gereinigt. Acetale und Ketale werden in einfacher Weise durch das Verfahren hergestellt, das in March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hilf Book Company, Seite 810, beschrieben ist. Alkohole, Aldehyde und Ketone können alle durch Bildung von jeweils Estern und Ethern, Acetalen oder Ketalen durch bekannte Verfahren geschützt werden, wie beispielsweise solchen, beschrieben bei McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 und Protecting Groups, Hg. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
  • Um den Wert n in den Verbindungen der Formel 108 zu erhöhen, bevor die Kondensationsreaktion von Reaktionsschema 101 beeinträchtigt wird (wobei solche Verbindungen, die Formel 108 entsprechen, nicht aus einer kommerziellen Quelle erhältlich sind), können aromatische oder heteroaromatische Carbonsäuren eine Homologisierung (während die Aldehyd-Gruppe geschützt ist) durch aufeinanderfolgende Behandlung unter Arndt-Eistert-Bedingungen oder anderen Homologisierungsverfahren unterworfen werden. Alternativ können Derivate, die nicht Carbonsäuren sind, ebenfalls durch geeignete Verfahren homologisiert werden. Die homologisierten Säuren können dann durch allgemeine Verfahren verestert werden, die im vorhergehenden Absatz dargestellt sind.
  • Die Verbindungen der Formel 108 (oder anderer Zwischenprodukte der Erfindung, falls anwendbar), bei denen A eine Alkenyl-Gruppe mit einer oder mehreren Doppelbindungen ist, kann beispielsweise durch Syntheseschemata hergestellt werden, die dem praktizierenden organischen Chemiker wohl bekannt sind; beispielsweise durch Wittig und dergleichen Reaktionen oder durch Einführung einer Doppelbindung durch Eliminierung von Halogen aus einer alpha-Haloarylalkylcarbonsäure, Ester oder dergleichen Carboxaldehyd. Verbindungen von Formel 108 (oder andere Zwischenprodukte der Erfindung, wie anwendbar), bei denen die A-Gruppe eine Dreifach (Acetylen)-Bindung aufweist, können durch Umsetzung eines entsprechenden aromatischen Methylketons mit einer starken Base, wie beispielsweise Lithiumdiisopropylamid, durch Umsetzung mit Diethylchlorphosphat und anschließende Addition bzw. Zusatz von Lithiumdiisopropylamid, hergestellt werden.
  • Die aus den Verbindungen von Formel 109 (oder anderen Zwischenprodukten oder Verbindungen der Erfindung, wie anwendbar) gewonnenen Säuren und Salze werden in einfacher Weise direkt als Folge der Kondensationsreaktion oder aus den entsprechenden Estern gewonnen. Eine basische Verseifung mit einer Alkalimetallbase wird die Säure ergeben. Beispielsweise kann ein Ester der Formel 109 (oder andere Zwischenprodukte oder Verbindungen der Erfindung, wie anwendbar) in einem polaren Lösungsmittel wie beispielsweise einem Alkanol, vorzugsweise unter einer inerten Atmosphäre bei Raumtemperatur, mit einem dreimolaren Überschuss an Base, beispielsweise Lithiumhydroxid oder Kaliumhydroxid, gelöst werden. Die Lösung wird für eine ausgedehnte Zeitspanne zwischen 15 und 20 Stunden gerührt, abgekühlt, angesäuert und das Hydrolysat durch herkömmliche Mittel gewonnen.
  • Das Amid kann durch irgendwelche in der Technik bekannten geeigneten Amidierungsmittel aus den entsprechenden Estern oder Carbonsäuren gebildet werden. Ein Weg, solche Verbindungen herzustellen, besteht darin, eine Säure zu einem Säurechlorid umzuwandeln und dann diese Verbindung mit Ammoniumhydroxid oder einem geeigneten Amin zu behandeln.
  • Alkohole werden durch Umwandeln der entsprechenden Säure zum Säurechlorid mit Thionylchlorid oder anderen Mitteln umgewandelt (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company), und dann wird das Säurechlorid mit Natriumborhydrid (Manch, ebd., Seite 1124) reduziert, was die entsprechenden Alkohole ergibt. Alternativ können die Ester mit Lithiumaluminiumhydrid bei reduzierten Temperaturen reduziert werden. Eine Alkylierung dieser Alkohole mit geeigneten Alkylhalogeniden unter Williamson-Reaktionsbedingungen (March, ebd., Seite 357) ergibt die entsprechenden Ether. Diese Alkohole können zu Estern umgewandelt werden, indem diese mit geeigneten Säuren in Gegenwart von sauren Katalysatoren oder von Dicyclohexylcarbodümid und Dimethylaminopyridin, umgesetzt werden.
  • Aldehyde können aus den entsprechenden primären Alkoholen unter Verwendung milder Oxidationsmittel, wie beispielsweise Pyridiniumdichromat, in Methylenchlorid (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979), oder Dimethylsulfoxid/Oxalylchlorid in Methylenchlorid (Omura, K,. Swern, D., Tetrahedron, 34: 1651 (1978)) hergestellt werden.
  • Die Ketone können aus einem geeigneten Aldehyd durch Behandlung des Aldehyds mit einem Alkyl-Grignard-Reagenz oder einem ähnlichen Reagenz, gefolgt von Oxidation, hergestellt werden.
  • Acetale oder Ketale können aus dem entsprechenden Aldehyd oder Keton durch das bei March, ebd., Seite 810 beschriebene Verfahren hergestellt werden.
  • Reaktionsschema 102
    Figure 00660001
  • Reaktionsschema 102 (Fortsetzung)
    Figure 00670001
  • Nunmehr Bezug nehmend auf Reaktionsschema 102, ist ein Syntheseweg für solche Verbindungen der Erfindung beschrieben, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 101, p Null ist, R2 im aromatischen Anteil der kondensierten Ringstruktur OH ist und R17 OH ist. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass diese Verbindungen (3-Diketone in der Enol-Form sind. Reaktionsschema 102 beschreibt ebenfalls einen Syntheseweg für solche Verbindungen der Erfindung, bei denen p 1 ist. Der Fachmann auf dem Gebiet wird leicht erkennen, dass die letzteren Verbindungen Flavone sind. Somit wird gemäß dieses Schemas ein 1,2,3,4-Tetrahydro-6-methoxynaphthalen-1-on-Derivat der Formel 110 mit Dialkylzink (R1Zn) in Gegenwart von Titantetrachlorid in einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise CH2Cl2 umgesetzt, um die Oxo-Funktion durch die geminale Dialkyl-Gruppe R1R1 zu ersetzen, um eine Verbindung der Formel 111 zu gewinnen, wobei R1 niederes Alkyl ist. In bevorzugten Ausführungsformen der Verbindungen der Erfindung, die gemäß Reaktionsschema 102 hergestellt werden, ist die R3-Gruppe Wasserstoff und ist R1 Methyl. Demgemäß ist das Dialkylzink-Reagenz Dimethylzink und das bevorzugte Ausgangsmaterial von Formel 110 ist 1,2,3,4-Tetrahydro-6-methoxynaphthalen-1-on. Die letztere Verbindung ist kommerziell erhältlich, beispielsweise von Aldrich Chemical Company. Das 1,2,3,4-Tetrahydro-1,2-dialkyl-6-methoxynaphthalen-Derivat der Formel 111 wird danach mit Chromtrioxid in Essigsäure und Acetanhydrid bzw. Essigsäureanhydrid oxidiert, so dass sich ein 1,2,3,4-Tetrahydro-3,4-dialkyl-7-methoxynaphthalen-1-on-Derivat der Formel 112 ergibt. Die Keton-Verbindung von Formel 112 wird mit einem Grignard-Reagenz (R14MgBr, R14 ist wie in Verbindung mit Formel 101 definiert) umgesetzt, um ein 1-Hydroxy-1-ary1-3,4-dihydro-3,4-dialkyl-7-methoxynaphthalen-Derivat der Formel 113 zu ergeben. Die Hydroxy-Verbindung von Formel 113 wird eine Eliminierung durch Erhitzen, vorzugsweise in einer Säure, unterworfen, um die Dihydronaphthalen-Verbindung von Formel 114 zu ergeben. Die Methylverbindung wird aus der phenolischen Methylether-Funktion der Verbindung von Formel 114 durch Behandlung mit Bortribromid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise CH2Cl2, entfernt und danach wird das phenolische OH mit einem Acylierungsmittel acyliert, das die R16CH2CO-Gruppe einführt, um eine Verbindung der Formel 115 zu ergeben. In der bevorzugten Ausführungsform ist R16H und deswegen ist das Acylierungsmittel Acetylchlorid oder Acetanhydrid. Die Acetylierungsreaktion wird in einem basischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Pyridin, durchgeführt. Die acetylierte Phenol-Verbindung der Formel 115 wird mit Aluminiumchlorid bei erhöhter Temperatur durchgeführt, verursacht dadurch eine Fries-Umlagerung und ergibt die 1-Aryl-3,4-dialkyl-3,4-dihydro-6-acyl-7-hydroxy-naphthalen-Verbindung der Formel 116. Die phenolische Hydroxyl-Gruppe der Verbindung von Formel 116 wird mit einem Acylierungsmittel (wie beispielsweise einem Säurechlorid) acyliert, das die CO-Y(R2)-A-B-Gruppe einführt, so dass eine Verbindung der Formel 117 erzielt wird. Im Säurechloridreagenz Cl-CO-Y(R2)-A-B (oder dergleichen Acylierungsmittel) weisen die Symbole Y, R2 und A-B die Bedeutung auf, wie sie in Verbindung mit Formel 101 definiert ist. Bei der Herstellung einer bevorzugten Verbindung der Erfindung gemäß dieses Schemas ist dieses Reagenz ClCOC6H4COOEt (das Halb-Ethylester-Halb-Säurechlorid der Terephthalsäure).
  • Die Verbindung nach Formel 117 wird mit einer starken Base, wie beispielsweise Kaliumhydroxid in Pyridin, umgesetzt, um als Folge eine intramolekulare Claisen-Kondensationsreaktion eine Verbindung nach Formel 118 zu ergeben. Die Verbindungen der Formel 118 liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung und innerhalb des Umfangs von Formel 101, bei der ein OH für den R2-Substituenden im aromatischen Anteil der kondensierten Ring-Gruppierung existiert und bei der R17 OH ist. In Verbindung mit der vorhergehenden Reaktion (intramolekulare Claisen-Kondensation) und der vorher erwähnten Fries-Umlagerung wird erwähnt, dass diese wahrscheinlichen Reaktionsmechanismen in dieser Beschreibung zum Zweck einer vollständigen Erklärung der hierin beschriebenen Reaktionen erwähnt sind und zur Erleichterung der Arbeit einer Person mit durchschnittlichem Fachkönnen auf dem Gebiet, um die hierin beschriebenen Reaktionen durchzuführen, und die erfindungsgemäßen Verbindungen herzustellen. Nichtsdestotrotz wollen die vorliegenden Erfinder nicht durch Reaktionsmechanismen und Theorien gebunden sein und die hierin beanspruchte Erfindung sollte hierauf nicht beschränkt sein.
  • Die Verbindungen von Formel 118 werden mit einer starken Säure, wie beispielsweise Schwefelsäure, in einem geeigneten protonischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Essigsäure, umgesetzt, um die Flavon-Verbindungen der Formel 119 zu ergeben. Die Verbindungen der Formel 119 sind ebenfalls Verbindungen der Erfindung, innerhalb des Umfangs der Formel 101, bei der p 1 ist. Sowohl die Verbindungen nach Formel 118 als auch Formel 119 können weiteren Reaktionen und Transformationen unterworfen werden, um weitere Homologe und Derivate bereitzustellen, wie hierin vorstehend in Verbindung mit Reaktionsschema 101 beschrieben ist. Dies ist in Reaktionsschema 102 als Umwandlung zu Homologen und Derivaten angezeigt.
  • Reaktionsschema 103
    Figure 00700001
  • Nunmehr Bezug nehmend auf Reaktionsschema 103 ist ein Syntheseweg dargestellt, der zu solchen Verbindungen der Erfindung führt, bei denen, unter Bezugnahme auf Formel 101, X S, O oder NR' ist, p Null ist und R17H oder ein niederes Alkyl ist. Jedoch kann das gegenwärtig gezeigte Syntheseverfahren durch Anwendung der allgemeinen Prinzipien der Synthese, die in Reaktionsschema 102 dargestellt sind, vom Fachmann auf dem Gebiet modifiziert oder adaptiert werden, um ebenfalls Verbindungen der Erfindung zu gewinnen, bei denen X S, O oder NR' ist und bei denen p 1 ist oder bei denen X S, O oder NR' ist und p Null ist, wobei die R2-Gruppe im aromatischen Anteil der kondensierten Ringkomponente OH ist und R17 OH ist.
  • Die Ausgangsverbindung von Reaktionsschema 103 ist ein Phenol, Thiophenol oder Anilin-Derivat nach Formel 120. Bei den gegenwärtig bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind die R2- und R16-Gruppen beide Wasserstoff und die bevorzugten Startverbindungen von Formel 120 sind 3-Ethenyl-thiophenol oder 3-Ethenylphenol, die in der chemischen Literatur bekannt sind (Nuyken et al., Polym. Bull (Berlin) 11: 165 (1984)). Zur Vereinfachung der vorliegenden Beschreibung kann in der nachfolgenden Beschreibung X in erster Linie als Schwefel als zur Herstellung der Benzothiopyran-Derivate der vorliegenden Erfindung betrachtet werden. Es sollte berücksichtigt werden, dass das hierin beschriebene Schema ebenfalls zur Zubereitung von Benzopyran (X=O) und Dihydrochinolin (X=NR') Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung geeignet ist, mit solchen Modifikationen, die für den Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennbar sind. Somit wird die Verbindung nach Formel 120 unter basischen Bedingungen mit einer 3-Bromcarbonsäure der Formel 121 umgesetzt. In diesem Reaktionsschema weisen die Symbole die Bedeutung auf, die in Verbindung mit Formel 101 beschrieben sind. Ein Beispiel für das Reagenz von Formel 121, bei dem R3 Wasserstoff ist, ist 3-Brompropionsäure. Die Reaktion mit der 3-Bromcarbonsäure von Formel 121 hat die Verbindung nach Formel 122 zur Folge. Die Letztere wird durch Behandlung mit einer Säure zyklisiert, um das 7-Ethenyl-thiochroman-4-on-Derivat (wenn X S ist) oder das 7-Ethenylchroman-Derivat (wenn X O ist) von Formel 123 zu ergeben. Das 7-Ethenyl-thiochroman-4-on oder das 7-Ethenyl-chroman-4-on-Derivat nach Formel 123 wird in Gegenwart von Pd(II)Cl2 und CuCl2-Katalysatoren oxidiert, um die entsprechende 7-Acyl(Keton)-Verbindung von Formel 124 zu ergeben. Der Fachmann auf dem Gebiet wird die letztere Reaktion als eine Wacker-Oxidation erkennen. Die exozyklische Keton-Gruppe der Verbindung nach Formel 124 wird in Form eines Ketals geschützt, beispielsweise durch Behandlung mit Ethylenglycol in einer Säure, um das 1,3-Dioxolanyl-Derivat nach Formel 125 zu ergeben. Danach wird die Verbindung nach Formel 125 einer Reaktionsfolge unterworfen, die derjenigen für die Verbindungen von Formel 105 in Reaktionsschema 101 beschriebenen analog ist. Somit wird das 1,3-Dioxolanyl-Derivat nach Formel 125 mit einem Grignard-Reagenz der Formel R14MgBr umgesetzt, um den tertiären Alkohol von Formel 126 zu ergeben, der danach in einer Säure dehydriert wird, um das Benzothiopyran (X = S), das Benzopyran (X = O) oder das Dihydrochinolin (X = NR') Derivat nach Formel 127 zu ergeben. Die Keton-Verbindung nach Formel 127 wird dann in Gegenwart einer Base mit dem Reagenz der Formel 108 in einer Aldol-Kondensation (Claisen-Schmidt)-Reaktion umgesetzt, um Verbindungen der Erfindung nach Formel 128 bereitzustellen. Die Verbindungen nach Formel 128 können zu weiteren Homologen und Derivaten, wie oben in Verbindung mit den Reakionsschemata 101 und 102 beschrieben, umgewandelt werden.
  • Spezielle Beispiele
  • 2-Hydroxy-2-methyl-5-phenylpentan
  • Einem Gemisch aus Magnesiumspänen 13,16 g (0,541 mol) in 200 ml wasserfreiem Et2O wurden 100,0 g (0,492 mol) 1-Brom-3-phenylpropan als eine Lösung in 100 ml Et2O zugesetzt. Nachdem 5–10 ml der Lösung zugesetzt wurden, wird der Zusatz gestoppt, bis die Bildung des Grignard-Reagenzes fortgeschritten war. Das zurückbleibende Bromid wurde dann über 1 Stunde hinweg zugesetzt. Das Grignard-Reagenz wurde für 20 Minuten bei 35 °C gerührt und darauf wurden 31,64 g (0,541 mol) Aceton über eine 45-minütige Zeitspanne zugesetzt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie auf 0°C abgekühlt war und wurde durch vorsichtigen Zusatz von 20% HCl angesäuert. Die wässrige Schicht wurde mit Et2O (3 × 200 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck und Destillation des Rückstandes lieferte 63,0 g (72%) des Produktes als blassgelbes Öl, Siedepunkt 99–102°C/0,5 mm Hg. 1H NMR (CDCl3): δ 7.28–7.18 (5H, m), 2.63 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.68 (2H, m), 1.52 (2H, m), 1.20 (6H, s).
  • 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen
  • Ein Gemisch aus P2O5 (55,3 g, 0,390 mol) in 400 ml Methansulfonsäure wurde auf 105 °C unter Argon erhitzt, bis der gesamte Feststoff gelöst war. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 2-Hydroxy-2-methyl-5-phenylpentan (63,0 g, 0,354 mol) wurden langsam unter Rühren zugesetzt. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion durch sorgfältiges Gießen der Lösung mit 1 l Eis abgeschreckt. Das sich ergebende Gemisch wurde mit Et2O (4 × 125 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter wässriger NaHCO3, Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden. Die Konzentration der Lösung unter reduziertem Druck, gefolgt von Destillation, lieferte 51,0 g (90%) des Produktes als ein klares farbloses Öl, Siedepunkt 65–67°C/1,1 mm Hg. 1H NMR (CDCl3): δ 7.32 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.16–7.05 (3H, m), 2.77 (2H, t, J = 6.3 Hz), 1.80 (2H, m), 1.66 (2H, m), 1.28 (6H, s).
  • 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalenon Verbindung A)
  • Eine Lösung von 350 ml Eisessig und 170 ml Acetanhydrid wurden auf 0°C abgekühlt und CrO3, 25,0 g (0,25 mol) wurden in kleinen Anteilen vorsichtig zugesetzt. Das sich ergebende Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, bevor 120 ml Benzol zugesetzt wurden. 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen wurden langsam als eine Lösung in 30 ml Benzol zugesetzt. Nach Abschluss des Zusatzes wurde die Reaktion bzw. das Reaktionsgemisch 4 Stunden lang bei 0°C gerührt. Die Lösung wurde mit H2O (200 ml) verdünnt und mit Et2O (5 × 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden. Die Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und die Destillation lieferten 16,0 g (74%) des Produktes als blassgelbes Öl, Siedepunkt 93–96 °C/0,3 mm Hg. 1H NMR (CDCl3): δ 8.02 (1H, dd, J 1.3, 7.8 Hz), 7.53 (1H, m ), 7.42 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.29 (1H, m), 2.74 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.02 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.40 (6H, s).
  • 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)napthalenon (Verbindung B)
  • Ein 100 ml Dreihalskolben, ausgestattet mit einem leistungsstarken Rückflusskondensator mit einem Trockenrohr und einem Zusatztrichter wurde mit einem Gemisch aus AlCl3 9,5 g (71,4 mmol) und 3 ml CH2Cl2 beschickt. Das 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-napthalenon (5,0 g, 28,7 mmol) wurde unter Rühren zum Gemisch bei Raumtemperatur tropfenweise zugesetzt (Vorsicht: exotherme Reaktion!). Brom, 5,5 g (34,5 mmol) wurden dann sehr langsam zugesetzt und das sich ergebende Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. (Anmerkung: Wenn das Rühren stoppt, kann das Gemisch auf 70°C erwärmt werden, bis das Rühren wieder anfängt). Die Reaktion wurde durch den langsamen Zusatz von eiskalter 6M HCl abgeschreckt. Das Gemisch wurde mit Et2O extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigtem NaCl gewaschen, bevor es über MgSO4 getrocknet wurde. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck und die Destillation des Rückstandes lieferten 5,8 g (80%) des Produktes als blassgelbes Öl, das sich bei Stehenlassen verfestigte, Siedepunkt: 140°C/0,4 mm Hg. 1H NMR (CDCl3): δ 8.11 (1H, d, J = 3.0 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 3.0, 9.0 Hz), 7.31 (1H, d, J = 9.0 Hz), 2.72 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.01 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.28 (6H, s).
  • 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hxdroxy-1-(4-methy_lphenxl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalen (Verbindung C)
  • Einem Gemisch aus Magnesium-Spänen (648,0 mg, 27,0 mmol) in 25 ml THF wurde eine Lösung aus 4-Bromtoluol (5,40 g, 31,8 mmol) in 10 ml THF in zwei Portionen zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 ml der Lösung begonnen, gefolgt vom langsamen Zusatz der verbleibenden Lösung über einen Zusatztrichter. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und darauf wurde die Lösung auf einen zweiten Kolben unter Verwendung einer Kanüle übertragen. Zu dem sich ergebenden Grignard-Reagenz wurden 4,0 g (15,9 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-Brom-1(2H)-naphthalenon (Verbindung B) als eine Lösung in 15 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde über Nacht unter Rückflusskühlung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch vorsichtigen Zusatz eiskalter 10%iger HCl gelöscht. Die Extraktion mit Et2O wurde durch Waschung der kombinierten organischen Schichten mit H2O und gesättigter wässriger NaCl, darauf von Trocknen über MgSO4 gefolgt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab ein Öl, das das Produkt als einen farblosen Feststoff nach Säulenchromatographie ergab (Hexan/EtOAc, 96 : 4). 1H NMR (CDCl3): δ 7.36 (1H, dd, J = 2.1, 7.6 Hz), 7.26 (3H, m), 7.12 (3H, s), 2.34 (3H, s), 2.24–2.04 (2H, m), 1.81 (1H, m), 1.55 (1H, m), 1.35 (3H, s), 1.30 (3H, s).
  • 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalen Verbindung D)
  • Ein Kolben, der mit einer Dean-Stark-Falle ausgestattet war, wurde mit 3,4 g (9,85 mmol) 1,2,3,4-Tethrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalen (Verbindung C) und 40 ml Benzol befüllt. Eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde zugesetzt, und die sich ergebende Lösung wurde unter Rückflusskühlung für 2 Stunden erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden Et2O zugesetzt und die Lösung mit H2O, gesättigter wässriger NaHCO3, und gesättiger wässriger NaCl gewaschen, dann über MgSO4 getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (100% Hexan/Silica-Gel) lieferten die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.32 (1H, dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.21 (5H, m), 7.15 (1H, d, J = 2.1 Hz), 5.98 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.40 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.30 (6H, s).
  • 7-Ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaphthalen-1(2H)-on Verbindung E)
  • Einer Lösung (15 Minuten lang mit einem Argon-Strom gespült bzw. gereinigt) aus 7 g (27,6 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-Brom-1(2H)-naphthalenon (Verbindung B) in 150 ml Triethylamin wurden 0,97 g (1,3 mmol) Bis-(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid und 0,26 g (1,3 mmol) Kupfer(I)iodid zugesetzt. Das Lösungsgemisch wurde mit Argon 5 Minuten lang gespült und darauf wurden 39 ml (36,6 mmol) (Trimethylsilyl)acetylen zusetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Druckrohr versiegelt und in einem vorerhitzten Ölbad (100 °C) für 24 Stunden angeordnet. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Celite filtriert, mit Et2O gewaschen und das Filtrat im Vakuum konzentriert, so dass sich rohes 7-(trimethylsilyl)ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaphthalen-1(2H)-on ergab. Einer Lösung dieser rohen TMS-Acetylen-Verbindung in 50 ml Methanol wurden 0,6 g (4,3 mmol) K2CO3 zugesetzt. Das Gemisch wurde für 8 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und wurde dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, mit Et2O verdünnt, mit Wasser, 10 % HCl und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (Silica, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als einen weißen Feststoff. PMR (COCl3) : δ 1.39 (6H, s), 2.02 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.73 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.08 (1H, s), 7.39 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.61 (1H, dd, 7 = 1.8, 8.2 Hz), 8.14 (1H, d, 7 = 9 1.8 Hz).
  • Ethyl-4-iodbenzoat
  • Einer Suspension von 10 g (40,32 mmol) 4-Iodbenzoesäure in 100 ml absolutem Ethanol wurden 2 ml Thionylchlorid zugesetzt und das Gemisch wurde unter Rückflusskühlung für 3 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 100 ml Ether gelöst. Die Etherlösung wurde mit gesättigter NaHCO3 und gesättigten NaCl-Lösungen gewaschen und getrocknet (MgSO4). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand Kugekohr-destilliert (100°C; 0,55 mm), um die Titelverbindung als ein farbloses Öl zu ergeben. PMR (CDCl3): δ 1.42 (3H, t, J ~ 7 Hz), 4,4 (2H, q, J ~ 7 Hz), 7.8 (4H).
  • 6-Iodnicotinsäure
  • Natriumiodid (20,59 g, 137,40 mmol) wurde unter Argon auf –78°C abgekühlt und darauf wurde Iodwasserstoffsäure (97,13 g, 759,34 mmol) zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt und die Suspension für 5 Minuten gerührt. Diesem Gemisch wurde 6-Chlornicotinsäure (22,09 g, 140,20 mmol) zugesetzt und das sich ergebende Gemisch ließ man langsam auf Umgebungstemperatur unter Rühren aufwärmen. Das Gemisch wurde unter Rückflusskühlung bei 125°C für 24 Stunden erhitzt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und in Aceton 1500 ml) bei 0°C gegossen. Der gelbe Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und mit 200 ml 1N wässriger NaHSO3-Lösung gewaschen. Eine Umkristallisierung aus Methanol (die Kristalle wurden mit Ethylether gewaschen) lieferte die Titelverbindung als weiße Kristalle: Schmelzpunkt 177–179°C [Literaturschmelzpunkt 187-192, Newkome et al. "Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives", J. Org. Chem. 51: 953–954 (1986)]. 1H NMR (DMSO-d6): δ 8.81 (1H, dd, J = 0.8, 2.4 Hz), 8.01 (1H, dd, J = 0.8, 8.2 Hz), 7.91 (1H, dd, J = 2.4, 8.2 Hz).
  • Ethyl-6-iodnicotinat
  • Einer Suspension von 6-Iodnicotinsäure (23,38 g, 94,20 mmol) in Dichlormethan (100 ml) wurde eine Lösung von 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümidhydrochlorid (19,86 g, 103,6 mmol) in Dichlormethan (250 ml) zugesetzt. Diesem Gemisch wurde Ethanol (112,40 g, 269,27 mmol), gefolgt von Dimethylaminopyridin (1,15 g, 9,41 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 24,5 Stunden auf 50°C erhitzt, im Vakuum konzentriert und mit Wasser (200 ml) verdünnt, und dann mit Ethylether (550 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättiger wässriger NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zu einem gelben Feststoff konzentriert. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, 10% EtOAc-Hexan) lieferte die Titelverbindung als weiße Nadeln: Schmelzpunkt 48–49°C. 1H NMR (CDCl3): δ 8.94 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.91 (1dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.85 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.41 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • Ethyl 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung F)
  • Einer Lösung von 4 g (21,7 mmol) 7-Ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaphthalen-1(2H)-on (Verbindung E ), gespült 15 Minuten mit einem Argon-Strom und 6 g (21,7 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 100 ml Triethylamin wurden 5 g (7,2 mmol) Bis(triphenylphosphin)-palladium(II)chlorid und 1,4 g (7,2 mmol) Kupfer(I)iodid zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Argon 5 Minuten lang gespült und dann bei Umgebungstemperatur für 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als einen weißen Feststoff. PMR (CDCl3): δ 1.41 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.41 (6H, s), 2.04 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz), 4.40 (2H, q, J = 7.2 Hz), 7.44 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.68 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 8.04 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.15 (1H, d, J = 1.8 Hz).
  • Ethyl 4-[(5 6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl] benzoat (Verbindung G)
  • Einer kalten Lösung (–78°C) von 291,6 mg (1,59 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 5,6 ml THF wurde eine Lösung aus 500 mg (1,44 mmol) Ethyl 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung F) in 4,0 ml THF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 35 Minuten bei –78°C gerührt und darauf wurde eine Lösung aus 601,2 mg (1,59 mmol) 5-Chlor(2-bis-trifluormethylsulfonyl)imid in 4,0 ml THF zugesetzt. Nach Rühren bei –78°C für 1 Stunde wurde die Lösung auf 0°C erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz wässriger gesättigter NH4Cl gelöscht bzw. abgeschreckt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (50 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5% wässriger NaOH, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und darauf im Vakuum konzentriert, um ein gelbes Öl zu ergeben. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (Siliciumdioxid, 7% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 8.04 (2H, dd, J = 1.8, 8.4 Hz), 7.60 (2H, dd, J = 1.8, 8.4 Hz), 7.51 (2H, m), 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.40 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.02 (1H, t, J = 5.0 Hz), 2.44 (2H, d, J = 5.0 Hz), 1.43 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyllbenzoat (Verbindung 1)
  • Einer Lösung von 4-Lithiotoluol wurde durch Zusatz von 189,9 mg (1,74 ml, 2,96 mmol) t-Butyllithium (1,7 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 253,6 mg (1,482 mmol) von 4-Bromtoluol in 2,0 ml THF hergestellt. Nach Rühren für 30 Minuten wurde eine Lösung aus 269,4 mg (1,977 mmol) Zinkchlorid in 3,0 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, für 30 Minuten gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus 472,9 mg (0,988 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) und 50 mg (0,04 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 4,0 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde Für 45 Minuten auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigter wässriger NH4Cl verdünnt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum zu einem gelben Öl konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (Siliciumdioxid, 5% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-aceton): δ 1.35 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.42 (3H, s), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.25 (5H, m), 7.35 (2H, m), 7.52 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.98 (2H, d, J = 8.5 Hz).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimeth-8-phenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1a)
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens, wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 203,8 mg (0,43 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)-oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 58,2 mg (0,36 ml, 0,69 mmol) Phenyllithium (1,8 M Lösung in Cyclohexan/Et2O), 116,1 mg (0,85 mmol) Zinkchlorid und 13,8 mg (0,01 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) umgewandelt. PMR (CDCl3): δ 1.36 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.7 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.02 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.20 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.27 (1H, m), 7.39 (6H, m), 7.52 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.98 (2H, d, J = 8.2 Hz).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethy1-8(3-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethin]benzoat (Verbindung 2)
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250 mg Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl] benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 284,8 mg (2,090 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin) palladium(O) in 2,0 ml THF und 3-Methylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 201,2 mg (1,86 ml, 3,14 mmol) Tetrabutyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78 °C) von 274,0 mg (1,568 mmol 3-Methylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.99 (2H, d, 7 = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.39–7.14 (7H, m), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.60 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimeth-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 3)
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 200,0 mg (0,418 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 199,4 mg (1,463 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 4,0 THF und 2-Methylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 133,9 mg (1,23 ml, 2,09 mmol) Tetrabutyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78 °C) von 178,7 mg (1,045 mmol) 2-Methylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.97 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.49–7.19 (6H, m), 6.81 (1H, d, 7 = 1.6 Hz), 5.89 (1H, t, J = 4.5 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.43–2.14 (2H, dq, J = 3.7, 5.4 Hz), 2.15 (3H, s), 1.39–1.34 (9H, m).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 4)
  • Unter Verwendung desselben Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 3,5-Dimethylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) Tert-butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78 °C) von 249,0 mg (1,305 mmol) von 3,5 Dimethylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, 7 = 8.4 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40–7.33 (2H, m), 7.20 (1 H, d, J = 1.6 Hz), 7.00 (1 H, s), 6.97 (2H, s), 5.97 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.36 (6H, s), 2.34 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 5)
  • Unter Verwendung des allgemein gleichen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurde 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4-Ethylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78 °C) von 244,0 mg (1,305 mmol) 4-Ethylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.99 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.42–7.24 (7H, m), 5.99 (1 H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.71 (2H, q, J = 7.6 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8(1,1-dimethethyl)phenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 6)
  • Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 4-tert-Butylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) von tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 167,0 mg (0,78 mmol) 4-tert-Butylbrombenzol in 1,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.99 (2H, d, J 8.4 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.28–7.45 (7H, m), 6.02 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.36 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.59 (3H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.39 (9H, s), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorophenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 7)
  • Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4-Chlorphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 252,4 mg (1,305 mmol) 4-Chlor-1-brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40–7.27 (6H, m), 7.12 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.00 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.40 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 8)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4-Methoxyphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 244,1 mg (1,305 mmol) 4-Methoxy-1-brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.40–7.21 (5H, m), 6.95 (2H, d, J = 8.7 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.34 (3H, s), 2.34 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4-[{5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 9)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4-Trifluormethylphenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) 296,6 mg (1,305 mmol) 4-Trifluormethylbrombenzol in 2,0 ml THF) hergestellt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.67 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.54–7.36 (6H, m), 7.10 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.06 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 10)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 2-Lithiopyridin (hergestellt durch Zusatz von 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) 123,8 mg (0,784 mmol) 2-Brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (d6-aceton): [δ 8.64 (1H, m), 7.99 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.85 (1H, ddd, J = 1.8, 7.7, 9.5 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.50 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.47 (2 H, d, J = 1.1 Hz), 7.35 (2H, m), 6.32 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 1.35 (3H, t, J = 7.0 hz), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 11)
  • Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 170,0 mg (0,35 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 3-Lithiopyridin (hergestellt durch Zusatz von 100,2 mg (0,92 ml, 1,56 mmol) tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 123,8 mg (0,784 mmol) 3-Brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 8.63–8.61 (2H, dd, J = 1.7 Hz), 7.99 2H, d, J = 8.4 Hz), 7.67 (1H, dt, J = 7.9 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43–7.34 (3H, m), 7.10 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.07 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.40 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.390 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.36 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-methyl-5-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 12)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 2-Methyl-5-lithiopyridin (hergestellt durch Zusatz von 100,5 mg (0,92 ml, 1,57 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 134,8 mg (0,784 mmol) 2-Methyl-5-brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 8.50 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.99 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.56 (1H, dd, J = 2.3, 8.0 Hz), 7.53 (2H, d, 7 = 8.4 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 2.3, 8.0 Hz), 7.37 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.21 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.11 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.63 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4-[{5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3((2,2-dimethylethyl-dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalenylethinyl]benzoat (Verbindung H)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) wurden 150,0 mg (0,314 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 150,0 mg (1,10 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 10 ml THF und 3-((2,2-Dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 100,2 mg (0,92 ml, 1,584 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung ( –78°C) aus 226,0 mg (0,787 mmol) 3-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40–7.22 (4H, m), 6. 95 (1H, d, J = 7. 6 Hz), 6.84–6.82 (2H, m), 6.00 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.3 7 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (3H, s), 0.99 (9H, s), 0.23 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)phenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat Verbindung I)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 210,0 mg (0,439 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 209,0 mg (1,53 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4-((2,2-Dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyllithium (hergestellt durch Zusatz von 140,3 mg (1,30 ml, 2,19 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 315,0 mg (1,09 mmol) 4-((2,2-Dimethylethyl)dimethylsiloxy)brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.39–7.25 (3H, m), 7.21 (2H, d, J = 8.5 Hz), 5.87 (2H, d, J = 8.5 Hz), 5.96 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s), 1.01 (9H, s), 0.25 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-hydroxyphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat Verbindung 13)
  • Einer Lösung aus Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)-phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung H), 60,0 mg (0,114 mmol) in 1,0 ml THF bei Raumtemperatur wurden 91,5 mg (0,35 ml, 0,35 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid (1 M Lösung in THF) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde die Lösung mit EtOAc verdünnt und mit H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Die Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (4 : 1, Hexane : EtOAc) lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.3 9–7.21 (4H, m), 6.93 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.84 (1H, d, 7.1 Hz), 6.83 (1H, s), 6.01 1 H, t, J = 4.7 Hz), 4.91 (1H, s), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-hydroxy]phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 14)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung I), 50,0 mg (0,095 mmol) in 1,0 ml THF bei Raumtemperatur wurden 73,2 mg (0,29 ml, 0,29 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid (1 M Lösung in THF) zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde die Lösung mit EtOAc verdünnt und mit H2O und gesättiger wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (4 : 1, Hexan : EtOAc) lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.98 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.41–7.20 (5H, m), 6.88 (2H, d, J = 8.4 Hz), 5.96 (1H, t, J = 4.5 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.34 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 264,0 mg (0,552 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 150,0 mg (1,10 mmol) Zinkchlorid, 14 mg (0,012 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 4,0 ml THF und 5 Methylthiazol-2-yllithium (hergestellt durch Zusetzen von 53,2 mg (0,53 ml, 0,83 mmol) n-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 82,0 mg (0,83 mmol) 5-Methylthiazol in 5,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 7.99 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.88 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.55 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.54 (1H, s), 7.45 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz), 7.3 5 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.48 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.3 8 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.51 (3H, s), 2.3 8 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.40 (3H, s), 1.32 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazol)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15a)
  • Eine Lösung von 2-Lithiothiazol wurde durch Zusatz von 41,2 mg (0,42 ml, 0,63 mmol) von n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 53,4 mg (0,63 mmol) Thiazol in 1,0 ml THF hergestellt. Die Lösung wurde für 30 Minuten gerührt und darauf wurde eine Lösung von 113,9 mg (0,84 mmol) Zinkchlorid in 1,5 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, für 30 Minuten gerührt, und darauf wurde das Organozink über eine Kanüle zu einer Lösung von 200,0 mg (0,42 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) und 12,4 mg (0,01 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 1,5 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 45 Minuten auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigter wässriger NH4Cl verdünnt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum zu einem gelben Öl konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (Silica, 20% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als ein farbloses Öl. PMR (CDCl3): δ 1.35 (6H, s), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.57 (1H, t, J = 4.8 Hz), 7.33 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.46 (1H, dd, J = 1.7 , 8.1 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.87 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.92 (1H, d, J = 3.3 Hz), 8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 16)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 295,0 mg (0,617 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 168,0 mg (1,23 mmol) Zinkchlorid, 16 mg (0,014 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 6,0 ml THF und 4-Methylthiazol-2-yl-lithium (hergestellt durch Zusatz von 59,6 mg (0,60 ml, 0,93 mmol) n-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 92,0 mg (0,93 mmol) 4-Methylthiazol in 6,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.80 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.87 (1H, s), 6.52 (1 H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.54 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.33 (3H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl)ethinyl] benzoat (Verbindung 17)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,5-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 200,0 mg (0,418 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 110,0 mg (0,84 mmol) Zinkchlorid, 12 mg (0,011 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF und 4,5-Dimethylthiazol-2-yl-lithium (hergestellt durch Zusetzen von 40,2 mg (0,39 ml, 0,63 mmol) n-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 71,0 mg (0,63 mmol) 4,5-Dimethylthiazol in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 8.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.82 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43 (1H, dd, J 1.7, 8.0 Hz), 7.33 91H, d, J = 8.0 Hz), 6.45 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.41 (3H, s), 2.40 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.40 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihvdro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-S-pyridyl-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 18)
  • Eine Lösung von 81,7 mg (0,194 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 12) und 40,7 mg (0,969 mmol) LiOH-H2O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1) V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff zu liefern. 1H NMR (d6-DMSO): δ 8.41 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.63 (1H, dd, J = 2.3, 7.9 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.49 (2H, m), 7.33 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H, s), 6.11 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.52 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.31 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 19)
  • Eine Lösung von 80,0 mg (0,196 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 10) und 20,6 mg (0,491 mmol) LiOH-H2O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff zu ergeben. 1H NMR (d6-DMSO): δ 8.64 (1H, m), 7.94 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.87 (1H, dt, J = 1.7, 7.8 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.47 (2H, s), 7.37 (1H, m), 7.25 (1H, s), 6.30 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.39 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.31 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylphenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 20)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 2), 30,0 mg (0,071 mmol) in 3 ml EtOH und zwei ml THF wurden 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, 7 = 8.5 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.46 (2H, s), 7.32–7.13 (4H, m), 7.10 (1H, s), 6.98 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.34 (3H, s), 2.31 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.30 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphen)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 21)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 5), 47,0 mg (0,108 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.46 (2H, s), 7.29–7.21 (4H, m), 7.02 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.64 (2H, q, J = 7.5 Hz), 2.33 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.29 (6H, s), 1.22 (3H, t, J = 7.5 Hz).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 22)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 8), 80,0 mg (0,183 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 40,0 mg (1,00 mmol, 1,0 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.45 (2H, s), 7.24 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.02–6.89 (3H, m), 5.98 (1H, t, J = 4.4 Hz), 3.79 (3H, s), 2.31 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.29 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluoromethylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl] benzoesäure (Verbindung 23)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dhydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 9), 70,0 mg, (0,148 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.80 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.61–7.47 (6H, m), 6.97 (2H, s), 6.16 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.30 (6H, s).
  • 4-[5,6-Dihydro-5,5-dimethy3,5-dimethphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 24)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dhydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]-benzoat (Verbindung 4), 90,0 mg (0,207 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.45 (2H, s), 7.00 (1H, s), 6.97 (1H, s), 5.97 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.31 (2H, d, J = 4.5 Hz), 2.30 (6H, s), 1.29 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 25)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 7), 80,0 mg (0,181 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und einem Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.51–7.48 (4H, m), 7.34 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.97 (1H, s), 6.07 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.34 (2H, d, J = 4.6 Hz), 1.29 (6H, s).
  • 4-[(5 6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 26)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]benzoat (Verbindung 11), 45,0 mg (0,110 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und einem Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ 8.60 (1H, d, J = 4.6 Hz), 8.55 (1H, s), 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.76 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.51–7.46 (3H, m), 6.94 (1H, s), 6.14 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.31 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure Verbindung 27)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalenyl) ethinyl]-benzoat (Verbindung 3) 80,0 mg (0,190 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (DMSO): δ. 7.89 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.46 (2H, s), 7.29–7.14 (4H, m), 6.59 (1H, s), 5.90 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.39 (2H, m), 2.60 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.29 (3H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-hydroxyphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 28)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung H), 40,0 mg (0,076 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 40,0 mg (1,00 mmol, 1,00 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-Aceton): δ 7.90 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.49 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.35 (2H, s), 7.15–7.07 (2H, m), 6.77–6.69 (3H, m), 5.92 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.25 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.23 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-4-hydroxyhenyl)-2-naphthalenyl)ethinyllbenzoesäure (Verbindung 29)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung I), 75,0 mg (0,143 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurde 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden auf 50 °C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na2SO4 und ein Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-aceton): δ 8.01 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (2H, s), 7.20–7.17 (3H, m), 6.92–6.89 (2H, m), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.34 (6H, s).
  • 4-[5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-metylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl]ethinylbenzoat (Verbindung 15) (100 mg, 0,23 mmol) und 4 ml EtOH bei Raumtemperatur wurde wässrige NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in eine Lösung von CH2Cl2 und Ether (5 : 1) suspendiert und auf einen pH von 5 mit 1 M wässriger HCl angesäuert. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.96 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.95 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.65 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.64 (1H, s), 7.53 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.46 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.59 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.50 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.5 Hz), 1.27 (6H, s).
  • 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a)
  • Einer Lösung von 33,9 mg (0,08 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15a) und 8,5 mg (0,20 mmol) LiOH-H2O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1), V/V wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als einen. farblosen Feststoff zu ergeben. PMR (d6-DMSO): δ 1.29 (6H, s), 2.42 (2H, d, J = 4.6 Hz), 6.68 (1H, t, J = 4.6 Hz), 7.51 (2H, m), 7.62 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.77 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.93 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.98 (1H, d, 7 = 3.3 Hz).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure {Verbindung 31)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl]ethinylbenzoat (Verbindung 16) (145,0 mg, 0,34 mmol) und 4 ml EtOH bei Raumtemperatur wurde wässrige NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in einer Lösung von CH2Cl2 und Ether (5 : 1) suspendiert und mit 1 M wässriger HCl auf einen pH von 5 angesäuert. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu ergeben. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.94 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.87 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1 H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.1 Hz), 7.27 (1 H, s), 6.58 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.43 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.26 (6H, s).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalen)ethinyl] benzoesäure (Verbindung 32)
  • sEiner Lösung von Ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalenyl]ethinylbenzoat (Verbindung 17) (58,0 mg, 0,13 mmol) und 4 ml EtOH wurde bei Raumtemperatur wässrige NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in einer Lösung aus CH2Cl2 und Ether (5 : 1) suspendiert und mit 1 M wässriger HCl auf einen pH von 5 angesäuert. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, so dass sich die Titelverbindung als ein weißer Feststoff ergab. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.94 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.86 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.50 (1H, dd, J = 1.6, 8.0 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.51 (1H, t, J = 4.9 Hz), 2.37 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 4.6 Hz), 2.32 (3H, s), 1.26 (6H, s).
  • Ethyl 4-[{5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 170,0 mg (0,366 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 202,0 mg (1,48 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,022 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 20 ml THF und 5-Methyl-2-lithiothiophen (hergestellt durch Zusetzen von 58,6 mg (0,36 ml, 0,915 mmol) n-Butyllithium (2,5 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C von 89,8 mg (0,915 mmol) 2-Methylthiophen in 2,0 ml THF) umgewandelt. 1H NMR (CDCl3): δ 8.00 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.59 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7. 3 5 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 3.5 Hz), 6.74 (1 H, d, J = 2.8 Hz), 6.15 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.38 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.52 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.8 Hz). 1.40 (3H, t, 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33a)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1), wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 186,8 mg (1,37 mmol) Zinkchlorid, 37,1 mg 0,03 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) und 2-Lithiothiophen (hergestellt durch Zusatz von 65,9 mg (0,69 ml, 1,03 mmol) n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexan) zu einer kalten Lösung (–78 °C) von 86,5 mg (1,03 mmol) Thiophen in 1,0 ml THF) umgewandelt. PMR (CDCl3): δ 1.33 (6H, s), 1.36 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.2 Hz), 6.25 (1H, t, J = 4.7 Hz), 7.13 (2H, m), 7.47 (4H, m), 7.62 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.00 (2H, d, J = 8.5 Hz).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimeth(5-methyl-2-thien)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 34)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naphthalenyl]ethinylbenzoat (Verbindung 33) (35,0 mg, 0,082 mmol) in 2 ml EtOH und 1 ml THF bei Raumtemperatur wurde wässrige NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und darauf mit 10% HCl angesäuert. Eine Extrakton mit EtOAc, gefolgt von einer Trocknung über Na2SO4 und einem Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-Aceton): δ 8.03 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.63 (2H, d, 7 = 8.6 Hz), 7.54–7.48 (3H, m), 6.89 (1H, m), 6.18 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.49 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.32 (6H, s).
  • 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 34a)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-B-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a) wurden 70,0 mg (0,17 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33a) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 17,8 mg (0,42 mmol) LiOH in H2O umgewandelt. PMR (d6-DMSO): δ 1.27 (6H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.9 Hz), 6.23 (1H, t, J = 4.9 Hz), 7.14 (2H, m), 7.38–7.56 (4H, m), 7.61 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.92 (2H, d, J = 8.3 Hz).
  • 5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung K)
  • Eine Lösung von 3,4-dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromonaphthalen (Verbindung D) (250,0 mg, 0,764 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 1,0 ml t-Butyllithium (1,68 mmol), 1,7 M Lösung in Pentan) wurde langsam zugesetzt. Nach Rühren für 1 Stunde bei –78°C wurde gasförmiges CO2 (erzeugt durch Abdampfen von Trockeneis und über ein Trockenrohr geleitet) für 1 Stunde durch den Reaktor geblasen. Die Lösung ließ man dann auf Raumtemperatur aufwärmen und die Reaktion wurde durch Zusatz von 10% HCl abgeschreckt. Einer Extraktion mit EtOAc folgte ein Waschen der kombinierten organischen Schicht mit H2O und gesättigter wässriger NaCl und durch Trocknen über MgSO4. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Waschen des Feststoffes mit Hexanen lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.94 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.76 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.24 (4H, m), 6.01 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.40 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 35)
  • Eine Lösung von 170,0 mg (0,58 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung K), 115,0 mg (0,70 mmol) Ethyl-4-aminobenzoat, 145,0 mg (0,76 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-Ethylcarbodümidhydrochlorid und 92,4 mg (0,76 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 6,0 ml DMF wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugesetzt und die sich ergebende Lösung wurde mit H2O, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigter wässriger NaCl gewaschen und darauf über MgSO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde das Produkt als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (10–15% EtOAc/Hexane). 1H NMR (CDCl3): δ 8.02 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.72 (2H, m), 7.65 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.52 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.25 (4H, m), 6.15 (1 H, t, J = 4.9 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.40 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.9 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H), s).
  • 4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]aminolbenzoesäure (Verbindung 36)
  • Einer Lösung von 26,5 mg (0,06 mmol) Ethyl 4[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 35) in 3,0 ml EtOH und 4,0 ml THF wurde 240,1 mg NaOH (6,00 mmol, 3,0 ml, 2 M wässrige Lösung) zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 72 Stunden wurde die Reaktion durch Zusatz von 10% HCl gelöscht. Eine Extraktion mit EtOAc und ein Trocknen der organischen Schichten über MgSO4 lieferte einen Feststoff nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck. Eine Kristallisierung aus CH3CN lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-DMSO): δ 10.4 (1H, s), 7.91–7.81 (5H, m), 7.54 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.45 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.23 (4H, s), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz) 2.35 (5H, s), 1.33 (6H, s).
  • Ethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methyl-phenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]oxy]-benzoat (Verbindung 37)
  • Eine Lösung von 25,0 mg (0,086 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung K), 17,5 mg (0,103 mmol) Ethyl-4-hydroxybenzoat, 21,4 mg (0,112 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-carbodiimidhydrochlorid und 12,6 mg (0,103 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 2,0 ml DMF wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugesetzt und die sich ergebende Lösung mit H2O, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde das Produkt durch Säulenchromatographie als ein blassgelber Feststoff isoliert (10% EtOAc/Hexane). 1H NMR (CDCl3): δ 8.08 (2H, d, J = 8.1 Hz), 8.05 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.89 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.22 (5H, m), 6.05 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.39 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.38 (3H, s), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.37 (6H, s).
  • 2-Trimethylsilylethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methphenyl)-2-naphthalenyl) carbonyl]oxy]-benzoat (Verbindung 38)
  • Eine Lösung von 93,5 mg (0,320 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung K) 76,0 mg (0,319 mmol) 2-Trimethylsilylethyl-4-hydroxybenzoat, 80,0 mg (0,417 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümidhydrochlorid und 51,0 mg (0,417 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 4,0 ml DMF wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Ethylacetat wurde zugesetzt und die sich ergebende Lösung mit H2O, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde das Produkt als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie (5% EtOAc (Hexane)) isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.08 (2H, d, J = 8.8 Hz), 8.05 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.26–7.18 (6H, m), 6.05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4.42 (2H, t, J = 8.4 Hz), 2.40 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.39 (3H, s), 1.38 (6H, s), 0.09 (9H, s).
  • 4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]oxy]-benzoesäure (Verbindung 39)
  • Eine Lösung von 110,0 mg (0,213 mmol) 2-Trimethylsilylethyl 4[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]oxy]-benzoat (Verbindung 38) und 167,3 mg Tetrabutylammoniumfluorid (0,640 mmol, 0,64 ml einer 1 M Lösung in THF) wurde in 2,0 ml THF bei Raumtemperatur für 22 Stunden gerührt. Ethylacetat wurde zugesetzt und die sich ergebende Lösung mit H2O und gesättiger wässriger NaCl gewaschen und dann über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Waschen des zurückbleibenden Feststoffs mit EtOAc und CH3CN lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (d6-aceton): δ 8.10 (2H, d, J = 8.8 Hz), 8.06 (1H, dd, J = 2.0, 8.1 Hz), 7.82 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.35 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.25 (4H, m), 6.08 (1H, t, 7 = 4.7 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.35 (3H, s), 1.39 (6H, s).
  • Ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl] amino]-benzoat Verbindung 40)
  • Eine Lösung von 115,0 mg (0,41 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung K), 89,0 mg (0,49 mmol) Ethyl-3-fluor-4-aminobenzoat, 102,0 mg (0,53 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümidhydrochlorid und 65,0 mg (0,53 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 5,0 ml DMF wurde für 1 Stunde bei 50 °C gerührt und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugesetzt und die sich ergebende Lösung mit H2O, gesättigter wässriger NaHCO3 und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde das Produkt als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie (20% EtOAc/Hexane) isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (1H, s), 7.89 (1H, t, J = 8.4 Hz), 7.70 (2H, m), 7.52 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (5H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (3H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.39 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.36 (6H, s).
  • 2-Fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalen)carbonyl]amino]-benzoesäure (Verbindung 41)
  • Einer Lösung von 41,6 mg (0,091 mmol) Ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 40) in 2,0 ml EtOH und 2,0 ml THF wurde 40,0 mg NaOH (1,00 mmol, 1,0 ml, 1 M wässrige Lösung) zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Reaktion durch Zusatz von 10 HCl gelöscht. Eine Extraktion mit EtOAc und ein Trocknen der organischen Schichten über MgSO4 ergab einen Feststoff nach Entfernen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck. Eine Kristallisation aus CH3CN lieferte die Titelverbindung als einen blassgelben Feststoff. 1H NMR (d6-aceton): δ 9.84 (1H, s), 7.94–7.83 (3H, m), 7.64 (1H, dd, J = 2.0 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.23 (4H, s), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.36 (3H, s), 1.35 (6H, s).
  • Ethyl 4[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)thiocarbonyl]aminolbenzoat (Verbindung 42)
  • sEine Lösung von 110,0 mg (0,25 mmol) Ethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 35) und 121,0 mg (0,30 mmol) [2,4-bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid] (Lawessons Reagenz) in 12,0 ml Benzol wurde über Nacht unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie als gelber Feststoff isoliert (10–25% EtOAc/Hexane). 1H NMR (CDCl3): δ 8.92 (1H, s), 8.06 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.88–7.70 (3H, m), 7.42 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.18 (4H, m), 6.03 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.37 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.38 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.56 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.35 (6H, s).
  • 4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-4-methphen)-2-naphthalen)thiocarbonyl]aminolbenzoesäure (Verbindung 43)
  • Eine Lösung von 84,0 mg (0,184 mmol) Ethyl 4[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)thiocarbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 42) in 2,0 ml EtOH und 2,0 ml THF wurde 60,0 mg NaOH (1,50 mmol, 1,5 ml, 1 M wässriger Lösung) zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Reaktion durch Zusatz von 10 HCl gelöscht. Eine Extraktion mit EtOAc und ein Trocknen der organischen Schichten über MgSO4 ergab einen Feststoff nach Entfernen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck. Eine Kristallisation aus CH3CN lieferte die Titelverbindung als einen gelben Feststoff. 1H NMR (d6-aceton): δ 10.96 (1H, s), 8.05 (4H, m), 7.72 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 7.54 (1 H, s), 7.46 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.20 (4H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.7 Hz), 2.3 8 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.3 3 (3H, s), 1.35 (6H, s).
  • 2-Acetyl-6-bromnaphthalen (Verbindung L)
  • Einem kalten (10°C) Gemisch von 44,0 g (0,212 mol) 2-Bromnaphthalen und 34,0 g (0,255 mol) Aluminiumchlorid in 400 ml Nitrobenzol wurde 21,0 g (267 mmol) Acetylchlorid zugesetzt. Das mechanisch gerührte Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 18 Stunden auf 40°C erhitzt. Nach Abkühlen im Eisbad auf 0°C wurde die Reaktion durch Zusatz von 12 M HCl (70 ml) gelöscht. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und verdünnter wässriger Na2CO3 gewaschen. Eine Kugelrohrdestillation, gefolgt von einer Umkristallisierung aus 10% EtOAc-Hexan ergab 23 g der Titelverbindung als einen bräunlichen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 8.44 (1H, br s), 8.04–8.10 (2H, m), 7.8 5 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.82 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.8 Hz), 2.73 (3H, s).
  • 6-Brom-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung M)
  • Einer Lösung von Natriumhypochlorit (62 ml, 5,25% in Wasser (G/G), 3,6 g, 48,18 mmol) und Natriumhydroxid (6,4 g, 160,6 mmol) in 50 ml Wasser wurde eine Lösung aus 2-Acetyl-6-bromnaphthalen (Verbindung L), 4 g (16,06 mmol) in 50 ml 1,4-Dioxan zugesetzt. Die gelbe Lösung wurde in einem Ölbad für 2 Stunden auf 70°C erhitzt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und mit Ethylether (2 × 50 ml) extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden mit NaHSO3-Lösung verdünnt (bis die Kl-Indikatorlösung farblos blieb) und wurde dann mit 1 N Schwefelsäure angesäuert (pH < 2), so dass sich ein weißes Präzipitat ergab. Das Gemisch wurde mit Ethylether extrahiert und die kombinierten organischen Phasen wurden mit gesättigter wässriger NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert, so dass sich 3,54 g (88%) der Titelverbindung als Feststoff ergaben. 1H NMR (DMSO-d6): δ 8.63 (1H, br s), 8.32 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.10 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.00-8.05 (2H, m), 7.74 (1H, dd, J = 2.0, 8.8 Hz).
  • Ethyl-6-Brom-2-naphthalencarboxylat (Verbindung N)
  • Einer Lösung von 6-Brom-2-naphthalencarbonsäure (Verbindung M), 3,1 g, (12,43 mmol) in Ethanol (30 ml, 23,55 g, 511,0 mmol) wurden 18 M Schwefelsäure (2 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde für 30 Minuten unter Rückflusskühlung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und das Reaktionsgemisch zwischen Pentan (100 ml) und Wasser (100 ml) aufgeteilt. Die wässrige Phase wurde mit Pentan (100 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigter wässriger NaCl (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und konzentriert, so dass sich ein gebrochen weißer Feststoff ergab. Eine Reinigung durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, 10% EtOAc-Hexan) lieferte die Titelverbindung als einen weißen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 8.58 (1H, br s), 8.10 (1H, dd, J = 1.7, 9 Hz), 8.06 (1H, d, J = 2 Hz), 7.83 (1H, d, J = 9 Hz), 7. 80 (1H, d, J = 9 Hz), 7.62 (1H, dd, J = 2, 9 Hz).
  • Ethyl (E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung O)
  • Einer Lösung von 520,0 mg (2,00 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-bromo-1(2H)-naphthalenon (Verbindung B) und 510,0 mg (2,90 mmol) Ethyl-4-vinylbenzoat in 4,0 ml Triethylamin (entgast durch Spülen mit Argon für 25 Minuten) wurde 124,0 mg (0,40 mmol) Tris-(2-methylphenyl)phosphin, gefolgt von 44,0 mg (0,20 mmol) Palladium(II)acetat, zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 2,5 Stunden auf 95°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und unter reduziertem Druck konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 8.19 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.03 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.69 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.20 (2H, s), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.76 (2H, t, J = 6.5 Hz}, 2.04 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz, and 6H, s).
  • Ethyl (E)-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl) ethenyl]-benzoat (Verbindung P)
  • Einer kalten (–78°C) Lösung von 440,0 mg (2,40 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 10,0 ml THF wurden 700,0 mg (2,00 mmol) Ethyl (E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung O) als eine Lösung in 25,0 ml THF zugesetzt. Nach Rühren bei –78°C für 1,5 Stunden wurden 960,0 mg (2,40 mmol) 2-[N,Nbis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in einer Portion zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung auf 0°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit 5% wässriger NaOH gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Die Titelverbindung wurde als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie (7% EtOAc/Hexane) isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.04 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.52 (1H, s), 7.49 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.20 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.10 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.00 (1H, t, J = 4.9 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.43 (2H, d, 7 = 4.9 Hz), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.32 (6H, s).
  • Ethyl(E)-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphen)-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung 44)
  • Eine Lösung von 4-Lithiotoluol wurde bei –78°C durch den Zustatz von 130,7 mg t-Butyllithium (2,04 mmol; 1,20 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) zu einer Lösung von 374,5 mg (2,20 mmol) 4-Bromtoluol in 2,5 ml THF hergestellt. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von 313,4 mg (2,30 mmol) ZnCl2 in 2,0 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, für 1,25 Stunden gerührt und dann über eine Kanüle einer Lösung von 285,0 mg (0,590 mmol) von Ethyl (E)-4-[2-(5,B-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung P) und 29,0 mg (0,025 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF, zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und darauf bei 55 °C für 2 Stunden. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zusatz von gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten Extrakte wurden mit 5% wässriger NaOH, gesättigter wässriger NaCl gewaschen und über Na2SO4 getrocknet, bevor sie unter reduziertem Druck konzentriert wurden. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie als farbloser Feststoff isoliert (10% EtOAc/Hexane). 1H NMR (CDCl3): δ 7.96 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.43–7.16 (7H, m), 7.07 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.93 (1H, d, J = 16.3 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.0 Hz), 2.41 (3H, s), 2.33 (1H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.33 (6H, s).
  • (E)-4-(2-(5 6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methphenyl)-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoesäure (Verbindung 45)
  • Einer Lösung von 65,0 mg (0,190 mmol) Ethyl (E)-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung 44) in 4,0 ml THF wurde 30,0 mg LiOH (0,909 mmol, 1,0 ml einer 1,1 M Lösung) und 1,0 ml MeOH zugesetzt. Die Lösung wurde für 3 Stunden auf 55°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in H2O gelöst und mit Hexanen extrahiert. Die wässrige Schicht wurde auf einen pH von 1 mit 10% HCl angesäuert, und mit Et2O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigter wässriger NaCl gewaschen, mit EtOAc verdünnt, so dass sich eine klare Lösung ergab, und über Na2SO4 getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, so dass sich die Titelverbindung als ein farbloser Feststoff ergab. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.86 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.58 (1H, dd, J = 1.7, 8.1 Hz), 7.41 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.28 (1H, d, J = 16.5 Hz), 7.23 (4H, s), 7.08 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.07 (1H, d, 7 = 16.5 Hz), 5.97 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.35 (3H, s), 2.31 (1H, d, J = 4.6 Hz), 1.29 (6H, s).
  • Ethyl 4-[1,1-dimethyl-3-(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 47)
  • Eine Lösung von 32,0 mg (0,187 mmol) 4-Bromtoluol in 1,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 24,0 mg t-Butyllithium (0,375 mmol, 0,22 ml) einer 1,7 m Lösung in Pentan) wurden langsam zugesetzt. Die gelbe Lösung wurde für 30 Minuten gerührt und zu diesem Zeitpunkt wurden 29,8 mg (0,219 mmol) ZnCl2 als eine Lösung in 1,0 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und nach 30 Minuten einem zweiten Kolben zugesetzt, der 29,0 mg (0,062 mmol) von Ethyl 4-[2-(1,1-dimethyl-3-(trifluormethylsulfonyl)oxy-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung FF) und 2,9 mg (0,003 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 1,0 ml THF enthielt, zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1 Stunde auf 50°C erwärmt und darauf bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht bzw. abgeschreckt und darauf mit Et2O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter wässriger NaCl gewaschen und über MgSO4 getrocknet, bevor sie unter reduziertem Druck konzentriert wurden. Die Titelverbindung wurde als farbloses Öl durch Säulen-Chromatographie (10% Et2O/Hexane) isoliert. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.03 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.66 (1H, s), 7.58 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.46 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.3 8 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.28 (2H, d, J = 9 Hz), 6.43 (1H, s), 4.40 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.43 (3H, s), 1.41 (3H, t; +6H, s).
  • 4-[2-(1,1-dimethyl(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinl]benzoesäure (Verbindung 48)
  • Einer Lösung von 10,0 mg (0,025 mmol) Ethyl 4-[2-(1,1-dimethyl-3-(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 47) in 0,5 ml THF/H2O (3 : 1 V/V) wurde 5,2 mg (0,12 mmol) LiOH-H2O zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 48 Stunden wurde die Lösung mit Hexanen extrahiert und die wässrige Schicht wurde mit gesättigter wässriger NH4Cl angesäuert. Festes NaCl wurde zugesetzt und das sich ergebende Gemisch mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (Na2SO4) und unter reduziertem Druck konzentriert, so dass sich die Titelverbindung als ein farbloser Feststoff ergab. 1H NMR (300 MHz, d6-DMSO): δ 7.95 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.65 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.57 (2H, m), 7.49 (3H, m), 7.30 (2H, d, J = 7.9 Hz), 6.61 (1H, s), 2.36 (3H, s), 1.36 (6H, s).
  • 3-(4-Bromthiophenoxy)propionsäure
  • Einer Lösung von 1,44 g (35,7 mmol) NaOH in 20,0 ml entgastem Wasser (gespült mit Argon) wurden 6,79 g (35,7 mmol) 4-Bromthiophenol zugesetzt. Das sich ergebende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Ein zweiter Kolben wurde mit 2,26 g (16,3 mmol) K2CO3 und 15 ml entgastem H2O befüllt. Dieser Lösung wurde (in Portionen) 5,00 g (32,7 mmol) 3-Brompropionsäure zugesetzt. Die sich ergebende Kaliumcarboxylat-Lösung wurde der Natriumthiolat-Lösung zugesetzt und das sich ergebende Gemisch bei Raumtemperatur für 48 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat mit Benzol extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden verworfen. Die wässrige Schicht wurde mit 10% HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigter wässriger NaCl gewaschen, über MgSO4 getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Der sich ergebende Feststoff wurde aus Et2O-Hexanen umkristallisiert, so dass sich diese Verbindung als gebrochen weiße Kristalle ergab. 1H NMR (CDCl3): δ 7.43 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.4 Hz), 3.15 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.68 (2H, t, J = 7.3 Hz).
  • 2,3-Dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
  • Eine Lösung von 3,63 g (13,9 mmol) 3-(4-Bromthiophenoxy)propionsäure in 60 ml Methansulfonsäure wurde für 1,5 Stunden auf bis 75°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit H2O verdünnt und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 2 N wässriger NaOH, H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen und dann über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte einen gelben Feststoff, aus dem das Produkt durch Säulenchromatographie (3% EtOAc-Hexane) als blassgelber Feststoff isoliert wurde. 1H NMR (CDCl3): δ 8.22 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.48 1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz), 7.17 (1H, d, J = 8.5 Hz), 3.24 (2H, t, 7 = 6.4 Hz), 2.98 (2H, t, J = 6.7 Hz).
  • 2,3-Dihydro-2-(2-trimethylsilylethinyl)-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
  • Eine Lösung von 1,00 g (4,11 mmol) 2,3 Dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 78,3 mg (0,41 mmol) Cul in 15,0 ml THF und 6,0 ml Et2NH wurden mit Argon für 5 Minuten gespült. Zu dieser Lösung wurden 2,0 ml (1,39 g, 14,2 mmol) von (Trimethylsilyl)acetylen, gefolgt von 288,5 mg (0,41 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid zugesetzt. Die sich ergebende dunkle Lösung wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt und dann durch ein Celite-Kissen filtriert, das mit EtOAc gewaschen wurde. Das Filtrat wurde mit H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor es über MgSO4 getrocknet wurde. Die Titelverbindung wurde als oranges Öl durch Säulen-Chromatographie isoliert (4% EtOAc-Hexane). 1H NMR (CDCl3): δ 8.13 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.36 (1H, dd, J = 2.1, 8.2 Hz), 7.14 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.19 (2H, d, J = 6.3 Hz), 2.91 (2H, d, J = 6.3 Hz), 0.21 (9H, s).
  • 2,3-Dihydro-6-ethinyl-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
  • Eine Lösung, die 600,0 mg (2,25 mmol) 2,3-Dihydro-6-(2-trimethylsilylethinyl)-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 100,0 mg (0,72 mmol) K2CO3 in 15 ml MeOH enthielt, wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit H2O verdünnt und mit Et2O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen orangen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 8.17 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.22 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.08 (1H, s) 2.94 (2H, t, J = 6.3 Hz).
  • Ethyl 4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1-benzothiopyran-4-onyl))ethinyl]benzoat
  • Eine Lösung von 405,0 mg (2,15 mmol) 2,3-Dihydro-6-ethinyl-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 594,0 mg (2,15 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 15 ml Et3N und 3 ml THF wurden mit Argon 15 Minuten lang gespült. Zu dieser Lösung wurden 503,0 mg (0,72 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid und 137,0 mg (0,72 mmol) Cul zugesetzt. Diese Lösung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und darauf durch ein Celite-Kissen filtriert, das mit EtOAc gewaschen wurde. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte einen braunen Feststoff. Eine Säulenchromatographie (3% EtOAc-Hexane) lieferte die Titelverbindung als einen orangen Feststoff. 1H NMR (d6 – aceton): δ 8.15 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.02 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.69 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz), 7.40 (1H, d, 7 = 8.2 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.40 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.96 (2H, t, J = 6.3 Hz), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • Ethyl 4-[2-(6-(4-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-(2H)-1-benzothiopanyl))ethinyl]benzoat
  • Einer Lösung von 221,9 mg (1,21 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 3,0 ml THF, abgekühlt auf –78°C, wurden 370,0 mg (1,10 mmol) Ethyl 4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1-benzothiopyran-4-onyl))ethinyl]benzoat in 4,0 ml THF zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in 4,0 ml THF langsam zugesetzt. Die Reaktion wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und nach 5 Stunden durch Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5% wässriger NaOH, H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck, gefolgt durch Säulenchromatographie (4% EtOAc-Hexan) lieferte die Titelverbindung als einen blassgelben Feststoff. 1H NMR (d6 -aceton): δ 8.12 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.56 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.49 (1H, dd, J = 1.7, 8,1 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.33 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.82 (2H, d, J = 5.7 Hz), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • Ethyl 4-[2-(6-(4-(4-methylphenyl)-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinl]benzoat (Verbindung
  • Einer Lösung von 120,8 mg (0,70 mmol) 4-Bromtoluol in 2,0 ml THF bei –78°C wurden 88,4 mg (1,38 mmol, 0,81 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) von t-Butyllithium zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von 131,6 mg (0,97 mmol) ZnCl2 in 2,0 ml THF zugesetzt und die sich ergebende blassgelbe Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Einem Rühren für 40 Minuten folgte ein Zusatz dieser Lösung zu einem zweiten Kolben, der 129,2 mg (0,28 mmol) Ethyl 4-[2-(6-(4-(trifluormethylsulfonyl)oxy-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat, 14,0 mg (0,012 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin) palladium(O) und 2,0 ml THF enthielt. Die sich ergebende Lösung wurde für 5 Stunden auf 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und durch den Zusatz wässriger gesättigter NH4Cl abgeschreckt. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, darauf getrocknet (MgSO4) und zu einem orangen Öl konzentriert. Die Titelverbindung wurde als farbloser Feststoff durch Säulen-Chromatographie (3–5% EtOAc-Hexane) isoliert. 1H NMR (d6-aceton): δ 7.98 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.44–7.38 (2H, m), 7.26–7.15 (5H, m), 6.14 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.34 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.53 (2H, d, J = 5.8 Hz), 2.37 (2H, s), 1.35 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • 4-[2-(6-(4-(4-methphenyl)-(2H)-1-benzothiopyl))ethin]-benzoesäure (Verbindung 50)
  • Einer Lösung von 29,0 mg (0,07 mmol) Ethyl 4-[2-(6-(4-(4-methylphenyl)-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat (Verbindung 49) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurden 160,0 mg (4,00 mmol, 2,0 ml einer 2 M wässrigen Lösung) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 2 Stunden bei 35°C gerührt und darauf auf Raumtemperatur abgekühlt und für zusätzliche 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz einer 10%igen wässrigen HCl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H2O und gesättigter NaCl gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte einen Feststoff, der mit CH3CN gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet wurde, so dass sich die Titelverbindung als ein blassgelber Feststoff ergab. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.90 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.40 (4H, m), 7.25–7.13 (4H, m), 7.02 (1H, d, J = 1.7 Hz), 6.11 (1H, t, J = 5.7 Hz), 3.54 (2H, d, J = 5.7 Hz), 2.34 (3H, s).
  • 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon(Verbindung R); und 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung S)
  • Einem kalten (0 °C) Gemisch aus Aluminiumchlorid (26,3 g, 199,0 mmol) in Dichlormethan (55 ml) wurde Acetylchlorid (15 g, 192 mmol) und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen (24,4 g, 152 mmol) in Dichlormethan (20 ml) über 20 Minuten zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt und für 4 Stunden gerührt. Eis (200 g) wurde dem Reaktionsgefäß bzw. -kolben zugesetzt und das Gemisch wurde mit Ether (400 ml ) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase mit 10% HCl (50 ml), Wasser (50 ml), 10% wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter wässriger NaCl (50 ml) gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurden.
  • Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt, so dass sich ein gelbes Öl ergab, das in Benzol gelöst wurde (50 ml).
  • Einer kalten (0°C) Lösung von Essigsäure (240 ml) und Acetanhydrid (120 ml) wurde Chromtrioxid (50 g, 503 mmol) in kleinen Teilen über 20 Minuten unter Argon zugesetzt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 0°C gerührt und mit Benzol (120 ml) verdünnt. Die Benzol-Lösung, oben hergestellt, wurde unter Rühren über einen Zusatztrichter über 20 Minuten zugesetzt. Nach 8 Stunden wurde die Reaktion durch vorsichtigen Zusatz von Isopropanol (50 ml) bei 0°C, gefolgt von Wasser (100 ml), abgeschreckt. Nach 15 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (1100 ml) und Wasser (200 ml) verdünnt und darauf mit festem Natriumhydrogencarbonat (200 g) neutralisiert. Die Ether-Schicht wurde mit Wasser (100 ml) und gesättigter wässriger NaCl (2 × 100 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte ein Gemisch der isomeren Diketone, die durch Chromatographie getrennt wurden (5% EtOAc/Hexane). (Verbindung R): 1H NMR (CDCl3): δ 8.55 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 2.0, 8.3 Hz), 7.53 (1H, d, J = 8.3 Hz), 2.77 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.62 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 6.6 Hz), 1.41 (6H, s). (Verbindung S): 1H NMR (CDCl3): δ 8.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.02 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.82 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 2.77 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s).
  • 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-2-(2-methyl-l,3-dioxolanyl)2H)-naphthalenon (Verbindung I)
  • Ein Gemisch von 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung R) (140,0 mg, 0,60 mmol), Ethylenglycol (55,0 mg, 0,90 mmol), p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (4 mg) und Benzol (25 ml) wurde unter Verwendung einer Dean-Stark-Vorrichtung für 12 Stunden unter Rückflusskühlung erhitzt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 10% wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung abgeschreckt und mit Ether (2 x 75 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser (5 ml) und gesättigter wässriger NaCl (5 ml) gewaschen, und über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als ein Öl. 1H NMR (CDCl3) : δ 8.13 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7. 64 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.2 Hz), 3.97-4.10 (2H, m), 3.70–3.83 (2H, m), 2.73 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.01 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.64 (3H, s), 1.39 (6H, s).
  • 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalen (Verbindung U)
  • Einer Lösung von 195,4 mg (1,00 mmol) p-Tolulylmagnesiumbromid (1,0 ml; 1 M Lösung in Ether) in 2 ml THF wurde eine Lösung von 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalenon (Verbindung T), 135,0 mg, 0,52 mmol) in 5 ml THF zugesetzt. Die Lösung wurde 16 Stunden lang unter Rückflusskühlung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Ether (50 ml) verdünnt. Die Lösung wurde mit Wasser (5 ml), gesättigter wässriger NH4Cl (5 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Säulenchromatographie (5 EtOAc/Hexane) lieferte die Titelverbindung als einen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.37 (2H, d), 7.21 (1H, s), 7.13 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz), 3.88–3.99 (2H, m), 3.58-3.75 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.12–2.30 (2H, m), 1.79–1.90 (1H, m), 1.57 (3H, s), 1.48–1.58 (1H, m), 1.38 (3H, s), 1.31 (3H, s).
  • 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-acetylnaphthalen Verbindung V)
  • Ein Gemisch von 1,2,3,4-tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalen (Verbindung in 130,0 mg (0,38 mmol), p-Toluolsulfonsäure-monohydrat (4 mg) und Benzol (5 ml) wurde 16 Stunden lang unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (100 ml) verdünnt und mit 10%iger wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, so dass sich die Titelverbindung als ein Feststoff ergab. 1H NMR (CDCl3): δ 7.83 (1H, dd, J = 1.8,8.0 Hz), 7.66 (1 H, d, J = 1.8 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.22 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.03 (1H, t, J = 6.3 Hz), 2.47 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 6.3 Hz), 1.36 (6H, s).
  • (E)-3-,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)-2-butennitril (Verbindung W)
  • Einer Aufschlämmung von NaH (48,0 mg, 2,00 mmol) in THF (6 ml) wurde Diethylcyanomethylphosphonat (450,0 mg, 2,50 mmol) zugesetzt. Nach 40 Minuten wurde eine Lösung von 3,4-dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-acetylnaphthalen (Verbindung V), 95,0 mg (0,33 mmol) in THF (4 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 16 Stunden gerührt, mit Ether verdünnt (100 ml) und mit Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor es über MgSO4 getrocknet wurde. Ein Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Säulenchromatographie (3% EtOAc/Hexane) lieferte die Titelverbindung als einen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.39 (1H, d, J = 1H), 7.32 (1H, dd, J = 2.0, 8.1 Hz), 7.20–7.25 (4H, brs), 7.15 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.03 (1H, t, J = 6.0 Hz), 5.44 (1H, s), 2.42 (3H, s), 2.36 (2H, d, J = 6.0 Hz), 2.35 (3H, s), 1.35 (6H, s).
  • (E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalen)-2-butenal (Verbindung
  • Einer kalten Lösung (–78°C) von (E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)-2-butennitril (Verbindung W), 84,0 mg, 0,29 mmol) in Dichlormethan (4 ml) wurden 0,50 ml (0,050 mmol) Diisobutylaluminiumhydrid (1 M Lösung in Dichlormethan) zugesetzt. Nach Rühren für 1 Stunde wurde die Reaktion bei –78°C durch Zusatz von 2-Propanol (1 ml) verdünnt mit Ether (100 ml) abgeschreckt. Nach Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit Wasser, 10% HCl und gesättiger wässriger NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, so dass sich die Titelverbindung als ein Öl ergab. 1H NMR (CDCl3): δ 10.12 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.43 (2H, s), 7.19–7.28 (5H, m), 6.27 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.03 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.47 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.37 (6H, s).
  • Ethyl (E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)-2,4,6-octatrienoat (Verbindung 51)
  • Einer kalten (–78°C) Lösung von Diethyl-(E)-3-ethoxycarbonyl-2-methylallylphosphonat (hergestellt gemäß J. Org. Chem. 39: 821 (1974)), 264,0 mg, 11,0 mmol in THF (2 ml)) wurden 26,0 mg (0,41 mmol, 0,65 ml) n-Butyllithium in Hexanen (1,6 M Lösung) unmittelbar gefolgt vom Zusatz von (E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)-2-butenal (Verbindung X), 82,0 mg, 0,26 mmol) in THF (3 ml) zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (60 ml) verdünnt, mit Wasser (5 ml), gesättigter wässriger NaCl (5 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck wurde die Titelverbindung durch Säulenchromatographie als ein Öl isoliert (5% EtOAc/Hexane, gefolgt von HPLC unter Verwendung von 1% EtOAc/Hexanen). 1H NMR (aceton-d6): δ 7.36–7.43 (2H, m), 7.18-7.27 (4H, m), 7.17 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.08 (1 H, dd, J = 11.2, 15.2 Hz), 6.46 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.38 (1H, d, J = 15.2 Hz), 5.98 (1H, t, J = 4.7 Hz), 5.78 (1H, s), 4.10 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (3H, s), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.12 (3H, s), 1.31 (6H, s), 1.22 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • (E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl-2-naphthalenyl)-2,4,6-octatriensäure (Verbindung 52)
  • Einer Lösung von Ethyl (E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)-2,4,6-octatrienoat (Verbindung 51), 85,0 mg, 0,20 mmol) in THF (1 ml) und Methanol (1 ml) wurde 12,0 mg (0,50 mmol) LiOH (0,5 ml, 1 M Lösung) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 6 Stunden gerührt, mit Ether (60 ml) verdünnt, mit 10% HCl (1 ml) angesäuert. Die Lösung wurde mit Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor sie über MgSO4 getrocknet wurde. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen Feststoff, der durch Umkristallisation aus Aceton gereinigt wurde. 1H NMR (aceton-d6): δ 7.35–7.45 (2H, m), 7.19–7.28 (4H, m), 7.17 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 11.5, 15.1 Hz), 6.48 (1H, d, J = 11.5 Hz), 6.42 (1H, d, J = 15.1 Hz), 5.99 (1H, t, J = 4.7 Hz), 5.82 (1H, s), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 2.32 (3H, s), 2.13 (3H, s), 1.32 (6H, s).
  • 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naphthalenon (Verbindung Y)
  • Zu 1,7 ml (3,0 g, 30,6 mmol, 18 M) H2SO4 bei –5°C (Eis-NaCl-Bad) wurden langsam 783,0 mg (4,49 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalenon zugesetzt. Eine Lösung von 426,7 mg (6,88 mmol, 0,43 ml, 16 M) HNO3 und 1,31 g (0,013 mol, 0,74 ml, 18 M) H2SO4 wurde langsam zugesetzt. Nach 20 Minuten wurde Eis zugesetzt und das sich ergebende Gemisch mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter reduziertem Druck konzentriert, so dass sich ein Rückstand ergab, aus dem die Titelverbindung, ein blassgelber Feststoff, durch Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) isoliert wurde. 1H NMR (CDCl3): δ 8.83 (1H, d, J = 2.6 Hz), 8.31 (1H, dd, 7 = 2.8, 8.9 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.7 Hz), 2.81 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.08 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.45 (6H, s).
  • 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-amino-1(2H)-naphthalenon (Verbindung Z)
  • Eine Lösung von 230,0 mg (1,05 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naphthalenon (Verbindung Y) in 5,0 ml EtOAc wurde bei Raumtemperatur mit einer katalytischen Menge 10% Pd-C unter 1 atm H2 für 24 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch ein Celite-Kissen entfernt und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert, so dass sich die Titelverbindung als ein dunkelgrünes Öl ergab. 1H NMR (CDCl3): δ 7.3 0 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.22 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 2.7, 8.5 Hz), 2.70 (2H, t, J = 6.6 Hz), 1.97 (2H, t, J = 6.6 HZ), 1.34 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6,7,8-tetrahdro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)azol-benzoat (Verbindung AA)
  • Einer Lösung von 198,7 ml (1,05 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-amino-1(2H)-naphthalenon (Verbindung Z) in 5,0 ml Eisessig wurden 180,0 mg (1,00 mmol) Ethyl-4-nitrosobenzoat zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und darauf unter reduziertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde aus dem restlichen Öl als roter Feststoff durch Säulenchromatographie (15% EtOAc-Hexane) isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.57 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.19 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.07 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.94 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.5 8 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.41 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.79 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.07 (2H, t, J = 7.02 Hz), 1.44 (6H, s), 1.42 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • Ethyl 4-[(5 6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethyl-sulfon)oxy-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung BB)
  • Einer Lösung von 90,4 mg Natriumbis(trimethylsilyl)amid (0,48 mmol, 0,48 ml einer 1,0 M THF-Lösung) in 2,0 ml THF bei –78°C wurden 153,0 mg (0,437 mmol) Ethyl 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung AA) in 2,0 ml THF zugesetzt. Die dunkelrote Lösung wurde bei –78°C für 30 Minuten gerührt und darauf wurden 204,0 mg (0,520 mmol) 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin als eine Lösung in 2,0 ml THF zugesetzt. Das Reaktionsgemisch ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und nach 3 Stunden wurde es durch Zusatz von H2O abgeschreckt. Die organische Schicht wurde unter reduziertem Druck zu einem roten Öl konzentriert. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographe (25% EtOAc/Hexane) als rotes Öl isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.21 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.94 (2H, m), 7.49 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.08 (1H, t, J = 2.5 Hz), 4.42 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.49 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.44 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.38 (6H, s).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung 46a)
  • Einer Lösung von 4-Lithiotoluol wurde durch Zusatz von 62,9 mg (0,58 ml, 0,98 mmol) t-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 84,0 mg (0,491 mmol) 4-Bromtoluol in 1,0 ml THF hergestellt. Nach Rühren für 30 Minuten wurde eine Lösung von 107,0 mg (0,785 mmol) Zinkchlorid in 2,0 ml THF zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, für 30 Minuten gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung von 94,7 mg (0,196 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung BB) und 25 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) in 2,0 ml THF, zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde für 1,5 Stunden bei 50°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigter wässriger NH4Cl verdünnt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet, im Vakuum konzentriert und die Titelverbindung wurde als roter Feststoff durch Säulenchromatographie (25% EtOAc-Hexane) isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.21 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.96 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7. 94 (2H, m), 7.49 (1 H, d, J 8.2 Hz), 6.08 (1H, t, J = 2.5 Hz), 4.42 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.49 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.44 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.38 (6H, s).
  • 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)azo]-benzoesäure (Verbindung 46b)
  • Einer Lösung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung 46a), 16,5 mg, 0,042 mmol, in THF (2 ml) und Ethanol (1 ml) wurde 80,0 mg (2,00 mmol) NaOH (2,0 ml, 1 M wässrige Lösung) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit 10% HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen und darauf über MgSO4 getrocknet. Ein Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und ein Umkristallisieren des Rückstands aus EtOAc/Hexan lieferte die Titelverbindung als roten Feststoff. 1H NMR (aceton-d6): δ 8.19 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.92 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.88 (2H, dd, J = 2.1, 6.1 Hz), 7.66 (1H, s), 7.64 (2H, d, J = 2.3 Hz), 7.28 (4H, d, J = 3.0 Hz), 6.09 (1H, t, J = 2.5 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.39 (3H, s), 1.40 (6H, s).
  • 6-(2-Trimethsilyl)ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung CC)
  • Einer Lösung von 815,0 mg (3,41 mmol) 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (s. Smith et al., Org. Prep. Proced. Int. 1978, 10 123–131) in 100 ml entgastem Et3N gespült mit Argon für 20 Minuten) wurden 259,6 mg (1,363 mmol) Kupfer(I)iodid, 956,9 mg (1,363 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid und 3,14 g (34,08 mmol) (Trimethylsilyl)acetylen zugesetzt. Das Gemisch wurde für 42 Stunden auf 70 °C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und durch ein Silicagel-Kissen filtriert und mit Ether gewaschen. Das Filtrat wurde mit Wasser, 1 M HCl, Wasser und zuletzt mit gesättigter wässriger NaCl gewaschen, bevor es über MgSO4 getrocknet wurde. Eine Konzentration der Lösung unter reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (Silicagel; 10% Et2O-Hexane) lieferte die Titelverbindung als braunes Öl. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.79 (1H, d, J = 1.4 Hz), 7.69 (1H, dd, J = 1.6, 8.3 Hz), 7.42 (1H, d, J = 8.5 Hz), 2.60 (2H, s), 1.41 (6H, s), 0.26 (9H, s).
  • 6-Ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung DD)
  • Einer Lösung von 875,0 mg (3,41 mmol) 6-(2-trimethylsilyl)ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung CC) in 28 ml MeOH wurden 197,3 mg (1,43 mmol) K2CO3 in einer Portion zugesetzt. Nach Rühren für 6 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch durch ein Celite-Kissen filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Das restliche Öl wurde auf einer Silicagel-Säule angeordnet und mit 5% EtOAc-Hexanen eluiert, so dass sich das Titelprodukt als ein farbloses Öl ergab. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.82 (1H, s), 7.72 (1H, dd, J = 1.6, 7.8 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.4 Hz), 3.11 (1H, s), 2.61 (2H, s), 1.43 (6H, s).
  • Ethyl 4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-7-oxo-2-indenyl)ethin]benzoat (Verbindung EE)
  • Eine Lösung von 280,0 mg (1,520 mmol) 6-ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung DD) und 419,6 mg (1,520 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 5 ml Et3N wurde mit Argon für 40 Minuten gespült. Dieser Lösung wurden 271,0 mg (1,033 mmol) Triphenylphosphin, 53,5 mg (0,281 mmol) Kupfer(I)iodid und 53,5 mg (0,076 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid zugesetzt. Das sich ergebende Gemisch wurde unter Rückflusskühlung für 2,5 Stunden erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Et2O verdünnt. Nach Filtration durch ein Celite-Kissen wurde das Filtrat mit H2O, 1 M HCl, H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen und darauf über MgSO4 getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde als blassgelber Feststoff durch Säulenchromatographie (15% EtOAc-Hexane) isoliert. 1H NMR (300 MHz, d6-aceton): δ 8.05 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.87 (1H, dd, J = 1.4, 8.1 Hz), 7.75 (2H, m), 7.70 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.60 (2H, s), 1.45 (6H, s), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • Ethyl 4-[2-(1,1-dimethyl-3-(trifluormethyl-sulfonyl)oxy-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung FF)
  • Eine Lösung von 88,0 mg (0,48 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 0,5 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 145,0 mg (0,43 G mmol) Ethyl 4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-7-oxo-2-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung EE) wurden als eine Lösung in 1,0 ml THF zugesetzt. Nach 30 Minuten wurden 181,7 mg (0,480 mmol) 2-(N,Nbis(trifluormethansulfonyl)amino)-5-chlorpyridin als eine Lösung in 1,0 ml THF zugesetzt. Die Reaktion ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und sie wurde nach 5 Stunden durch den Zusatz gesättigter wässriger NH4Cl gelöscht. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5% wässriger NaOH, H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen und darauf getrocknet (MgSO4) und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie (10% Et2O-Hexane) isoliert. 1H NMR (300 MHz, d6-aceton): δ 8.05 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.69 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.63 (2H, s), 7.55 (1H, s), 4.36 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s), 1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz).
  • 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylhenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 60)
  • Eine Lösung von 142,6 mg (0,339 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) und 35,6 mg (0,848 mmol) LiOH-H2O in 12 ml THF/Wasser (4 : 1, V/V) wurde über Nacht beim Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hexanen extrahiert und die Hexan-Fraktion mit 5 % wässriger NaOH extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden vereinigt und mit 1 M HCl angesäuert und darauf mit EtOAc und Et2O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert, so dass sich die Titelverbindung als ein farbloser Feststoff ergab. 1H NMR (d6 -DMSO): δ 7.91 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.47 (2H, s), 7.23 (4H, q, J = 8.1 Hz), 7.01 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.30 (6H, s).
  • 4-[(5 6-dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 60a)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie zur Herstellung von 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a), wurden 27,0 mg (0,07 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1 a) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 5,9 mg (0,14 mmol) LiOH in H2O, umgewandelt. PMR (d6-DMSO): δ 1.31 (6H, s), 2.35 (2H, d, J = 4.5 Hz), 6.05 (1H, t, J = J = J = 4.5 Hz), 7.00 (1H, s), 7.33 (2H, d, J = 6.2 Hz), 7.44 (4H, m), 7.59 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.90 (2H, d, J = 8.1 Hz).
  • 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl) benzoesäure (Verbindung 61)
  • Eine Lösung von 80,0 mg (0,173 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 6) und 18,1 mg (0,432 mmol) LiOH-H2O in 6 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hexanen extrahiert und die verbleibende wässrige Schicht mit 1 M HCl angesäuert und darauf mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert, so dass sich die Titelverbindung als ein farbloser Feststoff ergab. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7.82 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.44 (6H, m), 7.25 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.02 (1H, s), 6.01 (1H, t, J = 4.6 Hz), 2.32 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.32 (9H, s), 1.29 (6H, s).
  • Ethyl 2-fluoro-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl) thiocarbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 62)
  • Eine Lösung vom 54,4 mg (0,119 mmol) von Ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 40) und 57,7 mg (0,143 mmol) [2,4-bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid] (Lawessons Reagenz) in 12,0 ml Benzol wurde über Nacht unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (10–25% EtOAc/Hexane) als gelber Feststoff isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 9.08 (1H, s), 7.92 (1H, br s), 7.90 (1H, t, J = 8.2 Hz), 7.66 (1 H, dd, J = 2.0, 6.0 Hz), 7.38 (3H, m), 7.18 (4H, m), 6.01 (1H, t, J = 4.7 Hz), 4.35 (2H, q, J = 7.1 Hz), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.33 (6H, s).
  • 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)thiocarbonyl] amino]-benzoesäure (Verbindung 63)
  • Einer Lösung von 46,5 mg (0,098 mmol) Ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)thiocarbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 62) in 1,0 ml EtOH und 1,0 ml THF wurde 55 mg NaOH (1,4 mmol) und 1,0 ml H2O zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde EtOAc zugesetzt und die Reaktion durch Zusatz von 10% HCl abgeschreckt. Einer Extraktion mit EtOAc folgte eine Waschung der kombinierten organischen Schichten mit H2O, gesättigter wässriger NaCl und ein Trocknen über MgSO4. Eine Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab einen Feststoff, der nach Kristallisation aus CH3CN die Titelverbindung als einen blassgelben Feststoff lieferte. 1H NMR (d6-aceton) : δ 11.05 (1H, s), 8.02 (1H, m), 7.99 (1H, t, J = 8.3 Hz), 7.75 (1H, m), 7.69 (1H, dd, J = 2.0, 6.1 Hz), 7.52 (1H, s), 7.46 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.21 (4H, m), 6.04 (1H, t, J = 4.8 Hz), 2.37 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.33 (3H, s), 1.36 (6H, s).
  • Ethy15',6'-dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalen]-6-carboxylat (Verbindung 64)
  • Einer Lösung von 3,4-dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromonaphthalen (Verbindung D), 0,45 g, 1,40 mmol, und THF (2,1 ml) wurden Magnesium-Späne (0,044 g, 1,82 mmol) bei Raumtemperatur unter Argon zugesetzt. 2 Tropfen Ethylendibromid wurden zugesetzt, und die Lösung, die langsam trübe und gelb wurde, wurde unter Rückflusskühlung für 1,5 Stunden erhitzt. In einem zweiten Kolben wurde Zinkchlorid (0,210 g, 1,54 mmol) zugesetzt, der unter Hochvakuum geschmolzen, auf Raumtemperatur abkühlt und in THF (3 ml) gelöst wurde. Das Grignard-Reagenz wurde dem zweiten Kolben zugesetzt und nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde eine Lösung Ethyl-6-Brom-2-naphthalencarboxylat (Verbindung N), 0,293 g, (1,05 mmol) und THF (2 ml) zugesetzt. In einem dritten Kolben wurde eine Lösung aus Ni(PPh3)4 und THF wie folgt zubereitet: Eine Lösung aus NiCl2(PPh3)2 (0,82 g, 1,25 mmol) und PPh3 (0,66 g, 2,5 mmol) in THF (3,5 ml) wurde 1 M Lösung Diisobutylaluminiumhydrid und Hexane (2,5 ml, 2,5 mmol) zugesetzt und die sich ergebende Lösung mit THF auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt. Drei 0,60 ml Teilmengen der Ni(PPh3)4-Lösung wurde in 15-Minuten-Intervallen dem zweiten Kolben zugesetzt. Die sich ergebende Suspension wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 5 ml 1 N wässriger HCl gelöscht und für 1 Stunde gerührt, bevor die Produkte mit Ethylacetat extrahiert wurden. Die organischen Schichten wurden kombiniert, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde aus Hexanen kristallisiert, um 130 mg reines Material zu ergeben. Die Stammlösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand durch Silicagel-Chromatographie (95 : 5-Hexane : Ethylacetat) gereinigt, um zusätzliche 170 mg der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben (Gesamtausbeute = 300 mg, 64%). 1H NMR (CDCl3) δ 8.57 (s, 1H), 8.05 (dd, 1H, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.84–7.95 (überlappende d's, 3H), 7.66 (dd, 1H, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.58 (dd, 1H, J = 2.0, 8.0 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.04 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 4.44 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 2.40 (s, 3H), 2.39 (d, 2H, J = 4.8 Hz), 1.45 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 1.39 (s, 6H).
  • 5',6'-Dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalen]-6-carbonsäure (Verbindung 65)
  • Eine Lösung von Ethyl 5',6'-dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalen]-6-carboxylat (Verbindung 64) (0,19 g, 0,43 mmol), EtOH (8 ml) und 1 N wässrigem NaOH (2 ml) wurde für 3 Stunden auf 60 °C erhitzt. Die Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt und mit 1 N wässriger HCl angesäuert. Das Produkt wurde in Ethylacetat extrahiert und die organischen Schichten kombiniert, mit Wasser, Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde aus THF/Ethylacetat bei 0 °C umkristallisiert, um 35 mg reines Material zu ergeben. Die Stammlösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand durch Silicagel-Chromatographie (100 Ethylacetat) gereinigt, um zusätzliche 125 mg der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben (Gesamtausbeute = 160 ml, 90%). 1H NMR (DMSO-d6) δ 8.57 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.96–7.82 (überlappende d's, 3H), 7.65 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.50 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.28 (s, 1H), 7.26 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.01 (t, 1H, J = 4.5 Hz), 3.34 (br s, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.31 (d, 2H, J = 4.5 Hz), 1.31 (s, 6H).
  • Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 66
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid, 24,1 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) und 2-Lithiofuran (hergestellt durch Zusatz von 53,4 mg (0,52 ml, 0,78 mmol) n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexan) zu einer kalten Lösung (–78°C) von 53,4 mg (0,784 mmol) Furan in 1,0 ml THF) umgewandelt. PMR (CDCl3): δ 1.32 (6H, s), 1.41 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.35 (2H, d, J = 5.0 Hz), 4.39 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.41 (1H, t, J = 5.0 Hz), 6.50 (2H, s), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.45 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.49 (1H, s), 7.5 7 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.63 (1H, d, J = 1.7 Hz), 8.02 (2H, d, J = 8.2 Hz).
  • 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 67)
  • Unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a) wurde Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 66) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 16,0 mg (0,38 mmol) LiOH in H2O umgewandelt. PMR (d6-DMSO): δ 1.26 (6H, s), 2.33 (2H, d, J = 4.9 Hz), 6.41 (1H, t, J = 4.9 Hz), 6.60 (2H, m), 7.45–7.53 (3H, m), 7.64 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.75 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.93 (2H, d, J = 8.3 Hz).
  • 3 4-dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100C) and 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100D)
  • Einem kalten (0°C) Gemisch von Aluminiumchlorid (26,3 g, 199,0 mmol) in Dichlormethan (55 ml) wurde Acetylchlorid (15 g, 192 mmol) und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalen (24,4 g, 152 mmol) in Dichlormethan (20 ml) über 20 Minuten zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur aufgewärmt und für 4 Stunden gerührt. Eis (200 g) wurde dem Reaktionskolben zugesetzt und das Gemisch mit Ether (400 ml) verdünnt. Die wässrigen und organischen Schichten wurden getrennt und die organische Phase wurde mit 10% HCl (50 ml), Wasser (50 ml), 10% wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter wässriger NaCl (50 ml) gewaschen und dann über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt, um ein gelbes Öl zu ergeben, das in Benzol gelöst wurde (50 ml).
  • Einer kalten (0°C) Lösung von Essigsäure (240 ml) und Acetanhydrid (120 ml) wurde Chromtrioxid (50 g, 503 mmol) in kleinen Portionen über 20 Minuten unter Argon zugesetzt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 0°C gerührt und mit Benzol (120 ml) verdünnt. Die Benzol-Lösung, die oben hergestellt wurde, wurde unter Rühren über einen Zusatztrichter über 20 Minuten hinweg zugesetzt. Nach 8 Stunden wurde die Reaktion durch vorsichtigen Zusatz von Isopropanol (50 ml) bei 0°C, gefolgt von Wasser (100 ml) abgeschreckt. Nach 15 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (1100. ml) und Wasser (200 ml) verdünnt und darauf mit festem Natriumhydrogencarbonat (200 g) neutralisiert. Die Ether-Schicht wurde mit Wasser (100 ml) und gesättigter wässriger NaCl (2 × 100 ml) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck lieferte ein Gemisch der isomeren Diketone, die durch Chromatographie getrennt wurden (5% EtOAc/Hexane). (Verbindung 1000): 1H NMR (CDCl3): δ 8.55 (1H, d, J = 2.0 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 2.0, 8.3 Hz), 7.53 (1H, d, J = 8.3 Hz), 2.77 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.62 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 6.6 Hz), 1.41 (6H, s). (Verbindung 100D): 1H NMR (CDCl3): δ 8.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.02 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.82 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz), 2.77 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.44 (6H, s).
  • 3 4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100E)
  • Eine Lösung von 1,80 g (8,34 mmol) eines 1 : 5-Gemisches von 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 1000) und 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100D) in 500 ml Benzol wurde mit 517,7 mg (8,34 mmol) Ethylenglykol und 20 mg (0,11 mmol) p-Toluolsulfonsäure-monohydrat vereinigt. Die sich ergebende Lösung wurde unter Rückflusskühlung für 18 erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) als ein farbloses Öl isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 8.01 (1H, d, J = S.2 Hz), 7.51 (1H, s), 7.43 (1H, dd, J = 1.7, 6.4 Hz), 4.07 (2H, m), 3.79 (2H, m), 2.74 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.04 (2H, t, J = 7.1 Hz), 1.67 (3H, s), 1.46 (6H, s).
  • 1,2,3,4-tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalen (Verbindung 100F)
  • Einer Lösung von 496,2 mg (2,54 mmol) p-Tolylmagnesiumbromid in 20 ml THF (2,54 ml; 1 M Lösung in Ether) wurde eine Lösung von 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolan-yl))-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100E, 200,0 mg, 0,769 mmol) in THF (5 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde 16 Stunden lang unter Rückflusskühlung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Wasser, gesättigter wässriger NH4Cl gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Eine Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff. 1H NMR (CDCl3): δ 7.49 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.19 (2H, m), 7.10 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.05 (2H, m), 3.80 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.21 (1H, m), 2.10 (1H, m), 1.88 (1H, m), 1.65 (3H, s), 1.54 (1H, m), 1.39 (3H, s), 1.33 (3H, s).
  • 3,4-dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-acetphthalen (Verbindung 100G)
  • Eine Lösung von 1,2,3,4-tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalen (Verbindung 100F, 160,0 mg, 0,52 mmol), p-Toluol-sulfonsäure-monohydrat (4 mg) und 30 ml Benzol wurden für 12 Stunden unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (100 ml) verdünnt und mit 10% wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Wasser und gesättigter wässriger NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, so dass sich die Titelverbindung ergab, die durch Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) als gelbes Öl isoliert wurde. 1H NMR (CDCl3): δ 7.97 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 1.7, 6.4 Hz), 7.22 (4H, s), 7.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.10 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.59 (3H, s), 2.40 (3H, s), 2.38 (2H, d, J = 4.7 Hz), 1.38 (6H, s).
  • 4-[3-oxo-3-(7,8-dihydro-5-(4-methylphenyl)-8,8-dimethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoesäure (Verbindung 101)
  • Einer Lösung von 78,7 mg (0,272 mmol) von 3,4-dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalen (Verbindung 100G) in 4,0 ml MeOH wurden 53,1 mg (0,354 mmol) 4-Carboxybenzaldehyd und 80 mg (2,0 mmol; 2;0 ml 1 M wässrige NaOH) zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, unter reduziertem Druck konzentriert und das restliche Öl in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit 10% HCl behandelt und die organische Schicht wurde mit H2O und gesättigter wässriger NaCl gewaschen, darauf über Na2SO4 getrocknet. Das Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck lieferte die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff, der durch Umkristallisierung aus CH3CN aufgereinigt wurde. 1H NMR (aceton-d6): δ 8.00 (7H, m), 7. 83 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.24 (4H, s), 7.13 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.12 (1H, t, J = 4.5 Hz), 2.42 (2H, d, J = 4.8 Hz), 2.38 (3H, s), 1.41 (6H, s).
  • 3 4-dihydro-1-phenyl-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalen (Verbindung 100H)
  • Einer Lösung aus 508,0 mg (1,95 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100E) in 10 ml THF wurden 495,2 mg (2,54 mmol; 2,54 ml einer 1 M Lösung Et2O) Phenylmagnesiumbromid zugesetzt. Die sich ergebende Lösung wurde unter Rückflusskühlung 8 Stunden lang erhitzt, Wasser wurde zugesetzt und das Erhitzen für 30 Minuten fortgesetzt. Das THF wurde unter reduziertem Druck entfernt und der wässrige Rückstand wurde mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), unter reduziertem Druck konzentriert und die Titelverbindung aus dem Rückstand durch Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) als ein farbloses Öl isoliert. 1H NMR (CDCl3): δ 7.97 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 2.1, 8.0 Hz), 7.34 (5H, m), 7.10 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.12 (1H, d, J = 4.6 Hz), 2.59 (3H, s), 2.39 (2H, d, J = 4.8 Hz), 1.38 (6H, s).
  • 4-[3-oxo-3-(7,8-dihydro-5-phenyl-8,8-dimethyl-2-naphthalen)-1-propenyl]-benzoesäure (Verbindung 103)
  • Einer Lösung von 115,0 mg (0,42 mmol) 3,4-dihydro-1-phenyl-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalen (Verbindung 100H) und 65,0 mg (0,43 mmol) 4-Formyl-benzolsäure in 5,0 ml EtOH und 1,0 ml THF wurde 120,0 mg (3,0 mmol; 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) NaOH zugesetzt. Die sich ergebende gelbe Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit 6%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), unter reduziertem Druck konzentriert und die Titelverbindungen wurden durch Säulenchromatographie (50% EtOAc-Hexane) als blassgelber Feststoff isoliert). 1H NMR (CDCl3): δ 8.13 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.04 (1H, s), 7.81 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.75 (3H, m), 7.60 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.3 5 (5H, m), 7.14 (1 H, d, J = 8.1 Hz), 6.15 (1H, t, J = 4.2 Hz), 2.41 (2H, d, J = 4.2 Hz), 1.41 (6H, s).
  • Verfahren zum Verstärken von Kernrezeptor-Agonisten
  • Überblick und Einführung
  • Wir haben herausgefunden, dass eine Untergruppe von Retinoid-Antagonisten, die eine negative Hormonaktivität zeigt, zur Potenzierung bzw. Wirksammachung bzw. Verstärkung der biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Hormone der Steroidrezeptorsuperfamilie verwendet werden kann. Diese anderen Retinoide und Hormone der Steroidrezeptorsuperfamilie können entweder endogene Hormone oder pharmazeutische Mittel bzw. Wirkstoffe sein. Somit können beispielsweise bestimmte Aktivitäten bzw.
  • Wirksamkeiten pharmazeutischer Retinoid-Agonisten bei der Hervorrufung spezieller biologischer Wirkungen wirksamer gemacht werden, wenn sie in Kombination mit einem Retinoid-negativen Hormon verwendet werden. Dieser Kombinationsansatz zur Arzneistoff-Verabreichung kann in vorteilhafter Weise unerwünschte Nebenwirkungen der pharmazeutischen Retinoide minimieren, weil niedrigere Dosierungen der pharmazeutischen Retinoide mit einer verbesserten Wirksamkeit angewendet werden können.
  • Wir haben insbesondere herausgefunden, dass AGN 193109, ein synthetisches Retinoid mit der in 1 dargestellten Struktur, einzigartige und unerwartete pharmakologische Aktivitäten zeigt. AGN 193109 zeigt eine hohe Affinität für die RAR-Subklasse von Kernrezeptoren, ohne diese Rezeptoren zu aktivieren oder die Transkription von Retinoidresponsiven Genen zu stimulieren. Stattdessen hemmt AGN 193109 die Aktivierung von RAR durch Retinoid-Agonisten und verhält sich deswegen als ein Retinoid-Antagonist.
  • Wir haben zusätzlich herausgefunden, dass Retinoid-negative Hormone ohne gleichzeitige Verabreichung eines Retinoid-Agonisten oder Steroidhormons zur Kontrolle bestimmter Krankheitssymptome verwendet werden kann. Insbesondere können die hierin offenbarten Retinoid-negativen Hormone die Basistranskription der Gene auf hohem Niveau nach unten regulieren, die für nicht-Liganden-gebundene RARs responsiv sind. Wenn sich beispielsweise eine unkontrollierte Zellproliferation aus der Aktivität von Genen ergibt, die für nicht ligandierten RARs responsiv sind, dann kann diese Genaktivität durch die Verabreichung eines Retinoid-negativen Hormons reduziert werden, das RARs inaktiviert. Folglicherweise kann die Zellproliferation, die von der Aktivität von nicht ligandierten RARs abhängig ist, durch das negative Hormon gehemmt werden. Eine Hemmung von nicht ligandierten RARs konnte unter Verwendung herkömmlicher Antagonisten nicht erreicht werden.
  • Wir haben bedeutenderweise herausgefunden, dass AGN 193109 sowohl die RAR-Basalaktivität unterdrücken als auch die Aktivitäten weiterer Retinoid-Agonisten und Hormon-Agonisten der Steroidrezeptorsuperfamilie verstärken kann. Im Kontext der Erfindung wird ein Hormon-Agonist durch ein negatives Hormon wie beispielsweise AGN 193109 verstärkt, wenn, in Gegenwart des negativen Hormons, eine reduzierte Konzentration des Agonisten die im Wesentlichen gleiche quantitative Reaktion wie diejenige zeigt, die mit dem Agonisten alleine erzielbar ist. Die quantitative Reaktion kann beispielsweise in einem Reportergen-Assay in vitro gemessen werden. Somit wird ein therapeutisches Retinoid, das eine erwünschte Reaktion hervorruft, wenn es in einer speziellen Dosierung oder Konzentration verwendet wird, durch AGN 193109 potenziert, wenn, in Kombination mit AGN 193109, eine niedrigere Dosierung oder Konzentration des therapeutischen Retinoids zur Erzeugung des im Wesentlichen selben Effektes als eine höhere Dosis oder Konzentration des therapeutischen Retinoids verwendet werden kann, wenn das therapeutische Retinoid alleine verwendet wird. Die Liste der Agonisten, die durch gleichzeitige Verabreichung mit AGN 193109 potenziert werden können, schließt RAR-Agonisten, Vitamin-D-Rezeptoragonisten, Glucocorticoid-Rezeptoragonisten und Thyroidhonmon-Rezeptoragonisten ein. Insbesondere können spezielle Agonisten, die durch gleichzeitige Verabreichung potenziert werden können, Folgendes einschließen: ATRA, 13-cis Retinsäure, den synthetischen RAR-Agonisten AGN 191183, 1,25-Dihydroxyvitamin D3, Dexamethason und Schilddrüsenhormon (3,3',5-Trüodthyronin). Ebenfalls hierin offenbart ist ein Verfahren, das zur Identifizierung weiterer Hormone verwendet werden kann, die durch gleichzeitige Verabreichung mit AGN 193109 potenziert werden können.
  • Somit verhält sich AGN 193109 in einer Weise, die für einen einfachen Retinoid-Antagonisten nicht vorweggenommen ist, sondern als ein negatives Hormon, das die Aktivitäten verschiedener Mitglieder der Familie der Kernrezeptoren bzw. nukleären Rezeptoren potenzieren kann. Wir offenbaren ebenfalls einen einfachen Mechanismus, der sowohl für die negative Hormonaktivität als auch die Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivitäten anderer Kernrezeptorliganden zu potenzieren, verantwortlich sein kann. Dieser Mechanismus beinhaltet Elemente, von denen bekannt ist, dass sie an Retinoid-abhängigen Signalgebungswegen teilnehmen und schließt zusätzlich einen neuen negativen regulatorischen Bestandteil ein.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass RARs, die Hochaffinitätsziele einer AGN-193109-Bindung sind, Transkriptionsfaktoren sind, die die Expression einer Vielzahl von Retinoid-responsiven Genen regulieren. Cis-regulatorische DNA-Bindungsstellen für die RARs wurden nahe bei jenen identifiziert, die transkriptionell in einer Retinoid-abhängigen Weise reguliert werden. Eine RAR-Bindung an solche DNA-Stellen, die als Retinsäurereaktions-Elemente bekannt sind (retinoic acid response elements = RAREs) wurden wohl definiert. Bedeutenderweise binden die RAREs Heterodimere, die aus einem RAR und einem RXR bestehen. Der RXR-Bestandteil des Heterodimers dient dazu, eine Hochaffinitätswechselwirkung zwischen dem RAR/RXR-Heterodimer und dem RARE zu fördern (Mangelsdorf et al., The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2. Ausgabe, Hsg. Sporn et al., Raven Press Ltd., New York 1994).
  • Wie nachstehend ausführlich dargelegt wird, sind unserer Erkenntnisse bezüglich der negativen Hormonaktivität von AGN 193109 mit einem Mechanismus konsistent, der die Wechselwirkung eines vermeintlichen negativen Koaktivatorproteins (negative coactivator protein = NCP) mit dem RAR einschließt. Gemäß des vorgeschlagenen Mechanismus wird diese Interaktion durch AGN 193109 stabilisiert.
  • Unsere Ergebnisse zeigten weiterhin an, dass AGN 193109 die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP zur Interaktion mit anderen Kernrezeptoren als RARs modulieren kann, die von AGN 193109 belegt sind. Es folgt, dass AGN 193109 die transkriptionellen regulatorischen Wege potenzieren kann, die Kernrezeptoren einschließen, die mit den RARs die Fähigkeit teilen, das NCP zu binden. In dieser Hinsicht zeigt AGN 193109 die Fähigkeit, eine Vielzahl von Kernrezeptorwegen zu modulieren, eine Aktivität, die für einen herkömmlichen Retinoid-Antagonisten nicht vorhergesagt werden würde. Demgemäß ist AGN 193109 als ein Mittel zum Potenzieren der Aktivität von Kernrezeptorliganden von Nutzen, einschließlich sowohl endogener Hormone als auch verschriebener Therapeutika. Diese spezielle Ausführungsform veranschaulicht das allgemeinere Prinzip, dass jedes Kernrezeptor-negative Hormon die Aktivität anderer Kernrezeptoren potenzieren wird, die kompetitiv das NCP binden.
  • Obwohl andere Materialien und Verfahren, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, in der Ausübung oder im Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nunmehr beschrieben. Allgemeine Bezugnahmen auf Verfahren, die zur Durchführung der verschiedenen Nukleinsäure-Manipulationen und hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, sind in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hsg., Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience 1987) zu finden. Eine Beschreibung der Experimente und Ergebnisse, die zur Erzeugung der vorliegenden Erfindung führten, folgt.
  • Beispiel 6 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 jedes von drei RARs mit einer hohen Affinität band, jedoch dabei versagte, eine Retinoid-abhängige Genexpression zu aktivieren.
  • Beispiel 6
  • AGN 193109 bindet RARs mit einer hohen Affinität, transaktiviert jedoch die Retinoidabhängige Genexpression nicht
  • Humane RAR-α-, RAR-β- und RAR-γ-Rezeptoren wurden getrennt als rekombinante Proteine unter Verwendung eines Baculovirus Expressionssystems im Wesentlichen gemäß dem von Allegretto et al., in J. Biol. Chem. 268: 28625 (1993) beschriebenen Verfahren exprimiert. Die rekombinanten Rezeptorproteine wurden getrennt zur Bestimmung von AGN 193109 Bindungsaffinitäten unter Verwendung des [3H]-ATRA-Verdrängungsassays verwendet, wie er von Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992) beschrieben wurde. Die Dissoziationskonstanten (Kds) wurden gemäß des von Cheng et al. in Biochemical Pharmacology 22: 3099 (1973) beschriebenen Verfahrens bestimmt.
  • AGN 193109 wurde ebenfalls auf seine Fähigkeit getestet, RARs in CV-1-Zellen zu transaktivieren, die vorübergehend mit RAR-Expressionsvektoren und einem Retinoidresponsiven Reportergenkonstrukt kotransfiziert wurden. Rezeptorexpressionsvektoren pRShRAR-α (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook et al., Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol, Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden getrennt mit dem ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid kotransfiziert. Eine Verwendung dieses Luciferase-Reporterplasmids wurde durch Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992) offenbart. Das ΔMTV-TREp-Luc-Plasmid ist im Wesentlichen zum ΔMTV-TREp-CAT-Reporterkonstrukt, beschrieben von Umesono et al. in Nature 336: 262 (1988) im Wesentlichen identisch, außer dass das Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Reportergen durch eine Polynukleotidsequenz substituiert wurde, die Glühwürmchen-Luciferase kodiert. Eine Transfektion von grünen Meerkatzen-CV 1-Zellen wurde unter Verwendung des in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung der Calciumphosphat-Kopräzipitation durchgeführt. CV-1-Zellen wurden in einer Dichte von 4 × 104/Well in 12-Well-Multiwellplatten ausplattiert und vorübergehend mit einem Calciumphospat-Präzipitat transfiziert, das 0,7 μg Reporterplasmid und 0,1 μg Rezeptorplasmid enthielt, gemäß Standardlaborverfahren. Die Zellen wurden nach 18 Stunden gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen und erneut mit Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco) gespeist, das 10% Aktivkohle-extrahiertes fötales Rinderserum enthielt (Gemini Bio-Products). Die Zellen wurden mit Träger alleine (Ethanol) oder AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden behandelt. Zelllysate wurden in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA hergestellt. Eine Luciferase-Aktivität wurde wie von de Wet et al. in Mol Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschrieben gemessen, unter Verwendung von Gühwürmchen-Luciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und eines EG&G-Berthold-96-Wellplattenluminometers. Die berichteten Luciferase-Werte repräsentierten den Durchschnitt ± Standardabweichung von dreifachen Bestimmungen.
  • Die in Tabelle 11 präsentierten Ergebnisse zeigten, dass AGN 193109 jeweils RAR-α, RARβ und RAR-γ mit hoher Affinität banden, jedoch die Retinoid-abhängige Genexpression nicht aktivierten. Insbesondere band AGN 193109 jeden der drei Rezeptoren mit Kd-Werten im 2-bis 3-nM-Bereich. Trotz dieser engen Bindung versagte AGN 193109 dabei, die Genexpression zu aktivieren, im Vergleich mit Induktionen, die von ATRA stimuliert wurden. Demgemäß war die halbmaximale effektive Konzentration von AG 193109 (EC50) nicht messbar. Obwohl in der Tabelle nicht dargestellt, haben wir auch herausgefunden, dass AGN 193109 für die RXRs keine messbare Affinität aufwies.
  • Tabelle 11
    Figure 01290001
  • Beispiel 7 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 ein Antagonist einer ATRA-abhängigen Genexpression ist.
  • Beispiel
  • AGN-193109-abhängige Hemmung der RAR-Transaktivierung durch ATRA
  • Die Fähigkeit von AGN 193109, eine ATRA-vermittelte RAR-Aktivierung zu antagonisieren, wurde in CV-1-Zellen untersucht, die durch das Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren vom Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) kotransfiziert wurden. Eukaryotische Expressionsvektoren pRSIiRAR-α (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook et al., Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol, Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden mit dem von Hollenberg et al (Cell 55: 899 (1988)) beschriebenen ΔMTV-Luc-Reporterplasmid kotransfiziert. Bemerkenswerterweise enthielt das Reporterplasmid zwei Kopien des TRE-Palindrom-Reaktionselementes. Calciumphosphat-Transfektionen wurden exakt wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden mit Trägerstoff alleine (Ethanol), ATRA (10–9 bis 10–6 M), AGN 193109 (10–7 bis 10–6 M) oder 10–8 M ATRA in Kombination mit AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden dosiert. Zelllysate und Luciferase-Aktivitätsmessungen wurden ebenfalls wie in Beispiel 6 durchgeführt.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren sind in den 2A bis 2F präsentiert, wobei die Luciferase-Werte den Durchschnitt bzw. Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Bestimmungen repräsentieren. Genauer gesagt, zeigten die in den 2A, 2C und 2E präsentierten Ergebnisse an, dass eine Stimulation von mit ATRA transfizierten Zellen zu Dosis-responsiven Zunahmen der Luciferase-Aktivität führte. Dies bestätigte, dass ATRA jedes der drei RARs im experimentellen System aktivierte und eine Vergleichsbasis zum Nachweis der Aktivität eines Antagonisten bereitstellte. Die grafischen Ergebnisse, die in den 2B, 2D und 2F dargestellt sind, zeigten an, dass eine gleichzeitige Behandlung transfizierter Zellen mit 10 nM ATRA und zunehmenden Konzentrationen von AGN 193109 zu einer Hemmung der Luciferase-Aktivität führte. Insbesondere ergaben gleiche Dosen von AGN 193109 und ATRA mehr als 50% Hemmung bezüglich ATRA alleine für alle. drei RAR-Subtypen. Ein Vergleich der ATRA-Dosisreaktion in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an AGN 193109 zeigte, dass ATRA durch AGN 193109 kompetitiv gehemmt wurde. Es sei erwähnt, dass die horizontalen Achsen aller der in 2 dargestellten grafischen Darstellungen den Log der Retinoid-Konzentration repräsentieren. Diese Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 ein wirksamer RAR-Antagonist war.
  • Wir haben als nächstes Experimente durchgeführt, um den Mechanismus ans Licht zu bringen, der der Antagonistenaktivität von AGN 193109 zu Grunde liegt. Der Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass angenommen wird, das die Kernrezeptoraktivierung eine Konformationsänderung des Rezeptors einschließt, die durch die Ligandenbindung induziert wird. Tatsächlich haben die Ergebnisse der Proteaseschutz-Assays bestätigt, dass Kernhormon-Agonisten und -Antagonisten verursachen, dass Rezeptorproteine unterschiedliche Konformationen annehmen (Keidel et al., Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994); Allan et al., J. Biol. Chem. 267: 19513 (1992)). Wir verwendeten einen solchen Assay, um zu bestimmen, ob AGN 193109 und ATRA verursachten, dass RAR-α unterschiedliche Konformationen annahm. AGN 193583, ein RAR-α-selektiver Antagonist, wurde als positive Kontrolle eingeschlossen, von der bekannt ist, dass sie ein Antagonisten-spezifisches Muster einer Protease-Sensitivität verleiht.
  • Beispiel 8 beschreibt ein Verfahren, dass zum Nachweis von Konformationsänderungen in RAR-α verwendet wurde, die sich aus einer AGN-193109-Bindung ergibt. Wie nachstehend repräsentiert, zeigten die Ergebnisse dieses Verfahrens in unerwarteter Weise an, dass AGN 193109 zu einem Muster einer Trypsin-Sensitivität führte, das im Wesentlichen zu demjenigen, das durch ATRA, einem RAR-Agonisten, induziert wurde, identisch war und anders als das war, das durch einen Modell-RAR-Antagonisten induziert wurde. Diese Erkenntnis legt nahe, dass AGN 193109 Eigenschaften besaß, die von anderen Retinoid-Antagonisten verschieden sind.
  • Beispiel 8
  • Protease Protektionsanalyse
  • Ein Plasmid, das im Vektor pGEM3Z (Pharmacia) konstruiert wurde und das die RAR-α cDNA enthielt (Giguere et al., Nature 330: 624 (1987)) wurde in Verbindung mit dem TNTgekoppelten Reticulocyt-Lysat in vitro Transkriptions-Translationssystem (Promega) verwendet, um [35S]-Methionin-markiertes RAR-α herzustellen. Eine begrenzte proteolytische Verdauung des markierten Proteins RAR-α wurde gemäß des von Keidel et al. in Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Teilmengen eines Reticulocyt-Lysats, das [35S]-Methionin-markiertes RAR-α enthielt, wurde entweder mit ATRA, AGN 193583 oder AGN 193109 auf Eis für 45 Minuten in einem Gesamtvolumen von 9 μl inkubiert. Die Retinoid-Endkonzentration für alle Versuche betrug 100 nM für ATRA und AGN 193109 und 1000 nM für AGN 193583. Der Unterschied zwischen den Endkonzentrationen der Retinoide basierte auf der ungefähr 10-fachen Differenz der relativen Affinitäten von ATRA und AGN 193109 (mit einem Kd an RAR-α von 2 bzw. 10 nM) und AGN 193583 (mit einem Kd an RAR- von ≥ 100 nM).
  • Nach der Ligandenbindung wurden 1 μl in geeigneter Weise konzentriertes Trypsin dem Gemisch zugesetzt, um Endkonzentrationen von 25, 50 oder 100 μg/ml zu ergeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und die Trypsin-Verdauung durch den Zusatz von SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und gemäß Standardverfahren einer Autoradiographie unterworfen.
  • Sowohl der Agonist als auch der Antagonist führte zu unterschiedlichen Mustern einer Trypsin-Sensitivität, die von dem durch Digestion der nicht ligandierten Rezeptoren erzielten Ergebnis verschieden waren. Autoradiographische Ergebnisse zeigten an, dass die Trypsin-Konzentrationen von 25, 50 und 100 μl/ml das radiomarkierte RAR-α in 10 Minuten bei Raumtemperatur bei Fehlen eines zugesetzten Retinoids vollständig verdaute. Eine Vorbindung von ATRA führte zum Auftreten zweier Protease-resistenter Hauptspezies. Eine Vorbindung des RAR-α-selektiven Antagonisten AGN 193583 ließ eine Protease-resistente Spezies entstehen, die ein geringeres Molekulargewicht bzw. relative Molekülmasse aufwies, als diejenige, die sich aus einer ATRA-Vorbindung ergab. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Retinoid-Agonist und -Antagonist zu Konformationsänderungen führte, die mittels veränderter Trypsin-Sensivitäten nachweisbar sind. Überraschenderweise ließ eine Vorbindung von AGN 193109 ein Proteaseschutz-Muster entstehen, das von demjenigen, das durch Vorbindung von ATRA produziert wurde, unterscheidbar war.
  • Die oben präsentierten Ergebnisse bestätigten, dass AGN 193109 RAR-α band und dessen Konformation veränderten. Interessanterweise ähnelte die Natur dieser Konformationsänderung derjenigen sehr stark, die sich aus einer Bindung eines Agonisten (ATRA) ergab als die Veränderung, die sich durch eine Antagonisten (AGN 193583)-Bindung ergab. Klarerweise war der Mechanismus eines AGN-193109-abhängigen Antagonismus einzigartig.
  • Wir erwägten mögliche Mechanismen, die für die Antagonisten-Aktivität von AGN 193109 verantwortlich sein könnten. Insbesondere verwendeten wir einen Standard-Gel-Shift-Assay, um zu testen, ob AGN 193109 die RAR/RXR-Heterodimerbildung störte oder die Interaktion zwischen RAR und seiner verwandten DNA-Bindungsstelle hemmte.
  • Beispiel 9 beschreibt einen gelelektrophoretischen Mobilitäts-Shiftassay, der dazu verwendet wurde, zu demonstrieren, dass AGN 193109 weder die RAR/RXR-Dimerisierung hemmte noch eine Bindung der Dimere an eine Ziel-DNA hemmte.
  • Beispiel 9
  • Gel-Shift-Analyse
  • In vitro translatiertes RAR-α wurde im Wesentlichen wie unter Beispiel 8 beschrieben hergestellt, außer dass 35S-markiertes Methionin vermieden bzw. weggelassen wurde. In vitro translatiertes RXR-α wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Vektors auf pBluescript(II)(SK)-Basis hergestellt, der die RXR-α cDNA enthielt, beschrieben von Mangelsdorf et al. in Nature 345: 224–229 (1990), als eine Matrize zur Erzeugung von Invitro-Transkripten. Das markierte RAR-α und RXR-α, alleine oder in Kombination, oder vorgebunden mit AGN 193109 (10–6 M), entweder alleine oder in Kombination, ließ man mit einer end-markierten DR-5 RARE doppelsträngigen Sonde in Wechselwirkung treten, die die Sequenz 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3' (SEQ ID NO:1) enthielt. Das Bindungsgemisch wurde auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisiert und gemäß Laborstandardverfahren autoradiographiert. Eine einzige verlangsamte bzw. zurückgebliebene Spezies, die auf der Autoradiographie erschien und die allen Bahnen auf dem Gel gemeinsam war, repräsentierte einen undefinierten Sondenbindenden Faktor, der im Reticulocyt-Lysat vorlag. Nur die RAR/RXR-Kombination ließ eine Retinoidrezeptor-spezifische retardierte Spezies entstehen. Weder RAR alleine noch RXR alleine banden die Sonde, um diese verschobene Spezies zu produzieren. Die Gegenwart von AGN 193109 verminderte diese Interaktion nicht.
  • Diese Ergebnisse zeigten an, dass AGN 193109 weder die Homo- oder Hetero-Dimerisierungseigenschaften von RAR-α hemmte. Weiterhin hemmte AGN 193109 die Interaktion von Rezeptordimeren mit einem DNA-Segment, das die verwandte Bindungsstelle enthielt, nicht.
  • Im Hinblick auf die einzigartigen Eigenschaften, die AGN 193109 charakterisierten, führten wir Untersuchungen durch, ob dieser Antagonist zusätzlich die Aktivität von nicht ligandierten RARs hemmen könnte. Das Rezeptor/Reporter-System, das zur Durchführung dieser Bestimmung verwendet wurde, zeigte in vorteilhafter Weise ein hohes Niveau einer konstitutiven Aktivität bei Fehlen von zugesetzten Retionid-Agonisten. Insbesondere verwendeten diese Verfahren den chimären ER-RAR-Rezeptor und das ERE-tk-Luc-Reportersystem. Das ERE-tk-Luc-Plasmid schließt die Region –397 bis –87 der Östrogenresponsiven 5'-flankierenden Region des Xenopus vitellogenin A2-Gens ein, beschreiben von Klein-Hitpass, et al. in Cell 46: 1053–1061 (1986), ligiert stromaufwärts des HSV-Thymidin-Kinasepromotors und des Luciferase-Reportergens von Plasmid tk-Luc. Die chimären ER-RAR-Rezeptoren bestanden aus der Östrogen-Rezeptor-DNA-Bindungsdomäne fusioniert an die "D-E-F"-Domäne der RARs. Der Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass diese "D-E-F"-Domäne dazu dient, Retinoid zu binden, um eine durch Retinoid induzierbare Transaktivierungsfunktion bereitzustellen und um eine Kontaktstelle für die Heterodimerisierung mit RXR bereitzustellen. Somit war die Luciferase-Expression in diesem Reportersystem von der Aktivierung des transfizierten chimären Rezeptorkonstrukts abhängig.
  • Beispiel 10 beschreibt das Verfahren, das dazu verwendet wurde, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Basis-Genaktivität hemmte, die nicht Liganden-gebundenen RARs zuzuschreiben war. Dieses Verfahren wurde bei Fehlen von zugesetztem Retinoid-Agonist durchgeführt. Die nachstehend dargelegten Ergebnisse stellten den ersten Hinweis bereit, dass AGN 193109 eine negative Hormonaktivität zeigte.
  • Beispiel 10
  • Unterdrückung der basalen Genaktivität eines Retinoid-regulierten Rezeptors in vorübergehend kotransfizierten Zelllinien
  • CV-1-Zellen wurden mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder den ER-RAR-α-, ER-RAR-β- oder ER-RAR-γ-Expressionsplasmiden kotransfiziert. Das ERE-tk-Luc-Plasmid enthielt das Östrogen-responsive Promotorelement des Xenopus-Laevis vitellogenin-A2-Gens und war im Wesentlichen mit dem von Klein-Hitpass et al. in Cell 46: 1053 (1986) beschriebenen Reporterplasmid identisch, außer dass das CAT-Reportergen durch eine Polynukleotid-Sequenz substituiert war, die Luciferase kodierte. Die in der Kotransfektion verwendeten chimären ER-RAR-α, ER-RAR-β und ER-RAR-γ Rezeptor-kodierenden Polynukleotide wurden von Graupner et al. in Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991) beschrieben. Diese Polynukleotide wurden in den von Ellis et al. in Cell 45: 721 (1986) beschriebenen pECE-Expressionsvektor ligiert und unter Transkriptionskontrolle des SV-40-Promotors exprimiert. Calciumphosphat-Transfektionen wurden exakt wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt unter Verwendung eines 0,5 μg Well-Reporterplasmids und entweder eines 0,05 μg, 0,10 μg oder 0,2 μg/Well-Reporterplasmids. Die Zellen wurden mit Trägerstoff alleine (Ethanol), mit ATRA (10–9 bis 10–6 M) oder mit AGN 193109 (10–9 bis 10–6 M) für 18 Stunden dosiert. Die Zelllysate und Luciferase-Aktivitätsmessungen wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
  • Die in den 3A, 4A und 5A präsentierten Ergebnisse bestätigten, dass ATRA eine Luciferase-Expression in starker Weise in allen Transfektanten induzierte. Eine Expression auf Basisniveau von Luciferase für die drei transfizierten chimären RAR-Isoformen bewegte sich von ungefähr 7.000 bis 40.000 relativen Lichteinheiten (relative light units = RLU) und war ein wenig von der Menge des Reporterplasmids, das in der Transfektion verwendet wurde, abhängig. Somit waren die drei chimären Rezeptoren von ATRA, wie erwartet, aktivierbar. Insbesondere banden alle drei Rezeptoren ATRA und aktivierten die Transkription des Luciferase-Reportergens, das sich auf dem ERE-tk-Luc-Plasmid befand.
  • Die 3B, 4B und 5B präsentieren AGN 193109 Dosiswirkungskurven, die bei Fehlen irgendeines exogenen Retinoid-Agonisten erzielt wurden. Interessanterweise wurde ER-RARα (3B) im Wesentlichen von AGN 193109 nicht beeinträchtigt, wohingegen die chimären ER-RAR-β- oder ER-RAR-γ-Rezeptoren (4B bzw. 5B) eine AGN 193109 Dosisresponsive Abnahme der Luciferase-Reporteraktivität zeigten.
  • Wir untersuchten weiterhin die negative Hormonaktivität von AGN 193109 durch Testen seines Vermögens, eine durch einen chimären RAR-γ-Rezeptor vermittelte Genexpression zu unterdrücken, der so gentechnisch hergestellt wurde, dass er eine konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne besaß. Wir verwendeten insbesondere einen konstitutiv aktiven chimären RAR-γ-Rezeptor, fusioniert an die saure Aktivatordomäne von HSV VP-16, genannt RAR-γ-VP-16, in zwei Typen von Luciferase-Reportersystemen. Das erste bestand aus dem ERE-tk-Luc-Reporter, der mit ER-RARs und ER-RXR-α kotransfiziert war. Der zweite verwendete den ΔMTV-TREp-Luc-Reporter anstelle des ERE-tk-Luc-Reporters.
  • Beispiel 11 beschreibt das zur Demonstrierung verwendete Verfahren, das AGN 193109 die Aktivität einer Transkriptions-Aktivatordomäne eines RAR unterdrücken könnte. Die unten präsentierten Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 eine RAR-abhängige Genexpression bei Fehlen eines Agonisten unterdrücken könnte und bestätigten, dass AGN 193109 eine negative Hormonaktivität zeigte.
  • Beispiel 11
  • Unterdrückung der RAR-VP-16-Aktivität in vorübergehend transfizierten Zellen
  • CV-1-Zellen wurden gemäß der unter Beispiel 6 beschriebenen Calciumphosphat-Kopräzipitationstechnik vorübergehend kotransfiziert, unter Verwendung von 0,5 μg/Well des ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmids, 0,1 μg/Well des chimären ER-RAR-α-Reporterexpressionsplasmids und entweder von 0 μg oder 0,1 μg/Well des RAR-γ VP-16-Expressionsplasmids. Der chimäre Rezeptor ER-RAR-α bestand aus der Hormonbindungsdomäne (Aminosäuren 181 bis 458) von RXR-α (Mangelsdorf et al., Nature 345: 224–229 (1990)), fusioniert an die Östrogenrezeptor-DNA-Bindungsdomäne (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) und wurde aus dem SV-40-basierten Expressionsvektor pECE exprimiert, beschrieben von Ellis et al. in Cell, 45: 721 (1986). RAR-γ-VP-16 ist mit dem Nagpal et al. in EMBO J. 12: 2349 (1993) beschriebenen VP-16 RAR-γl-Expressionsplasmid identisch und kodiert ein chimäres Protein mit der Aktivierungsdomäne des VP-16-Proteins von HSV, fusioniert an den Amino-Terminus von RAR-γ in voller Länge. 18 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit Phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline = PBS) gespült und es wurde DMEM (Gibco-BRL) zugeführt, das 10% FBS (Gemini Bio-Products) enthielt, das mit Kohle zur Entfernung von Retinoiden extrahiert wurde. Die Zellen wurden mit einer geeigneten Verdünnung von AGN 193109 oder ATRA in Ethanol-Träger oder Ethanol alleine für 18 Stunden dosiert, dann mit PBS gespült und unter Verwendung von 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0 % TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA, lysiert. Die Luciferase-Aktivität wurde gemäß des von de Wet et al., in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von Glühwürmchen-Luciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und eines EG&G Berthold 96-Well Plattenluminometers gemessen. Die Luciferase-Werte repräsentierten den Durchschnitt ± Standardabweichung von dreifachen Bestimmungen.
  • Wie in 6 dargestellt, wurden CV-1-Zellen mit dem ERE-tk-luc-Reporterkonstrukt und dem chimären ER-RAR-α-Expressionsplasmid transfiziert, das eine schwache Aktivierung der Luciferase-Aktivität durch ATRA zeigte, die wahrscheinlich auf die Isomerisierung von ATRA an 9C-RA zurückzuführen war, der natürliche Ligand für die RXRs (Heyman et al., Cell 68: 397 (1992)). Zellen, die mit demselben Gemisch an Reporter und chimären Rezeptorplasmiden transfiziert wurden, die jedoch mit AGN 193109 behandelt wurden, zeigten keine Wirkung auf die Luciferase-Aktivität. Weil AGN 193109 nicht an die RXR bindet, war dieses letztere Ergebnis erwartet. CV-1-Zellen, in ähnlicher Weise mit dem EREtk-Luc-Reporter transfiziert, jedoch unter Substitution eines chimären ER-RAR-Rezeptorexpressionsplasmids für ER-RXR-α, zeigte eine robuste Indikation einer Luciferase-Aktivität im Anschluss an eine ATRA-Behandlung.
  • Im Gegensatz hierzu ergab ein Einschluss des RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmids mit den ER-RXR-α- und ERE-tk-Luc-Plasmiden im Transfektionsgemisch eine signifikante Zunahme der basalen Luciferase-Aktivität, wie sie bei Fehlen irgendeines zugesetzten Retinoids gemessen wurde. Diese Zunahme der basalen Luciferase-Aktivität, die für die ER-RXRα/RAR-γ-VP-16-Kotransfektanten beobachtet wurde, zeigte, wenn dies mit dem unter Verwendung von Zellen erzielten Ergebnis verglichen wurde, die mit ER-RXR-α alleine transfiziert wurden, dass rekombinante ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16-Proteine heterodimerisieren konnten. Eine Interaktion des Heterodimers mit dem cis-regulatorischen Östrogen-responsiven Element führte zu einem Targeting der VP-16-Aktivierungsdomäne an die Promotorregion des ERE-tk-Luc-Reporters. Eine Behandlung solcher dreifach transfizierter Zellen mit ATRA führte zu einer bescheidenen Zunahme der Luciferase-Aktivität über den hohen Basallevel. Jedoch hatte eine Behandlung der Dreifachtransfektanten mit AGN 193109 eine Dosis-abhängige Abnahme der Luciferase-Aktivität zur Folge. Bedeutenderweise zeigte 6, dass eine AGN-193109-Behandlung von Zellen, die mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16-kotransfiziert wurden, zu einer Repression der Luciferase-Aktivität mit maximaler Hemmung führte, die bei ungefähr 10–8 M AGN 193109 eintrat.
  • Unsere Beobachtung, das AGN 193109 die konstitutive transkriptionelle Aktivierungsfunktion von RAR-γ-VP-16 in Gegenwart eines RXRs unterdrückte, wurde durch ein Modell erklärt, bei dem eine Bindung von AGN 193109 an das RAR eine Konformationsänderung im RAR induzierte, das eine Negativ-Konformation stabilisiert, die die Bindung eines trans-wirkenden negativen Koaktivatorproteins erleichtert. Wenn der AGN 193109/RAR-Komplex von NCP gebunden wird, ist das RAR nicht dazu in der Lage, die Transkription von Genen nach oben zu regulieren, die üblicherweise auf aktivierte RARs ansprechen. Unser Modell schlägt weiterhin vor, dass das intrazelluläre Reservoir an NCP in bestimmtem Kontext in eingeschränkter Konzentration vorliegt und mittels einer AGN 193109 stimulierten Komplexierung mit RARs depletiert werden kann.
  • Die in 6 präsentierten Ergebnisse zeigten zusätzlich an, dass sogar bei 10–6 M AGN 193109 die ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Proteine zur Bildung von Heterodimeren interagieren könnten, die zur Aktivierung der Transkription des Reportergens in der Lage waren. Insbesondere ergaben Zellen, die mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 transfiziert und mit AGN 193109 in einer Konzentration (10–8 bis 10–6 M) behandelt wurden, die ausreichend war, um eine maximale Hemmung bereitzustellen, eine Luciferase-Aktivität-Ablesung von ungefähr 16.000 rlu. Umgekehrt zeigten Zellen, die nur mit ER-RXR-α transfiziert und dann mit AGN 193109 in einer Konzentration von sogar 10–6 M behandelt wurden, Luciferase-Expressionsniveaus von nur ungefähr 8.000 rlu. Die Tatsache, dass ein höheres Niveau einer Luciferase-Aktivität in Zellen erzielt wurde, die sowohl ER-RXR-α als auch RAR-γ-VP-16 exprimierten, sogar in Gegenwart von 10–6 M AGN 193109, zeigte das Vorherrschen bzw. Fortbestehen einer Interaktion zwischen den beiden rekombinanten Rezeptoren. Die Unterdrückung der RAR-γ-VP-16-Aktivität durch AGN 193109 legte nahe, dass eine Modulation einer NCP-Interaktion mit einer VP-16-Aktivierung kodominieren kann. Demgemäß realisierten wir, dass es möglich sein kann, die Expression von Genen in einer AGN-193109-abhängigen Weise zu modulieren, die üblicherweise nicht von Retinoiden reguliert werden.
  • Kandidaten für AGN-193109-regulierbare Gene schließen solche ein, die durch Transkriptionsfaktorkomplexe aktiviert werden, die aus Nicht-RAR-Faktoren bestehen, die sich mit RARs verbinden oder mit diesen heterodimerisieren, wobei der nicht-RAR-Faktor keinen RAR-Agonisten zur Aktivierung erfordert. Während eine Stimulation mit einem RAR-Agonisten im Wesentlichen keine Wirkung auf die Expression solcher Gene haben kann, kann eine Verabreichung von AGN 193109 die Bildung inaktiver Transkriptionskomplexe, die AGN 193109/RAR/NCP umfassen, fördern. Folglich kann der Zusatz des AGN 193109 Retinoid-negativen Hormons die Transkription eines ansonsten Retinoid-unempfindlichen Genes nach unten regulieren.
  • Derselbe Mechanismus kann für die Beobachtung verantwortlich sein, dass AGN 193109 die Aktivität des Gewebstransglutaminase-(TGase)Gens in HL-60-Zellen unterdrücken kann. Ein Retinoid-Response- bzw. -Reaktionselement, das aus drei kanonischen Retinoid-Halbstellen besteht, die durch 5 und 7 Basenpaare beabstandet sind, wurde in der Transkriptions-Kontrollregion dieses Gens identifiziert. Während die TGase durch RXR-selektive Agonisten induziert werden kann, ist sie gegenüber RAR-selektiven Agonisten nicht reaktiv, bzw. responsiv bzw. ansprechbar. Das TGase-Retinoid-Responseelement wird von einem RAR/RXR-Heterodimer (Davies et al., in Press) gebunden. Interessanterweise ist AGN 193109 dazu in der Lage, die TGase-Aktivität, die von RXR-Agonisten induziert wurde, zu unterdrücken. Diese AGN 193109 vermittelte Repression bzw. Unterdrückung kann auf die Fähigkeit dieses negativen Hormons zurückzuführen sein, NCPs an den RAR-Bestandteil des Heterodimers abzusondern, wodurch die Aktivität des gebundenen RXR unterdrückt wird.
  • Wir haben ebenfalls Ergebnisse erzielt, die Schlüsse stützen, die mit denjenigen unter Beispiel 11 präsentierten identisch sind, indem RAR-γ-VP-16 und Expressionskonstrukte und das ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid anstelle der RAR-γ-VP-16- und ER-RXR-α-Expressionskonstrukte in Kombination mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid verwendet werden. Konsistent bzw. übereinstimmend mit den oben präsentierten Ergebnissen haben wir herausgefunden, dass die RAR-γ-VP-16-Aktivität am ΔMTV-TREp-Luc-Reporter durch AGN 193109 gehemmt wurde. Deswegen unterdrückte AGN 193109 eine RAR-γ-VP-16-Aktivität, wenn dieser chimäre Rezeptor direkt an ein Retinsäurerezeptor-Reaktionselement anstelle einer indirekten Bindung an ein Östrogen-Reaktionselement in der Promotorregion des Reporterplasmids gebunden wurde. Diese Erkenntnisse zeigten, dass ein Assay zum Identifizieren von Mitteln bzw. Wirkstoffen mit einer negativen Hormonaktivität nicht durch Verwendung eines speziellen Reporterplasmids beschränkt sein müssen. Stattdessen schließt ein entscheidendes Merkmal, das durch ein experimentelles System verkörpert wird, das zur Identifizierung von Retinoid-negativen Hormonen von Nutzen ist, den Nachweis der Fähigkeit einer Verbindung ein, die Aktivität eines RAR, das gentechnisch so hergestellt wurde, dass es eine konstitutive Transkriptions-Aktivierungsdomäne enthält, nachweisen.
  • Im Allgemeinen können Retinoid-negative Hormone als eine Untergruppe von Retinoid-Verbindungen identifiziert bzw. definiert werden, die innerhalb einer transfizierten Zelle die Basalniveau-Expression eines Reportergens unterdrückt, das transkriptionell gegenüber einer direkten oder indirekten Bindung durch einen Retinoidrezeptor oder einen chimären Rezeptor anspricht, der zumindest die Domänen des Retinoidrezeptors einschließt, die sich C-terminal an der DNA-Bindungsdomäne des Rezeptors befinden. Dieser Ansatz wurde an ein Screening-Verfahren, das zur Identifizierung Retinoid-negativer Hormone von Nutzen ist, angepasst. In den verschiedenen Ausführungsformen des vorliegenden Screening-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Struktur des Rezeptors, für den ein negatives Hormon gesucht wird, variabel. Insbesondere kann der Retinoidrezeptor entweder der RARoder der RXR-Subtyp sein. Der Rezeptor kann wahlweise so gentechnisch hergestellt sein, dass er eine konstitutive Transla-iptions-Aktivatordomäne einschließt. Der zum Screenen nach negativen Hormonen verwendete Retinoidrezeptor enthält wahlweise eine heterologe DNA-Bindungsdomäne als Ersatz für die DNA-Bindungsdomäne, die endogen im nativen Rezeptor vorliegt. Wenn jedoch ein zweiter Rezeptor im Screening-Verfahren verwendet wird und wo der zweite Rezeptor mit dem Retinoidrezeptor, für den ein negatives Hormon gesucht wird, dimerisieren kann, kann der Retinoidrezeptor keine DNA-Bindungsdomäne erforderlich machen, weil er an die Transkriptions-Kontrollregion des Reportergens indirekt durch Dimerisierung mit dem zweiten Reporter gebunden sein kann, der selbst an die Transkriptions-Kontrollregion gebunden ist.
  • In der Praxis des Screening-Verfahrens wird die Fähigkeit einer Verbindung, die basale Expression eines Reporters zu unterdrücken, typischerweise in einem in-vitro-Assay gemessen. Die basale bzw. Basis-Expression repräsentiert das Grundlinienniveau der Reporterexpression in transfizierten Zellen unter Bedingungen, bei denen kein exogen zugesetzter Retinoid-Agonist vorliegt. Wahlweise können Schritte unternommen werden, die endogenen Retinoid-Liganden aus der Umgebung der transfizierten Zellen über Verfahren zu entfernen, wie beispielsweise eine Kohleextraktion des Serums, das zur Kultivierung von Zellen in vitro verwendet wird.
  • Beispiele für Reportergene, die in Verbindung mit dem Screening-Verfahren von Nutzen sind, schließen solche ein, die Luciferase, Betagalactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Zelloberflächenantigene kodieren, die durch immunchemische Mittel nachgewiesen werden können. In der Praxis wird nicht erwartet, dass die Art bzw. Natur des Reportergens für die Durchführbarkeit des Verfahrens entscheidend ist. Jedoch muss die transkripitionsregulatorische Region des Reporterkonstruktes ein oder mehrere cisregulatorische Elemente einschließen, die Ziele von Transkriptionsfaktoren sind, für die negative Hormone gesucht werden. Wenn beispielsweise jemand wünscht, RAR-negative Hormone zu identifizieren, dann könnte die transkriptionsregulatorische Region des Reporterkonstruktes ein cis-regulatorisches Element enthalten, das durch ein RARenthaltendes Protein gebunden sein kann. In diesem Beispiel sollte eine Korrespondenz zwischen der DNA-Bindungsdomäne des RAR und des cis-regulatorischen Elementes des transkriptionsregulatorischen Bereiches bzw. Region des Reporterkonstruktes bestehen. Somit sollte, wenn ein chimärer RAR mit einer konstitutiven Transkriptions-Aktivatordomäne und einer DNA-Bindungsdomäne, die cis-regulatorische Östrogen-responsive Elemente bindet, im Screening-Verfahren verwendet werden, die transkriptionsregulatorische Region des Reporterkonstruktes ein Östrogen-responsives Element enthalten.
  • Beispiele für cis-regulatorische Elemente, die Retinoid-Rezeptoren (RARE) direkt binden, und die in Verbindung mit dem Reporterassay von Nutzen sind, sind bei Mangelsdorf et al. in The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2. Ausgabe, Hsg. Sporn et al., Raven Press, Ltd. New York (1994) offenbart. Beispiele für cisregulatorische Elemente, die chimäre Rezeptoren indirekt binden können, schließen DNA-Bindungsstellen für jedes DNA-bindende Protein ein, für das die DNA-bindende Domäne des Proteins in einen chimären Rezeptor eingebaut werden kann, der aus dieser DNA-bindenden Domäne besteht, die an einen Retinoid-Rezeptor gebunden ist. Spezielle Beispiele für heterologe DNA-Bindungsdomänen, die so in chimären Rezeptoren gentechnisch hergestellt werden können und die heterologe cis-regulatorische Elemente erkennen werden, schließen solche ein, die Östrogen-responsive Elemente erkennen. Somit muss der Retinoid-Rezeptoranteil eines chimären Rezeptors, der in Verbindung mit dem Screening-Verfahren von Nutzen ist, die DNA-Bindung des Retinoid-Rezeptors nicht enthalten, jedoch muss er zumindest die Liganden-Bindungsdomäne des Retinoid-Rezeptors enthalten.
  • Ein weiteres Beispiel für eine indirekte Retinoid-Rezeptorbindung an das cis-regulatorische Element schließt die Verwendung eines Protein ein, das das cis-regulatorische Element binden und mit einem Retiooid-Rezeptor dimerisieren kann. In diesem Falle assoziiert bzw. bindet der Retinoid-Rezeptor das cis-regulatorische Element nur durch Bindung mit dem Protein, das für die DNA-Bindung verantwortlich ist. Ein Beispiel für ein solches System würde die Verwendung eine Fusionsproteins einschließen, das aus einer heterologen DNA-Bindungsdomäne besteht, fusioniert an RXR, und zumindest die Domäne des RXRs enthält, die für die Dimerisierung mit RARs verantwortlich ist. Gleichzeitig bzw. gemeinsam eingebrachte RARs können mit einem solchen Fusionsprotein dimerisieren, das an das cis regulatorische Element gebunden ist. Wir nehmen an, dass jedes cis-regulatorische Element bindende Protein, das mit RARs dimerisiert, so dass es eine indirekte Bindung des RAR mit dem cis-regulatorischen Element zur Folge hat, ebenfalls zur Verwendung mit dem negativen Hormon des Screening-Verfahrens geeignet sein wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Screening-Verfahrens werden Retinoid-negative Hormone als solche Retinoide identifiziert, die die basale Expression in einem gentechisch hergstellten RAR-Transkriptionsfaktor mit erhöhter Basalaktivität unterdrücken. Obwohl dies für die Durchführbarkeit des Screening-Verfahrens nicht essentiell ist, schloss das gentechnisch hergestellt RAR, das im nachfolgenden Beispiel verwendet wurde, eine konstitutive Transkriptions-Aktivierungsdomäne ein. Die Verwendung dieses Chimären Rezeptors stellte in vorteilhafter Weise ein Mittel bereit, durch das die Basisexpression eines Reportergenes in Abwesenheit irgendeines Retinoids angehoben werden konnte. Obwohl sie eine vorübergehende Transfektion in den oben ausgeführten Verfahren verwendeten, würden stabil transfizierte Zelllinien, die den chimären Rezeptor konstitutiv exprimieren, ebenfalls in Verbindung mit dem Screening-Verfahren von Nutzen sein.
  • Wie im nachfolgenden Beispiel offenbart, war ein chimärer Retinoid-Rezeptor, der eine konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne aufwies, mit einem zweiten Rezeptor heterodimerisierbar, der so gentechnisch hergestellt war, dass er eine DNA-Bindungsdomäne enthielt, die für ein Östrogen-responsives cis-regulatorisches Element spezifisch ist. In diesem Fall assoziiert der chimäre Retinoid-Rezeptor, der eine konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne aufweist, mit dem cis-regulatorischen Bereich, der die Reportergen-Expression steuert, indirekt über einer Bindung an einen zweiten Rezeptor, der eine DNA-Zielsequenz bindet. Insbesondere wurde der zweite Rezeptor so hergestellt, dass er eine DNA-Bindungsdomäne enthielt, die ein Östrogen-responsives Element erkannte. In vorteilhafter Weise war das Reportergen mit einem Östrogen-responsiven Element in der stromaufwärts gelegenen Promotorregion gegenüber Retinoid-Agonisten bei Fehlen des transfizierten chimären Rezeptors, der die konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne enthielt, nicht responsiv bzw. ansprechbar. Demgemäß wurde die gesamte Reportergen-Aktivität auf die transfizierten Rezeptoren zurückgeführt bzw. diesen zugeschrieben. Die Kombinationsverwendung der Östrogen-responsiven Element-DNA-Bindungsdomäne und des Östrogen-responsiven Element cis-regulatorischen Elements soll nur veranschaulichend sein. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass andere Kombinationen von gentechnisch veränderten Rezeptoren mit einer Spezifität für nicht-RARE-cisregulatorischen Elementen ebenfalls in der Ausübung des Screening-Verfahrens der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein werden.
  • Zellen, die in Verbindung mit dem Screening-Verfahren von Nutzen sind, sind eukaryotische Zellen, die transfiziert werden können. Die Zellen können Tierzellen, wie beispielsweise humane, Primaten- oder Nagetierzellen sein. Wir haben sehr gute Ergebnisse unter Verwendung von CV-1-Zellen erreicht, haben jedoch vernünftigerweise angenommen, dass andere kultivierte Zelllinien ebenfalls erfolgreich verwendet werden könnten. Irgendeines von mehreren herkömmlichen Transfektionsverfahren, das in der Technik bekannt ist, kann zur Einbringung eines Expressionskonstruktes verwendet werden, das den Chimären Retinoid-Rezeptor mit einer konstitutiven Transkriptions-Aktivatordomäne kodiert.
  • Die konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne besteht aus einer Vielzahl von Aminosäuren, die wahrscheinlich einen insgesamt sauren Charakter aufweist, wie es durch die negative Ladung unter neutralen pH-Bedingungen dargestellt wird. Beispielsweise kann die konstitutive Transkriptions-Aktivatordomäne eine Aminosäuresequenz aufweisen, die ebenfalls in viralen Transkriptionsfaktoren zu finden ist. Ein Beispiel für einen viralen Transkriptionsfaktor mit einer konstitutiven Transkriptions-Aktivatordomäne ist das Herpessimplex-Virus 16. Jedoch würden auch andere virale oder synthetische Transkriptions-Aktivatordomänen bei der Konstruktion von Expressionskonstrukten, die den Chimären Retinoid-Rezeptor mit einer konstitutiven Transkriptions-Aktivatordomäne kodieren, von Nutzen sein.
  • Wie unten beschrieben, haben wir ein generalisiertes Screening-Verfahren entwickelt, das zur Identifizierung von Retinoid-negativen Hormonen von Nutzen ist. Dieses Screening-Verfahren stellt ein Mittel zur Unterscheidung einfacher Antagonisten von Negativhormonen bzw. negativen Hormonen bereit. Tabelle 12 listet mehrere Retinoid-Verbindungen auf, die eine potente bzw. wirksame Affinität für RAR-γ bereits jetzt zeigen, mit Ausnahme von ATRA, das diesen Rezeptor in einem vorübergehenden Kotransfektions-Transaktivierungsassay nicht transaktivierte. Wir haben deswegen diese Verbindungen getestet, um zu bestimmen, welche RAR-γ-Antagonisten waren und welche, wenn überhaupt, dieser Antagonisten eine negative Hormonaktivität zeigten.
  • Beispiel 12 beschreibt das zur Identifizierung von Retinoid-Verbindungen, die Antagonisten waren, verwendete Verfahren und die Untergruppe von Antagonisten, die eine negative Hormonaktivität zeigten.
  • Beispiel 12
  • Assay nach Retinoid-negativen Hormonen
  • 4 × 104 CV-1-Zellen wurden durch das in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hsg. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) beschriebene Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren unter Verwendung von 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und 0,1 μg ER-RAR-γ (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) chimärem Expressionsplasmid transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und es wurde DMEM (Gibco-BRL) zugeführt, das 10% Aktivkohle-extrahiertes FBS (Gemini Bio-Products) enthielt. Die Zellen wurden mit 10–8 M ATRA in Ethanol oder Ethanol alleine behandelt. Zusätzlich wurden ATRA-behandelte Zellen mit 10–9, 10–8, 10–7 oder 10–6 M der in Tabelle 12 aufgelisteten Verbindungen behandelt. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 10,0 mM DTT, 2 mM EDTA lysiert. Die Luciferase-Aktivitäten wurden wie bei de Wet et al. in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschrieben, gemessen.
  • Tabelle 12
    Figure 01440001
  • Wie durch die in einem Teil in 7 und in Tabelle 12 präsentierten Ergebnisse angezeigt, waren alle der in Tabelle 12 aufgelisteten Verbindungen mit Ausnahme von ATRA an RAR-γ Retinoid-Antagonisten.
  • Die in Tabelle 12 identifizierten RAR-γ-Antagonisten wurden als nächstes gescreent, um zu bestimmen, ob, falls überhaupt, sie ebenfalls Retinoid-negative Hormone waren. 4 × 104 CV-1-Zellen wurden gemäß des in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Hsg., Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) beschriebenen Calciumphosphat-Verfahrens unter Verwendung von 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und 0,1 μg ER-RXR-α (Graupner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) und unter Verwendung von 0,2 μg RAR-γ-VP-16 (Nagpal et al. EMBO J. 12: 2349 (1993)) chimären Expressionsplasmiden transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und es wurde DMEM (Gibco-BRL) zugeführt, das 10% Aktivkohle-extrahiertes FBS (Gemini Bio-Products) enthielt. Die Zellen wurden mit 10–9, 10–8, 10–7 oder 10–6 M jeder der in Tabelle 12 aufgelisteten Verbindungen behandelt. Die Behandlung mit Ethanol-Träger alleine diente als Negativkontrolle. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA, lysiert. Die Luciferase-Aktivitäten wurden wie vorher durch de Wet et al. in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) gemessen.
  • Wie in 8 dargestellt, konnten die Retinoid-Antagonisten von Tabelle 12 in zwei Klassen unterteilt werden, mittels ihrer Wirkung auf die konstitutive Transkriptions-Aktivierungsfunktion des chimären RAR-γ-VP-16-Retinoid-Rezeptors. Eine Gruppe, die AGN 193174, AGN 193199 und AGN 193840 einschloss, unterdrückte die RAR-γ-VP-16-Aktivität nicht, obwohl sie ATRA-Antagonisten waren. Im Gegensatz hierzu zeigten AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871 eine Dosis-abhängige Unterdrückung einer RAR-γ-VP-16-konstitutiven Aktivität. Deswegen zeigten, während die Verbindungen beider Gruppen RAR-γ-Antagonisten waren, nur solche der zweiten Gruppe eine negative Hormon-Aktivität. Dieser Assay unterschied in vorteilhafter Weise Retinoid-negative Hormone von einfachen Retinoid-Antagonisten.
  • Die vorhergehenden experimentellen Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 den Kriterien entsprach, die ein negatives Hormon definieren. Insbesondere zeigten die unter Beispiel 11 präsentierten Ergebnisse, dass AGN 193109 die Fähigkeit aufwies, eine inhibitorische Aktivität an den RARs sogar in Abwesenheit von exogen zugesetzten Retinoid-Liganden zu zeigen. Diese Verbindung besitzt als solches biologische Aktivitäten, die nicht von einer Blockade der Interaktion zwischen den RARs und Agonisten wie beispielsweise ATRA und AGN 191183 abhängig sind. Diese Erkenntnisse führen uns zum Schluss, dass AGN 193109 Interaktionen zwischen RARs und NCPs stabilisierten. Wie in 9 dargestellt ist, existieren NCPIRAR/PCP-Interaktionen in einem Gleichgewichtszustand. Ein Agonist dient dazu, PCP-Interaktionen zu erhöhen und NCP-Interaktionen zu senken, während ein inverser Agonist oder ein negatives Hormon NCP stabilisiert und PCP-Interaktionen senkt. Wie kürzlich angezeigt, legten unsere experimentellen Ergebnisse nahe, dass die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP für andere Rezeptoren durch AGN-193109-Verabreichung moduliert werden kann. Wir entdeckten insbesondere, dass AGN 193109 die Komplexierung von NCP mit RARs fördern kann, wodurch das intrazelluläre Reservoir von NCP, das für eine Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren als den RARs verfügbar ist, reduziert wird.
  • Wir haben als nächstes die Auswirkung von AGN 193109 auf eine Agonisten-vermittelte Hemmung einer AP-1-abhängigen Genexpression untersucht. In Endocr. Rev. 14: 651 (1993) offenbart Pfhal, dass Retinoid-Agonisten die Genexpression nach unten regulieren können. In Endocr. Rev. 14: 651 (1993) offenbart Pfhal, dass Retinoid-Agonisten die Genexpression durch einen Mechanismus nach unten regulieren können, der die Hemmung einer AP-1-Aktivität mit einschloss. Wir postulierten, dass AGN 193109 jeden von zwei Effekten aufweisen könnte, wenn es in Kombination mit einem Retinoid-Agonisten in einem Modellsystem verwendet wurde, das zur Messung einer AP-1-Aktivität entwickelt wurde. Zuerst könnte AGN 193101 vorstellbar die Wirkung des Agonisten antagonisiert haben, und dadurch die Agonisten-abhängige Hemmung der AP-1-Aktivität freisetzen können. Alternativ könnte AGN 193109 die Aktivität des Agonisten potenziert haben, wodurch die Agonistenabhängige Hemmung der AP-1-Aktivität überbetont bzw. übertrieben werden könnte.
  • Beispiel 13 beschreibt die zur Demonstrierung verwendeten Verfahren, dass AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoid-Agonisten potenzierte. Wie nachstehend offenbart, hemmte der AGN-191183-Retinoid-Agonist eine AP-1-abhängige Genexpression schwach. Die Kombination von AGN 193109 und des Retinoid-Agonisten hemmte die AP-1-abhängige Genexpression stark. AGN 193109 selbst wies im Wesentlichen keine anti-AP-1-Aktivität auf.
  • Beispiel 13
  • AGN 193109 potenziert die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoid-Agonisten
  • HeLa-Zellen wurden mit 1 μg des Str-AP1-CAT-Reportergenkonstruktes und mit 0,2 μg von Plasmid pRS-hRARα transfiziert, beschrieben von Giguere et al. in Nature 33: 624 (1987), unter Verwendung von LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.). Str-AP1-CAT wurde durch Klonieren eines DNA-Fragmentes hergestellt, das den Positionen –84 bis +1 des Ratten-Stromelysin-1-Promotors (Matrisian et al., Mol., Cell. Biol. 6: 1679 (1986)) entsprach, zwischen den HindIII-BamHI-Stellen von pBLCAT3 (Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15: 5490 (1987)) hergestellt. Diese Sequenz des Stromelysin-1-Promotors enthält ein AP1-Motiv als einziges Enhancer-Element (Nicholson et al., EMBO J. 9: 4443 (1990). Die Promotor-Sequenz wurde durch Annealing zweier synthetischer Oligonucleotide hergestellt, die die folgenden Sequenzen aufwiesen.
  • Figure 01470001
  • Verfahren, die eine Transfektion, Behandlung mit geeigneten Verbindungen und Messung einer CAT-Aktivität einschlossen, wurden wie bei Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschrieben durchgeführt.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten an, dass AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität des Retinoid-Agonisten, AGN 191183, potenzierte. Insbesondere hemmte AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10–12 bis 10–10 M die TPA-induzierte Str-AP1-CAT-Expression nicht. Eine Behandlung mit AGN 193109 im Konzentrationsbereich von 10–10 bis 10–8 hemmte die AP-1-vermittelte Reporteraktivität im Wesentlichen nicht. Jedoch zeigten die in 10 präsentierten Ergebnisse an, dass eine Stimulation der Transfektanten mit der Kombination aus AGN 193109 (10–8 M) und AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10–12 bis 10–10 M die TPA-induzierte Str-AP1-CAT-Expression um einen Umfang bzw. eine Menge von 12–21% beträchtlich hemmte. Deswegen potenzierte AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 unter Bedingungen, bei denen dieser Retinoid-Agonist üblicherweise eine AP-1-Aktivität nicht hemmte.
  • Wir begründeten dies damit, dass AGN 193109 die Agonisten-vermittelte Repression einer AP-1-Aktivität durch einen Mechanismus potenzierte, der wahrscheinlich eine AGN-193109-abhängige Absonderung von NCPs an RARs mit einschloss. Die RARs gehören zur Superfamilie von Kernrezeptoren, die ebenfalls Rezeptoren für 1,25-Dihydroxyvitamin D3, Glucocorticoid, Schilddrüsenhormon, Östrogen und Progesteron einschließen. Es war eine vernünftige Annahme, dass die Fähigkeit, an NCPs zu binden, zwischen unterschiedlichen Mitgliedern der Kernrezeptorsuperfamilie geteilt werden kann. Dies führte uns dazu zu spekulieren, dass AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität einer oder mehrerer der Liganden potenzieren könnte, die mit dieser Superfamilie von Kernrezeptoren interagieren.
  • Die in dem vorhergehenden Beispiel präsentierten Ergebnisse zeigen klar an, dass AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoid-Agonisten potenziert. Insbesondere senkte AGN 193109 die Schwellendosis, bei der die Anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 nachgewiesen werden konnte. Weil AGN 193109 im Wesentlichen keine AP-1-Aktivität selbst aufweist, war seine Wirkung auf Kernrezeptor-Agonisten synergistisch. Wir haben ebenfalls herausgefunden, dass das negative Hormon AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 potenziert, der natürliche Ligand für den Vitamin-D3-Rezeptor.
  • Die beobachtete Synergie zwischen AGN 193109 und AGN 191193 im vorhergehenden Beispiel impliziert notwendigerweise, dass die Anti-AP-1-Aktivität des Retinoid-Agonisten und die AGN 193109 vermittelte Potenzierung der Aktivität aus unterschiedlichen Mechanismen resultieren müssen. Wenn die Wirkmechanismen der beiden Mittel identisch waren, dann folgt, dass die Wirksamkeit der Kombination aus AGN 193109 und dem Agonisten additiv sein würde. Stattdessen wurde gezeigt, dass die Kombination wirksamer als jedes Mittel alleine war, eine Wirkung, die im Vorfeld dieser Erkenntnis nicht vorhergesehen werden konnte.
  • In signifikanter Weise wurde die AGN-193109-vermittelte Potenzierung des RAR-Agonisten unter Verwendung eines ungefähr 100fachen molaren Überschusses von AGN 193109 bezüglich dem Retinoid-Agonisten durchgeführt. Demgemäß sollte die Mehrzahl der RARs durch AGN 193109 gebunden worden sein, unter einer nur geringen Anzahl von RARs, die zurückblieben, um für eine Agonisten-Bindung zur Verfügung zu stehen. Trotz dieser Tatsache war die Population von RARs, die von AGN 193109 nicht gebunden wurden, dazu in der Lage, Retinoid-Agonisten zu binden und eine Agonisten-abhängige Reaktion, die als Hemmung einer Reportergen-Expression messbar war, kräftig zu stimulieren. Somit legen unsere Daten eine mögliche Heterogenität der RARs nahe, die durch AGN 193109 induziert werden.
  • Die negative Hormonaktivität von AGN 193109, die seiner Fähigkeit, die Interaktion von RARs und NCPs zu fördern, zugeschrieben wird, stellte eine Basis für ein Verständnis der Synergie zwischen AGN 193109 und Retinoid-Agonisten bereit. Unsere Ergebnisse waren mit einem Modell voll konsistent, in dem eine AGN-193109-Behandlung von Zellen die Bindung von RARs und NCPs förderte, wodurch die Anzahl freier NCPs und freier RARs innerhalb der Zelle reduziert wurde. Dies hat die Erzeugung zweier Populationen von RARs zur Folge, die getrennt bzw. unterschiedlich funktionell sind. Die erste Population wird durch RARs repräsentiert, die mit NCPs verbunden sind. Derartige AGN 193109/RAR/NCP-Komplexe können nicht durch Retinoid-Agonisten aktiviert werden. Die zweite Population besteht aus RARs, die von NCPs nicht gebunden werden und die für eine Interaktion mit Agonisten verfügbar bleiben. Diese letztere Population wird als "RAR*" bezeichnet, um freie RARs in einer Umgebung anzuzeigen, die im Wesentlichen von NCP depletiert ist.
  • Die RAR*s weisen eine gesenkte Wahrscheinlichkeit einer Verbindung mit NCP durch eine Gleichgewichtsbindung auf und weisen eine erhöhte Sensitivität bzw. Empfindlichkeit gegenüber Retinoid-Agonisten auf, die beispielsweise als Anti-AP-1-Aktivität messbar ist. Dies ist der Fall, weil, während das intrazelluläre Reservoir von NCP mittels AGN-193109-Verabreichung depletiert ist, das Reservoir von PCP nicht depletiert wurde. Demgemäß kann freies RAR* einen Retinoid-Agonisten binden und mit PCP-Faktoren in einer Umgebung interagieren, die im Wesentlichen von NCP depletiert ist. Die Fähigkeit von AGN 193109, die Empfindlichkeit anderer Kernrezeptoren gegenüber ihren jeweiligen Agonisten zu erhöhen, kann der Fähigkeit dieser unterschiedlichen Kernrezeptoren zugeschrieben werden, mit denselben NCPs zu interagieren, die mit AGN 193109/RAR-Komplexen interagieren. Dieses Modell einer AGN-193109-vermittelten Modulation einer NCP-Verfügbarkeit für Mitglieder der Kernrezeptor-Familie ist schematisch in 11 dargestellt.
  • Dieses mechanistische Modell führte uns dazu, vorherzusagen, dass AGN 193109 die Aktivitäten von anderen Kernrezeptor-Liganden als Retinoid-Agonisten modulieren könnte. Wie im nachfolgenden Beispiel dargestellt, bestätigten wird, dass AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in einem In-vitro-Transaktivierungsassay potenzierte bzw. stärkte.
  • Beispiel 14 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dehydroxyvitamin D3 in einem Transaktivierungsassay steigerte.
  • Beispiel 14
  • AGN 193109 verstärkt die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Aktivität
  • HeLa-Zellen wurden unter Verwendung der von Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 84: 7413 (1987) beschriebenen kationischen Liposomen-vermittelten Transfektionsverfahrens transfiziert. 5 × 104 Zellen wurden in 12 Well Multiwellplatten ausplattiert und in DMEM gezüchtet, das mit 10% FBS ergänzt war. Die Zellen wurden mit Serum-freiem Medium kotransfiziert unter Verwendung von 2 μg/Well LIPOFECTAMINE-Reagenz (Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-VDRE-Luc, das 2 Kopien des 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Reaktionselementes:
  • 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3' (SEQ ID NO: 4) aus dem Maus-Osteopontin-Gen (Ferrara et al., J. Biol. Chem. 269: 2971 (1994)) enthielt, ligiert in das Reporterplasmid ΔMTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992)), und mit 0,3 μg des Plasmids pGEM3Z (Pharmacia, Inc.) als Träger-DNA, um die Endkonzentration der DNA auf 1,0 μg pro Well zu bringen. Nach 6 Stunden Transfektion wurden die Zellen mit einem Wachstumsmedium gespeist, das Kohle-extrahiertes FBS in einer Endkonzentration von 10% enthielt. 18 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit Vehikel bzw. Träger alleine (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol in einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M behandelt. 6 Stunden später wurde 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Ethanol in einer Endkonzentration von 10–10 bis 10–7 M zugesetzt. Die Zellen wurden lysiert und 18 Stunden im Anschluss an die 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung geerntet. Die Luciferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen. Dieses experimentelle System ermöglichte ein bequemes Verfahren zur Überwachung und Quantifizierung der 1,25 Dihydroxyvitamin D3-abhängigen Genexpression.
  • Die in 12 präsentierten Ergebnisse zeigen an, dass, wenn sie mit dem unter Verwendung von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 alleine erzielten Ergebnis verglichen wurden, AGN 193109, das mit 1,25-Dihydroxyvitamin D3 gleichzeitig verabreicht wurde, die Dosiswirkungskurve nach links verschob. Dies bestätigte, dass AGN 193109 die Wirksamkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 im In-vitro-Transaktivierungsassay vermehrte. Insbesondere veranschaulicht 12 graphisch, dass eine AGN-193109-Konzentration von nur 10–100 nM das 1,25-Dihydroxyvitamin D3 ungefähr 10fach wirksamer machte. Während eine 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Konzentration von 10–8 M dazu erforderlich war, eine Luciferase-Expression von ungefähr 2000 rlu zu erzeugen, war nur ein Zehntel sowie 1,25-Dihydroxyvitamin D3 erforderlich, um denselben Luciferase-Output zu erzeugen, wenn das Vitamin mit AGN 193109 in einer Konzentration von 10–8 bis 10–7 M gleichzeitig verabreicht wurde. Obwohl nicht in der graphischen Darstellung in 12 dargestellt, wurden im Wesentlichen identische Ergebnisse unter Verwendung von AGN-193109-Konzentrationen von 10–9 M und 10–8 M erzielt. Somit reduzierte eine Koadministration mit AGN 193109 die Menge an 1,25-Dihydroxyvitamin D3, die zur Erzeugung einer ähnlichen Wirkung in Abwesenheit des negativen Hormons erforderlich war, beträchtlich.
  • Interessanterweise existierte eine koinzidente Abnahme der Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 zu verstärken, wenn das obige Verfahren unter Kotransfektion eines Vitamin-D3-Rezeptors (VDR) Expressionsplasmids wiederholt wurde. Wir interpretierten dieses Ergebnis als Anzeichen dafür, dass eine Überexpression von VDRs das Vermögen von AGN 193109, die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 zu verstärken, beeinträchtigen könnte. Somit kann die intrazelluläre Konzentration eines Ligandenrezeptors, die sich in einer gewebsspezifischen Weise unterscheiden kann, die Fähigkeit von AGN 193109 zur Verstärkung der Aktivität eines Liganden, der den Rezeptor bindet, beeinflussen. Dies war wiederum mit einem Modell konsistent, in dem titrierbare NCPs zur Regulation der Vitamin-D3-Reaktion beitrugen und das oben dargelegte Modell unterstützten.
  • Wie im nachfolgenden Beispiel dargestellt ist, bestätigten wir ebenfalls, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 verstärkte. Unser Modell für die Aktivität einer AGN-193109-Wirkung erklärt diese Beobachtung durch Anführen, dass NCPs sich avidisch mit RARs in Gegenwart dieses Arzneistoffs verbinden. Endogene Vitamin-D-Rezeptoren, die in HeLa-Zellen vorhanden sind, wurden wahrscheinlich für den 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Liganden empfindlicher gemacht mit der Folge einer Übertreibung der Fähigkeit dieses Liganden, die Expression vom Str-AP1-CAT-Rezeptor zu hemmen.
  • Beispiel 15 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 potenzierte bzw. verstärkte.
  • Beispiel 15
  • AGN 193109 verstärkt die Anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D3
  • HeLa-Zellen wurden mit 1 μg Str-AP1-CAT unter Verwendung von LIPOFECTAMINE gemäß dem von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschriebenen Verfahren transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden mit AGN 193109 alleine (10–9 bis 10–7 M), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 alleine (10–12 bis 10–7 M) oder 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (10–12 bis 10–7 M) in Gegenwart von 10–8 M AGN 193109 behandelt.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten an, dass AGN 193109 die Fähigkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D3, eine TPA-induzierte AP-1-Aktivität zu hemmen, verstärkte. Wenn es alleine in einem Konzentrationsbereich von 10–9 bis 10–7 M verwendet wurde, wies AGN 193109 keine nachweisbare Anti-AP-1-Aktivität auf. Die in 13 präsentierten Ergebnisse zeigen an, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D3 eine TPA-stimulierte Aktivität nur im 10–8 und 10–7 M Konzentrationsbereich unterdrückte. Eine Analyse der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelten Unterdrückung einer TPA-stimulierten CAT-Aktivität in Gegenwart von 10–8 M AGN 193109 zeigte an, dass die Anti-AP-1-Aktivität bei 10–10 und 10–9 M 1,25-Dihydroxyvitamin D3 nachweisbar war und zeigte eine Zunahme der Aktivität bei 10–8 und 10–7 M Dosen, im Vergleich zu 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung alleine. Diese AGN-193109-abhängige Modulation von 1,25-Dihydroxyvitamin D3-vermittelter Anti-AP-1-Aktivität war mit unserem Modell konsistent, bei dem eine NCP-Absonderung an RARs das NCP für eine Interaktion mit anderen Mitgliedern der Kernrezeptorfamilie nicht verfügbar machte. Demgemäß wurden die Rezeptoren gegenüber der 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Behandlung empfindlicher gemacht.
  • Die einer RAR vermittelten Transaktivierung und einer Anti-AP-1-Aktivität zugrundeliegenden Mechanismen sind wahrscheinlich unterschiedlich. Dieser Schluss basierte auf unserer Beobachtung, dass hohe Dosen an AGN 193109 eine Transaktivierung hemmten, ohne eine Anti-AP-1-Aktivität im Wesentlichen zu hemmen. Wir wünschten uns deswegen, zusätzliche Beweise zu gewinnen, um unser Modell für die RAR*-Bildung zu stützen, die durch eine AGN-193109-Behandlung vermittelt war. Um dies zu erreichen, untersuchten wir, ob AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifischen Agonisten 191183 in einem In-vitro-Transaktivierungsassay verstärken konnte.
  • Beispiel 16 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifschen Agonisten AGN 191183 verstärkte. Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten an, dass unter bestimmten Umständen, AGN 193109 die Wirkstärke des RAR-spezifischen Retinoids erhöhte und ergab einen starken Hinweis bzw. Beweis dafür, dass AGN 193109 die RAR*-Bildung unterstützte.
  • Beispiel 16
  • Die Verstärkung der Retinoid-Wirksamkeit durch AGN-193109 Co-Verabreichung
  • HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des von Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987) beschriebenen kationischen Liposomen-vermittelten Transfektionsverfahrens transfiziert. 5 × 104-Zellen wurden in 12 Well/Multiwellplatten ausplattiert und in DMEM gezüchtet, das mit 10% FBS ergänzt war. Die Zellen wurden in Serum-freiem Medium unter Verwendung von LIPOFECTAMINE-Reagenz (2 μg/Well, Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-7hEp-Luc, das zwei Kopien des TREpaI-Reaktionselementes 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (SEQ ID NO:5) eingefügt in das Reporterplasmid ΔMTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992)) enthielt und mit 0,1 μg des RAR-Gammaexpressionsplasmids pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) kotransfiziert. Nach 6 Stunden Transfektion wurde den Zellen Wachstumsmedium zugeführt, das Kohlen-extrahiertes FBS in einer Endkonzentration von 10% enthielt. 18 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit Träger alleine (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol in einer Endkonzentration von 10–11 bis 10–8 M behandelt. 6 Stunden später wurde AGN 191183 in Ethanol in einer Endkonzentration von entweder 0, 10–10 oder 10–9 M zugesetzt. Die Zellen wurden nach 18 Stunden AGN-191183-Behandlung geerntet und die Luciferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen.
  • Vorläufige Experimente zeigten an, dass 10–9 M AGN 193109 in der Hemmung der Reaktion auf 10–9 M AGN 191183 in HeLa-Zellen relativ uneffektiv war. Dies kontrastierte mit der Fähigkeit von 10–9 M AGN 193109, 10–8 M ATRA in CV-1-Zellen zu hemmen (2).
  • Die in 14 präsentierten Ergebnisse unterstützten die Vorhersage, dass AGN 193109 die Bildung von RAR* stimulierte. Konsistent mit unserer Charakterisierung der Antagonistenund negativen Hormon-Aktivitäten von AGN 193109 hatte die Behandlung mit AGN 193109 eine zweiphasige Dosiswirkungskurve zur Folge. Die niedrigsten Dosen von AGN 193109 (10–11 und 10–10 M) hatten eine Stimulierung der Luciferase-Aktivität über diejenige von AGN 191183 alleine zur Folge. Diese Wirkung legt nahe, dass RAR* durch AGN 193109 erzeugt werden. Kurioserweise war dies ebenfalls bei AGN-193109-Behandlung alleine ersichtlich, was nahelegt, dass RAR* auf einen endogenen Liganden reagieren kann. AGN 191183 ist ein synthetischer Retinoid-Agonist und aktiviert wie ATRA, eine Transkription durch die RARs. Eine Substitution von AGN 191183 für ATRA in Beispiel 7 würde qualitativ ähnliche Ergebnisse ergeben (d. h., AGN 193109 würde die Wirkung von 10 nM AGN 191183 antagonisieren). Beispiel 16 veranschaulicht, dass, während AGN 193109 als ein Antagonist von RAR-Agonisten fungieren kann, die Dosierungsbedingungen in einfacher Weise identifiziert werden konnten, bei denen eine AGN-193109-Koadministration die Aktivierung, die durch einen RAR-Agonisten vermittelt war, verstärken konnte. Es ist von Bedeutung zu erwähnen, dass die Dosen der Verbindungen, die in Beispiel 16 verwendet wurden, beträchtlich niedriger als die Dosen sind, die im Verfahren verwendet wurden, das unter Beispiel 7 beschrieben wurde. Wir schlugen vor, dass eine AGN-193109-Behandlung zu einer RAR-Heterogenität von RARs gegen RAR* führen könnte. Die apparente Heterogenität (d. h. die Fähigkeit zu verstärken), scheint unterschiedliche Fenster in der Transaktivierung gegen die AP-1-Unterdrückung zu haben. Der Grund, dass die Kurven zweiphasig sind, liegt darin, dass mit zunehmenden Mengen an AGN 193109 proportional weniger RAR existiert, das für eine Bindung des Agonisten verfügbar ist. Dies scheint nicht der Fall für eine AP-1-Unterdrückung zu sein und wir überlassen dies der Spekulation, dass dieser Unterschied zwei unterschiedliche Mechanismen zur Transaktivierung und AP-1-Repression durch dieselbe Rezeptorspezies reflektieren muss.
  • Klinische Ergebnisse haben bestätigt, dass einige Retinoide zur Hemmung des Wachstums von prämalignen und malignen zervikalen Läsionen von Nutzen sind. Beispielhafte Studien, die diesen Schluss unterstützen, wurden von Graham et al. in West. J. Med. 145: 192 (1086), von Lippman et al. in J. Natl. Cancer Inst. 84: 241 (1992) und von Weiner et al. in Invest. New Drugs 4: 241 (1986)) veröffentlicht.
  • Ähnliche Schlüsse werden durch die Ergebnisse von In-vitro-Studien gestützt, die kultivierte Zellen dazu verwendeten, die antiproliferativen Wirkungen verschiedener Retinoide zu quantifizieren. Insbesondere verwendeten Agarwal et al. in Cancer Res. 51: 3982 (1991) die ECE16-1-Zelllinie, um ein Modell für die frühen Stadien der zervikalen Dysplasie zu etablieren und zeigten, dass Retinsäure eine epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor = EGF)-abhängige zelluläre bzw. Zellproliferation hemmen konnte.
  • Beispiel 17 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität des AGN 191183 Retinoid-Agonisten antagonisieren kann, der die Proliferation der ECE16-1-Zelllinie hemmte.
  • Beispiel 17
  • AGN 193109 antagonisiert die antiproliferative Wirkung von Retinoiden in ECE16-1-Zellen
  • ECE16-1-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro cm2 in vollständigem Medium ausgesät, das DMEM : F12 (3 : 1), nicht-essentielle Aminosäuren, 5% FBS, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM 3,3',5 Triiodthyronin (Schilddrüsenhormon oder "T3"), 0,1 nM Choleratoxin, 2 mM L-Glutamin, 1,8 × 10–4 M Adenin und 10 ng/ml EGF enthielten. Man ließ die Zellen sich über Nacht an den Platten anlagern und wechselte dann zu definiertem Medium, das DMEM : F12 (3 : 1), 2 mM L-Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Rinderserumalbumin, 1,8 × 10–4 M Adenin, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM T3, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 μg/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Gentamicin enthielt. Definiertes Medium (defined medium = DM) wurde mit 10 ng/ml EGF ergänzt. EGF-behandelte Zellen erhielten 10 mM des Retinoid-Agonisten AGN 191183 in Kombination mit entweder 0, 0,1, 1,0, 10, 100 oder 1000 nM AGN 193109 oder 1000 nM AGN 193109 alleine. Nach 3 Tagen der Behandlung wurden die Zellen geerntet, wie von Hembree et al. in Cancer Res. 54: 3160 (1994) beschrieben, und die Zellzahlen wurden unter Verwendung eines COULTER-Counters bestimmt.
  • Die in 15 präsentierten Ergebnisse zeigten, dass ECE16-1-Zellen in Reaktion auf EGF proliferierten, jedoch nicht in definiertem Medium alleine. Dies bestätigte die von Andreattavan Leyen et al. in J. Cell. Physio. 160: 265 (1994) und von Hembree et al. in Cancer Res. 54: 3160 (1994) veröffentlichten Erkenntnisse. Ein Zusatz von 10 mM AGN 191183 und 0 nM AGN 193109 hemmte die EGF-vermittelte Proliferation vollständig. Somit war AGN 191183 ein potentes antiproliferatives Retinoid. Eine Zunahme der AGN-193109-Konzentration von 0 nM auf 10 nM antagonisierte die durch AGN 191183 vermittelte Wachstumshemmung um ungefähr 50%. Ein 10facher molarer Überschuss von AGN 193109 kehrte die antiproliferative Wirkung von AGN 191183 vollständig um. Eine Behandlung von Zellen mit 1000 nM AGN 193109 alleine wies keine Wirkung auf die durch EGF vermittelte Zunahme der Proliferation auf. Diese Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirkung eines Retinoids antagonisierte, jedoch im Wesentlichen keine antiproliferative Aktivität aus sich selbst heraus zeigte, wenn es zur Behandlung von Zellen verwendet wurde, die Zervikalepithel repräsentierten, das gegenüber einer Wachstumshemmung durch Retinoide wie beispielsweise AGN 191183 empfindlich ist. Bemerkenswerterweise existiert kein Beweis dafür, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirksamkeit des AGN-191183-Agonisten unter Verwendung des ECE16-1-Modellsystems verstärkte.
  • Im Gegensatz durch das durch die ECE16-1-Zelllinie repräsentierte Modellsystem existieren weitere Beispiele, bei denen die Zellproliferation, die mit einer zervikalen Dysplasie assoziiert ist, durch Retinoid-Agonisten nicht gehemmt werden kann. Beispielsweise beschrieben Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994) die Verwendung von CaSki-Zellen als ein Modell für Zervikaltumore, die gegenüber einer Retinoid-Therapie nicht ansprechen. Wie nachstehend offenbart, wies eine Retinoid-Behandlung eher als eine Hemmung der Zellproliferation keine Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit von CaSki-Zellen auf. Das nachfolgende Beispiel betrifft die Wirkung des AGN-193109-Negativhormons auf die Proliferationsgeschwindigkeiten dieser Zelllinie. Die Ergebnisse bewiesen unerwarteterweise, dass AGN 193109 die Proliferation von Zervikaltumorzellen, die gegenüber der antiproliferativen Wirkungen von Retinoid-Agonisten nicht ansprechbar sind, hemmen kann.
  • Beispiel 18 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 das Wachstum einer Zervikaltumorzelllinie hemmte, die gegenüber der antiproliferativen Wirkungen anderer Retinoide, wie beispielsweise AGN 191183 nicht ansprechbar waren. Signifikanterweise zeigte AGN 193109 eine antiproliferative Aktivität bei Fehlen von zugesetztem Retinoid.
  • Beispiel 18
  • AGN 193109 hemmt die Proliferationseschwindikeit bzw. -rate einer CaSki-Zervikalkarzinom-abgeleiteten Zelllinie
  • Wir testeten die Wirkung von EGF auf die CaSki-Zellproliferation, entweder alleine oder in Kombination mit dem AGN-191183-Retinoid-Agonisten und/oder dem AGN-193109-negativen Hormon in einer Konzentration von 10–6 M. Zellproliferationsassays wurden wie oben beschrieben für Studien durchgeführt, die ECE16-1-Zellen involvierten. EGF wurde den Retinoid-behandelten Kulturen zugesetzt, so dass sich eine Endkonzentration von 20 ng/ml ergab. Die Zellen wurden mit AGN 191183 (10–10 bis 10–6 M) in Gegenwart oder bei Fehlen von 10–6 M AGN 193109 für insgesamt 3 Tage behandelt. Die Medien wurden durch frische Medien ersetzt und jede der beiden Retinoid-Verbindungen, wie angebracht, jeden Tag. Die Zellzahlen wurden unter Verwendung eines COULTER-Counters wie oben beschrieben bestimmt.
  • Die in 16 präsentierten Ergebnisse zeigten an, dass CaSki-Zellen gegenüber den Wirkungen eines Retinoid-Agonisten beständig waren und dass AGN 193109 in Abwesenheit von zugesetztem Retinoid eine antiproliferative Wirksamkeit zeigte. Die Gegenwart von EGF in den Kulturmedien stimulierte das CaSki-Zellwachstum. Dieser Schluss basierte auf einem Vergleich des gestreiften Balkens, der kein AGN 191183 repräsentiert und des nichtausgefüllten Balkens, der definiertes Wachstumsmedium ("DM") alleine repräsentiert. Eine AGN-191183-Behandlung wies keine antiprotiferative Wirksamkeit auf die CaSki-Tumorzelllinie auf. Wir zogen jede leichte Zunahme der Zellproliferationsgeschwindigkeit, die mit dem Retinoid-Agonisten in Verbindung stand, ab, weil eine 10.000fache Zunahme der Retinoid-Agonisten-Konzentration mit einer nur ungefähr 20%igen Zunahme der Proliferationsgeschwindigkeit verbunden war. Somit wies der Agonist AGN 191183 im Wesentlichen keine Wirkung auf die Proliferationsgeschwindigkeit von CaSki-Zellen auf.
  • Die in 16 präsentierten Ergebnisse zeigen ebenfalls an, dass AGN 193109 eine Proliferation der zervikalen Epithelzelllinie CaSki hemmte. Dieser Schluss basiert auf einem Vergleich der Messungen, die als der schwarze Balken "0" AGN 191183 und der gestreifte Balken "0" AGN 191183 erscheinen. Somit war AGN 193109 dazu in der Lage, eine biologische Reaktion in Abwesenheit von zugesetzten Retinoid-Agonisten zu stimulieren, wenn es dazu verwendet wurde, Zervikaltumorzellen zu behandeln, die durch einen Retinoid-Agonisten, wie beispielsweise AGN 191183, nicht Wachstum-inhibiert waren.
  • Unsere Entdeckung, dass das negative Hormon AGN 193109 die Zellproliferation hemmen könnte, war mit einem Modell konsistent, in dem nicht-Liganden-gebundenes RAR die Expression von Genen vermittelte, die zur Proliferation erforderlich waren. Während ein RAR-Agonist, wie beispielsweise AGN 191183, im Wesentlichen keine Wirkung aufwies oder die Zellproliferation vielleicht leicht förderte, wies AGN 193109 eine antiproliferative Wirkung auf. Das negative Hormon AGN 193109 band wahrscheinlich RARs und förderte dadurch die NCP-Bindung und verursachte, das die RARs eine inaktive Konformation einnahmen. Gemäß unseres Modells unterdrückt dies die Genaktivität, die durch nicht-Liganden-gebundenes RAR positiv reguliert wurde. Diese Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivität von nicht-Liganden-gebundenen RARs nach unten zu regulieren, ergab sich wahrscheinlich aus dessen Fähigkeit, die Bindung von RARs und NCPs zu fördern.
  • Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass einige Retinoid-Agonisten zur Steuerung der unerwünschten Folgen des Zellwachstums von Nutzen sind, die einer Netzhautablösung folgen. Nach einer Netzhautablösung dedifferenziert das Netzhauspigmentepithel (retinal pigment epithelium = RPE), proliferiert und migriert in den subretinalen Raum. Dieser Prozess kann den Erfolg von chirurgischen Verfahren negativ beeinflussen, die eine erneute Befestigung der Netzhaut zum Ziel haben. Campochiaro et al. in Invest. Opthal & vis. Sci. 32: 65 (1991) haben demonstriert, dass RAR-Agonisten, wie beispielsweise ATRA, eine antiproliferative Wirkung auf das Wachstum primärer humaner RPE-Kulturen zeigten. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Retinoid-Agonisten die Inzidenz einer Netzhautablösung im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff zur erneuten Befestigung der Netzhaut senkten (Fekrat et al., Opthamology 102: 412 (1994)). Wie im nachfolgenden Beispiel offenbart, analysierten wir das Vermögen des negativen Hormons AGN 193109, das Wachstum in primären humanen RPE-Kulturen zu unterdrücken.
  • Beispiel 19 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirkung eines Retinoid-Antagonisten in einer Primärkultur von humanem Netzhautpigmentepithel verstärkte.
  • Beispiel 19
  • AGN 193109 verstärkt die antiproliferative Aktivität von ATRA
  • Primäre Kulturen von humanem Netzhautpigmentepithel (RPE) wurden gemäß des von Campochiaro et al. in Invest. Ophthal & Vis. Sci. 32: 65 (1991) beschriebenen Verfahrens etabliert. 5 × 104 Zellen wurden in 16 mm Wells von 24 Well Multiwellplatten in DMEM (Gibco) ausplattiert, das 5% FBS enthielt. Die Zellen wurden mit Ethanolträger alleine, ATRA (10–10 bis 10–6 M) in Ethanol, AGN 193109 (10–10 bis 10–6 M) in Ethanol oder ATRA (10–10 bis 10–6 M) und 10–6 M AGN 193109 Pseudo-behandelt. Den Zellen wurden alle 2 Tage für insgesamt 5 Tage der Behandlung frische Medien zugeführt, die die geeigneten Konzentrationen dieser Verbindungen enthielten. Die Zellen wurden von den Platten durch sanften Verdau mit Trypsin entfernt und die Anzahl der Zellen wurde mit einem elektronischen Zellzähler gezählt.
  • Die in 17 präsentierten Ergebnisse zeigten an, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von ATRA auf RPE-Zellen dramatisch verstärkte. Eine Behandlung von primären RPE-Zellen mit ATRA führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der RPE-Zellproliferation mit einer ungefähr 40%igen Abnahme bei 10–6 M ATRA bezüglich Kontrollkulturen. Eine AGN-193109-Behandlung veränderte die Wachstumsgeschwindigkeit der RPE-Zellen in jedem im Verfahren getesteten Konzentration nicht wesentlich. Unerwarteterweise wies die Kombination von ATRA (10–11 bis 10–6 M) und 10–6 M AGN 193109 eine stärkere antiproliferative Aktivität als ATRA alleine auf. Somit verstärkte die gleichzeitige Behandlung mit AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von ATRA. Insbesondere zeigten die in der Figur dargestellten Ergebnisse, dass die antiproliferative Wirkung von 10–8 M ATRA unter Verwendung von nur 10–10 M ATRA in Kombination mit 10–7 M AGN 193109 erzielbar war. Somit erhöhte das negative Hormon AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von ATRA in vorteilhafter Weise um das ungefähr 100fache.
  • In einem unabhängigen Experiment zeigte ein Vergleich der antiproliferativen Wirkung von ATRA (10–11 bis 10–6 M) mit derjenigen von ATRA und 10–6 M AGN 193109 die offensichtliche Zunahme der Empfindlichkeit von primären RPE-Zellen gegenüber ATRA in Gegenwart von AGN 193109. In diesem System funktionierte AGN 193109 weder als Retinoid-Antagonist noch zeigte es eine antiproliferative Wirkung, wenn es alleine verwendet wurde. Jedoch verstärkte eine gleichzeitige Verabreichung von AGN 193109 die antiproliferative Wirksamkeit des Retinoid-Antagonisten.
  • AGN 193109 wurde auf dessen Fähigkeit getestet, die antiproliferative Wirkung von 13-cis Retinsäure (13-cis RA) in primären RPE-Kulturen unter Verwendung von Bedingungen und Techniken zur Messung einer RPE-Zellproliferation zu verstärken, die oben beschrieben wurden. Bemerkenswerterweise ist 13-cis RA klinisch signifikant. Insbesondere ist 13-cis RA bei der Behandlung mehrerer Erkrankungszustände von Nutzen, einschließlich der Akne (Peck et al., N. Engl. J. Med. 300: 329 (1977); Jones et al., Br. J. Dermatol, 108: 333 (1980)) und Plattenepithelkarzinom der Haut und Zervix in Kombinationsbehandlung mit Interferon 2a (Lippman et al., J. Natl. Cancer Irrst. 84: 231 (1992); Moore et al., Seminars in Hematology 31: 31 (1994)).
  • Die in 18 präsentierten Ergebnisse zeigten an, dass sowohl 13-cis RA (10– 12 bis 10–6 M) als auch ATRA (10–12 bis 10–6 M) das RPE-Zellwachstum effektiv hemmten. Bemerkenswerterweise war das 13-cis Isomer ungefähr um 2 Größenordnungen weniger wirksam in diesem Assay, wenn es mit ATRA verglichen wurde. Ähnlich den Ergebnissen, die unter Verwendung einer Koadministration von AGN 193109 und ATRA (s. o.) gewonnen wurden, erhöhte eine Koadministration von AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–6 M) mit 13-cis RA (10–12 bis 10–6 M) die Wirksamkeit von 13-cis RA in der Vermittlung einer Unterdrückung einer RPE-Zellproliferation dramatisch. Im Gegensatz zur Behandlung mit 13-cis RA alleine erhöhte eine Koadministration von AGN 193109 die Wirksamkeit von 13-cis RA. Somit potenzierte AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis RA.
  • Wir testeten als nächstes die Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivitäten anderer Kernrezeptorhormone in primären RPE-Zellkulturen zu verstärken. Dexamethason, ein synthetischer Glucocorticoid-Rezeptoragonist, ist ein Mitglied einer Klasse von Verbindungen, die wegen ihrer wirksamen antünflammatorischen und immunsuppressiven Eigenschaften klinisch verwendet wurden. Schilddrüsenhormon (T3; 3,3',5'-Trüodthyronin) ist ein natürlicher Schilddrüsenhormonrezeptoragonist, der in erster Linie als Hormonersatztherapie in der Behandlung des Hypothyroidismus verwendet wurde. Verfahren, die in diesen Experimenten verwendet werden, waren mit denjenigen identisch, die oben für Verfahren beschrieben wurde, die ATRA und 13-cis RA verwendeten.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten an, dass eine Koadministration von AGN 193109 und der Kernrezeptoragonisten die antiproliferativen Aktivitäten der Kernrezeptoragonisten verstärkten. Insbesondere zeigten die in 19 präsentierten Ergebnisse, dass eine Behandlung von RPE-Zellen mit einem Wirkstoff mit entweder Dexamethason (10–11 bis 10–6 M) oder ATRA (10–12 bis 10–6) im Wesentlichen nicht dazu in der Lage war, eine RPE-Zellproliferation zu hemmen. Jedoch unterdrückte eine Behandlung von RPE-Zellen mit Dexamethason (10–11 bis 10–6 M) und entweder 10–8 oder 10–6 M AGN 193109 die RPE-Zellproliferation in einem Ausmaß, das der durch Behandlung mit ATRA verursachten Hemmung nahekam. In ähnlicher Weise zeigten die in 20 präsentierten Ergebnisse an, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Schilddrüsenhormon verstärkte. Ähnlich den unter Verwendung von Dexamethason erzielten Ergebnissen war die Proliferation von RPE-Zellen gegenüber einer Ein-Wirkstoff-Behandlung mit Schilddrüsenhormon (10"" bis 10–6 M) beständig. Jedoch hemmte eine gleichzeitige Behandlung von RPE-Zellen mit Schilddrüsenhormon (10–11 bis 10–6 M) und AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–6 M) die RPE-Zellproliferation in einer Schilddrüsenhormon-abhängigen Weise. Wir schlossen, dass AGN 193109 primäre RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen dieser Kernrezeptoragonisten empfindlich machte. Der Mechanismus, durch den AGN 193109 diese Wirkungen vermittelte, involvierte wahrscheinlich eine Modulation von NCPIRAR-Wechselwirkungen.
  • Wir überprüften zusätzlich die Wirkung von AGN 193109 auf die Expression von Markergenen in anderen experimentellen Systemen, die gegenüber Retinoid-Agonisten empfindlich waren. Es ist bekannt, dass sowohl die MRP8- als auch Stromelysin-Gene durch Retinoid-Agonisten in einer Vielzahl von biologischen Systemen gehemmt werden. Beispielsweise haben Wilkinson et al. in J. Cell Sci. 91: 221 (1988) und Madsen et al. in J. Invest. Dermatol. 99: 299 (1992) offenbart, dass eine MRP8-Genexpression bei der Psoriasis erhöht wurde. Umgekehrt wurde eine MRP8-Genexpression durch den Retinoid-Agonisten AGN 190168 in humaner psoriatischer Haut unterdrückt (Nagpal et al, eingereicht 1995), in humanen Keratinocyten-Transplantatkulturen (Chandraratna et al., J. Invest. Dermatol. 102: 825 (1994)) und in kultivierten humanen Neugeborenen-Vorhaut-Keratinocyten (Thacher et al., J. Invest. Dermatol, 104: 594 (1995)). Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) haben offenbart, dass Stromelysin mRNA-Konzentrationen durch Retinoid-Agonisten wie beispielsweise AGN 190168 in kultivierten humanen Neugeborenen Vorhaut-Keratinocyten unterdrückt wurden. Wir untersuchten die regulierte Expression dieser Gene im Anschluss an eine Behandlung kultivierter humaner Neugeborenen Vorhaut-Keratinocyten mit entweder dem AGN-191183-Retinoid-Agonisten oder AGN 193109.
  • Beispiel 20 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 die MRP-8-Expression in kultivierten Keratinocyten hemmte.
  • Beispiel 20
  • AGN 193109 hemmt die MRP-8-Expression in Keratinocyten
  • Primäre Vorhaut-Keratinocyten wurden gemäß des von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschriebenen Verfahrens isoliert und in Keracyten-Wachstumsmedium (KGM) kultiviert, das von Clonetics bezogen wurde. Nach 3 Tagen Behandlung mit AGN 191183 (10–7 M) oder AGN 193109 (10–6 M) wurde Gesamtzell-RNA aus behandelten und Kontroll-Keratinocyten gemäß Standardverfahren isoliert. Die mRNA wurde in cDNA rücktranskribiert, die dann als Matrize in einem PCR-Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von Primern diente, die für entweder das Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-Housekeeping-Gen oder MRP-8 spezifisch waren. Die GAPDH-Primer wiesen die Sequenzen 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (SEQ ID NO: 6) and 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' (SEQ ID NO: 7) auf. Die MRP-8-Primer wiesen die Sequenzen 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3' (SEQ ID NO: 8) and 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3' (SEQ ID NO: 9) auf. Eine Teilmenge aus der MRP-8-Amplifikationsreaktion (10 μl) wurde nach jedem Zyklus einer PCR-Amplifikation startend bei 12 Zyklen und endend bei 21 Zyklen entfernt. In ähnlicher Weise wurde eine Teilmenge der GAPDH-Amplifikationsreaktion nach jedem PCR-Zyklus bzw. Umlauf entfernt, startend bei 15 Zyklen und endend bei 24 Zyklen. Die Proben wurden auf 2% Agarose-Gelen elektrophoretisiert und die getrennten Amplifikationsprodukte wurden durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen. Die Färbungsintensität der Amplifikationsprodukte diente als quantitative Messung der Menge von Start-mRNA, die für den vorgegebenen Primersatz spezifisch war.
  • Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten an, dass sowohl AGN 191183 als auch AGN 193109 unabhängig die MRP-8-Expression in Keratinocyten hemmten. Die Intensität des gefärbten GAPDH-Amplifikationsproduktes war im Wesentlichen in den Bahnen des Gels äquivalent, die Ausgangsmaterial repräsentierten, isoliert aus Kontrolle, AGN 191183 und AGN 193109 behandelten Keratinocyten. Schwache Banden, die das GAPDH-Amplifikationsprodukt repräsentierten, wurden zuerst in Bahnen nachgewiesen, die den nach 18 Umläufen PCR-Amplifikation entfernten Proben entsprachen. Die äquivalenten Färbungsintensitäten unter den verschiedenen Bahnen des Gels zeigten an, das äquivalente Massen an Ausgangsmaterial für alle Proben verwendet wurden. Demgemäß zeigten Unterschiede der Intensitäten gefärbter Banden, die MRP-8-Amplifikationsprodukte repräsentieren, die Unterschiede der MRP-8-mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Ausgangsproben an. Wie erwartet, wurde das MRP-8-amplifizierte Signal in AGN 191183 (10–7 M) behandelten Kulturen bezüglich einer unbehandelten Kontrolle gehemmt. AGN-193109 (10–6 M)-Behandlung kultivierter Keratinocyten unterdrückte die MRP-8-Expression ebenfalls, wie es durch eine geringere Intensität gefärbter Amplifikationsprodukte beurteilt wurde.
  • Wie im nachfolgenden Beispiel veranschaulicht ist, hemmte AGN 193109 ebenfalls die Expression eines zweiten Markergens in Keratinocyten. Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) offenbarten, dass eine Stromelysin-mRNA-Expression durch RAR-spezifische Agonisten in kultivierten Neugeborenen humanen Vorhaut-Keratinocyten reguliert wurde. Nicholson et al. (EMBO J. 9: 4443 (1990)) offenbarten, dass ein AP-1-Promotorelement eine Rolle in der Retinoid-abhängigen Negativregulation des Stromelysin-1-Gens spielte. Es war somit von Interesse zu bestimmen, ob AGN 193109 die Expression dieses Gens verändern konnte.
  • Beispiel 21 beschreibt die Verfahren, die dazu verwendet wurden, zu demonstrieren, dass AGN 193109 eine Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit von exogen zugesetzten Retinoid-Agonisten hemmte.
  • Beispiel 21
  • AGN 193109 hemmt die Stromelysin-1-Expression in kultivierten Keratinocyten
  • sPrimäre Vorhaut-Keratinocyten wurden entweder Pseudo-behandelt oder für 24 Stunden mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 (10–7 M) oder AGN 193109 (10–6 M) behandelt. Die aus scheinbehandelten und Retinoid-behandelten Keratinocyten hergestellte bzw. präparierte Gesamt-RNA wurde rücktranskribiert und die sich ergebende cDNA wurde unter Verwendung von β-Actin- oder Stromelysin-1-Oligoprimern exakt wie von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995)) beschrieben durch PCR amplifiziert. Eine Probe (10 μl) aus der PCR-Amplifikationsreaktion wurde nach 3 Zyklen entfernt, startend von 18 Zyklen der PCR-Amplifikation. Die Probe wurde auf einem 2%-Agarosegel elektrophoretisiert und nach Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen.
  • Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigten an, dass AGN 193109 die Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit eines exogen zugesetzten Retinoid-Agonisten hemmte. Insbesondere waren Ethidium-gefärbte Banden, die β-Actin-Amplifikationsprodukte repräsentierten, auf den Agarose-Gels nach 18 Umläufen der PCR leicht nachweisbar. Während alle Bandenintensitäten mit zusätzlichen Amplifikationsreaktionszyklen zunahmen, waren gefärbte Banden ein wenig weniger intensiv bei den Proben, die AGN 191183 behandelte Zellen repräsentieren. Dies zeigt an; das eine gering niedrigere Menge an RNA in den Ausgangsproben vorgelegen sein musste, die den mit AGN 191183 behandelten Zellen entsprachen. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls an, dass Stromelysin-1-mRNA in scheinbehandelten Keratinocyten nachweisbar war, startend bei 33 Zyklen einer PCR-Amplifikation. Wie erwartet wurden Stromelysin-1-mRNA-Expression nach AGN-191183 (10–7 M)-Behandlung gehemmt, wie durch die schwächere Bandenintensität auf den Gels beurteilt wurde, wenn diese mit Proben verglichen wurden, die von scheinbehandelten Proben gewonnen wurden. Wenn sie mit den Intensitäten der β-Actin-Amplifikationsprodukte normalisiert wurde und mit den bei den Messungen einer MRP-8-Expression erzielten Ergebnissen konsistent, hatte eine AGN-193109 (10–6 M)-Behandlung von Keratinocyten eine Nach-unten-Regulation der Stromelysin-1-inRNA-Niveaus zur Folge. Tatsächlich war die Nach-unten-Regulation, die durch eine AGN-193109-Behandlung stimuliert wurde, von der durch eine Behandlung mit Keratinocyten mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 verursachten Nach-unten-Regulation nicht unterscheidbar.
  • Wie hierin offenbart, kann AGN 193109 einen von drei möglichen Effekten bezüglich der Modulierung der Aktivität eines gleichzeitig verabreichten Steroid-Superfamilienagonisten aufweisen. Zuerst kann AGN 193109 keine Wirkung haben. Zweitens kann AGN 193109 die Wirkung des Agonisten antagonisieren, und dadurch zu einer Abnahme der Aktivität des Agonisten führen. Zuletzt kann AGN 193109 die Aktivität des Agonisten verstärken, und dadurch zu einer Stimulation der gemessenen Wirkung führen, die durch den Agonisten erzeugt wird.
  • Verbindungen mit Aktivitäten, die durch AGN 193109 moduliert werden können, schließen Retinoid-Rezeptoragonisten und Agonisten ein, die an andere Mitglieder der Steroid-Rezeptor-Superfamilie binden. Diese letztere Kategorie von Agonisten schließt Vitamin-D-Rezeptoragonisten, Glucocorticoid-Rezeptoragonisten und Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonisten ein. Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren, Östrogen-Rezeptor und Orphan-Rezeptoren mit gegenwärtig unbekannten Liganden können ebenfalls durch AGN 193109 verstärkt werden. In dem Fall, in dem der Agonist der Steroid-Superfamilie ein RAR-Agonist ist, kann AGN 193109 entweder die Wirksamkeit des Agonisten antagonisieren oder verstärken. In dem Fall, in dem der Agonist, der in Kombination mit AGN 193109 verwendet wird, eine Verbindung ist, die an einen anderen Kernrezeptor als RAR binden kann, wird eine Koadministration von AGN 193109 entweder keine Wirkung haben oder wird das System gegenüber dem Agonisten empfindlich machen, so dass die Aktivität des Agonisten verstärkt wird.
  • Ein verallgemeinertes beispielhaftes Verfahren zur Bestimmung, welche der drei möglichen Aktivitäten AGN 193109 in einem speziellen System haben wird, folgt. Diese Beschreibung veranschaulicht jeden der drei Outcomes für die AGN-193109-Koadministration mit einem Agonisten der Steroid-Rezeptor-Superfamilie. Biologische Systeme, die zur Bestimmung der Fähigkeit von AGN 193109 von Nutzen sind, um die Aktivität eines Kernrezeptor-Agonisten zu modulieren, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: etablierte Gewebskulturzelllinien, viral transformierte Zelllinien, Ex-vivo-Primärkulturzellen und Invivo-Studien, die lebende Organismen verwenden. Eine Messung der biologischen Wirkung von AGN 193109 in solchen Systemen könnte eine Bestimmung jeder einer Vielzahl von biologischen Endpunkten einschließen. Diese Endpunkte schließen ein: eine Analyse der Zellproliferation, eine Analyse des programmierten Zelltodes (Apoptose), eine Analyse des Differenzierungszustands von Zellen über Genexpressions-Assays, eine Analyse der Fähigkeit der Zellen, Tumore in nackten Mäusen (nude mice) zu bilden und eine Analyse der Genexpression nach vorübergehender oder stabiler Einbringung von Reportergenkonstrukten.
  • Für illustrative Zwecke wird eine mRNA-Spezies, die als mRNA "X" bezeichnet wird, aus einem Gen "X" in primär kultivierten "Y"-Zellen exprimiert, die aus dem Organ "Z" isoliert wurden. Unter Standardkulturbedingungen, in denen mehrere "Y"-Zellgenmarker erhalten bleiben, einschließlich der Expression von Gen "X", führt der Zusatz eines Retinoid-Agonisten zu einer Abnahme der Häufigkeit von "X" mRNA. Eine Analyse der Gen-X-Expression kann über eine Isolation zellulärer mRNA und eine Messung der Häufigkeit der „X" mRNA-Konzentrationen über ein Polymerase-Kettenreaktion, Ribonuclease-Schutz oder RNA-Blotting-Verfahren wie beispielsweise Northern Analysen festgestellt werden. Nach Isolation aus dem Organ Z werden primäre Y-Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert. Die primären Zellen werden dann in Gewebskulturplatten zur Expansion der Zellpopulation ausplattiert. Dieser Schritt erleichtert die Trennung der Zellen in vier Probengruppen, so dass verschiedene Dosen des Retinoid-Agonisten und AGN 193109 geliefert werden können. Die erste Gruppe wird eine Kontrolle sein, die nur Trägerstoff aufnimmt. Die zweite Gruppe wird den RAR-Agonisten, Retinsäure, empfangen, abgegeben in Ethanol, in Mengen, die ausreichend sind, um Endkonzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M bereitzustellen. Die niedrigste Dosis muss abhängig von der Empfindlichkeit des Systems empirisch bestimmt werden. Solche Bestimmungen fallen in den Umfang von Routineexperimenten für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet. Die dritte Gruppe wird sowohl den Kernrezeptoragonisten in denselben Dosen, die zur Behandlung der Zellen von Gruppe 2 verwendet wurden, und eine konstante Dosis von AGN 193109 empfangen. Die Dosis von AGN 193109, die zur Behandlung der Zellen von Gruppe 3 verwendet wird, muss ebenfalls empirisch bestimmt werden, sollte sich jedoch der Affinitätskonstante (Kd) von AGN 193109 für die RAR-Subtypen (d. h. zumindest 10–8 M) annähern. Die vierte Gruppe wird AGN 193109 in Dosen empfangen, die minimal diejenige einschließen, die zur Agonistenkoadministration in Gruppe 3 verwendet wurde. Eine Alternative für diese Dosierungsvorschrift würde den Retinoid-Agonisten, beschrieben im vorhergehenden Beispiel, durch AGN 193109 ersetzen, wie in Gruppe 2 spezifiziert, und eine konstante Dosis an Retinoid-Agonisten anstelle von AGN 193109, wie in Gruppe 3 und 4 spezifiziert ist. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode sollten die Zellen in einer Weise geerntet werden, die zur Bestimmung des biologischen Endpunktes, der als ein Indikator der Agonistenaktivität gemessen wird, geeignet ist.
  • Beispielsweise würde eine Analyse der Wirkung von AGN 193109 auf die Retinsäureabhängige Regulation der Genexpression einen Vergleich der Häufigkeit der mRNA-Spezies X im mRNA-Pool, geerntet aus Zellen, die gemäß jeder der vier Vorschriften, oben beschrieben, behandelt wurden, einschließen. RNA, die von Kontrollzellen abgeleitet ist, wird dazu dienen, die Grundlinienexpression von X mRNA zu bestimmen und repräsentiert einen Zustand, der keiner Unterdrückung entspricht. Ein Vergleich dieser Konzentration bzw. dieses Niveaus mit denjenigen, das im mRNA-Pool gemessen wird, der von mit Retinsäure behandelten Zellen gewonnen wird, ermöglicht die Bestimmung der Wirkung dieses Antagonisten auf die Genexpression. Die quantifizierten Konzentrationen der Unterdrückung spezifischer mRNAs, die sich aus einer Retinsäurebehandlung ergeben, kann dann mit den mRNA-Häufigkeiten aus Zellen verglichen werden, die parallel entweder mit AGN 193109 alleine oder mit AGN 193109 in Kombination mit Retinsäure behandelt wurden. Während dieses verallgemeinerte Beispiel eine Analyse der Wirkung von gleichzeitig verabreichtem AGN 193109 auf die Expression eines Genes veranschaulicht, das durch einen Retinoid-Agonisten unterdrückt wurde, könnte das Beispiel alternativ eine Analyse der Wirkung von koadministriertem AGN 193109 auf ein Gen beschreiben, das durch einen Retinoid-Agonisten induziert wurde. Das entscheidende Merkmal zur Bestimmung, ob sich AGN 193109 als ein Agonist, als ein negatives Hormon verhält oder keine Auswirkung in einem speziellen System hat, wird einen quantitativen Vergleich der Größenordnung der Wirkung in Gegenwart und Abwesenheit von AGN 193109 einschließen.
  • Ein Beispiel, bei dem AGN 193109 die Aktivität von gleichzeitig verabreichten Agonisten verstärkte, würde ein Fall sein, in dem eine AGN-193109-Ko-Behandlung mit Retinsäure ein Niveau einer X-mRNA-Expression zur Folge hätte, das bezüglich dem Niveau weiter unterdrückt ist, das in mit Retinsäure alleine behandelten Zellen gemessen wird. Insbesondere würde ein Vergleich der Dosiswirkungskurve der biologischen Wirkung (d. h. der Unterdrückung der X-mRNA-Häufigkeit), geplottet auf der Y-Achse gegen die Dosis des Agonisten (logarithmische Skalierung) auf der X-Achse einen Vergleich der Agonistenvermittelten Unterdrückung der X-mRNA-Häufigkeit in Gegenwart und bei Fehlen einer AGN 193109 Ko-Behandlung ermöglichen. Die Fähigkeit von AGN 193109, die biologische Reaktion gegenüber dem Agonisten empfindlich zu machen und dadurch die Aktivität des Agonisten zu verstärken, wird durch eine Nach-links-Verschiebung in der Dosiswirkungskurve angezeigt. Genauer gesagt, würde in Gegenwart von AGN 193109 weniger Agonist erforderlich sein, um dieselbe biologische Wirkung zu erzielen, die unter Verwendung des Agonisten alleine erzielbar ist.
  • Ein Beispiel für einen AGN 193109 vermittelnden Antagonismus eines gleichzeitig verabreichten Agonisten wäre ein Fall, in dem eine AGN 193109 Ko-Behandlung mit Retinsäure ein Niveau einer X-mRNA-Expression zur Folge hätte, das im Vergleich zu demjenigen, das in mit Retinsäure alleine behandelten Zellen gemessen wird, weniger unterdrückt ist. Ein Vergleich der Dosiswirkungskurven einer X-mRNA-Unterdrückung gegen die Log-Dosis des Agonisten in Gegenwart und bei Fehlen von AGN 193109 wird eine Verschiebung der Dosiswirkungskurve nach rechts zeigen. Genauer gesagt, wird in Gegenwart von AGN 193109 mehr Agonist notwendig sein, um dieselbe biologische Wirkung zu erzielen, die mit einer Ein-Wirkstoff-Behandlung mit dem Agonisten alleine erzielbar ist.
  • Die obigen Beispiele, bei denen AGN 193109 entweder einen Antagonismus oder eine Verstärkung vermittelt, beschreiben experimentelle Ergebnisse für die gleichzeitige Verabreichung von AGN 193109 mit einem Retinoid-Agonisten. Falls jedoch der mit AGN 193109 gleichzeitig verabreichte Agonist ein Agonist ist, der zur Bindung und Aktivierung eines anderen Mitglieds der Steroid-Rezeptor-Superfamilie als RAR in der Lage ist, dann wird es anstelle einer Antagonisierung des Agonisten möglich sein, dass AGN 193109 keine Wirkung auf die Aktivität des Agonisten aufweisen würde. Falls eine Ko-Behandlung von AGN 193109 mit einem solchen Agonisten ein Niveau einer mRNA-Expression mit sich bringt, das zu der in mit Agonisten alleine behandelten Zellen gemessenen Expression gleich ist, dann wird die Fähigkeit der AGN 193109, die Verfügbarkeit von NCPS über eine Förderung der RAR : NCP-Bindungen in diesem System zu beeinträchtigen, nicht in Erscheinung treten. Dies wäre ein Beispiel, bei dem AGN 193109 auf einen ko-verabreichten Agonisten keine Wirkung aufweist.
  • Beispiel für einen Antagonismus
  • Das im obigen verallgemeinerten Beispiel offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Wirkung eines AGN 193109, das mit einem Retinoid-Agonisten ko-verabreicht wird, wird durch das unter Beispiel 7 beschriebene Verfahren beispielhaft dargelegt. CV-1-Zellen, die mit einem der drei Retinsäure-Rezeptoren und dem Retinoid-Agonisten-induzierbaren MTV-TREp-Luc-Reporterkonstrukt kotransfiziert wurden, wurden mit entweder Ethanol (Kontrolle, Gruppe 1), AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10–9 bis 10–6 M (Gruppe 2), AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10–9 bis 10–6 M, ko-verabreicht mit Retinsäure zu 10–8 M (Gruppe 3), oder Retinsäure (10–8 M, Gruppe 4) dosiert. Ein Vergleich der Luciferase-Aktivität von Gruppe 1 mit derjenigen der Gruppe 4 ermöglichte eine Bestimmung des Niveaus einer Retinoid-Agonisten-induzierten Expression des Luciferase-Reportergens bei Fehlen von zugesetztem AGN 193109. Ein Vergleich der Luciferase-Reportergen-Expression in Zellen der Gruppe 3 mit derjenigen, die in Zellen der Gruppe 4 gemessen wurde, zeigte an, dass AGN 193109 sich in diesem System als ein Antagonist des Retinoid-Agonisten verhielt.
  • Beispiel für einen Antagonismus
  • Das im verallgemeinerten Beispiel zur Bestinmung der Wirkung von AGN 193109 offenbarte Verfahren, das mit einem Retinoid-Agonisten ko-verabreicht wurde, wurde ähnlich dazu verwendet, in Beispiel 17 zu bestimmen, dass AGN 193109 als Antagonist einer Retinoid-Agonisten-vermittelten Unterdrückung der EGF-stimulierten Zellproliferation in ECE-16-1-transformierten Cervicalepithelzellen diente. In diesem Verfahren schlossen Behandlungen von ECE-16-1-Zellen eine Kontrollprobe ein, die mit EGF alleine (Gruppe 1) behandelt wurde, eine Probe, die mit der Kombination aus EGF und AGN 193109 in einer Endkonzentration von 10–6 M (Gruppe 2) behandelt wurden, eine Probe ein, die mit der Kombination aus EGF und AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M behandelt wurde, ko-verabreicht mit einer Einfachdosis des Retinoid-Agonisten AGN 191183 zu 10–8 M (Gruppe 3) und eine Probe ein, die mit der Kombination aus EGF und AGN 191183 zu 10–8 M (Gruppe 4) behandelt wurden. Nach 3 Tagen Behandlung wurden die Zellproliferationsrate bzw. -geschwindigkeit bestimmt. Die Bestimmung, dass die Zellen zur Proliferation durch EGF simuliert wurden, war möglich, weil eine zusätzliche Kontrollbehandlung eingeschlossen wurde, bei der die Zellen gegenüber definiertem Medium exponiert wurden, das kein EGF enthielt. Ein Vergleich der Anzahl von Zellen in Gruppe 1 mit der Anzahl von Zellen in Gruppe 4 ermöglichte die Bestimmung, dass der RAR-Agonist AGN 191183 die EGF-stimulierte Proliferation von ECE-16-1-Zellen unterdrückte. Ein Vergleich der Gruppe 3 mit Gruppe 4 zeigte an, dass AGN 193109 die Aktivität des RAR-Agonisten in diesem System antagonisierte.
  • Beispiel der Verstärkung
  • Das im verallgemeinerten Beispiel offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoid-Agonisten ko-verabreicht wurde, wurde ebenfalls in Beispiel 14 dazu verwendet, zu bestimmen, dass AGN 193109 die Aktivität eines Kernrezeptoragonisten in HeLa-Zellen potenzierte, die mit dem 1,25-Dihydroxyvitamin D3 induzierbaren MTV-VDRE-Luc-Reportergen transfiziert wurden. Behandlungen transfizierter Zellen schlossen Träger alleine (Kontrolle, Gruppe 1), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–7 M (Gruppe 2), 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–7, ko-verabreicht mit AGN 193109 in einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M (Gruppe 3) und AGN 193109 als Einzel-Wirkstoffbehandlung in einer Endkonzentration von entweder 10–8 oder 10–7 M (Gruppe 4) ein. Ein Vergleich der Luciferase-Aktivität, gemessen in Gruppe-1 (Kontroll)-Zellen mit derjenigen der Gruppe-2-Zellen ermöglichte die Bestimmung, dass die 1,25-Dihydroxyvitamin D3 stimulierte Luciferase-Aktivität dosisabhängig war. Ein Vergleich der Luciferase-Aktivität, die in Zellen der Gruppe 4 (AGN 193109 Einfach-Wirkstoffbehandlung) gemessen wurde mit derjenigen, die in den Zellen der Gruppe 3 (AGN 193109 Ko-Verabreichung) gemessen wurde, erlaubte in ähnlicher Weise die Bestimmung der dosisabhängigen 1,25-Dihydroxyvitamin D3-stimulierten Luciferase-Aktivität in Gegenwart einer vorgegebenen Konzentration an AGN 193109. In diesem Fall repräsentiert der Nullwert die Luciferase-Aktivität in Zellen, die mit AGN 193109 alleine (Gruppe 4) behandelt wurden. Eine solche Dosierungsvorschrift ermöglichte den Vergleich von 3 1,25-Dihydroxyvitamin D3-Dosiswirkungskurven. Ein Vergleich der Dosiswirkungskurve von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 bei Fehlen von AGN 193109 mit der Kurve, die die Ko-Verabreichung von AGN 193109 (entweder 10–8 oder 10–7 M) darstellt, demonstrierte die Verstärkung der Agonistenaktivität, wie sie durch eine Nach-links-Verschiebung in der halbmaximalen Reaktion unter Beweis gestellt wurde.
  • Beispiel für eine Verstärkung
  • Das im verallgemeinerten Beispiel offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, das mit einem Retinoid-Agonisten ko-verabreicht wurde, wurde weiterhin dazu verwendet, in Beispiel 19 zu bestimmen, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität eines RAR-Agonisten in primären Kulturen von humanen Retinalpigmentepithelzellen verstärkte. Die Behandlungen der Zellen schlossen ein: Ethanolträger alleine (Gruppe 1), Retinsäure in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M (Gruppe 2), Retinsäure in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M, ko-verabreicht mit 10–6 M AGN 193109 (Gruppe 3) und AGN 193109 alleine in Endkonzentrationen von 10–10 bis 10–6 M (Gruppe 4). Ein Vergleich der Assay-Ergebnisse, die unter Verwendung von Zellen der Gruppe 1 und 2 erzielt wurden, ermöglichte die Bestimmung der dosisabhängigen Hemmung der Proliferation dieser Zellen durch Retinsäure. In ähnlicher Weise ermöglichte ein Vergleich der unter Verwendung der Zellen von Gruppe 3 mit denjenigen von Gruppe 1 erzielten Ergebnissen eine Bestimmung der dosisabhängigen Hemmung der Proliferation dieser Zellen durch Retinsäure in Gegenwart von ko-verabreichtem AGN 193109. Gruppe 4 zeigte das Unvermögen von AGN 193109, die Proliferationsgeschwindigkeit dieser Zellen wesentlich zu verändern, wenn es als Einzelbehandlungs-Wirkstoff verwendet wurde. Ein Vergleich der Dosiswirkungskurven der Retinsäure-vermittelten Unterdrückung der Zellproliferation, die in den Gruppen 2 und 3 erzeugt wurde, stellte die Basis für den Schluss bereit, das AGN 193109 primäre RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen des RAR-Agonisten empfindlich machte, wodurch die Aktivität des RAR-Agonisten verstärkt wurde.
  • Wie oben angezeigt, zeigten Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994), dass das CaSki-Zellwachstum anders als das Wachstum von HPV-immortalisierten ECE-16-1-Zellen durch Behandlung mit Retinoid-Agonisten nicht gehemmt wurde. Wie hierin offenbart, haben wir unerwarteterweise herausgefunden, dass das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit eines Retinoid-Agonisten gehemmt wurde. Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht, wie AGN 193109 zur Hemmung des Wachstums von CaSki-Zelltumoren in vivo verwendet werden kann.
  • Beispiel 22
  • Die Hemmung des CaSki-Zelltumorwachstums in nackten Mäusen im Anschluss an eine Verabreichung von AGN 193109
  • 1 × 106 CaSki-Zellen wurden in jeder einer Gruppe von nackten Mäusen injiziert. Die Tumorbildung wird unter Verwendung von Techniken bestimmt, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet vertraut sind. Nach der Injektion werden die Mäuse zufallsbedingt in Kontroll- und Testgruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe empfängt einen Placebo. Der Testgruppe wird AGN 193109 verabreicht. Tiere, denen der Placebo verabreicht wurde, empfangen eine intragastrische Intubation von Maisöl. Die Testtiere empfangen 20 μMol/kg AGN 193109 in Maisöl täglich für die Zeitspanne der Behandlung. Das Tumorvolumen wird in Kubikmillilitern unter Verwendung von graduierten Tastleeren gemessen. Das Tumorvolumen wird als eine Funktion der Zeit geplottet. Mäuse, die AGN 193109 empfingen, zeigen Tumore, die in ihrer Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zu Tumoren in Kontrollmäusen signifikant reduziert sind, wie es durch die Tumorgröße und die Anzahl über die Zeitspanne der Studie hinweg beurteilt wurde. Dieses Ergebnis stellt einen in-vivo-Beweis dar, dass AGN 193109 das Wachstum von fortgeschrittenen Zervikalkarzinomen hemmt, die gegenüber einer Therapie resistent sind, die eine Verabreichung eines Retinoid-Agonisten umfasst.
  • Wie oben angezeigt, sind CaSki-Zellen ein Modell von Zervikaltumoren, die auf eine Therapie mit einem Retinoid-Agonisten nicht ansprechen. Wir haben jedoch hierin offenbart, dass das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit einer Behandlung mit einem Retinoid-Agonisten gehemmt wurde. Die Fähigkeit von AGN 193109, die Proliferation von CaSki-Zellen zu hemmen legt nahe, dass AGN 193109 dazu verwendet werden könnte, Zervikalkarzinome therapeutisch zu behandeln, die gegenüber einer Therapie durch Retinoid-Agonisten unempfindlich sind. Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, das dazu verwendet werden kann, das therapeutische Potential von AGN 193109 in der Behandlung eines Zervikalkarzinoms zu beurteilen.
  • Beispiel 23
  • Beurteilung des therapeutischen Potentials von AGN 193109 bei Patienten mit Zervikalkarzinom
  • Ein Patient, der ein fortgeschrittenes Zervikalkarzinom zeigt, wird zunächst identifiziert. Eine Zervikalbiopsie wird gemäß Verfahren gewonnen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet vertraut sind. Zellen aus dem explantierten Tumor werden in Gewebskultur gemäß Standardtechniken vermehrt, um Zellzahlen bereitzustellen, die ausreichend sind, um eine Teilung in drei Probengruppen zu ermöglichen. Die von Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994) beschriebenen Bedingungen werden für diesen Zweck verwendet. Die erste Gruppe ist als eine Kontrolle reserviert und enthält alleine Träger (Ethanol). Die zweite Gruppe wird mit dem RAR-Agonisten Retinsäure in einer Konzentration von 10–10 bis 10–6 M behandelt. Die dritte Gruppe wird mit AGN 193109 in Dosen behandelt, die sich von 10–10 bis 10–6 M bewegen. Den Zellen wird frisches Wachstumsmedium täglich zugeführt und sie werden mit Retinoiden, oben beschrieben, versorgt, wie für jede Probengruppe geeignet. Die Zellen wurden nach 3 Tagen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers gezählt. Ein Vergleich der Anzahl von Zellen in den Kontrollkulturen mit der Anzahl von Zellen in den Retinsäure-behandelten Kulturen zeigt an, dass der RAR-Agonist die Wachstumsgeschwindigkeit der kultivierten Zervikalkarzinomzellen nicht wesentlich hemmt. Im Gegensatz hierzu zeigen Zellen, die mit AGN 193109 behandelt werden, eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl im Vergleich mit Zellzählungen in der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis, bei dem eine AGN 193109-Behandlung die Zellproliferation kultivierter Zervikalkarzinomzellen hemmt, zeigt an, dass AGN 193109 ein nützliches therapeutisches Mittel zur Behandlung von Zervikalkarzinom-Patienten mit einer metastatischen Erkrankung von Nutzen sein wird.
  • Zervikalkarzinom-Patienten, die zur Entfernung der Primärtumore einem chirurgischen Eingriff unterworfen wurden, und bei denen metastatische Erkrankungen vorliegen, werden in eine randomisierten klinischen Studie aufgelistet, mit dem Ziel, den therapeutischen Vorteil von AGN 193109 bei dieser Indikation unter Beweis zu stellen. Die Patienten werden in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe ist eine Kontrollgruppe, wohingegen Mitglieder der zweiten Gruppe mit AGN 193109 behandelt werden. AGN 193109 wird mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert, um eine Zusammensetzung zu erzeugen, die zur systemischen Verabreichung geeignet ist, alles gemäß der Techniken, die für den Durchschnittsfachmann vertraut sind. Der Kontrollgruppe wird eine Placebo-Zubereitung verabreicht und der experimentellen Gruppe wird die Formulierung verabreicht, die das negative Hormon AGN 193109 enthält. Die Dosierung der Patienten liegt bei der maximal tolerierten Dosis und wird jeden weiteren Tag für eine Zeitspanne von 3 Monaten bis zu 1 Jahr durchgeführt. Das Outcome dieser Studie wird über eine Messung des Disease-Free Survivals (krankheitsfreien Überlebens) über die Zeit hinweg quantifiziert. Individuen, die AGN 193109 empfingen, zeigten eine signifikante Zunahme des Disease-Free Survivals, einschließlich einer unverhältnismäßigen Anzahl von Patienten, die eine vollständige Remission ihrer metastatischen Erkrankung zeigten. Dieses Ergebnis zeigt an, dass AGN 193109 eine therapeutische Verwendung zur in-vivo-Behandlung von Zervikalkarzinomen zeigt, die auf die antiproliferativen Wirkungen von Retinoid-Agonisten, wie beispielsweise Retinsäure, nicht ansprechen.
  • Wie oben offenbart, verstärkt AGN 193109 die antiproliferative Wirkung von RAR-Agonisten in primären Kulturen von humanen Retinalpigmentepithelzellen. Demgemäß wird vernünftigerweise erwartet, dass eine Ko-Verabreichung von AGN 193109 mit einem RAR-Agonisten in vivo den therapeutischen Index des Agonisten erhöht, weil eine geringere Menge des RAR-Agonisten erforderlich sein wird, um denselben therapeutischen Endpunkt zu erzielen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass AGN 193109 Primärkulturen von humanen Netzhautpigmentepithelzellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von Glucocorticoid- und Schilddrüsenhormonrezeptor-Agonisten empfindlich macht. Das nachfolgende Kaninchenmodell von PVR wird in zwei getrennten Studien dazu verwendet, den erhöhten therapeutischen Index, der über Ko-Verabreichung von AGN 193109 jeweils mit einem RAR-Agonisten (13-cis Retinsäure) oder einem Schilddrüsenhormonrezeptoragonisten erzielt wurde, zu demonstrieren. Bemerkenswerterweise wurde das Kaninchenmodell der Netzhautablösung, veröffentlicht von Sen et al. in Arch. Opthalmol. 106: 1291 (1988) zur Demonstration verwendet, dass Retinoid-Agonisten, die eine Proliferation primärer RPE-Zellen in vitro zeigen, ebenfalls die Häufigkeit einer Netzhautablösung in vivo hemmen (Araiz et al., Invest. Opthalmol. 34: 522 (1993)). Somit wurde bezüglich ihrer Verwendung als Therapeutika in der Vorbeugung einer Netzhautablösung eine Korrelation zwischen den in-vitro- und in-vivo-Aktivitäten von Retinoid-Agonisten bereits etabliert. Die nachfolgenden Beispiele zeigen, wie AGN 193109 in therapeutischen Anwendungen verwendet werden kann, die auf die Vermeidung einer Netzhautablösung gerichtet sind.
  • Beispiel 24
  • Die Verwendung von AGN 193109 zur Erhöhung des therapeutischen Potentials von Agonisten der Steroid-Rezeptor-Superfamilie in der Behandlung der proliferativen Vitreoretinopathie (Proliferative Vitreoretinopathy = PVR)
  • In einer ersten Studie wurden humane RPE-Zellen in die Glaskörperhöhle von Kaninchenaugen gemäß dem von Sen et al. in Arch. Opthalmol. 106: 1291 (1988) beschriebenen Verfahren injiziert. Nach intravitrealer Injektion werden die Kaninchen in 5 Gruppen aufgeteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) empfängt Träger alleine durch intravitreale Injektion. Die zweite Gruppe empfängt Retinsäure als Einzel-Wirkstoffbehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion. Die dritte Gruppe empfängt AGN 193109 als Einzel-Wirkstofibehandlung (100 μg) durch intravitreale Injektion. Die vierte Gruppe empfängt durch intravitreale Injektion den RAR-Agonisten (Retinsäure) in einer Dosis von 1/10 der Menge, die der Gruppe 2 verabreicht wird (10 μg). Die fünfte Gruppe empfängt die Kombination von AGN 193109 (100 μg) und Retinsäure (10 μg) durch intravitreale Injektion. Tiere empfangen eine einzelne intravitreale Injektion der geeigneten Behandlung 1 Tag nach der intravitrealen Injektion von humanen RPE-Zellen. Kaninchen werden durch indirekte Opthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 überprüft und bezüglich der Häufigkeit und des Schweregrades einer traktionellen Netzhautablösung eingeteilt. Kaninchen aus der Gruppe, der 100 μg Retinsäure injiziert wurde, zeigen eine signifikant reduzierte Frequenz und Schweregrad einer Netzhautablösung im Vergleich zu Kontrollkaninchen oder Kaninchen, die entweder AGN 193109 oder Retinsäure (10 μg) alleine empfingen. Kaninchen in der Gruppe, der die Kombination von AGN 193109 und Retinsäure (10 μg) verabreicht wurde, zeigen eine signifikant reduzierte Häufigkeit und Schweregrad der Netzhautablösung im Vergleich zu solchen in Gruppen von entweder Kontrolle, AGN 193109 oder Retinsäure (10 μg). Dieses Ergebnis zeigt, dass AGN 193109 den therapeutischen Index des RAR-Agonisten Retinsäure in einem in-vivo-Modell der PVR verbessert.
  • In einer zweiten Studie wurde Kaninchen zunächst eine Injektion humaner RPE-Zellen in die Glaskörperhöhle des Auges verabreicht und diese wurden dann in vier Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) empfängt Trägerstoff alleine durch intravitreale Injektion. Die zweite Gruppe empfängt Thyroidhormon als einziges Behandlungsmittel (100 μg) durch intravitreale Injektion. Der dritten Gruppe wird AGN 193109 als einziges Behandlungsmittel (100 μg) durch intravitreale Injektion verabreicht. Der vierten Gruppe wird eine Kombination aus AGN 193109 (100 μg) und Schilddrüsenhormon (100 μg) verabreicht. Die Kaninchen werden durch indirekte Ophthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 überprüft und bezüglich der Häufigkeit und des Schweregrades einer traktionellen Netzhaut-Ablösung eingeteilt. Der Vergleich der Häufigkeit und des Schweregrades der Netzhaut-Ablösung in den vier Gruppen demonstriert, dass die Behandlung mit einem einzigen Mittel, entweder mit AGN 193109 oder Schilddrüsenhormon, die Netzhaut-Ablösung, im Vergleich mit Kontrollkaninchen, nicht hemmen kann. Im Gegensatz hierzu zeigt die Gruppe der Kaninchen, denen die Kombination aus AGN 193109 und Schilddrüsenhormon verabreicht wurde, eine signifikant reduzierte Inzidenz und Schweregrad einer Netzhautablösung. Dieses Ergebnis zeigt, dass AGN 193109 den therapeutischen Index des Schilddrüsenhormons in einem in-vivo-Modell der PVR verbessert.
  • Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht, wie AGN 193109 zur Steigerung des therapeutischen Indexes eines RAR-Agonisten verwendet werden kann, der zur Behandlung humaner Patienten im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff zur Wiederbefestigung der Netzhaut verwendet wird.
  • Beispiel 25
  • Zunahme des therapeutischen Index des RAR-Agonisten 13-cis-Retinsäure
  • Eine Population erwachsener Freiwilliger mit einer Netzhautablösung, die sich aus PVR ergibt, wird zunächst identifiziert. Die Individuen werden einer Reparatur der Ablösungen unter Verwendung von Techniken unterworfen, die in der Technik Standard sind. Die Patienten werden dann in fünf Gruppen eingeteilt. Die Kontrollgruppe besteht aus Patienten, die einem chirurgischen Eingriff der Netzhautablösung unterzogen werden und keine Retinoid-Verbindung empfangen. Die zweite Gruppe empfängt 40 mg oral 13-cis-Retinsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Die dritte Gruppe empfängt 40 mg AGN 103109 oral zweimal täglich für vier Wochen postoperativ. Die vierte Gruppe empfängt 4 mg oral 13-cis-Retinsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Die fünfte Gruppe empfängt 40 mg oral AGN 193109 in Kombination mit 4 mg oral 13-cis-Retinsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Die Behandlungsvorschrift und die Feststellung der Arzneistoffleistungsfähigkeit wird im Wesentlichen wie von Fekrat et al. in Ophthahnology 102: 412 (1995) beschrieben durchgeführt.
  • Die Häufigkeit und der Schweregrad der Netzhautablösung in postoperativen Patienten in allen fünf Gruppen wird über eine Zeitspanne von 9 Monaten unter Verwendung ophthalmologischer Überprüfungstechniken überwacht, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet vertraut sind. Patienten, die 40 mg orale 13-cis-Retinsäure empfingen, zeigten eine signifikant reduzierte Inzidenz einer Netzhaut-Ablösung im Vergleich mit Kontrollpatienten, Patienten, die 4 mg orale 13-cis-Retinsäure zweimal täglich empfingen, oder Patienten, die 40 mg orales AGN 193109 zweimal täglich empfingen. Eine Überprüfung der Patientengruppe, die die Kombination aus 40 mg oralem AGN 193109 und 4 mg oraler 13-cis-Retinsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ empfing, zeigt, dass das therapeutische Outcome in dieser Patientengruppe zu demjenigen der Patienten, die 40 mg orale 13-cis-Retinsäure zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ empfingen, gleich oder besser ist. Das Ergebnis zeigt, dass das negative Hormon AGN 193109 den therapeutischen Index eines RAR-Agonisten mittels Senken der Häufigkeit und des Schweregrades einer erneuten Netzhautablösung bei PVR-Patienten verbessert.
  • Generalisierter Assay zum Identifizieren von Kernrezeptor-negativen Hormonen
  • Wir haben oben demonstriert, dass AGN 193109 als negatives Hormon funktionieren kann, dass dazu in der Lage ist, die transkriptionelle Basisaktivität von RAR-Kernrezeptoren zu unterdrücken. Wir haben weiterhin einen Assay unter Verwendung von CV-1-Zellen beschrieben, die mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und dem ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden zur Unterscheidung von RAR-Liganden transfiziert wurden, die einfache Antagonisten sind, von denjenigen, die eine negative Hormonaktivität aufweisen.
  • Wir haben geschlossen, dass RAR-negative Hormone die Unterdrückung einer RARvermittelten transkriptionellen Aktivität durch Förderung einer erhöhten Interaktion zwischen dem RAR und den NCPs vermitteln. Wir haben weiterhin demonstriert, dass AGN 193109 die Wirkungen der Agonisten anderer Kernrezeptoren in einer Weise verstärken kann, die mit dem wechselseitigen Teilen von NCPs unter den Mitgliedern der Steroid-Superfamilie von Kernrezeptoren konsistent ist. Als solches können Ligaeden entwickelt und gescreent werden, um Verbindungen zu identifizieren, die an diesen Nicht-RAR-Kernrezeptoren eine negative Hormonaktivität aufweisen.
  • Unser Verfahren zum Screenen nach RAR-negativen Hormonen basierte auf der Verwendung von CV-1-Zellen, die mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und den ER-RXR-αund RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden ko-transfizert wurden, und dieses Verfahren kann im Allgemeinen so angepasst werden, dass die RAR-γ-Komponente des RAR-γ-VP-16-Plasmids zu derjenigen der Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR), Vitamin-D-Rezeptor (VDR), Schilddrüsenhormon-Rezeptor (T3R) oder irgendeines anderen Kernrezeptors der Steroid-Superfamilie umgewandelt werden kann, die zum Heterodimerisieren mit RXR in der Lage ist. CV-1-Zellen, die mit solchen Plasmiden kotransfiziert wurden, würden hohe Basisniveaus einer Luciferase-Aktivität exprimieren. Ligaeden, die zur Bindung der Liganden-Bindungsdomäne des für die RAR-γ-Komponente substituierten Rezeptors können in einfacher Weise nach einer negativen Hormonaktivität durch Messen ihrer Fähigkeit, die Luciferase-Aktivität zu unterdrücken, gescreent werden.
  • Für Kernrezeptoren der Steroid-Superfamilie, die nicht mit RXR heterodimerisieren (beispielsweise Glucocorticoid- und Östrogen-Rezeptoren) können dieselben Endergebnisse unter Verwendung von GR-VP-16 oder ER-VP-16-Rezeptoren und einem Luciferase-Rezeptorplasmid erreicht werden, das aus dem geeigneten Glucocorticoid- oder Östrogen-Reaktionselement fusioniert an ein heterologes Promotorelement und Luciferase und andere Reportergene, besteht. Ein essentielles Merkmal eines generalisierten Screening-Assays nach negativen Hormonen besteht im Einschluss zumindest der Liganden-Bindungsdomäne des speziellen Kernrezeptors, für den inverse Agonisten gescreent werden sollen, und ein Verfahren zum Lokalisieren der Kernrezeptor-Ligandenbindungsdomäne an den Promotor eines Reportergens. Dies sollte unter Verwendung der natürlichen DNA-Bindungsstelle der Rezeptoren erreicht werden oder alternativ durch Konstruktion eines chimären Rezeptors, der eine heterologe DNA-Bindungsdomäne aufweist, und der entsprechenden Verwendung eines Reportergens, das unter Kontrolle eines regulatorischen DNA-Elementes steht, das durch die heterologe DNA-Bindungsdomäne erkannt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das Plasmid, das den Kernrezeptor exprimiert, für den inverse Agonisten gescreent werden sollen, diesen Kernrezeptor als Fusionsprotein exprimieren, das eine konstitutive Aktivierungsdomäne enthält, wie beispielsweise die HSV-VP-16-Aktivierungsdomäne, um eine hohe Basisaktivität bereitzustellen. Dieses hohe Basisaktivität würde die Assay-Sensitivität effektiv erhöhen und dadurch eine Analyse von Kernrezeptor-Liganden ermöglichen, die eine basale transkriptionelle Aktivität bei Fehlen von zugesetztem Kemrezeptoragonist unterdrücken.
  • Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, das zum Screenen nach Verbindungen verwendet werden kann, die am Schilddrüsenhormon-Rezeptor eine negative Hormonaktivität aufweisen.
  • Beispiel 26
  • Verfahren zum Identifizieren von Thyroidhormonrezeptor-negativen Hormonen
  • CV-1-Zellen wurden mit dem Luciferase-Reporterplasmid ERE-tk-Luc und den Plasmiden ER-RXR-α- und T3R-VP-16 ko-transfiziert. T3R-VP-16 ist mit dem Plasmid RAR-γ-VP-16 identisch, außer dass die RAR-γ-Komponente von RAR-γ-VP-16 durch die Schilddrüsenhormon-Rezeptor-cDNA substituiert wurde. Als solches exprimiert T3R-VP-16 ein Fusionsprotein, das die Aktivierungsdomäne von HSV-VP-16 im Raster mit dem N-Terminus des Schilddrüsenhormon-Rezeptors exprimiert. Eine Standardtransfektion und Zellkulturverfahren wurden zu diesem Zweck verwendet. Nach Transfektion werden die Zellen gespült und mit Wachstumsmedium, das 10% fötales Kalbsserum enthält, gespült, das mit Aktivkohle extrahiert wurde. Die Zellen wurden mit Trägerstoff alleine (Ethanol), Schilddrüsenhormon (10–9 bis 10–10 M) oder Verbindung TR-1 (10–9 bis 10–6 M) behandelt. TR-1 ist ein synthetischer Schilddrüsenhormon-Rezeptorligand, der eine starke Affinität für den Schilddrüsenhormon-Rezeptor in Konkurrenz- bzw. kompetitiven Bindungsstudien zeigt, der jedoch den transfizierten Schilddrüsenhormon-Rezeptor in transienten Ko-Transfektions-Transaktivierungsassays unter Verwendung eines Schilddrüsenhormon-responsiven Reportergens und eines Schilddrüsenhormon-Rezeptorexpressionsplasmids nicht aktiviert. Weiterhin ist TR-1 dazu in der Lage, eine Schilddrüsenhormon-vermittelte Transaktivierung zu antagonisieren und ist als solches ein Schilddrüsenrezeptor-Antagonist.
  • Eine Analyse der Luciferase-Aktivität von einer CV-1-Zelle, die mit ERE-tk-Luc, ER-RXRα- und T3R-VP-16 transfiziert wurde, zeigt ein hohes Grundniveau einer Luciferase-Reporteraktivität in Trägerstoff-behandelten Zellen. Zellen, die mit Schilddrüsenhormon behandelt wurden, zeigen eine geringe Zunahme der Luciferase-Aktivität in einer Dosisabhängigen Weise. Zellen, die mit TR-1 behandelt wurden, zeigen eine Dosis-unabhängige Abnahme der Luciferase-Aktivität. Dies zeigt, dass TR-1 eine Thryroidrezeptor-inverse Agonisten-Aktivität zeigt, die vermutlich auf die erhöhte Interaktion eines NCP mit dem Schilddrüsenhormon-Rezeptor zurückzuführen ist.
  • Die Proliferationsgeschwindigkeit humaner primärer retinaler Pigmentepithelzellen wird durch Behandlung mit RAR-Agonisten unterdrückt. Der therapeutische Wert dieser Beobachtung wurde in der postoperativen Anwendung einer Retinoidtherapie nach einem chirurgischen Eingriff zur Wiederbefestigung der Netzhaut bewiesen. Wir haben oben demonstriert, dass das AGN 193109 RAR-negative Hormon primäre RPE-Zellen gegenüber der antiproliferativen Wirkung von ATRA und 13-cis-Retinsäure in Koadministrationsverfahren sensibilisieren kann. Weiterhin zeigte sich, dass AGN 193109 RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen anderer Kernrezeptoragonisten sensibilisiert. Insbesondere sensibilisierte AGN 193109 RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen des Glucocorticoid-Agonisten Dexamethason und das Schilddrüsenhormon gegen 3,3',5-Trüodthyronin T3. Diese Daten waren mit unserem Arbeitsmodell konsistent, in dem AGN 193109 die Verfügbarkeit von NCPs modulierte, die zwischen den Mitgliedern der Kernrezeptorfamilie geteilt. wurden. Die Behandlung von RPE-Zellen mit Schilddrüsenhormonrezeptor-inversem Agonist TR-1 wird die Verfügbarkeit geteilter NCPs in ähnlicher Weise verändern, so dass eine Koadministration mit einem Nicht-Schilddrüsenhormon-Rezeptoragonist, wie beispielsweise dem RAR-Agonisten 13-cis-Retinsäure, zu einer erhöhten antiproliferativen Wirkung auf die RPE-Kulturen im Vergleich zu 13-cis-Retinsäure als einzigem Behandlungsmittel führen wird.
  • Das nachfolgende Beispiel zeigt ein Verfahren, das dazu verwendet werden kann, primäre RPE-Zellen gegenüber der antiproliferativen Aktivität eines RAR-Agonisten empfindlicher zu machen. Es ist erwähnenswert, dass dieses Beispiel weiter veranschaulicht, wie die Aktivität der RAR-Agonisten durch gleichzeitige Verabreichung mit einem negativen Hormon verstärkt werden kann.
  • Beispiel 27
  • Sensibilisieren primärer retinaler Pigmentepithelzellen gegenüber den antiproliferativen Wirkunengen von RAR-Agonisten durch Koadministration des Schilddrüsenhormoninversen Agonisten TR-1
  • Humane primäre RPE-Zellen wurden gewonnen und gemäß Standardverfahren kultiviert. Die kultivierten Zellen werden in vier Gruppen eingeteilt und wie folgt behandelt. Gruppe 1 empfängt Träger alleine (Ethanol). Gruppe 2 wird mit 13-cis-Retinsäure in Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M behandelt. Gruppe 3 wird mit dem Schilddrüsenhormoninversen Agonisten TR-1 in Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–1 M behandelt. Gruppe 4 wird mit 13-cis-Retinsäure in Konzentrationen im Bereich von 10–11 bis 10–6 M TR-1 ko-behandelt. Die Zellen werden erneut mit frischem Wachstumsmedium versorgt und erneut mit der geeigneten Verbindung alle zwei Tage für insgesamt 5 Behandlungstage behandelt. Die Proliferationsrate über die Zeitdauer des Experimentes wird über die Messung der Zellanzahl in den Kulturen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers quantifiziert.
  • TR-1-behandelte Zellen (Gruppe 3) zeigen Raten einer Zellproliferation, die im Wesentlichen dieselben wie die Kontrollzellen (Gruppe 1) sind, und es existiert kein Effekt dieses inversen Agonisten auf die gemessene Wachstumsgeschwindigkeit der Kulturen. Zellen, die mit 13-cis-Retinsäure (Gruppe 2) behandelt wurden, zeigen eine Dosis-abhängige Abnahme der Zellanzahl. Ein Vergleich der Dosis-abhängigen Abnahme der Zellproliferation von Gruppe-4-Zellen (13-cis-RA und TR-1-Koadministration) mit derjenigen in Gruppe 3 erzielten Abnahme demonstriert die Fähigkeit des Schilddrüsenhormonrezeptor-inversen Agonisten TR-1, durch Koadministration RPE-Kulturen gegenüber der antiproliferativen Wirkung von 13-cis-Retinsäure empfindlich zu machen, wie durch die Verschiebung der Dosiswirkungskurve dieses RAR-Agonisten nach links in Gruppe 4 im Vergleich zu Gruppe-2-Zellen gemessen wurde.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 01820001
  • Figure 01830001
  • Figure 01840001
  • Figure 01850001
  • Figure 01860001
  • Figure 01870001

Claims (21)

  1. Verbindung der Formel
    Figure 01880001
    bei der X S, O, NR' ist, wobei R'H oder Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist oder X[C(R1)2]n ist, wobei R1 unabhängigH oder Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und n eine ganze Zahl zwischen 0 und 2 ist; R2 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br, I, CF3, fluorsubstituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkylthio von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R3 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F ist; m eine ganze Zahl mit dem Wert 0–3 ist; o eine ganze Zahl mit dem Wert 0–3 ist; Y eine Phenyl- oder Naphthyl-Gruppe oder ein Heteroaryl ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl besteht, wobei die Phenyl- und Heteroaryl-Gruppen wahlweise mit einer oder zwei R2-Gruppen substituiert sind; A(CH2)q ist, wobei q 0–5, niederes verzweigtkettiges Alkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen oder 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen oder 1 oder 2 Dreifachbindungen ist; B Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O oder tri-niederes Alkylsilyl ist, wobei R7 eine Alkyl, Cycloalkyloder Alkenyl-Gruppe ist, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, wobei R8 eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl ist, wobei die Alkyl-Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder R8 Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, wobei R9 und R10 unabhängig Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, wobei R11 niederes Alkyl, Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R12 niederes Alkyl ist und R13 ein zweiwertiges Alkylradikal von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, und R14(R15)r-Phenyl, (R15)r-Naphthyl oder (R15)r-Heteroaryl ist, wobei die Heteroaryl-Gruppe 1 bis 3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 0, S und N besteht, wobei r eine ganze Zahl mit den Werten von 0–5 ist, und R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine fluorsubstituierte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxy-Gruppe ist, wobei die Alkyl-Gruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen; R16 H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R17 H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH oder OCOR11 ist, und p Null ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der Y Phenyl, Pyridyl, Thienyl oder Furyl ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y Phenyl ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei der Phenyl-Ring 1,4 (para)-substituiert ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y Pyridyl ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, bei der Y Thienyl oder Furyl ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 1, bei der R14(R15)r-Phenyl ist.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R14(R15)r-Heteroaryl ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, bei der R14(R15)r-Hetoroaryl ist, wobei die Heteroaryl-Gruppe ein 5- oder sechsgliedriger Ring ist, der 1 oder 2 Heteroatome aufweist.
  10. Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Heteroaryl-Gruppe aus 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 2-Thienyl und 2-Thiazolyl ausgewählt ist.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die R15-Gruppe H, CF3, F, niederes Alkyl, niederes Alkoxy, Hydroxy oder Chlor ist.
  12. Verbindung nach Anspruch 1, bei der X[C(R1)2]n ist.
  13. Verbindung nach Anspruch 11, bei der R1CH3 ist und n 1 ist.
  14. Verbindung nach Anspruch 1, bei der X S, O oder NR' ist.
  15. Verbindung nach Anspruch 1, bei der A (CH2)q ist, wobei q 0–5 ist und bei der B COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8 oder CONR9R10 ist.
  16. Verbindung der Formel
    Figure 01900001
    bei der R1 unabhängigH oder Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R2 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br, I, CF3, fluorsubstituiertes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkylthio von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R3 Wasserstoff, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F ist; m eine ganze Zahl mit dem Wert 0–2 ist; o eine ganze Zahl mit dem Wert 0–3 ist; A(CH2)q ist, wobei q 0–5, niederes verzweigtkettiges Alkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3–6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2–6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Dreifachbindungen ist; B Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O oder tri-niederes Alkylsilyl ist, wobei R7 eine Alkyl-, Cycloalkyloder Alkenyl-Gruppe ist, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, wobei R8 eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl ist, wobei die Alkyl-Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder R8 Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, wobei R9 und R10 unabhängig Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Cycloalkyl-Gruppe von 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R11 niederes Alkyl, Phenyl oder niederes Alkylphenyl ist, R12 niederes Alkyl ist und R13 ein zweiwertiges Allcylradikal von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R15 unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine fluorsubstituierte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen, oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxy-Gruppe ist, wobei die Al-kyl-Gruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen; r eine ganze Zahl mit den Werten 0–5 ist; R16 H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; R17H, niederes Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH oder OCOR11 ist und p Null ist.
  17. Verbindung nach Anspruch 16, bei der A (CH2)q ist, wobei q 0–5 ist, und B COOH oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, COOR8 oder CONR9R10 ist.
  18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei R1CH3 ist.
  19. Verbindung nach Anspruch 18, bei der R2, R3, R16 und R17 Wasserstoff sind.
  20. Verbindung nach Anspruch 19, bei der R15H oder CH3 ist, und wenn R15CH3 ist, die 4-Position des Phenyl-Ringes belegt.
  21. Verbindung nach Anspruch 20, die 4-[3-Oxo-3-(7,8-dihydro 5-(4-methylphenyl)-8,8-dimethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoesäure oder 4-[3-Oxo-3-(7,8-dihydro 5-(phenyl)-8,8-dimethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoesäure ist.
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