ES2205380T3 - Sintesis y su de compuestos retinoides que tienen actividades negativas hormonales y/o antagonistas. - Google Patents

Sintesis y su de compuestos retinoides que tienen actividades negativas hormonales y/o antagonistas.

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ES2205380T3
ES2205380T3 ES98204074T ES98204074T ES2205380T3 ES 2205380 T3 ES2205380 T3 ES 2205380T3 ES 98204074 T ES98204074 T ES 98204074T ES 98204074 T ES98204074 T ES 98204074T ES 2205380 T3 ES2205380 T3 ES 2205380T3
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Alan T. Johnson
Andrew M. Standeven
Richard L. Beard
Samuel J. Gillet
Tien T. Duong
Sunil Nagpal
Vidyasagar Vilugonda
Min Teng
Roshantha A. Chandraratna
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Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN COMPUESTO DE FORMULA: DONDE X ES S, O, NR'', DONDE R'' ES H O ALQUILO DE 1 A 6 ATOMOS DE CARBONO, O X ES [C(R 1 ) 2 ] N , DONDE R 1 ES INDE PENDIENTEMENTE H O ALQUILO DE 1 A 6 CARBONOS, Y N ES UN ENTERO ENTRE 0 Y 2; R 2 ES HIDROGENO, ALQUILO INFERIOR DE 1 A 6 CARBONOS, F, CL, BR, I, CF 3 , ALQUILO DE 1 A 6 ATOMOS DE CARBONO SUSTITUIDO POR FLUOR, OH, SH, ALCOXI DE 1 A 6 CARBONOS, O ALQUILTIO DE 1 A 6 CARBONOS; R 3 ES HIDROGENO, ALQUILO INFERIOR DE 1 A 6 CARBONOS, O FLUOR; M ES UN ENTERO DE VALOR 0-3; O ES UN ENTERO DE VALOR 0-3; Y ES UN GRUPO FENILO O NAFTILO, O HETEROARILO SELECCIONADO A PARTIR DE UN GRUPO FORMADO POR PIRIDILO, TIENILO, FURILO, PIRIDAZINILO, PIRIMIDINILO, PIRAZINILO, TIAZOLILO, OXAZOLILO, IMIDAZOLILO Y PIRRAZOLILO, ESTANDO SUSTITUIDOS OPCIONALMENTE DICHOS GRUPOS FENILO Y HETEROARILO POR UNO O DOS GRUPOS R 2 ; A ES (CH 2 ) Q DONDE Q ES 0-5, ALQUILO INFERIOR DE CADENA RAMIFICADA DE 3-6 CARBONOS, CICLOALQUILO DE 3-6 CARBONOS, ALQUENILO DE 2-6 CARBONOSY 1 O 2 ENLACES DOBLES, ALQUINILO DE 2-6 CARBONOS Y 1 O 2 ENLACES TRIPLES: B ES HIDROGENO, COOH O UNA SAL FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE DEL MISMO, COOR 8 , CONR 9 R 10 , - CH 2 O H, CH 2 OR 11 , CH 2 OCOR 11 , CHO, CH(OR 12 ) 2 CHOR 13 O, - COR 7 , CR 7 (OR 12 ) SUB,2 , CR 7 OR 13 O O SILILO DE TRIALQUILO INFERIOR, DONDE R 7 ES UN GRUPO ALQUILO, CICLOALQUILO O ALQUENILO DE 1 A 5 ATOMOS DE CARBONO; R 8 ES UN GRUPO ALQUILO DE 1 A 10 CARBONOS O TRIMETILSILILALQUILO, DONDE EL GRUPO ALQUILO TIENE DE 1 A 10 CARBONOS, O UN GRUPO CICLOALQUILO DE 5-10 CARBONOS O FENILO O ALQUILFENILO INFERIOR; R 11 ES ALQUILO INFERIOR, FENILO O ALQUILFENILO INFERIOR; R 12 ES ALQUILO INFER IOR; Y R 13 ES UN RADICAL ALQUILO DIVALENTE DE 2-5 CARBONOS; Y R 14 ES (R 15 R - FENILO, (R 15 ) SUB ,R HETEROARILO, DONDE EL GRUPO HETEROARILO TIENE DE 1 A 3 HETEROATOMOS SELECCIONADOS A PARTIR DEL GRUPO FORMADO POR O, S Y N, R ES UN ENTERO DE VALOR 0-5 Y R 15 ES INDEPENDIENTEMENTE H, F, CL, BR, I, NO 2 , N(R 8 ) 2 , N(R 8 ) COR 8, NR 8 CON(R 8 ) 2 , OH, OCOR 8 , OH, OCOR 8 , OR 8 , CN, UN GRUPO ALQUILO DE 1-10 CARBONOS, UN GRUPO ALQUILO DE 1 A 10 ATOMOS DE CARBONO, SUSTITUIDO, UN GRUPO ALQUENILO DE 1 A 10 CARBONOS Y 1 A 3 ENLACES DOBLES, UN GRUPO ALQUINILO DE 1 A 10 CARBONOS Y DE 1 A 3 ENLACES TRIPLES, O UN GRUPO TRIALQUILSILILO O TRIALQUILSILOXI, DONDE LOS GRUPOS ALQUILOS, INDEPENDIENTEMENTE, TIENEN 1-6 C; R 16 ES H, ALQUILO DE 1 A 6 ATOMOS DE CARBONO; R 17 ES H, ALQUILO INFE RIOR DE 1 A 6 CARBONOS, OH O OCOR 11 , Y P ES 0 O 1, CON LA CONDICION DE QUE, CUANDO P ES 1, NO EXISTE GRUPO SUSTITUYENTE R 17 , Y M ES UN ENTERO ENTRE 0 Y 2.

Description

Síntesis y uso de compuestos retinoides que tienen actividades negativas hormonales y/o antagonistas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos que tienen actividades biológicas similares a hormona negativa de retinoides y/o a antagonista de retinoides. Más específicamente, la invención se refiere a derivados de benzopiranos 4-arilsustituidos, benzotiopiranos 4-aril-sustituidos, 1,2-dihidroquinolinas 4-arilsustituidas y 5,6-dihidronaftalenos 8-arilsustituidos, que también pueden estar sustituidos por un grupo 3-oxo-1-propenílico sustituido. Estos nuevos compuestos tienen actividad similar a antagonistas de retinoides, y son útiles para tratar o prevenir la toxicidad inducida por retinoides y vitamina A y precursores de vitamina A en mamíferos, y como un auxiliar para el tratamiento de mamíferos con retinoides para evitar o mejorar efectos secundarios indeseados. La invención se refiere además al uso de hormonas negativas de retinoides para aumentar las actividades biológicas de otros retinoides y hormonas esteroideas, e inhibir la actividad basal de receptores del ácido retinoico no ligados.
Antecedentes de la invención
Los compuestos que tienen actividad similar a retinoides son bien conocidos en la técnica, y se describen en numerosas patentes de los Estados Unidos y otras patentes, así como en publicaciones científicas. Generalmente se sabe y se acepta en la técnica que la actividad similar a retinoides es útil para tratar mamíferos, incluyendo seres humanos, a fin de curar o aliviar los síntomas asociados con numerosas enfermedades y estados.
Se sabe que los retinoides (vitamina A y sus derivados) tienen amplias actividades, incluyendo efectos sobre la proliferación y diferenciación celular, en una variedad de sistemas biológicos. Esta actividad ha hecho a los retinoides útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo trastornos dermatológicos y cánceres. La técnica anterior ha desarrollado un gran número de compuestos químicos que tienen actividad biológica similar a retinoides, y existen numerosas patentes y bibliografía química que describen tales compuestos. La bibliografía de patentes relevantes incluye las Patentes de Estados Unidos n^{os} 4.980.369, 5.006.550, 5.015.658, 5.045.551, 5.089.509, 5.134.159, 5.162.546, 5.234.926, 5.248.777, 5.264.578, 5.272.156, 5.278.318, 5.324.744, 5.346.895, 5.346.915, 5.348.972,
5.348.975, 5.380.877, 5.399.561, 5.407.937, (asignadas al mismo cesionario de la presente solicitud), y patentes y publicaciones citadas allí, que describen particularmente o se refieren a derivados de cromano, tiocromano y 1,2,3,4-tetrahidroquinolina que tienen actividad biológica similar a retinoides. Además, varias solicitudes están en trámite que se asignan al cesionario de la presente solicitud, y que están dirigidas a compuestos adicionales que tienen actividad similar a retinoides.
Las Patentes de Estados Unidos n^{os} 4.740.519 (Shroot et al.), 4.826.969 (Maignan et al.), 4.326.055 (Loeliger et al.), 5.130.335 (Chandraratna et al.), 5.037.825 (Klaus et al.), 5.231.113 (Chandraratna et al.), 5.324.840 (Chandraratna), 5.344.959 (Chandraratna), 5.130.335 (Chandraratna et al.), Solicitud de Patente Europea Publicada n^{os} 0 176 034 A (Wuest et al.), 0 350 846 A (Klaus et al.), 0 176 032 A (Frickel et al.), 0 176 033 A (Frickel et al.), 0 253 302 A (Klaus et al.), 0 303 915 A (Bryce et al.), 06/7020 A (Shudo et al.),Solicitud de Patente de UK GB 2190378 A (Klaus et al.), Solicitud de Patente Alemana n^{os} DE 3715955 A1 (Klaus et al.), DE 3602473 A1 (Wuest et al.), y los artículos J. Amer. Acad. Derm. 15: 756 - 764 (1986) (Sporn et al.), Chem. Pharm. Buff. 33: 404-407 (1985) (Shudo et al.), J. Med. Chem. 31: 2182-2192 (1988) (Kagechika et al.), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids CRC Press Inc. 1990 pp. 334 \cdot 335, 354 (Dawson et al.), describen o se refieren a compuestos que incluyen un resto tetrahidronaftílico y tienen actividad biológica similar o relacionada con retinoides. La solicitud de Patente Europea nº 0661 259 A describe derivados dihidronaftalénicos que tienen actividad biológica similar a la de los retinoides. La Patente de Estados Unidos nº 4.391.731 (Boiler et al.) describe derivados tetrahidronaftalénicos que son útiles en composiciones de cristales líquidos. La solicitud de Patente Europea nº 0 478 787 A describe métodos para la producción de derivados tetrahidronaftalénicos.
Un artículo de Kagechika et al. en J. Med. Chem. 32:834 (1989) describe ciertos derivados de 6-(3-oxo-1-propenil)-1,2,3,4-tetrametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalénicos y compuestos flavónicos relacionados que tienen actividad similar a retinoides. Los artículos de Shudo et al. en Chem. Pharm. Bull. 33:404 (1985) y por Jetten et al. en Cancer Research 47:3523 (1987) describen o se refieren a derivados adicionales de 3-oxo-1-propenilo (compuestos de calcona) y a su actividad biológica similar o relacionada con retinoides.
Desafortunadamente, los compuestos que tienen actividad similar a retinoides (retinoides) también provocan un número de efectos secundarios indeseados a niveles de dosis terapéuticas, incluyendo dolores de cabeza, teratogénesis, toxicidad mucocutánea, toxicidad musculoesquelética, dislipidemias, irritación de la piel, cefalea y hepatotoxicidad. Estos efectos secundarios limitan la aceptabilidad y utilidad de retinoides para tratar enfermedades.
Ahora es de conocimiento general en la técnica que existen dos tipos principales de receptores de retinoides en mamíferos (y otros organismos). Los dos tipos principales o familias de receptores se designan respectivamente como RAR y RXR. En cada tipo hay subtipos: en la familia RAR, los subtipos se designan RAR-\alpha, RAR-\beta y RAR-\gamma, en RXR los subtipos son: RXR-\alpha, RXR-\beta y RXR-\gamma. Ambas familias de receptores son factores de transcripción que se pueden distinguir entre sí basándose en sus especificidades de unión por el ligando. El todo-trans-RA (ATRA) se une y activa una clase de receptores del ácido retinoico (RAR) que incluye RAR-\alpha, RAR-\beta y RAR-\gamma. Un ligando diferente, 9-cis-RA (9C-RA), se une y activa tanto los RAR como los miembros de la familia de receptores X de retinoides (RXR).
También se ha establecido en la técnica que la distribución de los dos tipos principales de receptores de retinoides, y de los varios subtipos, no es uniforme en los diversos tejidos y órganos de los mamíferos. Además, se acepta generalmente en la técnica que muchos efectos secundarios indeseados de los retinoides están mediados por uno o más de los subtipos del receptor RAR. En consecuencia, entre los compuestos que tienen actividad similar a agonistas en receptores de retinoides, se considera que la especificidad o selectividad por uno de los tipos principales de familias, e incluso especificidad o selectividad por uno o más subtipos dentro de una familia de receptores, es una propiedad farmacológica deseable.
En la técnica se han desarrollado compuestos relativamente recientes que se unen a receptores de RAR sin provocar la respuesta o respuestas que son provocadas por agonistas de los mismos receptores. Los compuestos o agentes que se unen a receptores de RAR sin provocar una respuesta "retinoide" son capaces de este modo de bloquear (en un menor o mayor grado) la actividad de los agonistas de RAR en ensayos biológicos y sistemas. Más particularmente, con respecto a la bibliografía científica y de patentes en este campo, la Solicitud PCT publicada WO94/14777 describe ciertos derivados de ácidos heterocíclicos carbocíclicos que se unen a receptores de retinoide RAR, y se afirma en la solicitud que son útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades o estados, tales como acné, psoriasis, artritis reumatoide e infecciones víricas. Una descripción similar se hace en el artículo de Yoshimura et al. J. Med. Chem. 38:3163-3173 (1995). Kaneko et al., Med. Chem. Res. 1:220-225 (1991); Apfel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7129-7133 Augusty 1992 Cell Biology; Eckhardt et al. Toxicology Letters 70:299-308 (1994); Keidel et al. Molecular and Cellular Biology 14:287-298 (1994); y Eyrolles et al. J. Med. Chem. 37:1508^{*}1517 (1994) describen compuestos que tienen actividad similar a antagonistas en uno o más de los subtipos de retinoides de RAR. La Solicitud PCT publicada WO93/21146 describe compuestos similares a retinoides que son selectivos preferiblemente para los receptores RXR frente a los receptores RAR.
Además de los efectos secundarios indeseables de terapia con compuestos retinoides, ocasionalmente aparece un estado médico importante causado por sobredosis de vitamina A o de precursor de vitamina A, resultante tanto de la ingesta excesiva de suplementos vitamínicos como de la ingestión de hígado de ciertos peces y animales que contienen niveles elevados de la vitamina. Las toxicidades crónicas o agudas observadas con síndrome de hipervitaminosis A incluye dolor de cabeza, pelado de la piel, toxicidad ósea, dislipidemias, etc. En años recientes, se ha puesto de manifiesto que las toxicidades observadas con análogos de la vitamina A, es decir, retinoides, esencialmente recapitulan aquellas del síndrome de hipervitaminosis A, sugiriendo una causa biológica común, es decir, activación de RAR. Estas toxicidades se tratan actualmente de forma principal mediante medidas de apoyo y absteniéndose de exponerse al agente causante, ya sea hígado, suplementos vitamínicos, o retinoides. Aunque algunas de las toxicidades desaparecen con el tiempo, otras son permanentes (por ejemplo, cierre prematuro de la placa epifisaria).
Hablando de forma general, los antídotos específicos son el mejor tratamiento para el envenenamiento por agentes farmacológicos, pero sólo alrededor de dos docenas de productos químicos o clases de productos químicos de miles que existen tienen antídotos específicos conocidos. Un antídoto específico sería claramente valioso en el tratamiento de hipervitaminosis A y toxicidad por retinoides. De hecho, puesto que clínicamente se usan retinoides cada vez más potentes, un antídoto específico para el envenenamiento por retinoides podría salvar la vida.
Sumario de la invención
La presente invención cubre compuestos de Fórmula 101:
1
en la que X es S, O, NR' en el que R' es H o alquilo de 1 a 6 carbonos;o X es [C(R_{1})_{2}]_{n} en la que R_{1} es independientemente H o alquilo de 1 a 6 carbonos; y n es un número entero entre 0 y 2;
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, F, Cl, Br, I, CF_{3}, alquilo sustituido con flúor de 1 a 6 carbonos, OH, SH, alcoxi de 1 a 6 carbonos, o alquiltio de 1 a 6 carbonos;
R_{3} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, o F;
m es un número entero que tiene el valor de 0-3;
o es un número entero que tiene el valor de 0-3;
Y es un grupo fenilo o naftilo, un heteroarilo seleccionado de un grupo que consta de piridilo, tienilo, furilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiazolilo, oxazolilo, imidazolilo y pirazolilo, estando dichos grupos fenilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos con uno o más grupos R_{2},
A es (CH_{2})_{q} en la que q es 0-5, alquilo inferior de cadena ramificada que tiene 3-6 carbonos, cicloalquilo que tiene 3-6 carbonos, alquenilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 dobles enlaces, alquinilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 triples enlaces;
B es hidrógeno, COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, CONR_{9}R_{10}, -CH_{2}OH, CH_{2}OR_{11}, CH_{2}OCOR_{11}, CHO, CH(OR_{12})_{2}, CHOR_{13}O, -COR_{7}, CR_{7}(OR_{12})_{2}, CR_{7}OR_{13}O, o trialquilsililo inferior, en las que R_{7} es un grupo alquilo, cicloalquilo o alquenilo que contiene 1 a 5 carbonos, R_{8} es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o trimetilsililalquilo en el que el grupo alquilo tiene 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5 a 10 carbonos, o R_{8} es fenilo o alquilfenilo inferior, R_{9} y R_{10} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5-10 carbonos, o fenilo o alquilfenilo inferior, R_{11} es alquilo inferior, fenilo o alquilfenilo inferior, R_{12} es alquilo inferior, y R_{13} es un radical alquílico divalente de 2-5 carbonos, y
R_{14} es (R_{15})_{r}-fenilo, (R_{15})_{r}-naftilo o (R_{15})_{r}-heteroarilo en los que el grupo heteroarilo tiene 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consta de O, S y N, r es un número entero que tiene los valores de 0-5, y
R_{15} es independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, N(R_{8})_{2}, N(R_{8})COR_{8}, NR_{8}CON(R_{8})_{2}, OH, OCOR_{8}, OR_{8}, CN, un grupo alquilo que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo sustituido con flúor que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 dobles enlaces, grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 triples enlaces, o un grupo trialquilsililo o trialquilsililoxi en los que los grupos alquilo tienen independientemente 1 a 6 carbonos;
R_{16} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos;
R_{17} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, OH u OCOR_{11}, y
p es cero.
Los compuestos de la presente invención son útiles para prevenir ciertos efectos secundarios indeseados de retinoides que se administran para el tratamiento o prevención de ciertas enfermedades o estados. Para este fin, los compuestos de la invención se pueden coadministrar con retinoides. Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de toxicidad aguda o crónica que resulta de una sobredosis o envenenamiento por fármacos de retinoides o vitamina A.
La presente invención se refiere adicionalmente al uso de antagonistas de RAR para bloquear todos o algunos de los sitios del receptor de RAR en sistemas biológicos, incluyendo mamíferos, para evitar o disminuir la acción de los agonistas de RAR sobre dichos sitios del receptor. Más particularmente, la invención se refiere al uso de antagonistas de RAR para (a) la prevención y (b) el tratamiento de toxicidad crónica o aguda por retinoides (incluyendo vitamina A o precursor de vitamina A) y efectos secundarios de la terapia con retinoides.
En un aspecto particular de la presente invención, se proporciona un método para tratar un estado patológico en un mamífero. Estos estados tratados se asocian con una actividad del receptor del ácido retinoico. Este método implica administrar al mamífero un antagonista de retinoide o una hormona negativa capaz de unirse a uno de los siguientes subtipos de receptores del ácido retinoico: RAR\alpha, RAR\beta y RAR\gamma. El antagonista u hormona negativa se administra en una cantidad farmacéuticamente efectiva para proporcionar un beneficio terapéutico frente al estado patológico en el mamífero.
Como antídoto para el envenenamiento agudo o crónico por retinoides o vitamina A, el antagonista de RAR se puede administrar a un mamífero de forma enteral, es decir, intubación intragástrica o mezcla con alimentos/agua, o parenteralmente, por ejemplo intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, tópicamente, etc. El único requisito para la vía de administración es que debe permitir el suministro del antagonista al tejido diana. El antagonista de RAR se puede formular por sí mismo o en combinación con excipientes. El antagonista de RAR no necesita estar en disolución en la formulación, por ejemplo en el caso de uso entérico.
Como auxiliar para la terapia con retinoides, y a fin de evitar uno o más efectos secundarios del fármaco retinoide que se administra, el antagonista de RAR puede ser administrado de forma similar por vía entérica o parenteral. El antagonista de RAR y el agonista de RAR no necesitan ser administrados por la misma vía de administración. La clave es que estén presentes suficientes cantidades del antagonista de RAR de forma continua en el tejido de interés durante exposición al agonista de RAR. Para la prevención de la toxicidad por retinoides, es mejor que el antagonista de RAR se administre concurrentemente o antes del tratamiento con el agonista de RAR. En muchas situaciones, el antagonista de RAR se administrará mediante una vía diferente que la del agonista. Por ejemplo, se pueden evitar o mejorar efectos indeseables sobre la piel de un retinoide administrado entéricamente mediante un antagonista de RAR que se administra tópicamente.
Otro aspecto de la presente invención es un método para identificar hormonas negativas de retinoides. El método incluye las siguientes etapas: obtener células transfectadas que contienen un gen informador sensible transcripcionalmente a la unión de un receptor de retinoide recombinante, teniendo el receptor de retinoide recombinante al menos dominios proteínicos localizados en C-terminal, a un ADN que se une a un dominio de un receptor de retinoide intacto, medir un nivel basal de la expresión del gen indicador en células transfectadas no tratadas, propagándose las células transfectadas no tratadas en ausencia de un retinoide añadido, tratar las células transfectadas con un compuesto retinoide a ensayar para determinar la actividad de hormona negativa, medir un nivel de expresión del gen informador en células tratadas, comparar los niveles de expresión del gen informador medidos en células tratadas y células no tratadas, e identificar como hormonas negativas retinoides aquellos compuestos retinoides que producen un menor nivel de expresión del gen informador en células tratadas comparado con el nivel basal de la expresión de gen informador medida en células no tratadas. En ciertas realizaciones preferidas de este método, el receptor intacto es un subtipo RAR-\alpha, RAR-\beta o RAR-\gamma. En otras realizaciones, el receptor intacto es un subtipo RXR-\alpha, RXR-\beta o RXR-\gamma. El receptor recombinante puede ser también tanto un receptor de RAR recombinante como un receptor RXR recombinante. En algunas realizaciones, el receptor recombinante es un receptor de retinoide quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo. Tal dominio activador de transcripción constitutivo puede comprender una pluralidad de aminoácidos que tienen una carga negativa neta o tienen una secuencia de aminoácidos de un dominio activador de transcripción vírico, tal como el dominio activador de transcripción del virus VP-16 del herpes simple. En realizaciones en las que el dominio activador de transcripción constitutivo tiene una carga neta negativa, el receptor de retinoide puede ser recombinante y tiene suprimido un dominio de unión a DNA, tal como un dominio de unión a DNA específico para un elemento cis-regulador distinto de un elemento sensible a ácido retinoico. Estos elementos incluyen un elemento sensible a estrógeno. La célula transfectada se propaga preferiblemente en un medio de crecimiento sustancialmente exento de retinoides endógenos, tal como aquel que incluye suero extraído en carbón activado. En este método, el gen informador puede ser el gen luciferasa, en cuyo caso las etapas de medición pueden implicar luminometría. El gen informador puede ser también el gen \beta-galactosidasa, en cuyo caso las etapas de medida implicarían un ensayo de \beta-galactosidasa. La célula transfectada puede ser una célula de mamífero transfectada, tal como una célula de mono Green o una célula humana.
Otro aspecto de la presente invención es un método para potenciar una actividad farmacológica de un agonista del receptor de la superfamilia de esteroides a un mamífero. Este método implica coadministrar al mamífero con el agonista del receptor de la superfamilia de esteroides una composición que comprende una dosis farmacéuticamente efectiva de una hormona negativa retinoide para potenciar la actividad farmacológica del agonista del receptor de la superfamilia de esteroides. La actividad farmacológica se puede medir en un ensayo in vitro de trans-activación del gen informador, tal como midiendo la actividad anti-AP-1. La actividad farmacológica a ser potenciada puede ser una actividad antiproliferativa, tal como la actividad del tipo medible en el epitelio del pigmento retínico. El agonista del receptor de la superfamilia de esteroides puede ser cualquiera de los siguientes: un agonista del receptor de retinoides, un agonista del receptor de vitamina D, un agonista del receptor de glucocorticoides, un agonista del receptor de la hormona tiroidea, un agonista del receptor activado por el proliferador peroxisoma o un agonista del receptor de estrógenos. El agonista del receptor de retinoides puede ser un agonista de RAR, tal como ácido todo-trans-retinoico o ácido 13-cis-retinoico. El agonista del receptor de retinoides puede ser también un agonista de RXR. Un agonista preferido del receptor de vitamina D es 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. Un agonista preferido del receptor de glucocorticoides es dexametasona. Un agonista preferido del receptor de la hormona tiroidea es 3,3',5-triyodotironina. La hormona negativa retinoide es una hormona negativa retinoide específica para RAR, que tiene preferiblemente una constante de disociación menor o aproximadamente igual a 30 nM. Ejemplo de la hormona negativa retinoide específica para RAR incluye AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 y AGN 193871. La composición que comprende una dosis farmacéuticamente efectiva de una hormona negativa retinoide se puede coadministrar al mismo tiempo que el agonista de la superfamilia de esteroides, y se puede combinar antes de la coadministración. También se puede coadministrar como composiciones separadas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la estructura química de AGN 193109.
Las Figuras 2A-2F son una serie de gráficos lineales que muestran que AGN 193109 inhibió la transactivación dependiente de ATRA en los RAR. Las Figuras 2A y 2B representan la actividad en el receptor de RAR-\alpha; las Figuras 2C y 2D representan la actividad en el receptor de RAR-\beta; las Figuras 2E y 2F representan la actividad en el receptor de RAR-\gamma. En las Figuras 2A, 2C y 2E, los cuadrados abiertos representan el tratamiento con ácido retinoico, y los círculos rellenos representan el tratamiento con AGN 193109. En las Figuras 2B, 2D y 2F, las líneas sencillas representan la actividad de luciferasa medida tras el tratamiento con 10^{-8} M de ATRA y concentraciones variables de AGN 193109.
Las Figuras 3A y 3B son gráficos lineales que representan la actividad de luciferasa detectada en células CV-1 transfectadas con plásmido informador ERE-tk-Luc, y plásmido de expresión ER-RAR-\alpha, y estimuladas con ATRA (Figura 3A) o AGN 193109 (Figura 3B) a diversas concentraciones. Los puntos de datos representan la media \pm SEM de tres determinaciones independientes de luciferasa. Los resultados de las transfecciones llevadas a cabo usando diferentes cantidades de ER-RAR-\alpha co-transfectado (0,05, 0,1 y 0,2 \mug/pocillo) se indican en cada figura.
Las Figuras 4A y 4B son gráficos lineales que representan la actividad de luciferasa en células CV-1 transfectadas con plásmido informador ERE-tk-Luc y plásmido de expresión ER-RAR-\beta, y estimuladas con ATRA (Figura 4A) o AGN 193109 (Figura 4B) a diversas concentraciones. Los puntos de datos representan la media \pm SEM de tres determinaciones independientes de luciferasa. Los resultados de las transfecciones llevadas a cabo usando cantidades diferentes de ER-RAR-\beta co-transfectada (0,05, 0,1 y 0,2 \mug/pocillo) se indican en cada figura.
Las Figuras 5A y 5B son gráficos lineales que representan la actividad de luciferasa detectada en células CV-1 transfectadas con plásmido informador ERE-tk-Luc, y plásmido de expresión ER-RAR-\alpha, y estimuladas con ATRA (Figura 5A) o AGN 193109 (Figura 5B) a diversas concentraciones. Los puntos de datos representan la media \pm SEM de tres determinaciones independientes de luciferasa. Los resultados de las transfecciones llevadas a cabo usando diferentes cantidades de ER-RAR-\alpha co-transfectado (0,05, 0,1 y 0,2 \mug/pocillo) se indican en cada figura.
La Figura 6 muestra respuestas a las dosis de ATRA y AGN 193109 de células CV-1 cotransfectadas con el plásmido informador ERE-tk-Luc y tanto el plásmido de expresión del receptor quimérico ER-RXR-\alpha sólo o en combinación con el plásmido de expresión RAR-\gamma-VP-16. Las células cotransfectadas con ER-RXR-\alpha se trataron con ATRA (cuadrado) y AGN 193109 (diamantes). Las células cotransfectadas con la combinación de ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16 se trataron con ATRA (círculos) o AGN 193109 (triángulos).
La Figura 7 muestra un gráfico lineal que representa medidas de actividad de luciferasa registradas en lisados de células CV-1 transfectadas con el constructo informador ERE-tk-Luc y de expresión ER-RAR-\gamma, y luego tratadas con ATRA a 10^{-8} M y los compuestos de ensayo a las concentraciones indicadas en el eje horizontal. Los compuestos de ensayo fueron AGN 193109 (cuadrado), AGN 193357 (diamante despejado), AGN 193385 (círculo), AGN 193389 (triángulo), AGN 193840 (cuadrado en negrita) y AGN 192870 (diamante sombreado).
La Figura 8 muestra un gráfico lineal que representa medidas de actividad de luciferasa registradas en lisados de células CV-1 transfectadas con los constructos informadores ERE-tk-Luc y de expresión RAR-\gamma-VP-16 y ER-RXR-\alpha, y luego tratadas los compuestos de ensayo a las concentraciones indicadas en el eje horizontal. Los compuestos de ensayo fueron ATRA (cuadrado despejado), AGN 193109 (círculo en blanco), AGN 193274 (triángulo en blanco), AGN 193199 (cuadrado sombreado), AGN 193385 (círculo sombreado), AGN 193389 (triángulo invertido), AGN 193840 (cuadrado relleno diagonalmente) y AGN 193871 (diamante semi-relleno).
Las Figuras 9A, 9B y 9C representan un diagrama esquemáticamente de un mecanismo por el que AGN 193109 puede modular la interacción entre el RAR (caja sombreada) y proteínas coactivadoras negativas (-) ilustrada en el contexto de un ensayo de transactivación. La Figura 9A muestra que las proteínas coactivadoras negativas y proteínas coactivadoras positivas (+) están en un equilibrio de unión con el RAR. En ausencia de un ligando, se produce la transcripción del nivel basal del gen informador. Como se ilustra en la Figura 9B, la adición de un agonista de RAR promueve la asociación de proteínas coactivadoras positivas con el RAR, y da como resultado una transcripción sobrerregulada del gen informador. Como se ilustra en la Figura 9C, la adición de AGN 193109 promueve la asociación de proteínas coactivadoras negativas con el RAR, y evita la transcripción del gen informador.
La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la inhibición de la expresión de Str-AP1-CAT inducida por TPA como una función de la concentración de AGN 191183 (10^{-10} a 10^{-12} M), manteniendo constante a 10^{-8} M la concentración de AGN 193109. Los resultados de estos ensayos realizados con AGN 191183 sólo se muestran como barras sombreadas, mientras que las barras a rayas representan los resultados a partir de tratamiento con la combinación de AGN 193109 y AGN 191183.
La Figura 11 representa un diagrama esquemático de un mecanismo por el que AGN 193109 puede potenciar las actividades de los RAR y otros miembros de la familia de receptores nucleares. Como se ilustra en el diagrama los RAR introducidos (rectángulos en blanco que tienen dominios AB-C-DEF) tienen una sensibilidad aumentada por ligandos de RAR en el ensayo anti-AP1 debido a que la proteína coactivadora negativa (ncp), presente en el suministro limitante, es secuestrada sobre los RAR conduciendo de ese modo a dos poblaciones: RAR+ncp y RAR-ncp. La RAR-ncp tiene una sensibilidad aumentada por los ligandos. Los factores nucleares no RAR (rectángulos sombreados que tienen dominios AB-C-DEF) tienen sensibilidad aumentada por ligandos cognatos debido a que la ncp ha sido secuestrada hacia el RAR por la actividad de ASH 193109. Los dominios modulares de los receptores nucleares se designan usando la nomenclatura estándar como "AB" (dominio de transactivación independiente de ligando), "C" (dominio de unión a ADN), y "DEF" (dominio de transactivación regulado por ligando y dominio de dimerización).
La Figura 12 es un gráfico lineal que muestra el efecto de AGN 193109 sobre la respuesta a la dosis de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} en células CV-1 transfectadas con el plásmido informador MTV-DR3-Luc. Los agentes transfectantes se trataron con 1,25-dihidroxivitamina D_{3} (cuadrado lleno), 1,25-dihidroxivitamina D_{3} y AGN 193109 10^{-8} M (triángulo lleno) y 1,25-dihidroxivitamina D_{3} y AGN 193109 10^{-7} M (círculo lleno).
La Figura 16 es una gráfica de barras que muestra el efecto de la coadministración de AGN 193109 (10 nM) en la inhibición mediada por 1,25-dihidroxivitamina D_{3} de la actividad de Str-AP1-CAT inducida por TPA. Las barras rellenas representan la inhibición de la actividad de CAT en células transfectadas tratadas con 1,25-dihidroxivitamina D_{3} sola. Las barras en blanco representan la inhibición de la actividad de CAT en células transfectadas tratadas con la combinación de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} y AGN 193109.
La Figura 14 es una gráfica de líneas que muestra el efecto de AGN 193109 sola y en combinación con AGN 191183 sobre células HeLa cotransfectadas con RAR-\gamma y el constructo informador MTV-TREp-Luc sensible a RAR. Los tratamientos con fármacos ilustrados en la gráfica son: AGN 193109 sólo (cuadrado), AGN 193109 en combinación con AGN 191183 a 10^{-10} M (diamantes) y AGN 193109 en combinación con AGN 191183 a 10^{-9} M.
La Figura 15 es una gráfica lineal que muestra que las células ECE16-11 proliferaron en respuesta a EGF (cuadrado relleno) pero no en respuesta al medio definido solo (círculo en blanco). Las células tratadas con AGN 193109 sólo se representan por el triángulo relleno. Los círculos rellenos representan los resultados obtenidos para células tratadas con AGN 191183 10 nM y AGN 193109 0-1000 nM.
La Figura 16 es una gráfica de barras que muestra el efecto de AGN 193109 sobre la proliferación de células CaSki en presencia o ausencia del agonista de retinoides AGN 191183. Todos los grupos de muestra recibieron 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) con la excepción de la muestra propagada en medio definido (DIÁMETRO) solo (barra en blanco). Las barras con franjas representan muestras propagadas en ausencia de AGN 193109. Las barras rellenas representan muestras propagadas en presencia de AGN 193109 1000 nM. Las concentraciones de AGN 191183 usadas en el procedimiento se muestran en el eje horizontal.
La Figura 17 es una curva de respuesta a la dosis que muestra que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de ATRA sobre células del epitelio del pigmento retínico (RPE). Las muestras tratadas con sólo ATRA se representan por cuadrados rellenos. Las muestras tratadas con la combinación de ATRA y AGN 193109 (10^{-7} M) se representan por círculos rellenos. La concentración de ATRA usada para tratar las diversas muestras se da en el eje horizontal.
La Figura 18 es una curva de respuesta a la dosis que muestra que tanto 13-cis-RA como ATRA inhibieron el crecimiento de las células del RPE, y que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de 13-cis-RA. Los diversos tratamientos de las muestras señalados en la curva de respuesta a la dosis incluyeron 13-cis-RA sólo (cuadrado relleno), 13-cis-RA en combinación con AGN 193109 (10^{-6} M) (círculo relleno), 13-cis-RA en combinación con AGN 193109 (10^{-8} M) (triángulo relleno), y ATRA (diamante relleno). Las concentraciones de 13-cis-RA y ATRA usadas en los tratamientos de las muestras se presentan en el eje horizontal.
La Figura 19 es una curva de respuesta a la dosis que muestra que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de dexametasona en cultivos de células primarias de RPE. Los diversos tratamientos de las muestras presentados en la curva de respuesta a la dosis incluyeron ATRA (cuadrado relleno), dexametasona sola (círculo relleno), dexametasona en combinación con AGN 193109 (10^{-8} M) (triángulo relleno), y dexametasona en combinación con AGN 193109 (10^{-6} M) (diamante relleno). Las concentraciones de dexametasona y ATRA usadas en los tratamientos de las muestras se presentan en el eje horizontal.
La Figura 20 es una curva de respuesta a la dosis que muestra que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de la hormona del tiroides (T3) en cultivos de células primarias de RPE. Los diversos tratamientos de las muestras presentados en la curva de respuesta a la dosis incluyeron ATRA (cuadrado relleno), T3 sola (círculo relleno), T3 en combinación con AGN 193109 (10^{-8} M) (triángulo relleno), T3 en combinación con AGN 193109 (10^{-6} M) (diamante relleno). Las concentraciones de T3 y ATRA usadas en los tratamientos de las muestras se presentan en el eje horizontal.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Para los fines de la presente invención, un antagonista de RAR se define como un compuesto químico que se une a uno o más de los subtipos de RAR con una K_{d} menor que 1 micromolar (K_{d} < 1 \muM) pero que no provoca una activación transcripcional significativa de esos genes regulados por los subtipos de RAR en un ensayo de cotransfección de receptor. Convencionalmente, los antagonistas son agentes químicos que inhiben las actividades de los agonistas. De este modo, la actividad de un antagonista de receptor se mide convenientemente en virtud de su capacidad para inhibir la actividad de un agonista.
Un agonista de RAR se define como un compuesto químico que se une a uno o más subtipos de receptores de RAR con K_{d} menor que 1 micromol (K_{d} < 1 \muM), y provoca la activación transcripcional de esos genes regulados por el subtipo de RAR en un ensayo de cotransfección de receptores. La expresión "agonista de RAR" incluye compuestos químicos que se pueden unir a y/o activar otros receptores además de a RAR, por ejemplo receptores de RXR.
Como se usa en este documento, una hormona negativa o agonista inverso es un ligando para un receptor que provoca que el receptor adopte un estado inactivo con relación a un estado basal que aparece en ausencia de cualquier ligando. De este modo, aunque un antagonista puede inhibir la actividad de un agonista, una hormona negativa es un ligando que puede alterar la conformación del receptor en ausencia de un agonista. El concepto de hormona negativa o agonista inversa ha sido explorado por Bond et al. en Nature 374:272 (1995). Más específicamente, Bond et al. han propuesto que el \beta2-adrenoreceptor no ligado existe en un equilibrio entre una conformación inactiva y una conformación espontáneamente activa. Se propone que los agonistas estabilizan el receptor en una conformación activa. Por el contrario, se cree que los agonistas inversos estabilizan una conformación inactiva del receptor. De este modo, aunque un antagonista manifiesta su actividad en virtud de una inhibición de un agonista, una hormona negativa puede manifestar adicionalmente su actividad en ausencia de un agonista inhibiendo la conversión espontánea de un receptor no ligado a una conformación activa. Sólo un subconjunto de antagonistas actuarán como hormonas negativas. Como se describe en esta memoria, AGN 193109 es tanto antagonista como hormona negativa. Hasta la fecha, no se ha demostrado que otros retinoides tengan actividad de hormona negativa.
Como se usa en este documento, la coadministración de dos compuestos farmacológicamente activos se refiere al suministro de dos entidades químicas separadas, ya sea in vitro o in vivo. La coadministración se refiere al suministro simultáneo de agentes separados; al suministro simultáneo de una mezcla de agentes; así como al suministro de un agente seguido de la administración de un segundo agente. En todos los casos, los agentes que se coadministran están destinados a funcionar conjuntamente entre sí.
El término alquilo se refiere y cubre cualquiera y todos los grupos que se sabe son alquilos, alquilos de cadena ramificada y cicloalquilos conocidos. El término alquenilo se refiere y cubre grupos alquenilo normales, grupos alquenilos de cadena ramificada y cicloalquenilos que tienen uno o más sitios de insaturación. De forma similar, el término alquinilo se refiere y cubre a grupos alquinilo normales, y alquinilos de cadena ramificada, que tienen uno o más triples enlaces.
Alquilo inferir significa la definición amplia anteriormente dada de grupos alquílicos que tienen 1 a 6 carbonos en caso de alquilos inferiores, y según sea aplicable 3 a 6 carbonos para grupos ramificados inferiores y cicloalquilos. De forma similar, el alquenilo inferior se define por 2 a 6 átomos de carbono para grupos alquenílicos inferiores normales, y 3 a 6 carbonos para grupos alquenílicos inferiores ramificados y cíclicos. Alquinilo inferior también se define de forma similar por tener 2 a 6 carbonos para grupos alquinílicos inferiores normales, y 4 a 6 carbonos para grupos alquinílicos inferiores de cadena ramificada.
El término "éster" se usa aquí para referirse y cubrir cualquier compuesto que cae dentro de la definición de ese término como se usa clásicamente en química orgánica. Incluye ésteres orgánicos e inorgánicos. Cuando B (de Fórmula 1 o Fórmula 101) es -COOH, este término cubre los productos derivados a partir del tratamiento de esta función con alcoholes o tioles, preferiblemente con alcoholes alifáticos que tienen 1-6 carbonos. Cuando el éster se obtiene a partir de compuestos en los que B es -CH_{2}OH, este término cubre compuestos obtenidos a partir de ácidos orgánicos capaces de formar ésteres, que incluyen ácidos a base de fósforo y a base de azufre, o compuestos de la fórmula -CH_{2}OCOR_{11} en la que R_{11} es cualquier grupo alifático, aromático, heteroaromático o alifático aromático sustituido o no sustituido, preferiblemente con 1-6 carbonos en las porciones alifáticas.
Excepto que se establezca de otro modo en esta solicitud, los ésteres preferidos se obtienen a partir de alcoholes alifáticos saturados o ácidos de 10 o menor número de átomos de carbono, o los alcoholes cíclicos o cíclicos alifáticos saturados y ácidos de 5 a 10 átomos de carbono. Los ésteres alifáticos particularmente preferidos son aquellos que se obtienen a partir de ácidos y alcoholes de alquilo inferior. También se prefieren los ésteres fenílicos o alquilfenílicos inferiores.
Las amidas tienen el significado clásicamente acordado para ese término en química orgánica. En este caso, incluye las amidas no sustituidas y todas las amidas alifáticas y aromáticas mono y disustituidas. Excepto que se establezca de otro modo en esta solicitud, las amidas preferidas son las amidas mono y disustituidas obtenidas a partir de radicales alifáticos saturados de 10 o menor número de átomos de carbono, o radicales cíclicos o alifaticocíclicos saturados de 5 a 10 átomos de carbono. Las amidas particularmente preferidas son aquellas que se obtienen a partir de alquilaminas inferiores sustituidas y no sustituidas. También se prefieren amidas mono y disustituidas obtenidas a partir de las fenilaminas o alquilfenilaminas inferiores sustituidas y no sustituidas. También se prefieren las amidas no sustituidas.
Los acetales y cetales incluyen los radicales de la fórmula -CK en la que K es (-OR)_{2}. Aquí, R es alquilo inferior. También, K puede ser -OR_{7}O- en la que R_{7} es alquilo inferior de 2-5 átomos de carbono, de cadena lineal o ramificada.
Una sal farmacéuticamente aceptable se puede preparar para cualquiera de los compuestos en esta invención que tengan una funcionalidad capaz de formar una sal, por ejemplo una funcionalidad de ácido. Una sal farmacéuticamente aceptable es cualquier sal que retenga la actividad del compuesto progenitor y que no proporcione ningún efecto pernicioso o desfavorable sobre el sujeto al que se administra y en el contexto en el que se administra.
Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener a partir de bases orgánicas o inorgánicas. La sal puede ser un ion mono o polivalente. De particular interés son los iones inorgánicos, sodio, potasio, calcio y magnesio. Las sales orgánicas se pueden obtener con aminas, particularmente sales de amonio tales como mono, di y trialquilaminas o etanolaminas. Las sales también se pueden formar con cafeína, trometamina y moléculas similares. Cuando hay un nitrógeno suficientemente básico para que sea capaz de formar sales de adición de ácidos, éstas se pueden formar con cualquier ácido inorgánico u orgánico o agente alquilante tal como yoduro de metilo. Las sales preferidas son aquellas formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. También se puede usar cualquier número de ácidos orgánicos simples, tales como el monoácido, diácido o triácido.
Algunos de los compuestos de la presente invención pueden tener isómeros trans y cis (E y Z). Además, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros quirales y, por lo tanto, pueden existir en formas enantiómeras y diastereómeras. El alcance de la presente invención está destinado a cubrir todos los citados isómeros per se, así como mezclas de isómeros cis y trans, mezclas de diastereómeros y mezclas racémicas de enantiómeros (isómeros ópticos) igualmente. En la presente solicitud, cuando no se haga mención específica de la configuración (cis, trans o R o S) de un compuesto (o de un carbono asimétrico), entonces se destina una mezcla de tales isómeros, o bien uno de los isómeros.
Derivados benzopiránicos, benzotiopiránicos, dihidroquinolínicos y 5,6-dihidronaftalénicos, aril y (3-Oxo-1-propenil)-sustituidos, que tienen actividad biológica similar a antagonistas de retinoides
Con referencia al símbolo Y en la Fórmula 101, los compuestos preferidos de la invención son aquellos en los que Y es fenilo, piridilo, tienilo o furilo. Incluso son más preferidos los compuestos en los que Y es fenilo o piridilo, y aún más preferidos en los que Y es fenilo. En cuanto se refiere a las sustituciones en los grupos Y (fenilo) e Y (piridilo), se prefieren compuestos en los que el grupo fenilo esté sustituido en 1,4 (para) por los grupos -CR_{16} = CR_{17}- y A-B, y en los que el anillo piridínico está sustituido en 2,5 por los grupos -CR_{16}-CR_{17}- y A-B. (La sustitución en las posiciones 2,5 en la nomenclatura "piridínica" corresponde a la sustitución en la posición 6 en la nomenclatura del "ácido nicotínico"). En los compuestos preferidos de la invención no hay sustituyente opcional R_{2} sobre el grupo Y.
El grupo A-B de los compuestos preferidos es (CH_{2})_{n}-COOH o (CH_{2})_{n}-COOR_{8}, en los que n y R_{8} se definen como anteriormente. Incluso más preferiblemente, n es 0 y R_{8} es alquilo inferior, o n es 0 y B es COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
En los ejemplos actualmente preferidos de compuestos de la invención, X es [C(R_{1})_{2}]_{n} en el que n es 1. No obstante, también se prefieren compuestos en los que X es S u O (derivados benzotiopiránicos y benzopiránicos). Cuando X es [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 1, entonces R_{1} es preferiblemente alquilo de 1 a 6 carbonos, incluso más preferiblemente metilo.
El grupo R_{2} unido a la porción aromática del resto tetrahidronaftalénico, benzopiránico, benzotiopiránico o dihidroquinolínico de los compuestos de Fórmula 101, es preferiblemente H, F o CF_{3}. R_{3} es preferiblemente hidrógeno o metilo, incluso más preferiblemente hidrógeno.
Refiriéndose ahora al grupo R_{14}, se prefieren compuestos en los que R_{14} es fenilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 2-tienilo, y 2-tiazolilo. El grupo R_{15} (sustituyente del grupo R_{14}) es preferiblemente H, alquilo inferior, trifluorometilo, cloro, alcoxi inferior o hidroxi.
Compuestos preferidos de la invención se muestran en la Tabla 2 con referencia a la Fórmula 102.
2
TABLA 2
Compuesto R_{15}* R_{8}*
101 CH_{3} H
102 CH_{3} Et
103 H H
104 H Et 
\newpage
Actividad biológica, modos de administración
Como se ha indicado anteriormente, los compuestos de la presente invención son antagonistas de uno o más subtipos de receptores de RAR. Esto significa que los compuestos de la invención se unen a uno o más subtipos de receptores de RAR, pero no provocan la respuesta que es provocada por agonistas de los mismos receptores. Algunos de los compuestos de la presente invención son antagonistas de los tres subtipos de receptores de RAR (RAR-\alpha, 
\hbox{RAR- \beta }
y RAR-\gamma), y se les denomina "panantagonistas de RAR". Algunos otros son antagonistas de sólo uno o dos de los subtipos de receptores de RAR. Algunos compuestos dentro del alcance de la presente invención son agonistas parciales de uno o dos subtipos de receptores de RAR y antagonistas de los restantes subtipos. Los compuestos de la invención no se unen a receptores de RXR, por lo tanto no son ni agonistas ni antagonistas de RXR.
Dependiendo del sitio y de la naturaleza de los efectos secundarios indeseables que se desea suprimir o mejorar, los compuestos usados según la invención pueden ser antagonistas de uno sólo o dos de los subtipos de receptores de RAR. Algunos compuestos usados según la invención pueden ser agonistas parciales de uno o dos subtipos de receptores de RAR, y antagonistas de los restantes subtipos. Tales compuestos, son, hablando generalmente, utilizables según la invención si el efecto antagonista es sobre aquél subtipo (o subtipos) del receptor de RAR que es (son) responsable o responsables predominantemente del envenenamiento por sobredosis o del efecto o efectos secundarios indeseados. A este respecto, se hace observar que hablando generalmente, un compuesto se considera un antagonista de un subtipo de receptor dado si en los ensayos de cotransfección descritos más abajo el compuesto no provoca una activación transcripcional significativa del receptor regulado por el gen informador, pero no obstante se une al receptor con un valor K_{d} menor que aproximadamente 1 \muM.
En los siguientes ensayos se puede analizar si un compuesto es un antagonista de RAR y, por tanto, se puede utilizar según la presente invención.
En la Solicitud PCT publicada nº WO94/17796, publicada el 18 de Agosto de 1994, se describe en detalle un ensayo de transactivación de receptor quimérico que analiza la actividad similar a agonista en los subtipos de receptores de BAR-\alpha, RAR-\beta, RAR-\gamma, RXR-\alpha, y que se basa en el trabajo publicado por Feigner P. L. y Holm M. Focus Vol 11, No. 2 (1989). Esta última publicación es la contraparte PCT de la solicitud U.S. serie nº 08/016.404, presentada el 11 de Febrero de 1993, que se expidió como Patente de EE.UU. nº 5.455.265. En este ensayo un compuesto no debe causar activación significativa de un gen informador a través de un subtipo de receptor dado (RAR-\alpha, RAR-\beta o RAR-\gamma), a fin de cuantificarlo como un antagonista de RAR con utilidad en la presente invención.
En la Solicitud publicada PCT nº WO93/11755 (particularmente en las páginas 30-33 y 37-41), publicada el 24 de Junio de 1993, se describe un ensayo de transactivación de holorreceptor y un ensayo de unión a ligando, que mide la actividad similar a antagonista/agonista de los compuestos de la invención, o su capacidad para unirse a los diversos subtipos de receptores de retinoides, respectivamente. También se proporciona a continuación una descripción del ensayo de transactivación de holorreceptor.
Ensayo de transactivación de holorreceptor
Se transfectaron células CV1 (5.000 células/pocillo) con un plásmido informador de RAR MTV-TREp-LUC (50 ng) junto con uno de los vectores de expresión de RAR (10 ng) en un formato de 96 pocillos automatizado mediante el procedimiento de fosfato de calcio de Heyman et al. Cell 68: 397-406. Para los ensayos de transactivación de RXR-\alpha y RXR-\gamma, se usó un plásmido informador sensible a RXR CRBPII-tk-LUC (50 ng) junto con los vectores de expresión de RXR apropiados (10 ng), sustancialmente como se describe por Heyman et al. anteriormente, y Allegretto et al. J. Biol. Chem. 268: 26625-26633. Para los ensayos de transactivación de RXR-\beta, se usó como se describe anteriormente un plásmido informador CPRE-tk-LUC (50 mg) sensible a RXR, junto con el vector de expresión de RXR-\beta (10 ng). Estos informadores contienen elementos DRI a partir de CRBPII humano y ciertos elementos DRI precedentes de promotor, respectivamente (véase Mangelsdorf et al. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, p. 319-349, Raven Press Ltd., New York y Heyman et al., citado anteriormente). Se usó un vector de expresión de \beta-galactosidasa (50 ng) como un control interno en las transfecciones para normalizar las variaciones en la eficiencia de la transfección. Las células se transfectaron por triplicado durante 6 horas, seguido de incubación con retinoides durante 36 horas, y los extractos se analizaron para determinar las actividades de luciferasa y \beta-galactosidasa. El procedimiento experimental detallado para las transactivaciones de holorreceptores se ha descrito en Heyman et al. anteriormente y Allegretto et al. citado anteriormente. Los resultados obtenidos en este ensayo se expresan en números de EC_{50}, puesto que también están en el ensayo de transactivación de receptor quimérico. Los resultados del ensayo de unión a ligando se expresan en números de K_{d}. Véase Cheng et al. Biochemical Pharmacology 22: 3099-3108.
Un compuesto no debe causar la activación significativa de un gen informador a través de un subtipo dado de receptor (RAR-\alpha, RAR-\beta o RAR-\gamma) en el ensayo de transactivación de holorreceptores, a fin de cualificarlo como un antagonista de RAR con utilidad en la presente invención. Finalmente, pero no menos importante, un compuesto se debe unir a al menos uno de los subtipos de receptores de RAR en el ensayo de unión a ligandos, con una K_{d} menor que aproximadamente 1 micromolar (Kd < 1 \muM), a fin de ser capaz de funcionar como un antagonista del subtipo de receptor unido, con la condición de que el mismo subtipo de receptor no sea activado significativamente por el compuesto.
La Tabla 3 a continuación muestra los resultados del ensayo de transactivación de holorreceptor, y la Tabla 4 describe la eficacia (en porcentaje) en este ensayo, del compuesto de ensayo con relación al ácido todo-trans-retinoico, para ciertos compuestos ejemplares de la invención. La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo de unión a ligandos para ciertos compuestos ejemplares de la invención.
TABLA 3
Ensayo de transactivación de holorreceptor
Compuesto EC_{50} (nanomolar)
n° RAR\alpha RAR\beta RAR\gamma RXR\alpha RXR\beta RXR\gamma
18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
26 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
27 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
28 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
29 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
31 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
32 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
34 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
39 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
45 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
46b 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
52 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
60 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
61 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
63 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
101 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
103 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,0 en la Tabla 3 indica que el compuesto es 20% menos activo (eficaz) en este ensayo
que el ácido todo-trans-retinoico
TABLA 4
Eficacia del ensayo de transactivación (% de actividad de RA)
Compuesto n° RAR\alpha RAR\beta RAR\gamma RXR\alpha RXR\beta RXR\gamma
18 4,0 1,00 0,00 2,00 10,00 1,0
19 0,00 5,0 3,0 0,0 9,0 4,0
20 3,0 4,0 0,00 4,00 0,00 3,0
21 2,00 2,00 2,00 3,00 0,00 3,00
22 0,00 0,00 2,00 1,00 0,00 2,00
23 0,00 6,00 3,00 1,00 0,00 4,00
24 3,00 7,00 4,00 1,00 0,00 3,00
25 2,00 3,00 3,00 5,00 0,00 3,00
TABLA 4 (continuación)
Eficacia del ensayo de transactivación (% de actividad de RA)
Compuesto n° RAR\alpha RAR\beta RAR\gamma RXR\alpha RXR\beta RXR\gamma
26 1,00 6,00 0,00 2,00 0,00 3,00
27 9,00 14,00 6,00 2,00 0,00 4,00
28 2,00 10,00 2,00 2,00 0,00 3,00
29 0,00 6,00 11,00 0,00 6,00 2,00
30 3,00 5,00 1,00 0,00 9,00 3,00
31 4,00 14,00 2,00 1,00 8,00 6,00
32 0,00 2,00 2,00 1,00 0,00 2,00
34 3,00 5,00 2,00 1,00 0,00 3,00
36 1,00 5,00 0,00 1,00 7,00 2,00
39 1,00 7,00 9,00 2,00 0,00 1,00
41 3,00 5,00 6,00 1,00 0,00 3,00
45 2,00 0,00 7,00 3,00 8,00 0,00
46b 4,00 5,00 3,00 2,00 0,00 4,00
52 0,00 15,00 3,00 0,00 0,00 10,00
60 0,00 1,00 4,00 3,00 0,00 3,00
61 2,00 2,00 0,00 1,00 0,00 3,00
63 2,00 2,00 7,00 1,00 0,00 1,00
101 0,00 4,00 2,00 1,00 0,00 3,0
103 4,00 12,0 7,0 0,00 0,0 2,0
TABLA 5
Ensayo de unión a ligando
Compuesto K_{d} (nanomolar)
n° RAR\alpha RAR\beta RAR\gamma RXR\alpha RXR\beta RXR\gamma
18 24,00 11,00 24,00 0,00 0,00 0,00
19 565 210 659 0,00 0,00 0,00
20 130,00 22,0 34,00 0,00 0,00 0,00
21 16 9 13 0,00 0,00 0,00
22 24,0 17,0 27,0 0,00 0,00 0,00
23 32,00 25,00 31,00 0,00 0,00 0,00
24 699 235 286 0,00 0,00 0,00
25 50 17 20 0,00 0,00 0,00
26 40,00 31,00 36,00 0,00 0,00 0,00
27 69,00 14,00 26,00 0,00 0,00 0,00
28 669 77 236 0,00 0,00 0,00
29 234 48 80 0,00 0,00 0,00
30 683 141 219 0,00 0,00 0,00
31 370 52,0 100,00 0,00 0,00 0,00
32 0,00 89,00 169,00 0,00 0,00 0,00
34 52,00 30,00 17,00 0,00 0,00 0,00
36 13,00 550,00 0,00 0,00 0,00 0,00
39 67,00 38,00 113,00 0,00 0,00 0,00
41 5,1 491 725 0,00 0,00 0,00
45 12,0 2,80 17,0 0,00 0,00 0,00
46b 250 3,70 5,80 0,00 0,00 0,00
52 60,00 63,00 56,00 0,00 0,00 0,00
TABLA 5 (continuación)
Ensayo de unión a ligando
Compuesto K_{d} (nanomolar)
n° RAR\alpha RAR\beta RAR\gamma RXR\alpha RXR\beta RXR\gamma
60 1,5 1,9 3,3 0,00 0,00 0,00
61 95 15 16 0,00 0,00 0,00
63 133 3219 0,00 0,00 0,00 0,00
101 750 143 637 0,00 0,00 0,00
103 301 273 261 0,00 0,00 0,00
0,0 en la Tabla 5 indica un valor mayor que 1000 nM.
Como se puede observar a partir de los estados de ensayo resumidos en las Tablas 3, 4 y 5, los compuestos ejemplares allí indicados de la invención son antagonistas de los subtipos de receptores de RAR, pero no tienen afinidad por los subtipos de receptores de RXR. (Otros compuestos de la invención pueden ser antagonistas de algunos pero no todos los subtipos de receptores de RAR, y agonistas de los restantes subtipos de RAR). Debido a esta propiedad, los compuestos de la invención se pueden usar para bloquear la actividad de agonistas de RAR en ensayos biológicos. En mamíferos, incluyendo seres humanos, los compuestos de la invención se pueden coadministrar con agonistas de RAR y, por medio de una selectividad farmacológica o administración específica del sitio, previenen preferentemente los efectos secundarios de los agonistas de RAR. Los compuestos de la invención también se pueden usar para tratar sobredosis de vitamina A, aguda o crónica, que resulta ya sea de la ingesta excesiva de suplementos de vitamina A o de la ingestión de hígado de ciertos peces y animales que contienen un nivel elevado de vitamina A. Aún adicionalmente, los compuestos de la invención también se pueden usar para tratar la toxicidad aguda o crónica causada por fármacos retinoides. Se ha sabido en la técnica que las toxicidades observadas con síndrome de hipervitaminosis A (dolores de cabeza, pelado de la piel, toxicidad ósea, dislipidemias) son similares o idénticas a las toxicidades observadas con otros retinoides, sugiriendo una causa biológica común, esto es, la activación de RAR. Debido a que los compuestos de la presente invención bloquean la activación de RAR, son adecuados para tratar las toxicidades anteriores.
Los compuestos de la invención son capaces de prevenir sustancialmente la irritación cutánea inducida por retinoides agonistas de RAR, cuando el compuesto de la invención se coadministra tópicamente a la piel. De forma similar, los compuestos de la invención se pueden administrar tópicamente a la piel, para bloquear la irritación cutánea, en pacientes o animales a los que se les administra sistémicamente compuestos agonistas de RAR. Los compuestos de la invención pueden acelerar la recuperación de una toxicidad preexistente de retinoides, pueden bloquear la hipertrigliceridemia causada por retinoides coadministrados, y pueden bloquear la toxicidad ósea inducida por un agonista (retinoide) de RAR.
Hablando generalmente, para aplicaciones terapéuticas en mamíferos según la presente invención, los compuestos antagonistas se pueden administrar entérica o tópicamente como un antídoto a la vitamina A, precursores de la vitamina A, o antídoto para la toxicidad de retinoides que resulta de una sobredosis o exposición prolongada, después de haberse discontinuado la ingesta del factor causante (precursor de vitamina A u otro retinoide). Como alternativa, los compuestos antagonistas se coadministran con fármacos retinoides según la invención, en situaciones en los que el retinoide proporciona un beneficio terapéutico, y en las que el antagonista coadministrado alivia o elimina uno o más efectos secundarios indeseados del retinoide. Para este tipo de aplicación, el antagonista se puede administrar de una manera específica del sitio, por ejemplo como una crema o loción tópicamente aplicada, mientras que el retinoide coadministrado se puede proporcionar entéricamente.
Para aplicaciones terapéuticas según la presente invención, los compuestos antagonistas se incorporan en composiciones farmacéuticas, tales como comprimidos, pastillas, cápsulas, disoluciones, suspensiones, cremas, ungüentos, geles, bálsamos, lociones, y similares, usando excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables que per se son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la preparación de formulaciones tópicas se describe bien en Remington's Pharmaceutical Science, Edition 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Para la aplicación tópica, los compuestos antagonistas también se podrían administrar como un polvo o pulverización, particularmente en forma de aerosol. Si el fármaco se ha de administrar sistémicamente, se puede confeccionar como un polvo, pastilla, comprimido, o similar, o como un jarabe o elixir adecuado para la administración oral. Para la administración intravenosa o intraperitoneal, el compuesto antagonista se preparará como una disolución o suspensión capaz de ser administrada mediante inyección. En ciertos casos, puede ser útil formular los compuestos antagonistas mediante inyecciones. En ciertos casos, puede ser útil formular los compuestos antagonistas en forma de supositorios o como una formulación de liberación prolongada para su depósito bajo la piel o inyección intramuscular.
Los compuestos antagonistas se administrarán en una dosis terapéuticamente efectiva según la invención. Una concentración terapéutica será aquella concentración que efectúe una reducción del estado particular (tal como toxicidad debido a exposición a retinoides o vitamina A, o efectos secundarios de fármacos retinoides) o retarda su expansión. Se debe entender que cuando se coadministran los compuestos antagonistas para bloquear la toxicidad inducida por retinoides o efectos secundarios según la invención, los compuestos antagonistas se usan de una manera profiláctica para prevenir el comienzo de un estado particular, tal como irritación cutánea.
Una concentración terapéutica o profiláctica útil variará de un estado a otro, y en ciertos casos puede variar con la gravedad del estado tratado y la susceptibilidad del paciente al tratamiento. En consecuencia, una concentración única no será uniformemente útil, sino que requerirá modificación dependiendo de las particularidades de la toxicidad a retinoides aguda o crónica o del estado relacionado que se está tratando. Se puede llegar a tales concentraciones mediante experimentación habitual. Sin embargo, se anticipa que una formulación que contiene entre 0,01 y 1,0 miligramos de compuesto antagonista por mililitro de formulación constituirá una concentración terapéuticamente efectiva para la aplicación tópica. Si se administra sistémicamente, sería de esperar que una cantidad de entre 0,01 y 5 mg por kg por día de peso corporal daría un resultado terapéutico. La base de la utilidad de los antagonistas de RAR para la prevención o tratamiento de toxicidad inducida por agonistas de RAR es la inhibición competitiva de la activación de receptores de RAR por agonistas de RAR. La principal distinción entre estas dos aplicaciones de antagonistas de RAR es la presencia o ausencia de toxicidad a retinoides preexistente. La mayoría de los ejemplos descritos inmediatamente más abajo se refieren al uso de retinoides para prevenir la toxicidad a retinoides, pero los métodos generales descritos en este documento son aplicables igualmente para el tratamiento de toxicidad preexistente a retinoides.
Descripción de experimentos que demuestran el uso de antagonistas de RAR para prevenir o tratar toxicidad a retinoides y/o efectos secundarios de fármacos de retinoides Ejemplo 1 La irritación cutánea inducida por agonista aplicado tópicamente se trata con antagonista aplicado tópicamente
El compuesto ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametilnaftalen-2-il)propen-1-il]benzoico, denominado AGN 191183, es conocido en la técnica anterior como un agonista potente de RAR (véase por ejemplo la parte descriptiva y figura de la Patente de Estados Unidos nº 5.324.840). (El número "AGH" es un número de referencia designado arbitrariamente y utilizado por el cesionario de la presente invención para la identificación de los compuestos).
El ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(fenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (AGN 192869, también designado como compuesto 60a) es un compuesto cuya preparación se describe más abajo. Este compuesto es un antagonista de RAR.
La irritación cutánea inducida por un agonista de RAR, AGN 191183, administrado tópicamente, se puede bloquear mediante un antagonista de RAR, AGN 192869, también administrado tópicamente en ratones atímicos.
Más particularmente, la irritación cutánea se midió en una escala semicuantitativa mediante evaluación diaria subjetiva de la escamación y abrasiones cutáneas. Un único número, la puntuación de irritación tópica, resume la irritación cutánea inducida en un animal durante el transcurso de un experimento. La puntuación de la irritación tópica se calcula según lo siguiente. La puntuación de irritación tópica es la suma algebraica de una puntuación de escamación compuesta y una puntuación de abrasión compuesta. Las puntuaciones compuestas oscilan de 0-9 y 0-8 para escamación y abrasiones, respectivamente; y tienen en cuenta la gravedad máxima, el tiempo de comienzo, y la gravedad media de la escamación y abrasiones observadas.
La gravedad de la escamación se puntúa en una escala de 5 puntos, y la gravedad de las abrasiones se puntúa en una escala de 4 puntos, reflejando puntuaciones más altas una mayor gravedad. El componente máximo de gravedad de las puntuaciones compuestas sería la puntuación diaria más alta de gravedad asignada a un animal dado durante el transcurso de la observación.
Para el tiempo del componente de comienzo de la puntuación compuesta, se asigna una puntuación que oscila de 0 a 4 según lo siguiente:
TABLA 6
Tiempo de aparición de escamación o abrasiones de gravedad 2 o mayor
(días) Tiempo de puntuación de comienzo
8 0
6-7 1
5 2
3-4 3
1-2 4
El componente medio de gravedad de la puntuación compuesta es la suma de las puntuaciones diarias de escamación y abrasión dividida entre el número de días de observación. El primer día de tratamiento no se cuenta, puesto que el compuesto fármaco no ha tenido la oportunidad de tener efecto en el momento de este primer tratamiento.
Para calcular las puntuaciones compuestas de escamación y abrasión, se suman las puntuaciones medias de gravedad y de tiempo de comienzo, y se dividen entre 2. El resultado se añade a la puntuación máxima de gravedad. Las puntuaciones compuestas de escamación y abrasión se suman entonces para dar la puntuación global de irritación tópica. Cada animal recibe una puntuación de irritación tópica, y los valores se expresan como la media \pm SD de las puntuaciones individuales de un grupo de animales. Los valores se redondean al número entero más próximo.
Se trataron ratones atímicos hembra [CrI:SKH1-hrBR] (8-12 semanas, n = 6) tópicamente durante 5 días consecutivos con acetona, AGN 191183, AGN 192869, o alguna combinación de AGN 192869 y 191183. Las dosis de los compuestos respectivos se dan en la Tabla 7. Los tratamientos se aplican a la piel dorsal en un volumen total de 4 ml/kg (\sim0,1 ml). Los ratones se observaron diariamente y se les puntuó según su escamación y abrasiones hasta e incluyendo 3 días después del último tratamiento, es decir, el día 8.
TABLA 7
Diseño experimental y resultados, Ejemplo 1
Grupo Dosis AGN Dosis AGN Relación molar Irritación tópica
191183 192869 (192869:191183) (puntuación)
(mg/Kg/d) (mg/Kg/d)
A 0 0 - - 0 \pm 0
B 0,025 0 - - 8 \pm 2
C 0,025 0,06 2:1 5 \pm 2
D 0,025 0,30 10:1 2 \pm 1
E 0,025 1,5 50:1 1 \pm 0
F 0 1,5 - - 0 \pm 0
Las puntuaciones de la irritación tópica para el Ejemplo 1 se dan en la Tabla 7. Ni la acetona (vehículo) ni AGN 192869 (antagonista) a una dosis de 1,5 mg/kg/d (grupo F) provocaron irritación tópica observable. El AGN 191183, el agonista de RAR, provocó una modesta irritación tópica a una dosis de 0,025 mg/kg/d. Sin embargo, la irritación tópica inducida por AGN 191183 fue inhibida de una manera dependiente de la dosis por AGN 192869, con la abolición casi completa de la irritación en presencia de un exceso molar de 50 veces de AGN 192869. Esto demuestra que un antagonista tópico de RAR bloquea la irritación cutánea provocada por un agonista tópico de RAR. El bloqueo completo de la irritación cutánea inducida por el agonista de RAR se puede lograr con relaciones molares inferiores de antagonista a agonista cuando los antagonistas de RAR son más potentes, tal como el compuesto ácido 4-[(5,6-dihidro-5,6-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (AGN 193109, también denominado en esta solicitud como el Compuesto 60).
Ejemplo 2 Irritación cutánea inducida por agonista aplicado oralmente que es bloqueada con antagonista aplicado tópicamente
En este ejemplo se usó el potente agonista de RAR, AGN 191183 (ácido 4-[(E)-2-(5,8,7,8-etrahidro-5,5,8,8-tetrametilnaftalen-2-il)propen-1-il)benzoico) y el potente antagonista de RAR, el ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (AGN 193109, Compuesto 60), y se usó el peso corporal de los animales experimentales (ratones) como un marcador de la exposición sistémica al agonista de RAR.
Los grupos de ratones hembras atímicas (8-12 semanas, n = 6) se trataron mediante intubación intragástrica con aceite de maíz o AGN 191183 (0,26 mg/kg) suspendido en aceite de maíz (5 ml/kg). Los ratones se trataron de forma simultánea tópicamente sobre la piel dorsal con vehículo (97,6% de acetona/2,4% de dimetilsulfóxido) o disoluciones de AGN 193109 en vehículo (6 ml/kg). En la Tabla 8 se dan las dosis específicas para los diferentes grupos de tratamiento. Los tratamientos se administraron diariamente durante 4 días consecutivos. Los ratones se pesaron y se graduaron según la irritación tópica diaria como se describe en el Ejemplo 1 hasta e incluso 1 día después del último tratamiento. Se calculó el porcentaje del cambio de peso corporal restando el peso corporal final (día 5) del peso corporal inicial (día 1º), dividiendo entre el peso corporal inicial, y multiplicando por 100%. Las puntuaciones de irritación tópica se calculan como se describe en el Ejemplo 1.
En la Tabla 8 se dan las puntuaciones de irritación tópica y la pérdida de peso para los diferentes grupos. El tratamiento combinado con los vehículos tópico y oral, es decir, acetona y aceite de maíz, respectivamente, no provocaron irritación tópica o pérdida de peso. De forma similar, el tratamiento combinado con el vehículo oral y el antagonista tópico AGN 193109 no dio como resultado irritación tópica o pérdida de peso. El AGN 191183 oral indujo por sí mismo una pérdida de peso sustancial y una irritación cutánea. La irritación cutánea inducida por AGN 191183 se redujo sustancialmente cuando se combinó con la dosis inferior de AGN 193109, y se bloqueó completamente con la dosis superior de AGN 193109. La pérdida de peso inducida por AGN 191183 también se bloqueó de una manera relacionada con la dosis por AGN 193109 tópico, pero el bloqueo no fue completo. De este modo, el AGN 193109 tópico bloqueó preferentemente la toxicidad dérmica de AGN 191183. Presumiblemente, se absorbieron sistémicamente niveles bajos de AGN 193109, y esto bloqueó parcialmente la pérdida de peso inducida por AGN 191183. Sin embargo, tal absorción probablemente sería incluso menor en una especie con una piel menos permeable, tales como en seres humanos. Como alternativa, la inhibición de la pérdida de peso por AGN 193109 podría ser debida a una mejora de la irritación cutánea inducida por AGN 191183.
TABLA 8
Diseño experimental y resultados, Ejemplo 2
Grupo Dosis tópica de Dosis oral de % de ganancia Irritación tópica
AGN 193109 AGN 191183 (o pérdida) de peso (puntuación)
(mg/Kg/d) (mg/Kg/d)
A 0 0 1 \pm 2 0 \pm 0
B 0 0,26 (21 \pm 6) 8 \pm 1
C 0,12 0,26 (9 \pm 5) 1 \pm 1
D 0,47 0,26 (3 \pm 5) 0 \pm 1
E 0,47 0 3 \pm 3 0 \pm 0
De este modo, el Ejemplo 2 demuestra que los antagonistas de RAR administrados tópicamente se pueden usar para bloquear preferentemente la irritación cutánea inducida por un agonista de RAR administrado oralmente.
Ejemplo 3 El antagonista aplicado tópicamente acelera la recuperación de una toxicidad preexistente de retinoides
En este ejemplo, la pérdida de peso se induce por tratamiento tópico con el agonista de RAR AGN 191183, y luego los animales del ensayo se tratan tópicamente bien con vehículo o bien con el antagonista de RAR AGN 193109.
Se trataron tópicamente ratones hembras atímicas (8-12 semanas, n = 5) con AGN 191183 (0,13 mg/kg/d) en vehículo (97,6% de acetona/2,4% de DMSO, 4 ml/kg) diariamente durante 2 días. Los grupos de estos mismos ratones (n = 5) se trataron entonces tópicamente bien con vehículo o bien con AGN 193109 en vehículo (4 ml/kg) diariamente durante 3 días consecutivos comenzando el día 3. Los ratones se pesaron en los días 1-5 y en el día 8. Los pesos corporales se expresaron como la media \pm SD. Las medias se compararon estadísticamente usando un test t no pareado de dos colas. Las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05.
TABLA 9
Resultados, Ejemplos 3
Tratamientos Peso corporal (g)
(días 3-5) DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 DIA 8
vehículo 24,6 \pm 1,5 23,9 \pm 1,2 21,4 \pm 1,2 20,3 \pm 1,7 21,0 \pm 1,4 24,7 \pm 1,0
AGN 193109 23,9 \pm 1,0 23,5 \pm1,2 21,4 \pm 0,6 22,2 \pm 0,7 22,8 \pm 0,8 25,0 \pm 1,1
En la Tabla 9 se da el transcurso del tiempo de los pesos corporales en el Ejemplo 3. Los pesos corporales de ambos grupos de ratones disminuyeron en paralelo en los días 2 y 3 como resultado del tratamiento con AGN 191183 en los días 1 y 2. Los pesos corporales en los dos grupos no fueron significativamente diferentes en los días 1, 2 ó 3. Sin embargo, el tratamiento con AGN 193109 aumentó significativamente el peso corporal con relación al tratamiento con vehículo en los días 4 y 5. Estos datos indicaron que la recuperación de la pérdida de peso corporal inducida por AGN 191183 fue acelerada por el tratamiento subsiguiente con AGN 193109. Los pesos corporales no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos de ratones en el día 8, indicando que se logró una recuperación completa en ambos grupos cuando se les da el tiempo suficiente. De este modo, los antagonistas de RAR son efectivos aliviando la toxicidad inducida por agonistas de RAR incluso si la toxicidad inducida por agonistas de RAR precede al tratamiento con antagonistas de RAR, es decir, en el argumento de envenenamiento con agonista de RAR.
Ejemplo 4 El antagonista aplicado oralmente bloquea hipertrigliceridemia inducida por agonista de retinoides coadministrado oralmente
El ácido 5-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-3,5,5,8,8-pentametilnaftalen-2-il)propen-1-il]-2-tiofencarboxílico, es un pan-agonista de RAR/RXR conocido (véase la Patente de Estados Unidos nº 5.324.840, columna 32) y se designa como AGN 191659. Este compuesto se usó oralmente para inducir hipertrigliceridemia aguda en ratas, y se coadministró oralmente AGN 193109, Compuesto 60, para bloquear la hipertrigliceridemia inducida por AGN 191659.
Las ratas macho Fischer (6-7 semanas, n = 5) se trataron mediante intubación intragástrica con aceite de maíz (vehículo), AGN 191659, AGN 193109 o una combinación de AGN 191659 y AGN 193109. El AGN 191659 y AGN 193109 se dieron como suspensiones finas en aceite de maíz. En la Tabla 10 se da el diseño experimental, incluyendo las dosis.
Se extrajo sangre de la vena cava inferior bajo narcosis con dióxido de carbono. Se separó el suero de la sangre mediante centrifugación a baja velocidad. Se midieron los triglicéridos totales en suero (triglicéridos más glicerol) con un ensayo de punto final espectrofotométrico estándar disponible comercialmente como un kit y adaptado a un formato de placas de 96 pocillos. Los niveles de triglicéridos en suero se expresan como la media \pm SD. Las medias se compararon estadísticamente mediante el análisis de una vía de varianza seguido de un test de Dunnett si se encontrasen diferencias significativas. Las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05.
Como se muestra en la Tabla 10, el propio AGN 191659 provocó una elevación significativa de los triglicéridos en suero con relación al tratamiento con vehículo. El propio AGN 193109 no aumentó significativamente los triglicéridos en suero. De forma importante, la combinación de AGN 193109 y AGN 191659, a relaciones molares de 1:1 y 5:1, redujo los triglicéridos en el suero hasta niveles que no fueron significativamente diferentes de los del control.
TABLA 10
Diseño experimental y resultados, Ejemplo 4
Grupo Tratamiento (dosis) Triglicéridos en
suero (mg/d)
A vehículo 55,0 \pm 3,1
B AGN 193109 (19,6 mg/kg) 52,4 \pm 6,3
C AGN 191659 (3,7 mg/kg) 122,5 \pm 27,6
D AGN 193109 (3,9 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 55,7 \pm 14,7
E AGN 193109 (19,6 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 72,7 \pm 8,9
El Ejemplo 4 demuestra que se puede usar un antagonista de RAR para bloquear la hipertrigliceridemia inducida por un retinoide coadministrado.
Ejemplo 5 El antagonista aplicado parenteralmente bloquea la toxicidad ósea inducida por un agonista de retinoides coadministrado parenteralmente
El Ejemplo 5 demuestra que los antagonistas de RAR pueden bloquear la toxicidad ósea inducida por un agonista de RAR. En este ejemplo, se usa AGN 193109 para bloquear el cierre prematuro de la placa epifisaria causada por un agonista de RAR coadministrado, AGN 191183, en cobayas.
Se implantó intraperitonealmente a grupos de cobayas macho Hartley (\sim3 semanas, n = 4) con bombas osmóticas que contienen vehículo (20% de dimetilsulfóxido/80% de polietilenglicol-300), AGN 191183 (0,06 mg/ml), o AGN 191183 (0,06 mg/ml) en combinación con AGN 193109 (0,34 mg/ml). Las bombas osmóticas se diseñan por el fabricante para suministrar \sim5 \mul de disolución por hora continuamente durante 14 días.
Los animales se sometieron a eutanasia mediante asfixia con dióxido de carbono 14 días después de la implantación. La tibia izquierda se retiró y se colocó en formalina tamponada al 10%. Las tibias se descalcificaron mediante exposición a una disolución de ácido fórmico/formalina durante 3-4 días, y se prepararon secciones en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina mediante métodos estándares. Se examinó la placa epifisaria tibial proximal, y se puntuó según estuviera cerrada o no. El cierre de la placa epifisaria se define para este fin como cualquier interrupción de la continuidad del cartílago de la placa de crecimiento epifisario, es decir, sustitución por hueso y/o tejido fibroblástico.
Ninguno de los cuatro cobayas tratados con el vehículo mostraron cierre de la placa epifisaria al final del experimento. Esto era esperado, puesto que la placa epifisaria proximal de las tibias de cobaya no se cierran normalmente hasta que los animales tienen al menos 10 meses. Los cuatro cobayas tratados con AGN 191183 mostraron un cierre parcial o completo de la placa epifisaria. Sin embargo, ninguno de los cobayas tratados con la combinación de AGN 191183 y AGN 193109 demostraron cierre de la placa epifisaria. De este modo, el AGN 193109, en un exceso molar de 5 veces, bloqueó completamente la toxicidad ósea inducida por AGN 191183 cuando estos compuestos se coadministraron parenteralmente.
Compuestos antagonistas de RAR
Los compuestos ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (AGN 193109,
Compuesto 60) y ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(fenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (AGN 192869, Compuesto 60a) son ejemplos de antagonistas de RAR que se usaron en los ensayos anteriormente descritos con animales para bloquear receptores de RAR según la presente invención. Los compuestos de la siguiente fórmula (Fórmula 1) sirven como ejemplos adicionales y generales para compuestos antagonistas adicionales de RAR para uso según la presente invención.
3
En la Fórmula 1, X es S, O, NR' en la que R' es H o alquilo de 1 a 6 carbonos, o
X es [C(R_{1})_{2}]_{n} en la que R_{1} es H o alquilo de 1 a 6 carbonos, y n es un número entero entre 0 ó 1;
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, F, CF_{3}, alquilo sustituido con flúor de 1 a 6 carbonos, OH, SH, alcoxi de 1 a 6 carbonos, o alquiltio de 1 a 6 carbonos;
R_{3} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos o F;
m es un número entero que tiene el valor de 0-3;
o es un número entero que tiene el valor de 0-3;
Z es -C \equiv C,
-N = N-,
-N = CR_{1}-,
-CR_{1} = N,
-(CR_{1} = CR_{1})_{n'}-
en la que n' es un número entero que tiene el valor 0-5,
-CO-NR_{1}-,
-CS-NR_{1}-,
-NR_{1}-CO,
-NR_{1}-CS,
-COO-,
-OCO-;
-CSO-;
-OCS-,
Y es un grupo fenilo o naftilo, un heteroarilo seleccionado de un grupo que consta de piridilo, tienilo, furilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiazolilo, oxazolilo, imidazolilo y pirazolilo, estando dichos grupos fenilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos con uno o más grupos R_{2}, o
cuando Z es -(CR_{1} = CR_{1})_{n'}- y n' es 3, 4 ó 5, entonces Y representa un enlace de valencia directo entre dicho grupo (CR_{2} = CR_{2})_{n'} y B;
A es (CH_{2})_{q} en la que q es 0-5, alquilo inferior de cadena ramificada que tiene 3-6 carbonos, cicloalquilo que tienen 3-6 carbonos, alquenilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 dobles enlaces, alquinilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 3 triples enlaces;
B es hidrógeno, COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, CONR_{9}R_{10}, -CH_{2}OH, CH_{2}OR_{11}, CH_{2}OCOR_{11}, CHO, CH(OR_{12})_{2}, CHOR_{13}O, -COR_{7}, CR_{7}(OR_{12})_{2}, CR_{7}OR_{13}O, o trialquilsililo inferior, en las que R_{7} es un grupo alquilo, cicloalquilo o alquenilo que contiene 1 a 5 carbonos, R_{8} es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o trimetilsililalquilo en el que el grupo alquilo tiene 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5 a 10 carbonos, o R_{8} es fenilo o alquilfenilo inferior, R_{9} y R_{10} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5-10 carbonos, o fenilo o alquilfenilo inferior, R_{11} es alquilo inferior, fenilo o alquilfenilo inferior, R_{12} es alquilo inferior, y R_{13} es un radical alquílico divalente de 2-5 carbonos, y R_{14} es (R_{15})_{r}-fenilo, (R_{15})_{r}-naftilo o (R_{15})_{r}-heteroarilo en los que el grupo heteroarilo tiene 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consta de O, S y N, r es un número entero que tiene los valores de 0-5, y
R_{15} es independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, N(R_{8})_{2}, N(R_{8})COR_{8}, NR_{8}CON(R_{8})_{2}, OH, OCOR_{8}, OR_{8}, CN, un grupo alquilo que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo sustituido con flúor que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 dobles enlaces, grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 triples enlaces, o un grupo trialquilsililo o trialquilsililoxi en los que los grupos alquilo tienen independientemente 1 a 6 carbonos.
Métodos sintéticos - Compuestos arilsustituidos
Los compuestos antagonistas de RAR ejemplares de Fórmula 1 se pueden obtener mediante las rutas químicas sintéticas ilustradas aquí. El químico sintético apreciará fácilmente que las condiciones expuestas en este documento son realizaciones específicas que se pueden generalizar a cualquiera y a todos los compuestos representados por la Fórmula 1.
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Esquema de Reacción 1
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Esquema de Reacción 1 (continuación)
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El Esquema de Reacción 1 ilustra la síntesis de compuestos de Fórmula 1 en los que el grupo Z es una función etinilo (-C \equiv C-) y X es [C(R_{1})_{2}]_{n} en la que n es 1. En otras palabras, el Esquema de Reacción 1 ilustra la síntesis de derivados dihidronaftalénicos etinilsustituidos de la presente invención. Según este esquema, se broma un compuesto tetrahidronaftalen-1-ona de Fórmula 6 para proporcionar el derivado bromado de Fórmula 7. Los compuestos de Fórmula 6 ya llevan los sustituyentes R_{1}, R_{2} y R_{3} deseados, según se definen anteriormente en relación con la Fórmula 1. Un ejemplo preferido de un compuesto de Fórmula 6 es 3,4-dihidro-4,4-dimetil-1(2H)-naftalenona, que se describe en la bibliografía química (Arnold et al. J. Am. Chem. Soc. 69: 2322-2325 (1947)). Una ruta actualmente preferida para la síntesis de este compuesto a partir de 1-bromo-3-fenilpropano también se describe en la sección experimental de la presente solicitud.
Los compuestos de Fórmula 7 se hacen reaccionar con (trimetilsilil)acetileno para proporcionar los compuestos 3,4-dihidro-naftalen-1(2H)-ona (trimetilsililetinilsustituidos) de Fórmula 8. La reacción con (trimetilsilil)acetileno se realiza típicamente con calor (aproximadamente 100ºC) en presencia de yoduro cuproso, un catalizador adecuado, que tiene típicamente la fórmula Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2}, un aceptor de ácidos (tal como trietilamina) en una atmósfera de un gas inerte (argón). El tiempo de reacción típico es aproximadamente 24 horas. Los compuestos 3,4-dihidro-naftalen-1(2H)-ona (trimetilsilil)etinilsustituidos de Fórmula 8 se hacen reaccionar entonces con una base (hidróxido potásico o carbonato potásico) en un disolvente alcohólico, tal como metanol, para proporcionar las 3,4-dihidro-1-naftalen-1(2H)-onas etinil sustituidas de Fórmula 9. Los compuestos de Fórmula 9 se acoplan entonces con el reactivo aromático o heteroaromático X_{1}-Y(R_{2})-A-B' (Fórmula 10) en presencia de yoduro cuproso, un catalizador adecuado, típicamente Pd(PPh_{3})_{2}Cl_{2}, un aceptor de ácidos, tal como trietilamina, en una atmósfera de gas inerte (argón). Como alternativa, se puede acoplar una sal de cinc (u otra sal de metal adecuada) de los compuestos de Fórmula 9 con los reactivos de Fórmula 10 en presencia de Pd(PPh_{3})_{4} o un complejo similar. Típicamente, la reacción de acoplamiento con el reactivo X_{1}-Y(R_{2})-A-B' (Fórmula 10) se realiza a temperatura ambiente o moderadamente elevada. Hablando generalmente, en la Patente de Estados unidos nº 5.264.456 se describe el acoplamiento entre un derivado etinilarílico o su sal de cinc y un compuesto arílico o heteroarílico sustituido con halógeno, tal como reactivo de Fórmula 10. Los compuestos de Fórmula 11 son precursores de los compuestos ejemplares de la presente invención, o sus derivados protegidos en el grupo B', a partir de los cuales se puede eliminar fácilmente el grupo protector por reacciones bien conocidas en la técnica. Los compuestos de Fórmula 11 también se pueden convertir en precursores adicionales de los compuestos ejemplares mediante tales reacciones y transformaciones que son bien conocidas en la técnica. Tales reacciones se indican en el Esquema de Reacción 1 mediante conversión en "homólogos y derivados". Una de tales conversiones empleada para la síntesis de varios compuestos ejemplares es la saponificación de un grupo éster (cuando B o B' es un éster) para proporcionar el ácido carboxílico libre o su sal.
Los compuestos arílicos o heteroarílicos sustituidos con halógenos de Fórmula 10 pueden, hablando generalmente, obtenerse por reacciones bien conocidas en la técnica. Un ejemplo de tal compuesto es 4-yodobenzoato de etilo que se puede obtener, por ejemplo, mediante esterificación de ácido 4-yodobenzoico. Otro ejemplo es 6-yodonicotinoato de etilo que se puede obtener realizando una reacción de intercambio de halógeno sobre ácido 6-cloronicotínico, seguido de esterificación. Incluso hablando de forma más general, con respecto a la obtención de derivados de compuestos de Fórmula 11 y/o la síntesis de compuestos arílicos y heteroarílicos de Fórmula 10 que se pueden hacer reaccionar después con compuestos de Fórmula 9, se pueden emplear los siguientes principios generales bien conocidos y publicados y la siguiente metodología sintética.
Los ácidos carboxílicos se esterifican típicamente poniendo a reflujo el ácido en una disolución del alcohol apropiado en presencia de un catalizador ácido tal como cloruro de hidrógeno o cloruro de tionilo. Como alternativa, el ácido carboxílico se puede condensar con el alcohol apropiado en presencia de diciclohexilcarbodiimida y dimetilaminopiridina. El éster se recupera y purifica por medios convencionales. Los acetales y cetales se pueden obtener fácilmente mediante el método descrito en March, Advanced Organic Chemistry, 2ª Edición, McGraw-Hill Book Company, p. 810. Todos los alcoholes, aldehídos y cetonas se pueden proteger formando, respectivamente, éteres y ésteres, acetales o cetales mediante métodos conocidos tales como los descritos en McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 y Protecting Groups, Ed. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
Para incrementar el valor de n en los compuestos de Fórmula 10 antes de efectuar la reacción de acoplamiento del Esquema de Reacción 1, (en la que tales compuestos se corresponden a la Fórmula 10 no están disponibles a partir de una fuente comercial) se somete a ácidos carboxílicos aromáticos o heteroaromáticos a homologación mediante tratamiento sucesivo en condiciones de Arndt-Eistert u otros procedimientos de homologación. Como alternativa, los derivados que no son ácidos carboxílicos también se pueden homologar mediante procedimientos apropiados. Los ácidos homologados se pueden esterificar entonces mediante el procedimiento general perfilado en el párrafo precedente.
Los compuestos de Fórmula 10 (u otros compuestos intermedios o ejemplares), en los que A es un grupo alquenilo que tiene uno o más dobles enlaces, se pueden obtener, por ejemplo, mediante esquemas sintéticos bien conocidos por el químico orgánico; por ejemplo, mediante reacciones de Witting y similares, o mediante introducción de un doble enlace por eliminación de halógeno a partir de un ácido alfa-halo-arilalquil-carboxílico, éster o carboxaldehído similar. Los compuestos de Fórmula 10 (u otros compuestos intermedios o ejemplares), en los que el grupo A tiene un triple enlace (acetilénico), se pueden obtener mediante reacción de una metilcetona aromática correspondiente con una base fuerte, tal como diisopropilamiduro de litio, reacción con clorofosfato de dietilo y adición subsiguiente de diisopropilamiduro de litio.
Los ácidos y sales derivados de los compuestos de Fórmula 11 (u otros compuestos intermedios o ejemplares) son fácilmente obtenibles a partir de los ésteres correspondientes. La saponificación básica con una base de metal alcalino proporcionará el ácido. Por ejemplo, se puede disolver un éster de Fórmula 11 (u otro compuesto intermedio o ejemplar) en un disolvente polar, tal como un alcanol, preferiblemente en una atmósfera inerte a temperatura ambiente, con alrededor de un exceso molar tres veces superior de base, por ejemplo, hidróxido de litio o hidróxido de potasio. La disolución se agita durante un período de tiempo prolongado, entre 15 y 20 horas, se enfría, se acidifica, y el hidrolizado se recupera mediante medios convencionales.
La amida se puede formar mediante cualquier medio de amidación apropiado conocido en la técnica a partir de los ésteres o ácidos carboxílicos correspondientes. Una forma de preparar tales compuestos es convertir un ácido en un cloruro de ácido y luego tratar ese compuesto con hidróxido amónico o una amina apropiada.
Los alcoholes se pueden obtener convirtiendo los ácidos correspondientes en el cloruro de ácido con cloruro de tionilo u otro medio (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2ª Edición, McGraw-Hill Book Company), reduciendo después el cloruro de ácido con borohidruro sódico (March, Ibid, p. 1124), que da los alcoholes correspondientes. Como alternativa, los ésteres se pueden reducir con hidruro de litio y aluminio a temperaturas reducidas. La alquilación de estos alcoholes con haluros de alquilo apropiados en condiciones de reacción de Williamson (March, Ibid, p. 357) da los éteres correspondientes. Estos alcoholes se pueden convertir en ésteres haciéndolos reaccionar con ácidos apropiados en presencia de catalizadores ácidos o diciclohexilcarbodiimida y dimetilaminopiridina.
Los aldehídos se pueden preparar a partir de los alcoholes primarios correspondientes usando agentes oxidantes suaves, tales como dicromato de piridinio en cloruro de metileno (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979), o dimetilsulfóxido/cloruro de oxalilo en cloruro de metileno (Omura, K., Swem, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)).
Las cetonas se pueden preparar a partir de un aldehído apropiado tratando el aldehído con un reactivo de Grignard alquílico o reactivo similar seguido de oxidación.
Los acetales o cetales se pueden preparar a partir del aldehído o cetona correspondiente mediante el método descrito en March, Ibid, p. 810.
Los compuestos de Fórmula 10 (u otros intermedios, o compuestos ejemplares), en los que B es H, se pueden preparar a partir de los correspondientes compuestos aromáticos o heteroaromáticos halogenados, preferiblemente en los que el halógeno es I.
Refiriéndonos nuevamente al Esquema de Reacción 1, los compuestos de Fórmula 11 se hacen reaccionar con bis(trimetilsilil)amiduro de sodio y 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina en un disolvente inerte de tipo éter, tal como tetrahidrofurano, a temperaturas bajas (-78ºC y 0ºC). Esto se muestra en el Esquema de Reacción 1 en el que el intermedio de sal sódica habitualmente no aislado se muestra entre corchetes como Fórmula 12. La reacción da como resultado los derivados trifluorometilsulfoniloxi representados en la Fórmula 13 (Tf - SO_{2}CF_{3}). Los compuestos de Fórmula 13 se convierten entonces en los compuestos ejemplares de la invención, mostrados en la Fórmula 14, mediante reacción con un derivado organometálico obtenido a partir de un compuesto arílico o heteroarílico R_{14}H, de forma que la fórmula del derivado organometálico sea R_{14}Met (Met representa un metal monovalente), preferiblemente R_{14}Li (R_{14} se define en relación con la Fórmula 1). La reacción con el derivado organometálico, preferiblemente derivado lítico de la fórmula R_{14}Li, se realiza habitualmente en un disolvente inerte de tipo éter (tal como tetrahidrofurano) en presencia de cloruro de cinc (ZnCl_{2}) y tetraquis(trifenilfosfina)-paladio(0) (Pd(PPh_{3})_{4}). Si no está comercialmente disponible, el reactivo organolítico R_{14}Li se puede preparar a partir del compuesto R_{14}H (o su derivado halogenado R_{14}X_{1}, en la que X_{1} es halógeno) en un disolvente de tipo éter según la práctica conocida en la técnica. El intervalo de temperatura para la reacción entre el reactivo R_{14}Li y los compuestos de Fórmula 13 es, hablando generalmente, aproximadamente -78ºC a 50ºC. Los compuestos de Fórmula 14 se pueden convertir en homólogos y derivados posteriores según las reacciones discutidas anteriormente.
Los compuestos intermedios 7-bromo-tetrahidronaftalen-1-ona de Fórmula 7 mostrados en el Esquema de Reacción 1 también se pueden convertir con un reactivo de Grignard de la fórmula R_{14}MgBr (R_{14} se define en relación con la Fórmula 1) para producir el alcohol terciario de Fórmula 15. El alcohol terciario se deshidrata por tratamiento con ácido para proporcionar los derivados 3,4-dihidro-7-bromonaftalénicos de Fórmula 16, que sirven como intermedios para la síntesis de compuestos adicionales de la presente invención (véanse los Esquemas de Reacción 6, 7 y 8).
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Esquema de Reacción 2
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Refiriéndose ahora al Esquema de Reacción 2, se describe una ruta sintética para esos compuestos en la que con referencia a la Fórmula 1 X es S, O o NR' y el grupo Z es una función etinilo (-C \equiv C-). El material de partida para esta secuencia de la reacción es un bromofenol, bromotiofenol o bromoanilina de la estructura mostrada en la Fórmula 17. En aras de la simplicidad de la presente memoria descriptiva, en la siguiente descripción X se puede considerar principalmente azufre por lo que respecta a la preparación de derivados benzotiopiránicos. Sin embargo, se debe mantener en mente que el esquema descrito aquí también es adecuado, con modificaciones tales que serán fácilmente manifiestas para los expertos en la técnica, para la preparación de compuestos benzopiránicos (X = O) y dihidroquinolínicos (X = NR') de la presente invención. De este modo, el compuesto de Fórmula 17, preferiblemente para-bromotiofenol, para-bromofenol o para-bromoanilina, se hace reaccionar en condición básica con un ácido 3-bromocarboxílico de la Fórmula 18. En este esquema de reacción, los símbolos tienen el significado descrito en relación con la Fórmula 1. Un ejemplo para el reactivo de Fórmula 18, en el que R_{3} es hidrógeno, es ácido 3-bromopropiónico. La reacción con el ácido 3-bromocarboxílico de Fórmula 18 da como resultado el compuesto de Fórmula 19. Este último se cicla por tratamiento con ácido para producir el derivado 6-bromotiocroman-4-ona (en el que X es S) o el derivado 6-bromocrománico (en el que X es O) de Fórmula 20. Los compuestos bromados de Fórmula 20 se someten entonces a sustancialmente la misma secuencia de reacciones en condiciones análogas, que se describen en el Esquema de Reacción 1 para la conversión de los compuestos bromados de Fórmula 7 en los compuestos de la invención. De este modo, brevemente resumido aquí, los compuestos bromados de Fórmula 20 se hacen reaccionar con (trimetilsilil)acetileno para proporcionar los compuestos tiocroman-4-ona o croman-4-ona 6-(trimetilsilil)etinilsus-tituidos de Fórmula 21. Los compuestos triocroman-4-ona 6-(trimetilsilil)etinilsustituidos de Fórmula 21 se hacen reaccionar entonces con una base (hidróxido potásico o carbonato potásico) para proporcionar las tiocroman-4-onas etinil sustituidas o 6-etinilsustituidas de Fórmula 22. Los compuestos de Fórmula 22 se acoplan entonces con el reactivo aromático o heteroaromático X_{1}-Y(R_{2})-A-B' (Fórmula 10) en condiciones análogas a las descritas para las reacciones análogas del Esquema de Reacción 1, para producir los compuestos de Fórmula 23.
Los compuestos de Fórmula 23 se hacen reaccionar entonces aún en condiciones análogas a las reacciones similares descritas en el Esquema de Reacción 1, con bis(trimetilsilil)amiduro de sodio y 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina para producir los derivados benzotiopiránicos o benzopiránicos 4-trifluorometilensulfoniloxi representados en la Fórmula 24. Los compuestos de Fórmula 24 se convierten entonces en los compuestos mostrados en la Fórmula 25, mediante reacción con un derivado organometálico obtenido a partir del compuesto arílico o heteroarílico R_{14}H, como se describe en relación con el Esquema de Reacción 1.
De forma similar al uso de los compuestos intermedios 7-bromo-tetrahidronaftalen-1-ona de Fórmula 7 del Esquema de Reacción 1, los compuestos intermedios 6-bromotiocroman-4-ona de Fórmula 20 también se pueden usar para la preparación de compuestos posteriores dentro del alcance de la presente invención, como se describe más abajo, en los Esquemas de Reacción 6, 7 y 8. Los compuestos de Fórmula 25 también se pueden convertir en homólogos adicionales y derivados, en reacciones análogas a las descritas en relación con el Esquema de Reacción 1.
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Esquema de Reacción 3
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El Esquema de Reacción 3 describe una ruta sintética para compuestos en los que, con referencia a la Fórmula 1, X es [C(R_{1})_{2}]_{n'}, n es 0 y el grupo Z es una función etinilo (-C \equiv C-). Según este esquema, se hace reaccionar un derivado 6-bromo-2,3-dihidro-1H-inden-1-ona de Fórmula 26 en una secuencia de reacciones (comenzando con la reacción con trimetilsililacetileno) que son análogas a las reacciones descritas anteriormente en relación con los Esquemas de Reacción 1 y 2, para proporcionar, a través de los intermedios de las Fórmulas 27-30, los derivados indénicos de Fórmula 31. En una realización preferida dentro del alcance del Esquema de Reacción 3, el material de partida es 6-bromo-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona que está disponible según la bibliografía química (véase Smith et al. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123-131). Los compuestos de Fórmula 26, tales como 6-bromo-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona, también se pueden usar para la síntesis de aún otros compuestos ejemplares para uso en la presente invención, como se describe más abajo.
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Esquema de Reacción 4
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Refiriéndose ahora al Esquema de Reacción 4, se describe una ruta sintética para compuestos ejemplares en la que, con referencia a la Fórmula 1, Z es -(CR_{1} = CR_{1})_{n'}-, n' es 3, 4 ó 5, e Y representa un enlace de valencia directo entre el grupo (CR_{1} = CR_{1})_{n'} y B. Esta ruta sintética se describe para ejemplos en los que el grupo X es [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 1 (derivados dihidronaftalénicos). No obstante, se debe entender que las reacciones y metodología sintética descritas en el Esquema de Reacción 4 y esquemas siguientes posteriores, también son aplicables, con modificaciones tales que serán fácilmente manifiestas para los expertos en la técnica, a derivados en los que X es S, O, NR' (derivados benzotiopiránicos, benzopiránicos o dihidroquinolínicos) o [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 0 (derivados indénicos).
Según el Esquema de Reacción 4, se hace reaccionar un derivado 1,2,3,4-tetrahidronaftalénico de Fórmula 32 con un cloruro de ácido (R_{1}COCl) en condiciones de Friedel Crafts, y el producto acetilado resultante se oxida, por ejemplo, en una reacción de oxidación de Jones, para producir una mezcla de derivados 6- y 7-acetil-1(2H)-naftalenónicos isómeros de Fórmula 33. En un ejemplo específico preferido de esta reacción, el compuesto de partida de Fórmula 32 es 1,2,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno (un compuesto conocido) que se puede preparar según un procedimiento descrito en la sección experimental de la presente solicitud. El derivado 7-acetil-1(2H)-naftalenónico de Fórmula 33 se hace reaccionar con etilenglicol en presencia de ácido para proteger la función oxo del resto cetónico exocíclico, como un derivado cetálico de Fórmula 34. El cetal de Fórmula 34 se hace reaccionar posteriormente con un reactivo de Grignard de la fórmula R_{14}MgBr (los símbolos se definen en relación con la Fórmula 1), para proporcionar el alcohol terciario de Fórmula 35. Después, se elimina el grupo protector dioxolánico y el alcohol terciario se deshidrata por tratamiento con ácido para proporcionar los derivados 3,4-dihidro-7-acetilnaftalénicos de Fórmula 36. La función cetónica de los compuestos de Fórmula 36 se someten a una reacción de Horner Emmons (o análoga) en condiciones fuertemente alcalinas con un reactivo de fosfonato de Fórmula 37, para producir, tras la reducción, los compuestos aldehídicos de Fórmula 38. Aún otra reacción de Horner Emmons (o análoga) en condiciones fuertemente alcalinas con un reactivo de Fórmula 39 proporciona compuestos de Fórmula 40. Este último se puede convertir en homólogos y derivados adicionales según las reacciones descritas anteriormente. Un ejemplo específico del reactivo de Horner Emmons de Fórmula 37, que se usa para la preparación de un compuesto preferido, es cianometilfosfonato de dietilo; un ejemplo del reactivo de Horner Emmons de Fórmula 39 es (E)-3-etoxicarbonil-2-metilalilfosfonato de dietilo.
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Esquema de Reacción 5
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El Esquema de Reacción 5 describe un procedimiento sintético para preparar compuestos en los que el grupo Z es un grupo azo (-N = N-). Como en el Esquema de Reacción 4, este proceso se describe para ejemplos en los que el grupo X es [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 1 (derivados dihidronaftalénicos). No obstante, se debe entender que la metodología sintética descrita también es aplicable, con modificaciones tales que serán fácilmente manifiestas para los expertos en la técnica, a todos los azocompuestos para uso en la invención, principalmente a derivados en los que X es S, O, NR' (derivados benzotiopiránicos, benzopiránicos o dihidroquinolínicos) o [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 0 (derivados indénicos). De este modo, se introduce un grupo nitro en el compuesto de partida de Fórmula 6 en condiciones sustancialmente estándares de nitración, para producir el derivado 3,4-dihidro-7-nitro-1(2H)-naftalenónico de Fórmula 41. El último compuesto se reduce al derivado 3,4-dihidro-7-amino-1(2H)-naftalenónico de Fórmula 42 y después se hace reaccionar con un grupo nitroso de la fórmula ON-Y(R_{2})-A-B (Fórmula 43) en condiciones empleadas normalmente (ácido acético glacial) para preparar azocompuestos. El nitrosocompuesto de Fórmula 43 se puede obtener según reacciones conocidas en la técnica. Un ejemplo específico para tal compuesto, que se usa para la síntesis de un compuesto preferido, es 4-nitrosobenzoato de etilo. El azocompuesto de Fórmula 44 se hace reaccionar después con bis(trimetilsilil)amiduro de sodio y 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina para producir los 4-trifluorometilsulfoniloxi derivados representados en la Fórmula 45. Los compuestos de Fórmula 45 se convierten luego en los azocompuestos mostrados en la Fórmula 46, mediante reacción con un derivado organometálico obtenido a partir de un compuesto arílico o heteroarílico R_{14}H. Estas dos últimas reacciones, principalmente la conversión a los derivados 4-trifluorometilsulfoniloxi y reacción subsiguiente con el derivado organometálico, se han descrito anteriormente en relación con los Esquemas de Reacción 1, 2 y 3, y se emplean en varios procesos sintéticos actualmente preferidos que conducen a compuestos ejemplares antagonistas de RAR.
Esquema de Reacción 6
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El Esquema de Reacción 6 describe un proceso sintético actualmente preferido para la preparación de compuestos en el que, con referencia a la Fórmula 1, el grupo Z es COO- o CONR_{1} (R_{1} es preferiblemente H). Estos derivados de éster y de amida se preparan a partir de los derivados 3,4-dihidro-7-bromonaftalénicos de Fórmula 16, que se pueden obtener como se describe en el Esquema de Reacción 1. De este modo, los compuestos de Fórmula 16 se hacen reaccionar con una base fuerte, tal como t-butil-litio, en un disolvente inerte de tipo éter, tal como tetrahidrofurano, a temperatura fría, y se añade dióxido de carbono (CO_{2}) para proporcionar los derivados de ácido 5,6-dihidro-2-naftalencarboxílico de Fórmula 47. Los compuestos de Fórmula 47 se hacen reaccionar luego con compuestos de la fórmula X_{2}-Y(R_{2})-A-B (Fórmula 48) en la que X_{2} representa un grupo OH o NR_{1}, siendo preferiblemente R_{1} hidrógeno. Los expertos en la técnica reconocerán que los compuestos de Fórmula 48 son hidroxi o aminoderivados arílicos o heteroarílicos que se pueden obtener según el estado de la técnica. La reacción entre los compuestos de Fórmula 47 y Fórmula 48 se puede realizar en diversas condiciones conocidas formadoras de ésteres o de amidas, tales como acoplamiento de los dos en presencia de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 4-dimetilaminopiridina. Como alternativa, los compuestos de Fórmula 47 se pueden convertir en el correspondiente cloruro de ácido para el acoplamiento con los compuestos de Fórmula 48 en presencia de una base. Los compuestos de amida o de éster de Fórmula 49 se pueden convertir en homólogos y derivados adicionales, como se describe más arriba. Aunque el Esquema de Reacción 6 se describe y se muestra para el ejemplo en el que el grupo X de Fórmula 1 es [C(R_{1})_{2}]_{n} y n es 1 (derivados dihidronaftalénicos), el proceso descrito aquí se puede adaptar para la preparación de derivados benzopiránicos, benzotiopiránicos, dihidroquinolínicos e indénicos igualmente.
Los compuestos de la presente invención en los que, con referencia a la Fórmula 1, Z es -OCO-, NR_{1}CO, así como los análogos correspondientes de tioéster y tioamida, se pueden preparar a partir de los intermedios obtenidos a partir de los compuestos de Fórmula 16 en los que la función bromo se sustituye por un grupo amino o hidroxilo y según las enseñanzas de la Patente de Estados Unidos nº 5.324.744.
Esquema de Reacción 7
11
El Esquema de Reacción 7 describe un proceso sintético actualmente preferido para la preparación de compuestos en los que, con referencia a la Fórmula 1, Z es -(CR_{1}-CR_{1})_{n'}- y n' es 0. Estos compuestos de Fórmula 50 se pueden obtener en una reacción de acoplamiento entre compuestos de Fórmula 16 y un reactivo de Grignard obtenido a partir de los halocompuestos de Fórmula 10. La reacción de acoplamiento se realiza típicamente en presencia de una sal de cinc y un catalizador de níquel (Ni(O)) en un disolvente inerte de tipo éter, tal como tetrahidrofurano. Los compuestos de Fórmula 50 se pueden convertir en análogos y derivados posteriores, como se describe anteriormente.
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Esquema de Reacción 8
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Haciendo referencia ahora al Esquema de Reacción 8, se describe un proceso sintético actualmente preferido para la preparación de compuestos en los que Z es -(CR_{1} = CR_{1})_{n'}- y n' es 1. Más particularmente, el Esquema de Reacción 8 describe el proceso actualmente preferido para preparar aquellos compuestos que son derivados hidronaftalénicos y en los que el grupo Z representa una función vinilo (-CH = CH-). Sin embargo, la metodología genérica descrita aquí se puede extender, con modificaciones tales que serán manifiestas a los expertos en la técnica, a los compuestos análogos benzopiránicos, benzotiopiránicos, y dihidroquinolínicos, y a compuestos en los que el grupo vinilo está sustituido. De este modo, según el Esquema de Reacción 8, el derivado 7-bromo-1(2H)-naftalenónico de Fórmula 7 se hace reaccionar con un derivado vinílico de la estructura CH_{2} = CH-Y(R_{2})-A-B (Fórmula 51) en presencia de un catalizador adecuado, que tiene típicamente la fórmula Pd(PPh_{3}), un aceptor de ácidos (tal como trietilamina) en una atmósfera de gas inerte (argón). Las condiciones de esta reacción son análogas a las del acoplamiento de los derivados acetilénicos de Fórmula 9 con el reactivo de Fórmula 10 (véase, por ejemplo, el Esquema de Reacción 1), y este tipo de reacción es generalmente conocido en la técnica como la reacción de Heck. El derivado vinílico de Fórmula 51 se puede obtener según el estado de la técnica; un ejemplo para tal reactivo usado para la síntesis de un compuesto preferido para usar en la invención es 4-vinilbenzoato de etilo.
El producto de la reacción de acoplamiento de Heck es un derivado etenílico de Fórmula 52, que después se convierte en compuestos usados en la presente invención mediante tratamiento con bis(trimetilsilil)amiduro de sodio y 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina, para producir los derivados 4-trifluorometilsulfoniloxi de Fórmula 53, y la reacción subsiguiente con un derivado organometálico obtenido a partir del compuesto arílico o heteroarílico R_{14}H, según se describe anteriormente. Los compuestos resultantes de Fórmula 54 se pueden convertir en homólogos y derivados posteriores.
Los compuestos de Fórmula 54 también se pueden obtener a través de esquemas sintéticos que emplean una reacción de Wittig o de Horner Emmons. Por ejemplo, el intermedio de Fórmula 33 (véase el Esquema de Reacción 4) se puede hacer reaccionar con un reactivo de bromuro de trifenilfosfonio (Wittig), o más preferiblemente con un reactivo de fosfonato de dietilo (Horner Emmons) de la estructura (EtO_{2})PO-CH_{2}-Y(R_{2})-A-B, como se describe para reacciones análogas de Horner Emmons en la Patente de Estados Unidos nº 5.324.840. La reacción de Horner Emmons recién mencionada proporciona compuestos intermedios análogos en estructura a la Fórmula 52, y se pueden convertir en compuestos de Fórmula 54 mediante la secuencia de reacciones descrita en el Esquema de Reacción 8 para los compuestos de Fórmula 52.
Métodos sintéticos - Compuestos aril y (3-oxi-1-propenil)-sustituidos
Los compuestos ejemplares antagonistas de RAR de Fórmula 101 se pueden obtener mediante las vías químicas sintéticas ilustradas aquí. El químico sintético apreciará fácilmente que las condiciones expuestas aquí son realizaciones específicas que se pueden generalizar a cualquiera y a todos los compuestos representados por la Fórmula 101.
Esquema de Reacción 101
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Esquema de Reacción 101 (continuación)
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El Esquema de Reacción 101 ilustra la síntesis de compuestos de Fórmula 101 en la que X es [C(R_{1})_{2}]_{n}, n es 1, p es cero y R_{17} es H o alquilo inferior. En otras palabras, el Esquema de Reacción 101 ilustra la síntesis de compuestos de la invención que son derivados 3,4-dihidronaftlanénicos. Según este esquema, un compuesto tetrahidronaftalénico de Fórmula 103, que está apropiadamente sustituido con los grupos R_{3} y R_{2} (según se definen en relación con la Fórmula 101), sirve como el material de partida. Un ejemplo preferido de un compuesto de Fórmula 103 es 1,3,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno, que se describe en la bibliografía química (Mathur et al. Tetrahedron. 1985, 41:1509. En la sección experimental de la presente solicitud también se describe una ruta actualmente preferida para la síntesis de este compuesto a partir de 1-bromo-3-fenilpropano.
El compuesto de Fórmula 103 se hace reaccionar en una reacción de tipo Friedel Crafts con un cloruro de ácido que tiene la estructura R_{16}CH_{2}COCl (R_{16} se define en relación con la Fórmula 101), y después se oxida con trióxido de cromo en ácido acético para proporcionar los derivados 6- y 7-acil-3,4-dihidro-1(2H)-naftalenónicos isómeros. Sólo se muestra el derivado 6-acílico, que es de interés desde el punto de vista de la presente invención, mediante la fórmula estructural (Fórmula 104) en el Esquema de Reacción 101. En la preparación de los compuestos actualmente preferidos de esta invención, los grupos R_{1} representan metilo, R_{2}, R_{3} y R_{16} son H, y por lo tanto el intermedio preferido correspondiente a la Fórmula 104 es 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-acetil-1(2H)-naftalenona.
La función cetónica exocíclica del compuesto de Fórmula 104 se protege después como un cetal, por ejemplo mediante tratamiento con etilenglicol en ácido, para proporcionar el derivado 1,3-dioxolanílico de Fórmula 105. El compuesto de Fórmula 105 se hace reaccionar luego con un reactivo de Grignard de la fórmula R_{14}MgBr (R_{14} se define en relación con la Fórmula 101) para dar el derivado 1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-naftalénico de Fórmula 106. La función cetónica exocíclica del compuesto de Fórmula 106 se desprotege luego por tratamiento con ácido y se deshidrata para dar el compuesto de Fórmula 107.
Un método alternativo para obtener los compuestos de Fórmula 107 a partir de los compuestos de Fórmula 105 es haciendo reaccionar los compuestos de Fórmula 105 con bis(trimetilsilil)amiduro de sodio y 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina (Tf - SO_{2}CF_{3}) en un disolvente inerte de tipo éter, tal como tetrahidrofurano, a baja temperatura (-78ºC y 0ºC). Esta reacción transcurre a través de un intermedio de sal sódica que habitualmente no se aísla y no se muestra en el Esquema de Reacción 101. La reacción global da como resultado un trifluorometilsulfoniloxiderivado, que después se hace reaccionar con un derivado organometálico obtenido a partir de un compuesto arílico o heteroarílico R_{14}H, de forma que la fórmula del derivado organometálico es R_{14}Met (Met representa un metal monovalente), preferiblemente R_{14}Li (R_{14} se define en relación con la Fórmula 101). La reacción con el derivado organometálico, preferiblemente el derivado lítico de la fórmula R_{14}Li, habitualmente se realiza en un disolvente inerte de tipo éter (tal como tetrahidrofurano) en presencia de cloruro de cinc (ZnCl_{2}) y tetraquis(trifenilfosfina)-paladio(0) (Pd(PPh_{3})_{4}). El reactivo organolítico R_{14}Li, si no está comercialmente disponible, se puede preparar a partir del compuesto R_{14}H (o su derivado halogenado R_{14}-X_{1} en el que X_{1} es halógeno) en un disolvente de tipo éter según la práctica conocida en la técnica. El intervalo de temperatura para la reacción entre el reactivo R_{14}Li y el derivado trifluorometilsulfoniloxi está, hablando generalmente, en el intervalo de aproximadamente -78ºC a 50ºC.
Los compuestos de la invención se forman como resultado de una condensación entre el compuesto cetónico de Fórmula 107 y un aldehído o cetona de Fórmula 108. En la preparación de los compuestos ejemplares preferidos de la invención, el reactivo de Fórmula 108 es 4-carboxibenzaldehído (R_{17}-H). Ejemplos de otros reactivos dentro del alcance de la Fórmula 108 y adecuados para la reacción de condensación y para la síntesis de compuestos dentro del alcance de la presente invención (Fórmula 101) son: 5-carboxipiridin-2-aldehído, 4-carboxipiridin-2-aldehído, 4-carboxitiofen-2-aldehído, 5-carboxitiofen-2-aldehído, 4-carboxifuran-2-aldehído, 5-carboxifuran-2-aldehído, 4-carboxiacetofenona, ácido 2-acetilpiridin-5-carboxílico, ácido 2-acetil-piridin-4-carboxílico, ácido 2-actiltiofen-4-carboxílico, ácido 2-acetiltiofen-5-carboxílico, ácido 2-acetilfuran-4-carboxílico, y ácido 2-acetil-furan-5-carboxílico. Estos últimos compuestos están disponibles según la bibliografía química; véase, por ejemplo, Decroix et al., J. Chem. Res.(S), 4: 134 (1978); Dawson et al., J. Med. Chem. 29:1282 (1983); y Oueguiner et al., Bull Soc. Chimique de France No. 10, p. 3678 - 3683 (1969). La reacción de condensación entre los compuestos de Fórmula 107 y Fórmula 108 se realiza en presencia de una base en un disolvente alcohólico. Preferiblemente, la reacción se realiza en etanol en presencia de hidróxido sódico. Los expertos en la técnica reconocerán a esta reacción de condensación como una condensación aldólica, y en caso de los ejemplos preferidos descritos aquí (condensando una cetona de Fórmula 107 con un aldehído de Fórmula 108) como una reacción de Claisen-Schmidt (véase March: Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, p. 694 - 695 McGraw Hill (1968). Los compuestos de Fórmula 109 están dentro del alcance de la presente invención, y también se pueden someter a transformaciones ulteriores dando como resultado compuestos adicionales de la invención. Como alternativa, el grupo A-B de Fórmula 108 puede ser un grupo que está dentro del alcance de la invención, como se define en la Fórmula 101, sólo tras una o más transformaciones sintéticas de naturaleza tal que es bien conocida y está dentro de la pericia del químico orgánico. Por ejemplo, la reacción realizada en el grupo A-B puede ser una etapa de desprotección, homologación, esterificación, saponificación, formación de amida o similar.
Hablando generalmente, con respecto a la obtención de derivados de compuestos de Fórmula 109 y/o la síntesis de compuestos arílicos y heteroarílicos de Fórmula 108 que después se pueden hacer reaccionar con los compuestos de Fórmula 107, se puede emplear los siguientes principios generales y metodología sintética bien conocidos y publicados.
Como se ha indicado anteriormente, los ácidos carboxílicos se esterifican típicamente poniendo a reflujo el ácido en una disolución del alcohol apropiado en presencia de un catalizador ácido tal como cloruro de hidrógeno o cloruro de tionilo. Como alternativa, el ácido carboxílico se puede condensar con el alcohol apropiado en presencia de diciclohexilcarbodiimida y dimetilaminopiridina. El éster se recupera y se purifica por medios convencionales. Los acetales y cetales se obtienen fácilmente mediante el método descrito en March, Advanced Organic Chemistry, 2ª Edición, McGraw-Hill Book Company, p. 810. Los alcoholes, aldehídos y cetonas se pueden proteger todos formando, respectivamente, éteres y ésteres, acetales o cetales mediante métodos conocidos, tales como los descritos en McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 y Protecting Groups, Ed. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
Para incrementar el valor de n en los compuestos de Fórmula 108 antes de efectuar la reacción de acoplamiento del Esquema de Reacción 101, (en la que tales compuestos se corresponden a la Fórmula 108 no están disponibles a partir de una fuente comercial) se somete a ácidos carboxílicos aromáticos o heteroaromáticos a homologación (mientras se protege el grupo aldehído) mediante tratamiento sucesivo en condiciones de Arndt-Eistert u otros procedimientos de homologación. Como alternativa, los derivados que no son ácidos carboxílicos también se pueden homologar mediante procedimientos apropiados. Los ácidos homologados se pueden esterificar entonces mediante el procedimiento general perfilado en el párrafo precedente.
Los compuestos de Fórmula 108 (u otros intermedios o compuestos de la invención, según sea aplicable), en los que A es un grupo alquenilo que tiene uno o más dobles enlaces, se pueden obtener, por ejemplo, mediante esquemas sintéticos bien conocidos por el químico orgánico; por ejemplo, mediante reacciones de Witting y similares, o mediante introducción de un doble enlace por eliminación de halógeno a partir de un ácido alfa-halo-arilalquil-carboxílico, éster o carboxaldehído similar. Los compuestos de Fórmula 108 (u otros compuestos intermedios o ejemplares), en los que el grupo A tiene un triple enlace (acetilénico), se pueden obtener mediante reacción de una metilcetona aromática correspondiente con una base fuerte, tal como diisopropilamiduro de litio, reacción con clorofosfato de dietilo y adición subsiguiente de diisopropilamiduro de litio.
Los ácidos y sales derivados de los compuestos de Fórmula 109 (u otros intermedios o compuestos de la invención, según sea aplicable) son fácilmente obtenibles directamente como resultado de la reacción de condensación, o a partir de los ésteres correspondientes. La saponificación básica con una base de metal alcalino proporcionará el ácido. Por ejemplo, se puede disolver un éster de Fórmula 109 (u otros intermedios o compuestos de la invención, según sea aplicable) en un disolvente polar, tal como un alcanol, preferiblemente en una atmósfera inerte a temperatura ambiente, con alrededor de un exceso molar tres veces superior de base, por ejemplo, hidróxido de litio o hidróxido de potasio. La disolución se agita durante un período de tiempo prolongado, entre 15 y 20 horas, se enfría, se acidifica, y el hidrolizado se recupera mediante medios convencionales.
La amida se puede formar mediante cualquier medio de amidación apropiado conocido en la técnica a partir de los ésteres o ácidos carboxílicos correspondientes. Una forma de preparar tales compuestos es convertir un ácido en un cloruro de ácido y luego tratar ese compuesto con hidróxido amónico o una amina apropiada.
Los alcoholes se pueden obtener convirtiendo los ácidos correspondientes en el cloruro de ácido con cloruro de tionilo u otro medio (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2ª Edición, McGraw-Hill Book Company), reduciendo después el cloruro de ácido con borohidruro sódico (March, Ibid, p. 1124), que da los alcoholes correspondientes. Como alternativa, los ésteres se pueden reducir con hidruro de litio y aluminio a temperaturas reducidas. La alquilación de estos alcoholes con haluros de alquilo apropiados en condiciones de reacción de Williamson (March, Ibid, p. 357) da los éteres correspondientes. Estos alcoholes se pueden convertir en ésteres haciéndolos reaccionar con ácidos apropiados en presencia de catalizadores ácidos o diciclohexilcarbodiimida y dimetilaminopiridina.
Los aldehídos se pueden preparar a partir de los alcoholes primarios correspondientes usando agentes oxidantes suaves, tales como dicromato de piridinio en cloruro de metileno (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979), o dimetilsulfóxido/cloruro de oxalilo en cloruro de metileno (Omura, K., Swem, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)).
Las cetonas se pueden preparar a partir de un aldehído apropiado tratando el aldehído con un reactivo de Grignard alquílico o reactivo similar seguido de oxidación.
Los acetales o cetales se pueden preparar a partir del aldehído o cetona correspondiente mediante el método descrito en March, Ibid, p. 810.
(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema de Reacción 102
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Esquema de Reacción 102 (continuación)
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Haciendo referencia ahora al Esquema de Reacción 102, se describe una ruta sintética para aquellos compuestos de la invención en los que, con referencia a la Fórmula 101, p es cero, R_{2} en la porción aromática de la estructura de anillo condensado es OH y R_{17} es OH. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que estos compuestos son \beta-dicetonas en la forma enólica. El Esquema de Reacción 102 también describe una ruta sintética para aquellos compuestos de la invención en los que p es 1. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que estos últimos compuestos son flavonas. De este modo, según este esquema, se hace reaccionar un derivado 1,2,3,4-tetrahidro-6-metoxinaftalen-1-ona de Fórmula 110 con dialquil-cinc (R_{1}Zn) en presencia de tetracloruro de titanio en un disolvente adecuado, tal como CH_{2}Cl_{2}, para sustituir la función oxo con el grupo dialquílico geminal R_{1}R_{1}, para producir un compuesto de Fórmula 111, en la que R_{1} es alquilo inferior. En realizaciones preferidas de los compuestos de la invención, que se obtienen según el Esquema de Reacción 102, el grupo R_{3} es hidrógeno y R_{1} es metilo. En consecuencia, el reactivo de dialquil-cinc es dimetil-cinc, y el material de partida preferido de Fórmula 110 es 1,2,3,4-tetrahidro-6-metoxinaftalen-1-ona. El último compuesto está comercialmente disponible, por ejemplo de Aldrich Chemical Company. El derivado 1,2,3,4-tetrahidro-1,2-dialquil-6-metoxinafta-lénico de Fórmula 111 se oxida después con trióxido de cromo en ácido acético y anhídrido acético para dar un derivado 1,2,3,4-tetrahidro-3,4-dialquil-7-metoxinaftalen-1-ona de Fórmula 112. El compuesto cetónico de Fórmula 112 se hace reaccionar con un reactivo de Grignard (R_{14}MgBr, R_{14} se define en relación con la Fórmula 101) para producir un derivado 1-hidroxi-1-aril-3,4-dihidro-3,4-dialquil-7-metoxinaftalénico de Fórmula 113. El hidroxicompuesto de Fórmula 113 se somete a eliminación por calefacción, preferiblemente en ácido, para producir el compuesto dihidronaftalénico de Fórmula 114. El grupo metílico se elimina de la función metileterfenólica del compuesto de Fórmula 114 mediante tratamiento con tribromuro de boro en un disolvente adecuado, tal como CH_{2}Cl_{2}, y después el OH fenólico se acila con un agente acilante que introduce el grupo R_{16}CH_{2}CO, para dar un compuesto de Fórmula 115. En la realización preferida R_{16} es H, y por tanto el agente acilante es cloruro de acetilo o anhídrido acético. La reacción de acetilación se realiza en un disolvente básico, tal como piridina. El compuesto fenólico acilado de Fórmula 115 se hace reaccionar con cloruro de aluminio a temperatura elevada, provocando que sufra una transposición de Fries y produzca el compuesto 1-aril-3,4-dialquil-3,4-dihidro-6-acil-7-hidroxinaftalénico de Fórmula 116. El grupo hidroxilo fenólico del compuesto de Fórmula 116 se acila con un agente acilante (tal como un cloruro de ácido) que introduce el grupo CO-Y(R_{2})-A-B para producir un compuesto de Fórmula 117. En el reactivo de cloruro de ácido Cl-CO-Y(R_{2})-A-B (o reactivo acilante similar), los símbolos Y, R_{2} y A-B tienen el significado definido en relación con la Fórmula 101. En la preparación de un compuesto preferido de la invención según este esquema, este reactivo es ClCOC_{6}H_{4}COOEt (el semiéster semicloruro de ácido del ácido tereftálico).
El compuesto de Fórmula 117 se hace reaccionar con una base fuerte, tal como hidróxido potásico en piridina, para producir, como resultado de una reacción de condensación de Claisen intramolecular, un compuesto de Fórmula 118. Los compuestos de Fórmula 118 están dentro del alcance de la invención y de la Fórmula 101, en la que hay un OH para el sustituyente R_{2} en la porción aromática del resto de anillo condensado, y R_{17} es OH. En relación con la reacción anterior (la condensación de Claisen intramolecular) y la transposición de Fries previamente mencionada, se observa que estos mecanismos de reacción probables se mencionan en esta descripción con el fin de explicar completamente las reacciones aquí descritas, y para facilitar el trabajo de una persona experta ordinariamente en la técnica para realizar las reacciones aquí descritas y preparar los compuestos de la invención. No obstante, no se desea estar unido por mecanismos de reacción y teorías, y la invención aquí reivindicada no se debe limitar por ello.
Los compuestos de Fórmula 118 se hacen reaccionar con un ácido fuerte, tal como ácido sulfúrico, en un disolvente prótico adecuado, tal como ácido acético, para producir los compuestos flavónicos de Fórmula 119. Los compuestos de Fórmula 119 también son compuestos de la invención, dentro del alcance de la Fórmula 101 en la que p es 1. Tanto los compuestos de Fórmula 118 como de Fórmula 119 se pueden someter a reacciones y transformaciones posteriores para proporcionar homólogos y derivados adicionales, como se describe anteriormente en relación con el Esquema de Reacción 101. Esto se indica en el Esquema de Reacción 102 como conversión a homólogos y derivados.
Esquema de Reacción 103
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Refiriéndose ahora al Esquema de Reacción 103, se muestra una ruta sintética que conduce a aquellos compuestos de la invención en los que, con referencia a la Fórmula 101, X es S, O o NR', p es cero y R_{17} es H o alquilo inferior. Sin embargo, aplicando los principios genéricos de síntesis mostrados en el Esquema de Reacción 102, el proceso sintético actualmente mostrado se puede modificar o adaptar por aquellos expertos normales en la técnica para obtener también compuestos de la invención en los que X es S, O o NR' y p es 1, o en los que X es S, O o NR' y p es cero, el grupo R_{2} en la porción aromática del resto de anillo condensado es OH y R_{17} es OH.
El compuesto de partida del Esquema de Reacción 103 es un derivado fenólico, tiofenólico o anilínico de Fórmula 120. En los compuestos actualmente preferidos de la invención, los grupos R_{2} y R_{16} son ambos hidrógeno, y los compuestos de partida preferidos de Fórmula 120 son 3-etenil-tiofenol o 3-etenil-fenol que son conocidos en la bibliografía química (Nuyken, et al. Polym. Bull (Berlín) 11:165 (1984). En aras de simplificar la presente memoria descriptiva, en la descripción que sigue X se puede considerar principalmente azufre en cuanto a la preparación de derivados benzotiopiránicos de la presente invención. Se debería de mantener en mente, sin embargo, que el esquema aquí descrito también es adecuado, con modificaciones tales que serán fácilmente manifiestas para los expertos en la técnica, para la preparación de compuestos benzopiránicos (X = O) y dihidroquinolínicos (X = NR') dentro del alcance de la presente invención. De este modo, el compuesto de Fórmula 120 se hace reaccionar en condición básica con un ácido 3-bromocarboxílico de la Fórmula 121. En este esquema de reacción, los símbolos tienen el significado descrito en relación con la Fórmula 101. Un ejemplo para el reactivo de Fórmula 121 en el que R_{3} es hidrógeno, es ácido 3-bromopropiónico. La reacción con el ácido 3-bromocarboxílico de Fórmula 121 da como resultado el compuesto de Fórmula 122. Este último se cicla por tratamiento con ácido para producir el derivado 7-etenil-tiocroman-4-ona (cuando X es S) o derivado 7-etenil-crománico (cuando X es O) de Fórmula 123. El derivado 7-etenil-tiocroman-4-ona o 7-etenil-croman-4-ona de Fórmula 123 se oxida en presencia de catalizadores de Pd(II)Cl_{2} y CuCl_{2} para proporcionar el compuesto 7-acil (cetona) correspondiente de Fórmula 124. Los expertos en la técnica reconocerán que esta última reacción es una oxidación de Wacker. El grupo cetónico exocíclico del compuesto de Fórmula 124 se protege en forma de un cetal, por ejemplo mediante tratamiento con etilenglicol en ácido, para proporcionar el derivado 1,3-dioxolanílico de Fórmula 125. Después, el compuesto de Fórmula 125 se somete a una secuencia de reacciones análoga a las descritas para los compuestos de Fórmula 105 en el Esquema de Reacción 101. De este modo, el derivado 1,3-dioxolanílico de Fórmula 125 se hace reaccionar con un reactivo de Grignard de la fórmula R_{14}MgBr para dar el alcohol terciario de Fórmula 126, que después se deshidrata en ácido para proporcionar el derivado benzotiopiránico (X es S), benzopiránico (X es O) o dihidroquinolínico (X es NR') de Fórmula 127. El compuesto cetónico de Fórmula 127 se hace reaccionar luego en presencia de base con el reactivo de Fórmula 108 en una reacción de condensación aldólica (Claisen-Schmidt) para proporcionar compuestos de la invención de Fórmula 128. Los compuestos de Fórmula 128 se pueden convertir en homólogos y derivados adicionales, como se describe anteriormente en relación con los Esquemas de Reacción 101 y 102.
Ejemplos específicos 2-hidroxi-2-metil-5-fenilpentano
A una mezcla de limaduras de magnesio, 13,16 g (0,541 moles) en 200 ml de Et_{2}O anhidro, se añadieron 100,0 g (0,492 moles) de 1-bromo-3-fenilpropano como una disolución en 100 ml de Et_{2}O. Después de que se hubieran añadido 5-10 ml de la disolución, la adición se detuvo hasta que progresaba la formación del reactivo de Grignard. El bromuro restante se añadió luego a lo largo de 1 hora. El reactivo de Grignard se agitó durante 20 minutos a 35ºC, y luego se añadieron 31,64 g (0,541 moles) de acetona durante un período de 45 minutos. La reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente antes de ser enfriada a 0ºC, y se acidificó mediante adición cuidadosa de HCl al 20%. La capa acuosa se extrajo con Et_{2}O (3 x 200 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, y NaCl acuoso saturado antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida y la destilación del residuo dio 63,0 g (72%) del producto como un aceite amarillo pálido, p.e. 99-102ºC/0,5 mm Hg. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,28-7,18 (5H, ml, 2,63 (2H. t, J = 7,5 Hz), 1,68 (2H, m), 1,52 (2H, m), 1,20 (6H, s).
1,2,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno
Se calentó a 105ºC una mezcla de P_{2}O_{5} (55,3 g, 0,390 moles) en 400 ml de ácido metanosulfónico, en argón hasta que todo el sólido se hubo disuelto. La disolución resultante se enfrió a temperatura ambiente, y se añadió lentamente con agitación 2-hidroxi-2-metil-5-fenilpentano (63,0 g, 0,354 moles). Tras 4 horas, la reacción se paralizó vertiendo cuidadosamente a la disolución sobre 1 l de hielo. La mezcla resultante se extrajo con Et_{2}O (4 x 125 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, NaHCO_{3} acuoso saturado, agua, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La concentración de la disolución a presión reducida, seguido de destilación, dio 51,0 g (90%) del producto como un aceite claro incoloro, p.e. 65-67ºC/1,1 mm Hg. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,32 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,16-7,05 (3H, m), 2,77 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,80 (2H, m), 1,66 (2H, m), 1,28 (6H, s).
3,4-dihidro-4,4-dimetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto A)
Se enfrió a 0ºC una disolución de 350 ml de ácido acético glacial y 170 ml de anhídrido acético, y se añadió cuidadosamente en pequeñas porciones CrO_{3}, 25,0 g (0,25 moles). La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos antes de añadir 120 ml de benceno. Se añadió lentamente 1,2,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno como una disolución en 30 ml de benceno. Tras completar la adición, la reacción se agitó durante 4 horas a 0ºC. La disolución se diluyó con H_{2}O (200 ml), y se extrajo con Et_{2}O (5 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, NaCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la destilación, dio 16,0 g (74%) del producto como un aceite amarillo pálido, p.e. 93-96ºC/0,3 mm Hg. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,02 (1H, dd, J = 1,3, 7,8 Hz), 7,53 (1H, m), 7,42 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,29 (1H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,02 (2H, t, J = 6,8 Hz), 1,40 (6H, s).
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3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-bromo-1(2H)-naftalenona (Compuesto B)
Se cargó un matraz de tres bocas de 100 ml, equipado con un condensador de reflujo eficiente y un tubo de secado, y un embudo de adición, con una mezcla de AlCl_{3} 9,5 g (71,4 mmoles) y 3 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se añadió gota a gota, con agitación (Precaución: ¡Reacción Exotérmica!) 3,4-dihidro-4,4-dimetil-1(2H)-naftalenona (5,0 g, 28,7 mmoles) a la mezcla a temperatura ambiente. Entonces se añadió muy lentamente bromo, 5,5 g (34,5 mmoles), y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. (Nota: si la agitación se detiene, la mezcla se puede calentar a 70ºC hasta que se reanude la agitación). La reacción se paralizó entonces mediante adición lenta de HCl 6M enfriada en hielo. La mezcla se extrajo con Et_{2}O, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida, y la destilación del residuo, dio 5,8 g (80%) del producto como un aceite amarillo pálido que solidificó al dejar reposar, p.e. 140ºC/0,4 mm Hg. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,11 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,31 (1H, d, J = 9,0 Hz), 2,72 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,28 (6H, s).
1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-bromonaftaleno (Compuesto C)
A una mezcla de limaduras de magnesio (648,0 mg, 27,0 mmoles) en 25 ml de THF se añadió una disolución de 4-bromotolueno (5,40 g, 31,8 mmoles) en 10 ml de THF en dos porciones. La reacción se inició por adición de 2 ml de la disolución, seguido de la adición lenta de la disolución restante vía un embudo de adición. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego la disolución se transfirió a un segundo matraz usando una cánula. Al reactivo de Grignard resultante se añadió 4,0 g (15,9 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-bromo-1(2H)-naftalenona (Compuesto B) como una disolución en 15 ml de THF. La disolución resultante se calentó a reflujo toda la noche, se enfrió a temperatura ambiente, y la reacción se paralizó mediante la adición cuidadosa de HCl al 10% enfriado en hielo. La extracción con Et_{2}O fue seguida del lavado de las capas orgánicas combinadas con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y secando luego sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida proporcionó un aceite que dio el producto como un sólido incoloro tras cromatografía en columna (hexanos/EtOAc, 96:4). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 7,6 Hz), 7,26 (3H, m), 7,12 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,24-2,04 (2H, m), 1,81 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1,35 (3H, s), 1,30 (3H, s).
3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-bromonaftaleno (Compuesto D)
Un matraz equipado con un colector Dean-Stark se cargó con 3,4 g (9,85 mmoles) de 1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-bromonaftaleno (Compuesto C) y 40 ml de benceno. Se añadió una cantidad catalítica de ácido p-toluenosulfónico monohidratado, y la disolución resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadió Et_{2}O y la disolución se lavó con H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, y luego se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la cromatografía en columna (100% de hexano/gel de sílice) dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,32 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,21 (5H, m), 7,15 (1H, d, J = 2,1 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,30 (6H, s).
7-etinil-3,4-dihidro-4,4-dimetilnaftalen-1(2H)-ona (Compuesto E)
A una disolución (lavada durante 15 minutos con una corriente de argón) de 7 g (27,6 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-bromo-1(2H)-naftalenona (Compuesto B) en 150 ml de trietilamina se añadieron 0,97 g (1,3 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) y 0,26 g (1,3 mmoles) de yoduro cuproso. La mezcla de la disolución se lavó con argón durante 5 minutos, y luego se añadieron 39 ml (36,6 mmoles) de (trimetilsilil)acetileno. La mezcla de reacción se cerró herméticamente en un tubo a presión y se colocó en un baño de aceite precalentado (100ºC) durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró luego a través de Celite, se lavó con Et_{2}O y el filtrado se concentró a vacío para dar 7-(trimetilsilil)etinil-3,4-dihidro-4,4-dimetilnaftalen-1(2H)-ona bruta. A una disolución de este compuesto TMS- acetilénico bruto en 50 ml de metanol se añadieron 0,6 g (4,3 mmoles) de K_{2}CO_{3}. La mezcla se agitó durante 8 horas a temperatura ambiente, y luego se filtró. El filtrado se concentró a vacío, se diluyó con Et_{2}O, se lavó con agua, HCl al 10% y salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró a vacío. La purificación mediante cromatografía en columna (sílice, 10% de EtOAc-hexano) produjo el compuesto del título como un sólido blanco. PMR (CDCl_{3}): \delta 1,39 (6H, s), 2,02 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,08 (1H, s), 7,39 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 9 1,8 Hz).
4-yodobenzoato de etilo
A una suspensión de 10 g (40,32 mmoles) de ácido 4-yodobenzoico en 100 ml de etanol absoluto se añadieron 2 ml de cloruro de tionilo, y la mezcla se calentó luego a reflujo durante 3 horas. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se disolvió en 100 ml de éter. La solución etérea se lavó con disoluciones saturadas de NaHCO_{3} y NaCl, y se secó (MgSO_{4}). El disolvente se eliminó luego a vacío, y el residuo se destiló en Kugelrohr (100ºC; 0,55 mm) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro, PMR (CDCl_{3}): \delta 1,42 (3H, t, J7 Hz), 7,8 (4H9.
Ácido 6-yodonicotínico
Se enfrió yoduro sódico (20,59 g, 137,40 mmoles) a -78ºC en argón, y luego se añadió ácido yodhídrico (97,13 g, 759,34 mmoles). Se retiró el baño de enfriamiento, y la suspensión se agitó durante 5 minutos. A esta mezcla se añadió ácido 6-cloronicotínico (22,09 g, 140,20 mmoles), y la mezcla resultante se calentó lentamente a temperatura ambiente con agitación. La mezcla se calentó a reflujo a 125ºC durante 24 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en acetona (500 ml) a 0ºC. El sólido amarillo se recogió por filtración y se lavó con 200 ml de disolución de NaHSO_{3} acuosa 1N. La recristalización en metanol (los cristales se lavaron con éter etílico) dio el compuesto del título como cristales blancos, p.f. 177-179ºC (p.f. de la bibliografía 187-192, Newkome at al. "Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives" J. Org. Chem. 51: 953-954 (1986). 1H NMR (DMSO-d6): \delta 8,81 (1H, dd, J = 0,8, 2,4 Hz), 8,01 (1H, dd, J = 0,8, 8,2 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,4, 8,2 Hz).
6-yodonicotinoato de etilo
A una suspensión de ácido 6-yodonicotínico (23,38 g, 94,20 mmoles) en diclorometano (100 ml) se añadió una disolución de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (19,86 g, 103,6 mmoles) en diclorometano (250 ml). A esta mezcla se añadió etanol (12,40 g, 269,27 mmoles) seguido de dimetilaminopiridina (1,15 g, 9,41 mmoles). La mezcla se calentó a 54ºC durante 24,5 horas, se concentró a vacío, y se diluyó con agua (200 ml), y luego se extrajo con éter etílico (550 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado, se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron hasta un sólido amarillo. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, 10% de EtOAc-hexano) dio el compuesto del título como agujas blancas: p.f. 48-49ºC; 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,94 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto F)
A una disolución de 4 g (21,7 mmoles) de 7-etinil-3,4-dihidro-4,4-dimetilnaftalen-1(2H)-ona (Compuesto E) lavada durante 15 minutos con una corriente de argón, y 6 g (21,7 mmoles) de 4-yodobenzoato de etilo en 100 ml de trietilamina se añadieron 5 g (7,2 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) y 1,4 g (7,2 mmoles) de yoduro cuproso. La mezcla se lavó con argón durante 5 minutos, y luego se agitó a temperatura ambiente durante 28 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, y el filtrado se concentró a vacío. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, 10 % de EtOAc-hexano) produjo el compuesto del título como un sólido blanco. PMR (CDCl_{3}): \delta 1,41 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,41 (6H, s), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,04 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,15 (1H, d, J = 1,8 Hz).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto G)
A una disolución fría (-78ºC) de 291,6 mg (1,59 mmoles) de bis(trimetilsilil)amiduro de sodio en 5,6 ml de THF se añadió una disolución de 500,0 mg (1,44 mmoles) de 4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto F) en 4,0 ml de THF. La mezcla de reacción se agitó a -78ºC durante 35 minutos, y luego se añadió una disolución de 601,2 mg (1,59 mmoles) de 5-cloro(2-bis-trifluorometilsulfonil)imida en 4,0 ml de THF. Tras agitar a -78ºC durante 1 hora, la disolución se calentó a 0ºC y se agitó durante 2 horas. La reacción se paralizó mediante adición de NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (50 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH acuoso al 5%, agua, y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y luego se concentró a vacío hasta un aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía en columna (sílice, 7% de EtOAc-hexanos) produjo el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,04 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,60 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,51 (2H, m), 7,32 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 5,0 Hz), 2,44 (2H, d, J = 5,0 Hz), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1)
Se preparó una disolución de 4-litiotolueno por adición de 189,9 mg (1,74 ml, 2,96 mmoles) de t-butil-litio (disolución de 1,7 M en hexanos) a una disolución fría (-78ºC) de 253,6 mg (1,482 mmoles) de 4-bromotolueno en 2,0 ml de THF. Tras agitar durante 30 minutos, se añadió una disolución de 269,4 mg (1,977 mmoles) de cloruro de cinc en 3,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante 30 minutos, y se añadió vía una cánula a una disolución de 472,9 mg (0,988 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)-oxi-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto G) y 50 mg (0,04 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 4,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 45 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (40 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró a vacío hasta un aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía en columna (sílice, 5% de EtOAc-hexanos) produjo el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-acetona): \delta 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,42 (3H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,25 (5H, m), 7,35 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-fenil-2-naftalenil)etinil]-benzoato de etilo (Compuesto 1a)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 203,8 mg (0,43 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 58,2 mg (0,36 ml, 0,69 mmoles) de fenil-litio (disolución 1,8 M en ciclohexano/Et_{2}O), 116,1 mg (0,85 mmoles) de cloruro de cinc y 13,8 mg (0,01 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0). PMR (CDCl_{3}): 6 1,36 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,20 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,27 (1H, m), 7,39 (6H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-metilfenil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 2)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 284,8 mg (2,090 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 3-metilfenil-litio (preparado añadiendo 201,2 mg (1,86 ml, 3,14 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 274,0 mg (1,568mmoles) de 3-metilbromobenceno en 2,0 ml de THF. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,14 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metilfenil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 3)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 200,0 mg (0,418 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 199,4 mg (1,463 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 4,0 ml de THF, y 2-metilfenil-litio (preparado añadiendo 133,9 mg (1,23 ml, 2,09 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 178,7 mg (1,045 mmoles) de 2-metilbromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,97 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,49-7,19 (6H, m), 6,81 (1H, d, J = 1,6 Hz), 5,89 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43-2,14 (2H, dq, J = 3,7, 5,4 Hz), 2,15 (3H, s), 1,39-1,34 (9H, m).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3,5-dimetilfenil)-2-nafta-lenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 4)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 249,0 mg (1,827 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 3,5-dimetilfenil-litio (preparado añadiendo 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 249,0 mg (1,305 mmoles) de 3,5-dimetilbromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,33 (2H, m), 7,20 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,00 (1H, s), 6,97 (2H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (6H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-etilfenil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 5)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 249,0 mg (1,827 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4-etilfenil-litio (preparado añadiendo 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 244,0 mg (1,305 mmoles) de 4-etilbromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,42-7,24 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,71 (2H, q, J = 7,6 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-(1,1-dimetiletil)fenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 6)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,52 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 142,4 mg (1,045 mmoles) de cloruro de cinc y 4-terc-butil-litio (preparado añadiendo 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,5 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 167,0 mg (0,78 mmoles) de 4-terc-butilbromobenceno en 1,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,28-7,45 (7H, m), 6,02 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,59 (3H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,35 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-clorofenil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 7)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 249,0 mg (1,827 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4-clorofenil-litio (preparado añadiendo 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 252,4 mg (1,305 mmoles) de 4-cloro-1-bromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,27 (6H, m), 7,12 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,00(1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metoxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 8)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 249,0 mg (1,827 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4-metoxifenil-litio (preparado añadiendo 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 244,1 mg (1,305 mmoles) de 4-metoxi-1-bromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,40-7,21 (5H, m), 6,95 (2H, d, J = 8,7 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 4,34 (3H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-trifluorometilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 9)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 249,0 mg (1,827 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4-trifluorometilfenil-litio (preparado añadiendo 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 296,6 mg (1,305 mmoles) de 4-trifluorometilbromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54-7,36 (6H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,06 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-piridil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 10)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,52 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo(Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 142,4 mg (1,045 mmoles) de cloruro de cinc, y 2-litiopiridina (preparado añadiendo 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,5 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 123,8 mg (0,784 mmoles) de 2-bromopiridina en 2,0 ml de THF), 1H NMR (d6-acetona): \delta 8,64 (1H, m), 7,99 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,85 (1H, ddd, J = 1,8, 7,7, 9,5 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,47 (2H, d, J = 1,1 Hz), 7,35 (2H, m), 6,32 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,42 (2H, d, J = 7,4 Hz), 1,35 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-piridil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 11)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 170,0 mg (0,35 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 142,4 mg (1,045 mmoles) de cloruro de cinc, y 3-litiopiridina (preparado añadiendo 100,2 mg (0,92 ml, 1,56 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,5 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 123,8 mg (0,784 mmoles) de 3-bromopiridina en 1,0 ml de THF), 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,63-8,61 (2H, dd, J = 1,7 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,67 (1H, dt, J = 7,9 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43-7,34 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,07 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,390 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metil-5-piridil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 12)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 142,4 mg (1,045 mmoles) de cloruro de cinc, y 2-metil-5-litiopiridina (preparado añadiendo 100,5 mg (0,92 ml, 1,57 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 134,8 mg (0,784 mmoles) de 2-metil-5-bromopiridina en 1,0 ml de THF), 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,50 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43(1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,37 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,21 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,11 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,63 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)etinil] benzoato de etilo (Compuesto H)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 150,0 mg (0,314 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 150,0 mg (1,10 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 10,0 ml de THF, y 3-((2,2-dimetiletil)dimetilsiloxi)fenil-litio (preparado añadiendo 100,2 mg (0,92 ml, 1,584 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 226,0 mg (0,787 mmoles) de 3-((2,2-dimetiletil)dimetilsiloxi)bromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,22 (4H, m), 6,95 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,84-6,82 (2H, m), 6,00 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (3H, s), 0,99 (9H, s), 0,23 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)etinil] benzoato de etilo (Compuesto I)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 210,0 mg (0,439 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 209,0 mg (1,53 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4-((2,2-dimetiletil)dimetilsiloxi)fenil-litio (preparado añadiendo 140,3 mg (1,30 ml, 2,19 mmoles) de terc-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 315,0 mg (1,09 mmoles) de 4-((2,2-dimetiletil)dimetilsiloxi)bromobenceno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,25 (3H, m), 7,21 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,87 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s), 1,01 (9H, s), 0,25 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-hidroxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 13)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto H) 60,0 mg (0,114 mmoles) en 1,0 ml de THF a temperatura ambiente se añadió 91,5 mg (0,35 ml, 0,35 mmoles) de fluoruro de tetrabutilamonio (disolución 1 M en THF). Tras agitar toda la noche, la disolución se diluyó con EtOAc y se lavó con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, seguido de cromatografía en columna (4:1, hexanos:EtOAc) dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,39-7,21 (4H, m), 6,93 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,84 (1H, d, J = 7,1 Hz), 6,83 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,91 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-hidroxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 14)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto I) 50,0 mg (0,095 mmoles) en 1,0 ml de THF a temperatura ambiente se añadieron 73,2 mg (0,29 ml, 0,29 mmoles) de fluoruro de tetrabutilamonio (disolución 1 M en THF). Tras agitar toda la noche, la disolución se diluyó con EtOAc y se lavó con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, seguido de cromatografía en columna (4:1, hexanos:EtOAc) dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,41-7,20 (5H, m), 6,88 (2H, d, J = 8,4 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 15)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), seconvirtieron 264,0 mg (0,522 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 150,0 mg (1,10 mmoles) de cloruro de cinc, 14 mg (0,012 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 4,0 ml de THF, y 5-metiltiazol-2-il-litio (preparado añadiendo 53,2 mg (0,53 ml, 0,83 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,55 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 82,0 mg (0,83 mmoles) de 5-metiltiazol en 5,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,99 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,55 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,54 (1H, s), 7,45 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,48 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,51 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, s), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 15a)
Se preparó una disolución de 2-litiotiazol por adición de 41,2 mg (0,42 ml, 0,63 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,5 M en hexanos) a una disolución fría (-78ºC) de 53,4 mg (0,63 mmoles) de tiazol en 1,0 ml de THF. La disolución se agitó durante 30 minutos y entonces se añadió una disolución de 113,9 mg (0,84 mmoles) de cloruro de cinc en 1,5 ml de THF. La disolución resultante se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante 30 minutos y entonces se añadió el compuesto organocinc vía una cánula a una disolución de 200,0 mg (0,42 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)etinil]-benzoato de etilo (Compuesto G) y 12,4 mg (0,01 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 1,5 ml de THF. La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 45 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (40 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentró a vacío hasta un aceite amarillo. La purificación mediante cromatografía en columna (sílice, 20% de EtOAc-hexanos) produjo el compuesto del título como un aceite incoloro. PMR (CDCl_{3}): \delta 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,57 (1H, t, J = 4,8 Hz), 7,33 (1H, d, J = 13 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,92 (1H, d, J = 3,3 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 16)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 295,0 mg (0,617 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 168,0 mg (1,23 mmoles) de cloruro de cinc, 16 mg (0,014 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 6,0 ml de THF, y 4-metiltiazol-2-il-litio (preparado añadiendo 59,6 mg (0,60 ml, 0,93 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,55 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 92,0 mg (0,93 mmoles) de 4-metiltiazol en 6,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, s), 6,52 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,54 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,33 (3H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 17)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 200,0 mg (0,418 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 110,0 mg (0,84 mmoles) de cloruro de cinc, 12 mg (0,011 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF, y 4,5-dimetiltiazol-2-il-litio (preparado añadiendo 40,2 mg (0,39 ml, 0,63 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,55 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 71,0 mg (0,63 mmoles) de 4,5-dimetiltiazol en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,45 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H, s), 2,40 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metil-5-piridil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 18)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 81,7 mg (0,194 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metil-5-piridil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 12) y 40,7 mg (0,969 mmoles) de LiOH-H_{2}O en 3 ml de THF/agua (3:1, v/v). La reacción se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron a vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 8,41 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (1H, dd, J = 2,3, 7,9 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, m), 7,33 (1H, d, J = 7,8 Hz), 6,95 (1H, s), 6,11 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,52 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,31 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-piridilo)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 19)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 80,0 mg (0,196 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-piridil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 10) y 20,6 mg (0,491 mmoles) de LiOH-H_{2}O en 3 ml de THF/agua (3:1, v/v). La reacción se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron a vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 8,64 (1H, m), 7,94 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,87 (1H, dt, J = 1,7, 7,8 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,47 (2H, s), 7,37 (1H, m), 7,25 (1H, s), 6,30 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,31 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 20)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 2), 30,0 mg (0,071 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 28,0 mg (0,70 mmoles, 0,7 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,46 (2H, s), 7,32-7,13 (4H, m), 7,10 (1H, s), 6,98 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,30 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-etilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 21)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-etilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 5), 47,0 mg (0,108 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 28,0 mg (0,70 mmoles, 0,7 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29-7,21 (4H, m), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,64 (2H, q, J = 7,5 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,29 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,5 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metoxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 22)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metoxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 8), 80,0 mg (0,183 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 40,0 mg (1,0 mmoles, 1,0 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45 (2H, s), 7,24 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,02-6,89 (3H, m), 5,98 (1H, t, J = 4,4 Hz), 3,79 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,29 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-trifluorometilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 23)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-trifluorometilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo
(Compuesto 9), 70,0 mg (0,148 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 60,0 mg (1,50 mmoles, 1,50 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,61-7,47 (6H, m), 6,97 (2H, s), 6,16 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,30 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3,5-dimetilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 24)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3,5-dimetilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 4), 90,0 mg (0,207 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 48,0 mg (1,20 mmoles, 1,20 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,45 (6H, s), 7,00 (1H, s), 6,97 (1H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 2,30 (6H, s), 1,29 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-clorofenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 25)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-clorofenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 7), 80,0 mg (0,181 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 48,0 mg (1,20 mmoles, 1,20 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,48 (4H, m), 7,34 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,97 (1H, s), 6,07 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-piridil)-2-nafta-lenil)etinil]benzoico (Compuesto 26)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-piridil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 11), 45,0 mg (0,110 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 48,0 mg (1,20 mmoles, 1,20 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 8,60 (1H, d, J = 4,6 Hz), 8,55 (1H, s), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,76 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,46 (3H, m), 6,94 (1H, s), 6,14 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,31 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 27)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 3), 80,0 mg (0,190 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 60,0 mg (1,50 mmoles, 1,50 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (DMSO): \delta 7,89 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29-7,14 (4H, m), 6,59 (1H, s), 5,90 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,39 (2H, m), 2,60 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,29 (3H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-hidroxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 28)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(3-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto H), 40,0 mg (0,076 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 40,0 mg (1,00 mmoles, 1,00 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (d6- acetona): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35 (2H, s), 7,15-7,07 (2H, m), 6,77-6,69 (3H, m), 5,92 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,25 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,23 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-hidroxifenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 29)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-((2,2-dimetiletil)-dimetilsiloxi)fenil)-2-naftalenil)-eti-nil]
benzoato de etilo (Compuesto I), 75,0 mg (0,143 mmoles) en 3 ml de EtOH y 2 ml de THF, se añadieron 60,0 mg (1,50 mmoles, 1,50 ml) de NaOH (disolución acuosa 1,0 M). La disolución se calentó a 50ºC durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4} y eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (d6- acetona): \delta 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (2H, s), 7,20-7,17 (3H, m), 6,92-6,89 (2H, m), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,34 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 30)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 15), (100,0 mg, 0,23 mmoles) y 4 ml de EtOH a temperatura ambiente se añadió NaOH acuoso (1 ml, 1 M, 1 mmol). La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 1 hora, y se concentró a vacío. El residuo se suspendió en una disolución de CH_{2}Cl_{2} y éter (5:1), y se acidificó hasta pH 5 con HCl acuoso 1 M. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con salmuera, y se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 7,96 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,95 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,64 (1H, s), 7,53 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,59 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,50 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,27 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 30a)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 80,0 mg (0,196 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 15a) y 8,5 mg (0,20 mmoles) de LiOH-H_{2}O en 3 ml de THF/agua (3:1, v/v). La reacción se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron a vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. PMR (d6-DMSO): \delta 1,29 (6H, s), 2,42 (2H, d, J = 4,6 Hz), 6,68 (1H, t, J = 4,6 Hz), 7,51 (2H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,77 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (1H, d, J = 3,3 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 31)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 16), (145,0 mg, 0,34 mmoles) y 4 ml de EtOH a temperatura ambiente se añadió NaOH acuoso (1 ml, 1 M, 1 mmol). La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 1 hora, y se concentró a vacío. El residuo se suspendió en una disolución de CH_{2}Cl_{2} y éter (5:1), y se acidificó hasta pH 5 con HCl acuoso 1 M. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con salmuera, y se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 7,94 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,27 (1H, s), 6,58 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,43 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,26 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 32)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo
(Compuesto 17), (58,0 mg, 0,13 mmoles) y 4 ml de EtOH a temperatura ambiente se añadió NaOH acuoso (1 ml, 1 M, 1 mmol). La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 1 hora, y se concentró a vacío. El residuo se suspendió en una disolución de CH_{2}Cl_{2} y éter (5:1), y se acidificó hasta pH 5 con HCl acuoso 1 M. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con salmuera, y se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,66 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,51 (1H, t, J = 4,9 Hz), 2,37 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,6 Hz), 2,32 (3H, s), 1,26 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metil-2-tienil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 33)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 170,0 mg (0,366 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 202,0 mg (1,48 mmoles) de cloruro de cinc, 24 mg (0,022 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 10,0 ml de THF, y 5-metil-2-litiotiofeno (preparado añadiendo 58,6 mg (0,36 ml, 0,915 mmoles) de n-butil-litio (disolución 2,5 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 89,8 mg (0,915 mmoles) de 2-metiltiofeno en 2,0 ml de THF). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,74 (1H, d, J = 2,8 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, t, 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tienil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 33a)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1), se convirtieron 250,0 mg (0,52 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 186,8 mg (1,37 mmoles) de cloruro de cinc, 37,1 mg (0,03 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0), y 2-litiotiofeno (preparado añadiendo 65,9,2 mg (0,69 ml, 1,03 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,5 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 86,5 mg (1,03 mmoles) de tiofeno en 1,0 ml de THF). PMR (CDCl_{3}): \delta 1,33 (6H, s), 1,36 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 6,25 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,13 (2H, m), 7,47 (4H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,5 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metil-2-tienil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 34)
A una disolución de 4-[5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(5-metil-2-tienil)-2-naftalenil]etinilbenzoato de etilo (Compuesto 33) (33,0 mg, 0,082 mmoles) en 2 ml de EtOH y 1 ml de THF a temperatura ambiente se añadió NaOH acuoso (1 ml, 1 M, 1 mmol). La disolución resultante se agitó a temperatura ambiente toda la noche, y entonces se purificó con HCl al 10%. La extracción con EtOAc, seguido de secado sobre Na_{2}SO_{4}, y eliminación de los disolventes a presión reducida, dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-acetona): \delta 8,03 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,54-7,48 (3H, m), 6,89 (1H, m), 6,18 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,49 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tienil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 34a)
Empleando el mismo procedimiento que para la preparación de ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 30a), se convirtieron 70,0 mg (0,17 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tienil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 33a) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 17,8 mg (0,42 mmoles) de LiOH en H_{2}O. PMR (d6-DMSO): \delta 1,27 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,23 (1H, t, J = 4,9 Hz), 7,14 (2H, m), 7,38- 7,56 (4H, m), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Ácido 5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalencarboxílico (Compuesto K)
Se enfrió a -78ºC una disolución de 3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-bromonaftaleno (Compuesto D) (250,0 mg, 0,764 mmoles) en 2,0 ml de THF, y se añadió lentamente 1,0 ml de t-butil-litio (1,68 mmoles, disolución 1,7 M en pentano). Tras agitar 1 hora a -78ºC, se burbujeó a través de la reacción durante 1 hora CO_{2} gaseoso(generado por evaporación de hielo seco, y que se hizo pasar a través de un tubo de secado). La disolución se dejó entonces calentar hasta temperatura ambiente, y la reacción se paralizó por adición de HCl al 10%. La extracción con EtOAc fue seguida del lavado de las capas orgánicas combinadas con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y el secado sobre MgSO_{4}. A la eliminación de los disolventes a presión reducida, y el lavado del sólido con hexanos, dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,94 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,76 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,24 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 35)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 170,0 mg (0,58 mmoles) de ácido 5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalencarboxílico (Com-puesto K), 115,0 mg (0,70 mmoles) de 4-aminobenzoato de etilo, 145,0 mg (0,76 mmoles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, y 92,4 mg (0,76 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina en 6,0 ml de DMF. Se añadió acetato de etilo, y la disolución resultante se lavó con H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, y entonces se secó sobre MgSO_{4}. Tras la eliminación del disolvente a presión reducida, se aisló el producto como un sólido incoloro mediante cromatografía en columna (10 a 15% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,02 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,72 (2H, m), 7,65 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,52 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,48 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (4H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
Ácido 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoico (Compuesto 36)
A una disolución de 26,5 mg (0,06 mmoles) de 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 35) en 3,0 ml de EtOH y 4,0 ml de THF se añadieron 240,1 mg de NaOH (6,00 mmoles, 3,0 ml de una disolución acuosa 2 M). Tras agitar a temperatura ambiente durante 72 horas, la reacción se paralizó mediante adición de HCl al 10%. La extracción con EtOAc, y el secado de las capas orgánicas sobre MgSO_{4}, proporcionó un sólido tras la eliminación del disolvente a presión reducida. La cristalización en CH_{3}CN dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 10,4 (1H, s), 7,91-7,81 (5H, m), 7,54 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (5H, s), 1,33 (6H, s).
4-[[(5,6-Dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)-carbonil]oxi]benzoato de etilo (Compuesto 37)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 25,0 mg (0,086 mmoles) de ácido 5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalencarboxílico (Com-puesto K), 17,5 mg (0,103 mmoles) de 4-hidroxibenzoato de etilo, 21,4 mg (0,112 mmoles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, y 12,6 mg (0,103 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina en 2,0 ml de DMF. Se añadió acetato de etilo, y la disolución resultante se lavó con H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. Tras la eliminación del disolvente a presión reducida, se aisló el producto mediante cromatografía en columna como un sólido amarillo pálido (10% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,08 (2H, d, J = 8,1 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (5H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,38 (3H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
4-[[(5,6-Dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]oxi]benzoato de 2-trimetilsililetilo (Compuesto 38)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 93,5 mg (0,320 mmoles) de ácido 5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalencarboxílico (Com-puesto K), 76,0 mg (0,319 mmoles) de 4-hidroxibenzoato de 2-trimetilsililetilo, 80,0 mg (0,417 mmoles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, y 51,0 mg (0,417 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina en 4,0 ml de DMF. Se añadió acetato de etilo, y la disolución resultante se lavó con H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. Tras la eliminación del disolvente a presión reducida, se aisló el producto mediante cromatografía en columna como un sólido incoloro (5% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,08 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,26-7,18 (6H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,42 (2H, t, J = 8,4 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,39 (3H, s), 1,38 (6H, s), 0,09 (9H, s).
Ácido 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]oxi]benzoico (Compuesto 39)
Se agitó a temperatura ambiente durante 22 horas una disolución de 110,0 mg (0,213 mmoles) de 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]oxi]-benzoato de 2-trimetilsililetilo (Compuesto 38) y 167,3 mg de fluoruro de tetrabutilamonio (0,640 mmoles, 0,64 ml de una disolución 1 M en THF) en 2 ml de THF. Se añadió acetato de etilo, y la disolución resultante se lavó con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y entonces se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y el lavado del sólido residual con EtOAc y CH_{3}CN, dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-acetona): \delta 8,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,06 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,35 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,25 (4H, m), 6,08 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,35 (3H, s), 1,39 (6H, s).
2-Fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 40)
Se agitó a 50ºC durante 1 hora y luego toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 115,0 mg (0,41 mmoles) de ácido 5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalencarboxílico (Compuesto K), 89,0 mg (0,49 mmoles) de 2-fluoro-4-aminobenzoato de etilo, 102,0 mg (0,53 mmoles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, y 65,0 mg (0,53 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina en 5,0 ml de DMF. Se añadió acetato de etilo, y la disolución resultante se lavó con H_{2}O, NaHCO_{3} acuoso saturado, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. Tras la eliminación del disolvente a presión reducida, se aisló el producto mediante cromatografía en columna como un sólido incoloro (20% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,96 (1H, s), 7,89 (1H, t, J = 8,4 Hz), 7,70 (2H, m), 7,52 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (5H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
Ácido 2-fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)carbonil]amino] benzoico (Compuesto 41)
A una disolución de 41,6 mg (0,091 mmoles) de 2-fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 40) en 2,0 ml de EtOH y 2,0 ml de THF se añadieron 40,0 mg de NaOH (1,00 mmoles, 1,0 ml de una disolución acuosa 1 M). Tras agitar a temperatura ambiente toda la noche, la reacción se paralizó por adición de HCl al 10%. La extracción con EtOAc, y el secado de las capas orgánicas sobre MgSO_{4}, proporcionó un sólido tras la eliminación del disolvente a presión reducida. La cristalización en CH_{3}CN dio el compuesto del título como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (d6-acetona): \delta 9,84 (1H, s), 7,94-7,83 (3H, m), 7,64 (1H, dd, J = 2,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,36 (3H, s), 1,35 (6H, s).
4-[[(5,6-Dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)-tiocarbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 42)
Se puso a reflujo toda la noche una disolución de 110,0 mg (0,25 mmoles) de 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 35) y 121,0 mg (0,30 mmoles) de [2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetan-2,4-disulfuro] (Reactivo de Lawesson) en 12,0 ml de benceno. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto del título se aisló mediante cromatografía en columna (10 a 25% de EtOAc/hexanos) como un sólido amarillo. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,92 (1H, s), 8,06 (2H, t, J = 8,5 Hz), 7,88-7,70 (3H, m), 7,42 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,18 (4H, m), 6,03 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,56 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
Ácido 4-[[(5,6-Dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)-tiocarbonil]amino]benzoico (Compuesto 43)
A una disolución de 84,0 mg (0,184 mmoles) de 4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)-tiocarbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 42) en 2,0 ml de EtOH y 2,0 ml de THF se añadieron 60,0 mg de NaOH (1,50 mmoles, 1,5 ml de una disolución acuosa 1 M). Tras agitar a temperatura ambiente toda la noche, la reacción se paralizó por adición de HCl al 10%. La extracción con EtOAc, y el secado de las capas orgánicas sobre MgSO_{4}, proporcionó un sólido tras la eliminación del disolvente a presión reducida. La cristalización en CH_{3}CN dio el compuesto del título como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (d6-acetona): \delta 10,96 (1H, s), 8,05 (4H, m), 7,72 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,54 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,20 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,33 (3H, s), 1,35 (6H, s).
2-acetil-6-bromonaftaleno (Compuesto L)
A una mezcla fría (10ºC) de 44,0 g (0,212 moles) de 2-bromonaftaleno y 34,0 g (0,255 moles) de cloruro de aluminio en 400 ml de nitrobenceno se añadieron 21,0 g (267 mmoles) de cloruro de acetilo. La mezcla de reacción agitada mecánicamente se calentó hasta temperatura ambiente, y se calentó hasta 40ºC durante 18 horas. Tras enfriar a 0ºC en un baño de hielo, la reacción se paralizó por adición de HCl 12 M (70 ml). Las capas se separaron, y la fase orgánica se lavó con agua y Na_{2}CO_{3} acuoso diluido. La destilación en Kugelrohr, seguido de recristalización en 10% de EtOAc/hexano produjo 23 g del compuesto del título como un sólido cobrizo. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,44 (1H, br s), 8,04-8,10 (2H, m), 7,85 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,82 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,8 Hz), 2,73 (3H, s).
Ácido 6-bromo-2-naftalencarboxílico (Compuesto M)
A una disolución de hipoclorito sódico (62 ml, 5,25% en agua (p/p), 3,6 g, 48,18 mmoles) e hidróxido de sodio (6,4 g, 160,6 mmoles) en 50 ml de agua se añadió una disolución de 2-acetil-6-bromonaftaleno (Compuesto L) (4 g, 16,06 mmoles) en 50 ml de 1,4-dioxano. La disolución amarilla se calentó hasta 70ºC en un baño de aceite durante 2 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se extrajo con éter etílico (2 x 50 ml). Las capas acuosas se diluyeron con disolución de NaHSO_{3} (hasta que la disolución indicadora de KI permaneció incolora), y luego se acidificó (pH < 2) con ácido sulfúrico 1N para dar un precipitado blanco. La mezcla se extrajo con éter etílico, y la fase orgánica combinada se lavó con NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}) y se concentró para dar 3,54 g (88%) del compuesto del título como un sólido. 1H NMR (DMSO-d6): \delta 8,63 (1H, br s), 8,32 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,10 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,00-8,05 (2H, m), 7,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,8 Hz).
6-Bromo-2-naftalencarboxilato de etilo (Compuesto N)
A una disolución de ácido 6-bromo-2-naftalencarboxílico (Compuesto M) 3,1 g (12,43 mmoles) en etanol (30 ml, 23,55 g, 511,0 mmoles) se añadió ácido sulfúrico 18 M (2 ml). La disolución se puso a reflujo durante 30 minutos, se enfrió a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción se repartió entre pentano (100 ml) y agua (100 ml). La fase acuosa se extrajo con pentano (100 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado (100 ml), se secó (MgSO_{4}), y se concentró para dar un sólido blanquecino. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (sílice, 10% de EtOAc-hexano) dio el compuesto del título como un sólido blanco. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,58 (1H, dd, J = 1,7, 9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 2 Hz), 7,83 (1H, d, J = 9 Hz), 7,80 (1H, d, J = 9 Hz), 7,62 (1H, dd, J = 2, 9 Hz).
(E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)etenil]benzoato de etilo (Compuesto O)
A una disolución de 520,0 mg (2,00 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-bromo-1(2H)-naftalenona (Compuesto B) y 510,0 mg (2,90 mmoles) de 4-vinilbenzoato de etilo en 4,0 ml de trietilamina (desgasificada rociando con argón durante 25 minutos), se añadieron 124,0 mg (0,40 mmoles) de tris(2-metilfenil)fosfina, seguido de 44,0 mg (0,20 mmoles) de acetato de paladio (II). La disolución resultante se calentó hasta 95ºC durante 2,5 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se concentró a presión reducida. La purificación mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc/hexanos) dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,19 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,20 (2H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz, y 6H, s).
(E)-4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfo-nil)oxi-2-naftalenil)etenil]benzoato de etilo (Compuesto P)
A una disolución fría (-78ºC) de 440,0 mg (2,40 mmoles) de bis(trimetilsilil)amiduro de sodio en 10,0 ml de THF se añadieron 700,0 mg (2,00 mmoles) de (E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)etenil]-benzoato de etilo (Compuesto O) como una disolución en 25 ml de THF. Tras agitar a -78ºC durante 1,5 horas, se añadió de una sola vez 960,0 mg (2,40 mmoles) de 2-[N,N- bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina. Tras 30 minutos, la disolución se calentó hasta 0ºC, y se agitó durante 3 horas. La reacción se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado, y se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con NaOH acuoso al 5%, se secaron (Na_{2}SO_{4}), y los disolventes se eliminaron a presión reducida. El compuesto del título se aisló como un sólido incoloro mediante cromatografía en columna (7% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,04 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (1H, s), 7,49 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,10 (1H, d, J = 16,4 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
(E)-4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etenil]benzoato de etilo (Compuesto 44)
Se preparó a -78ºC una disolución de 4-litiotolueno mediante adición de 130,7 mg de t-butil-litio (2,04 mmoles; 1,20 ml de una disolución 1,7 M en pentano) a una disolución de 374,5 mg (2,20 mmoles) de 4-bromotolueno en 2,5 ml de THF. Después de 30 minutos, se añadió una disolución de 313,4 mg (2,30 mmoles) de ZnCl_{2} en 2,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó hasta temperatura ambiente, se agitó durante 1,25 horas y entonces se añadió vía una cánula a una disolución de 285,0 mg (0,590 mmoles) de (E)-4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)etenil]benzoato de etilo (Compuesto P) y 29,0 mg (0,025 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF. La disolución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces a 55ºC durante 2 horas. Con el enfriamiento a temperatura ambiente, la disolución se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc, y los extractos combinados se lavaron con NaOH acuoso al 5%, NaCl acuoso saturado, y se secaron sobre Na_{2}SO_{4} antes de ser concentrados a presión reducida. El compuesto del título se aisló mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc/hexanos) como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,96 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,47 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,43-7,16 (7H, m), 7,07 (1H, d, J = 16,3 Hz), 6,93 (1H, d, J = 16,3 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,41 (3H, s), 2,33 (1H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,33 (6H, s).
Ácido (E)-4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etenil]benzoico (Compuesto 45)
A una disolución de 65,0 mg (0,190 mmoles) de (E)-4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-etenil]benzoato de etilo (Compuesto 44) en 4,0 ml de THF se añadieron 30,0 mg de LiOH (0,909 mmoles, 1,0 ml de una disolución 1,1 M) y 1,0 ml de MeOH. La disolución se calentó hasta 55ºC durante 3 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en H_{2}O y se extrajo con hexanos. La capa acuosa se acidificó hasta pH 1 con HCl al 10%, y se extrajo con Et_{2}O. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado, se diluyeron con EtOAc para dar una disolución clara, y se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. Los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d6-DMSO): \delta 7,86 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,41 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,28 (1H, d, J = 16,5 Hz), 7,23 (4H, s), 7,08 ((1H, d, J = 1,7 Hz), 7,07 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,31 (1H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
4-[2-(1,1-dimetil-3-(4-metilfenil)-5-indenil)etinil]ben-zoato de etilo (Compuesto 47)
Se enfrió a -78ºC una disolución de 32,0 mg (0,187 mmoles) de 4-bromotolueno en 1,0 ml de THF, y se añadió lentamente 24,0 mg de t-butil-litio (0,375 mmoles, 0,22 ml de una disolución 1,7 M en pentano). La disolución amarilla se agitó durante 30 minutos, en cuyo momento se añadieron 29,8 mg (0,219 mmoles) de ZnCl_{2} como una disolución en 1,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó hasta temperatura ambiente, y tras 30 minutos se añadió a un segundo matraz que contiene 29,0 mg (0,062 mmoles) de 4-[2-(1,1-dimetil-3-(trifluorometilsulfonil)oxi-5-indenil)etinil]-benzoato de etilo (Compuesto FF) y 2,9 mg (0,003 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 1,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó hasta 50ºC durante 1 hora, y luego se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se paralizó mediante adición de NH_{4}Cl acuoso saturado, y entonces se extrajo con Et_{2}O. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, NaCl acuoso saturado, y se secaron sobre MgSO_{4}, antes de concentrar a presión reducida. El compuesto del título se aisló como un aceite incoloro mediante cromatografía en columna (10% de Et_{2}O/hexanos). 1H NMR (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 8,03 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (1H, s), 7,58 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,38 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,28 (2H, d, J = 9 Hz), 6,43 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,43 (3H, s), 1,41 (3H, t; + 6H, s).
Ácido 4-[2-(1,1-dimetil-3-(4-metilfenil)-5-indenil)eti-nil]benzoico (Compuesto 48)
A una disolución de 10,0 mg (0,025 mmoles) de 4-[2-(1,1-dimetil-3-(4-metilfenil)-5-indenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 47) en 0,5 ml de THF/H_{2}O (3:1 v/v) se añadieron 5,2 mg (0,12 mmoles) de LiOH H_{2}O. Tras agitar a temperatura ambiente durante 48 horas, la disolución se extrajo con hexanos, y la capa acuosa se acidificó con NH_{4}Cl acuoso saturado. Se añadió NaCl sólido, y la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}), y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (300 MHz, d_{6}-DMSO): \delta 7,95 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, m), 7,49 (3H, m), 7,30 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,61 (1H, s), 2,36 (3H, s), 1,36 (6H, s).
Ácido 3-(4-bromotiofenoxi)propiónico
A una disolución de 1,44 g (35,7 mmoles) de NaOH en 20,0 ml de H_{2}O desgasificada (rociado con argón) se añadieron 6,79 g (35,7 mmoles) de 4-bromotiofenol. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se cargó un segundo matraz con 2,26 g (16,3 mmoles) de K_{2}CO_{3} y 15 ml de H_{2}O desgasificada. A esta disolución se añadió (en porciones) 5,00 g (32,7 mmoles) de ácido 3-bromopropiónico. La disolución de carboxilato potásico resultante se añadió a la disolución de tiolato sódico, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La mezcla se filtró, y el filtrado se extrajo con benceno, y las capas orgánicas combinadas se descartaron. La capa acuosa se acidificó con HCl al 10%, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado, se secaron sobre MgSO_{4}, y se concentraron a presión reducida. El sólido resultante se recristalizó en Et_{2}O-hexanos para dar el compuesto del título como cristales blanquecinos. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,4 Hz), 3,15 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,68 (2H, t, J = 7,3 Hz).
2,3-dihidro-6-bromo-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona
Se calentó hasta 75ºC durante 1,5 horas una disolución de 3,63 g (13,9 mmoles) de ácido 3-(4-bromotiofenoxi)propiónico en 60 ml de ácido metanosulfónico. Tras enfriar a temperatura ambiente, la disolución se diluyó con H_{2}O y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH acuoso 2 N, H_{2}O, y NaCl acuoso saturado, y entonces se secaron sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida dio un sólido amarillo a partir del cual se aisló el producto mediante cromatografía de columna (3% de EtOAc-hexanos) como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,22 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,17 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,24 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,98 (2H, t, J = 6,7 Hz).
2,3-dihidro-6-(2-trimetilsililetinil)-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona
Se roció con argón durante 5 minutos una disolución de 1,00 g (4,11 mmoles) de 2,3-dihidro-6-bromo-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona y 78,3 mg (0,41 mmoles) de CuI en 15,0 ml de THF y 6,0 ml de Et_{2}NH. A esta disolución se añadieron 2,0 ml (1,39 g, 14,2 mmoles) de (trimetilsilil)acetileno seguido de 288,5 mg (0,41 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II). La disolución oscura resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, y entonces se filtró a través de una almohadilla de Celita, que se lavó con EtOAc. El filtrado se lavó con H_{2}O y NaCl acuoso saturado antes de secar sobre MgSO_{4}. El compuesto del título se aisló como un aceite naranja mediante cromatografía en columna (4% de EtOAc-hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,13 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,19 (2H, d, J = 6,3 Hz), 2,91 (2H, d, J = 6,3 Hz), 0,21 (9H, s).
2,3-dihidro-6-etinil-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona
Se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas una disolución que contiene 600,0 mg (2,25 mmoles) de 2,3-dihidro-6-(2-trimetilsililetinil)-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona y 100,0 mg (0,72 mmoles) de K_{2}CO_{3} en 15 ml de MeOH. La disolución se diluyó con H_{2}O, y se extrajo con Et_{2}O. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O y NaCl acuoso saturado antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un sólido naranja. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,40 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,22 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,08 (1H, s), 2,94 (2H, t, J = 6,3 Hz).
4-[2-(6-(2,3-dihidro-(4H)-1-benzotiopiran-4-onil))etinil]-benzoato de etilo
Se roció con argón durante 15 minutos una disolución de 405,0 mg (2,15 mmoles) de 2,3-dihidro-6-etinil-(4H)-1-benzotiopiran-4-ona y 594,0 mg (2,15 mmoles) de 4-yodobenzoato de etilo en 15 ml de Et_{3}N y 3 ml de THF. A esta disolución se añadieron 503,0 mg (0,72 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) y 137,0 mg (0,72 mmoles) de CuI. Esta disolución se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente, y entonces se filtró a través de una almohadilla de Celita, que se lavó con EtOAc. La eliminación de los disolventes a presión reducida dio un sólido marrón. La cromatografía en columna (3% de EtOAc-hexanos) dio el compuesto del título como un sólido naranja. 1H NMR (d_{6}-acetona): \delta 8,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,40 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,96 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(6-(4-(trifluorometilsulfonil)oxi-(2H)-1-benzotiopira-nil))etinil]benzoato de etilo
A una disolución de 221,9 mg (1,21 mmoles) de bis(trimetilsilil)amiduro de sodio en 3,0 ml de THF enfriada a -78ºC se añadieron 370,0 mg (1,10 mmoles) de 4-[2-(6-(2,3-dihidro-(4H)-1-benzotiopiran-4-onil))etinil]benzoato de etilo en 4,0 ml de THF. Después de 30 minutos, se añadió lentamente una disolución de 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina en 4,0 ml de THF. La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente, y después de 5 horas se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH acuoso al 5%, H_{2}O, y NaCl acuoso saturado antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, seguido de cromatografía en columna (4% de EtOAc-hexano) dio el compuesto del título como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (d_{6}-acetona): \delta 8,12 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,56 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,33 (1H, t, J = 5,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,82 (2H, d, J = 5,7 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(6-(4-(4-metilfenil)-(2H)-1-benzotiopiranil))etinil]-benzoato de etilo (Compuesto 49)
A una disolución de 120,8 mg (0,70 mmoles) de 4-bromotolueno en 2,0 ml de THF a -78ºC se añadieron 88,4 mg (1,38 mmoles, 0,81 ml de una disolución 1,7 M en pentano) de t-butil-litio. Después de 30 minutos, se añadió una disolución de 131,6 mg (0,97 mmoles) de ZnCl_{2} en 2,0 ml de THF, y la disolución amarilla pálida resultante se calentó hasta temperatura ambiente. La agitación durante 40 minutos fue seguida de adición de esta disolución a un segundo matraz que contiene 129,2 mg (0,28 mmoles) de 4-[2-(6-(4-(trifluorometilsulfonil)oxi-(2H)-1-benzotiopiranil))eti-nil]benzoato de etilo, 14,0 mg (0,012 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0), y 2,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó hasta 50ºC durante 5 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se paralizó por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, entonces se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron hasta un aceite naranja. El compuesto del título se aisló como un sólido incoloro mediante cromatografía en columna (3 a 5% de EtOAc-hexanos). 1H NMR (d_{6}-acetona): \delta 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44-7,38 (2H, m), 7,26-7,15 (5H, m), 6,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,53 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,37 (2H, s), 1,35 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ácido 4-[2-(6-(4-(4-metilfenil)-(2H)-1-benzotiopiranil))-etinil]benzoico (Compuesto 50)
A una disolución de 29,0 mg (0,07 mmoles) de 4-[2-(6-(4-(4-metilfenil)-(2H)-1-benzotiopiranil))etinil]-benzoato de etilo (Compuesto 49) en 2,0 ml de THF y 2,0 ml de EtOH se añadieron 160,0 mg (4,00 mmoles, 2,0 ml de una disolución acuosa 2 M). La disolución resultante se agitó a 35ºC durante 2 horas, y entonces se enfrió hasta temperatura ambiente y se agitó 2 horas adicionales. La reacción se paralizó por adición de HCl acuoso al 10%, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida dio un sólido que se lavó con CH_{3}CN y se secó a alto vacío para dar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (D_{6}-DMSO): \delta 7,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40 (4H, m), 7,25-7,13 (4H, m), 7,02 (1H, d, J = 1,7 Hz), 6,11 (1H, t, J = 5,7 Hz), 3,54 (2H, d, J = 5,7 Hz), 2,34 (3H, s).
3,4-Dihidro-4,4-dimetil-7-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto R) y 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto S)
A una mezcla fría (0ºC) de cloruro de magnesio (26,3 g, 199,0 mmoles) en diclorometano (55 ml) se añadió cloruro de acetilo (15 g, 192 mmoles) y 1,2,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno (24,4 g, 152 mmoles) en diclorometano (20 ml) durante 20 minutos. La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 4 horas. Se añadió hielo (200 g) al matraz de reacción, y la mezcla se diluyó con éter (400 ml). Las capas se separaron, y la fase orgánica se lavó con HCl al 10% (50 ml), agua (50 ml), bicarbonato sódico acuoso al 10%, y NaCl acuoso saturado (50 ml) antes de secar sobre MgSO_{4}. El disolvente se eliminó mediante destilación para dar un aceite amarillo que se disolvió en benceno (50 ml).
A una disolución fría (0ºC) de ácido acético (240 ml) y anhídrido acético (120 ml) se añadió trióxido de cromo (50 g, 503 mmoles) en pequeñas porciones durante 20 minutos en argón. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 0ºC, y se diluyó con benceno (120 ml). La disolución bencénica preparada anteriormente se añadió con agitación vía un embudo de adición durante 20 minutos. Tras 8 horas, la reacción se paralizó por adición cuidadosa de isopropanol (50 ml) a 0ºC, seguido de agua (100 ml). Tras 15 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con éter (1100 ml) y agua (200 ml), y entonces se neutralizó con bicarbonato sódico sólido (200 g). La capa etérea se lavó con agua (100 ml), y NaCl acuoso saturado (2 x 100 ml), y se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida dio una mezcla de las dicetonas isómeras que se separaron por cromatografía (5% de EtOAc/hexanos). (Compuesto R): 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,41 (6H, s). (Compuesto S): 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
3,4-Dihidro-4,4-dimetil-7-(2-(2-metil-1,3-dioxolanil))-1(2H)-naftalenona (Compuesto T)
Se puso a reflujo usando un aparato Dean-Stark durante 12 horas una mezcla de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto R) (140,0 mg, 0,60 mmoles), etilenglicol (55,0 mg, 0,90 mmoles), ácido p-toluensulfónico monohidratado (4 mg) y benceno (25 ml). La reacción se paralizó por adición de bicarbonato sódico acuoso al 10%, y se extrajo con éter (2 x 75 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (5 ml), y NaCl acuoso saturado (5 ml), y se secaron sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida dio el compuesto del título como un aceite. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,13 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,97-4,10 (2H, m), 3,70-3,83 (2H, m), 2,73 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,64 (3H, s), 1,39 (6H, s).
1,2,3,4-Tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-(2-(2-metil-1,3-dioxolanil)) naftaleno (Compuesto U)
A una disolución de 195,4 mg (1,00 mmoles) de bromuro de p-toluilmagnesio (1,0 ml; disolución 1 M en éter) en 2 ml de THF se añadió una disolución de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-(2-(2-metil-1,3-dioxolanil))-1(2H)-naftalenona (Compuesto T) (135,0 mg, 0,52 mmoles) en 5 ml de THF. La disolución se puso a reflujo durante 16 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se diluyó con éter (50 ml). La disolución se lavó con agua (5 ml), NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), y se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la cromatografía en columna (5% de EtOAc/hexanos) dio el compuesto del título como un sólido. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,37 (2H, d), 7,21 (1H, s), 7,13 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,08 (2H, d, J = 8,5 Hz), 3,88-3,99 (2H, m), 3,58-3,75 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,12-2,30 (2H, m), 1,79-1,90 (1H, m), 1,57 (3H, s), 1,48-1,58 (1H, m), 1,38 (3H, s), 1,31 (3H, s).
3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-acetilnaftaleno (Compuesto V)
Se puso a reflujo durante 16 horas una mezcla de 1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-(2-(2-metil-1,3-dioxolanil))naftaleno (Compuesto U) 130,0 mg (0,38 mmoles), ácido p-toluensulfónico monohidratado (4 mg) y benceno (5 ml). Al enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con éter (100 ml) y se lavó con bicarbonato de sodio acuoso al 10%, agua, y NaCl acuoso saturado. La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, y los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,83 (1H, dd, J = 1,8, 8,0 Hz), 7,66 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,3 Hz), 2,47 (3H, s), 2,41 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 6,3 Hz), 1,36 (6H, s).
(E)-3-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2-butenonitrilo (Compuesto W)
A una suspensión de NaH (48,0 mg, 2,00 mmoles) en THF (6 ml) se añadió cianometilfosfonato de dietilo (450,0 mg, 2,50 mmoles). Después de 40 minutos, se añadió una disolución de 3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-acetilnaftaleno (Compuesto V) 95,0 mg (0,33 mmoles) en THF (4 ml). La mezcla se agitó durante 16 horas, se diluyó con éter (100 ml), y se lavó con agua, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la cromatografía en columna (3% de EtOAc/hexanos) dio el compuesto del título como un sólido. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,39 (1H, d, J = 1H), 7,32 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,20-7,25 (4H, bis), 7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,44 (1H, s), 2,42 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 6,0 Hz), 2,35 (3H, s), 1,35 (6H, s).
(E)-3-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2-butenal (Compuesto X)
A una disolución fría (-78ºC) de (E)-3-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2-butenonitrilo (compuesto W) 84,0 mg, 0,29 mmoles, en diclorometano (4 ml) se añadieron 0,50 ml (0,50 mmoles) de hidruro de diisobu-tilaluminio (disolución 1 M en diclorometano). Tras agitar durante 1 hora, la mezcla de reacción se paralizó a -78ºC añadiendo 2-propanol (1 ml) diluido con éter (100 ml). Al calentar hasta temperatura ambiente, la disolución se lavó con agua, HCl al 10%, y NaCl acuoso saturado. La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 10,12 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,43 (2H, s), 7,19-7,28 (5H, m), 6,27 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,03 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,42 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,37 (6H, s).
(E,E,E)-3-metil-7-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)-2,4,6 octatrienoato de etilo (Compuesto 51)
A una disolución fría (-78ºC) de (E)-3-etoxicarbonil-2-metilalilfosfonato de dietilo [preparada según J. Org. Chem. 39:821 (1974)] 264,0 mg (11,00 mmoles) en THF (2 ml) se añadieron 26,0 mg (0,41 mmoles, 0,65 ml) de n-butil-litio en hexanos (disolución 1,6 M) seguido inmediatamente por la adición de (E)-3-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2-butenal (Compuesto X) 82,0 mg (0,26 mmoles) en THF (3 ml). Después de 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con éter (60 ml), se lavó con agua (50 ml), NaCl acuoso saturado (5 ml) y se secó sobre MgSO_{4}. Tras la eliminación de los disolventes a presión reducida, se aisló el compuesto del título como un aceite mediante cromatografía en columna (5% de EtOAc/hexanos, seguido de HPLC usando 1% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (acetona-d6): \delta 7,36-7,43 (2H, m), 7,18-7,27 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 11,2, 15,2 Hz), 6,46 (1H, d, J = 11,2 Hz), 6,38 (1H, d, J = 15,2 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,78 (1H, s), 4,10 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,12 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ácido (E,E,E)-3-metil-7-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2,4,6-octatrienoico (Compuesto 52)
A una disolución de (E,E,E)-3-metil-7-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-2,4,6-octatrienoato de etilo (Compuesto 51) 85,0 mg (0,20 mmoles) en THF (1 ml) y metanol (1 ml) se añadieron 12,0 mg (0,50 mmoles) de LiOH (0,5 ml, disolución 1 M). La mezcla se agitó durante 6 horas, se diluyó con éter (60 ml), se acidificó con HCl al 10% (1 ml). La disolución se lavó con agua, y NaCl acuoso saturado, antes de secar sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un sólido, que se purificó mediante recristalización en acetona. 1H NMR (acetona-d6): \delta 7,35-7,45 (2H, m), 7,19-7,28 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 11,5, 15,1 Hz), 6,48 (1H, d, J = 11,5 Hz), 6,42 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,82 (1H, s), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,32 (3H, s), 2,13 (3H, s), 1,32 (6H, s).
3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-nitro-1(2H)-naftalenona (Compuesto Y)
A 1,7 ml (3,0 g, 30,6 mmoles, 18 M) de H_{2}SO_{4} a -5ºC (baño de hielo y NaCl) se añadió lentamente 783,0 mg (4,49 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-1(2H)-naftalenona. Se añadió lentamente una disolución de 426,7 mg (6,88 mmoles, 0,43 ml, 16 M) de HNO_{3} y 1,31 g (0,013 moles, 0,74 ml, 18 M) de H_{2}SO_{4}. Después de 20 minutos, se añadió hielo, y la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. Los extractos combinados se concentraron a presión reducida para dar un residuo a partir del cual se aisló el compuesto del título, un sólido amarillo pálido, mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc/hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,83 (1H, d, J = 2,6 Hz), 8,31 (1H, dd, J = 2,8, 8,9 Hz), 7,62 (1H, d, J = 8,7 Hz), 2,81 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,08 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,45 (6H, s).
3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-amino-1(2H)-naftalenona (Compuesto Z)
Se agitó a temperatura ambiente una disolución de 230,0 mg (1,05 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-nitro-1(2H)-naftalenona (Compuesto Y) en 5,0 ml de EtOAc, con una cantidad catalítica de Producto al 10% sobre C en 101 kPa de H_{2} durante 24 horas. El catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de Celita, y el filtrado se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite verde oscuro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,30 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,22 (1H, d, J = 8,4 Hz), 6,88 (1H, dd, J = 2,7, 8,5 Hz), 2,70 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,97 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)-azo]benzoato de etilo (Compuesto AA)
A una disolución de 198,7 mg (1,05 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-amino-1(2H)-naftalenona (Compuesto Z) en 5,0 ml de ácido acético glacial se añadieron 180,0 mg (1,00 mmoles) de 4-nitrosobenzoato de etilo. La disolución resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente, y entonces se concentró a presión reducida. El producto se aisló a partir del aceite residual como un sólido rojo mediante cromatografía en columna (15% de EtOAc-hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,57 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 8,6 Hz), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,79 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,07 (2H, t, J = 7,02 Hz), 1,44 (6H, s), 1,42 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)azo]-benzoato de etilo (Compuesto BB)
A una disolución de 90,4 mg de bis(trimetilsilil)amiduro de sodio (0,48 mmoles, 0,48 ml de una disolución 1,0 M en THF) en 2,0 ml de THF a -78ºC se añadieron 153,0 mg (0,437 mmoles) de 4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5-dimetil-8-oxo-2-naftalenil)azo]benzoato de etilo (Compuesto AA) en 2,0 ml de THF. La disolución roja oscura se agitó a -78ºC durante 30 minutos, y entonces se añadieron 204,0 mg (0,520 mmoles) de 2-[N,N-bis(trifluorometilsulfonil)amino]-5-cloropiridina como una disolución en 2,0 ml de THF. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente, y después de 3 horas se paralizó por adición de H_{2}O. La capa orgánica se concentró hasta un aceite rojo a presión reducida. El producto se aisló mediante cromatografía en columna (25% de EtOAc/hexanos) como un aceite rojo. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)-azo]benzoato de etilo (Compuesto 46a)
Se preparó una disolución de 4-litiotolueno por adición de 62,9 mg (0,58 ml, 0,98 mmoles) de t-butil-litio (disolución 1,7 M en pentano) a una disolución fría (-78ºC) de 84,0 mg (0,491 mmoles) de 4-bromotolueno en 1,0 ml de THF. Después de agitar durante 30 minutos, se añadió una disolución de 107,0 mg (0,785 mmoles) de cloruro de cinc en 2,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante 30 minutos, y se añadió vía una cánula a una disolución de 94,7 mg (0,196 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)-oxi-2-naftalenil)azo]benzoato de etilo (Compuesto BB) y 25 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) en 2,0 ml de THF. La disolución resultante se calentó a 50ºC durante 1,5 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (40 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se concentró a vacío, y el compuesto del título se aisló como un sólido rojo mediante cromatografía en columna (25% de EtOAc-hexanos). 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)azo]benzoico (Compuesto 46b)
A una disolución de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)azo]benzoato de etilo (Compuesto 46a) 16,5 mg (0,042 mmoles) en THF (2 ml) y etanol (1 ml) se añadieron 80,0 mg (2,00 mmoles) de NaOH (2,0 ml, disolución acuosa 1 M). La mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente, se acidificó con HCl al 10%, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y NaCl acuoso saturado, se secaron entonces sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la recristalización del residuo en EtOAc/hexano, dio el compuesto del título como un sólido rojo. 1H NMR (acetona-d6): \delta 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (2H, dd, J = 2,1, 6,1 Hz), 7,66 (1H, s), 7,64 (2H, d, J = 2,3 Hz), 7,28 (4H, d, J = 3,0 Hz), 6,09 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,39 (3H, s), 1,40 (6H, s).
6-(2-Trimetilsilil)etinil-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona (Compuesto CC)
A una disolución de 815,0 mg (3,41 mmoles) de 6-bromo-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona (véase Smith et al. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10 123-131) en 100 ml de Et_{3}N desgasificada (rociada con argón durante 20 minutos) se añadieron 259,6 mg (1,363 mmoles) de yoduro de cobre(I), 956,9 mg (1,363 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) y 3,14 g (34,08 mmoles) de (trimetilsilil)acetileno. Esta mezcla se calentó a 70ºC durante 42 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice y se lavó con éter. El filtrado se lavó con agua, HCl 1 M, agua y finalmente con NaCl acuoso saturado antes de secar sobre MgSO_{4}. La concentración de la disolución a presión reducida, seguido de cromatografía en columna (gel de sílice; 10% de Et_{2}O-hexanos) dio el compuesto del título como un aceite marrón. 1H NMR (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,79 (1H, d, J = 1,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 1,6, 8,3 Hz), 7,42 (1H, d, J = 8,5 Hz), 2,60 (2H, s), 1,41 (6H, s), 0,26 (9H, s).
6-Etinil-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona (Compuesto DD)
A una disolución de 875,0 mg (3,41 mmoles) de 6-(2-trimetilsilil)etinil-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona (Compuesto CC) en 28 ml de MeOH se añadieron 197,3 mg (1,43 mmoles) de K_{2}CO_{3} en una sola porción. Tras agitar durante 6 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celita, y el filtrado se concentró a presión reducida. El aceite residual se colocó en una columna de gel de sílice y se eluyó con 5% de EtOAc-hexanos para dar el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H NMR (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,82 (1H, s), 7,72 (1H, dd, J = 1,6, 7,8 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,11 (1H, s), 2,61 (2H, s), 1,43 (6H, s).
4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-7-oxo-2-indenil)etinil]-benzoato de etilo (Compuesto EE)
Se roció con argón durante 40 minutos una disolución de 280,0 mg (1,520 mmoles) de 6-etinil-2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-inden-1-ona (Compuesto DD) y 419,6 mg (1,520 mmoles) de 4-yodobenzoato de etilo en 5 ml de Et_{3}N. A esta disolución se añadieron 271,0 mg (1,033 mmoles) de trifenilfosfina, 53,5 mg (0,281 mmoles) de yoduro de cobre(I) y 53,5 mg (0,076 mmoles) de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 2,5 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se diluyó con Et_{2}O. Tras la filtración a través de una almohadilla de Celita, el filtrado se lavó con H_{2}O, HCl 1 M, H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y entonces se secó sobre MgSO_{4} y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se aisló como un sólido amarillo pálido mediante cromatografía en columna (15% de EtOAc-hexanos). 1H NMR (300 MHz, d6-acetona): \delta 8,05 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,87 (1H, dd, J = 1,4, 8,1 Hz), 7,75 (2H, m), 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (2H, s), 1,45 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(1,1-dimetil-3-(trifluorometilsulfonil)oxi-5-indenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto FF)
Se enfrió a -78ºC una disolución de 88,0 mg (0,48 mmoles) de bis(trimetilsilil)amiduro de sodio en 0,5 ml de THF, y se añadió 145,0 mg (0,436 mmoles) de 4-[2-(5,6-dihidro-5,5-dimetil-7-oxo-2-indenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto EE) como una disolución en 1,0 ml de THF. Después de 30 minutos, se añadieron 181,7 mg (0,480 mmoles) de 2-[N,N-bis(trifluorometanosulfonil)amino]-5-cloropiridina como una disolución en 1,0 ml de THF. La disolución se dejó calentar lentamente hasta temperatura ambiente, y se paralizó tras 5 horas por adición de NH_{4}Cl acuoso saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH acuoso al 5%, H_{2}O, y NaCl acuoso saturado, y entonces se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión reducida. El producto se aisló como un sólido incoloro mediante cromatografía en columna (10% de Et_{2}O-hexanos). 1H NMR (300 MHz, d6-acetona): \delta 8,05 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,63 (2H, s), 7,55 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-nafta-lenil)etinil]benzoico (Compuesto 60)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 142,6 mg (0,339 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1) y 35,6 mg (0,848 mmoles) de LiOH-H_{2}O en 12 ml de THF/agua (4:1, v/v). La mezcla de reacción se extrajo con hexanos, y la fracción de hexanos se extrajo con NaOH acuoso al 5%. Las capas acuosas se combinaron y se acidificaron con HCl 1 M, y entonces se extrajeron con EtOAc y Et_{2}O. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron a vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d_{6}-DMSO): \delta 7,91 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,47 (2H, s), 7,23 (4H, q, J = 8,1 Hz), 7,01 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,30 (6H, s).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-fenil-2-naftalenil)-etinil]benzoico (Compuesto 60a)
Empleando el mismo procedimiento general que el de la preparación de ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 30a) se convirtieron 27,0 mg (0,07 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-fenil-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1a) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 5,9 mg (0,14 mmoles) de LiOH en H_{2}O. PMR (d_{6}-DMSO): \delta 1,31 (6H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,5 Hz), 6,05 (1H, t, J = J = J = 4,5 Hz), 7,00 (1H, s), 7,33 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,44 (4H, m), 7,59 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,1 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-(1,1-dimetiletil)-fenil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 61)
Se agitó toda la noche a temperatura ambiente una disolución de 80,0 mg (0,173 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-(1,1-dimetiletil)fenil)-2-naftalenil)eti-nil]benzoato de etilo (Compuesto 6) y 18,1 mg (0,432 mmoles) de LiOH-H_{2}O en 6 ml de THF/agua (3:1, v/v). La mezcla de reacción se extrajo con hexanos, y la capa acuosa que queda se acidificó con HCl 1 M, y luego se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentraron a vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (d_{6}-DMSO): \delta 7,82 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44 (6H, m), 7,25 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (9H, s), 1,29 (6H, s).
2-Fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)tiocarbonil]amino] benzoato de etilo (Compuesto 62)
Se puso a reflujo toda la noche una disolución de 54,4 mg (0,119 mmoles) de 2-fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil-2-naftalenil)carbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 40) y 57,7 mg (0,143 mmoles) de [2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetan-2,4-disulfuro] (Reactivo de Lawesson) en 12,0 ml de benceno. Con el enfriamiento a temperatura ambiente, la mezcla se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto del título se aisló mediante cromatografía en columna (10 a 25% de EtOAc/hexanos) como un sólido amarillo. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 9,08 (1H, s), 7,92 (1H, br s), 7,90 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,66 (1H, dd, J = 2,0, 6,0 Hz), 7,38 (3H, m), 7,18 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
Ácido 2-fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfe-nil)-2-naftalenil)tiocarbonil]amino] benzoico (Compuesto 63)
A una disolución de 46,5 mg (0,098 mmoles) de 2-fluoro-4-[[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metilfenil)-2-naftalenil)tiocarbonil]amino]benzoato de etilo (Compuesto 62) en 1,0 ml de EtOH y 1,0 ml de THF se añadieron 55 mg de NaOH (1,4 mmoles) y 1,0 ml de H_{2}O. Tras agitar a temperatura ambiente durante toda la noche, se añadió EtOAc, y la reacción se paralizó por adición de HCl al 10%. La extracción con EtOAc fue seguida del lavado de las capas orgánicas combinadas con H_{2}O, NaCl acuoso saturado, y el secado sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida proporcionó un sólido que, tras la cristalización en CH_{3}CN, dio el compuesto del título como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (d_{6}-acetona): \delta 11,05 (1H, s), 8,02 (1H, m), 7,99 (1H, t, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, m), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 7,52 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,21 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,33 (3H, s), 1,36 (6H, s).
5',6'-dihidro-5',5'-dimetil-8'-(4-metilfenil)-[2,2'-binaftalen]-6-carboxilato de etilo (Compuesto 64)
Se añadió una disolución de 3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-7-bromonaftaleno (Compuesto D) 0,45 g (1,40 mmoles) y THF (2,1 ml) a limaduras de magnesio (0,044 g, 1,82 mmoles) a temperatura ambiente en argón. Se añadieron 2 gotas de dibromuro de etileno, y la disolución, que se puso lentamente turbia y amarilla, se calentó hasta reflujo durante 1,5 horas. En un segundo matraz se añadió cloruro de cinc (0,210 g, 1,54 mmoles), que se fundió a alto vacío, se enfrió hasta temperatura ambiente y se disolvió en THF (3 ml). Se añadió el reactivo de Grignard al segundo matraz y, tras 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió una disolución de 6-bromo-2-naftalencarboxilato de etilo (Compuesto N) 0,293 g (1,05 mmoles) y THF (2 ml). En un tercer matraz se preparó una disolución de Ni(PPh_{3})_{4} y THF como sigue. A una disolución de NiCl_{2}(PPh_{3})_{2} (0,82 g, 1,25 mmoles) y PPh_{3} (0,66 g, 2,5 mmoles) en THF (9,5 ml) se añadió una disolución 1 M de hidruro de diisobutilaluminio y hexanos (2,5 ml, 2,5 mmoles), y la disolución resultante se diluyó con THF hasta un volumen total de 15 ml, y se agitó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 3 alícuotas de 0,60 ml de la disolución de Ni(PPh_{3})_{4} a intervalos de 15 minutos al segundo matraz. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se paralizó por adición de HCl acuoso 1 N 5 ml, y se agitó durante 1 hora antes de extraer los pros con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se cristalizó en hexanos para dar 130 mg de material puro. El licor madre se concentró a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (95:5 de hexanos:acetato de etilo) para dar 170 mg adicionales del compuesto del título (rendimiento global = 300 mg, 64%) como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,57 (s, 1H), 8,05 (dd, 1H, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,84-7,95 (d solapados, 3H), 7,66 (dd, 1H, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,58 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,43 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,32 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,04 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 4,44 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,39 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 1,45 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 1,39 (s, 6H).
Ácido 5',6'-dihidro-5',5'-dimetil-8'-(4-metilfenil)-[2,2'-binaftalen]-6-carboxílico (Compuesto 65)
Se calentó a 60ºC durante 3 horas una disolución de 5',6'-dihidro-5',5'-dimetil-8'-(4-metilfenil)-[2,2'-binaftalen]-6-carboxilato de etilo (Compuesto 64) 0,19 g (0,43 mmoles), EtOH (8 ml) y NaOH acuoso 1 N (2 ml). La disolución se enfrió hasta 0ºC, y se acidificó con HCl acuoso 1 N. El producto se extrajo en acetato de etilo, y las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con agua, salmuera, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se recristalizó en THF/acetato de etilo a 0ºC para dar 35 mg de material puro. El licor madre se concentró a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (100% de acetato de etilo) para dar 125 mg adicionales del compuesto del título (rendimiento global = 160 mg, 90%) como un sólido incoloro. 1H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,57 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,96-7,82 (d solapados, 3H), 7,65 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,28 (s, 1H), 7,26 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,01 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 3,34 (br s, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,31 (d, 2H, J = 4,5 Hz), 1,31 (s, 6H).
4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-furil)-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto 66)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(4-metil-fenil)-2-naftalenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 1) se convirtieron 250,0 mg (0,52 mmoles) de 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(trifluorometilsulfonil)oxi-2-naftalenil)-etinil]benzoato de etilo (Compuesto G) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 142,4 mg (1,045 mmoles) de cloruro de cinc, 24,1 mg (0,02 mmoles) de tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) y 2-litiofurano (preparado mediante la adición de 53,4 mg (0,52 ml, 0,78 mmoles) de n-butil-litio (disolución 1,5 M en hexano) a una disolución fría (-78ºC) de 53,4 mg (0,784 mmoles) de furano en 1,0 ml de THF. PMR (CDCl_{3}): \delta 1,32 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 5,0 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,41 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,50 (2H, s), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,49 (1H, s), 7,57 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,63 (1H, d, J = 1,7 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,2 Hz).
Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-furil)-2-naftale-nil)etinil]benzoico (Compuesto 67)
Empleando el mismo procedimiento general que para la preparación de Ácido 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-tiazolil)-2-naftalenil)etinil]benzoico (Compuesto 30a), se convirtió 4-[(5,6-dihidro-5,5-dimetil-8-(2-furil)-2-nafta-lenil)etinil]benzoato de etilo (Compuesto 66) en el compuesto del título (sólido incoloro) usando 16,0 mg (0,38 mmoles) de LiOH en H_{2}O. PMR (d_{6}-DMSO): \delta 1,26 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,41 (1H, t, J = 4,9 Hz), 6,60 (2H, m), 7,45-7,53 (3H, m), 7,64 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,3 Hz).
3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100C) y 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100D)
A una mezcla fría (0ºC) de cloruro de aluminio (26,3 g, 199,0 mmoles) en diclorometano (55 ml) se añadió cloruro de acetilo (15 g, 192 mmoles) y 1,2,3,4-tetrahidro-1,1-dimetilnaftaleno (24,4 g, 152 mmoles) en diclorometano (20 ml) durante 20 minutos. La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 4 horas. Se añadió hielo (200 g) al matraz de reacción, y la mezcla se diluyó con éter (400 ml). Las capas acuosa y orgánica se separaron, y la fase orgánica se lavó con HCl al 10% (50 ml), agua (50 ml), bicarbonato de sodio acuoso al 10% y NaCl acuoso saturado (50 ml), y entonces se secó sobre MgSO_{4}. El disolvente se eliminó por destilación para producir un aceite amarillo que se disolvió en benceno (50 ml).
A una disolución fría (0ºC) de ácido acético (240 ml) y anhídrido acético (120 ml) se añadió trióxido de cromo (50 g, 503 mmoles) en pequeñas porciones durante 20 minutos en argón. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 0ºC, y se diluyó con benceno (120 ml). La disolución bencénica preparada anteriormente se añadió con agitación vía un embudo de adición durante 20 minutos. Tras 8 horas, la reacción se paralizó por adición cuidadosa de isopropanol (50 ml) a 0ºC, seguido de agua (100 ml). Tras 15 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con éter (1100 ml) y agua (200 ml), y entonces se neutralizó con bicarbonato sódico sólido (200 g). La capa etérea se lavó con agua (100 ml), y NaCl acuoso saturado (2 x 100 ml), y se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente a presión reducida dio una mezcla de las dicetonas isómeras que se separaron por cromatografía (5% de EtOAc/hexanos). (Compuesto 100C): 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,41 (6H, s). (Compuesto 100D): 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-(2-(2-metil-1,3-tioxolanil))-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100E)
Se combinó una disolución de 1,80 g (8,34 mmoles) de una mezcla 1:5 de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-7-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100C) y 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-acetil-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100D) en 50 ml de benceno con 517,7 mg (8,34 mmoles) de etilenglicol y 20,0 mg (0,11 mmoles) de ácido p-toluensulfónico monohidratado. La disolución resultante se calentó hasta reflujo durante 18 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se aisló mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc-hexanos) como un aceite incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,01 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,51 (1H, s), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz), 4,07 (2H, m), 3,79 (2H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,67 (3H, s), 1,46 (6H, s).
1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-6-(2-(2-metil-1,3-tioxolanil)) naftaleno (Compuesto 100 F)
A una disolución de 496,2 mg (2,54 mmoles) de bromuro de p-tolilmagnesio en 20 ml de THF (2,54 ml; disolución 1 M en éter) se añadió una disolución de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-(2-(2-metil-1,3-tioxolanil))-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100E); 200,0 mg, 0,769 mmoles) en THF (5 ml). La disolución se puso a reflujo durante 16 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente, y se lavó con agua, NH_{4}Cl acuoso saturado, y se secó sobre MgSO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida, y la cromatografía en columna (10% de EtOAc/hexanos), dio el compuesto del título como un sólido incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,49 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,19 (2H, m), 7,10 (2H, d, J = 7,9 Hz), 7,04 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,05 (2H, m), 3,80 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,21 (1H, m), 2,10 (1H, m), 1,88 (1H, m), 1,65 (3H, s), 1,54 (1H, m), 1,39 (3H, s), 1,33 (3H, s).
3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-6-acetilnaftaleno (Compuesto 100 G)
Se puso a reflujo durante 12 horas una disolución de 1,2,3,4-tetrahidro-1-hidroxi-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-6-(2-(2-metil-1,3-tioxolanil))naftaleno (Compuesto 100F); 160,0 mg, 0,52 mmoles), ácido p-toluensulfónico monohidratado (4 mg) y 30 ml de benceno. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con éter (100 ml) y se lavó con bicarbonato de sodio acuoso al 10%, agua, y NaCl acuoso saturado. La capa orgánica se secó sobre MgSO_{4}, y los disolventes se eliminaron a presión reducida para dar el compuesto del título, que se aisló mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc-hexanos) como un aceite amarillo. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,97 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz), 7,22 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,10 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,59 (3H, s), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (6H, s).
Ácido 4-[3-oxo-3-(7,8-dihidro-5-(4-metilfenil)-8,8-dimetil-2-naftalenil)-1-propenil] benzoico (Compuesto 101)
A una disolución de 78,7 mg (0,272 mmoles) de 3,4-dihidro-1-(4-metilfenil)-4,4-dimetil-6-acetilnaftaleno (Compuesto 100 G) en 4,0 ml de MeOH se añadieron 53,1 mg (0,354 mmoles) de 4-carboxibenzaldehído y 80 mg (2,00 mmoles, 2,0 ml de NaOH acuoso 1 M). La disolución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas, se concentró a presión reducida, y el aceite residual se disolvió en EtOAc. La disolución se trató con HCl al 10%, y la capa orgánica se lavó con H_{2}O y NaCl acuoso saturado, y entonces se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La eliminación de los disolventes a presión reducida dio el compuesto del título como un sólido incoloro que se purificó por recristalización en CH_{3}CN. 1H NMR (acetona-d6): \delta 8,00 (7H, m), 7,83 (1H, d, J = 15,6 Hz), 7,24 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,38 (3H, s), 1,41 (6H, s).
3,4-dihidro-1-fenil-4,4-dimetil-6-acetilnaftaleno (Compuesto 100H)
A una disolución de 508,0 mg (1,95 mmoles) de 3,4-dihidro-4,4-dimetil-6-(2-(2-metil-1,3-tioxolanil))-1(2H)-naftalenona (Compuesto 100E) en 10 ml de THF se añadieron 496,2 mg (2,54 mmoles, 2,54 ml de una disolución 1 M en Et_{2}O) de bromuro de fenilmagnesio. La disolución resultante se calentó hasta reflujo durante 8 horas, se añadió H_{2}O y se continuó calentando durante 30 minutos. El THF se eliminó a presión reducida, y el residuo acuoso se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se concentraron a presión reducida, y el compuesto del título se aisló a partir del residuo mediante cromatografía en columna (10% de EtOAc-hexanos) como un aceite incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,97 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 2,1, 8,0 Hz), 7,34 (5H, m), 7,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, d, J = 4,6 Hz), 2,59 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,38 (6H, s).
Ácido 4-[3-oxo-3-(7,8-dihidro-5-fenil-8,8-dimetil-2-nafta-lenil)-1-propenil]benzoico (Compuesto 103)
A una disolución de 115,0 mg (0,42 mmoles) de 3,4-dihidro-1-fenil-4,4-dimetil-6-acetilnaftaleno (Compuesto 100H) y 65,0 mg (0,43 mmoles) de ácido 4-formilbenzoico en 5,0 ml de EtOH y 1,0 ml de THF se añadieron 120,0 mg (3,00 mmoles; 3,0 ml de una disolución acuosa 1 M) de NaOH. La disolución amarilla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La disolución se acidificó con HCl acuoso al 6%, y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se concentraron a presión reducida, y los compuestos del título se aislaron mediante cromatografía en columna (50% de EtOAc-hexanos) como un sólido amarillo pálido. 1H NMR (CDCl_{3}): \delta 8,13 (2H, d, J = 7,7 Hz), 8,04 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,75 (3H, m), 7,60 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,35 (5H, m), 7,14 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,2 Hz), 2,41 (2H, d, J = 4,2 Hz), 1,41 (6H, s).
Método para potenciar los agonistas de receptores nucleares Revisión e introducción
Se ha descubierto que se puede usar un subconjunto de antagonistas de retinoides que exhiben actividad hormonal negativa para potenciar las actividades biológicas de otros retinoides y hormonas de la superfamilia de receptores de esteroides. Estos otros retinoides y hormonas de la superfamilia de receptores de esteroides pueden ser hormonas endógenas o agentes farmacéuticos. De este modo, por ejemplo, cuando se usan en combinación con una hormona negativa de retinoides, ciertas actividades de los agonistas de retinoides farmacéuticos se pueden hacer más activos para provocar efectos biológicos específicos. Ventajosamente, este enfoque de combinaciones para la administración de fármacos puede minimizar los efectos secundarios indeseables de retinoides farmacéuticos debido a que se pueden usar dosis más bajas de retinoides farmacéuticos con una eficacia mejorada.
Más particularmente, se ha descubierto que AGN 193109, un retinoide sintético que tiene la estructura mostrada en la Figura 1, muestra actividades farmacológicas únicas e inesperadas. AGN 193109 muestra alta afinidad por la subclase de RAR de receptores nucleares sin activar estos receptores o estimular la transcripción de genes sensibles a retinoides. En su lugar, AGN 193109 inhibe la activación de los RAR por los agonistas de retinoides, y por lo tanto se comporta como un antagonista de retinoides.
Adicionalmente, se ha descubierto que se pueden usar hormonas negativas de retinoides sin co-administración de un agonista de retinoide u hormona esteroidea para controlar ciertos síntomas de enfermedades. Más específicamente, la hormona negativa de retinoides descrita en este documento puede regular a la baja el elevado nivel de transcripción basal de genes que son sensibles a RAR no ligados. Por ejemplo, si resulta una proliferación celular incontrolada a partir de la actividad de genes sensibles a RAR no ligados, entonces esa actividad de los genes se puede reducir mediante la administración de una hormona negativa de retinoides que inactiva los RAR. En consecuencia, la proliferación celular dependiente de la actividad de los RAR no ligados se puede inhibir por la hormona negativa. La inhibición de RAR no ligados no se puede lograr usando antagonistas convencionales.
De forma significativa, se ha descubierto que AGN 193109 puede tanto reprimir la actividad basal de RAR como algunas veces puede potenciar las actividades de otros agonistas de retinoides y de hormonas de la superfamilia de receptores de esteroides. En el contexto de la invención, se afirma que un agonista de hormona se potencia por una hormona negativa, tal como AGN 193109, si, en presencia de la hormona negativa, una concentración reducida del agonista provoca sustancialmente la misma respuesta cuantitativa que aquélla obtenible con el agonista sólo. La respuesta cuantitativa puede, por ejemplo, medirse en un ensayo de gen informador in vitro. De este modo, un retinoide terapéutico que provoca una respuesta deseada cuando se usa a una dosis o concentración particular se potencia por AGN 193109 si, en combinación con AGN 193109, se puede usar una dosis o concentración más baja del retinoide terapéutico para producir sustancialmente el mismo efecto que una dosis o concentración más alta del retinoide terapéutico cuando ese retinoide terapéutico se usa solo. La lista de agonistas que pueden ser potenciados por la co-administración con AGN 193109 incluye agonistas de RAR, agonistas de receptores de vitamina D, agonistas de receptores de glucocorticoides y agonistas de receptores de hormonas del tiroides. Más particularmente, los agonistas específicos que pueden ser potenciados por la co-administración incluyen: ATRA, ácido 13-cis-retinoico, el agonista de RAR sintético AGN 191183, 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, dexametasona y la hormona del tiroides (3,3',5-triyodotironina). También se describe en esta memoria un método que se puede usar para identificar otras hormonas que pueden ser potenciadas por la co-administración con AGN 193109.
De este modo, AGN 193109 se comporta de una manera no prevista para un antagonista simple de retinoides, sino como una hormona negativa que puede potenciar las actividades de diversos miembros de la familia de receptores nucleares. También se describe un mecanismo posible que puede dar razón tanto de la actividad de hormona negativa como de la capacidad de AGN 193109 para potenciar las actividades de otros ligandos de receptores nucleares. Este mecanismo incorpora elementos conocidos por su participación en rutas de señalización dependientes de retinoides, e incorpora adicionalmente un nuevo componente regulador negativo.
Los expertos normales en la técnica apreciarán que los RAR, que son dianas de alta afinidad de la unión de AGN 193109, son factores de transcripción que regulan la expresión de una variedad de genes sensibles a retinoides. Se han identificado sitios de unión de ADN cis-reguladores para los RAR, próximos a genes que se regulan transcripcionalmente de una manera dependiente de retinoides. La unión de los RAR a tales sitios de ADN, conocidos como elementos sensibles al ácido retinoico (RARE), ha sido muy bien definida. De forma importante, los heterodímeros que se unen a los RARE constan de un RAR y un RXR. El componente RXR del heterodímero funciona para promover una interacción de alta afinidad entre el heterodímero de RAR/RXR y el RARE (Mangelsdorf et al. The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2ª edición, eds. Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York 1994).
Como se detalla a continuación, los hallazgos relacionados con la actividad hormonal negativa de AGN 193109 son consistentes con un mecanismo que implica la interacción de una proteína coactivadora negativa (NCP) putativa con el RAR. Según el mecanismo propuesto, esta interacción está estabilizada por AGN 193109.
Los resultados indican adicionalmente que AGN 193109 puede modular la disponibilidad intracelular de NCP para la interacción con receptores nucleares distintos de los RAR que están ocupados por AGN 193109. Se concluye que AGN 193109 puede potenciar las rutas reguladoras transcripcionales que implican receptores nucleares que comparten con los RAR la capacidad para unirse a la NCP. A este respecto, AGN 193109 muestra la capacidad de modular una variedad de rutas de receptores nucleares, una actividad que no se predeciría para un antagonista convencional de retinoides. En consecuencia, AGN 193109 es útil como un agente para potenciar la actividad de ligandos de receptores nucleares, incluyendo tanto las hormonas endógenas como compuestos terapéuticos recetados. Esta realización específica ilustra el principio más general de que cualquier hormona negativa de receptores nucleares potenciará la actividad de otros receptores nucleares que se unen competitivamente a la NCP.
Aunque se pueden usar otros materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o el ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. Se pueden encontrar referencias generales para los métodos que se pueden usar para realizar las diversas manipulaciones de ácidos nucleicos y procedimientos descritos en este documento en Molecular Cloning: A laboratory Manual (Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1987). A continuación se da una descripción de los experimentos y resultados que condujeron a la creación de la presente invención.
El Ejemplo 6 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 se unió a cada uno de los tres RAR con alta afinidad pero fracasó activando la expresión de genes dependiente de retinoides.
Ejemplo 6 AGN 193109 se une a los RAR con alta afinidad pero no transactiva la expresión de genes dependiente de retinoides
Se expresaron separadamente como proteínas recombinantes receptores humanos de RAR-\alpha RAR-\beta y RAR-\gamma usando un sistema de expresión de baculovirus esencialmente según el método descrito por Allegretto et al. en J. Biol. Chem. 268: 28625 (1993). Las proteínas de receptores recombinantes se emplearon separadamente para determinar las afinidades de unión de AGN 193109 usando el ensayo de desplazamiento de [^{3}H]-ATRA descrito por Heyman et al. en Cell 68:397 (1992). Las constantes de disociación (K_{d}) se determinaron según el procedimiento descrito por Cheng et al. en Biochemical Pharmacology 22:3099 (1973).
También se ensayó AGN 193109 para determinar su capacidad para transactivar RAR en células CV-1 cotransfectadas transitoriamente con vectores de expresión de RAR y un constructo de gen informador sensible a retinoides. Se cotransfectaron separadamente vectores de expresión de receptores pRShRAR-\alpha (Giguere et al. Nature 330:624 (1987)), pRShRAR-\beta (Benbrook et al. Nature 333:669 (1988)) y pRShRAR-\gamma (Ishikawa et al. Mol. Endocrinol. 4:837 (1990)) con el plásmido informador \DeltaMTV-TREp-Luc. El uso de este plásmido informador de luciferasa se ha descrito por Heiman et al. en Cell 68:397 (1992). El plásmido \DeltaMTV-TREp-Luc es esencialmente idéntico al constructo informador \DeltaMTV-ThEp-CAT descrito por Umesono et al. en Nature 336:262 (1988), excepto que el gen informador de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) se sustituyó por una secuencia de polinucleótido que codifica la luciferasa de luciérnaga. La transfección de células CV-1 de mono verde se llevó a cabo usando el método de coprecipitación con fosfato de calcio descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al. eds, Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Las células CV-1 se colocaron en placas a una densidad de 4 x 10^{4}/pocillo en placas multipocillos de 12 pocillos, y se transfectaron transitoriamente con un precipitado de fosfato de calcio que contiene 0,7 \mug de plásmido informador y 0,1 \mug de plásmido receptor según procedimientos de laboratorio estándares. Las células se lavaron después de 18 horas para eliminar el precipitado, y se realimentaron con el medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) (Gibco), que contiene 10% de suero bovino fetal extraído en carbón activado (Gemini Bio-Products). Las células se trataron con el vehículo sólo (etanol) o con AGN 193109 (10^{-9} a 10^{-6} M) durante 18 horas. Los lisados celulares se prepararon en KPO_{4} 0,1 M (pH 7,8), TRITON X-100 al 1,0%, DTT 1,0 mM, EDTA 2 mM. La actividad de luciferasa se midió como se describe por de Wet et al. en Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987) usando luciferina de luciérnaga (Analytical Luminescence Laboratory) y un luminómetro de placas de 96 pocillos EG&G Berthold. Los valores de luciferasa dados representaron la media \pm SEM de determinaciones por triplicado.
Los resultados presentados en la Tabla 11 indicaron que AGN 193109 se unió a cada uno de RAR-\alpha, RAR-\beta y RAR-\gamma con alta afinidad, pero que no activó la expresión de genes dependiente de retinoides. Más específicamente, AGN 193109 se unió a cada uno de los tres receptores de K_{d} en el intervalo de 2-3 nM. A pesar de esta unión ajustada, AGN 193109 fracasó activando la expresión de genes cuando se compara con inducciones estimuladas por ATRA. En consecuencia, la concentración semi-máxima efectiva de AGN 193109 (EC_{50}) no fue medible. Aunque no se presenta en la Tabla, también se ha encontrado que AGN 193109 no tuvo afinidad medible por los RXR.
TABLA 11
Unión de AGN 193109 y transactivación de los RAR
RAR-\alpha RAR-\beta RAR-\gamma
EC_{50} (nM) Sin actividad Sin actividad Sin actividad
K_{d} (nM) 2 2 3
El Ejemplo 7 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 es un antagonista de la expresión de genes dependiente de ATRA.
Ejemplo 7 Inhibición dependiente de AGN 193109 de la transactivación de RAR por ATRA
Se investigó la capacidad de AGN 193109 para antagonizar la activación de RAR mediada por ATRA en células CV-1 cotransfectadas por el método de coprecipitación con fosfato de calcio de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Se cotransfectaron vectores de expresión eucariotas pRShRAR-\alpha (Giguere et al. Nature 330:624 (1987)), pRShRAR-\beta (Benbrook et al. Nature 333:669 (1988)) y pRShRAR-\gamma (Ishikawa et al. Mol. Endocrinol. 4:837 (1990)) con el plásmido informador \Delta-MTV-Luc descrito por Hollenberg et al. (Cell 55:899 (1988)). De forma notable, el plásmido informador contenía dos copias del elemento sensible palíndromo a TRE. Las transfecciones con fosfato de calcio se llevaron a cabo exactamente como se describe en el Ejemplo 6. Las células se dosificaron con vehículo solo (etanol), ATRA (10^{-9} a 10^{-6} M), AGN 193109 (10^{-9} a 10^{-6} M) o ATRA 10^{-8} M en combinación con AGN 193109 (10^{-9} a 10^{-6} M) durante 18 horas. Los lisados celulares y las medidas de la actividad de luciferasa también se realizaron como en el Ejemplo 6.
Los resultados de estos procedimientos se presentan en las Figuras 2A a 2F en las que los valores de luciferasa representan la media \pm SEM de determinaciones por triplicado. Más específicamente, los resultados presentados en las Por ejemplos 2A, 2C y 2E indicaron que la estimulación de células transfectadas con ATRA condujo a aumentos sensibles a la dosis en la actividad de luciferasa. Esto confirmó que ATRA activó cada uno de los tres RAR en el sistema experimental, y proporcionó una base comparativa para detectar la actividad de un antagonista. Los resultados gráficos presentados en las Figuras 2B, 2D y 2F indicaron que el cotratamiento de células transfectadas con ATRA 10 nM y concentraciones crecientes de AGN 193109 condujo a una inhibición de la actividad de luciferasa. En particular, dosis iguales de AGN 193109 y ATRA dieron una inhibición mayor del 50% con relación a ATRA sola para los tres subtipos de RAR. La comparación de la respuesta a la dosis de ATRA en presencia de concentraciones diferentes de AGN 193109 indicó que ATRA fue inhibida competitivamente por AGN 193109. De forma notable, el eje horizontal en todas las gráficas mostradas en la Figura 2 representan el logaritmo de la concentración de retinoides. Estos resultados demostraron que AGN 193109 fue un potente antagonista de RAR.
Seguidamente se realizaron experimentos para elucidar el mecanismo que subyace a la actividad antagonista de AGN 193109. Aquellos expertos normales en la técnica apreciarán que se cree que la activación de receptores nucleares implica un cambio conformacional del receptor que está inducido por la unión al ligando. De hecho, los resultados de los ensayos de protección de proteasas han confirmado que los agonistas y antagonistas de hormonas nucleares provocan que las proteínas de receptores adopten diferentes conformaciones (Keidel et al. Mol. Cell. Biol. 14:287 (1994); Allan et al. J. Biol. Chem. 267:19513 (1992)). Se ha usado tal ensayo para determinar si AGN 193109 y ATRA provocaron que RAR-\alpha adopte conformaciones diferentes. AGN 193583, un antagonista selectivo de RAR-\alpha, se incluyó como un control positivo que se sabe confiere un patrón específico de antagonista de sensibilidad a proteasa.
El Ejemplo 8 describe un método que se usó para detectar los cambios conformacionales en RAR-\alpha que resultan de la unión de AGN 193109. Como se presenta a continuación, los resultados de este procedimiento indicaron inesperadamente que AGN 193109 condujo a un patrón de sensibilidad a tripsina que fue sustancialmente idéntico al inducido por ATRA, y distinto al inducido por un antagonista modelo de RAR. Este hallazgo sugiere que AGN 193109 poseía propiedades distintas de otros antagonistas de retinoides.
Ejemplo 8 Análisis de protección de proteasa
Se usó un plásmido construido en el vector pGEM3Z (Pharmacia) y que contiene el ADNc de RAR-\alpha (Giguere et al. Nature 330:624 (1987)), en conexión con el sistema de transcripción-traducción in vitro de lisado reticulocítico acoplado a TNT (Promega) para preparar RAR-\alpha marcado isotópicamente con [^{35}S]-metionina. La digestión proteolítica limitada de la proteína marcada de RAR-\alpha se llevó a cabo según el método descrito por Keidel et al. En Mol. Cell. Biol. 14:287 (1994). Se incubaron alícuotas de lisado reticulocítico que contiene RAR-\alpha marcado isotópicamente con [^{35}S]-metionina, bien con ATRA, AGN 193583 o AGN 193109 en hielo durante 45 minutos en un volumen total de 9 \mul. La concentración final de retinoide para los ensayos fue 100 nM para ATRA y AGN 193109, y 1000 nM para AGN 193583. La diferencia entre las concentraciones finales de los retinoides se basó en la diferencia aproximada de 10 veces en las afinidades relativas de ATRA y AGN 193109 (que tienen Kd a RAR-\alpha de 2 y 10 nM, respectivamente) y AGN 193583 (que tiene Kd a RAR-\alpha de \geq 100 nM). Tras la unión al ligando, se añadió 1 \mul de tripsina apropiadamente concentrada a la mezcla para dar concentraciones finales de 25, 50 ó 100 \mug/ml. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y la digestión con tripsina se detuvo por adición de tampón de muestra SDS. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida, y se autorradiografiaron según los procedimientos estándares.
Tanto el agonista como el antagonista condujeron a patrones distintos de sensibilidad a tripsina que fueron diferentes a partir del resultado obtenido por la digestión del receptor no unido a ligando. Los resultados autorradiográficos indicaron que las concentraciones de tripsina de 25, 50 y 100 \mug/ml digirieron completamente el RAR-\alpha marcado isotópicamente en 10 minutos a temperatura ambiente en ausencia de retinoide añadido. La unión previa de ATRA condujo a la aparición de dos especies principales resistentes a proteasa. La unión previa del antagonista selectivo de RAR-\alpha AGN 193583 dio lugar a una especie resistente a proteasa que fue de un peso molecular menor que el resultante de la unión previa de ATRA. Este resultado demostró que un agonista y antagonista de retinoides condujo a cambios conformacionales detectables en virtud de las sensibilidades alteradas a la tripsina. De forma sorprendente, la unión previa de AGN 193109 dio lugar a un patrón de protección de proteasa que fue indistinguible del producido por la unión previa de ATRA. Los resultados presentados anteriormente confirmaron que AGN 193109 se unió a RAR-\alpha y alteró su conformación. De forma interesante, la naturaleza de este cambio conformacional se parecía mucho a aquél que resultó de la unión de un agonista (ATRA) que a la alteración producida por la unión del antagonista (AGN 193583). Claramente, el mecanismo de antagonismo dependiente de AGN 193109 fue único.
Se consideraron posibles mecanismos que pudieran dar cuenta de la actividad antagonista de AGN 193109. En particular, se usó un ensayo de desplazamiento de gel estándar para analizar si AGN 193109 perturbó la formación del heterodímero de RAR/RXR o inhibió la interacción entre RAR y su sitio de unión de ADN cognato.
\newpage
El Ejemplo 9 describe un ensayo de desplazamiento y movilidad electroforética de gel usado para demostrar que AGN 193109 no inhibió la dimerización de RAR/RXR ni inhibió la unión de dímeros a un ADN diana.
Ejemplo 9 Análisis de desplazamiento de gel
Se produjo RAR-\alpha traducido in vitro esencialmente como se describe en el Ejemplo 8, excepto que se omitió la metionina marcada con ^{35}S. La RXR- \alpha traducida in vitro se produjo de forma similar usando un vector a base de pBluescript(II)(SK) que contiene el ADNc de RXR-\alpha descrito por Mangelsdorf, et al. en Nature 345:224-229 (1990) como el molde para generar los transcriptos in vitro. Se dejó que RAR-\alpha y RXR-\alpha marcados isotópicamente, solos o en combinación, o preunidos con AGN 193109 (10^{-6} M) bien solo o en combinación, interaccionaran con una sonda de cadena doble RARE DR-5 marcada en el extremo que tiene la secuencia 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3' (SEQ ID NO:1). La mezcla de unión se sometió a electroforesis en un gel poliacrilamídico no desnaturalizante, y se autorradiografió según los procedimientos de laboratorio estándares. Una única especie retardada que aparece en la autorradiografía que era común para todas las filas en el gel representó un factor no definido de unión a la sonda presente en el lisado reticulocítico. Sólo la combinación de RAR/RXR dio lugar a una especie retardada específica del receptor de retinoides. Ni RAR solo ni RXR solo se unieron a la sonda para producir esta especie desplazada. La presencia de AGN 193109 no disminuyó esta interacción.
Estos resultados indicaron que AGN 193109 no alteró sustancialmente ni las propiedades de homo- ni hetero-dimerización de RAR-\alpha. Además, AGN 193109 no inhibió la interacción de dímeros del receptor con un segmento de ADN que contiene el sitio de unión a cognato.
En vista de las propiedades únicas que caracterizaron a AGN 193109, se procedió a investigar si este antagonista podría inhibir adicionalmente la actividad de los RAR no ligados. El sistema de receptor/informador usado para obtener esta determinación mostró ventajosamente un alto nivel de actividad constitutiva en ausencia de agonista de retinoides añadido. Más específicamente, estos procedimientos emplearon el receptor quimérico ER-RAR y el sistema informador ERE-tk-Luc. El plásmido ERE-tk-Luc incluye la región -397 a -87 de la región flanqueante 5' sensible a estrógenos del gen A2 vitelogenínico de Xenopus, descrito por Klein-Hitpass, et al. en Cell 46:1053-1061 (1986), ligado hacia la posición promotor de timidinquinasa HSV y gen informador de luciferasa de plásmido tk-Luc. Los receptores quiméricos ER-RAR constaron del dominio de unión de ADN de receptor de estrógenos fusionado al dominio "D-E-F" de los RAR. Aquellos expertos normales en la técnica apreciarán que este dominio "D-E-F" funciona para unir al retinoide, para proporcionar una función de transactivación inducible por retinoides y para proporcionar un sitio de contacto para la heterodimerización con RXR. De este modo, la expresión de luciferasa en este sistema informador dependió de la activación del constructo del receptor quimérico transfectado.
El Ejemplo 10 describe el método usado para demostrar que AGN 193109 inhibió la actividad génica basal atribuible a los RAR no ligados. Estos procedimientos se realizaron en ausencia de agonista de retinoides añadido. Los resultados presentados a continuación proporcionaron la primera indicación de que AGN 193109 mostró actividad hormonal negativa.
Ejemplo 10 Represión de la actividad génica basal de un informador regulado por retinoides en estirpes celulares cotransfectadas transitoriamente
Se cotransfectaron células CV-1 con el plásmido informador ERE-tk-Luc y con los plásmidos de expresión ER-RAR-\alpha, ER-RAR-\beta o ER-RAR-\gamma. El plásmido ERE-tk-Luc contenía el elemento promotor sensible a estrógeno del gen A2 vitelogenínico de Xenopus Laevis, y fue sustancialmente idéntico al plásmido informador descrito por Klein-Hitpass et al. en Cell 46:1053 (1986), excepto que el gen informador de CAT se sustituyó por una secuencia de polinucleótidos que codifica luciferasa. Los polinucleótidos que codifican al receptor quimérico ER-RAR-\alpha, ER-RAR-\beta y ER-RAR-\gamma empleados en la cotransfección se han descrito por Graupner et al. en Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991). Estos polinucleótidos se ligaron en el vector de expresión pECE descrito por Ellis et al. en Cell 45:721 (1986), y se expresaron en un control transcripcional del promotor SV-40. Las transfecciones con fosfato de calcio se llevaron a cabo exactamente como se describe en el Ejemplo 6 usando 0,5 \mug/pocillo de plásmido informador, y 0,05 \mug, 0,10 \mug o 0,2 \mug/pocillo de plásmido receptor. Las células se dosificaron con plásmido solo (etanol), ATRA (10^{-9} a 10^{-6} M), o AGN 193109 (10^{-9} a 10^{-6} M) durante 18 horas. Los lisados celulares y las medidas de la actividad de luciferasa se realizaron como se describe en el Ejemplo 6.
Los resultados presentados en las Figuras 3A, 4A y 5A confirmaron que ATRA indujo fuertemente la expresión de luciferasa en todos los transfectantes. La expresión de nivel basal de luciferasa para las tres isoformas de RAR quiméricas transfectadas oscilaron de aproximadamente 7.000 a 40.000 unidades relativas de luz (rlu), y en cierto modo dependía de la cantidad de plásmido receptor usado en la transfección. De este modo, como se esperaba, los tres receptores quiméricos fueron activables por ATRA. Más específicamente, los tres receptores se unieron a ATRA, y activaron la transcripción del gen informador de luciferasa cosechado en el plásmido ERE-tk-Luc.
Las Figuras 3B, 4B y 5B presentan curvas de respuesta a la dosis de AGN 193109 obtenidas en ausencia de cualquier agonista exógeno de retinoides. De forma interesante, ER-RAR-\alpha (Figura 3B) no fue afectado sustancialmente por AGN 193109, mientras que los receptores quiméricos ER-RAR-\beta y ER-RAR-\gamma (Figuras 4B y 5B, respectivamente) mostraron una disminución sensible a la dosis de AGN 193109 en la actividad informadora de luciferasa.
Se investigó adicionalmente la actividad hormonal negativa de AGN 193109 analizando su capacidad para reprimir la expresión génica mediada por un receptor quimérico de RAR-\gamma manipulado por ingeniería para que posea un dominio activador de la transcripción constitutiva. Más específicamente, se usó un receptor quimérico de RAR-\gamma constitutivamente activo fusionado con el dominio de activador ácido de HSV VP-16, denominado RAR-\gamma-VP-16, en dos tipos de sistemas informadores de luciferasa. El primero constaba del informador ERE-tk-Luc cotransfectado con ER- RAR y ER-RXR-\alpha. El segundo utilizó el informador \DeltaMTV-TREp-Luc en lugar del informador ERE-tk-Luc.
El Ejemplo 11 describe el método usado para demostrar que AGN 193109 pudo suprimir la actividad de un dominio activador de la transcripción de un RAR. Los resultados presentados más abajo demostraron que AGN 193109 pudo suprimir la expresión génica dependiente de RAR en ausencia de un agonista, y confirmaron que AGN 193109 mostró actividad hormonal negativa.
Ejemplo 11 Represión de la actividad de RAR-VP-16 en células transfectadas transitoriamente
Se cotransfectaron transitoriamente células CV-1 según la técnica de coprecipitación con fosfato de calcio descrita en el Ejemplo 6, usando 0,5 \mug/pocillo del plásmido informador de luciferasa ERE-tk-Luc, 0,1 \mug/pocillo del plásmido de expresión de informador quimérico ER-RXR-\alpha, y 0 g o 0,1 g/pocillo del plásmido de expresión RAR-\gamma-VP-16. El receptor quimérico ER-RXR-\alpha constaba del dominio de unión de hormonas (aminoácidos 181 a 456) de RXR-\alpha (Mangelsdorf et al. Nature 345:224-229 (1990)) fusionado al dominio de unión a ADN de receptor de estrógeno (Graupner, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)) y se expresó a partir del vector de expresión pECE basado en SV-40 descrito por Ellis, et al. en Cell 45:721 (1986). RAR-\gamma-VP-16 es idéntico al plásmido de expresión VP16RAR-\gamma1 descrito por Nagpal et al. en EMBO J. 12:2349 (1993), y codifica una proteína quimérica que tiene el dominio de activación de la proteína VP-16 de HSV fusionado al término amino de RAR-\gamma de longitud completa. Ocho horas después de la transfección, las células se enjuagaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se alimentaron con DMEM (Gibco-BRL) que contiene 10% de FBS (Gemini Bio-Products) que se extrajo con carbón para eliminar los retinoides. Las células se dosificaron con una dilución apropiada de AGN 193109 o ATRA en el vehículo etanol o en etanol sólo durante 18 horas, entonces se enjuagaron con PBS y se lisaron usando KPO_{4} 0,1 M (pH 7,8), TRITON X-100 al 1,0%, DDT 1,0 mM, EDTA 2 mM. Se midió la actividad de luciferasa según el método descrito por de Wet, et al. en Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987), usando luciferina de luciérnaga (Analytical Luminiscence Laboratory) y un luminómetro de placas de 96 pocillos EG&G Berthold. Los valores de luciferasa representaron la media \pm SEM de determinaciones por triplicado.
Como se muestra en la Figura 6, las células CV-1 transfectadas con el constructo informador ERE-tk-Luc y el plásmido de expresión quimérico ER-RAR-\alpha exhibieron una activación débil de actividad de luciferasa por ATRA, probablemente debido a la isomerización de ATRA a 9C-RA, el ligando natural para los RXR (Heyman et al. Cell 68:397 (1992). Las células transfectadas con la misma mezcla de plásmidos informador y receptor quimérico pero tratadas con AGN 193109 no mostraron ningún efecto sobre la actividad de luciferasa. Puesto que AGN 193109 no se une a los RXR, este último resultado era de esperar. Las células CV-1 transfectadas de forma similar con el informador ERE-tk-Luc pero con la sustitución de un plásmido de expresión de receptor quimérico ER-RAR en vez de 
\hbox{ER-RXR- \alpha }
mostraron una inducción robusta de actividad de luciferasa tras el tratamiento con ATRA.
Por contra, la inclusión del plásmido de expresión RAR-\gamma-VP-16 con los plásmidos ER-RXR-\alpha y ERE-tk-Luc en la mezcla de transfección dio como resultado un aumento significativo en la actividad basal de luciferasa según se mide en ausencia de cualquier retinoide añadido. Este aumento en la actividad basal de luciferasa observado para los agentes cotransfectantes ER-RXR-\alpha/RAR-\gamma-VP-16, cuando se compara con el resultado obtenido usando células transfectadas con ER-RXR-\alpha sólo, indicó que las proteínas recombinantes ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16 se podrían haber heterodimerizado. La interacción del heterodímero con el elemento sensible a estrógenos cis-regulador condujo a la selección como diana del dominio de activación de VP-16 por la región del promotor del informador ERE-tk-Luc. El tratamiento de tales células triplemente transfectadas con ATRA condujo a un aumento modesto de la actividad de luciferasa sobre el nivel elevado basal. Sin embargo, el tratamiento de los transfectantes triples con AGN 193109 dio como resultado una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa. De forma importante, la Figura 6 muestra que el tratamiento con AGN 193109 de células cotransfectadas con ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16 condujo a la represión de la actividad de luciferasa apareciendo la inhibición máxima a aproximadamente una concentración de AGN 193109 10^{-8} M.
La observación de que AGN 193109 reprimió la función de activación transcripcional constitutiva de RAR-\gamma-VP-16 en presencia de un RXR fue explicada por un modelo en el que la unión de AGN 193109 al RAR indujo un cambio conformacional en RAR que estabiliza una conformación negativa que facilita la unión de una proteína coactivadora negativa transactuante. Cuando el complejo AGN 193109/RAR está unido por la NCP, el RAR es incapaz de regular hacia arriba la transcripción de genes que son sensibles normalmente a RAR activados. El modelo propone además que el depósito intracelular de NCP está en una concentración limitante en ciertos contextos y se puede agotar en virtud de la complejación estimulada por AGN 193109 con los RAR.
Los resultados presentados en la Figura 6 indicaron adicionalmente que, incluso a una concentración de AGN 193109 de 10^{-6} M, las proteínas ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16 pudieron interaccionar para formar heterodímeros competentes para activar la transcripción del gen informador. Más específicamente, las células transfectadas con 
\hbox{ER-RXR- \alpha }
y RAR-\gamma-VP-16, y tratadas con AGN 193109 a una concentración (10^{-8}-10^{-6} M) suficiente para proporcionar una inhibición máxima, dieron lecturas de actividad de luciferasa de aproximadamente 16.000 rlu. A la inversa, las células transfectadas sólo con ER-RXR-\alpha y tratadas luego con AGN 193109 a una concentración tan alta como 10^{-6} M mostraron niveles de expresión de luciferasa de solo aproximadamente 8.000 rlu. El hecho de que se obtuvo un mayor nivel de actividad de luciferasa en células que expresaban tanto ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16, incluso en presencia de AGN 193109 10^{-6} M, demostró la persistencia de una interacción entre los dos receptores recombinantes. La represión de la actividad de RAR-\gamma-VP-16 por AGN 193109 sugirió que la modulación de la interacción de NCP se puede codominar con la activación de VP-16. En consecuencia, se observa que puede ser posible modular la expresión de genes que no están regulados normalmente por retinoides de una manera dependiente de AGN 193109.
Los candidatos para genes regulables por AGN 193109 incluyen aquellos que son activados por complejos de factores de transcripción que constan de factores que no son RAR que se asocian o heterodimerizan con los RAR, en los que el factor que no sea RAR no requiere un agonista de RAR para la activación. Mientras la estimulación con un agonista de RAR puede no tener sustancialmente efecto sobre la expresión de tales genes, la administración con AGN 193109 puede promover la formación de complejos de transcripción inactivos que comprenden AGN 193109/RAR/NCP. Inversamente, la adición de la hormona negativa de retinoides AGN 193109 puede regular a la baja la transcripción de un gen de otro modo insensible a retinoides.
Este mismo mecanismo puede dar cuenta de la observación de que AGN 193109 puede reprimir la actividad del gen de transglutaminasa (TGasa) de los tejidos en células HL-60. Se ha identificado un elemento de respuesta a retinoides que consta de tres medios sitios de retinoides canónicos espaciados por 5 y 7 pares de bases en la región de control de transcripción de este gen. Aunque la TGasa puede ser inducida por agonistas selectivos de RXR, no es sensible a agonistas selectivos de RAR. El elemento de respuesta a retinoides TGasa está unido por un heterodímero RAR/RXR (Davies et al en Press). De forma interesante, AGN 193109 es capaz de reprimir la actividad de TGasa inducida por agonistas de RXR. Esta represión mediada por AGN 193109 puede explicar la capacidad de esta hormona negativa para secuestrar las NCP al componente RAR del heterodímero, reprimiendo de ese modo la actividad del RXR asociado.
También se han obtenido resultados que apoyan conclusiones idénticas a las presentadas bajo el Ejemplo 11 empleando constructos de expresión RAR-\gamma- VP-16 y el plásmido informador \DeltaMTV-TREp-Luc en vez de los constructos de expresión RAR-\gamma-VP-16 y ER-RXR-\alpha en combinación con el plásmido informador ERE-tk-Luc. Consistente con los resultados presentados anteriormente, se ha encontrado que la actividad de RAR-\gamma-VP-16 en el informador \DeltaMTV-TREp-Luc fue inhibida por AGN 193109. Por lo tanto, AGN 193109 reprimió la actividad de RAR-\gamma-VP-16 cuando este receptor quimérico estaba directamente unido a un elemento sensible al receptor de ácido retinoico en vez de indirectamente unido a un elemento sensible estrógeno en la región del promotor del plásmido informador. Estos hallazgos demuestran que un ensayo para identificar agentes que tienen actividad hormonal negativa no necesita estar limitado por el uso de un plásmido informador particular. En su lugar, la característica crítica realizada por un sistema experimental útil para identificar hormonas negativas de retinoides implica detectar la capacidad de un compuesto para reprimir la actividad de un RAR manipulado por ingeniería genética para que contenga un dominio de la activación de la transcripción constitutivo.
Generalmente, las hormonas negativas de retinoides se pueden identificar como el subconjunto de compuestos de retinoides que reprimen dentro de una célula transfectada el nivel basal de expresión de un gen informador que es sensible transcripcionalmente a la unión directa o indirecta mediante un receptor de retinoides o un receptor quimérico que incluye al menos los dominios del receptor de retinoides localizados en el terminal C al dominio de unión de ADN de ese receptor. Este enfoque se ha adaptado para un método de selección útil para identificar hormonas negativas de retinoides. El las diversas realizaciones del método de selección inventado, la estructura del receptor, para el cual se busca la hormona negativa, es variable. Más específicamente, el receptor de retinoides puede ser del subtipo RAR o del subtipo RXR. El receptor se puede manipular por ingeniería opcionalmente para incluir un dominio de activador de transcripción constitutivo. El receptor de retinoides usado para seleccionar hormonas negativas contiene opcionalmente un dominio de unión de ADN heterólogo como sustituto para el dominio de unión de ADN endógeno al receptor nativo. Sin embargo, cuando se usa un segundo receptor en el método de selección, y cuando el segundo receptor se puede dimerizar con el receptor de retinoides para el que se busca la hormona negativa, entonces ese receptor de retinoides puede no requerir un dominio de unión a ADN debido a que está enlazado a la región de control de transcripción del gen informador indirectamente a través de la dimerización con el segundo receptor que por sí mismo está unido a la región de control de transcripción.
En la práctica del método de selección, la capacidad de un compuesto para reprimir la expresión basal de un informador se mide típicamente en un ensayo in vitro. La expresión basal representa el nivel de línea base de expresión del informador en células transfectadas en condiciones en las que no hay agonista de retinoides exógenamente añadido. Opcionalmente, las etapas se pueden tomar para eliminar ligandos de retinoides endógenos del medio circundante de las células transfectadas vía procedimientos tales como extracción con carbón del suero que se usa para cultivar células in vitro.
Ejemplos de genes informadores útiles en relación con el método de selección incluyen aquellos que codifican luciferasa, \beta-galactosidasa, cloranfenicol-acetil-transferasa o antígenos de las superficies celulares que se pueden detectar por medios inmunoquímicos. En la práctica, no se espera que la naturaleza del gen informador sea crítica para la operabilidad del método. Sin embargo, la región reguladora transcripcional del constructo informador debe incluir uno o más elementos cis-reguladores que son dianas de factores de transcripción para los cuales se están buscando las hormonas negativas. Por ejemplo, si se desea identificar hormonas negativas de RAR, entonces la región reguladora transcripcional del constructo informador debería contener un elemento cis-regulador que se puede unir mediante una proteína que contiene RAR. En este ejemplo, debería haber correspondencia entre el dominio de unión de ADN del RAR y el elemento cis-regulador de la región reguladora transcripcional del constructo informador. De este modo, si se emplea en el método de selección un RAR quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo y un dominio de unión a ADN que se puede unir a elementos sensibles a estrógenos cis-reguladores, entonces la región reguladora transcripcional del constructo informador debe contener un elemento sensible a estrógenos.
Ejemplos de elementos cis-reguladores que se pueden unir directamente a receptores de retinoides (RARE) útiles en relación con el ensayo informador se describen por Mangelsdorf et al. en The Retinoid Receptors en The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2ª edición, eds. Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York (1994). Ejemplos de elementos cis-reguladores que se unen indirectamente a receptores quiméricos incluyen sitios de unión a ADN para cualquier proteína que se une a ADN para la que el dominio de unión a ADN de la proteína se puede incorporar en un receptor quimérico que consta de este dominio de unión a ADN pegado a un receptor de retinoides. Ejemplos específicos de dominios de unión a ADN heterólogos que se pueden manipular por ingeniería en receptores quiméricos, y que reconocerán elementos cis-reguladores heterólogos, incluyen aquellos que reconocen elementos sensibles a estrógenos. De este modo, la porción de receptor de retinoides de un receptor quimérico útil en relación con el método de selección no necesita contener el dominio de unión a ADN del receptor de retinoides sino debe contener al menos el dominio de unión a ligando del receptor de retinoides.
Un ejemplo adicional de receptor de retinoides indirecto que se une al elemento cis-regulador incluye el uso de una proteína que se puede unir al elemento cis- regulador y se puede dimerizar con un receptor de retinoide. En este caso, el receptor de retinoides se asocia con el elemento cis-regulador sólo por asociación con la proteína responsable de la unión a ADN. Un ejemplo de tal sistema incluiría el uso de una proteína de fusión que consta de un dominio de unión a ADN heterólogo fusionado con un RXR, que contiene al menos el dominio del RXR responsable de la dimerización con los RAR. Los RAR cointroducidos se pueden dimerizar con tal proteína de fusión unida al elemento cis-regulador. Se anticipa que cualquier proteína que se une al elemento cis-regulador, que se dimeriza con los RAR para dar como resultado una asociación indirecta del RAR con el elemento cis-regulador, también será adecuada para uso con el método de selección de la hormona negativa.
En una realización preferida del método de selección, las hormonas negativas de retinoides se identifican como aquellos retinoides que reprimen la expresión basal de un factor de transcripción de RAR manipulado por ingeniería que tiene actividad basal aumentada. Aunque no es esencial para el funcionamiento del método de selección, el RAR manipulado por ingeniería empleado en el siguiente ejemplo incluyó un dominio activador de la transcripción constitutivo. El uso de este receptor quimérico proporcionó ventajosamente un medio por el cual se pudo elevar la expresión basal de un gen informador en ausencia de cualquier retinoide. Aunque se ha empleado una transfección transitoria en los procedimientos descritos anteriormente, las estirpes celulares establemente transfectadas que expresan constitutivamente el receptor quimérico también serían útiles en relación con el método de selección.
Como se describe en el siguiente Ejemplo, un receptor de retinoides quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo fue heterodimerizable con un segundo receptor manipulado por ingeniería para que contenga un dominio de unión a ADN específico para un elemento cis-regulador sensible a estrógenos. En este caso, el receptor de retinoides quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo se asocia con la región cis-reguladora que controla la expresión del gen informador indirectamente vía la unión a un segundo receptor que se une a una secuencia diana de ADN. Más particularmente, el segundo receptor se manipuló por ingeniería para que contenga un dominio de unión a ADN que reconociera un elemento sensible a estrógenos. Ventajosamente, el gen informador que tiene un elemento sensible a estrógenos en la región promotora aguas arriba fue insensible a los agonistas de retinoides en ausencia del receptor quimérico transfectado que tiene el dominio activador de la transcripción constitutivo. En consecuencia, toda la actividad del gen informador se atribuyó a los receptores transfectados. El uso combinado del dominio de unión a ADN del elemento sensible a estrógenos y del elemento cis-regulador del elemento sensible a estrógenos está destinado a ser ilustrativo solamente. Los expertos normales en la técnica sabrán que también son útiles otras combinaciones de receptores manipulados por ingeniería que tienen especificidad por elementos cis- reguladores no RARE, en la práctica del método de selección de la invención.
Las células útiles en relación con el método de selección serán células eucariotas que se pueden transfectar. Las células pueden ser células animales, tales como células humanas, de primates o de roedores. Se han logrado muy buenos resultados usando células CV-1, pero es de esperar razonablemente que también se puedan usar con éxito otras estirpes celulares cultivadas. Se puede usar cualquier número de métodos de transfección convencionales conocidos en la técnica para introducir un constructo de expresión que codifica el receptor de retinoides quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo.
El dominio activador de transcripción constitutivo constará de una pluralidad de aminoácidos que probablemente tendrán un carácter global ácido según se representa por una carga negativa en condiciones de pH neutro. Por ejemplo, el dominio activador de transcripción constitutivo puede tener una secuencia de aminoácidos que también se encuentra en factores de transcripción víricos. Un ejemplo de un factor de transcripción vírico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo es el virus 16 del herpes simple. Sin embargo, también serían útiles otros dominios activadores de transcripción víricos o sintéticos en la construcción de constructos de expresión que codifican el receptor de retinoides quimérico que tiene un dominio activador de transcripción constitutivo.
Como se describe a continuación, se ha desarrollado un método de selección generalizado útil para identificar hormonas negativas de retinoides. Este método de selección proporciona un medio para distinguir antagonistas simples de hormonas negativas. La Tabla 12 enumera varios compuestos de retinoides que muestran afinidad potente por 
\hbox{RAR- \gamma }
que, con la excepción de ATRA, no transactiva este receptor en un ensayo de transactivación por cotransfección transitoria. Por lo tanto, se ha analizado estos compuestos para determinar cuales eran antagonistas de RAR-\gamma y cuales, si los hay, de estos antagonistas mostraron actividad hormonal negativa.
El Ejemplo 12 describe el método usado para identificar compuestos de retinoides que fueron antagonistas, y el subconjunto de antagonistas que mostraron actividad hormonal negativa.
Ejemplo 12 Ejemplo para buscar hormonas negativas de retinoides
Se transfectaron 4 x 10^{4} células CV-1 mediante el procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) usando 0,5 \mug de plásmido informador ERE-tk-Luc y 0,1 \mug de plásmido de expresión quimérico ER-RAR-\gamma (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)). Tras 18 horas, las células se enjuagaron con PBS y se alimentaron con DMEM (Gibco-BRL) que contiene 10% de FBS (Gemini Bio-Products) extraído con carbón activado. Las células se trataron con ATRA 10^{-8} M en etanol o en etanol sólo. Además, las células tratadas con ATRA se trataron con 10^{-9}, 10^{-8}, 10^{-7} ó 10^{-6} M de los compuestos enumerados en la Tabla 12. Tras 18 horas, las células se enjuagaron con PBS y se lisaron en KPO_{4} 0,1 M (pH 7,8), TRITON X-100 al 1,0%, DTT 1,0 mM, EDTA 2 mM. Las actividades de luciferasa se midieron como se describe por deWet et al. en Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987).
TABLA 12
Compuesto Kd (nM) @ RAR-\gamma^{a} EC50 (nM) @ RAR-\gamma^{b}
ATRA 12 17
AGN 193109 (Compuesto 60) 6 na
AGN 193174 (Compuesto 34a) 52 na
AGN 193199 30 na
AGN 193385 (Compuesto 23) 25 na
AGN 193389 (Compuesto 25) 13 na
AGN 193840 40 na
AGN 193871 (Compuesto 50) 30 na
^{a} Afinidad relativa (Kd) determinada por competición de la unión de ^{3}H-ATRA a RAR-\gamma
expresado en baculovirus, y aplicación de la ecuación de Cheng-Prussof
^{b} EC_{50} medida en células CV-1 cotransfectadas transitoriamente con \DeltaMTV-TREp-Luc
y RS-RAR-\gamma. "na" representa nada de actividad
Como se indica por los resultados presentados en parte en la Figura 7 y en la Tabla 12, con la excepción de ATRA, todos los otros compuestos enumerados en la Tabla 12 fueron antagonistas de retinoides en RAR-\gamma.
Los antagonistas de RAR-\gamma identificados en la Tabla 12 se seleccionaron seguidamente para determinar cuales, si los hay, también fueron hormonas negativas de retinoides. Se transfectaron 4 x 10^{4} células CV-1 según el procedimiento con fosfato de calcio descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) usando 0,5 \mug de plásmido informador ERE-tk- Luc y 0,1 \mug de plásmido de expresión quimérico ER-RAR-\gamma (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)) y 0,2 \mug RAR-\gamma-VP-16 (Nagpal et al. EMBO J. 12:2349 (1993)). Tras 18 horas, las células se enjuagaron con PBS y se alimentaron con DMEM (Gibco-BRL) que contiene 10% de FBS (Gemini Bio-Products) extraído con carbón activado. Las células se trataron con 10^{-9}, 10^{-8}, 10^{-7} ó 10^{-6} M de cada uno de los compuestos enumerados en la Tabla 12. El tratamiento con sólo vehículo etanólico sirvió como el control negativo. Tras 18 horas, las células se enjuagaron en PBS y se lisaron en KPO_{4} 0,1 M (pH 7,8), TRITON X-100 al 1%, DTT 1,0 mM, EDTA 2 mM. Las actividades de luciferasa se midieron como antes mediante deWet at al. in Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987).
Como se muestra en la Figura 8, los antagonistas de retinoides de la Tabla 12 se pudieron separar en dos clases en virtud de su efecto sobre la función de activación de transcripción constitutiva del receptor de retinoides quimérico RAR-\gamma-VP- 16. Un grupo, que incluyó AGN 193174, AGN 193199 y AGN 193840, no reprimió la actividad de RAR-\gamma-VP-16 incluso aunque hubo antagonistas de ATRA. Por contra, AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 y AGN 193871 mostraron una represión dependiente de la dosis de la actividad constitutiva de RAR-\gamma-VP-16. Por lo tanto, mientras que los compuestos de ambos grupos fueron antagonistas de RAR-\gamma, sólo aquellos del segundo grupo mostraron actividad hormonal negativa. Este ensayo distinguió ventajosamente las hormonas negativas de retinoides de los antagonistas simples de retinoides.
Los anteriores resultados experimentales demostraron que AGN 193109 cumplió los criterios que definen una hormona negativa. Más específicamente, los resultados presentados en el Ejemplo 11 demostraron que AGN 193109 tuvo la capacidad de ejercer actividad inhibidora en los RAR incluso en ausencia de ligandos de retinoides añadidos exógenamente. Como tal, este compuesto poseyó actividades biológicas que no dependieron del bloqueo de la interacción entre los RAR y los agonistas tales como ATRA y AGN 191183. Estos hallazgos condujeron a la conclusión de que AGN 193109 estabilizó las interacciones entre los RAR y las NCP. Como se muestra en el diagrama en la Figura 9, las interacciones NCP/RAR/PCP existen en un estado de equilibrio. Un agonista sirve para aumentar las interacciones de PCP y disminuir las interacciones de NCP, mientras que un agonista inverso o una hormona negativa estabiliza las interacciones de NCP y disminuyen las interacciones de PCP. Como se ha indicado previamente, los resultados experimentales sugieren que la disponibilidad intracelular de NCP para otros receptores se puede modular mediante la administración de AGN 193109. Más específicamente, se ha descubierto que AGN 193109 puede promover el complejamente de NCP con los RAR, reduciendo de ese modo el depósito intracelular de NCP disponible para la interacción con factores de transcripción distintos de los RAR.
Seguidamente se examinó el efecto de AGN 193109 sobre la inhibición mediada por agonistas de la expresión génica dependiente de AP-1. En Endocr. Rev. 14:651 (1993), Pfhal describe que los agonistas de retinoides pueden regular a la baja la expresión génica. En Endocr. Rev. 14:651 (1993), Pfhal describe que los agonistas de retinoides pueden regular a la baja la expresión génica mediante un mecanismo que implica la inhibición de la actividad de AP-1. Se postula que AGN 193109 podría tener cualquiera de los dos efectos cuando se usa en combinación con un agonista de retinoides en un sistema modelo diseñado para medir la actividad de AP-1. Primeramente AGN 193109 podría haber antagonizado el efecto del agonista, aliviando de ese modo la inhibición dependiente de agonistas de la actividad de AP-1. Como alternativa, AGN 193109 podría haber potenciado la actividad del agonista, exagerando de ese modo la inhibición dependiente de agonistas de la actividad de AP-1.
El ejemplo 13 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de un agonista de retinoides. Como se describe más abajo, el agonista de retinoides AGN 191183 inhibió débilmente la expresión génica dependiente de AP-1. La combinación de AGN 193109 y del agonista de retinoides inhibió fuertemente la expresión génica dependiente de AP-1. Por sí mismo, AGN 193109 no tuvo sustancialmente ninguna actividad anti-AP-1.
Ejemplo 13 AGN 193109 potencia la actividad anti-AP-1 de un agonista de retinoides
Se transfectaron células HeLa con 1 \mug del constructo de gen informador Str-AP1-CAT y 0,2 \mug de plásmido prs-hRAR\alpha, descrito por Giguere et al. en Nature 33:624 (1987), usando LIPOFECTAMINA (Life Technologies, Inc.). El Str-AP1-CAT se preparó clonando un fragmento de ADN que corresponde a las posiciones -84 a +1 del promotor de estromelisina-1 de rata (Matrisian et al., Mol. Cell. Biol. 6:1679 (1986) entre los sitios HindIII-BamHI de pBLCAT3 (Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15:5490 (1987)). Esta secuencia del promotor de estromelisina-1 contiene un motivo AP1 como el único elemento potenciador (Nicholson et al., EMBO J 9:4443 (1990). La secuencia del promotor se preparó hibridando dos oligonucleótidos sintéticos que tienen las secuencias:
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Los procedimientos que implican la transfección, el tratamiento con compuestos apropiados y la medida de la actividad de CAT se llevaron a cabo como se describe por Nagpal at al. en J. Biol. Chem. 270:923 (1995).
Los resultados de estos procedimientos indicaron que AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 del agonista de retinoides AGN 191183. Más específicamente, en el intervalo de concentración de 10^{-12} a 10^{-10} M, AGN 191183 no inhibió la expresión de Str-AP1-CAT inducida por TPA. El tratamiento con AGN 193109 en el intervalo de concentración de 10^{-10} a 10^{-8} M no inhibió sustancialmente la actividad del informador mediada por AP-1. Sin embargo, los resultados presentados en la Figura 10 indicaron que la estimulación de los agentes transfectantes con la combinación de AGN 193109 (10^{-8} M) y AGN 191183 en el intervalo de concentración de 10^{-12} a 10^{-10} M inhibió sustancialmente la expresión de Str-AP1-CAT inducida por TPA en una cantidad de 12% a 21%. Por lo tanto, AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de AGN 191183 en condiciones en las que este agonista de retinoides normalmente no inhibe la actividad de AP-1.
Se razonó que AGN 193109 potenció la expresión mediada por agonistas de la actividad de AP-1 mediante un mecanismo que probablemente implicó el secuestro dependiente de AGN 193109 de las NCP en los RAR. Los RAR pertenecen a una superfamilia de receptores nucleares que también incluyen receptores de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, glucocorticoides, hormona del tiroides, estrógeno y progesterona. Era una suposición razonable que la capacidad para unir a los NCP se pueda compartir entre diferentes miembros de la superfamilia de receptores nucleares. Esto condujo a especular que AGN 193109 podría potenciar la actividad anti-AP-1 de uno o más de los ligandos que interaccionan con esta superfamilia de receptores nucleares.
Los resultados presentados en el Ejemplo anterior indicaron claramente que AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de un agonista de retinoides. Más específicamente, AGN 193109 redujo la dosis umbral a la que se podría detectar la actividad anti-AP-1 de AGN 191183. Puesto que AGN 193109 no tiene sustancialmente actividad anti-AP-1 por sí misma, su efecto sobre los agonistas de receptores nucleares fue sinérgico. También se encontró que la hormona negativa AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, el ligando natural para el receptor de la vitamina D_{3}.
La sinergia observada entre AGN 193109 y AGN 191193 en el Ejemplo precedente implicó necesariamente que la actividad anti-AP-1 del agonista de retinoides y la potenciación mediada por AGN 193109 de esa actividad deben resultar de diferentes mecanismos. Si los mecanismos de acción de los dos agentes fuera idéntico, entonces se concluye que la eficacia de la combinación de AGN 193109 y del agonista debería haber sido aditiva. En su lugar, se mostró que la combinación era más efectiva que cualquiera de los agentes solos, un efecto que no se habría podido predecir con anterioridad a este hallazgo.
De forma significativa, la potenciación mediada por AGN 193109 del agonista de RAR se realizó usando un exceso molar de aproximadamente 100 veces de AGN 193109 sobre el del agonista de retinoides. En consecuencia, la mayoría de los RAR deberían haber estado unidos por AGN 193109 dejando muy pocos RAR disponibles para la unión con el agonista. A pesar de este hecho, la población de los RAR que no estaba unida por AGN 193109 fue capaz de unirse al agonista de retinoides y estimular vigorosamente una respuesta dependiente de agonistas medible como una inhibición de la expresión del gen informador. De este modo, los datos sugieren una posible heterogeneidad de los RAR que son inducidos por AGN 193109.
La actividad hormonal negativa de AGN 193109, atribuida a su capacidad para promover la interacción de los RAR y las NCP, proporcionó una base para comprender la sinergia entre AGN 193109 y los agonistas de retinoides. Los resultados fueron completamente consistentes con un modelo en el que el tratamiento con AGN 193109 de células promovió la unión de los RAR y las NCP, reduciendo de ese modo el número de NCP libres y RAR libres dentro de la célula. Esto da como resultado la generación de dos poblaciones del RAR que son funcionalmente distintos. La primera población está representada por los RAR asociados con las NCP. Tales complejos AGN 193109/RAR/NCP no se pueden activar por agonistas de retinoides. La segunda población consta de los RAR que no están unidos por NCP, y que permanecen disponibles para la interacción con los agonistas. Esta última población se designa "RAR*" para indicar los RAR libres en un medio ambiente sustancialmente agotado de NCP.
Los RAR* tienen menores probabilidades de asociación con NCP a través de una unión de equilibrio, y tienen una mayor sensibilidad por agonistas de retinoides medible, por ejemplo, como actividad anti-AP-1. Esto es así debido a que, aunque el depósito intracelular de NCP está agotado en virtud de la administración de AGN 193109, el depósito de PCP no se ha agotado. En consecuencia, los RAR* libres se pueden unir a agonistas de retinoides e interaccionar con los factores de PCP en un medio sustancialmente agotado de NCP. La capacidad de AGN 193109 para aumentar la sensibilidad de otros receptores nucleares por sus agonistas respectivos se puede atribuir a la capacidad de estos receptores nucleares diferentes para interaccionar con las mismas NCP que interaccionan con los complejos AGN 193109/RAR. Este modelo de modulación mediada por AGN 193109 de disponibilidad de NCP para los miembros de la familia de receptores nucleares se representa esquemáticamente en la Figura 11.
Este modelo mecanístico condujo a predecir que AGN 193109 podría modular las actividades de ligandos de receptores nucleares distintos de los agonistas de retinoides. Como se ilustra en el siguiente Ejemplo, se confirmó que AGN 193109 potenció la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} en un ensayo de transactivación in vitro.
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El Ejemplo 14 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 potenció la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} en un ensayo de transactivación.
Ejemplo 14 AGN 193109 potencia la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}
Se transfectaron células HeLa usando el procedimiento de transfección mediado por liposomas catiónicos descrito por Felgner et al. en Procedimiento. Natl. Acad. Sci: USA 84:7413 (1987). Se sembraron 5 x 10^{4} células en placas de múltiples pocillos de 12 pocillos, y se hicieron crecer en DMEM suplementado con FBS al 10%. Las células se cotransfectaron en un medio libre de suero usando 2 \mug/pocillo de reactivo LIPOFECTAMINA (Life Technologies, Inc.) con 0,7 \mug del plásmido informador MTV-VDRE-Luc, que contiene dos copias del elemento sensible a 1,25- dihidroxivitamina D_{3} 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3' (SEQ ID NO:4) a partir del gen de osteopontina de ratón (Ferrara et al. J. Biol. Chem. 269:2971 (1994)) ligado al plásmido informador \DeltaMTV-Luc (Heyman et al. en Cell: 397 (1992)), y 0,3 \mug del plásmido pGEM3Z (Pharmacia, Inc.) como ADN soporte hasta llevar a la concentración final de ADN a 1,0 \mug por pocillo. Tras seis horas de transfección, las células se alimentaron con medio de crecimiento que contiene FBS extraído con carbón a una concentración final de 10%. Dieciocho horas tras la transfección, las células se trataron con vehículo sólo (etanol) o AGN 193109 en etanol a una concentración final de 10^{-8} ó 10^{-7} M. Seis horas más tarde se añadió 1,25-dihidroxivitamina D_{3} en etanol hasta una concentración final de 10^{-10} a 10^{-7} M. Las células se lisaron y se cosecharon dieciocho horas tras el tratamiento con 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. La actividad de luciferasa se midió como se describe anteriormente. Este sistema experimental permitió un método conveniente de monitorizar y cuantificar la expresión génica dependiente de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}.
Los resultados presentados en la Figura 12 indicaron que, cuando se comparan con el resultado obtenido usando 1,25-dihidroxivitamina D_{3} sola, AGN 193109 coadministrada con 1,25-dihidroxivitamina D_{3} desplazó la curva de respuesta a la dosis hacia la izquierda. Esto confirmó que AGN 193109 potenció la eficacia de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} en el ensayo de transactivación in vitro. Más específicamente, la Figura 12 ilustra gráficamente que una concentración de AGN 193109 tan baja como 10-100 nM hizo a la 1,25-dihidroxivitamina D_{3} aproximadamente unas 10 veces más activa. Aunque se requirió una concentración de 10^{-8} de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} para producir una expresión de luciferasa de aproximadamente 2.000 rlu, sólo se requirió como mucho una décima parte de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} para producir la misma producción de luciferasa cuando la vitamina se coadministró con AGN 193109 a una concentración de 10^{-8}-10^{-7} M. Aunque no se muestra en la gráfica en la Figura 12, se obtuvieron resultados sustancialmente idénticos usando concentraciones de AGN 193109 de 10^{-9} M y 10^{-8} M. De este modo, la coadministración con AGN 193109 redujo sustancialmente la cantidad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} que se requirió para producir un efecto similar en ausencia de la hormona negativa.
De forma interesante, cuando se repitió el procedimiento anterior con la cotransfección de un plásmido del receptor de vitamina D (VDR), hubo una disminución coincidente en la capacidad de AGN 193109 para potenciar la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. Este resultado se interpreta como que la sobreexpresión de los VDR podría afectar a la capacidad de AGN 193109 para potenciar la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. De este modo, la concentración intracelular de un receptor de ligando, que puede diferir de una manera específica para los tejidos, puede influir la capacidad de AGN 193109 para potenciar la actividad de un ligando que se une al receptor. Esto, nuevamente, fue consistente con un modelo en el que las NCP valorables contribuyeron a la regulación de la respuesta de vitamina D_{3}, y apoyó el modelo expuesto anteriormente.
Como se ilustra en el siguiente Ejemplo, también se confirmó que AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. El modelo para la actividad de la acción de AGN 193109 explica esta observación invocando que las NCP se asocian ávidamente con los RAR en presencia de este fármaco. Los receptores de vitamina D endógenos presentes en las células HeLa se hicieron igualmente más sensibles al ligando de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}, con la consecuencia de exagerar la capacidad del ligando para inhibir la expresión del informador Str-AP1-CAT.
El ejemplo 15 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 potenció la actividad anti-AP-1 de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}.
Ejemplo 15 AGN 193109 potencia la actividad anti-AP-1 de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}
Se transfectaron célula HeLa con 1 \mug de Str-AP1-CAT usando LIPOFECTAMINE según el método descrito por Nagpal et al. In J. Biol. Chem. 270:923 (1995). Las células transfectadas se trataron con AGN 193109 sólo (10^{-9} a 10^{-7} M), 1,25-dihidroxivitamina D_{3} sola (10^{-12} a 10^{-7} M), o 1,25-dihidroxivitamina D_{3} (10^{-12} a 10^{-7} M) en presencia de AGN 193109 10^{-8} M.
Los resultados de estos procedimientos indicaron que AGN 193109 potenció la capacidad de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} para inhibir la actividad de AP-1 inducida por TPA. Cuando se usa sola en el intervalo de concentración de 10^{-9} a 10^{-7} M, AGN 193109 no tiene actividad anti-AP-1 detectable. Los resultados presentados en la Figura 13 indicaron que la 1,25-dihidroxivitamina D_{3} reprimió la actividad estimulada por TPA sólo en el intervalo de concentración de 10^{-8} y 10^{-7} M. El análisis de la represión mediada por 1,25-dihidroxivitamina D_{3} de la actividad de CAT estimulada por TPA en presencia de AGN 193109 10^{-8} M indicó que la actividad anti-AP-1 fue detectable a 10^{-10} y 10^{-9} M de 1,25-dihidroxivitamina D_{3} y un incremento en la actividad a las dosis de 10^{-8} y 10^{-7} M comparada con el tratamiento 1,25-dihidroxivitamina D_{3} sólo. Esta modulación dependiente de AGN 193109 de la actividad anti-AP-1 mediada por 1,25-dihidroxivitamina D_{3} fue consistente con un modelo en el que el secuestro de NCP por los RAR hace que la NCP no esté disponible para la interacción con otros miembros de la familia de receptores nucleares. En consecuencia, los receptores se hicieron más sensibles al tratamiento de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}.
Los mecanismos que subyacen a la transactivación mediada por RAR y a la actividad anti-AP-1 son probablemente diferentes. Esta conclusión se basa en la observación de que dosis elevadas de AGN 193109 inhibieron completamente la transactivación sin inhibir sustancialmente la actividad anti-AP-1. Por lo tanto, se deseó ganar evidencia adicional para apoyar el modelo para la formación de RAR* mediada por el tratamiento de AGN 193109. Para lograr esto, se ha investigado si AGN 193109 podría potenciar la actividad del agonista específico de RAR AGN 191183 en un ensayo de transactivación in vitro.
El ejemplo 16 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 potenció la actividad del agonista específico de RAR, AGN 191183. Los resultados de este procedimiento indicaron que, en circunstancias particulares, AGN 193109 potenció la potencia del retinoide específico de RAR, y proporcionó una fuerte evidencia de que AGN 193109 promovió la formación de RAR*.
Ejemplo 16 Potenciación de la eficacia del retinoide mediante la coadministración de AGN 193109
Se transfectaron células HeLa usando el procedimiento de transfección mediada por liposomas catiónicos descritos por Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). Se cosecharon 5 x 10^{4} células en placas multipocillos de 12 pocillos, y se hicieron crecer en DMEM suplementado con FBS al 10%. Las células se cotransfectaron en un medio libre de suero usando el reactivo de LIPOFECTAMINE (2 \mug/pocillo, Life Technologies, Inc.) con 0,7 \mug del plásmido informador MTV-ThEp-Luc, que contiene dos copias del elemento sensible a TREpal 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (SEQ ID NO:5) insertado en el plásmido informador \DeltaMTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68:397 (1992), y 0,1 \mug el plásmido de expresión de RAR-\gamma pRShRAR-\gamma (Ishikawa et al. Mol. Endocrinol.4:837 (1990)). Después de seis horas de transfección, las células se alimentaron con medio de crecimiento que contiene FBS extraído con carbón a una concentración final de 10%. Dieciocho horas después de la transfección, las células se trataron con vehículo sólo (etanol) o AGN 193109 en etanol a una concentración final de 10^{-11} a 10^{-8} M. Seis horas más tarde, se añadió AGN 191183 en etanol hasta una concentración final de 0, 10^{-10} o 10^{-9} M. Las células se cosecharon después de dieciocho horas de tratamiento con AGN 191183, y se midió la actividad de luciferasa como se describe anteriormente.
Los experimentos preliminares indicaron que AGN 193109 10^{-9} M fue relativamente inefectiva inhibiendo la respuesta de AGN 191183 10^{-9} M en células HeLa. Esto contrastó con la capacidad de AGN 193109 10^{-9} M para inhibir ATRA 10^{-8} M en células CV-1 (Figura 2).
Los resultados presentados en la Figura 14 apoyaron la predicción de que AGN 193109 estimula la formación de RAR*. Consistente con la caracterización de las actividades de antagonista y de hormona negativa de AGN 193109, el tratamiento con AGN 193109 dio como resultado una actividad de respuesta a la dosis bifásica. Las dosis más bajas de AGN 193109 (10^{-11} y 10^{-10} M) dieron como resultado una estimulación de la actividad de luciferasa sobre la de AGN 191183 sola. Este efecto sugiere que los RAR* sean generados por AGN 193109. Curiosamente, esto también se observó para el tratamiento de AGN 193109 sólo, sugiriendo que los RAR* pueden responder a un ligando endógeno. AGN 191183 es un agonista de retinoides sintético y, al igual que ATRA, activa la transcripción a través de los RAR. La sustitución de AGN 191183 por ATRA en el Ejemplo 7 daría resultados cualitativamente similares (es decir, AGN 193109 antagonizaría el efecto de AGN 191183 10 nM). El Ejemplo 16 ilustra que, mientras AGN 193109 puede funcionar como un antagonista de agonistas de RAR, se podrían identificar fácilmente las condiciones de dosificación en las que la coadminsitración de AGN 193109 potenciara la activación mediada por un agonista de RAR. Es importante observar que las dosis de los compuestos usados en el Ejemplo 16 son sustancialmente menores que las dosis empleadas en el procedimiento descrito en el Ejemplo 7. Se propone que el tratamiento con AGN 193109 podría conducir a la heterogeneidad de RAR de los RAR frente a los RAR*. La aparente heterogeneidad (es decir, capacidad para potenciar) parece tener diferentes ventanas en la transactivación frente a la represión de AP-1. La razón de que las curvas sean bifásicas es debido a que, con cantidades crecientes de AGN 193109, hay proporcionalmente menos RAR disponible para unirse al agonista. Esto no parece ser el caso para la represión de AP-1, y cabe especular que esta diferencia dispone reflejar dos mecanismos distintos para la transactivación y represión de AP-1 por la misma especie de receptor.
Los resultados clínicos han confirmado que algunos retinoides son útiles para inhibir el crecimiento de lesiones cervicales premalignas y malignas. Estudios ejemplares que apoyan esta conclusión se han publicado por Graham et al. en West. J. Med. 145:192 (1986), por Lippman et al. en J. Natl. Cancer Inst. 84:241 (1992), y por Weiner et al. en Invest. New Drugs 4:241 (1986).
Conclusiones similares son apoyadas por los resultados de estudios in vitro que usaron células cultivadas para cuantificar los efectos antiproliferativos de diversos retinoides. Más específicamente, Agarwal et al. en Cancer Res. 51:3982 (1991) empleó la estirpe celular ECE16-1 para hacer un modelo de las etapas tempranas de la displasia cervical, y demostraron que el ácido retinoico puede inhibir la proliferación celular dependiente del factor de crecimiento epidérmico (EGF).
El Ejemplo 17 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 puede antagonizar la actividad del agonista de retinoides AGN 191183 que inhibió la proliferación de la estirpe celular ECE16-1.
Ejemplo 17 AGN 193109 antagoniza el efecto antiproliferativo de retinoides en células ECE16-1
Se sembraron células ECE16-1 a una densidad de 1 x 10^{4} células por cm^{3} en un medio completo que contiene DMEM:F12 (3:1), aminoácidos no esenciales, FBS al 5%, 5 \mug/ml de transferrina, 2 nM de 3,3',5-triyodotiroidina (hormona del tiroide o "T_{3}"), 0,1 nM de toxina del cólera, 2 mM de L-glutamina, 1,8 x 10^{-4} M de adenina y 10 ng/ml de EGF. Las células se dejaron que se pegaran a las placas toda la noche y luego se desplazaron a un medio definido que contiene DMEM:F12 (3:1), 2 mM de L-glutamina, aminoácidos no esenciales, albúmina de suero bovino al 0,1%, 1,8 x 10^{-4} M de adenina, 5 \mug/ml de transferrina, 2 nM de T_{3}, 50 \mug/ml de ácido ascórbico, 100 \mug/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de gentamicina. Un medio definido (DM) se suplementó con 10 ng/ml de EGF. Las células tratadas con EGF recibieron 10 nM del antagonista de retinoides AGN 191183 en combinación con 0, 0,1, 1,0, 10, 100 o 1000 nM de AGN 193109 o 1000 nM de AGN 193109 solo. Después de tres días de tratamiento, las células se cosecharon como se describe por Hembree et al. en Cancer Res. 54:3160 (1994), y se determinó el número de células usando el contador COULTER.
Los resultados presentados en la Figura 15 demostraron que las células ECE16-1 proliferaron en respuesta a EGF pero no en el medio definido sólo. Esto confirmó los hallazgos publicados por Andreatta-van Leyen et al. en J. Cell. Physio. 160:265 (1994) y por Hembree et al. en Cancer Res. 54:3160 (1994). La adición de 10 nM de AGN 191183 y 0 nM de AGN 193109 inhibió completamente la proliferación mediada por EGF. De este modo, AGN 191183 fue un retinoide antiproliferativo potente. Aumentando la concentración de AGN 193109 de 0 nM a 10 nM se antagonizó la inhibición del crecimiento mediada por AGN 191183 en aproximadamente un 50%. Un exceso molar de 10 veces de AGN 193109 invirtió completamente el efecto antiproliferativo de AGN 191183. El tratamiento de las células con 1000 nM de AGN 193109 solo no tuvo efecto sobre el aumento de la proliferación mediada por EGF. Estos resultados demostraron que AGN 193109 antagonizó el efecto antiproliferativo de un retinoide pero no tuvo sustancialmente actividad antiproliferativa por sí mismo cuando se usó para tratar células que representan al epitelio cervical que es sensible a inhibición del crecimiento por retinoides tales como AGN 191183. Notablemente, no hubo evidencia de que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa del agonista AGN 191183 usando el sistema del modelo 
\hbox{ECE16-1.}
Contrariamente al sistema del modelo representado por la estirpe celular ECE16-1, hay otros ejemplos en los que la proliferación celular asociada con la displasia cervical no se puede inhibir por agonistas de retinoides. Por ejemplo, Agarwal et al. en Cancer Res. 54:2108 (1994) describe el uso de células CaSki como un modelo para tumores cervicales que son insensibles a la terapia con retinoides. Como se describe más abajo, en vez de inhibir la proliferación celular, el tratamiento con retinoides no tiene sustancialmente ningún efecto sobre la velocidad del crecimiento de las células CaSki. El siguiente ejemplo señala en efecto de la hormona negativa AGN 193109 sobre la velocidad de proliferación de esta estirpe celular. Los resultados demostraron inesperadamente que AGN 193109 puede inhibir la proliferación de células tumorales cervicales que son insensibles a los efectos antiproliferativos de agonistas de retinoides.
El Ejemplo 18 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 inhibió el crecimiento de una estirpe celular de tumor cervical que no respondió a los efectos antiproliferativos de otros retinoides tales como AGN 191183. De forma significativa, AGN 193109 desempeñó actividad antiproliferativa en ausencia de retinoides añadidos.
Ejemplo 18 AGN 193109 inhibe la velocidad de proliferación de la estirpe celular CaSki derivada de carcinoma cervical
Se analizó el efecto de EGF sobre la proliferación de células CaSki, bien solo o en combinación con un agonista de retinoides AGN 191183 y/o la hormona negativa AGN 193109 a una concentración de 10^{-6} M. Los ensayos de proliferación celular e realizaron como se describe anteriormente para estudios que implican células ECE16-1. El EGF se añadió a cultivos tratados con retinoides para dar una concentración final de 20 ng/ml. Las células se trataron con AGN 191183 (10^{-10} a 10^{-6} M), en presencia o en ausencia de AGN 193109 10^{-6} M, durante un total de tres días. Los medios se sustituyeron con medios recientes, y cada uno de los dos compuestos de retinoides, según sea apropiado, cada día. El número de células se determinó usando el contador COULTER como se describe anteriormente.
Los resultados presentados en la Figura 16 indicaron que las células CaSki fueron sustancialmente refractables a los efectos de un agonista de retinoides, y que AGN 193109 mostró actividad antiproliferativa en ausencia de retinoide añadido. La presencia de EGF en el medio de cultivo estimuló el crecimiento de las células CaSki. Esta conclusión se basa en la comparación de la barra rayada que representa nada de AGN 191183 y la barra en blanco que representa medio de crecimiento definido ("DM") solo. El tratamiento por AGN 191183 no tuvo actividad antiproliferativa sobre la estirpe de células tumorales CaSki. Se descontó cualquier ligero incremento en la velocidad de proliferación celular asociado con el agonista de retinoides, debido a que un incremento de unas diez mil veces en la concentración de agonista de retinoides se asoció con sólo apenas un incremento de 20% en la velocidad de proliferación. De este modo, el agonista AGN 191183 no tuvo sustancialmente ningún efecto sobre la velocidad de proliferación de las células CaSki.
Los resultados presentados en la Figura 16 también indicaron que AGN 193109 inhibió la proliferación de la estirpe celular epitelial cervical CaSki. Esta conclusión se basó en la comparación de las medidas que aparecen como el "0" de la barra negra de AGN 191183 y el "0" de la barra rayada de AGN 191183. De este modo, AGN 193109 fue capaz de estimular una respuesta biológica en ausencia de agonista de retinoides añadido cuando se usa para tratar células de tumores cervicales cuyo crecimiento no fue inhibido por agonistas de retinoides tales como AGN 191183.
El descubrimiento de la hormona negativa AGN 193109 pudo inhibir la proliferación celular fue consistente con un modelo en el que RAR no ligado mediara la expresión de genes que fueron requeridos para la proliferación. Mientras un agonista de RAR tal como AGN 191183 no tuvo sustancialmente ningún efecto, o quizás promovió ligeramente la proliferación celular, la AGN 193109 tuvo un efecto antiproliferativo. La hormona negativa AGN 193109 apenas se unió a los RAR promoviendo de este modo la asociación de las NCP y provocando que los RAR adopten una conformación inactiva. Según el modelo, esto reprimió la actividad génica que fue regulada positivamente por los RAR no ligados. Esta capacidad de AGN 193109 para regular a la baja la actividad de los RAR no ligados probablemente resultó de su capacidad para promover la asociación de los RAR y NCP.
Aquellos expertos normales en la técnica apreciaron que algunos agonistas de retinoides son útiles para controlar las consecuencias indeseables del crecimiento celular que sigue al desprendimiento de retina. Después del desprendimiento de retina, el epitelio del pigmento de la retina (RPE) se desdiferencia, prolifera y migra al espacio subretinal. Este proceso puede impactar negativamente un acontecimiento de procedimientos quirúrgicos dirigidos a volver a pegar al retina. Campochiaro et al. en Invest. Opthal & vis. Sci. 32:65 (1991) ha demostrado que los agonistas de RAR tales como ATRA mostraron un efecto antiproliferativo sobre el crecimiento de cultivos de RPE humano primario. Los agonistas de retinoides también han demostrado que disminuyen la incidencia de desprendimiento de retina la cirugía de reprendimiento de la retina (Fekrat et al. Opthalmology 102:412 (1994)). Como se describe en el siguiente ejemplo, se analizó la capacidad de la hormona negativa AGN 193109 para suprimir el crecimiento en cultivos de RPE humano primario.
El Ejemplo 19 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 potenció el efecto antiproliferativo y antagonista de retinoides en un cultivo primario de epitelio de pigmento retínico humano.
Ejemplo 19 AGN 193109 potencia la actividad antiproliferativa de ATRA
Se establecieron cultivos primarios de epitelio de pigmento retínico humano (RPE) según el método descrito por Campochiaro et al. en Invest. Opthal. & vis. Sci. 32:65 (1991). Se colocaron 5 x 10^{4} células en pocillos de 16 mm de placas multipocillos con 24 pocillos en DMEM (Gibco) que contiene FBS al 5%. Las células se trataron con vehículo etanol sólo, ATRA (10^{-10} a 10^{-6} M) en etanol, AGN 193109 (10^{-10} a 10^{-6} M) en etanol, o ATRA (10^{-10} a 10^{-6} M) y AGN 193101 10^{-6} M. Las células se alimentaron con medio reciente que contiene las concentraciones apropiadas de estos compuestos cada dos días durante un total de 5 días de tratamiento. Las células se retiraron de las placas mediante digestión suave con tripsina, y se contó el número de células con un contador electrónico de células.
Los resultados presentados en la Figura 17 indicaron que AGN 193109 potenció dramáticamente la actividad antiproliferativa de ATRA sobre células de RPE. El tratamiento de células de RPE primarias con ATRA condujo a una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de RPE con una disminución de aproximadamente 40% a una concentración de ATRA de 10^{-6} M con relación a cultivos de control. El tratamiento con AGN 193109 no alteró sustancialmente la velocidad de crecimiento de las células de RPE a ninguna concentración ensayada en el procedimiento. Inesperadamente, la combinación de ATRA (10^{-11} a 10^{-6} M) y AGN 193109 10^{-6} M hubo una actividad antiproliferativa más fuerte que ATRA sola. De este modo, el cotratamiento con AGN 193109 potenció el efecto antiproliferativo de ATRA. Más específicamente, los resultados mostrados en la Figura indicada fue el efecto antiproliferativo de ATRA 10^{-8} M fue obtenible usando sólo ATRA 10^{-10} M en combinación con AGN 193109 10^{-7} M. De este modo, la hormona negativa AGN 193109 potenció ventajosamente la actividad antiproliferativa de ATRA en aproximadamente 100 veces.
En un experimento independiente, la comparación del efecto antiproliferativo de ATRA (10^{-11} a 10^{-6} M) con el de ATRA y AGN 193109 10^{-6} M demostró nuevamente el incremento manifiesto en la sensibilidad de las células de RPE primarias por ATRA en presencia de AGN 193109. En este sistema, AGN 193109 no funcionó ni como un antagonista de retinoides ni mostró un efecto antiproliferativo cuando se usó sola. Sin embargo, la coadministración con AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa del agonista de retinoides.
Se analizó AGN 193109 para determinar su capacidad para potenciar el efecto antiproliferativo de ácido 13-cis-retinoico (13-cis RA) en cultivos de RPE primarios usando condiciones y técnicas para medir la proliferación de células de RPE descrita anteriormente. Notablemente, el 13-cis-RA es clínicamente significativo. Más particularmente, el 13-cis-RA es útil en el tratamiento de varios estados mórbidos, incluyendo acné (Peck et al. N. Engl. J. Med. 300:329 (1977); Jones et al. Br. J. Dermatol. 108:333 (1980)), y carcinoma de célula escamosa de la piel y la cerviz en el tratamiento de combinación con interferon 2\alpha (Lippman et al. J. Natl. Cancer Inst. 84:241 (1992); Moore et al. Seminars in Hematology 31:31 (1994)).
Los resultados presentados en la Figura 18 indicaron que tanto en 13-cis-RA (10^{-12} a 10^{-6} M) como ATRA (10^{-12} a 10^{-6} M) inhibieron efectivamente el crecimiento de células de RPE. Notablemente, el isómero 13-cis fue aproximadamente unos dos órdenes de magnitud menos efectivo en este ensayo cuando se compara con ATRA. Similar a los resultados obtenidos usando la coadministración de AGN 193109 y ATRA (anteriormente) la coadministración de AGN 193109 (10^{-8} o 10^{-6} M) con 13-cis-RA (10^{-12} a 10^{-6} M) aumentó dramáticamente la potencia de 13-cis-RA para mediar la represión de la proliferación de células de RPE. Contrariamente al tratamiento con 13-cis-RA solo, la coadministración de AGN 193109 potenció la potencia de 13-cis-RA. De este modo, AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de 13-cis-RA.
Seguidamente se analizó la capacidad de AGN 193109 para potenciar las actividades de otras hormonas de receptores nucleares en cultivos de células de RPE primarias. La dexametasona, un agonista sintética del receptor glucocorticoides, es un miembro de una clase de compuesto que se ha usado clínicamente por sus potentes propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras. La hormona del tiroides (T3; 3,3'.5'-triyodotirodina) es un agonista natural del receptor de la hormona del tiroides usado principalmente para terapia de sustitución de hormonas en el tratamiento de hipotiroidismo. Los métodos usados en estos experimentos fueron idénticos a los descritos anteriormente para los procedimientos que emplean ATRA y 13-cis-RA.
Los resultados de estos procedimientos indicaron que la coadministración de AGN 193109 y los agonistas del receptor nuclear potenció las actividades antiproliferativas de los agonistas de receptores nucleares. Más específicamente, los resultados presentados en la Figura 19 mostraron que el tratamiento con un único agente de células de RPE, bien con dexametasona (10^{-11} a 10^{-6} M) o bien con ATRA (10^{-12} a 10^{-6} M), fue sustancialmente incapaz de inhibir la proliferación de células de RPE. Sin embargo, el tratamiento de células de RPE con dexametasona (10^{-11} a 10^{-6} M) y AGN 193109 10^{-8} o 10^{-6} M reprimió la proliferación de células de RPE hasta un grado que se aproxima a la inhibición provocada por el tratamiento con ATRA. De forma similar, los resultados presentados en la Figura 20 indicaron que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de la hormona del tiroides. Similar a los resultados obtenidos usando dexametasona, la proliferación de células de RPE fue refractaria al tratamiento con agente único con la hormona del tiroides (10^{-11} a 10^{-6} M). Sin embargo, el cotratamiento de células de RPE con hormonas del tiroides (10^{-11} a 10^{-6} M) y AGN 193109 (bien 10^{-8} o bien 10^{-6} M) inhibió la proliferación de células de RPE de una manera dependiente de la hormona del tiroides. Se concluye que AGN 193109 hizo que los cultivos de RPE primarios fueran sensibles a los efectos antiproliferativos de estos agonistas de receptores nucleares. El mecanismo por el cual AGN 193109 medió estos efectos probablemente implicó la modulación de interacciones de NCP/RAR.
Adicionalmente se examinó el efecto de AGN 193109 sobre la expresión de genes marcadores en otros sistemas experimentales que fueron sensibles a agonistas de retinoides. Tanto los genes MRP8 como los de estromelisina son conocidos por ser inhibidos por agonistas de retinoides en una variedad de sistemas biológicos. Por ejemplo, Wilkinson et al. en J. Cell. Sci. 91:221 (1988) y Madsen et al. en J. Invest. Dermatol. 99:299 (1992) ha descrito que la expresión de gen MRP8 fuera elevada en la psoriasis. Contrariamente, la expresión del gen MRP8 fue reprimida por el agonista de retinoides AGN 190168 en la piel psoriática humana (Nagpal et al., submitted 1995), en cultivos numerosos de queratinocitos humanos (Chandraratna et al. J. Invest. Dermatol. 102:925 (1994) y en queratinocitos de prepucio de neonato humano cultivados (Thacher et al. J. Invest. Dermatol. 104:594 (1995)). (Nagpal et al., en J. Biol. Chem. 270:923 1995) ha descrito que los niveles de mRNA de estromelisina fueron reprimidos por agonistas de retinoides tales como AGN 190168 en queratinocitos del prepucio de neonato humano cultivados. Se analizó la expresión regulada de estos genes tras el tratamiento de queratinocitos del prepucio de neonato humano cultivado con el agonista de retinoides AGN 191183 o con AGN 193109.
El Ejemplo 20 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 inhibió la expresión de MRP-8 en queratinocitos cultivados.
Ejemplo 20 AGN 193109 inhibe la expresión de MRP-8 en queratinocitos
Se aislaron queratinocitos de prepucio primarios según el procedimiento descrito por Nagpal et al. en J. Biol. Chem. 270:923 (1995) y se cultivaron en un medio de crecimiento de queratinocitos (KGM) que se compró de Clonetics. Después de 3 días de tratamiento con AGN 191183 (10^{-7} M) o AGN 193109 (10^{-6} M), se aisló ARN celular total a partir queratinocitos tratados de control según los métodos estándares. El ARNm se transfirió de forma inversa en ADNc que entonces sirvió como el molde en un protocolo de amplificación por técnica de PCR usando cebadores específicos bien para el gen de gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o bien para MRP-8. Los cebadores para GAPDH tuvieron las secuencias 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (SEQ ID NO:6) y 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-E' (SEQ ID NO:7). Los cebadores para MRP-8 tuvieron las secuencias 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3' (SEQ ID NO:8) y 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3' (SEQ ID NO:9). Se retiró una alícuota de la reacción de amplificación de MRP-8 (10 \mul) después de cada ciclo de amplificación de PCR comenzando a partir de 12 ciclos y terminando a los 21 ciclos. De forma similar, se retiró una alícuota de la reacción de amplificación de GAPDH después de cada ciclo de PCR comenzando en el ciclo 15 y terminando en el ciclo 24. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%, y los productos de amplificación separados se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio. La intensidad de la tinción de los productos de la amplificación sirvieron como una medida cuantitativa de la cantidad de ARNm de partida específico para el conjunto de cebador dado.
Los resultados de este procedimiento indicaron tanto AGN 191183 como AGN 193109 inhibieron independientemente la expresión de MRP-8 en queratinocitos. La intensidad del producto de amplificación de GAPDH teñido fue sustancialmente equivalente en las líneas del gel que representan material de partida aislado a partir de queratinocitos tratados con el control, AGN 191183 y AGN 193109. Las bandas débiles que representan el productos de amplificación de GAPDH fueron detectables primeramente en las líneas que corresponden a las muestras retiradas después de 18 ciclos de amplificación de PCR. Las intensidades de tinción equivalentes entre las diversas líneas del gel indicaron que se usaron para todas las muestras masas equivalentes de material de partida. En consecuencia, las diferencias en las intensidades de las bandas teñidas que representan los productos de amplificación de MRP-8 fueron indicativas de las diferencias en la expresión de ARNm de MRP-8 entre las diversas muestras de partida. Como era de esperar, la señal amplificada de MRP-8 fue inhibida en cultivos tratados con AGN 191183 (10^{-7} M) con relación a un control no tratado. El tratamiento con AGN 193109 (10^{-6} M) de queratinocitos cultivados también reprimió la expresión de MRP-8 según se juzga por la menor intensidad del producto de amplificación teñido.
Como se ilustra en el siguiente ejemplo, AGN 193109 también inhibe la expresión de un segundo gen marcador en queratinocitos. Nagpal et al. en J. Biol. Chem. 270:923 (1995) describe que la expresión de ARNm de estromelisina se reguló a la baja por agonistas específicos de RAR en queratinocitos de prepucio humano de neonato cultiva. Nicholson et al. (EMBO J. 9:4443 (1990)) describe que un elemento promotor de AP-1 desempeñó el papel en la regulación negativa dependiente de retinoides del gen de estromelisina-1. De este modo, fue de interés determinar si AGN 193109 pudo alterar la expresión de este gen.
El Ejemplo 21 describe los métodos usados para demostrar que AGN 193109 inhibió la expresión del gen estromelisina-1 en ausencia del agonista de retinoides añadidos exógenamente.
Ejemplo 21 AGN 193109 inhibe la expresión de estromelisina-1 en queratinocitos cultivados
Se trataron de forma simulada o se trataron realmente queratinocitos de prepucio primarios durante 24 horas con el agonista de RAR AGN 191183 (10^{-7} M), o AGN 193109 (10^{-6} M). El ARN total preparado a partir de los queratinocitos tratados de forma simulada y de los queratinocitos tratados con los retinoides se transcribió de forma inversa, y el ADNc resultante se amplificó mediante PCR usando óligocebadores de \beta-actina o estromelisina-1 exactamente como se describe por Nagpal et al. en J. Biol.. Chem. 270:923 (1995). Se retiró una mezcla (10 \mul) de la reacción de amplificación mediante la técnica de PCR tras cada tres ciclos comenzando a partir de 18 ciclos de amplificación con PCR. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 2%, y se detectó tras teñir con bromuro de etidio.
Los resultados de estos procedimientos indicaron que AGN 193109 inhibió la expresión del gen de estromelisina-1 en la ausencia de un agonista de retinoides añadido exógenamente. Más específicamente, las bandas teñidas con etidio que representan los productos de amplificación de \beta-actina fueron fácilmente detectables en los geles de agarosa después de 18 ciclos de PCR. Mientras que todas las intensidades de las bandas aumentaron con ciclos adicionales de la reacción de amplificación, las bandas teñidas fueron en cierto modo menos intensas en las muestras que representan células tratadas con AGN 191183. Esto indicó que debía haber una cantidad ligeramente menor de ARN en las muestras de partida que corresponden a las células tratadas con AGN 191183. Los resultados también indicaron que el ARNm de estromelisina-1 fue detectable en queratinocitos tratados de forma simulada comenzando a los 33 ciclos de la amplificación por PCR. Como era de esperar, la expresión de ARNm de estromelisina-1 fue inhibida tras el tratamiento por AGN 191183 (10^{-7} M) según se juzga por la intensidad más débil de las bandas cuando se compara con las muestras derivadas de aquellas tratadas de forma simulada. Cuando se normaliza con las intensidades de los productos de la amplificación de \beta-actina, y consistente con los resultados obtenidos en las medidas de la expresión de MRP-8, el tratamiento con AGN 193109 (10^{-6} M) de queratinocitos dio como resultado una regulación a la baja de los niveles de ARNm de estromelisina-1. Con esto, la regulación a la baja estimulada por el tratamiento de AGN 193109 fue indistinguible por la regulación a la baja causada por el tratamiento de queratinocitos con el agonista de RAR AGN 191183.
Como se describe en esta memoria, AGN 193109 puede tener cualquiera de los tres posibles efectos con respecto a la modulación de la actividad de un agonista de la superfamilia de esteroides coadministrados. Primero, AGN 193109 puede no tener ningún efecto. En segundo lugar, AGN 193109 puede antagonizar el efecto del agonista, conduciendo de ese modo a la disminución en la actividad del agonista. Finalmente, AGM 193109 puede potenciar la actividad del agonista, conduciendo de este modo a una estimulación del efecto medido producido por el agonista.
Los compuestos que tienen actividades que pueden ser moduladas por AGN 193109 incluyen agonistas de receptores de retinoides y agonistas que se unen a otros miembros de receptores de la superfamilia de esteroides. Esta última categoría de agonistas incluye los agonistas de receptores de vitamina D, agonistas de receptores de glucocorticoides y agonistas de receptores de la hormona del tiroides. Los receptores activados por proliferadores peroxisómicos, el receptor estrógeno y los receptores de orfano que tienen actualmente ligandos desconocidos, también pueden ser potenciados por AGN 193109. En el caso en el que el agonista de la superfamilia de esteroides es un agonista de RAR, AGN 193109 puede antagonizar o bien potenciar la actividad de ese agonista. En el caso en el que el agonista usado en combinación con AGN 193109 es un compuesto que se puede unir a un receptor nuclear distinto de un RAR, la coadministración de AGN 193109 no tendrá efecto o bien sensibilizará el sistema al agonista de forma que se potencie la actividad del agonista.
A continuación sigue un procedimiento ejemplar generalizado para determinar cuál de las tres posibles actividades tendrá AGN 193109 en un sistema particular. Esta descripción ilustra cada una de los posibles resultados para la coadministración de AGN 193109 con un agonista de receptores de la superfamilia de esteroides. Sistemas biológicos útiles para determinar la capacidad de AGN 193109 para modular la actividad de un agonista de receptor nuclear incluyen pero no se limitan a estirpes celulares de cultivos de tejidos establecidos, estirpes celulares transformadas víricamente, células de cultivos primarios ex-vivo y estudios in vivo que utilizan organismos vivos. La medida del efecto biológico de AGN 193109 en tales sistemas podría incluir la determinación de cualquiera de una variedad de metas biológicas. Estas metas incluyen: análisis de la proliferación celular, análisis de la muerte celular programada (apoptosis), análisis del estado de diferenciación de las células vía ensayos de expresión génica, análisis de la capacidad de las células para formar tumores en ratones atímicos y análisis de la expresión génica tras la introducción transitoria o estable de constructos de genes informadores.
Con fines ilustrativos, se expresa una especie de ARNm designado como ARNm "X" a partir del gen "X" en células "Y" cultivadas primarias aisladas del órgano "Z". En condiciones de cultivo estándares, en las que se mantienen varios marcadores genéticos de células "Y", incluyendo la expresión del gen "X", la adición de un agonista de retinoides conduce a una disminución en la abundancia de ARNm "X". Los análisis de la expresión del gen X se puede determinar vía aislamiento de ARNm celular, y mediante la medida de la abundancia de los niveles de ARNm X vía PCR, protección de ribonucleasa o procedimientos de transferencia de ARN tales como análisis Northern. Tras el aislamiento del órgano Z, las células Y primarias se cultivan en un medio de crecimiento apropiado. Los cultivos primarios se colocan entonces en placas de cultivos de tejidos para la expansión de la población celular. Esta etapa facilita la separación de las células en cuatro grupos de muestras de forma que se puede suministrar diversas dosis del agonista de retinoides y AGN 193109. El primera grupo será un control, que recibe solamente vehículo. El segundo grupo recibirá el agonista de RAR, ácido retinoico, suministrado en etanol, en cantidades suficientes para proporcionar concentraciones finales en el intervalo de 10^{-11} a 10^{-6} M. A dosis más bajas puede necesitar ser determinada empíricamente dependiendo de la sensibilidad del sistema. Tales determinaciones caen dentro del alcance de la experimentación rutinaria para aquel experto normal en la técnica. El tercer grupo recibirá tanto el agonista del receptores nucleares a las mismas dosis usadas para tratar las células del grupo dos, y una dosis constante de AGN 193109. La dosis de AGN 193109 usada para tratar las células del grupo 3 también necesitarán ser determinadas empíricamente, pero se deberían aproximar a la constante de afinidad (Kd) de AGN 193109 para los subtipos de RAR (es decir, al menos 10^{-8} M). El cuarto grupo recibirá AGN 193109 a dosis mínimas que incluyen la usada para la coadministración de agonistas en el grupo tres. Una alternativa a este régimen de dosificación sustituirá AGN 193109 por el agonista de retinoides descrito en el ejemplo anteriormente citado, como se especifica en el grupo dos, y una dosis constante de agonistas de retinoides en lugar AGN 193109, según se especifica en los grupos tres y cuatro. Después de un período de incubación adecuado, las células se deben cosechar de una manera adecuada para la determinación del objetivo biológico que se está midiendo como un indicador de la actividad del agonista.
Por ejemplo, el análisis del efecto de AGN 193109 sobre la regulación dependiente del ácido retinoico de la expresión génica implicará la comparación de la abundancia de la especie X de ARNm en el conjunto de ARNm cosechado a partir de células tratadas según cada uno de los cuatro protocolos descritos anteriormente. El ARN derivado de las células de control servirá para determinar la expresión de la línea base de ARNm X, y representará un estado que corresponde a ninguna represión. La comparación de este nivel con el medido en el conjunto de ARNm derivado a partir de células tratadas con ácido retinoico permitirá la determinación del efecto de este agonista sobre expresión génica. Entonces se pueden comparar niveles cuantificados de la represión de los ARNm específicos que resultan del tratamiento con ácido retinoico con las abundancias de ARNm a partir de células tratadas en paralelo con AGN 193109 sólo o AGN 193109 en combinación con ácido retinoico. Aunque este ejemplo generalizado ilustra un análisis del efecto de AGN 193109 coadministrado sobre la expresión de un gen reprimido por un agonista de retinoides, el ejemplo podría haber descrito alternativamente el análisis del efecto de AGN 193109 coadministrado sobre un gen que fue inducido por un agonista de retinoides. La característica crítica para determinar si AGN 193109 se comportará como un agonista, como una hormona negativa, o no tendrá ningún efecto en el sistema particular, implicará la comparación cuantitativa de la magnitud del efecto en presencia y ausencia de AGN 193109.
Un ejemplo en el que AGN 193109 potenció la actividad de un agonista coadministrado sería el caso en el que el cotratamiento de AGN 193109 con ácido retinoico diera como resultado un nivel de expresión de ARNm X que está reprimido adicionalmente con relación al nivel medido en células tratadas con ácido retinoico sólo. Más específicamente, la comparación de la curva de respuesta a la dosis del efecto biológico (es decir, represión de la abundancia de ARNm X) dibujado en el eje Y frente a la dosis del agonista (escala logarítmica) en el eje X permitiría la comparación de la represión mediada por el agonista de la abundancia de ARNm X en presencia y ausencia de cotratamiento con AGN 193109. La capacidad de AGN 193109 para sensibilizar la respuesta biológica al agonista, potenciando de este modo la actividad del agonista, se indicará mediante un desplazamiento a la izquierda en la curva de respuesta a la dosis. Más específicamente, en presencia de AGN 193109 se requeriría menos agonistas para obtener el mismo efecto biológico obtenible usando el agonista sólo.
Un ejemplo de un antagonismo mediado por AGN 193109 de un agonista coadministrado sería el caso en el que el cotratamiento de AGN 193109 con ácido retinoico diera como resultado un nivel de expresión de ARNm X que está menos reprimido comparado con el medido en células tratadas con el ácido retinoico sólo. La comparación de las curvas de respuesta a las dosis de la represión de ARNm X frente al logaritmo de la dosis del agonista en presencia y ausencia del AGN 193109 demostrará un desplazamiento a la derecha en la curva de respuesta a la dosis. Más específicamente, en presencia de AGN 193109 fueran necesarios más agonistas para obtener el mismo aspecto biológico obtenible con el tratamiento de agente único con el agonista solo.
Los ejemplos anteriores en los que el AGN 193109 media en antagonismo o la potenciación describen resultados experimentales para la coadministración del AGN 193109 con un agonista de retinoides. Sin embargo, si el agonista coadministrado con AGN 193109 es un agonista capaz de unirse y activar un miembro de la superfamilia de receptores esteroides distinto de un RAR, entonces en lugar de antagonizar al agonista, se hace posible que AGN 193109 no tenga efecto sobre la actividad del agonista. Si el cotratamiento del AGN 193109 con tal agonista da como resultado un nivel de expresión de ARNm es igual al debido en células tratadas con el agonista sólo, entonces la capacidad de AGN 193109 para afectar la disponibilidad de los NCP vía la promoción las asociaciones RAR:NCP será muda en este sistema. Esto sería un ejemplo en el que AGN 193109 no tiene efectos sobre un agonista coadministrado.
Ejemplo de antagonismo
El método descrito en el ejemplo generalizado anterior para determinar el efecto de AGN 193109 coadministrado con un agonista de retinoides se ejemplifica mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 7. Las células CV-1 cotransfectadas con uno de los tres receptores de ácido retinoico, y el constructo informador MTV-TREp-Luc inducible por el agonista de retinoides, se dosificaron con etano (control, grupo 1), AGN 193109 a concentraciones finales de 10^{-9} a 10^{-6} M (grupo 2), AGN 193109 en concentraciones finales de 10^{-9} a 10^{-6} M coadministrado con ácido retinoico a 10^{-8} M (grupo 3), o ácido retinoico (10^{-8} M, grupo 4). La comparación de la actividad de luciferasa del grupo 1 con la del grupo 4 permitió la determinación del nivel de expresión inducida por el agonista de retinoides del gen informador de luciferasa en ausencia de AGN 193109 añadido. La comparación de la expresión del gen informador de luciferasa en células del grupo 3 con la medida en células del grupo 4 indicó que AGN 193109 se comporta como un antagonista del agonista de retinoides en este sistema.
Ejemplo de antagonismo
El método descrito en el ejemplo generalizado para determinar el efecto de AGN 193109 coadministrado con un agonista de retinoides se usó de forma similar para determinar en el Ejemplo 17 que AGN 193109 funcionó como un antagonista de una represión mediada por agonistas de retinoides de la proliferación celular estimulada por EGF en células epiteliales cervicales transformadas en ECE16-1. En este procedimiento, los tratamientos de células ECE-16-1 incluyeron una muestra de control tratada con EGF solo (grupo 1), una muestra tratada con la combinación de EGF y AGN 193109 a una concentración final de 10^{-6} M (grupo 2), una muestra tratada con la combinación de EGF y AGN 193109 a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{-6} M coadministrada con una dosis única del agonista de retinoides AGN 191183 a 10^{-8} M (grupo 3), y una muestra tratada con la combinación de EGF y AGN 191183 10^{-8} M (grupo 4). Después de tres días de tratamiento, se determinaron las velocidades de proliferación celular. La determinación de que las células se habían estimulado para proliferar mediante EGF fue posible debido a que se incluyó el tratamiento de control adicional en el que las células se expusieron a medios definidos que no contenían EGF. La comparación del número de células en el grupo 1 con el número de células en el grupo 4 permitió la determinación de que el agonista de RAR AGN 191183 reprimió la proliferación estimulada por EGF de células ECE-16-1. La comparación del grupo 3 con el grupo 4 indicó que AGN 193109 antagonizó la actividad del agonista de RAR en este sistema.
Ejemplo de potenciación
El método descrito en el ejemplo generalizado para determinar el efecto de AGN 193109 coadministrado con un agonista de retinoides también se usó en el Ejemplo 14 para determinar que AGN 193109 potenció la actividad de un agonista de receptor nuclear en células HeLa transfectadas con el gen informador MTV-VDRE-Luc inducible por 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. Los tratamientos de células transfectadas incluyeron vehículo sólo (control, grupo 1), 1,25-dihidroxivitamina D_{3} a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{-7} M (grupo 2), 1,25-dihidroxivitamina D_{3} a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{-7} M coadministrada con AGN 193109 a una concentración final de 10^{-8} o 10^{-7} M (grupo 3), y AGN 193109 como un tratamiento de agente único a la concentración de 10^{-8} o 10^{-7} M (grupo 4). La comparación de la actividad de luciferasa medida en células del grupo 1 (control) con la de las células del grupo 2 permitió la determinación de que 1,25-dihidroxivitamina D_{3} estimuló la actividad de luciferasa de manera dependiente de la dosis. La comparación de la actividad de luciferasa medida en células del grupo 4 (tratamiento con agente único AGN 193109) con la medida en células del grupo (coadministración con AGN 193109) permitió de forma similar la determinación de la actividad de luciferasa estimulada por 1,25-dihidroxivitamina D_{3} dependiente de la dosis en presencia de una concentración dada de AGN 193109. En este caso, el valor cero representó la actividad de luciferasa en células tratadas con AGN 193109 sólo (grupo 4). Tal régimen de dosificación permitió la comparación de las tres curvas de respuesta a la dosis de 1,25- dihidroxivitamina D_{3}. La comparación de la curva de respuesta a la dosis de 1,25- dihidroxivitamina D_{3} en ausencia de AGN 193109 con la curva que representa la coadministración de AGN 193109 (bien 10^{-8} a 10^{-7} M) demostró la potenciación de la actividad agonista según se evidencia por el desplazamiento hacia la izquierda en la respuesta semi-máxima.
Ejemplo de potenciación
El método descrito en el ejemplo generalizado para determinar el efecto de AGN 193109 coadministrado con un agonista de retinoides se usó adicionalmente para determinar en el Ejemplo 19 que AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de un agonista de RAR en cultivos primarios de células de epitelio de pigmento de retina humana. Los tratamientos de las células incluyeron: vehículo de etanol sólo (grupo 1), ácido retinoico a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{-6} M (grupo 2), ácido retinoico a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{-6} M coadministrado con AGN 193109 10^{-6} M (grupo 3), y AGN 193109 sólo a concentraciones finales desde 10^{-10} a 10^{- 6} M (grupo 4). La comparación de resultados del ensayo obtenidos usando células de los grupos 1 y 2 permitió la determinación de la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de estas células por el ácido retinoico. De forma similar, la comparación de los resultados obtenidos usando células del grupo 3 con los del grupo 1 permitió la determinación de la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de estas células por ácido retinoico en presencia de AGN 193109 coadministrado. El grupo 4 demostró la incapacidad de AGN 193109 para alterar sustancialmente la velocidad de proliferación de estas células cuando se usó como un agente de tratamiento único. La comparación de las curvas de respuesta a la dosis de la represión mediada por el ácido retinoico de la proliferación celular generada en los grupos 2 y 3 proporcionó la base para la conclusión de que AGN 193109 sensibilizó las células de RPE primarias a los efectos antiproliferativos del agonista de RAR, potenciando de este modo la actividad del agonista de RAR.
Como se ha indicado anteriormente, Agarwal et al., en Cancer Res. 54:2108 (1994) demostró que el crecimiento de las células CaSki, a diferencia del crecimiento de las células ECE-16-1 inmortalizadas con HPV, no se inhibió por el tratamiento con agonistas de retinoides. Como se describe aquí, se ha encontrado que el crecimiento de las células CaSki fue inhibido por AGN 193109 en ausencia del agonista de retinoides. El siguiente ejemplo ilustra cómo se puede usar AGN 193109 para inhibir el crecimiento de tumores de células CaSki in vivo.
Ejemplo 22 Inhibición de crecimiento de tumor de células CaSki en ratones atímicos tras la administración de AGN 193109
Se inyectaron 1 x 10^{6} células CaSki en cada uno de un panel de ratones atímicos. La formación de tumores se determinó usando técnicas que serán familiares para un experto normal en la técnica. Tras la inyección, los ratones se dividen aleatoriamente en grupos de control y grupos de ensayo. El grupo de control recibe un placebo. Se administra al grupo de ensayo con AGN 193109. Los animales administrados con el placebo recibe intubación intragástrica de aceite de maíz. Los animales del ensayo reciben 20 \muMol/kg de AGN 193109 en aceite de maíz diariamente durante el periodo del tratamiento. Se mide el volumen del tumor en milímetros cúbicos usando calibres graduados. El volumen del tumor se representa gráficamente como en función del tiempo. Los ratones que reciben AGN 193109 muestran tumores que son significativamente más reducidos en su velocidad de crecimiento según se comparan con los tumores en los ratones de control, tal como se juzga por el tamaño de los tumores y el número durante el período del estudio. Este resultado proporciona una demostración in vivo de que AGN 193109 inhibe el crecimiento de un carcinoma cervical avanzado que es resistente a la terapia que comprende la administración de un agonista de retinoides.
Como se indica anteriormente, las células CaSki son un modelo de tumores cervicales que no son sensibles a la terapia con agonistas de retinoides. Sin embargo, aquí se ha descrito que el crecimiento de las células CaSki fue inhibido por AGN 193109 en ausencia de tratamiento con un agonista de retinoides. La capacidad de AGN 193109 para inhibir la proliferación de células CaSki sugirió que AGN 193109 se podría usar para tratar terapéuticamente carcinomas cervicales que son insensibles a la terapia con agonistas de retinoides. El siguiente ejemplo ilustra un método que se puede usar para determinar el potencial terapéutico de AGN 193109 en el tratamiento de un carcinoma cervical.
Ejemplo 23 Determinación del potencial terapéutico de AGN 193109 en pacientes que tienen carcinoma cervical
Se identificó primeramente un paciente que presenta un carcinoma cervical avanzado. Se obtiene una biopsia cervical según los métodos que serán familiares para el experto normal en la técnico. Las células presentes del tumor explantado se propagan en cultivo tisular según las técnicas estándar para proporcionar números de células suficientes para permitir la división en tres grupos de muestras. Para este fin de emplean las condiciones de cultivo descritas por Agarwal et al. en Cancer Res. 54:2108 (1994). El primer grupo se reserva como control y recibe vehículo sólo (etanol). El segundo grupo se trata con el agonista de RAR ácido retinoico a una concentración de 10^{-10} a 10^{-6} M. El tercer grupo se trata AGN 193109 a dosis que oscilan desde 10^{-10} a 10^{-6} M. Las células se alimentan diariamente por medios de crecimiento recientes, y se proporcionan con los retinoides descritos anteriormente según sea apropiado para cada grupo de muestra. Las células se cuentan después de tres días usando un contador de células eléctrico. La comparación del número de células en los cultivos de control con el número de células en los cultivos tratados con ácido retinoico indica que el agonista de RAR no inhibe sustancialmente la velocidad de crecimiento de las células de carcinoma cervical cultivadas. Por el contrario, las células tratadas con AGN 193109 mostraron una disminución dependiente de la dosis en el número de células cuando se comparan con los recuentos de células en el grupo de control. Este resultado, en el que el tratamiento con AGN 193109 inhibe la proliferación de células de carcinoma cervical cultivadas, indica que AGN 193109 será un agente terapéutico útil para tratar pacientes con carcinoma cervical que tienen enfermedad metastásica.
Los pacientes con carcinoma cervical que han sufrido cirugía para la eliminación de los tumores primarios, y que presentan enfermedad metastásica, son englobados en un estudio químico de grupos aleatorios que busca demostrar el beneficio terapéutico de AGN 193109 en esta enfermedad. Los pacientes se dividen en dos grupos. El primer grupo es un grupo de control, mientras que los miembros del segundo grupo son tratados con AGN 193109. Se combina AGN 193109 con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una composición adecuada para la administración sistémica, todo según técnicas que son familiares para el experto normal en la técnica. Se administra al grupo control una formulación placebo, y al grupo experimental se le administra la formulación que contiene la hormona negativa AGN 193109. La dosificación de los pacientes es a la dosis máxima tolerada, y se realiza cada día durante un período de tres meses a un año. El resultado del estudio se cuantifica vía la medida de la supervivencia libre de la enfermedad a lo largo del tiempo. Los individuos que reciben AGN 193109 desarrollan un aumento significativo en la supervivencia libre de la enfermedad, incluyendo un número desproporcionado de pacientes que desarrollan una reducción completa de su enfermedad metastásica. Este resultado indica que AGN 193109 tiene utilidad terapéutica para el tratamiento in vivo de carcinomas cervicales que son insensibles a los efectos antiproliferativos de agonistas de retinoides, tales como ácido retinoico.
Como se describe anteriormente, AGN 193109 potenció la actividad antiproliferativa de agonistas de RAR en cultivos primarios de células de epitelio de pigmento retínico humano. En consecuencia, es de esperar razonablemente que la coadministración de AGN 193109 con un agonista de RAR in vivo aumente el índice terapéutico del agonista debido a que se requerirá una cantidad menor del agonista de RAR para obtener el mismo resultado final terapéutico. Adicionalmente, se ha demostrado que AGN 193109 sensibiliza cultivos primarios de células de epitelio de pigmento retínico humano a los efectos antiproliferativos de agonistas de receptores de glucocorticoides y de la hormona del tiroides. Se utilizará el siguiente modelo de conejo de PVR en dos estudios separados para demostrar el índice terapéutico creciente obtenido vía la coadministración de AGN 193109 con un agonista de RAR (ácido 13-cis-retinoico) o un agonista del receptor de la hormona del tiroides, respectivamente. De forma notable, se ha usado el modelo de conejo de redesprendimiento de retina publicado por Sen et al. en Arch. Opthalmol. 106:1291 (1988) para demostrar que los agonistas de retinoides que inhiben la proliferación de células de RPE primarias in vitro también inhiben la frecuencia de desprendimiento de retina in vivo (Araiz et al. Invest. Opthalmol. 34:522 (1993). De este modo, con respecto a su uso como compuestos terapéuticos en la prevención del desprendimiento de retina, se ha establecido una correlación entre las actividades in vitro y in vivo de los agonistas de retinoides. Los siguientes Ejemplos ilustran cómo se puede usar AGN 193109 en aplicaciones terapéuticas dirigidas a prevenir el desprendimiento de retina.
Ejemplo 24 Uso de AGN 193109 para aumentar el potencial terapéutico de agonistas de receptores de la superfamilia de esteroides en el tratamiento de vitreorretinopatía proliferativa (PVR)
En un primer estudio, se inyectaron células de RPE humano en la cavidad vítrea de ojos de conejos según el método descrito por Sen et al. en Arch. Opthalmol. 106:1291 (1988). Tras la inyección intravítrea, los conejos se dividieron en cinco grupos. El primer grupo (control) recibirá vehículo sólo mediante inyección intravítrea. El segundo grupo recibe ácido retinoico como tratamiento de agente único (100 \mug) mediante inyección intravítrea. El tercer grupo recibe AGN 193109 como un tratamiento de agente único (100 \mug) mediante inyección intravítrea. El cuarto grupo recibe mediante inyección intravítrea un agonista de RAR (ácido retinoico) a una dosis que es la décima parte de la cantidad administrada al grupo 2 (10 \mug). El quinto grupo recibe la combinación de AGN 193109 (100 \mug) y ácido retinoico (10 \mug) mediante inyección intravítrea. Los animales recibieron una única inyección intravítrea del tratamiento apropiado un día después de la inyección intravítrea de las células de RPE humanas. Los conejos se examinaron mediante oftalmoscopia indirecta los días 7, 14 y 28, y se gradúan según la frecuencia y gravedad del desprendimiento de retina traccional. Los conejos del grupo inyectados con 100 \mug de ácido retinoico mostraron una presencia y gravedad significativamente reducidas del desprendimiento de retina comparadas con los conejos de control o con los conejos que reciben bien AGN 193109 o bien ácido retinoico (10 \mug) sólo. Los conejos en el grupo administrado con la combinación de AGN 193109 y ácido retinoico (10 \mug) mostraron una frecuencia y gravedad significativamente reducida del desprendimiento de retina según se compara con aquellos en los grupos de control, AGN 193109 o de ácido retinoico (10 \mug). Este resultado demuestra que AGN 193109 mejora el índice terapéutico del agonista de RAR ácido retinoico en un modelo in vivo de PVR.
En un segundo estudio, se proporciona primeramente a los conejos con una inyección de células de RPE humanas en la cavidad vítrea del ojo, y entonces se dividen en cuatro grupos. El primer grupo (control) recibe vehículo sólo mediante inyección intravítrea. El segundo grupo recibe hormona del tiroides como tratamiento de agente único (100 \mug) mediante inyección intravítrea. Al tercer grupo se le administra con AGN 193109 como un tratamiento de agente único (100 \mug) mediante inyección intravítrea. Se administra al cuarto grupo con la combinación de AGN 193109 (100 \mug) y hormona del tiroides (100 \mug). Los conejos se examinaron mediante oftalmoscopia indirecta en los días 7, 14 y 28, y se graduaron para determinar la frecuencia y gravedad del desprendimiento de retina traccional. La comparación de la frecuencia y gravedad del desprendimiento de retina en los cuatro grupos demuestra que el tratamiento de agente único con AGN 193109 o la hormona del tiroides no inhibe el desprendimiento de retina cuando se compara con los conejos del control. Por el contrario, el grupo de conejos a los que se les administra la combinación de AGN 193109 y la hormona del tiroides muestra una incidencia y gravedad significativamente reducida del desprendimiento de retina. Este resultado demuestra que AGN 193109 mejora el índice terapéutico de la hormona del tiroides en un modelo in vivo de PVR.
El siguiente ejemplo ilustra cómo se puede usar AGN 193109 para potenciar el índice terapéutico de un agonista de RAR usado para tratar pacientes humanos tras la cirugía de redesprendimiento de retina.
Ejemplo 25 Aumento del índice terapéutico del agonista de RAR ácido 13-cis-retinoico
Se identifica primeramente una población de voluntarios adultos que tiene desprendimiento de retina resultante de PVR. Los individuos sufren reparación quirúrgica de los desprendimientos usando técnicas que estándares en la técnica. Los pacientes se dividen entonces en cinco grupos. El grupo de control consta de pacientes que sufren cirugía reparadora del desprendimento de retina y no reciben ningún compuesto retinoide. El segundo grupo recibe 40 mg de ácido 13-cis-retinoico oralmente dos veces al día durante cuatro semanas post-operatoriamente. El tercer grupo recibe 40 mg de AGN 193109 oralmente dos veces al día durante cuatro semanas post-operatoriamente. El cuarto grupo recibe 4 mg de ácido 13-cis-retinoico oralmente dos veces al día durante cuatro semanas post-operatoriamente. El quinto grupo recibe 40 mg de AGN 193109 oralmente en combinación con 4 mg de ácido 13-cis-retinoico oralmente dos veces al día durante cuatro semanas post-operatoriamente. El protocolo de tratamiento y la determinación de la eficacia del fármaco se realiza esencialmente como se describe por Fekrat et al. in Ophtalmolgoy 102:412 (1995).
La frecuencia y gravedad del redesprendimiento de retina en pacientes post- operatorios en los cinco grupos se monitoriza durante un periodo de nueve meses usando técnicas de examen oftalmológicas que serán familiares a los expertos normales en la técnica. Los pacientes que reciben 40 mg por vía oral de ácido 13-cis-retinoico muestran una incidencia significativamente reducida del redesprendimento de retina cuando se comparan con los pacientes del control, pacientes que reciben 4 mg por vía oral de ácido 13-cis-retinoico dos veces al día o pacientes que reciben 40 mg por vía oral de AGN 193109 dos veces al día. El examen del grupo de pacientes que reciben la combinación de 40 mg por vía oral de AGN 193109 y 4 mg por vía oral de ácido 13-cis-retinoico dos veces al día durante cuatro semanas post-operativamente demuestra que el resultado terapéutico de este grupo de pacientes es igual o mejor que aquellos pacientes que reciben 40 mg por vía oral de ácido 13-cis-retinoico dos veces al día durante cuatro semanas post- operativamente. Este resultado demuestra que la hormona negativa AGN 193109 mejora el índice terapéutico de un agonista de RAR en virtud de la disminución de la frecuencia y gravedad del redesprendimiento de retina en pacientes con PVR.
Ensayo generalizado para identificar hormonas negativas de receptores nucleares
Se ha demostrado anteriormente que AGN 193109 pueden funcionar como una hormona negativa capaz de reprimir la actividad transcripcional basal de receptores nucleares de RAR. Además, se ha descrito un ensayo que usa células CV-1 cotransfectadas con el plásmido informador de luciferasa ERE-tk-Luc y los plásmidos de expresión de receptores ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16 para distinguir los ligandos de RAR que son antagonistas simples de aquellos que tienen actividad hormonal negativa.
Se ha concluido que las hormonas negativas de RAR median de represión de la actividad transcripcional mediada por RAR promoviendo un aumento de interacción entre el RAR y los NCP. Además, se ha demostrado que AGN 193109 puede potenciar los efectos de agonistas de otros receptores nucleares de una manera consistente con la compartición mutua de los NCP entre miembros de las superfamilias de esteroides de receptores nucleares. Como tales, los ligandos se pueden diseñar y seleccionar para identificar compuestos que tienen actividad hormonal negativa en éstos receptores nucleares no RAR.
El método de selección de hormonas negativas de RAR, basado en el uso de células CV-1 cotransfectadas con el plásmido informador de luciferasa ERE-tk-Luc y los plásmidos de expresión de receptores ER-RXR-\alpha y RAR-\gamma-VP-16, se puede adaptar generalmente de forma que el resto RAR-\gamma del plásmido RAR-\gamma-VP-16 se convierte a aquel de los receptores activados por los proliferadores peroxisómicos (PPAR), receptor de vitamina D (VDR), receptor de la hormona del tiroides (T3R) o cualquier otro receptor nuclear de la superfamilia de esteroides capaz de heterodimerizarse con RXR. Las células CV-1 cotransfectadas con tales plásmidos expresarían niveles basales generales de actividad luciferasa. Los ligandos capaces de unirse al dominio de unión a ligandos del receptor sustituido por el resto RAR-\gamma se pueden seleccionar fácilmente para determinar la actividad hormonal negativa midiendo su capacidad para reprimir la actividad de luciferasa.
Para los receptores nucleares de la superfamilia de esteroides que no se heterodimerizan con RXR (por ejemplo, receptores de glucocorticoides y de estrógenos), se puede lograr el mismo resultado final usando receptores de GR-VP-16 o ER-VP- 16 y un plásmido informador de luciferasa que consta del elemento sensible al glucocorticoide o a estrógenos apropiados fusionados a un elementos promotor heterologo y luciferasa u otro gen informador. Una característica esencial de un ensayo de selección de hormona negativa generalizado es la inclusión de al menos el dominio de unión a ligandos del receptor nuclear particular para el que se van a seleccionar los agonistas inversos y un método para localizar el dominio de unión a ligandos del receptor nuclear al promotor de un gen informador. Esto se podría lograr usando el sitio de unión de ADN natural de los receptores, o como alternativa mediante la construcción de un receptor quimérico que tiene el dominio de unión de ADN heterólogo y el uso correspondiente de un gen informador que está bajo el control de un elemento regulador de ADN que es reconocido por el dominio de unión de ADN heterólogo. En una realización preferida, el plásmido que expresa el receptor nuclear para los cuales se van a seleccionar los agonistas inversos expresaría este receptor nuclear como una proteína de fusión que contiene un dominio de activación constitutivo, tal como el dominio de activación HSV VP-16, a fin de proporcionar una elevada actividad basal. Esta elevada actividad basal aumentaría efectivamente la sensibilidad del ensayo, permitiendo de ese modo que el análisis de ligando de receptores nucleares que reprimen la actividad transcripcional basal en ausencia de agonista del receptor nuclear añadido.
El siguiente ejemplo ilustra un método que se puede usar para seleccionar los compuestos que tienen actividad hormonal negativa en el receptor de la hormona del tiroides.
Ejemplo 26 Método para identificar la hormona negativa del receptor de la hormona del tiroides
Se cotransfectan células CV-1 con el plásmido informador de luciferasa ERE-tk- Luc y los plásmidos ER-RXR-\alpha y T3R-VP-16. El T3R-VP-16 es idéntico al plásmido RAR-\gamma-VP-16, excepto que el resto RAR-\gamma de RAR-\gamma- VP-16 ha sido sustituido por el ADNc del receptor de la hormona del tiroides. Como tal, el T3R-VP-16 expresa una proteína de fusión que contiene el dominio de activación de HSV VP-16 en ventana con el término N del receptor de la hormona del tiroides. Para este fin se entregan métodos de transfección estándar y de cultivos de células. Tras la transfección, las células explanan y se alimentan con medio de crecimiento que contiene suero de ternero fetal al 10% que se ha extraído con carbón activado. Las células se tratan con vehículo sólo (etanol), hormona de tiroides (10^{-9} a 10^{-10} M), o compuesto TR-1 (10^{-9} a 10^{-6} M). El TR-1 es un ligando sintético del receptor de la hormona del tiroides que muestra una fuerte afinidad por el receptor de la hormona del tiroides en estudios de competición de unión, pero que no activa al receptor de hormona del tiroides transfectado en el ensayos de transactivación por cotransfección transitoria usando un gen informador sensible a la hormona del tiroides y el plásmido de expresión de receptor de hormona del tiroides. Además, el TR-1 es capaz de antagonizar la transactivación mediada por la hormona del tiroides, y como tal es un antagonista del receptor del tiroides.
El análisis de la actividad de luciferasa a partir de células CV-1 transfectadas con ERE-tk-Luc, ER-RXR-\alpha y T3R-VP-16 demuestra un nivel basal elevado de actividad del informador de luciferasa en las células tratadas con el vehículo. Las células tratadas con la hormona del tiroides muestran un ligero incremento de la actividad de luciferasa de una manera dependiente de la dosis. La células tratadas con TR-1 muestran una disminución dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa. Esto indica que TR-1 muestra actividad agonista inversa del receptor del tiroides, presumiblemente debido a la interacción creciente de NCP con el receptor de la hormona del tiroides.
La velocidad de proliferación células de epitelio del pigmento retínico primario humano está reprimida por el tratamiento con agonistas de RAR. El valor terapéutico de esta observación ha sido demostrado en el uso post-operatorio de la terapia de retinoides tras la cirugía de recolocación de la retina. Se ha demostrado anteriormente que la hormona negativa de RAR AGN 193109 puede sensibilizar células de RPE primarias al efecto antiproliferativo de ATRA y del ácido 13-cis-retinoico en procedimientos de coadministración. Además, también se ha demostrado que AGN 193109 sensibiliza células de RPE a los efectos antiproliferativos de otros agonistas de receptores nucleares. Más específicamente, AGN 193109 sensibilizó células de RPE a los efectos antiproliferativos del agonista de glucocorticoides, dexametasona, y del agonista de la hormona del tiroides 3,3',5-triyodotirodina, T3. Este dato fue consistente con el modelo de trabajo en el que AGN 193109 moduló la disponibilidad de los NCP que se compartieron entre los miembros de la familia de receptores nucleares. El tratamiento de las células de RPE con el antagonista inverso TR-1 de receptor de la hormona del tiroides alterará de forma similar la disponibilidad de las NCP compartidos de forma que la coadministración con un agonista no receptor del tiroides, tal como el agonista RAR ácido 13-cis-retinoico, conducirá a un efecto antiproliferativo sobre los cultivos de RPE según se compara con el ácido 13-cis-retinoico como tratamiento de agente único.
El siguiente ejemplo ilustra un método que se puede usar para hacer a las células de RPE primarias más sensibles a la actividad antiproliferativa de un agonista de RAR. Notablemente, este ejemplo ilustra adicionalmente cómo se puede potenciar la actividad de los agonistas de RAR mediante coadministración con una hormona negativa.
Ejemplo 27 Sensibilización de células del epitelio de pigmento retínico primario a los efectos antiproliferativos de agonistas de RAR mediante coadministración del agonista inverso de la hormona del tiroides TR-1
Se obtuvieron y cultivaron células de RPE primarias según los métodos estándares. Las células cultivadas se dividen en cuatro grupos y se trataron según los siguiente. El grupo 1 recibe vehículo sólo (etanol). El grupo 2 se trata con ácido 13-cis- retinoico a concentraciones que oscilan desde 10^{-11} a 10^{-6} M. El grupo 3 se trata con el agonista inverso TR-1 de la hormona del tiroides a concentraciones que oscilan de 10^{-11} a 10-1 M. El grupo 4 se co-trata con ácido 13-cis-retinoico a concentraciones que oscilan desde 10- 11 a 10^{-6} M de TR-1. Las células se realimentan con medio de crecimiento recientes, y se vuelven a tratar con el compuesto apropiado cada dos días durante un total de cinco días de tratamiento. La velocidad de proliferación a lo largo de la duración del experimento se cuantifica vía la medida del número de células en los cultivos usando un contador de células electrónico.
Las células tratadas con TR-1 (grupo 3) exhiben velocidades de proliferación celular que son esencialmente las mismas que las células del control (grupo 1), y no hay efecto de agonista inverso sobre la velocidad de crecimiento medida de los cultivos. Las células tratadas con ácido 13-cis-retinoico (grupo 2) mostraron una disminución dependiente de la dosis en el número de células. La comparación de la disminución dependiente de la dosis en la proliferación celular de las células del grupo 4 (coadministración de 13-cis RA y TR-1) con la obtenida en el grupo 3 demuestra la capacidad de la coadministración de agonista inverso TR-1 del receptor de la hormona del tiroides para sensibilizar cultivos de RPE al efecto antiproliferativo del ácido 13-cis-retinoico, según se mide mediante el desplazamiento en la curva de respuesta a la dosis de agonista de RAR a la izquierda en el grupo 4 según se compara con las células del grupo 2.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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I.
SOLICITANTE: ALLERGAN
II.
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SÍNTESIS Y USO DE COMPUESTOS RETINOIDES QUE TIENEN ACTIVIDADES HORMONALES NEGATIVAS Y/O ACTIVIDADES ANTAGONISTAS
III.
NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
IV.
DIRECCIÓN POSTAL:
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(A)
DESTINATARIO: Knobbe, Martens, Olson & Bear
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(B)
CALLE: 620 Newport Center Drive 16th Floor
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(C)
CIUDAD: Newport Beach
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(D)
ESTADO: CA
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(E)
PAIS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 92660
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V.
FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR
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(A)
TIPO MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: IBM compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
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(D)
SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5
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VI.
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN
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(C)
CLASIFICACIÓN
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VII.
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/522,778
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 1-SEPTIEMBRE-1995
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD: 08/522,779
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(B)
FECHA DE SOLICITUD: 1-SEPTIEMBRE-1995
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD: 08/542,648
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-OCTUBRE-1995
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD: 08/613,863
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-MARZO-1996
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VIII.
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE
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\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Altman, Daniel E
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(B)
NUMERO DE REGISTRO: 34,115
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(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: ALRGN,058A
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IX.
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
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\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELEFONO: 714-760-0404
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 714-760-9502
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TELES:
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\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCAGGTCACC AGGAGGTCAG A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGAAGCTTAT GGAAGCAATT ATGAGTCAGT TTGCGGGTGA CTCTGCAAAT 
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACTGCCACTC 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TATAAAAGTT GGGCTCAGAA AGGTGGACCT CGAGGATCCA G 
\hfill
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGGATCCTC GAGGTCCACC TTTCTGAGCC CAACTTTTAT AGAGTGGCAG 
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TATTTGCAGA 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GTCACCCGCA AACTGACTCA TAATTGCTTC CATAAGCTTC T 
\hfill
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCAGGTCATG ACCTGA 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACGCGTCCGG AAGACCTGGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
I.
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
II.
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
III.
HIPOTÉTICO: NO
IV.
ANTISENTIDO: NO
V.
TIPO DE FRAGMENTO:
VI.
FUENTE ORIGINAL:
VII.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ATTCTGCAGG TACATGTCCA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (21)

1. Un compuesto de la fórmula:
19
en la que X es S, O, NR' en el que R' es H o alquilo de 1 a 6 carbonos;o X es [C(R_{1})_{2}]_{n} en la que R_{1} es independientemente H o alquilo de 1 a 6 carbonos; y n es un número entero entre 0 y 2;
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, F, Cl, Br, I, CF_{3}, alquilo sustituido con flúor de 1 a 6 carbonos, OH, SH, alcoxi de 1 a 6 carbonos, o alquiltio de 1 a 6 carbonos;
R_{3} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, o F;
m es un número entero que tiene el valor de 0 - 3;
o es un número entero que tiene el valor de 0 - 3;
Y es un grupo fenilo o naftilo, un heteroarilo seleccionado de un grupo que consta de piridilo, tienilo, furilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiazolilo, oxazolilo, imidazolilo y pirazolilo, estando dichos grupos fenilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos con uno o más grupos R_{2},
A es (CH_{2})_{q} en la que q es 0-5, alquilo inferior de cadena ramificada que tiene 3-6 carbonos, cicloalquilo que tiene 3-6 carbonos, alquenilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 dobles enlaces, alquinilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 triples enlaces;
B es hidrógeno, COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, CONR_{9}R_{10}, -CH_{2}OH, CH_{2}OR_{11}, CH_{2}OCOR_{11}, CHO, CH(OR_{12})_{2}, CHOR_{13}O, -COR_{7}, CR_{7}(OR_{12})_{2}, CR_{7}OR_{13}O, o trialquilsililo inferior, en las que R_{7} es un grupo alquilo, cicloalquilo o alquenilo que contiene 1 a 5 carbonos, R_{8} es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o trimetilsililalquilo en el que el grupo alquilo tiene 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5 a 10 carbonos, o R_{8} es fenilo o alquilfenilo inferior, R_{9} y R_{10} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5-10 carbonos, o fenilo o alquilfenilo inferior, R_{11} es alquilo inferior, fenilo o alquilfenilo inferior, R_{12} es alquilo inferior, y R_{13} es un radical alquílico divalente de 2-5 carbonos, y
R_{14} es (R_{15})_{r}-fenilo, (R_{15})_{r}-naftilo o (R_{15})_{r}-heteroarilo en los que el grupo heteroarilo tiene 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consta de O, S y N, r es un número entero que tiene los valores de 0-5, y
R_{15} es independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, N(R_{8})_{2}, N(R_{8})COR_{8}, NR_{8}CON(R_{8})_{2}, OH, OCOR_{8}, OR_{8}, CN, un grupo alquilo que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo sustituido con flúor que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquenilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 dobles enlaces, grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 triples enlaces, o un grupo trialquilsililo o trialquilsililoxi en los que los grupos alquilo tienen independientemente 1 a 6 carbonos.
R_{16} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos;
R_{17} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, OH u OCOR_{11}, y
p es cero.
2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es fenilo, piridilo, tienilo o furilo.
3. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es fenilo.
4. Un compuesto de la reivindicación 3, en el que el anillo fenílico está sustituido en 1,4 (para).
5. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es piridilo.
6. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que Y es tienilo o furilo.
7. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{14} es (R_{15})_{r}-fenilo
8. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{14} es (R_{15})_{r}-heteroarilo.
9. Un compuesto de la reivindicación 8, en el que R_{14} es (R_{15})_{r}-heteroarilo en el que el grupo heteroarilo es un anillo de 5 ó 6 miembros que tiene 1 ó 2 heteroátomos.
10. Un compuesto de la reivindicación 9, en el que el grupo heteroarilo se selecciona de 2-piridilo, 3-piridilo, 2-tienilo, y 2-tiazolilo.
11. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que el grupo R_{15} es H, CF_{3}, F, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o cloro.
12. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que X es [C(R_{1})_{2}]_{n}.
13. Un compuesto de la reivindicación 11, en el que R_{1} es CH_{3} y n es 1.
14. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que X es S, O o NR'.
15. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que A es (CH_{2})_{q} en la que q es 0-5 y en la que B es COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, o CONR_{9}R_{10}.
16. Un compuesto de fórmula:
20
en la que R_{1} es independientemente H o alquilo de 1 a 6 carbonos;
R_{2} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, F, Cl, Br, I, CF_{3}, alquilo sustituido con flúor de 1 a 6 carbonos, OH, SH, alcoxi de 1 a 6 carbonos, o alquiltio de 1 a 6 carbonos;
R_{3} es hidrógeno, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, o F;
m es un número entero que tiene el valor de 0-2;
o es un número entero que tiene el valor de 0-3;
A es (CH_{2})_{q} en la que q es 0-5, alquilo inferior de cadena ramificada que tiene 3-6 carbonos, cicloalquilo que tiene 3-6 carbonos, alquenilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 dobles enlaces, alquinilo que tiene 2-6 carbonos y 1 ó 2 triples enlaces;
B es hidrógeno, COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, CONR_{9}R_{10}, -CH_{2}OH, CH_{2}OR_{11}, CH_{2}OCOR_{11}, CHO, CH(OR_{12})_{2}, CHOR_{13}O, -COR_{7}, CR_{7}(OR_{12})_{2}, CR_{7}OR_{13}O, o trialquilsililo inferior, en las que R_{7} es un grupo alquilo, cicloalquilo o alquenilo que contiene 1 a 5 carbonos, R_{8} es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o trimetilsililalquilo en el que el grupo alquilo tiene 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5 a 10 carbonos, o R_{8} es fenilo o alquilfenilo inferior, R_{9} y R_{10} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos, o un grupo cicloalquilo de 5-10 carbonos, o fenilo o alquilfenilo inferior, R_{11} es alquilo inferior, fenilo o alquilfenilo inferior, R_{12} es alquilo inferior, y R_{13} es un radical alquílico divalente de 2-5 carbonos,
R_{15} es independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, N(R_{8})_{2}, N(R_{8})COR_{8}, NR_{8}CON(R_{8})_{2}, OH, OCOR_{8}, OR_{8}, CN, un grupo alquilo que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo sustituido con flúor que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquenilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 dobles enlaces, grupo alquinilo que tiene 1 a 10 carbonos y 1 a 3 triples enlaces, o un grupo trialquilsililo o trialquilsililoxi en los que los grupos alquilo tienen independientemente 1 a 6 carbonos;
r es un número entero que tiene los valores 0-5;
R_{16} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos;
R_{17} es H, alquilo inferior de 1 a 6 carbonos, OH u OCOR_{11}, y
p es cero.
17. Un compuesto de la reivindicación 16, en el que A es (CH_{2})_{q} en el que q es 0-5, y B es COOH o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, COOR_{8}, o CONR_{9}R_{10}.
18. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que R_{1} es CH_{3}.
19. Un compuesto de la reivindicación 18, en el que R_{2}, R_{3}, R_{16} y R_{17} son hidrógeno.
20. Un compuesto de la reivindicación 19, en el que R_{15} es H o CH_{3} y cuando R_{15} es CH_{3} ocupa la posición 4 del anillo fenólico.
21. Un compuesto de la reivindicación 20, que es ácido 4-[3-oxo-3-(7,8-dihidro-5-(4-metilfenil)-8,8-dimetil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico o ácido 4-[3-oxo-3-(7,8-dihidro-5-fenil-8,8-dimetil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico.
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