PL188705B1 - Związki retinoidowe i ich zastosowanie - Google Patents

Związki retinoidowe i ich zastosowanie

Info

Publication number
PL188705B1
PL188705B1 PL96325249A PL32524996A PL188705B1 PL 188705 B1 PL188705 B1 PL 188705B1 PL 96325249 A PL96325249 A PL 96325249A PL 32524996 A PL32524996 A PL 32524996A PL 188705 B1 PL188705 B1 PL 188705B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mmol
compound
solution
ethyl
dimethyl
Prior art date
Application number
PL96325249A
Other languages
English (en)
Other versions
PL325249A1 (en
Inventor
Elliott S. Klein
Alan T. Johnson
Andrew M. Standeven
Richard L. Beard
Samuel J. Gillett
Tien T. Duong
Sunil Nagpal
Vidyasagar Vuligonda
Min Teng
Roshantha A. Chandraratna
Original Assignee
Allergan Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Allergan Inc filed Critical Allergan Inc
Publication of PL325249A1 publication Critical patent/PL325249A1/xx
Publication of PL188705B1 publication Critical patent/PL188705B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/78—Benzoic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D335/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D335/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D335/06—Benzothiopyrans; Hydrogenated benzothiopyrans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C245/00—Compounds containing chains of at least two nitrogen atoms with at least one nitrogen-to-nitrogen multiple bond
    • C07C245/02—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides
    • C07C245/06—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C245/10—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/38—Amides of thiocarboxylic acids
    • C07C327/48—Amides of thiocarboxylic acids having carbon atoms of thiocarboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/46—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing six-membered aromatic rings and other rings, e.g. cyclohexylphenylacetic acid
    • C07C57/50—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing six-membered aromatic rings and other rings, e.g. cyclohexylphenylacetic acid containing condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/33—Polycyclic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/33—Polycyclic acids
    • C07C63/49—Polycyclic acids containing rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/66—Polycyclic acids with unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/68—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen
    • C07C63/72—Polycyclic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/68—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen
    • C07C63/74—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/01—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C65/19—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups having unsaturation outside the aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/21—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C65/28—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/32—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups
    • C07C65/38—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/612—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to an acyclic carbon atom and having a six-membered aromatic ring in the acid moiety
    • C07C69/618—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to an acyclic carbon atom and having a six-membered aromatic ring in the acid moiety having unsaturation outside the six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/84—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/90—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring with esterified hydroxyl and carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/94—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of polycyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/30—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/16—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/0803—Compounds with Si-C or Si-Si linkages
    • C07F7/081—Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/02—Systems containing two condensed rings the rings having only two atoms in common
    • C07C2602/04—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring
    • C07C2602/10—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring the other ring being six-membered, e.g. tetraline

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Zwiazek retinoidowy o wzorze 1 w którym X oznacza S; Z oznacza -C=C-; Y oznacza grupe fenylowa; B oznacza COOH lub COOEt; a R 14 oznacza 4-MePh. wzór 1 w z ó r 1a PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe związki retinoidowe i ich zastosowanie. Te nowe rwiąrni wykazują aktywność podobną do retinoidok'tgy antagonisty i są przydatne do leczenia lub zapobiegania toksyczności indukowanej retinoidem i witaminą A oraz prekursorem witaminy A u ssaków i jako dodatek do leczenia ssaków retinoidami w celu zapobiegania lub łagodzenia niechcianych lub niepożądanych skutków ubocznych.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie związków i'etinoidowz'cb do zwiększania biologicznej aktywności innych retinoidów i hormonów steroidowych i hamowania podstawowej aktywności receptorów bkzligandywego kwasu retinowego.
Związki wykazujące aktywność podobną do rettnoidowego antagonisty są dobrze znane i opisane w licznych opisach patentowych USA i innych oraz w publikacjach naukowych. Wiadomo ogólnie, ze aktywność rktinyidypodobne jest przydatna do leczenia ssaków, w tym ludzi, w celu leczenia łub łagodzenia objawów związanych z licznymi chorobami i stanami.
Rktinoidy (witamina A i jej pochodne) są znane z dużej aktywności, w tym wpływu na namnażanik i różnicowanie komórek, w różnych układach biologicznych. Ta aktywność warunkuje pyrzdśtność retinoidów w leczeniu różnych chorób, w tym zaburzeń dermaśologicznzcb i nowotworów skóry. Dotychczas opracowano wiele chemicznych zkiąsnów, które wykazują ^^tinoidopodobną biologiczną aktywność i opisano je w obszernej patentowej i chemicznej literaturze. Odnośna literatura patentowa obejmuje opisy patentowe USA nr nr 4980369, 5006550, 5015658, 5045551, 5089509, 5134159, 5362546, 5234926, 5248777, 5264578, 5272156, 5278318, 5324744, 5346895, 5346915, 5348972, 5348975, 5380877, 5399561, 5407937 (wszystkie przeniesione na właściciela niniejszego zgłoszenia) i cytowane tam opisy patentowe· i publikacje, które szczególnie opisują lub odnoszą się do pochodnych chromami, tiochyomśnu i 1,2,3,4-tetrahydroc]hLnoliny o retinoidypodobnkj biologicznej aktywności. Ponadto złożonych jest kilka zgłoszeń właściciela mniejszego zgłoszenia dotyczących dalszych związków wykazujących retinoidopydybną aktywność.
Opisy patentowe USA nr nr 4740519 (Sbroot i in.), 4826969 (Maignan i in., 4326055 (Lykligkr i in., 5130335 (Chandraratna i in.) 5037825 (Klaus i in.), 5231113 (Cbśndraratna i in.), 5324840 (Chśndyayatna), 5344959 (Chandraratna), 5130335 (Chandraratna i in.), opublikowane kuyopęjsnik zgłoszenia patentowe nr 0 176 034 A (Wuest i in.), 0 350 846 A (Klaus i in.), 0 176 032 A (F^ckel i in.), 0 176 033 A (Frickel i in.), 0 253 302 A (Klaus i in.), 0 303 915 A (Bryce i in.), brytyjskie zgłoszenie patentowe nr GB 2190378 A (Klaus i in.), niemieckie zgłoszenia patentowe nr DE 3715955 A1 (Klaus i in.), DE 3602473 Al (Wuest i in., oraz artykuły J. Amer. Acad Derm. 15: 756 - 764 (1986); Sporn i in.), Chem. Pharm. Bull. 33: 404-407 119851 (Shudo i in.). J. Med Chem. 31: 2182 2192 (1988) (Kagechika i in.), Chemist^ and Bio^y of Synthetic Retinyids, CRC Press Inc. 1990 str. 334 - 335, 354 (Dawson i in.), opisują lub odnoszą się do związków zakierajączch ugrupowanie tktrśbydronaftylowe i wykazujących retinoidopydobną lub spokrewnioną biologiczną aktywność. W opisie patentowym USA ni 4391731 (Boller i in.) ypisśny pochodne tktiśbydrynaftalknu, które są przydatne w ciekłokrystalicznych nompyzzcjach.
Kag^mi i in. w J. Med. Chem. 32:834 (1989) opisują pewne pochodne 6-(3-yksy-lpropenylo)-1,2,3,4-tktrametylo-1,2,3,4-tetrśbydrynaftślenu i pokrewne flawonowe związki wykazujące retinoidoρodybną antyk'ność. Shudo i in. w Chem. Pharm. Bull. 33:404 (1985) i Jettena i in. w CancM Rkseśych 47:3523 (1987) opisują dalsze pochodne 3-ykso-1-propenyłowk (zkiąrni chalkonowe) i ich retinoidoprdobną lub pokrewną biologiczną aktywność.
188 705
Niestety, związki wykazujące retinoidopodobną aktywność (retinoidy) powodują także wiele niepożądanych skutków ubocznych w dawkach leczniczych, w tym ból głowy, teratogenezę, śluzówkowo-skómą toksyczność, mięśniowo-szkieletową toksyczność, dyslipidemie, podrażnienie skóry, ból głowy i hepatotoksyczność. Te skutki uboczne ograniczają dopuszczalność i przydatność retinoidów do leczenia chorób.
Wiadomo obecnie ogólnie, że u ssaków (i u innych organizmów) występują dwa główne typy receptorów retinoidowych. Te dwa główne typy lub rodziny receptorów są odpowiednio oznaczone jako RAR i RXR. W każdym typie występuj ąpodtypy: w rodzinie RAR podtypy są oznaczone RAR-a, RAR-β i RAR-γ, w RXR podtypy to: RXR-a, ίΤΧΒ-β i RXR-y. Obie rodziny receptorów są czynnikami transkrypcyjnymi, które można odróżniać od siebie na podstawie ich specyficzności wiązania ligandów. Ligand ΑΙΙ-trans RA (ATRA) wiąże i aktywuje klasę receptorów kwasu retinowego (RAR), która obejmuje RAR-a, RAR-β i RAR-γ. Inny ligand, 9-cis-RA (9C-RA), wiąże i aktywuje RAR i członków rodziny retinoidowego receptora X(RXR).
Ustalono już także, że rozkład dwu głównych retinoidowych typów receptorów, oraz kilku podtypów, nie jest równo mierny w różnych tkankach i narządach organizmów ssaków. Ponadto ogólnie przyjęto, że jeden łub kilka podtypów receptora RAR pośredniczy w wielu niepożądanych skutkach ubocznych retinoidów. Tak więc, dla związków wykazujących agonistyczną aktywność wobec receptorów retinoidowych, specyficzność lub selektywność wobec jednego z głównych typów lub rodzin, a nawet specyficzność lub selektywność wobec jednego lub kilku podtypów w rodzinie receptorów jest uważana za pożądaną cechę farmakologiczną.
Stosunkowo niedawno opracowano związki wiążące receptory RAR bez uruchamiania odpowiedzi uruchamianych przez agonistów tych samych receptorów. Związki lub środki wiążące się z receptorami RAR bez uruchamiania „retinoidowej” odpowiedzi są więc zdolne do blokowania (w mniejszym lub większym stopniu) aktywności agonistów RAR w biologicznych próbach i układach. Dokładniej, w opublikowanym zgłoszeniu PCT nr WO 94/14777 opisano pewne pochodne heterocyklicznych kwasów karboksylowych wiążące się z retinoidowymi receptorami RAR i mające według zgłoszenia być przydatne do leczenia pewnych chorób lub stanów, takich jak trądzik, łuszczyca, reumatoidalne zapalenia stawów i infekcje wirusowe. Podobne dane ujawnia artykuł Yoshimury i in., J. Med. Chem. 38: 31633173 (1995). Kaneko i in., Med. Chem. Res. 1:220-225 (1991); Apfel i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129-7133, Augusty 1992 Cell Biology; Eckhardt i in., Toxicology Letters 70:299-308 (1994); Keidel i in., Molecular and Cellular Biology 14:287-298 (1994); a Eyrolles i in., J. Med Chem. 37: 1508-1517 (1994) opisują związki wykazujące antagonistyczną aktywność wobec jednego lub kilku podtypów retinoidowych RAR.
Poza niepożądanymi skutkami ubocznymi terapii związkami retinoidowymi, występuje niekiedy poważny stan medyczny spowodowany przedawkowaniem witaminy A lub prekursora witaminy A, wynikający albo z nadmiernego uzupełnienia witaminy albo spożywania wątroby pewnych ryb i zwierząt zawierającej znaczną ilość witaminy. Przewlekła lub ostra toksyczność obserwowana w zespole hiperwitaminozy A obejmuje bół głowy, łuszczenie skóry, toksyczność kości, dyslipidemie, itp. W ostatnich latach stało się oczywiste, że objawy toksyczności obserwowane dla analogów witaminy A, to jest retinoidów, zasadniczo są takie same jak dla zespołu hiperwitaminozy A, sugerując wspólny powód biologiczny, to jest, aktywację RAR. Te toksyczności leczy się obecnie głównie w sposób podtrzymujący i przez unikanie dalszego działania czynnika sprawczego, którym jest wątroba, spożywanie witaminy lub retinoidy. Chociaż pewne toksyczności zanikają z czasem, inne (np. przedwczesne zamykanie płytki nasadowej) są trwałe.
Ogólnie mówiąc, specyficzne odtrutki są najlepszym leczeniem na zatrucia środkami farmakologicznymi, lecz tylko około dwu tuzinów środków chemicznych łub klas środków chemicznych spośród tysięcy istniejących ma specyficzne znane odtrutki. Specyficzna odtrutka byłaby oczywiście bardzo wartościowa w leczeniu hiperwitaminozy A i toksyczności retinoidów. Istotnie, ponieważ coraz silniejsze retinoidy stosuje się klinicznie, specyficzna odtrutka na zatrucie retinoidami może być środkiem ratującym życie.
188 705
Przedmiotem wynalazku są związki retinoidowe, które spełniają określone wymagania, przedstawione wzorem 1
w którym X oznacza S;
Z oznaczą -C=C-;
Y oznacza grupę fenylową;
B oznacza COOH lub COOEt; a
R14 oznacza 4-MePh.
Przedmiotem wynalazku są również związki retinoidowe o wzorze 1a
w którym X oznacza -[C(Ri)2 ]n, gdzie Ri oznacza H lub metyl, n = 0 lub 1;
R3 oznacza H lub metyl;
Z oznacza -C=C, -N=N-, -CH=CH-, -CO-NH-, -CS-NH-, -COO-, -(CRi=CRi)n-, gdzie n' = 3, a Ri ma wyżej określone znaczenie;
Y oznacza grupę fenylową ewentualnie podstawioną fluorem lub grupę nafiylową;
B oznacza COOH, COOEt lub COO(CH2)2 SiCH; a
R14 oznacza fenyl, ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami alkilowymi Cm, grupą CF3, OH, CH3O lub atomem Cl, lub oznacza pirydyl, tiazolil, tienyl ewentualnie podstawione jednym lub dwoma metylami, albo furyl, przy czym gdy w grupie X n stanowi 0, wówczas Z oznacza -C=C=, B oznacza COOH lub COOEt, R4 oznaczą metylofenyl;
gdy Z oznacza -(CRi=CRi)n, wówczas Y oznacza wiązanie między Z i B; a gdy Y oznacza naftyl, wówczas Z oznacza wiązanie.
Związki według niniejszego wynalazku są przydatne do zapobiegania pewnym niepożądanym skutkom ubocznym retinoidów, które są podawane w celu leczenia lub zapobiegania pewnym chorobom lub stanom. W tym celu związki według wynalazku mogą być podawane wraz z retinoidami. Związki według niniejszego wynalazku są także przydatne w leczeniu ostrej lub przewlekłej toksyczności wskutek przedawkowania lub zatrucia retinoidowymi lekami lub witaminą A.
Jako odtrutka przy ostrym lub przewlekłym zatruciu retinoidem lub witaminą A związki według wynalazku mogą być podawane ssakowi dojelitowe, to jest, metodą intubacji do żołądka lub w mieszaninie z pokarmem/wodą, albo pozajelitowe, np., dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie, miejscowo, itp. Jedyne wymaganie odnośnie do drogi podawania jest takie, że musi umożliwiać dostarczenie antagonisty do tkanki docelowej. Związek według wynalazku może być formułowany sam lub w połączeniu z zarobkami i nie musi w preparacie występować w roztworze, np. w przypadku stosowania jelitowego.
Jako dodatek do terapii retinoidami i w celu zapobiegania jednemu lub wielu skutkom ubocznym podawanego leku retinoidowego, można podobnie podawać związek według wynalazku dojelitowo lub pozajelitowe. Związek według wynalazku - antagonista RAR i agonista RAR, nie muszą być podawane tą samą drogą. Kluczowa jest obecność dostatecznej ilości
188 705 antagonisty RAR w tkance cały czas podczas działania agonisty RAR. W celu zapobiegania toksyczności retinoidów, najlepiej jest podawać antagonistę RAR jednocześnie lub przed podaniem agonisty RAR. W wielu sytuacjach antagonista RAR będzie podawany inną drogą niż agonistą. Np. niepożądanym efektom skórnym jelitowo podawanego retinoidu można zapobiegać lub łagodzić je miejscowym podawaniem antagonisty RAR.
Niniejszy wynalazek umożliwią wzmocnienie farmakologicznej aktywności agonisty receptora nadrodziny steroidów podawanego ssakowi. Sposób ten obejmuje współpodawanie ssakowi z agonistą receptora nadrodziny steroidów kompozycję obejmującą farmaceutycznie skuteczną dawkę retinoidowego negatywnego hormonu w celu wzmocnienia farmakologicznej aktywności agonisty receptora nadrodziny steroidów. Farmakologiczną, aktywność można mierzyć w próbie trans-aktywacji genu reporterowego in vitro, takiej jak pomiar aktywności anty-AP-1. Farmakologiczną. aktywnością wzmacnianą może być aktywność antyproliferacyjna, taka jak aktywność, którą można zmierzyć w siatkówkowym pigmentowym nabłonku. Agonistą receptora nadrodziny steroidów może być dowolnym z następujących: agonistą receptora retinoidów, agonistą receptora witaminy D, agonistą receptora glukokortykoidu, agonistą receptora hormonu tarczycy, agonistą receptora aktywowanego proliferatorem peroksysomu lub agonistą receptora estrogenu. Agonistą receptora retinoidów może być agonistą RAR, taki jak all-trans kwas retinowy lub kwas 13-cis retinowy. Agonistą receptora retinoidów może także być agonistą RXR. Korzystnym agonistą receptora witaminy D jest 1,25dihydroksywitamina D3. Korzystnym agonistą receptora glukokortykoidu jest deksametazon. Korzystnym agonistą receptora hormonu tarczycy jest 3,3',5-trijodotyronina. Negatywnym hormonem retinoidowym jest specyficzny dla RAR negatywny hormon retinoidowy, który korzystnie ma stałą dysocjacji mniejszą niż lub w przybliżeniu równą 30 nM. Przykłady specyficznego dla RAR negatywnego hormonu retinoidowego obejmują AGN 193109, AGN 193385, AGN 93389 i AGN 193871. Kompozycję zawierającą farmaceutycznie skuteczną dawkę negatywnego hormonu retinoidowego można podawać jednocześnie z agonistą nadrodziny steroidów i łączyć przed podaniem. Można je także podawać jako oddzielne kompozycje.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 pokazuje chemiczną strukturę AGN 193109.
Fig. 2A - 2F przedstawia serię wykresów pokazujących, że AGN 193109 inhibitowało zależną od ATRA transaktywację na RAR. Fig. 2A i 2B reprezentują aktywność na receptorze RAR-α; Fig. 2C i 2D reprezentują aktywność na receptorze RAR-β; Fig. 2E i 2F reprezentują aktywność na receptorze RAR-γ. Na fig. 2A, 2C i 2E, otwarte kwadraty reprezentują, traktowanie kwasem retinowym i pełne koła reprezentują traktowanie AGN 193109. Na fig. 2B, 2D i 2F pojedyncze linie reprezentują aktywność lucyferazy mierzoną po traktowaniu 10 8 M ATRA i zmiennymi stężeniami AGN 193109.
Fig. 3A i 3B są wykresami reprezentującymi aktywność lucyferazy wykrytą w komórkach CV-1 transfekowanych reporterowym plazmidem ERE-tk-Luc i plazmidem ekspresji ER-RAR-α i stymulowanych ATRA (fig. 3A) lub AGN 193109 (fig. 3B) w różnych stężeniach. Punkty danych reprezentują średnią ± błąd standardowy trzech niezależnych pomiarów lucyferazy. Wyniki transfekcji prowadzonej z użyciem różnych ilości współtransfekowanego ER-RAR-α (0,05, 0,1 i 0,2 pg/dołek) wskazano na każdej figurze.
Fig. 4A i 4B są wykresami reprezentującymi aktywność lucyferazy w komórkach CV-1 transfekowanych reporterowym plazmidem ERE-tk-Luc i plazmidem ekspresji ER-RAR-β i stymulowanych ATRA (fig. 4A) lub AGN 193109 (Fig. 4B) w różnych stężeniach. Punkty danych reprezentują średnią ± błąd standardowy trzech niezależnych pomiarów lucyferazy. Wyniki transfekcji prowadzonej z użyciem różnych ilości współtransfekowanego ER-RAR-β (0,05, 0,1 i 0,2 pg/dołek) wskazano na każdej figurze.
Fig. 5A i 5B są wykresami reprezentującymi aktywność lucyferazy wykrytą w komórkach CV-1 transfekowanych reporterowym plazmidem ERE-tk-Luc i plazmidem ekspresji ER-RAR-γ i stymulowanych ATRA (fig. 5A) lub AGN 193109 (Fig. 5B) w różnych stężeniach. Punkty danych reprezentują średnią ± błąd standardowy trzech niezależnych pomiarów lucyferazy. Wyniki transfekcji prowadzonej z użyciem różnych ilości współtransfekowanego ER-RAR-γ [0/05, 0,1 i 0,2 pg/dołek) wskazano na każdej figurze.
188 705
Fig. 6 pokazuje odpowiedzi na dawki ATRA i AGN 193109 komórek CV-1 współtransfekowanych reportera wym plazmidem ERE-tk-luc i samym plazmidem ekspresji chimerycznego receptora ER-RXR-a lub plazmidem w kombinacji z plazmidem ekspresji RAR-y-VP-16. Komórki współtransfekowane ER-RXR-a potraktowano ATRA (kwadrat) i AGN 193109 (romb). Komórki współtransfekowane kombinacją ER-RXR-a i RAR-y-VP-16 potraktowano ATRA (kółko) lub AGN 193109 (trójkąt).
Fig. 7 pokazuje wykres liniowy reprezentujący pomiary aktywności lucyferazy zanotowane w lizatach komórek CV-1 transfekowanych reporterem ERE-tk-Luc i konstruktem ekspresji ER-RAR-γ i następnie potraktowanych ATRA przy 10’8 M i testowanymi związkami w stężeniach wskazanych na osi poziomej. Testowane związki to AGN 193109 (kwadrat), AGN 193357 (otwarty 5 romb), AGN 193385 (okrąg), AGN 193389 (trójkąt), AGN 193840 (zakreskowany kwadrat) i AGN 192870 (pełny romb).
Fig. 8 wykres liniowy reprezentujący pomiary aktywności lucyferazy zanotowane w lizatach komórek CV-1 transfekowanych reporterem ERE-tk-Luc i konstruktami ekspresji RARY-VP-16 i ER-RKR-a i następnie potraktowanych testowanymi związkami w stężeniach wskazanych na osi poziomej. Testowane związki to ATRA (otwarty kwadrat), AGN 193109 (otwarty okrąg), AGN 193174 (otwarty trójkąt), AGN 193199 (zakreskowany kwadrat), AGN 193385 (zakreskowany okrąg), AGN 193389 (odwrócony trójkąt), AGN 193840 (skośnie wypełniony kwadrat) i aGn 193871 (wypełniony w połowie romb).
Fig. 9A, 9B i 9C przedstawiają schematycznie mechanizm, przy pomocy którego AGN 193109 może modulować oddziaływanie pomiędzy RAR (zacieniony kwadrat) i negatywnie współaktywującymi białkami (-), zilustrowany w kontekście próby transaktywacji. Fig. 9A pokazuje, że negatywnie współaktywujące białka i pozytywnie współaktywujące białka ( + ) znajdują się w równowadze wiążącej z RAR. W nieobecności liganda zachodzi transkrypcja na podstawowym poziomie genu reporterowego. Jak ilustruje fig. 9B, dodanie agonisty RAR promuje asocjację pozytywnie współaktywujących białek z RAR i powoduje transkrypcję regulowanego w górę genu reporterowego. Jak ilustruje fig. 9C, dodanie AGN 193109 promuje asocjację negatywnie współaktywującego białka z RAr i zapobiega transkrypcji genu reporterowego.
Fig. 10 jest wykresem słupkowym pokazującym inhibicję indukowanej TPA ekspresji Str-AP1-CAT w funkcji stężenia AGN 191183 (10‘° do 10'12 M) ze stałym stężeniem AGN 193109 108 M. Wyniki z prób prowadzonych z samym AGN 191183 pokazano jako zakreskowane słupki, podczas gdy słupki w paski reprezentują wyniki z traktowania kombinacją AGN 193109 i AGN 191183.
Fig. 11 przedstawia schematycznie mechanizm, przy pomocy którego AGN 193109 może wzmacniać aktywność RAR i innych członków rodziny jądrowych receptorów; Jak ilustruje wykres, wprowadzone RAR (otwarte prostokąty mające domeny AB-C-DEF) zwiększyły wrażliwość na ligandy RAR w próbie anty-AP1, ponieważ negatywnie współaktywujące białko (ncp), obecne w o graniczonej ilości, jest maskowane na RAR, dając początek dwu populacjom: RAR+ncp i RAR-ncp. RAR-ncp zwiększa wrażliwość na ligandy. Czynniki jądrowe nie-RAR (zacienione prostokąty mające domeny AB-C-DEF) zwiększyły wrażliwość na rodzime ligandy, ponieważ ncp zostało zamaskowane na RAR przez aktywność AGN 193109. Modularne domeny jądrowych receptorów są nazwane zgodnie ze standardową nomenklaturą jako „AB” (domena transaktywacji niezależna od liganda), „C” (domena wiążąca DNA) i „DEF” (domena transaktywacji regulowana przez ligand i domena dimeryzacji).
Fig. 12 jest wykresem liniowym pokazującym wpływ AGN 193109 na odpowiedź na dawkę 1,25-dihydroksywitaminy D3 w komórkach CV-1 transfekowanych plazmidem reporterowym fviT'V-DR3-Luc. Transfektanty potraktowano 1,25-dihydrGksywitaminąD3 (pełny kwadrat), 1,25-dihydroksvw'itaminą D3 i 10'8 M AGN 193109 (pełne trójkąty) i 1,25-dihydroksywitaminą D3 i 10 M AGN 193109 (pełne koła).
Fig. 13 jest wykresem słupkowym pokazującym wpływ współpodawania AGN 193109 (10 nM) na mediowaną 1,25-dihydroksywitaminą D3 inhibicję indukowanej TPA aktywności Str-AP1-CAT. Pełne słupki reprezentują inhibicję aktywności CAT w transfekowanych komórkach potraktowanych samą 1,25-dihydroksywitaminą D3. Otwarte słupki reprezentują
188 705 inhibicję aktywności CAT w transfekowanych komórkach potraktowanych kombinacją 1,25dihydroksywitaminy D 3 i AGN 193109.
Fig. 14 jest wykresem liniowym pokazującym wpływ samego AGN 193109 i w kombinacji z AGN 191183 na komórki HeLa współtransfekowane RAR-γ i odpowiadającym RAR konstruktem reporterowym MTV-TREp-Luc. Traktowanie lekami zilustrowane na wykresie to: samo AGN 193109 (kwadrat), AGN 193109 w kombinacji z AGN 191183 przy 10'10 M (romb) i AGN 193109 w kombinacji z AGN 191183 przy 109 M.
Fig. 15 jest wykresem liniowym pokazującym, że komórki ECE16-1 namnażały się w odpowiedzi na EGF (pełny kwadrat), lecz nie w odpowiedzi na samą zdefiniowaną pożywkę (otwarty okrąg). Komórki potraktowane samym. AGN 193109 są reprezentowane pełnym trójkątem. Wypełnione okręgi reprezentują wyniki otrzymane dla komórek potraktowanych 10 nM AGN 191183 i 0-1000 nM AGN 193109.
Fig. 16 jest wykresem słupkowym pokazującym wpływ AGN 193109 na namnażanie komórek CaSki w obecności lub nieobecności agonisty retinoidowego AGN 191183. Wszystkie grupy próbek otoymały 20 ng/ml czynnika wzrostu naskórka (EGF) za wyjątkiem próbki propagowanej w zdefiniowanej pożywce (DMI) (otwarty słupek). Słupki z paskami reprezentują próbki propagowane w nieobecności ligandów AGN 193109. Pełne słupki reprezentują próbki propagowane w obecności 1000 nM AGN 193109.
Stężenia AGN 191183 użytego w procedurze pokazano na osi poziomej.
Fig. 17 przedstawia krzywą odpowiedzi na dawkę pokazującą, że AGN 193109 wzmacniał antyproliferacyjną aktywność ATRA na komórkach siatkówkowego pigmentowego nabłonka (RPE). Próbki potraktowane samym ATRA są reprezentowane pełnymi kwadratami. Próbki potraktowane kombinacją ATRA i AGN 193109 (10'7 M) reprezentują pełne okręgi. Stężenie ATRA użytego do traktowania różnych próbek pokazano na osi poziomej.
Fig. 18 jest krzywą odpowiedzi na dawkę pokazującą, że 13-cis-RA i ATRA inhibitowały wzrost komórek RPE, i że AGN 193109 wzmacniał antyproliferacyjną aktywność 13-cisRA. Traktowanie różnych próbek pokazane jako odpowiedzi na dawkę obejmują sam 13-cisRA (pełny kwadrat), 13-cis-RA w kombinacji z AGN 193109 (10'7 M) (pełny okrąg), 13-cisRA w kombinacji z AGN 193109 (10‘8 M) (pełny trójkąt), i ATRA (pełny romb). Stężenia 13cis-RA i ATRA użytego do traktowania różnych próbek pokazano na osi poziomej.
Fig. 19 jest kreywą odpowiedzi na dawkę pokazuj ącą że AGN 193109 wzmacniał antyproliferacyjną aktywność deksametazonu w pierwszorzędowych kulturach komórek RPE. Traktowanie różnych próbek pokazane jako odpowiedzi na dawkę obejmują ATRA (pełny kwadrat), sam deksametazon (pełny okrąg), deksametazon w kombinacji z AGN 193109 (10s M) (pełny trójkąt), i deksametazon w kombinacji z AGN 193109 (106 M) (pełny romb). Stężenia deksametazonu i ATRA użytego do traktowania próbek pokazano na osi poziomej.
Fig. 20 jest krzywą odpowiedzi na dawkę pokazującą, że AGN 193109 wzmacniał antyproliferacyjną aktywność hormonu tarczycy (T3) w pierwszorzędowych kulturach komórkowych rpE.
Traktowanie różnych próbek pokazane jako odpowiedzi na dawkę obejmują ATRA (pełny kwadrat), sam T3 (pełny okrąg), T3 w kombinacji z AGN 193109 (10'8 M) (pełny trójkąt), T3 w kombinacji z AGN 193109 (10M) (pełny romb). Stężenia T3 i ATRA użytego do traktowania próbek pokazano na osi poziomej.
Dla celów niniejszego wynalazku antagonistę RAR definiuje się jako związek chemiczny, który wiąże jeden lub kilka podtypów RAR z Kd poniżej 1 pM (Kd < 1 pM), lecz nie powoduje znaczącej transkrypcyjnej aktywacji regulowanych przez podtypy RAR genów w próbie wspołtransfekcji receptora. Konwencjonalnie antagoniści są środkami chemicznymi hamującymi aktywność agonistów. Tak więc aktywność antagonisty receptora konwencjonalnie mierzy się poprzez jego zdolność do hamowania aktywności agonisty.
Agonistę RAR definiuje się jako związek chemiczny, który wiąże jeden lub kilka podtypów receptora RAR z Kd poniżej 1 pM (Kd < 1 pM) i powoduje tra^.skr>y^<^;yjn^ aktywację regulowanych podtypem RAR genów w próbie wspołtransfekcji receptora. Termin „agonista RAR” obejmuje związki chemiczne, które mogą wiązać i/lub aktywować inne receptory poza RAR, np. receptory RXR.
188 705
W niniejszym opisie negatywny hormon lub odwrotny agonista oznacza ligand receptora powodujący przyjęcie przez receptor stanu nieaktywnego wobec stanu podstawowego zachodzącego w nieobecności ligandów Tak więc podczas gdy antagonista może hamować aktywność agonisty, negatywny hormon jest ligandem, który może zmieniać konformację receptora w niebecności ligandów agonisty. Pomysł negatywnego hormonu lub odwrotnego agonisty zbadał Bond i in. w Nature 374:272 (1995). Dokładniej, Bond i in. zaproponowali, ze bezligandowy [T-adrenoceptor występuje w równowadze pomiędzy nieaktywną konformacją i spontanicznie aktywną konformacją. Agonista ma stabilizować receptor w aktywnej konformacji. Z kolei odwrotni agoniści mają stabilizować nieaktywną konformację receptora. Tak więc chociaż antagonista manifestuje aktywność przez inhibicję agonisty, negatywny hormon może dodatkowo manifestować aktywność w nieobecności ligandów agonisty hamując spontaniczną konwersję bezligandowego receptora w aktywną konformację. Tylko część antagonistów będzie działać jako negatywne hormony. Jak opisano tutaj, AGN 193109 jest antagonistą i negatywnym hormonem. Do dziś nie wykazano aktywności negatywnego hormonu innych retinoidów.
W niniejszym opisie, określenie „współpodawanie” dwóch farmakologicznie aktywnych związków odnosi się do podawania dwóch odrębnych chemicznych całości, in vitro lub in vivo. Współpodawanie odnosi się do jednoczesnego podawania oddzielnych środków, do jednoczesnego podawania mieszaniny środków, jak też do podawania jednego środka, a następnie drugiego środka. We wszystkich przypadkach środki współpodawane mają współdziałać.
Związki według wynalazku można podawać w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli, jeśli związek ma grupy grupy funkcyjne zdolne do tworzenia soli, np. grupę kwasową. Farmaceutycznie dopuszczalna sól jest dowolną solą zachowującą aktywność macierzystego związku i nie działającą szkodliwie lub niekorzystnie na pacjenta, któremu z konkretnych przyczyn podaje się taką sól.
Farmaceutycznie dopuszczalne sole mogą pochodzić od organicznych lub nieorganicznych zasad. Sól może zawierać mono lub wielowartościowy jon. Szczególnie interesujące są nieorganiczne jony sodu, potasu, wapnia i magnezu. Organiczne sole można wytwarzać z aminami, szczególnie z takimi jak mono-, di- i trialkiloaminy lub etanoloaminy. Sole można także tworzyć z .kofeiną, trometaminąi podobnymi cząsteczkami. Gdy obecny jest azot dostatecznie zasadowy, aby móc tworzyć sole addycyjne z kwasami, można je wytwarzać z dowolnymi nieorganicznymi lub organicznymi kwasami lub środkiem alkilującym takim jak jodek metylu. Korzystne sole wytwarza się z kwasami nieorganicznymi takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy lub kwas fosforowy. Można także stosować dowolne z wielu prostych organicznych kwasów takich jak mono-, di- lub trikwasy.
Niektóre związki według niniejszego wynalazku mogą mieć izomery trans i cis [E i Z]. Ponadto związki według niniejszego wynalazku mogą zawierać jedno lub kilka centrów chiralnych, a więc mogą występować w enancjomerycznych i diastereomerycznych formach. Zakres niniejszego wynalazku ma obejmować wszystkie takie izomery jako takie, jak też mieszaniny izomerów cis i trans, mieszaniny diastereomerów i racemiczne mieszaniny enancjomerów (optycznych izomerów). W niniejszym zgłoszeniu, gdy nie mówi się o konkretnej konfiguracji (cis, trans albo R lub S) związku (lub asymetrycznego atomu węgla), ma się na myśli mieszaninę takich izomerów, lub jeden z izomerów.
Niniejsze najkorzystniejsze związki według wynalazku pokazano w tabeli 1 z odniesieniami do wzorów 2, 3, 4, 5 i 5 a.
Wzór 2
Wzór 3 io i88 705
Wzór 4 Wzór 5
Wzór 5a
Tabela 1
Związek Wzó: r.4. Z r2* r8*
1 2 3 4 5 6
1 2 4-metylofenyl -C-C- H Et
1a 2 fenyl -C-C- H Et
2 2 3-metylofenyl -C-C- H Et
3 2 2-metylofenyl -C-C- H Et
4 2 3,5-dimetylofenyl -C-C- H Et
5 2 4-etylofenyl -C-C- H Et
6 2 4-t-butylofenyl -C-C- H Et
7 2 4-chlorofenyl -C-C- H Et
8 2 4-metoksyfenyl -C-C- H Et
9 2 4-trifluorometylofenyl -C-C- H Et
i0 2 2-pirydyl -C-C- H Et
ii 2 3-pirydyl -C-C- H Et
i2 2 2-metylo-5-pirydyl -C-C- H Et
i3 2 3-hydroksyfenyl -C-C- H Et
14 2 4-hydroksyfenyl -C-C- H Et
15 2 5-metylo-2-tiazolil -C-C- H Et
188 705 c d. tabeli 1
1 2 3 4 5 6
15a 2 2-tiazolil -C-C- H Et
16 2 4-metylo-2-tiazolil -OC- H Et
17 2 4,5-dimetylo-2-tiazolil -C-C- H Et
18 2 2-metylo-5-pirydyl -C-C- H H
19 2 2-pirydyl -C-C- H H
20 2 3-metylofenyl -C-C- H H
21 2 4-etylofenyl -OC- H H
22 2 4-metoksyfenyl -C-C- H H
23 2 4-trifluorometylofenyl -C-C- H H
24 2 3,5-dimetylofenyl -C-C- h H
25 2 4-chlorofenyl -OC- H H
26 2 3-pirydyl -C-C- H H
27 2 2-metylofenyl -C-C- H H
28 2 Z. 3-hydroksyfenyl -C-C- H H
29 2 4-hydroksyfenyl -OC- H H
30 2 5-metylo-2-tiazolil -C-C- H H
30a 2 2-tiazolil -C-C- H H
31 2 4-metylo-2-tiazolil -C-C- H H
32 2 4,5-dimetylo-2-tiazolil -C-C- H H
33 2 5-metylo-2-tienyl -C-C- H Et
33a 2 2-tienyl -C-C- H Et
34 2 5-metylo-2-tienyl -C-C- H H
34a 2 2-tienyl -C-C- H H
35 2 4-metylofenyl -CONH- H Et
36 2 4-metylofenyl -CONH- H H
37 2 4-metylofenyl -COO- H Et
38 2 4-metylofenyl -COO- H (CH2)2Si (CH)
39 2 4-metylofenyl -COO- H H
40 2 4-metylofenyl -CONH- F Et
41 2 4-metylofenyl -CONH F H
42 2 4-metylofenyl -CSNH- H Et
43 2 4-metylofenyl -CSNH- H H
44 2 4-metylofenyl -CH=CH- H Et
45 2 4-metylofenyl -CH=CH- H H
188 705 c d tabeli 1
1 2 3 4 5 6
46a 2 4-metylofenyl -N=N- H Et
46b 2 4-metylofenyl -N=N- H H
47 3 4-metylofenyl -C=C- H Et
48 3 4-metylofenyl -C=C- H H
49 4 4-metylofenyl -C-C- H Et
50 4 4-metylofenyl -c^c- H H
51 5 4-metylofenyl - - Et
52 5 4-metylofenyl - - H
60 2 4-metylofenyl -C=C- H H
60a 2 fenyl -C=C- H H
61 2 4-t-butylofenyl -C=C- H H
62 2 4-metylofenyl -cssnh F Et
63 2 4-metylofenyl -CSNH- F H
64 5a 4-metylofenyl - - Et
65 5a 4-metylofenyl - - H
66 2 2-fUryl -CsC- H Et
67 2 2-fUryl -C=C- H H
Jak wspomniano powyżej, związki według niniejszego wynalazku są antagonistami jednego lub kilku podtypów receptora RAR. Oznacza to, że związki według wynalazku wiążą się z jednym lub kilkoma podtypami receptora RAR, ale nie uruchamiają odpowiedzi włączanej przez agonistów tych samych receptorów. Niektóre związki według niniejszego wynalazku są antagonistami wszystkich trzech podtypów receptora RAR (RAR-α, RAR-β i RAR-γ i nazywa się je „ogólnymi antagonistami RAR”. Inne związki są antagonistami tylko jednego lub dwu pydtzpók receptora RAR, natomiast niektóre związki według wynalazku są częściowymi agonistami jednego lub dwu podtypów receptora RAR i antagonistami pozostałych podtypów. Związki według wynalazku nie wiążą się z receptorami RXR, tak więc nie są agonistami ani antagonistami RXR.
W zależności od miejsca i natury nikpyżądśnych skutków ubocznych, które trzeba stłumić lub złagodzić, stosuje się związki według wynalazku, które mogą być antagonistami tylko jednego lub dwu podtypów receptora RAR. Niektóre związki według wynalazku mogą być częściowymi agonistami jednego lub dwu podtypów receptora RAR i antagonistami pozostałych podtypów. Takie zwiąrnr są, ogólnie mówiąc, przydatne, jeśli działanie antagonistyczne występuje wobec tego podtypu (lub podtypów) receptora RAR który(e) jest (są) głównie odpywiedriślne za zatrucie przy przedawkowaniu lub za niepożądane skutki uboczne. Należy w związku z tym zauważyć, że ogólnie mówiąc, związek uważa się za antagonistę danego podtypu receptora, jeśli w poniżej opisanych próbach kotranfekcji związek nie powoduje znaczącej transkrypcyjnej aktywacji regulowanego receptorem genu reporterowego, ale tym niemniej wiąże się z receptorem z wartością Kd mniejszą niż około 1 μΜ.
Badanie rwiąlnu jako antagonisty RAR i możliwość jego stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można prowadzić w następujących próbach.
Próba transaktywacji chimerycznego receptora testująca podobną do agonisty aktywność dla podtypów receptora RAR-α, RAR-β, RAR-γ, RKR-α, oparta na pracy ypublinywśnej przez Feignera P. L. i Holma M., Focus tom 11, nr 2 (1989) jest opisana szczegółowo
188 705 w zgłoszeniu PCT nr WO94/17796, opublikowanym 18 sierpnia 1994. Ta publikacja jest odpowiednikiem zgłoszenia patentowego USA nr 08/016404, złożonego 11 lutego 1993, na które udzielono patentu USA nr 5455265. Związek nie powinien powodować znaczącej aktywacji reporterowego genu przez dany podtyp receptora (RAR-a, RAR-β lub RAR-γ) w tej próbie, w celu zakwalifikowania jako antagonisty RaR przydatnego w niniejszym wynalazku.
Próbę transaktywacji holoreceptora i próbę wiązania liganda mierzącą podobną do antagonistycznej/agonistycznej aktywności związków według wynalazku, lub ich zdolność do wiązania z kilkoma podtypami receptora retinoidowego, odpowiednio, opisano w zgłoszeniu PCT nr WO93/11755 (szczególnie na str. 30 - 33 i 37 - 41) opublikowanym 24 czerwca 1993. Poniżej opisano także próbę transaktywacji holoreceptora.
Próba transaktywacji holoreceptora
Komórki CV1 (5000 komórek/studzienkę) transfekowano reporterowym plazmidem RAR MTV-TREp-LUC (50 ng) wraz z jednym z wektorów ekspresji RAR (10 ng) w zautomatyzowanym układzie 96 studzienek metodą procedury z fosforanem wapnia Heymana i in., Cell 68: 397 - 406. Dla prób transaktywacji RXR-a i rXr^, zastosowano odpowiedzialny za RXR reporterowy plazmid CRBPII-tk-LUC (50 ng) wraz z odpowiednimi wektorami ekspresji RXR (10 ng) dokładnie jak opisał Heyman i in. powyżej, i Allegretta i in. J. Biol. Chem. 268: 26625 - 26633. Dla prób transaktywacji RXR-O zastosowano odpowiedzialny za RXR reporterowy plazmid CPRE-tk-LUC (50 mg) wraz z wektorem ekspresji RXR-p (10 mg) jak opisano powyżej. Te reportery zawierają elementy DRI z ludzkiego CRBPII i pewne elementy DRI z promotora, odpowiednio (patrz Mangelsdorf i in. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, str. 319 - 349, Raven Press Ltd., New York i Heyman i in., cytowane powyżej). Jako wewnętrznej kontroli w transfekcji użyto wektora ekspresji β-galaktozydazy (50 ng) w celu znormalizowania odchyleń w wydajności transfekcji. Komórki transfekowano w trzech próbkach przez 6 godzin, następnie inkubowano z retinoidami przez 36 godzin i ekstrakty testowano na aktywność lucyferazy i β-galaktozydazy. Szczegółową doświadczalną procedurę transaktywacji holoreceptora opisał Heyman i in., powyżej, i Allegretta i in. cytowane powyżej. Wyniki otrzymane w tej próbie oraz w próbie transaktywacji chimerycznego receptora wyrażono jako liczby EC50· Wyniki próby wiązania liganda wyrażono w liczbach Kd. Patrz Cheng i in. Biochemical Pharmacology 22: 3099-3108.
Związek nie powinien powodować znaczącej aktywacji genu reporterowego przez dany podtyp receptora (RAR-a, RAR-β lub RAR-γ) w próbie transaktywacji holoreceptora, aby można było zakwalifikować go jako antagonistę RAR z przydatnością w niniejszym wynalazku. Na koniec związek powinien wiązać się z co najmniej jednym z podtypów receptora RAR w próbie wiązania liganda z Kd poniżej około 1 pM (Kd < 1 pM), aby mógł działać jako antagonista podtypu związanego receptora, jeśli ten sam podtyp receptora nie jest znacząco aktywowany przez związek.
W tabeli 2 poniżej przedstawiono wyniki próby transaktywacji holoreceptora, w tabeli podano skuteczność (procentową) w tej próbie testowanego związku względem kwasu w całości trans retinowego, dla pewnych przykładowych związków według wynalazku. W tabeli 4 przedstawiono wyniki próby wiązania liganda dla pewnych przykładowych związków według wynalazku.
Tabela2
Próba transaktywacji holoreceptora
Związek nr EC50 (nanomole)
RARα RAR β RARy RXRa RXR β RXRy
1 2 3 4 5 6 7
18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
188 705
c.d tabeli 2
1 2 3 4 5 6 7
23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
26 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
27 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
28 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
29 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
31 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
32 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
34 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
39 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
45 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
46b 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
52 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
60 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
61 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
63 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,0 w tabeli 2 wskazuje, że związek w badaniu tym ma mniejszą o 20% aktywność (skuteczność) niż kwas całkowicie trans retinowy
Tabela 3
Skuteczność próby transaktywacji (% aktywności RA)
Związek nr RARa RARP RARy RXRa rxr3 RXRy
1 2 3 4 5 6 7
18 4,00 1,00 0,00 2,00 10,00 1,00
19 0,00 5,00 3,00 0,00 9,00 4,00
20 3,00 4,00 0,00 4,00 0,00 3,00
21 2,00 200 2,00 3,00 0,00 3,00
22 0,00 0,00 2,00 1,00 0,00 2,00
23 0,00 8,00 3,00 1,00 0,00 4,00
24 3,00 7,00 4,00 1,00 0,00 3,00
25 200 3,00 3,00 5,00 0,00 3,00
26 1,00 6,00 0,00 2,00 0,00 3,00
27 9,00 14,00 6,00 2,00 0,00 4,00
28 2,00 10,00 2,00 2,00 0,00 3,00
29 0,00 6,00 11,00 0,00 6,00 2,00
30 3,00 5,00 1,00 0,00 9,00 3,00
188 705
c.d. tabeli 3
1 2 3 4 5 6 7
31 4,00 14,00 2,00 1,00 8,00 6,00
32 0,00 2,00 2,00 1,00 0,00 2,00
34 3,00 5,00 2,00 1,00 0,00 3,00
36 1,00 5,00 0,00 1,00 7,00 2,00
39 1,00 7,00 9,00 2,00 0,00 1,00
41 3,00 5,00 6,00 1,00 0,00 3,00
45 2,00 0,00 7,00 3,00 8,00 0,00
46b 4,00 5,00 3,00 2,00 0,00 4,00
52 0,00 15,00 3,00 0,00 0,00 10,00
60 0,00 1,00 4,00 3,00 0,00 3,00
61 200 200 0,00 1,00 0,00 3,00
63 2,00 2,00 7,00 1,00 0,00 1,00
Tabela 4
Próba wiązania ligandów
Związek nr Kd (nanomole)
RARa RARP RARy RXRa RXRp RXRy
1 2 3 4 5 6 7
18 24,00 11,00 24,00 0,00 0,00 0,00
19 565,00 210,00 659,00 0,00 0,00 0,00
20 130,00 22,00 34,00 0,00 0,00 0,00
21 16,00 9,00 13,00 0,00 0,00 0,00
22 24,00 17,00 27,00 0,00 0,00 0,00
23 32,00 25,00 31,00 0,00 0,00 0,00
24 699,00 235,00 286,00 0,00 0,00 0,00
25 50,00 17,00 20,00 0,00 0,00 0,00
26 40,00 31,00 36,00 0,00 0,00 0,00
27 69,00 14,00 26,00 0,00 0,00 0,00
28 669,00 77,00 236,00 0,00 0,00 0,00
29 234,00 48,00 80,00 0,00 0,00 0,00
30 683,00 141,00 219,00 0,00 0,00 0,00
31 370,00 52,00 100,00 0,00 0,00 0,00
32 0,00 89,00 169,00 0,00 0,00 0,00
34 52,00 30,00 17,00 0,00 0,00 0,00
36 13,00 550,00 0,00 0,00 0,00 0,00
188 705
c.d tabeli 4
1 2 3 4 5 6 7
39 67,00 38,00 113,00 0,00 0,00 0,00
41 5,10 491,00 725,00 0,00 0,00 0,00
45 12,00 2,80 17,00 0,00 0,00 0,00
46 250,00 3,70 5,80 0,00 0,00 0,00
52 60,00 63,00 56,00 0,00 0,00 0,00
60 1,50 1,90 3,30 0,00 0,00 0,00
61 96,00 15,00 16,00 0,00 0,00 0,00
63 133,00 3219,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,0 w tabeli 4 wskazuje wartość większą niż 1000 nM.
Jak widać z wyników testów podsumowanych w tabelach 2, 3 i 4, wskazane tam przykładowe związki według wynalazku są antagonistami podtypów receptora RAR, ale nie wykazują powinowactwa do podtypów receptora RXR (inne związki według wynalazku mogą być antagonistami pewnych, ale nie wszystkich podtypów receptora RAR i agonistów pozostałych podtypów RAR). Dzięki takim właściwościom, związki według wynalazku można stosować do blokowania aktywności agonistów RAR w biologicznych próbach. U ssaków, w tym ludzi, związki według wynalazku mogą być podawane razem z agonistami RAR i dzięki farmakologicznej selektywności lub miejscowej specyficzności dostarczania, preferencyjnie zapobiegają niepożądanym efektom agonistów RAR. Związki według wynalazku można także stosować do leczenia przedawkowania witaminy A, ostrego lub przewlekłego, powstałego wskutek nadmiernego poboru witaminy A lub spożywania wątroby pewnych ryb łub zwierząt, które zawierają duże ilości witaminy A. Ponadto związki według wynalazku można także stosować do leczenia ostrej lub przewlekłej toksyczności spowodowanej lekiem retinoidowym. Wiadomo, że toksyczności obserwowane przy zespole hiperwitaminozy A (ból głowy, łuszczenie skóry, toksyczność kości, dyslipidemie) są podobne lub identyczne z toksycznością obserwowaną z innymi retinoidami, co sugeruje wspólny biologiczny powód, to jest aktywację RAR. Ponieważ związki według niniejszego wynalazku blokują aktywację RAR, są przydatne do leczenia wspomnianej toksyczności.
Związki według wynalazku mogą zdecydowanie zapobiegać podrażnieniu skóry indukowanemu przez retinoidy agonistyczne RAR, gdy związek według wynalazku jest miejscowo podawany razem na skórę. Podobnie, związki według wynalazku można podawać miejscowo na skórę, w celu zablokowania podrażnienia skóry, u pacjentów lub zwierząt, którym podawano agonistyczne związki RAR układowo. Związki według wynalazku mogą przyspieszać wychodzenie z wcześniejszej retinoidowej toksyczności, mogą blokować hipertrigłicerydemię powodowaną przez współpodawane retinoidy, oraz mogą blokować toksyczność kości indukowaną przez agonistę RAR (retinoid).
Ogólnie, w leczniczych zastosowaniach u ssaków według niniejszego wynalazku, antagonistyczne związki można podawać dojelitowo łub miejscowo jako odtrutkę na witaminę A, prekursora witaminy A, lub odtrutkę na toksyczność retinoidową powstałą wskutek przedawkowania lub zbyt długiego działania, po przerwaniu pobierania czynnika sprawczego (prekursora witaminy A lub innego retinoidu). Alternatywnie, antagonistyczne związki podaje się razem z lekami retinoidowymi według wynalazku, w sytuacjach, gdy retinoid daje korzyść terapeutyczną, i gdy współpodawane antagonisty łagodzi lub eliminuje jeden lub więcej niepożądanych skutków ubocznych retinoidu. Przy takim stosowaniu antagonistę można podawać w sposób specyficzny dla miejsca, np. jako miejscowo nakładany krem lub mleczko, podczas gdy współpodawany retinoid można podawać dojelitowo.
W leczniczych zastosowaniach według niniejszego wynalazku antagonistyczne związki podaje się jako kompozycje farmaceutyczne w postaciach użytkowych, takich jak tabletki,
188 705 pigułki, kapsułki, roztwory, zawiesiny, kremy, maści, żele, balsamy, mleczka i tym podobne, stosując znane w tej dziedzinie farmaceutycznie dopuszczalne zarobki i nośniki. Np. wytwarzanie miejscowych preparatów dobrze opisano w Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Do stosowania miejscowego antagonistyczne związki można także podawać jako proszek lub aerozol, szczególnie aerozol. Jeśli lek ma być podawany układowo, może być sporządzony jako proszek, pigułka, tabletka lub podobne albo jako syrop lub eliksir odpowiedni do podawania doustnego. Do podawania dożylnego lub dootrzewnowego związek antagonistyczny sporządza się jako roztwór lub zawiesinę nadającą się do podawania przez iniekcję. W pewnych przypadkach może być przydatne sporządzenie związków antagonistycznych w postaci czopków lub preparatów o przedłużonym uwalnianiu do umieszczenia pod skórą lub wstrzykiwania dożylnego.
Związki antagonistyczne będą podawane w leczniczo skutecznej dawce. Lecznicze stężenie jest stężeniem, przy którym, uzyskuje się złagodzenie konkretnego stanu (takiego jak toksyczność wskutek działania retinoidu lub witaminy A, lub skutek uboczny leku retinoidowego) lub zahamowanie jego rozwoju. Należy rozumieć, że gdy współpodaje się związki antagonistyczne w celu zablokowania indukowanej retinoidem toksyczności lub skutków ubocznych, związki antagonistyczne stosuje się profilaktycznie do zapobiegania wystąpieniu konkretnego stanu, takiego jak podrażnienie skóry.
Odpowiednie lecznicze lub profilaktyczne stężenie będzie się zmieniać się w zalezności od leczonego stanu i w pewnych przypadkach w zależności od ostrości stanu leczonego i podatnością pacjenta na leczenie. A zatem, dane stężenie może nie być przydatne dla konkretnego pacjenta i może wymagać modyfikacji w zależności od danej przewlekłej lub ostrej toksyczności retinoidowej lub pokrewnego stanu leczonego. Takie stężenie można ustalić drogą, eksperymentalną. Jednakże można przewidywać, że do podawania miejscowego skuteczne stężenie uzyska się przy zawartości 0,01 i 1,0 mg związku antagonistycznego na ml preparatu. Przy podawaniu układowym leczniczo skuteczna dawka może mieści się w zakresie od 0,01 do 5 mg na kg ciężaru ciała.
Podstawą przydatności antagonistów RAR do zapobiegania lub leczenia indukowanej przez agonistę RAR toksyczności jest współzawodniczącą inhibicja aktywacji receptorów RAR przez agonistów RAR. Główną różnicą między tymi dwoma zastosowaniami antagonistów RAR jest obecność lub nieobecność wcześniejszej toksyczności retinoidowej. Większość przykładów opisanych poniżej odnosi się do stosowania retinoidów do zapobiegania retinoidowej toksyczności, lecz ogólne sposoby opisane tutaj stosują się także do leczenia wcześniejszej toksyczności retinoidowej.
Opis doświadczeń pokazujących zastosowanie antagonistów RAR do zapobiegania lub leczenia toksyczności retinoidowej i/lub skutków ubocznych leków retinoidowych
Przykład 1: podrażnienie skóry indukowane przez miejscowo podawanego agonistę traktuje się miejscowo nakładanym antagonistą
Kwas 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylonaftalen-2-ylo)propen-l-ylo]benzoesowy, oznaczony AGN 191183, znany jest jako silny agonista RAR (patrz np. część opisowa i fig. 2b opisu patentowego USA nr 5324840). (Liczba „AGN” jest przyjętym numerem odnośnikowym stosowanym przez właściciela niniejszego wynalazku do identyfikacji związków).
Kwas 4-[(5,6-dihyd!O-5,5-dimetylo-8-(fenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (AGN 192869, oznaczony też jako związek 60a) jest związkiem, którego wytwarzanie opisano poniżej. Związek ten jest antagonistą RAR.
Podrażnienie skóry indukowane przez agonistę RAR, AGN 191183, podawanego miejscowo, można zablokować antagonistą RAR, AGN 192869, także podawanym miejscowo u bezwłosych myszy.
Dokładniej, podrażnienie skóry mierzono na skalę półilościową przez dzienną subiektywną ocenę łuszczenia i ścierania skóry. Jedna liczba, ocena miejscowego podrażnienia, sumuje podrażnienie skóry indukowane u zwierzęcia podczas doświadczenia. Ocenę miejscowego podrażnienia oblicza się jak następuje. Ocena miejscowego podrażnienia jest sumą algebraiczną złozonej oceny łuszczenia i złozonej oceny ścierania. Złożone oceny wahają się od 0-9 i 0-8 dla łuszczenia i ścierania, odpowiednio, i uwzględniającą maksymalną ostrość, czas wystąpienia i średnią ostrość zaobserwowanego łuszczenia i ścierania.
188 705
Ostrość łuszczenia ocenia się w skali 4-punktowej, a ostrość ścierania w skali 4-punktowej, przy czym wyższa ocena oznacza większą ostrość. Składnik złożonej oceny w odniesieniu do maksymalnej ostrości ocenianego stanu stanowi najwyższa dzienna ocena ostrości przypisana danemu zwierzęciu podczas obserwacji.
Dla składnika złożonej oceny w odniesieniu do czasu wystąpienia zmiany chorobowej, ocenę od 0 do 4 przypisuje się jak następuje:
Tabela 5
Czas do pojawienia się łuszczenia lub ścierania o ostrości 2 lub wyzszej
Dni Ocena czasu do pojawienia się zmiany
8 0
6-7 1
5 2
3-4 3
1-2 4
Składnik złożonej oceny w odniesieniu do średniej ostrości jest sumą ocen dziennego łuszczenia lub ścierania podzieloną przez liczbę dni obserwacji. Pierwszy dzień leczenia nie jest liczony, ponieważ związek nie mógł zadziałać w czasie pierwszego stosowania.
W celu obliczenia złożonej oceny łuszczenia i ścierania sumuje się oceny średniej ostrości i do czasu pojawienia się zmiany i dzieli przez 2. Wynik dodaje się do oceny maksymalnej ostrości. Złożone oceny łuszczenia i ścierania sumuje się następnie otrzymując ogólną ocenę miejscowego podrażnienia. Każde zwierzę otrzymuje ocenę miejscowego podrażnienia, a wartości wyraża się jako średnie ± standardowe odchylenie indywidualnych ocen dla grupy zwierząt. Wartości zaokrągla się do najbliższej liczby całkowitej.
Samice bezwłosych myszy [CrI:SKH1-hrBR] (8-12 tygodni, n=6) potraktowano miejscowo przez 5 kolejnych dni acetonem, AGN 191183, AGN 192869 lub pewną kombinacją AGN 192869 i 191183. Dawki odpowiednich związków podano w tabeli 6. Na skórę grzbietu nanosi się związki w łącznej objętości 4 ml/kg (~0,1 ml). Myszy obserwowano codziennie i oceniano na łuszczenie i ścieranie do 3 włącznie dni po ostatnim traktowaniu, to jest przez 8 dni.
Tabela 6
Plan i wyniki doświadczenia, przykład 1
Grupa Dawka AGN 191183 (mg/kg dziennie) Dawka AGN 192869 (mg/kg dziennie) Stosunek molowy 192869:191183 Ocena miejscowego podrażnienia
A 0,000 0 - 0±0
B 0,025 0 - 8 ± 2
C 0,025 0,06 2:1 5 ± 2
D 0,025 0,30 10:1 2 ± 1
E 0,025 1,5 50:1 1 ±0
F 0,000 1,5 - 0±0
Oceny miejscowego podrażnienia z przykładu 1 podano w tabeli 6. Ani aceton (nośnik), ani AGN 192869 (antagonista) w dawce 1,5 mg/kg dziennie (grupa F) nie spowodował widocznego miejscowego podrażnienia. AGN 191183, agonista rAr, spowo dował umiarkowane miejscowe podrażnienie w dawce 0,025 mg/kg dziennie. Jednakże indukowane AGN i88 705 i9 i9ii83 miejscowe podrażnienie było hamowane w sposób zależny od dawki przez AGN i92869, z prawie całkowitym zniesieniem podrażnienia w obecności 50-krotnego molowego nadmiaru AGN i92869. Wykazuje to, że miejscowy antagonista RAR blokuje podrażnienie skóry powodowane przez miejscowego agonistę RAR. Całkowitą blokadę indukowanego przez agonistę RAR podrażnienia skóry można osiągnąć przy niższych stosunkach molowych antagonisty do agonisty, gdy antagoniści RAR są silni, jak kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (AGN i93i09, określany tutaj także w zgłoszeniu jako związek 60).
Przykład 2: podrażnienie skóry indukowane przez doustnie podawanego agonistę blokuje się miejscowo nakładanym antagonistą
W tym przykładzie zastosowano silnego agonistę RAR, AGN i9ii83 (kwas 4-[(E)-2(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetraetylonaftalen-2-ylo)propen-i-ylo]-benzoesowy) i silnego antagonistę RAR, kwas 4-|(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (AGN i93i09, związek 60), a ciężary ciała doświadczalnych zwierząt (myszy) stanowiły znacznik działania układowego agonisty RAR.
Grupy samic bezwłosych myszy (8-i2 tygodni, n=6) potraktowano metodą intubacji żołądkowej olejem kukurydzianym lub AGN i9ii83 (0,26 mg/kg) w zawiesinie w oleju kukurydzianym (5 ml/kg). Myszy jednocześnie potraktowano miejscowo na skórze grzbietu nośnikiem (97,6% acetonu/2,4% dimetylosulfotlenku) lub roztworami AGN i93i09 w nośniku (6 ml/kg). Konkretne dawki dla różnych traktowanych grup podano w tabeli 7. Środki podawano codziennie przez 4 kolejne dni. Myszy ważono i oceniano na miejscowe podrażnienie codziennie, jak opisano w przykładzie i do i dnia włącznie po ostatnim zabiegu. Procent zmiany masy ciała obliczono odejmując końcową masę ciała (dzień 5) od początkowej masy ciała (dzień i), dzieląc przez początkową masę ciała i mnożąc przez i00%. Oceny miejscowego podrażnienia ustalono jak opisano w przykładzie 1.
Oceny miejscowego podrażnienia i utratę masy dla różnych grup podano w tabeli 7. Połączone traktowanie miejscowe i podawnie doustne nośników, to jest acetonu i oleju kukurydzianego, odpowiednio, nie spowodowało miejscowego podrażnienia lub utraty ciężarni ciała. Podobnie, połączone podawanie doustnie nośnika i traktowanie miejscowym antagonistą AGN i93i09 nie spowodowało miejscowego podrażnienia lub utraty masy. Sam podany doustnie AGN i9ii83 spowodował znaczną utratę masy i podrażnienie skóry. Spowodowane AGN i9ii83 podrażnienie skóry zmalało znacznie w połączeniu z niższą dawką AGN i93i09 i całkowicie zanikło przy wyższej dawce AGN i93i09. Spowodowana AGN i9ii83 utrata masy także zanikała w sposób zależny od dawki przy miejscowym traktowaniu AGN i93i09, ale blokowanie nie było kompletne. Tak więc, miejscowo podany AGN i93i09 preferencyjnie blokował skórną toksyczność AGN i9ii83. Zapewne niewielkie ilości AGN i93i09 były absorbowane układowo, a więc częściowo blokowały utratę masy indukowaną przez AGN i9ii83. Jednakże taka absorpcja będzie zapewne nawet mniejsza u gatunków z mniej przepuszczalną skórą takich jak ludzie. Alternatywnie hamowanie utraty masy przez AGN i93i09 mogło być spowodowane złagodzeniem indukowanego AGN i9ii83 podrażnienia skóry.
Tabela 7
Plan i wyniki doświadczenia, przykład 2
Grupa Dawka miejscowa AGN 193109 (mg/kg dziennie) Dawka doustnego AGN 191183 (mg/kg dziennie) % spadku (wzrostu) masy Ocena miejscowego podrażnienia
A 0,00 0,00 1 ±2 0±0
B 0,00 0,26 (21 ±6) 8 ± 1
C 0,12 0,28 (9 ±5) 1 ± 1
D 0,47 0,26 (3 ±5) 0 ± 1
E 0,47 0,00 3 ± 3 0 ± 0
188 705
Tak więc, przykład 2 pokazuje, że antagonistów RAR podawanych miejscowo można stosować w celu zablokowania preferencyjnie podrażnienia skóry indukowanego przez agonistę RAR podawanego doustnie.
Przykład 3: miejscowo podawany antagonista przyspiesza wychodzenie z retinoidowej toksyczności '
W tym przykładzie utratę masy wywołuje się przez miejscowe traktowanie agonistą RAR AGN 191183, a następnie badane zwierzęta traktuje się miejscowo nośnikiem lub antagonistą RAR AGN 193109.
Samice bezwłosych myszy (8-12 tygodni, n=5) potraktowano miejscowo AGN 191183 (0,13 mg/kg dziennie) w nośniku (97,6% acetonu/2,4% DMSO, 4 ml/kg) codziennie przez 2 dni. Grupy tych samych myszy (n=5) potraktowano następnie miejscowo nośnikiem lub AGN 193109 w nośniku (4 ml/kg) codziennie przez 3 kolejne dni zaczynając od dnia 3. Myszy ważono w dniach 1-5 i w dniu 8. Masy ciała wyraża się jako średnią ± odchylenie standardowe. Średnie porównuje się statystycznie stosując niesparowany dwubiegunowy test t. Różnice uznawano za znaczące przy P < 0,05.
Tabela 8 Wyniki, przykład 3
Traktowanie (dni 3 - 5 ) Masa ciała (g)
Dzień 1 Dzień 2 Dzień 3 Dzień 4 Dzień 5 Dzień 8
nośnik 24,5±1,5 23,9±1,2 21,4±1,2 20,3±1,7 21,0±1,4 24,7±1,0
AGN 193109 23,9±1,0 23,5±1,2 21,4±0,6 22,2±0,7 22,8±0,8 25,0±1,1
Zmiany masy ciała w przykładzie 3 podano w tabeli 8. Masy ciała w obu grupach myszy obniżyły się równolegle w dniach 2 i 3 w wyniku traktowania AGN 191183 w dniach 1 i 2. Masy ciała w dwu grupach nie były istotnie różne w dniach 1, 2, lub 3. Jednakże traktowanie AGN 193109 znacząco zwiększyło masy ciała w porównaniu z traktowaniem nośnikiem w dniach 4 i 5. Dane te wskazują, że wychodzenie z indukowanej AGN 191183 utraty masy ciała przyspieszało traktowanie AGN 193109. Masy ciała nie były istotnie różne pomiędzy dwoma grupami myszy w dniu 8, wskazując na pełne ozdrowienie osiągalne w obu grupach po dostatecznym czasie. Tak więc, antagoniści RAR są skuteczni w łagodzeniu indukowanej agonistą RAR toksyczności nawet jeśli indukowana przez agonistę RAR toksyczność poprzedza traktowanie antagonistą RAR, to jest, w scenariuszu zatrucia agonistą RAR.
Przykład 4: doustnie podawany antagonista blokuje hipertrrglicerydemię indukowaną przez doustnie współpodawanego agonistę retinoidu
Kwas 5-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentametylonaftalen-2-ylo)propen-1-ylo]-2tiofenokarboksylowy jest znanym pantagonistą RAR/RKR (patrz opis patentowy USA nr 5324840 kolumna 32) i jest oznaczany AGN 191659. Związku tego użyto doustnie do indukowania ostrej hipenriglicerydemii u szczurów, a AGN 193109 (związek 60) był współpodawany doustnie w celu zablokowania indukowanej AGN 191659 hipertriglicerydemii.
Samce szczurów Fischer (6-7 tygodni, n=5) potraktowano metodą intubacji żołądkowej olejem kukurydzianym (nośnik), AGN 191659, AGN 193109 lub kombinacją AGN 191659 i AGN 193109. AGN 191659 i AGN 193109 podawano jako subtelną zawiesinę w oleju kukurydzianym. Plan doświadczenia, w tym dawki, podano w tabeli 9.
Krew odciągnięto z żyły głównej dolnej pod narkozą dwutlenkiem węgla. Surowicę oddzielono od krwi przez powolne odwirowanie. Łączne triglicerydy surowicy (triglicerydy plus gliceryna) mierzono w standardowej próbie spektrofotometrycznej punktu końcowego w dostępnym w handlu zestawie i adaptowanym do układu 96-studzienkowego. Poziomy triglicerydów surowicy wyraża się jako średnią± odchylenie standardowe.
188 705
Średnie porównywano statystycznie metodą jednokierunkowej analizy wariancji, następnie testem Dunnetta, jeśli znajdowano znaczące różnice. Różnice uważano za znaczące przy P < 0,05.
Jak przedstawiono w tabeli 9, AGN 191659 sam powodował znaczące podwyższenie poziomu triglicerydów w surowicy względem traktowania nośnikiem. Sam AGN 193109 nie zwiększał znacząco poziomu triglicerydów w surowicy''. Ważne jest, że kombinacja AGN 193109 i AGN 191659 w stosunkach molowych 1:1 i 5:1 obniżała pyriym triglickrzdów w surowicy do wartości nie różniących się znacząco od nyntyrlnych.
Tabela 10
Plan i wyniki doświadczenia, przykład 4
Grupa Traktowanie (dawka) Triglicerydy w surowicy (mg/dl)
A nośnik 55,0 ± 3,1
B AGN 193109 (19,6 mg/kg) 52,4 ± 6,3
C AGN 191659 (3,7 mg/kg) 122,5 ±27,6
D AGN 193109 (3,9 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 55,7 ± 14,7
E AGN 193109 (19,6 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 72,7 ± 8,9
Przykład 4: pokazuje, że antagonistę RAR można stosować w celu zablokowania hypkrtrigłicerydkmli indukowanej przez współprdawane retinoidy.
Przykład 5: pozajelitowo podawany antagonista blokuje toksyczność kości indukowaną przez pozajelitowe współpodawśnik ^^l^^^i^idowego agonisty
Przykład 5: pokazuje, że antagonista RAR może blokować toksyczność kości indukowaną przez agonistę RAR. W tym przykładzie AGN 193109 stosuje się w celu zablokowania przedwczesnego zamykania płytki nasadowej powodowanego przez współpodawśnkgo agonistę RAR, AGN 191183, u świnek morskich.
Grupy samców świnek morskich Hartley (~3 tygodni, n=4) otrzymały dootrzewnowy wszczep pomp osmot^cznych zawierających nośnik (20% drmetylosulfotlennu/80% poli(glikylu ktylenowego-300), AGN 191183 (0,06 mg/ml), lub AGN 191183 (0,06 mg/ml) w połączeniu z AGN 193109 (0,34 mg/ml). Pompy osmotyczne dostarczają, według wytwórcy ~5 μΐ roztworu na godzinę ciągle przez 14 dni.
Zwierzęta uśpiono dwutlenkiem węgla 14 dni po wszczepieniu. Lewą piszczel usunięto i umieszczono w 10% buforowanej formalinie. Piszczele odwapniono działaniem roztworu kwasu mrówkowego/formaliny przez 3-4 dni i wykonano przekroje parafinowe. Przekroje zabarwiono bkmatoksyliną i enzyną standardowymi sposobami. Zbadano bliską płytkę nasadową piszczeli i oceniono jako zamkniętą lub niezamkniętą. Zamknięcie płytką nasadową definiuje się w tym celu jako dowolną przerwę ciągłości chrząstki nasadowego wzrostu płytki, to jest zastąpienie przez kość i/lub tkankę fibroblastową.
Żadna z czterech potraktowanych nośnikiem świnek morskich nie wykazywała zamykania płytki nasadowej przed końcem doświadczenia. Spodziewano się tego, ponieważ bliska płytka nasadowa świnki morskiej nie zamyka się zwykle przed osiągnięciem wieku co najmniej 10 miesięcy. Wszystkie cztery potraktowane AGN 191183 świnki morskie wykazały częściowe lub całkowite zamknięcie płytki nasadowej. Jednakże żadna ze świnek morskich pytiakΐϋwarlzch kymbinacją AGN 191183 i AGN 193109 nie wykazywała zamknięcia płytki nasadowej. Tak więc AGN 193109 w 5-krotnzm molowym nadmiarze całkowicie blokuje indukowaną AGN 191183 toksyczność kości, gdy te związki współpydawśny pozajelitowe.
Związki antagonistyczne RAR
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-B-(4-metylofenylo)^-naftślenylo)ktznylo]benzoesowy (AGN 193109, związek 60) i kwas d-^ó-dihydro-S^-dimetylo^-fenykO-i-naftalknz'lo)etynylo]bcnzoesowz' (AGN 192869, związek 60a) są przykładami antagonistów RAR,
188 705 których użyto w powyżej opisanych testach na zwierzętach do blokowania receptorów RAR według niniejszego wynalazku.
Przykładowe antagonistyczne związki RAR o wzorze 1 można wytwarzać zilustrowanymi tutaj metodami syntezy chemicznej.
Schemat reakcji 1
pTsOH
Δ v
k2co3
MeOH v
Wzór 9
Wzór 16
Schemat reakcji 1 ilustruje syntezę związków o wzorze la, gdzie grupa Z jest grupą etynylową (-OC-) i X oznacza [C(Ri)2]n gdzie n oznacza 1. Innymi słowy, schemat reakcji 1 ilustruje syntezę podstawionych etynylem pochodnych dihydronaftalenu według niniejszego
188 705 wynalazku. Zgodnie z tym schematem, tetrahydronaf.alen-1-onowy związek o wzorze 6 bromuje się z wytworzeniem bromowej pochodnej o wzorze 7. Związki o wzorze 6 już zawierają żądane podstawniki R1, R2 i R3, jak zdefiniowano je w związku o wzorze la. Korzystnym przykładem związku o wzorze 6 jest 3,4-dihydro-4,4-dimetylo-1(2H)-naitalenon, opisany w literaturze chemicznej (Arnold i in. J. Am. Chem. Soc. 69: 2322 - 2325 (1947)). Korzystną drogę syntezy związku z 3-bromo-3-fenylopropanu opisano także w części doświadczalnej niniejszego zgłoszenia.
Związki o wzorze 7 poddaje się następnie reakcji z (tr^im^t^t^!l^)sililo)acetylenem z wytworzeniem (trimetylosililo)-etynylo-podstawionego 3,4-dihyd^^na:P^i^]^l^]^-1(2H)-onowych związków o wzorze 8. Reakcję z (trimetylosililo)acetylenem prowadzi się zwykle z ogrzewaniem (około 100°C) w obecności jodku miedziawego, odpowiedniego katalizatora, typowo mające go wzór Pd(PPh3)2Cl2, akceptora kwasu (takiego jak trietyloamina) w atmosferze gazu obojętnego (argonu). Typowy czas reakcji wynosi około 24 godziny. (Tnmetyk)sililo)etynylo podstawione 3,4-dihydronaftalen-1 (2H)-ony o wzorze 8 poddaje się następnie reakcji z zasadą (wodorotlenek potasu lub węglan potasu) w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol, z wytworzeniem etynylo-podstawionych 3,4-dihydro-1-naftalen-1(2H)onów o wzorze 9. Związki o wzorze 9 sprzęga się następnie z aromatycznym lub heteroaromatyeznym reagentem Xj-Y(R2)-A-B' (wzór 10) w obecności jodku miedziawego, odpowiedniego katalizatora, typowo Pd(Pph3)2Cl2, akceptora kwasu, takiego jak trietyloamina, w atmosferze gazu obojętnego (argon). Alternatywnie, sól cynkową (lub inną odpowiednią sól metalu) związków o wzorze 9 można sprzęgać z reagentami o wzorze 70 w obecności Pd(PPh);,)4 lub podobnego kompleksu. Typowo, reakcję sprzęgania z reagentem Xt-Y(R2)-A-B' (wzór 10) prowadzi się w temperaturze pokojowej lub nieco podwyższonej. Mówiąc ogólnie, sprzęganie pomiędzy pochodną etynyloaryJową lub jej solą cynkową i podstawionym chlorowcem ar^towym lub heteroatylowym związkiem, takim jak reagent o wzorze 10, opisano w opisie patentowym USA nr 5284456. Związki o wzorze 11 są prekursorami przykładowych związków według wynalazku, lub ich pochodnymi zabezpieczonymi na grupie B', z której grupę zabezpieczającą można łatwo usunąć w dobrze znanych reakcjach. Związki o wzorze 11 można także przekształcić w dalsze prekursory przykładowych związków w takich reakcjach i transformacjach, które są dobrze znane. Takie reakcje są pokazane na schemacie reakcji 1 przez konwersję w „homologi i pochodne”. Jedną taką konwersją stosowaną do syntezy kilku przykła dowych związków jest zmydlanie grupy estrowej (gdy B lub B' oznacza ester) z wytworzeniem wolnego kwasu karboksytowego lub jego soli.
Podstawiony chlorowcem arylowy lub heteroar^drn^^'y związek o wzorze 10 można, mówiąc ogólnie, otrzymać w dobrze znanych reakcjach. Przykładem takiego związku jest 4-jodobenzoesan etylu, który można otrzymać, np., przez estryfikację kwasu 4-jodobenzoesowego. Innym przykładem jest 6-jodonikotynian etylu, który można otrzymać prowadząc reakcję wymiany chlorowca 6-chlorokwasu nikotynowego, następnie estryfikację. W celu derywatyzacji związków o wzorze 11 i/lub syntezy arylowych i heteroaryyowych związków o wzorze 10, które można następnie poddać reakcji za związkami o wzorze 9, można wykorzystać poniższe dobrze znane i opublikowane ogólne zasady i metodologię syntezy7.
Kwas karr^(o^i^y^yl^^^v^7 typowo estryfikuje się przez ogrzewanie do wrzenia kwasu w roztworze odpowiedniego alkoholu w obecności kwasowego katalizatora takiego jak chlorowodór lub chlorek tionylu. Alternatywnie, kwas karboksylowy można kondensować z odpowiednim alkoholem w obecności dicykloheksylokarbodiimidu i dimetyloaminopirydyny. Ester odzyskuje się i oczyszcza w konwencjonalny sposób. Acetale i ketale wytwarza się łatwo sposobem opisanym przez Marcha, Advanced Organie Chemistry wyd. 2, McGraw-Hill Book Company, str. 810). Alkohole, aldehydy i ketony mogą być wszystkie zabezpieczone przez utworzenie odpowiednio, eterów i estrów, acetali lub ketali znanymi sposobami takimi jak opisane u McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 i Pn^otecting Groups, wyd. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
W celu zwiększenia wartości n w związkach o wzorze 10 przed dokonaniem reakcji sprzęgania ze schematu 1 (gdzie takie związki odpowiadające wzorowi 30 nie są dostępne w handlu) aromatyczne lub heteroaromatyczne kwasy karboksylowe poddaje się homologacji przez kolejne traktowanie w warunkach Arndta-Eisterta lub innym procedurom homologacji. Alternatywnie, pochodne nie będące kwasami karboksylowymi można także homologować
188 705 odpowiednimi procedurami. Homologowane kwasy można następnie estryfikować ogólnymi procedurami podanymi w poprzednim akapicie.
Związki o wzorze 10, (lub inne związki pośrednie lub przykładowe) gdzie A oznacza grupę alkenylową mającą jedno lub więcej podwójnych wiązań, można wytwarzać np., w schematach syntezy dobrze znanych praktykowi organikowi; np. w reakcji Wittiga i podobnych reakcjach, lub przez wprowadzenie podwójnego wiązania metodą eliminacji chlorowca z kwasu alfa-chlorowco-arylalkilo-karboksylowego, estru lub podobnego karboksyaldehydu. Związki o wzorze 10 (lub inne związki pośrednie lub przykładowe) gdzie grupa A zawiera potrójne (acetylenowe) wiązanie, można wytwarzać w reakcji odpowiedniego aromatycznego metyloketonu z silną zasadą, taką jak diizopropyloamidek litu, z chlorofosforanem dietylu i następnie dodanie diizopropyloamidku litu.
Kwasy i sole związków o wzorze 11 (lub inne związki pośrednie lub przykładowych) można łatwo otrzymać z odpowiednich estrów. Zasadowe zmydlanie zasadą metalu alkalicznego da kwas. Np., ester o wzorze 11 (lub inne związki pośrednie lub przykładowe) można rozpuszczać w polarnym rozpuszczalniku takim jak alkanol, korzystnie w obojętnej atmosferze w temperaturze pokojowej, z około potrójnym molowym nadmiarem zasady, np., wodorotlenku litu lub wodorotlenku potasu. Roztwór miesza się przez dłuższy czas, pomiędzy 15 i 20 godzin, chłodzi, zakwasza i hydrolizat odzyskuje w konwencjonalny sposób.
Amid można wytwarzać dowolnym odpowiednim sposobem aminowania z odpowiednich estrów lub kwasów karboksylowych. Jednym ze sposobów wytwarzania takich związków jest przekształcenie kwasu w chlorek kwasowy i następnie potraktowanie związku wodorotlenkiem amonu lub odpowiednią aminą.
Alkohole wytwarza się przekształcając odpowiednie kwasy w chlorek kwasowy chlorkiem tionylu lub innymi środkami (J. March, Advanced Organic Chemistry, wyd. 2, McGraw-Hill Book Company), następnie redukując chlorki kwasowe borowodorkiem sodu (March, ibid., str. 1124), otrzymując odpowiednie alkohole. Alternatywnie, estry można redukować wodorkiem litowo-glinowym w obniżonej temperaturze. Alkilowanie tych alkoholi odpowiednimi halogenkami alkilu w warunkach reakcji Williamsona (March, ibid., str. 357) daje odpowiednie etery. Te alkohole można przekształcić w estry w reakcji z odpowiednimi kwasami w obecności katalizatorów kwasowych lub dicykloheksylokarbodiimidu i dimetyloaminopirydyny.
Aldehydy można wytwarzać z odpowiednich pierwszorzędowych alkoholi stosując słabe środki utleniające takie jak dwuchromian pirydyniowy w chlorku metylenu (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979), lub dimetylosulfotlenek/chlorek oksalilu w chlorku metylenu (Omura, K., Swern, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)).
Ketony można wytwarzać z odpowiedniego aldehydu przez potraktowanie aldehydu alkilowym odczynnikiem Grignarda lub podobnym reagentem, następnie utlenianie.
Acetale lub ketale można wytwarzać z odpowiedniego aldehydu lub ketonu sposobem opisanym u Marcha, ibid., str. 810.
Związki o wzorze 10 (lub inne związki pośrednie, lub przykładowe) gdzie B oznacza H, można wytwarzać z odpowiednich chlorowcowanych aromatycznych lub heteroaromatycznych związków, korzystnie gdy chlorowiec oznacza I.
Wracając do schematu reakcji 1, związki o wzorze 11 pod daje się reakcji z bis(trimetylosililo)amidkiem sodu i 2-[N,N-bis(trifluorometylosulfanylo)amino]-5-chloropirydyną w obojętnym eterowym rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran, w niskich temperaturach [-78°C i 0°C]. Pokazano to na schemacie reakcji 1, gdzie zwykle nie wydzielaną pośrednią sól sodową pokazano w nawiasach jako wzór 12. Reakcja daje triihiorometylosuifonyioksylowe pochodne reprezentowane wzorem 13. (Tf = SO2 CF3). Związki o wzorze 13 przekształca się następnie w przykładowe związki według wynalazku, pokazane wzorem 14, w reakcji z pochodną metaloorganiczną pochodzącą z arylowego lub hetenoai^;^yl^'^'ego związku R14H, tak że wzór metaloorganicznej pochodnej to R^Met (Met jest jednowartościowym metalem), korzystnie RHLi. (R14 definiuje się jak we wzorze 1.) Reakcję z pochodną metaloorganiczną, korzystnie litową pochodną o wzorze R^Li prowadzi się zwykle w obojętnym eterowym rozpuszczalniku (takim jak tetrahydrofuran) w obecności chlorku cynku (ZnCL) i tetrads(hrfenylofosfmo)pallad(O) (Pd(PPh3)4). Reagent litoorganiczny R^Li, jeśli nie jest dostępny w handlu, można wytwarzać ze związku R14H (lub jego chlorowcowej pochodnej Rpł-X1 gdzie Χ1 oznacza
188 705 chlorowiec) w eterowego typu rozpuszczalniku zgodnie ze znaną praktyką. Zakres temperatur dla reakcji pomiędzy reagentem R^Li i związkami o wzorze 13 jest, mówiąc ogólnie, w zakresie około -78°C do 50°C. Związki o wzorze 14 można przekształcić w dalsze homologi i pochodne w reakcjach przedyskutowanych wyżej.
Pośrednie 7-bromo-tetrahydronaftalen-1-onowe związki o wzorze 7 pokazane na schemacie reakcji 1 można także przekształcić w reagent Grignarda o wzorze R^MgBr (R14 definiuje się jak we wzorze 1) z wytworzeniem trzeciorzędowego alkoholu o wzorze 15. Trzeciorzędowy alkohol odwadnia się działając kwasem z wytworzeniem 3,4-dihydro-7-bromonaftalenowych pochodnych o wzorze 16, które służą jako związki pośrednie do syntezy dodatkowych związków według niniejszego wynalazku (patrz schematy reakcji 6 i 8).
HX
Wzór 17
Br
Schemat reakcji 2
Η+/Δ
NaNfSiMe^^ THF/-78 °C
Wzór 25
Homologi 1 pochodne
N(Tf)2
OTf
(RA» Wzór 24
Y(Rj)
188 705
Na schemacie reakcji 2 podano drogę syntezy związków o wzorze 1, w którym X oznacza S, a grupa Z oznacza etynyl (-C^C-). Substratem dla tego ciągu reakcji jest bromofenol o wzorze 17. Tak więc, związek o wzorze 17, korzystnie parabromofenol, poddaje się reakcji w warunkach zasadowych z kwasem 3-bromokarboksylowym o wzorze 18. Na tym schemacie reakcji symbole mają znaczenia opisane we wzorze 1. Przykładem reagenta o wzorze 18, w którym R3 oznacza wodór, jest kwas 3-bromopropionowy. Reakcja z kwasem 3-bromokarboksylowym o wzorze 18 daje związek o wzorze 19, który cyklizuje się przez potraktowanie kwasem z wytworzeniem 6-bromotiochroman-4-onowej pochodnej (X oznacza S) o wzorze 20. Związki bromowe o wzorze 20 poddaje się następnie zasadniczo tej samej sekwe cji reakcji w analogicznych warunkach jak opisano w schemacie reakcji 1 konwersji związków bromowych o wzorze 7 w związki według wynalazku. Tak więc w skrócie związki bromowe o wzorze 20 poddaje się reakcji z (trimct^losililo)acetylenem z wytworzeniem 6-(tπmetylosllilo)et.ynylo-podstawicłnego-tiochroman-4 onu lub chroman-4-onu o wzorze 21. 6-(tπmetylosilllo)-etynylo-podstawione-tiochroman
4-onowe związki o wzorze 21 poddaje się następnie reakcji z zasadą (wodorotlenek potasu lub węglan potasu) z wytworzeniem etynylo-podstawionych 6-etynylo-podstawionych tiochroman-4-onów o wzorze 22. Związki o wzorze 22 sprzęga się następnie z aromatycznym lub heteroaromatycznym reagentem X]-Y(R? )-A-B' (wzór 10) w warunkach analogicznych do opisanych dla analogicznych reakcji ze schematu reakcji 1, z wytworzeniem związków o wzorze 23.
Związki o wzorze 23 poddaje się następnie reakcji wciąż warunkach analogicznych do podobnych reakcji opisanych na schemacie reakcji 1 z bis(tnmetylosililo)amidkiem sodu i 2[N,N-bis(trifluorometylosulfonylo)amino]-5-chloropirydyną z wytworzeniem pochodnych 4trifluorometylosulfonyloksybenzotiopiranu lub benzopiranu reprezentowanych wzorem 24. Związki o wzorze 24 przekształca się następnie w związki o wzorze 25, w reakcji z metaloorganiczną pochodną pochodzącą od arylowego lub heteroarylowego związku R14H. jak opisano w związku ze schematem reakcji 1.
Podobnie, jak w przypadku stosowania pośrednich 7-bromo-tetrahydronaftalen-1-onO wych związków o wzorze 7 na schemacie reakcji 1, pośrednie fT-bromotiochromanN-onowe związki o wzorze 20 można także stosować do wytwarzania kolejnych związków w zakresie niniejszego wynalazku, jak opisano poniżej, przy schematach reakcji 6, 7 i 8. Związki o wzorze 25 można także przekształcić w dalsze homologi i pochodne, w reakcjach analogicznych do opisanych w związku ze schematem reakcji 1.
188 705
Schemat reakcji 3
Schemat reakcji 3 ujawnia drogę syntezy związków, o wzorze 1, w którym X oznacza [C(Ri)2]n, n oznacza 0, a grupa Z oznacza etynyl (-C-C-). Zgodnie z tym schematem,
6-bromo-2,3-dihydro-1H-inden-1-onową pochodną o wzorze 25 poddaje się sekwencji reakcji rozpoczynając od reakcji z tnmetylosililoacetylenem, analogicznych do reakcji opijanych powyżej w związku ze schematami reakcji 1 i 2, z wytworzeniem, przez związki pośrednie o wzorach 27-30, indenowych pochodnych o wzorze 31. W korzystnej odmianie w zakresie schematu reakcji 3, substratem jest 6-bromo-2,3-dihydrr-3,3-dimetylo--H-inden-l-on dostępny zgodnie z chemiczną literaturą (patrz Smith i in. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123-131). Związki o wzorze 26, takie jak 6ibromo-2,-idihydro-3,3-dimeΐylo-1H-inden-1iOn, można także stosować do syntezy dalszych przykładowych związków do stosowania w niniejszym wynalazku, jak opisano poniżej.
i88 705
Schemat reakcji 4
A1CI3/R]COCI
2. CrO J >
HOA0/AC2O
Rj^MgBr
EtjO
Wzór 33
Homologi i pochodne
Schemat reakcji 4 ujawnia drogę syntezy związków o wzorze ia, w którym Z oznacza -(CRi=CRi)n- n' oznacza 3, a Y oznacza bezpośrednie wiązanie pomiędzy (CRi=CRi)n' B. Tę drogę syntezy opisano dla przykładów, gdzie grupa X oznacza [C(Ri)2]n i n oznacza i (pochodne dihydronaftalenu).
Zgodnie ze schematem reakcji 4 pochodną i,2,3,4-tetrahydronaftalenu o wzorze 32 poddaje się reakcji z chlorkiem kwasowym (R]COCl) w warunjkach Friedela Craftsa, i wytworzony acetylowany produkt utlenia się, np. w reakcji utleniania Jonesa, z wytworzeniem mieszaniny izomerycznych 6- i 7-acetylo-i(2H)-naftalenonowych pochodnych o wzorze 33. W konkretnym korzystnym przykładzie reakcji substratem o wzorze 32 jest i,2,3,4tetrahydro-i,i-dimetylonaftalen (znany związek), który można wytwarzać zgodnie ze sposobem opisanym w części doświadczalnej niniejszego zgłoszenia. 7-acetylo-i(2Il)-na.italenonową pochodną o wzorze 33 poddaje się reakcji z glikolem etylenowym w obecności kwasu dla zabezpieczenia grupy okso egzocyklicznego ketonowego ugrupowania, do ketalowej po188 705 chodnej o wzorze 34. Ketal o wzorze 34 poddaje się następnie reakcji z reagentem Grignarda o wzorze RuMgBr (symbole są zdefiniowane jak we wzorze 1), z wytworzeniem trzeciorzędowego alkoholu o wzorze 35. Następnie dioksolanową grupę zabezpieczającą usuwa się i trzeciorzędowy alkohol odwadnia działaniem kwasu z wytworzeniem 3,4-dihydro-7acetylonaftalenowej pochodnej o wzorze 36. Ketonową grupę związków o wzorze 36 poddaje się reakcji Homera Emmonsa (lub analogicznej) w silnie zasadowych warunkach z fosfonianowym reagentem o wzorze 37, z wytworzeniem, po redukcji, aldehydowych związków o wzorze 38. Jeszcze inna reakcja Homera Emmonsa (lub analogiczna) w silnie zasadowych warunkach z reagentem o wzorze 39 daje związki o wzorze 40. Ten ostatni można przekształcić w dalsze homologi i pochodne według reakcji opisanych powyżej. Konkretnym przykładem reagentu Homera Emmonsa o wzorze 37 stosowanego do wytwarzania korzystnego związku jest dietylocyjanometylofosfonian; przykładem reagentu Homera Emmonsa o wzorze 39 jest dietylo-(E)-3-etoks^\-^karbonylo-2-metyloallilofosfonian.
1. NaN(SiMe3)2
Schemat reakcji 5
THF/-78 °C
Wzór 45
Homologi i pochodne
Wzór 46
188 705
Schemat reakcji 5 przedstawia proces syntezy związków o wzorze 1a, w którym grupa Z oznacza grapę azową (-N=N-). Tak więc grupę nitrową, wprowadza się do substratu o wzorze 6 w zasadniczo standardowych warunkach nitrowania, z wytworzeniem 3,4-dihydro-7-nitro1(2H)-naitalenonowej pochodnej o wzorze 41, którą redukuje się do 3,4-dlhydyo-7-śmino1(2H)-naftalenonywkj pochodnej o wzorze 42 i następnie poddaje reakcji z nitrozozwiąrkiem o wzorze ON-Y(R2)-A-B (wzór 43) w warunkach zwykle stosowanych (lodowaty kwas octowy) do wytwarzania śzyzwiąrnów. Nitryzozwiąrek o wzorze 43 można otrzymać w znanych reakcjach. Konkretnym przykładem takiego związku, stosowanego do syntezy korzystnego związku, jest 4-nitrorrbenzoksan etylu. Aryzwiąrkk o wzorze 44 poddaje się następnie reakcji z bisOrimetylosililotymidkiem sodu i 2-[N,N-bis(trifluorometylosulfonylo)amino]-5-cbloroplrzdyną z wytworzeniem 4-trifluorometylosulfonylonsylowycb pochodnych reprezentowa nych wzorem 45. Związki o wzorze 45 przekształca się następnie w aryzwiezni o wzorze 45, w reakcji z metaloorganiczną pochodną pochodzącą od arylowych lub beteroarylowych związków R14H. Te dwie ostatnie reakcje, konkretnie konwersja do 4-tyifluoro-mktzlysulfynyloksylokych pochodnych i reakcja z metaloorganiczną. pochodną, opisano powyżej w związku ze schematami reakcji 1, 2 i 3, i stosuje się w kilku niniejszych korzystnych procesach syntezy prowadzących do przykładowych antagonistów RAR.
Schemat reakcji 6
Homologi i pochodne
Schemat reakcji 6 przedstawia procesy syntezy związków o wzorze 1a, w których grupa Z oznacza COO- lub CONH. Te pochodne estru i amidu wytwarza się z 3,4-dibydry-7-bromopochodnych o wzorze 16, które można otrzymać jak opisano na schemacie reakcji 1. Tak więc związki o wzorze 16 poddaje się reakcji z silną zasadą, takąjakt-butylolit, w obojętnym eterowym rozpuszczalniku, takim jak tetyśbydrofuran, w niskiej temperaturze, i dodaae dwutlenek wi^ę^lra (CO2) z wytworzeniem potchodi^^j kwasu 5,6-dibydro-2-naftaśenokarboksylowego o wzorze 47. Związki o wzyrzk 47 poddaje się następnie reakcji ze związ188 705 kami o wzorze X2-Y(R2)-A-B (wzór 48) gdzie X2 reprezentuje grupę OH lub NR1, R1 korzystnie oznacza wodór. Specjalista zauważy, że związki o wzorze 48 oznaczają arylowe lub heteroarylowe hydroksylowe lub aminowe pochodne, które można otrzymać znanymi sposobami. Reakcję pomiędzy związkami o wzorze 47 i 48 można prowadzić w różnych znanych warunkach tworzenia estru lub amidu, takich jak sprzęganie obu w obecności chlorowodorku
1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu i 4-dimetyloaminopirydyny. Alternatywnie, związki o wzorze 47 można przekształcić w odpowiednie chlorki kwasowe przez sprzęganie ze związkami o wzorze 48 w obecności zasady. Amidowe lub estrowe związki o wzorze 49 można przekształcić w dalsze homologi i pochodne, jak opisano powyżej.
Związki według niniejszego wynalazku o wzorze 1a, w którym Z oznacza -OCO-, NHCO, jak tez odpowiednie analogi tioamidu, można wytwarzać ze związków pośrednich pochodzących od związku o wzorze 16, gdzie bromowy podstawnik zastępuje się grupą aminową lub hydroksylową i zgodnie z opisem patentowym USA nr 5324744.
Schemat reakcji 8
Homologi i pochodne
Na schemacie reakcji 8 ujawniono korzystne procesy syntezy związków o wzorze 1a, w którym Z oznacza -(CR^CRO^, a n' oznacza 1. Dokładniej, na schemacie reakcji 8 przedstawiono korzystny sposób wytwarzania związków, które są pochodną dihydronaftalenu i w których grupa Z oznacza winyl (-CH=CH-). Opisany tu sposób można jednakże rozszerzyć na analogiczne związki benzopiranowe, bentotiopiranowe, dihyd^oc^łh^colij^n^owe i związki, w których grupa winylowa jest podstawiona. Modyfikacje takie są oczywiste dla specjalisty. Tak więc zgodnie ze schematem reakcji 8 7-bromo-1(2H)-naftalenonową pochodną o wzorze 7 poddaje się reakcji z winylową pochodną o wzorze -Cłł2=CH-Y(R2 )-A-B (wzór 51) w obecności odpowiedniego katalizatora, typowo mającego wzór Pd(PPh3), akceptora kwasu (takiego jak trietyloamina) w atmosferze gazu obojętnego (argon). Warunki tej reakcji są ana32
188 705 logiczne do sprzęgania pochodnych acetylenu o wzorze 9 z reagentem o wzorze 10 (patrz np. schemat reakcji 1), i ten typ reakcji jest ogólnie znany jako reakcja Hecka. Winylową pochodną o wzorze 51 można otrzymać w znany sposób, przykładem takiego reagentu użytego do syntezy korzystnego związku do stosowania w wynalazku jest 4iwinylobenzotsan etylu.
Produktem reakcji sprzęgania Hecka jest etenylowa pochodna o wzorze 52, którą następnie przekształca się w związki stosowane w niniejszym wynalazku działaniem bis(trimetylosililo)amidku sodu i 2i[N,N-bis(trifluorometylosul·iΌnylo)amino]i5-chloropirydyny z wytworzeniem 4-trii'luorometylosulfonyloksylowych pochodnych o wzorze 53, i w dalszej reakcji z metaloorganiczną pochodna pochodzącą z arylowego lub heteroa^lowego związku RpiH, jak opisano powyżej. Powstałe związki o wzorze 54 można przekształcić w dalsze homologi i pochodne.
Związki o wzorze 54 można także otrzymać metodami syntezy opartymi na reakcjach Wittiga lub Homara Emmonsa. Np., związek pośredni o wzorze 33 (patrz schemat reakcji 4) można poddać reakcji z bromkiem trifenylofosfoniowym (Wittig) lub korzystniej z diet^lofosfonianem (Harner Emmons) o strukturze (EtO)2PO-CH-Y(R2)-A-B, jak opisano dla analogicznych reakcji Homera Emmonsa w opisie patentowym Stanów Zjednioczonych Ameryki nr 5324840. Wspomniana reakcja Homera Emmonsa daje pośrednie związki analogiczne w budowie z wzorami 52, i można je przekształcić w związki o wzorze 54 w sekwencji reakcji opisanych na schemacie reakcji 8 przez związków o wzorze 52.
Przykłady syntezy
2-hydroksyi2imetylo-5-fenylopentan
Do mieszaniny opiłków magnezu 13,16 g (0,541 mol) w 200 ml bezwodnego Et2O dodano 100,0 g (0,492 mol) 1-brcmo-3-fenyl propanu jako roztworu w 100 ml Et20. Po dodaniu
5-10 ml roztworu, zatrzymano dodawanie do rozpoczęcia tworzenia reagentu Grignarda. Pozostały bromek dodano następnie w czasie 1godziny. Reagent Grignarda mieszano przez 20 minut w temperaturze 35°C i następnie dodano 31,64 g (0,541 mol) acetonu w czasie 45 minut. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, następnie oziębiono do 0°C i zakwaszono dodając ostrożnie 20% HCl. Warstwę wodną ekstrahowano Et20 (3 x 200 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i destylacją pozostałości otrzymano 63,0 g (72%) produktu w postaci bladożółtego olej, temperatura wrzenia 99-102°C /66,66 Pa. 1HNMR (CDCh): δ 7,26-7,18 (5H, m), 2,63 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,68 (2H, m), 1,52 (2H, m), 1,20 (6 H, s).
1,2,3,4itttrahydrOi1,1 -dimety-onfftaten
Mieszaninę P2O5 (55,3 g, 0,390 mol) w 400 ml kwasu metanosulfonowego ogrzewano do 105°C pod argonem do rozpuszczenia ciała stałego. Otrzymany roztwór oziębiono do temperatury pokojowej i dodano powoli z mieszaniem 2-hydroksy-2-metylOi5-fenylopentan (63,0 g, 0,354 mol). Po 4 godzinach reakcję zatrzymano ostrożnie wylewając roztwór na 1 l lodu. Uzyskaną mieszaninę ekstrahowano Et2O (4 x 125 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto wodą, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl przed osuszeniem nad MgSO4. Zatężanie roztworu pod zmniejszonym ciśnieniem, następnie destylacją dały 51,0 g (90%) produktu jako przejrzystego bezbarwnego oleju, temperatura wrzenia 65-67°C / 1,1 mmHg. 1H NMR (CDCh): δ 7,32 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,167,05 (3H, m), 2^*^^ t, J = 5,3 Hz), 1,^0 (2H, m), 1,66 (2H, m), 1,28 (6H, s).
-,4-dihydro-4,4idimetylOi1(2H)-naftalenon (związek A)
Roztwór 350 ml lodowatego kwasu octowego i 170 ml bezwodnika octowego ochłodzono do 0°C i ostrożnie dodano w małych porcjach CrO^ 25,0 g (0,25 mol). Powstałą mieszaninę mieszano przez 30 minut przed dodaniem 120 ml benzenu. 1,2,3,4-tetrahydro-1,1dimttylonaftaltn dodano powoli jako roztwór w 30 ml benzenu. Po zakończeniu dodawania mieszaninę mieszano przez 4 godziny w temperaturze 0°C. Roztwór rozcieńczono H2O (200 ml) i ekstrahowano Et2O (5 x 50 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą nasyconym wodnym roztworem Na2CO^ i nasyconym wodnym roztworem NaCl, przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem i destylacja dały 16,0 g (74%) produktu jako bladożółtego oleju, temperatura wrzenia 93-96°C / 0,3 mm Hg 1H NMR
188 705 (CDCh): δ 8,02 (1H, dd, J = 1,3, 7,1 Hz), 7,53 (1H, m), 7,42 (1H, d, J = 7,9 H), 7,29 (1H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,02 (2H, t, J = 6,8 Hz), 1,40 (6H, s).
3.4- dihydro-4.4-dimetylo-7-biOmo-1(2H)-naftalenon (związek B)
100 ml trój szyjną kolbę, zaopatrzoną w wydajny skraplacz refluksu i rurę suszącą oraz wkraplacz, napełniono mieszaniną AlCh 9,5 g (71,4 mmol) i 3 ml CH2Cty Dodano kroplami z mieszaniem 3,4-dihydro-4,4-dimetylo-1(2H)-naftalenon (5,0 g, 28,7 mmol) (uwaga: reakcja egzotermiczna). Następnie dodano bardzo powoli brom 5,5 g (34,5 mmol) i powstałą mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (uwaga: jeśli przestanie się mieszać, mieszanina może się ogrzać do 70°C przed jego wznowieniem). Reakcję zatrzymano następnie przez powolne dodanie lodowatego 6M HCl. Mieszaninę ekstrahowano Et2O i połączone warstwy organiczne przemyto wod^ nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, i nasyconym NaCl, przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i destylacji pozostałości otrzymano 5,8 g (80%) produktu w postaci bladożółtego oleju, który zestalił się po odstawieniu, temperatura wrzenia: 140°C/53,33 Pa. 1H NMR (CDCh): δ 8,11 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,61 (3H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,31 (1H, d, J = 9,0 Hz), 2,72 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,28 (6 H, s).
1.2.3.4- tetrahydro-1-hydroksy-1 -(4-metylofenylo)-4,4-dimetylo-7-bromonaftalen (związek C) Do mieszaniny opiłków magnezu (648,0 mg, 27,0 mmol) w 25 ml THF dodano roztworu 4-bromotoluenu (5,40 g, 31,8 mmol) w 10 ml THF w dwóch porcjach. Reakcję rozpoczęto dodatkiem 2 ml roztworu, następnie powoli dodano pozostały roztwór z wkraplacza. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie roztwór przeniesiono do drugiej kolby stosując rurkę. Do powstałego reagentu Grignarda dodano 4,0 g (15, 9 mmol)
3.4- dihydro-4,4-dimetylo-7-bromo-1(2H)-naftalenonu (związek B) jako roztworu w 15 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez noc, oziębiono do temperatury pokojowej, i reakcję zatrzymano dodając ostrożnie lodowatego 10% HCl. Ekstrakcją Et2O poprzedzała przemycie połączonych warstw organicznych H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie osuszenie nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano olej, z którego po kolumnowej chromatografii (heksany/EtOAc, 96:4) uzyskano produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej. 1H NMR (CDCh): δ 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 7,6 Hz), 7-26 (3H, m), 7,12 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,24-2,04 (2H, m), 1,81 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1,35 (3H, s), 1,30 (3H, s).
3,4~dihydro-1-(4-metylofenylo)-4,4-dimetylo-7-bromona.ftalen (związek D)
Kolbę wyposażoną w łapacz Deana-Starka napełniono 3,4 g (9,85 mmol) 1,2,3,4-tetrahydro1~hydroksy-1~(4~met\iofenylo)·-4,4-dimetylo-7-bromonaftalenu (związek C) i 40 ml benzenów. Dodano katalityczną ilość monohydratu kwasu p-toluenosuifonowego i wytworzony roztwór ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej dodano Et2O i roztwór przemyto H2O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i po kolumnowej chromatografii (100% heksanu/żel krzemionkowy) otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCh): δ 7,32 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,21 (5H, m), 7,15 (1H, d, J = 2,1 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,30 (6 H, s).
7-etynylo~3,4-dihydro-4,4~dimetylonaftalen~1(2H)~on (związek E)
Do roztworu (przedmuchanego przez 15 minut strumieniem argonu) 7 g (27,6 mmol)
3.4- dihydlΌ-4,4-dimetylo~7-bromo-1(2H)~naftalenonu (związek B) w 15 0 mł tri etyl oamtny dodano 0,97 g (1,3 mmol) chlorku bis(taif'enylofosfino)palladu(II) i 0,26 g (1,3 mmol) jodku miedziawego. Roztwór przedmuchano argonem przez 5 minut i następnie dodano 39 ml (36,6 mmol) (trimetylosililo)acetylenu. Mieszaninę reakcyjną zamknięto w probówce ciśnieniowe i umieszczono we wstępnie ogrzanej łaźni olejowej (100°C) na 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono następnie przez celit, przemyto Et20 i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem surowego 7-(trimettyosihlO)etynyio-3,4-dihydro-4,4-dimetylo- naftalen 1(2H)-onu. Do roztworu tego surowego TMS-acetylenowego związku w 50 ml metanolu dodano 0,6 g (4,3 mmol) K2 CO3. Mieszaninę mieszano przez 8 godzin w temperaturze otoczenia i następnie przesączono. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczono i88 705
Et2O, przemyto wodą, i0% HCl i solanką, wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej (krzemionka, i0% EtOAc-heksan) otrzymano tytułowy związek jako białe ciało stałe. PMR (CDCl·,): δ i,39 (6H, s), 2,02 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,08 (iH, s), 7,39 (iH, d, J = 8,2 Hz),
7,6i (iH, dd, J = i,8 ,8,2 Hz), 8,i4 (iH, d, J = 9i,8 Hz).
4-Jodobenzoesan etylu
Do zawiesiny i0 g (40,32 mmol) kwasu 4-jodobenzoesowego w i00 ml absolutnego etanolu dodano 2 ml chlorku tionylu i mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze wrzenia przez 3 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w i00 ml eteru. Eterowy roztwór przemyto nasyconymi roztworami NaHCO3 i NaCl i wysuszono (MgSO4). Rozpuszczalnik usunięto następnie pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość destylowano przez chłodnicę kulkową (i00°C; 73,33 Pa) z wytworzeniem tytułowego związku jako bez barwnego oleju, PMR (CDCl3): δ i,42 (3H, t, J = 7 Hz), 4,4 (2H, q, J ~ 7 Hz), 7,8 (4H).
Kwas 6-jodonikotynowy
Jodek sodu (20,59 g, i37,40 mmol) oziębiono do -78°C pod argonem i następnie dodano kwasu jodowodorowego (97,i3 g, 759,34 mmol). Łaźnię chłodzącą usunięto i zawiesinę mieszano przez 5 minut. Do tej mieszaniny dodano kwas 6-chloronikotynowy (22,09 g, i40,20 mmol) i otrzymaną mieszaninę ogrzano powoli do temperatury otoczenia z mieszaniem. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w temperaturze i25°C przez 24 godziny, oziębiono do temperatury otoczenia i wylano do acetonu (500 ml) w temperaturze 0°C. Żółte ciało stałe odsączono i przemyto 200 ml In wodnego roztworu NaHSO3. Po rekrystalizacji z metanolu (kryształy przemyto eterem etylowym) uzyskano tytułowy związek jako białe kryształy: temperatura topnienia i77-i79°C (temperatura topnienia podana w literaturze i87-i92°C. Newkome i in. „Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives” J. Org. Chem. 5i: 953-954 (i986). 3H NMR (DMSO-d6): 8 8,8i (iH, dd, J = 0,8, 2,4 Hz), 8,0i (iH, dd, J = 0,8, 8,2 Hz), 7,9i (iH, dd, J = 2,4, 8,2 Hz).
6-jodonikotynian etylu
Do zawiesiny kwasu 6-jodonikotynowego (23,38 g, 94,20 mmol) w dichlorometanie (i00 ml) dodano roztworu chlorowodorku i-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (i9,86 g, i03,6 mmol) w dichlorometanie (250 ml). Do tej mieszaniny dodano etanolu (i2,40 g, 269,27 mmol), następnie dimetyloaminopirydynę (i,i5 g, 9,4i mmol). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C przez 24,5 godziny, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozcieńczono wodą (200 ml), następnie ekstrahowano eterem etylowym (550 ml). Połączone fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono (MgSO4) i zatężono do żółtego ciała stałego. Po oczyszczeniu metodą chromatografii (krzemionka, i0% EtOAcheksan) otrzymano tytułowy związek jako białe igły: temperatura topnienia 48-49°C; iH NMR (CDCl3): δ 8,94 (iH, d, J = 2,i Hz), 7,9i (iH, dd, J = 2,i, 8,2 Hz), 7,85 (iH, d, J = 8,2 Hz),
4,4i (2H, q, J = 7il Hz), i,41 (3H, t, J = 74 Hz).
4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimetylo-8-okso-2-naftalenylo)etynylo] benzoesan etylu (związek F)
Do roztworu 4 g (2i,7 mmol) 7-etynylo-3,4-dihydro-4,4-dimetylonaftalen-i(2H)-onu (związek E) przedmuchanego przez i5 minut strumieniem argonu, i 6 g (2i,7 mmol) 4jodobenzoesanu etylu w i00 ml trietyloaminy dodano 5 g (7,2 mmol) chlorku bis(trifenylofosfino)palladu(II) i 3,4 g (7,2 mmol) jodku miedziawego. Mieszaninę przedmuchano argonem przez 5 minut i następnie mieszano w temperaturze otoczenia przez i8 godzin. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit i przesącz, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu szybkiej metodą chromatografii (krzemionka, i0 % EtOAc-heksan) otrzymano tytułowy związek jako białe ciało stałe. PMR (CDCty): δ i,4i (3H, t, J = 7,2 Hz), i,4i (6H, s), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 7,44 (iH, d, J =
8,2 Hz), 7,55) (22^, d, J = 8,4 Hz), 7,68 OH, dd, J = 1& 8,2 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 845 (iH, d, J= i,8 Hz).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluorometylosulfonylo)oksy-2-naftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek G)
188 705
Do zimnego roztworu (-78°C) 291,6 mg (1,59 mmol) bis(trimetylosililo)amidu sodu w 5,6 ml THF dodano roztworu 500,0 mg (1,44 mmol) 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5.5-dimetylo-8okso-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek F) w 4,0 ml THF. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez 35 minut i następnie dodano roztwór 601,2 mg (1,59 mmol) 5-chloro(2-bis-triflourometylosulfbnylo)imidu w 4,0 ml THF. Po wymieszaniu w temperaturze -78°C przez godzinę, roztwór ogrzano do 0°C i mieszano przez 2 godziny. Reakcję zatrzymano przez dodanie nasyconego wodnego roztworu NH4 Cl.
Mieszaninę ekstrahowano EtOAc (50 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto 5X wodnym roztworem NaOH, wodą i solanką. Fazę organiczną wysuszono nad Na2 SO4 i następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do żółtego oleju. Po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej (krzemionka, 7% EtOAc-heksany) otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCh): δ 8,04 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,60 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,51 (2H, m), 7,32 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 5,0 Hz), 2,44 (2H, d, J = 5,0 Hz), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s). 4-[(5,6-dihyd^<^^5,5-(^^iet;ylo-8-(4-metyłofen^^o)-^:^'^i^^lt^ien^yyl^^ety^^yl^]]^i^I^<^^san etylu (związek 1)
Roztwór 4-toluenolitu wytworzono przez dodanie 189,9 mg (1,74 ml, 296 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78°C) 253,6 mg (1,482 mmol) 4-bromo-toluenu w 20 ml THF. Po wymieszaniu przez 30 minut dodano roztwór 269,4 mg (1,977 mmol) chlorku cynku w 3,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do temperatury pokojowej, mieszano przez 30 minut i dodano przez rurkę do roztworu 472,9 mg (0,988 mmol) 4[(ó,6-dil^ydro-5,5-dimetylo-8-(triiΊuorometyk]sulfonylo)oksy-2-yafΐalenylo)etyyylo]beyzoesanu etylu (związek G) i 50 mg (0,04 mmol) tetrakis(triifenylofosfino)palladu(0) w 4,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzewano w temperaturze 50°C przez 45 minut, oziębiono do temperatury pokojowej i rozcieńczono wodnym roztworem NHCl. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc (40 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto wodą i solanką. Fazę organiczną wysuszono nad Na2 SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do żółtego oleju. Po oczyszczeniu metodą kolumnowej chromatografii (krzemionka, 5% EtOAc-heksany) otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-aceton): δ 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,42 (3H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz),
7,25 (5H, m), 7,35 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz).
4-[(5,6-dihydro-5.5-dimetylo-8-fenylo-2-yaftalenylo)etynylo]benzoesay etylu (związek la) Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5.6-dihydro-5.5-dimetylo-8(4-metylofenylo)-2-yaftalenylo)etyyylo]beyzoesayu etylu (związek 1), 203,8 mg (0,43 mmol) 4[(5.6-dlhydro-5,5-dinletylo-8-(trifkloron^etylosulfonylo)oksy-2-naft:aleyylo)etyyylo]-beyzoesayu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 58,2 mg (0,36 ml, 0,59 mmol) fenylolitu (1,8 M roztwór w cykloheksayie/Et2O), 116,1 mg (0,85 mmol) chlorku cynku i 13,8 mg (0,01 mmol) tetrakίs(triienylofosimo)paΠadu(0). PMR (CDCl3): δ 1,36 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H. q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1 H, t, J = 4,7 Hz), 7,20 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,27 (1H, m), 7,39 (6H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz).
4-[(5.6-dihydro-5,5-<dimetylo-8-(3-metylofenylo]-2-nafttdenylo)etynylo]beyzoesay etylu (związek 2)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo8-(4-metyk]feny'lo)-2--naftaleyylo)etyyylo]benzoesayu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluor<^]m^^t^l<]s^U'f'θ]^i/ll])(^^]^ί^S^^-^^r^‘1ίftllt^^Ίn^l^]ί^tt^ly^ll]]l^t^Iyzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stale) stosując 284,8 mg (2,090 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(t.riieΓLylofosfiino)palladu(0') w 2,0 ml THF i 3-metylofenylolit (wytworzonego przez dodame 201,2 mg (1,88 ml, 3,14 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 274,0 mg (1,568 mmol) 3metylobromobenzenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCla): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,14 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihyώΌ-5.5-dimetylo-8-(2-n^etylofen.yk))-2-yaftaleyylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 3)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4metylofenylo)-2-naftaleny lo)etynylojbenzoesanu etylu (związek 1), 200,0 mg (0,418 mmol)] 436
188 705
L5,6-dihylkr)5,5-dimetylo-8--(rifluorrmetylosulffoylo)o]ky-2-naftdenylo)elynylo]belϊzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 199,4 mg (1,463 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylofosfino)palladu(0) w 4,0 ml THF, i 2-metylofenylolit (wytworzony przez dodanie 133,9 mg (1,23 ml, 2,09 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 178,7 mg (1,045 mmol)
2-metylobromobenzenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCty): δ 7,97 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,49-7,19 (6H, m), 6,81 (1H, d, J = 1,6 Hz), 5,89 (1H, t, J = 4-5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43-2,14 (2H, dq, J = 3,7, 5,4 Hz), 2,15 (3H, s), 1,39-1,34 (9H, m). 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(3,5-dimetylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 4)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluorometylosulfonylo)oksy-2-nafalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 249,0 mg (1,827 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrOds(trifenylofosfino)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 3,5-dimetylofenylolit (wytworzony przez dodanie 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 249,0 mg (1,305 mmol)
3,5-dimetylobromobenzenu w 20 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,33 (2H, ml, 7,20 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,00 (1 H, s), 6,97 (2H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (6H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,8 Hz),
1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-etynylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 5)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-di.metylo8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluo^^^et^^yiosulfonyl)-oksy-2-naftalenylo)ety^iylo]benzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 249,0 mg (1,827 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylofosfino)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 4-etylofenylolit (wytworzony przez dodanie 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 244,0 mg (1,305 mmol) 4-etylobromobenzenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCl3): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,42 - 7,24 (7H, ml, 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz). 2,71 (2H, q, J = 7,6 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J - 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-(1,1-dimetyloetylo)fenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 6)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5, 6-dihydro-5,5-dimetylo-8(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluorometylosulfonylo)oksy-2-nafalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 142,4 mg (1,045 mmol) chlorku cynku i 4-t-butylo-fenylolit (wytworzonego przez dodanie 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) t-butylolitu (1,5 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 167,0 mg (0,78 mmol) 4-t-butylo-bromobenzenu w 1,0 ml tHf). 1H NMR (CDO3): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,28-7,45 (7H, m) 6,02 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,59 (3H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,35 (6H, s).
4-[(5,6-dihy&o-5,5--bmetylo-8-(4-cłhorrffnylo))2-nafftlenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 7)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifuorometylosulfbnylo)oksy-2-nafalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 249,0 mg (1,827 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetr^l^i.s(tI^!tUl—^^<^ofosfno)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 4-chlorofenylolit (wytworzony przez, dodanie 167,7 mg (1,54 ml,
2,62 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 252,4 mg (1,305 mmol) 4-ehloro-1-bromobenzenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCty): δ 7,98 (2H, d, J =
188 705
8,4 Hz), 77>5 (2H, d,J = 8,4 Hz), 7/1007712 (6H,m), 7,12 ( 1H, d,J = 1 ,6 Hz), 6,00 ( 1H, t, J - 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5·dimetylo78-(4-metoksyftnylo)-2-raίtalenyk>)etynyloberzotsan etylu (związek 8)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4[(5,6-dihycdo-5,5-dimetylo-8-((rifluorometylosulfonylo)oksy-2-riaft.alenylo)etynylolbenzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 249,0 mg (1,827 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrαks(trifenylofosfmo)palladu (0) w 2,0 ml THF, i 4-metoksyfenylolit (wytworzony przez dodanie 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tbutylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 200,1 mg (1,305 mmol) 4-metoksy-1-bromobenzenu w 20 ml THF). 1H NMR (CDCl 3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,40-7,21 (5H, m), 6,95 (2H, d, J = 8,7 Hz), 5,91 (1H, t, J = 4,7 Hz),
4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 4,34 (3H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
0-[('5,6-dihydro-5,5-dimetyk)-8-(4trrifluoromttyk>ftryio)-2-naftalenylo)etynylo]berzoesar etylu (związek 9)
Stosując tę samą. ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5.6^dihydro-5,5-dimetylo-8-(0metylofenylo)-2-naltalenylo)ttynylo]btnzotsanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,522 mmol) 4[(5,6-dił^ydIΌ-5,5-dimetykw8-7tyiifuorometylosullbrylo)oksy(2-nfftatenylo)etynylc>]berz-)esanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 249,0 mg (1,827 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trrfenylofosfino)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 0-tπl'luorometylofelrylolit (wytworzony przez dodanie 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 296,6 mg (1,305 mmol) 0-trifluorometylobromobenzenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCl 3): δ,98 (2H, d, J = 8-5 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54 - 7,36 (6H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,06 (1H, t, J = 4,8 Hz),
4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
0-[(5,6-dihydro-5t5-dimetyk--8-(2-prrydyk-)-2-rlaftaltrylo) etynylo]benzoesan etylu (związek 10)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 0-[(5,6-dihydro-5,5-d'imetyio-8-(0metyloftnylo)-2-nαftalenylo)etynylo]btrzotsanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,52 mmol) 4-[(5,6dihydro-5,5-dimetylo-8--tyrfluorometylosulfonylo-oksy(2rnaftalenylo)etynyk-|berlzc)esaru etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 142,4 mg (1,045 mmol) chlorku cynku i 2-litopirydynę (wytworzoną przez dodanie 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) t-butylolitu (1,5 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 123,8 mg (0,784 mmol) 2bromopirydyny w 1,0 ml THF). 1H NMR (d6-aceton): δ 8,64 (1H, m), 7,99 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,85 (1 H, ddd, J = 1,8, 7,7, 9,5 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,47 (2H, d, J = 1,1 Hz), 7,35 (2H, m), 6,32 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz),
2,42 (2H, d, J = 7,4 Hz), 1,35 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,35 (6H, s).
07[(5t6-dihydro5,5-dimetylo-8-(3-pirydylo)-2-nafyαlerylo)-etyrylo]lbtnzoesan etylu (związek 11)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 0-[(5,6^1hydro-5,5-dimetylo-8-(4metylolerylo)-2-nal'talenylo)etyrylo]benzotsaru etylu (związek 1), 170,0 mg (0,35 mmol) 4[(-,6-dlhydro-5,5-dimetylo-8-(trifluoromttylosulfonylo)oksy-2-naftαltnylo)etynylo]btnzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 142,4 mg (1,045 mmol) chlorku cynku i 3-litopirydynę (wytworzoną przez dodanie 100,2 mg (0,92 ml, 1,56 mmol) t-butylolitu (1,5 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 123,8 mg (0,784 mmol) 3-bromopirydyny w 1,0 ml THF). 1H NMH (CDCk): δ 8,63-8,61 (2H, dd, J = 1,7 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,67 (1H, dt, J = 7,9 Hz) , 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43-7,34 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,07 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4-7 Hz), 1,390 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
4-[(5,6-dlhydro-5,5-dimetylo-8-(2-metyło-5-prydylo)-2-naftalenylo)etynylo]berzoesan etylu (związek 12)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimttylo-8-(0metylofenylo^-naftalenylo^tynylo] benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,52 mmol) 4[(5,6-dihydro-5,5-dίmetylo-8-(trifluoromttylosulforylo)oksy-2-raftalenylo)etyrylo]benzoesaru
188 705 etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 142,4 mg (1,045 mmol) chlorku cynku i 2-metylo-5-litopirydynę (wytworzoną przez dodanie 100,5 mg (0,92 ml, 1,57 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-76°C) 134,8 mg (0,784 mmol) 2-mktzlo-5-bromy-piyydzny w 1,0 ml THF). 1H NMR (CDCL·,): δ 8,50 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,37 (2H, d, J=8,0Hz), 7,21 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,11 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,63 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6 H, s).
4-[(5,6-dihyclyo-5,5-dia^etylo-8-(3-((2,2-dia^ktyloktylo)-dimetyloslloksyfenykr)-2-naίlalknzk))etznzlo]bknroksan etylu (związek H)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dibydro-5,5-dimetylo-8-(4mktylofenyly)-2-nśftalenzlo)etZnyly]benryesanu etylu (związek G), 150,0 mg (0,314 mmol) 4[(5,6-dibz'dro-5,5-dimetylo-8-(trilfuorometylosufonylorokyy22-naftatenylo)etyn)yly]benz:yesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy' związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 150,0 mg (1,10 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tetrdkιs(triienylofosfmy)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 3-((2,2-dimktylyetylo)dimetylosilynsz)fenylollt (wytworzony' przez dodanie 100,2 mg (0,92 ml, 1,564 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 226,0 mg (0,787 mmol) 3-((2,2-dimetyloetylo)dimetylosiloksy)bromobenzknu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCl 3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,407,22 (4H, m), 6,95 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,84-6,82 (2H, m), 6,00 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz) , 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (3H, s), 0,99 (9H, s), 0,23 (6H, s).
4-[(5,6-dibz’dyυ-5,5-dimkty'lo-8-(4-((2,2-dialkTytrkίylo)-dimelylosiloksyfeIlylυ)-2-nal'talkny'lo)etznylo] benzoesan etylu (związek I)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dibydro-5,5-dimktylo-8-(4metylyfenylo)-2-nśftślknyly)etynylo]benroesśnu etylu (związek 1), 210,0 mg (0,439 mmol) 4[(5,6-dibydro-5,5-dimetylo-8-((rifluoromatylorsllfonyloroksy-2-naffaśenylo)etynylo]benrokSśnu etylu (zkiąrkk G) pyzknsz.talcono w tytułowy związek ciało stałe) stosując 209,0 mg (1,53 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,02 mmol) tktrakis(1trfenylofosfno)palladu(0) w 2,0 ml THF, i 4-((2,2-dimetzlyktylo)dimetylosiloksy)fenylolit (wytworzony przez dodanie 140,3 mg (1,30 ml, 2,19 mmol) t-butylolitu (1,7 M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78 °C) 315,0 mg (1,09 mmol) 4-((2,2-dimetyloetyΊo)dlmktylysllonsy)bromybknrenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCl 3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,25 (3H, m), 7,21 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,87 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s), 1,01 (9H, s), 0,25 (6H, s).
4-[(5,6-dlhzdro-5,5-dimktylo-8-(3-hydroksyfenyly)-2-nafślenylo)ktynyly]bknzykSśn etylu (związek 13)
Do roztworu 4-[(5,6-dibydry-5,5-dimetyly-8-(3-((2,2-dimktzloktylo)-dimetzlosilokszfenyly)2-nśftślenylo)ktyny'lo]benzoesanu etylu (zkiąrkk H) 60,0 mg (0,114 mmol) w 1,0 ml THF w tkmpkyśtl·lrzk pokojowej dodano 91,5 mg (0,35 ml, 0,35 mmol) fluorku tktrabutyloćanoniowkgo (1 M roztwór w THF). Po wymieszaniu przez noc, roztwór rozcieńczono EtOAc i pyremzto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem i następnie po chromatografii kolumnowej (4:1, heksany: EtOAc) otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCl 3): δ 7,98 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,39 - 7,21 (4H, m), 6,93 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,84 (1H, d, 7,1 Hz), 6,83 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,91 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-dlbzdro-5,5-dimktylo-8-(4-hydrokszfknyly)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesśn etylu (związek 14)
Do roztworu 4-[(5,6-dibydro-5,5-dimktylo-8-(4-((2,2-dimktzlyetylo)dlmktzlysilokszfknylo)2-nśftalknylo)etynylo]bknroesśnu etylu (rkiązkk I) 50,0 mg (0,095 mmol) w 1,0 ml THF w temperaturze pokojowej dodano 73,2 mg (0,29 ml, 0,29 mmol) fluorku tktrabutykr;aaoniowego (1 M roztwór w THF). Po mieszaniu przez noc roztwór rozcieńczono EtOAc i przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, po czym wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpusz188 705 czalników pod zmniejszonym ciśnieniem i następnie po chromatografii kolumnowej (4:1, heksany: EtOAc) otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCh): δ 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz), 8 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,41 - 7,20 (5H, m), 6,88 (2H, d, J = 8,4 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6 H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(5-metylotiazoli2iilo)i2inaftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 15)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydlΌ-5,5drimetylo-8-(4mttylofenylo)i2-na.ftalenylo)etynylo]btnzotsaιnu etylu (związek 1), 264,0 mg (0,552 mmol) 4[(5,6-dihydro-5,5-dimttylo-8i(trifluorometylos^Ufonylo)oksy-2-naikdenylo)etynylo]benzoesaίnu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 150,0 mg (1,10 mmol) chlorku cynku, 14 mg (0,012 mmol) tetrdds(trifenylofosfmo)palladu(0) w 4,0 ml THF, i 5imetyloΐiazol-2iilolit (wytworzony przez dodanie 53,2 mg (0,53 ml, 0,83 mmol) n-butylolitu (1,55 M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78°C) 82,0 mg (0,83 mmol) 5imetylotiazolu w 5,0 ml THF). 1H NMR (CDCla): δ 7,98 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,55 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,54 (1H, s), 7,45 (1H, dd, J = 1,5, 8,0Hz), 7,35 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,48 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,51 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, s), 1,32 (6H. s).
4-[(5,6idihyxiro-5,5idimetyk)-8-(2--tiazolilo)-2-naftaltnylo)ttynylo]btnzoesan etylu (związek 15a)
Roztwór 2-litotiazolu wytworzono przez dodanie 41,2 mg (0,42 ml, 0,63 mmol) n-butylolitu (1,5M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78 °C) 53,4 mg (0,63 mmol) tiazolu w 1,0 ml THF. Roztwór mieszano przez 30 minut i następnie dodano roztwór 113,9 mg (0,84 mmol) chlorku cynku w 1,5 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do temperatury pokojowej, mieszano przez 30 minut i następnie cynkoorganiczny związek dodano przez rurkę do roztworu 200,0 mg (0,42 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8i(triiluoIΌmetyk-i sulfonyło)oksyi2inaftalenylo)ttynylo]benzotsanu etylu (związek G) i 12,4 mg (0,01 mmol) tetrakis(t^^jfei^;^]^l^:fosfi^o)pa^ladu(Ó) w 1,5 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzewano w temperaturze 50°C przez. 45 minut, oziębiono do temperatury pokojowej i rozcieńczono nasyconym wodnym roztworem NH4CL Mieszaninę ekstrahowano EtOAc (40 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto wodą i solanką. Fazę organiczną wysuszono nad Na2 SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do żółtego oleju. Po oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej (krzemionka, 20% EtOAc-heksany) otrzymano tytułowy związek jako bezbarwny olej. PMR (CDCl 3): δ 1,35 (6 H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,57 (1H, t, J = 4,8 Hz), 7,33 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,92 (1H, d, J =
3,3 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz).
4-[(5,6idihydro-5,5idimetylOi8i(4-metylotiazolilo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesan etylu (związek 16)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6idihydIΌ-5,5idimetyk-i8-(4i mttyloftnylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzotsanu etylu (związek 1), 295,0 mg (0,617 mmol) 4[(5,6-dihylbo-5,5-dimetylo-8-(trifluoromttylosui0:)ny-o-oksy22-naίatenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 168,0 mg (1,23 mmol) chlorku cynku, 16 mg (0,014 mmol) tetrakis(trifenylofbsimo)palladu(0) w 6,0 ml tHf, i 4^^10110201-2-^^ (wytworzony przez dodanie 59,6 mg (0,60 ml, 0,93 mmol) nbutylolitu (1,55 M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78°C) 92,0 mg (0,93 mmol) 4metylotiazolu w 6,0 ml THF). 1H NMR (CDCh): δ 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, s), 6,52 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,54 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,33 (3H, s).
4-[(5,6idihydIΌ-5,5-dimtąylOi8i(4.5idimetyloti£lzol-2-ik))i2-naitalenylo)ttynylo]benzoesan etylu (związek 17)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydtΌ-5,5idimetylo-8i(4mttyk-ienylo)-2-naftalenylo)etynylo]btnzoesanu etylu (związek 1), 200,0 mg (0,418 mmol) 4[(5A-dihydrr-5,5-dimetylo-8-itriifuorametylo-ullónyk-)oksy-2inafΐalenylo)etynyk-]benzoesanu i88 705 etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując ii0,0 mg (0,84 mmol) chlorku cynku, i2 mg (0,0ii mmol) tetraks(trifenylofosfmo)palladu(0) w 20 ml THF, i 4,5-dimetylotiazol-2-ilolit (wytworzony przez dodanie 40,2 mg (0,39 ml, 0,63 mmol) n-butylolitu (i,55 M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78°C) 7i,0 mg (0,63 mmol) 4,5dimetylotiazolu w 20 ml THF). iH NMR (CDCh): δ 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,82 (iH, d, J = i,7 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (iH, dd, J = i,7, 8,0 Hz), 7,33 (iH, d, J = 8,0 Hz), 6,45 (iH, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,i Hz), 2,4i (3H. s), 2,40 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,9 Hz), i,40 (3H, t, J = 7,i Hz), i,32 (6H, s).
Kwas 4-[(5l6-dihydro-5,5-dimetylo-8-l2-metylo-5-pirydylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek i8)
Roztwór 8i,7 mg (0,i94 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-metylo-5-pirydylo)-2naftalenylo)etynylo]benzoe.san etylu (związek i2) i 40,7 mg (0,969 mmol) LiOH-ltyO w 3 ml THF/wody (3:i, objętościowo), mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano przez dodanie nasyconego wodnego roztworu NIUCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i solanką wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci bezbarwnego ciała stałego. iH NMR ^-DMSO): δ 8,4i (iH, d, J = i,9 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (iH, dd, J = 2,3, 7,9 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, m), 7,33 (iH, d, J = 7,8 Hz), 6,95 (iH, s), 6,ii (iH, t, J = 4,5 Hz), 2,52 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), i,3i (6 H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-pirydylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek i9)
Roztwór 80,0 mg (0,i96 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-pirydylo)-2-na.ftalenyio)etynylo]benzoesanu etylu (związek i0) i 20,6 mg (0,49i mmol) LiOH-H2O w 3 ml THF/wody (3:i, objętościowo), mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Reakcję przerwano dodatkiem nasyconego wodnego roztworu NH4 Cl i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i solanką, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci bezbarwnego ciała stałego. iH NMR (d6-DMSO): δ 8,64 (iH, m), 7,94 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,87 (iH, dt, J = i,7, 7,8 Hz), 7,58 (2H, d, J = 9,3 Hz), 7,50 (iH, d, J = 8,2 Hz), 7,47 (2H, s), 7,37 (iH, m), 7,25 (iH, s), 6,30 (iH, t, J = 4,6 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,6 Hz), i,3i (6H, s).
Kwas 4-[(5b-dihydroHA-dimetylo-,^-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek 20)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(3-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynyio]benzoesanu etylu (związek 2) 30,0 mg (0,07i mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (i,0 M wodny roztwór). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godzin, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono i0% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2 SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. iH NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J =
8,5 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,46 (2H, s), 7,32-7,i3 (4H, m), 7,i0 (iH, s), 6,98 (iH, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (3H, s), 2,3i (2H, d, J = 4,5 Hz), i,30 (6 H, s).
Kwas4-[(5,6-dihydro-5,5-dinhetylo-8--4-etylofenylo)-2-nattalenyko)etynylo]benzoesowy (związek 21)
Do roztworu 4-[(5l8-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-etynylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 5) 47,0 mg (0,i08 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (i,0 M wodny roztwór). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono i0% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciało stałe. iH NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29 - 7,2i (4H, m), 7,02 (iH, s), 6,0i (iH, t, J = 4,5 Hz), 2,64 (2H, q, J = 7,5 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,5 Hz), i,29 (6H, s), i,22 (3H, t, J = 7,5 Hz).
Kwas 4-[(5l8-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metoksyfenylo)-2-nafta!enylo)etynylo]benzoesowy (związek 22)
188 705
Do roztworu 4-['e5,6~dihydao-5,5-dimetyΊo-8~(4~metoksy^'enylo)-2~naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 8) 80,0 mg (0,183 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 40,0 mg (1,00 mmol, 1,0 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie wysuszeniu nad Na2SO4, i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz),
7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45 (2H, s), 7,24 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,02-6,89 (3H, m), 5,98 (1H, t, J = 4,4 Hz), 3,79 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,29 (6 H, s).
Kwas4~[(5,6~dihydla1-5,5~dimetylo-8-(4~trifluoaometylofenylo5~2~naftalenylo)eΐγnyloJbenzoesowy (związek 23)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydao~5,5~dimetylo-8-(4-trifluorometylofenylo)-2-naflaιlenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 9) 70,0 mg (0,148 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej, i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie suszenie nad Na2 SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,61-7,47 (6H, m), 6,97 (2H, s), 6,16 (1H, t, J = 4,5 Hz),
2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,30 (6 H, s).
Kwas4-[e5,6~dihydao-5,5-dimetylo-8~(3,5~dimetylofenylo)-2~naffalenylo)etynylo]be.nzυesowy (związek 24)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro~5,5-dimetylo~8-e3,5-dlmetylofenylo)-2-naftalenylo)etyny~ lo]benzoesanu etylu (związek 4) 90,0 mg (0,207 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H nMr DMSO): 8 7,90 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,45 (2H, s), 7,00 (1H, s), 6,97 (1H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 2,30 (6 H, s), 1,29 (6 H, s).
Kwas4-[(5,6~cłihydao-5,5~dimetykl~8~(4-chlorofenylo)-2-naftalenγTo)etynylo]benzoesowγ (związek 25)
Do roztworu 4-[e5,6-dihydro-5,5~dimetylo-8~(4-chlorofenylo)-2-nafadenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 7) 80,0 mg (0,181 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór o-grzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,48 (4H, m), 7,34 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,97 (1H, s), 6,07 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,6 Hz), 129 (6H, s).
Kwas 4~[(5,6~dlhydao~5,5~dimetylo~8~(3-piaydylo)-2-nafidenylo)et>yϊylo]bemoesowy (związek 26)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8~(3~piaydylo)~2~naifalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 11) 45,0 mg (0,110 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 mi) NaOH (1,0 M wodny roztwór). Roztwór ogrzewano do 50°C przez. 2 godziny, oziębiono do pokojowej temperatury, i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2 SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO): δ 8,60 (1H, d, J = 4,6 Hz), 8,55 (1H, s), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7-76 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,48 (3H, m), 6,94 (1H, s), 6,14 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,31 (6H, s).
Kwas 4- [(5,6-dihydro-5,5 -dimetylo-8~(2~metylofenylo)~2-naftalenylo)etynylo] benzoesowy (związek 27)
Do roztworu 4~[(5,6-dihydao-5,5-dimetylo-8-(2-meylloeenylo--2-nataalenylo)etynylo]ben~ zoesanu etylu (związek 3) 80,0 mg (0,190 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po
188 705 wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO): δ 7,89 (2H, 25 d, J =
8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29-7,14 (4H, m), 6,59 (1H, s), 5,90 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,39 (2H, m), 2,60 (3H. s), 1,39 (3H, s), 1,29 (3H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(3-hydroksyfenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek 28)
Do roztworu 4-[(5,6-dihyd.rr^-i^,;^^ii^u.^t^yo^ł^-^(i3-((2,2-dimety’loe^t^y'lo)-^iiim^e^tylosiloksyfenylo)-2-naftalenylo)etynylo] -benzoesanu etylu (związek H) 40,0 mg (0,076 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 40,0 mg (1,00 mmol, 1,00 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez. 2 godziny, oziębiono to pokojowej temperatury i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-aceton): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35 (2H, s), 7,15-7,07 (2H, m), 6,77-6,69 (3H, m), 5,92 (1H, t, J = 4,7 Hz), 225 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,23 (6H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-hydroksyfenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek 29)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-((2,2-dimetyloetylo)-dimetylosiloksyfenylo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek Γ) 75,0 mg (0,143 mmol) w 3 ml EtOH i 2 ml THF dodano 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M roztwór wodny). Roztwór ogrzewano do 50°C przez 2 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zakwaszono 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2 SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-aceton): δ 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (2H, s), 7,20-7,17 (3H, m), 6,92-6,89 (2H, m), 5,97 (1 H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,34 (6 H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihycdΌ-5,5-dimetylo-8-(5-metyloti;azol-2-ilo)-2-naftalenylo)etynylo]berzoesowy (związek 30)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(5-mtly)otiaoo2-2l)lo2-2-n£tftaleny)o)e|ynylo]benzoesanu etylu (związek 15) (100 mg, 0,23 mmol) i 4 ml EtOH w temperaturze pokojowej dodano wodnego roztworu NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol). Wytworzony roztwór ogrzewano do 50°C przez godzinę i zatęzono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość umieszczono w zawiesinie w roztworze CH2Ch i eteru (5:1) i zakwaszono do pH 5 1M wod nym roztworem HCl. Warstwy oddzielono i warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono (Na2 SO4), przesączono i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku jako białego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,96 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,95 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,64 (1H, s), 7,53 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,59 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,50 (3H, s), 239 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,27 (6 H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-tiazolilo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowy (związek 30a)
Roztwór 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-tiazolilo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 15a) i 8,5 mg (0,20 mmol) kiOH-H2O w 3 ml THF/wody (3:1, objętościowo), mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Reakcję przerwano dodatkiem nasyconego wodnego roztworu NH4CI i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i solan<ą wysuszono nad Na2 SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci bezbarwnego ciała stałego. PMR (d6-DMSO): δ 1,29 (0H, s), 2,42 (2H, d, J = 4,6 Hz), 6,08 (111, t, J = 4,6 Hz), 7,51 (2H, m), 7,62 (2h, d, J = 8,2 Hz), 7,77 (1H, d, J = 3,3Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (1H, d, J = 3,3 Hz).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5 -dimetylo-8-(4-metylotiazol-2-ilo)-2-naftalenylo)etyir^4i^.)bem^(o2sowy (związek 31)
Do roztworu 4-[(5,6-dihyd^^-5,5-dimetylo-8-(4-metylotiazolilo)^2^-^r^aftalenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 16) (145,0 mg, 0,34 mmol) i 4 ml EtOH w temperaturze pokojowej dodano wodnego roztworu NaOH (1 ml, 1M, 1 mmol). Wytworzony roztwór ogrzewano do 50°C przez.
188 705 godzinę i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość umieszczono w zawiesinie w roztworze CH2O 2 i eteru (5:1) i zakwaszono do pH 5 1M wodnym roztworem HCl. Warstwy oddzielono i warstwę organiczna przemyto solanką, wysuszono (Na2SO4), przesączono i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci białego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,94 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,6 Hz),
7,63 22H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 0H, dd , J =j 1,6, 8,1 Hz), 7,45 11H, d, J = 8,1 Hz), 7,27 0H, s) , 6,58 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,43 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,26 (6H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4.5-dimetyk]ttazo]-2-iio)-2-yai'lalenylo)eίyyιylo]benzoesowy (związek 32)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydιΌ-5,)-dimetylo-8-(4,5-dimetylotiazol-2ii]o--2-nfflaιlenylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 17) (58,0 mg, 0,13 mmol) i 4 ml EtOH w temperaturze pokojowej dodano wodnego roztworu NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol). Wytworzony roztwór ogrzewano do 50°C przez godzinę i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość umieszczono w zawiesinie w roztworze CH2 Cl2 i eteru (5:1) i zakwaszono do pH 5 1M wodnym roztworem HCl. Warstwy oddzielono i warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono (Na2SO4), przesączono i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,86 (2H, d, J = 1,6 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J =
1,6, 8,0 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,51 (1H, t, J = 4,9 Hz), 2,37 (3H, s), 2,36 (2H, d, J =
4,6 Hz), 2,32 (3H, s), R26 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(5-metyΊo-2-tieyyloS-2-naftalcyylo)etyyylo]beyzoesay etylu (związek 33)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5.6-dihydro-5,5-dimetylo8-(4-metylofeyyloS-2-naftalenylo)eΐy'yylo]benzoesayu etylu (związek 1), 170,0 mg (0,366 mmol) 4-[(5.6-dihy'dro-5,5-dimety'k]-8-(trifluorometyk]sulfonylo)oksy-2-yaftalenyk])etyyyk]]beyzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 202,0 mg (1,48 mmol) chlorku cynku, 24 mg (0,022 mmol) tetrakisitritcinyk)fosfino)palladu(O) w 20 ml THF, i 5-mathyl-2-litotiofey (wytworzony przez dodanie 58,6 mg (0,36 ml, 0,915 mmol) n-butylolitu (2,5 M roztwór w heksanach) do zimnego roztworu (-78°C) 89,8 mg (0,915 mmol) 2-metylotiofenu w 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCb): δ 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (1 H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Ηε), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,J^'7 (1H, d, J = 3,5 fk), 6,74 (1H, d, J = 2,8 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,0 Hz), 1,40 (3H, t, 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5.5-dimetylo-8-(2-tienylo)-2-naftalenylo)etyyylo]beyzoesay etylu (związek 33a)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4-[(5,6-dihydr^-^^,5-dimetylo-8-(4metylofenylo)-2-naftaleyylo)etynylo]benzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,52 mmol) 4-|kŚ,6-dihydro-5,5-dimetyk]-8-(trifluoΓometyyo]ulffoylo]ok.sy-2-nyatalenylo]etynylo]beyzoesanu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 186,8 mg (1,37 mmol) chlorku cynku, 37,1 mg (0,03 mmol) tetrί^^l^ii^(t^t^iie^ίyylofosfiyo)palladu(0) i 2litotiofen (wytworzony przez dodanie 65,9 mg (0,69 ml, 1,03 mmol) n-butylolitu (1,5 M roztwór w heksanie) do zimnego roztworu (-78°C) 86,5 mg (1,03 mmol) tiofenu w 1,0 ml THF). PMR (CDCl3): δ 1,33 (6H, s), 1,36 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 6,25 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,13 (2H, m), 7,47 (4H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,5 Hz).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(5-metylo-2-tienylo)-2-naftalenylo)ebyyylo]benzoesowy (związek 34)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5.5-dimetylo-8-(5-metylo-2-tienylo)-2-naftalenylo)ctynylo]benzoesanu etylu (związek 33) (35,0 mg, 0,082 mmol) w 2 ml EtOH i 1 ml THF w temperaturze pokojowej dodano wodnego roztworu NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol). Wytworzony roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez noc i następnie zakwaszono 30% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, a następnie po wysuszeniu nad Na2SO4 i usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-aceton):
188 705 δ 8,03 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,54-7,48 (3N, m), 6,89 (1H, m), 6,18 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,49 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (6H, s).
Kwas 4-[((,6-dlhydiΌ-5,5-dimety·kr-8-(2-tiknyio)-2-nafaśenylo)etyynZorbenzoesywy (związek 34a)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu.
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(2-tiazylllo)-2-naftalenylo)etynylo]benzoesowz (związek 30a), 70,0 mg (0,17 mmol) 4-[(5,6-dibydyo-5,5-dlmktylo-8-(2-tlenylo)-2-nśftalenylo)etznyly]bknzoesan etylu (związek 33 a) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 17,8 mg (0,42 mmol) LiOH w H2 O. PMR (d 6-DMSO): δ 1,27 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,23 (1H, t, J = 4,9 Hz), 7,14 (2H, m), 7,38 - 7,56 (4H, m),
7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Kwas 5,6-dlhydro-5,5-dimetyly-8-(4-metzlyfknylo)-2-naftalknokarboksylowy (związek K)
Roztwór .3,4-dihy''dro-1-(4-mety4ofenylo)-4,4-dimetylr)-7-bromonaftalknu (związek D) (250,0 mg, 0,764 mmol) w 2,0 ml THF oziębiono do -78°C i dodano powoli 1,0 ml tbutylolitu (1,68 mmol, 1,7 M roztwór w pentanie). Po wymieszaniu przez godzinę w temperaturze -78°C gazowy CO2 (wytworzony przez odparowanie suchego lodu, i przepuszczony przez rurę suszącą) barbotowano przez mieszaninę przez 1 godzinę. Roztwór pozostawiono następnie do ogrzania do temperatury pokojowej i reakcję przerwano dodatkiem 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc połączone warstwy organiczne przemyto H2 O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, i wysuszono nad MgSO4- Po usunięciu yozpusrcralninów pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyciu ciała stałego heksanami uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCl 3): δ 7,94 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,76 (1H, d, J = 1,8 ΗζΧ 7,4,5 ( 1H, d, J = 8 ,1 Hz^ 7,24 (4H, ηή, 6,61 ( 1H, t, J = 4,7 Hz^ 2 ,20 (3H, s)} 2 ,2(5 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,35 (6 H, s).
7-[[((,6-dihydyo-(,(-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenyly)karbonylo]amlno]benzoesan etylu (związek 35)
Roztwór 120,0 mg (0,58 mmol) kwasu 5,6-dihydro-5,5-dimetyΊo-8-(7-metyiofenyIo)2-naftalknokarboksylowkgo (związek K), 115,0 mg (0,70 mmol) 7-aminobknzokSśnu etylu, 145,0 mg (0,76 mmol) chlorowOdorku (-(3-dmtetylośmlinopropylo)-3kttylokaybodlimidu i 924 mg (0,76 mmol) 4-dimktylyśminopiyzdzny w 6,0 ml DMF mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Dodano octan etylu i wytworzony roztwór przemyto H2O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, produkt wyodrębniono w postaci bezbarwnego ciała stałego metodą kolumnowej chromatografii (10 do 15% EtOAc/heksany). 1H NMR (CDCl3): δ 8,02 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,72 (2H; m), 7,65 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,52 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,48 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (4H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
Kwas 7-[[(5,6-dlhydro-5,5-dimktylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)kaybonylo]śmino]bknzoesowy (związek 36)
Do roztworu 26,5 mg (0,06 mmol) 7-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(7-metylyfknylo)-2naftalenzlo)karbonylo]amino]-benzoesanu etylu (związek 35) w 3,0 ml EtOH i 4,0 ml THF dodano 270,1 mg NaOH (6,00 mmol, 3,0 ml 2M wodnego roztworu). Po wymieszaniu w tempkyatuyzk pokojowej przez 72 godziny reakcję przerwano dodatkiem 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc i wysuszeniu warstw organicznych nad MgSO4 i po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano ciało stałe. Po krystalizacji z CH3CN uzyskano tytułowy rkląren w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ (1H, s), 7,91 (5H, m), 7,54 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,75 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, r, J = 4,4 Hz), 2,35 (5H, s), 1,33 (6H, s).
4-[ [(5,6-d^ydr^-5,5-dlmktzlo-8-(4-metylofenyly)-2-nafiaιlknyly)kśrbonylo]oksy]benzoesan etylu (związek 37)
Roztwór 25,0 mg (0,086 mmol) kwasu (,6-dlbydro-5,5-dimetylo-8-(7-mktyΊyfenzly)-2nś.ftalenynarboksyklk·ego (związek K), 17,5 mg (0,103 mmol) 4-hydroksybknzoksanu etylu,
21,4 mg ^¢,1112 mmolt chlorowodorku (-(3-dimetykśammopropyio-33tetylokarbodiimidu
188 705 i 126 mg (0,103 mmol) 0-dimetyloaminopirydyny w 20 ml DMF mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Dodano octanu etylu i wytworzony roztwór przemyto H2 O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3, i nasyconym wodnym roztworem NaCl, przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem produkt wydzielono metodą kolumnowej chromatografii w postaci bladożółtego ciała stałego (10% EtOAc/heksany). 1H NMR (CDCl 3): δ 8,08 (2H, d, J = 8,1 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (5H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H. q, J = 7,1 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,38 (3H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s). 4-[[(-,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-mety)oeeny-o)-2-na:yalenylo)karbonyloksy]benzotsan 2-trimetylosililu (związek 38)
Roztwór 93,5 mg (0,320 mmol) kwasu 5,67dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metyloferylo)-2naftalenokarboksylowego (związek K), 76,0 mg (0,319 mmol) 4-hydroksybenzoesanu 2trimetylosililoetylu, 80,0 mg (0,417 mmol) chlorowodorku 1-(3-dimttyloaminopropylo)-3etylokarbodiimidu i 51,0 mg (0,417 mmol) 4-dimetyloaminopirydyny w 4,0 ml dMf mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Dodano octan etylu i wytworzony roztwór przemyto H2 O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i nasyconym wodnym roztworem NaCl, przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem produkt wydzielono w postaci bezbarwnego ciała stałego metodą kolumnowej chromatografii (5% EtOAc/heksany). 1H NMR (CDCl 3): δ 8,08 (2H, d, J = 8,0 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,26-7,18 (1H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,42 12H, t, J = 8,4 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,39 (3H, s), 1,38 (6H, s), 0,09 (9H, s).
Kwas 0-1[(5,6-dihydro-5,5wiimttylo-8-(4-metγk)ftnylo)-2-raftalerylo)kća·bonylloksylbenzoesow'y (związek 39)
Roztwór 110,0 mg (0,213 mmol) 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(0-metylofenylo)-2raftalenylo)karbonyl]oksy]-benzoesanu 2-trimetylosililu (związek 38) i 167,3 mg fluorku tetrabutyllanoInowtgo (0,640 mmol, 0,64 ml 1M roztworu w THF) w 2,0 ml THF mieszano w temperaturze pokojowej przez 22 godziny. Dodano octan etylu i wytworzony roztwór przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyciu resztowego ciała stałego EtOAc i CH3CN uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (dó-aceton): δ 8,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,06 (1 H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,35 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,25 (4H, m), 6,08 (1H, t, J = 4,7 Hz),
2,42 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,35 (3H, s), 1,39 (6H, s).
2-lluoro-4-[[(5.6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metγlofenylo)-2-naftalenylo)karbotrylojamiro]btrzoesan etylu (związek 40)
Roztwór 115,0 mg (0,41 mmol) kwasu -,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-mttylofenylo)-2naftalenokarboksyłowego (związek K), 89,0 mg (0,49 mmol) 2-fluoro-0-αminobenzotsanu etylu, 102,0 mg (0,53 mmol) chlorowodorku 1-(3-dimetylo-ammopropylo)-3-etylokarbodiimidu i 65,0 mg (0,53 mmol) 4-din'leyyloamirloplrydyny w 5,0 ml DMf mieszano w temperaturze 50°C przez godzinę i następnie przez noc w temperaturze pokojowej. Dodano octanu etylu i wytworzony roztwór wysuszono nad MgSO4, przemyto H2 O, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i nasyconym wodnym roztworem NaCl. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i po chromatografii kolumnowej (20% EtOAc/heksany) wyodrębniono produkt w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCl 3): δ 7,96 (1H, s), 7,89 (1H, f J = 8,4 Hz), 7,70 (2H, m), 7,52 (1H, d, J = 1,9 Hz) , 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (5H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz),
1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
Kwas 2-lluoro-4-[|)5,6-dihydro-5,57dlmttyk>-8-(0-metylofenylo--2-naftalenylo)kćlr'borylo]amlno] benzoesowy (związek 41)
Do roztworu 41,6 mg (0,091 mmol) 2-fluoro-4-[[(5,6-dihycdΌ-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenyk))-2-raftαleryk))karbonγlo]amiro]berzoesanu etylu (związek 40) w 2,0 ml EtOH i 2,0 ml THF dodano 40,0 mg NaOH (1,00 mmol, 1,0 ml 1 M wodnego roztworu). Po wymieszaniu w temperaturze pokojowej przez noc, reakcję przerwano dodatkiem 10% HCl. Po ekstrakcji EtOAc i wysuszeniu warstw organicznych nad MgSO4 i po usunięciu rozpuszczalnika pod i88 705 zmniejszonym ciśnieniem uzyskano ciało stałe. Po krystalizacji z CH3CN uzyskano tytułowy związek jako bladożółte ciało stałe. iH NMR (d6-aceton): δ 9,84 (iH, s), 7,94-7,83 (3H, m),
7,64 (iH, dd, J = 2,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,i Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (iH, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,36 (3H, s), i,35 (6H, s).
4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)tiokarbonylo]amino]benzoesan etylu (związek 42)
Roztwór ii0,0 mg (0,25 mmol) 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2naftalenylo)karbonylo]^anino]-benzoesanu etylu (związek 35) i i2i,0 mg (0,30 mmol) [2,4bis(4-metoksyfenylo)-i,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disiarczku] (reagent Lawessona) w i2,0 ml benzenu ogrzewano w temperaturze wrzenia przez noc. Po oziębieniu do temperatury pokojowej mieszaninę przesączono i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Tytułowy związek wydzielono metodą chromatografii kolumnowej (i0 do 25% EtOAc/heksany) jako żółte ciało stałe. iH NMR (CDCh): δ 8,92 (iH, s), 8,06 (2H, t, J = 8,5 Hz), 7,88-7,70 (3H, m), 7,42 (2H, d, J = 8,i Hz), 7,i8 (4H, m), 6,03 (iH, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,i Hz),
2,38 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), i,56 (3H, t, J = 7,i Hz), i,35 (6H, s).
Kwas 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)tiokarbonylo]amino] benzoesowy (związek 43)
Do roztworu 84,0 mg (0,i84 mmol) 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)2-raftalerylo)tiokarbonylo]-amino]benzoesanu etylu (związek 42) w 2,0 ml EtOH i 20 ml THF dodano 60,0 mg NaOH (i,50 mmol, i,5 ml i M roztworu wodnego). Po wymieszaniu w temperaturze pokojowej przez noc, reakcję przerwano dodatkiem i0% HCl. Po ekstrakcji EtOAc, wysuszeniu warstw organicznych nad MgSO4 i po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano ciało stałe. Po krystalizacji z CH3CN uzyskano tytułowy związek w postaci żółtego ciała stałego. iH NMR (d6-aceton): δ i0,96 (iH, s), 8,05 (4H, m), 7,72 (iH, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,54 (iH, s), 7,46 (iH, d, J = 8,i Hz), 7,20 (4H, m), 6,04 (iH, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,33 (3H, s), i,35 (6H, s).
2-acetylo-8-bromonaftalen (związek L)
Do zimnej (i0°C) mieszaniny 44,0 g (0,2i2 mol) 2-bromonaftalenu i 34,0 g (0,255 mol) chlorku glinu w 400 ml nitrobenzenu dodano 2i,0 g (267 mmol) chlorku acetylu. Mechanicznie mieszaną mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i ogrzewano do 40°C przez i8 godzin. Po oziębieniu do 0°C na łaźni lodowej reakcję zatrzymano przez dodanie i2 M HCl (70 ml). Warstwy oddzielono i fazę organiczną przemyto wodą i rozcieńczonym wodnym roztworem Na2CO3. Po destylacji przez chłodnicę kulkową, a następnie po rekrystalizacji z i0% EtOAc-heksan otrzymano 23 g tytułowego związku jako brązowego ciała stałego. iH NMR (CDCl3): δ 8,44 (iH, br s), 8,04-8,i0 (2H, m), 7,85 (iH, d, J = 8,5 Hz), 7,82 (iH. d, J = 8,8 Hz), 7,64 (iH, d, J = 8,8 Hz), 2,73 (3H, s).
Kwas 6-bromo-2-naftalenokarboksylowy (związek M)
Do roztworu podchlorynu sodu (62 ml, 5,25% w wodzie (wagowo), 3,6 g, 48,i8 mmol) i wodorotlenku sodu (6,4 g, i60,6 mmol) w 50 ml wody dodano roztwór 2-acetylo-6bromonaftalenu (związek L), 4 g (i6,06 mmol) w 50 ml i,4-dioksanu. Żółty roztwór ogrzewano do 70°C w łaźni olejowej przez 2 godziny, oziębiono do temperatury otoczenia i ekstrahowano eterem etylowym (2 x 50 ml). Warstwy wodne rozcieńczono roztworem NaHSO3 (aż wskaźnikowy roztwór KI pozostawał bezbarwny) i następnie zakwaszono (pH < 2) iN kwasem siarkowym z wytworzeniem białego osadu. Mieszaninę ekstrahowano eterem etylowym i połączoną fazę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono (MgSO4) i zatęzono z wytworzeniem 3,54 g (88 %) tytułowego związku w postaci ciała stałego. iH NMR (DMSO-d6): 8,63 (iH, br s), 8,32 (iH, d, J = 20 Hz), 8,i0 (iH, d, J = 8,8 Hz), 8,00-8,05 (2H, m), 7,74 (iH, dd, J = 2,0, 8,8 Hz).
6-bromo-2-naftalenokarboksylan etylu (związek N)
Do roztworu kwasu 6-bromo-2-naftalenokarbołk;ylowego (związek M) 3,i g, (i2,43 mmol) w etanolu (30 ml, 23,55 g, 5ii,0 mmol) dodano 8M kwasu siarkowego (2 ml). Roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 30 minut, oziębiono do temperatury pokojowej i mieszaninę reakcyjną podzielono pomiędzy pentan (i00 ml) i wodę (i00 ml). Wodną fazę ekstrahowano pentanem (100 ml) i połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym wod188 705 nym roztworem NaCl (100 ml), wysuszono (MgSO4) i zatężono z wytworzeniem białawego ciała stałego. Po oczyszczeniu metodą szybkiej chromatografii (krzemionka, 10% EtOAcheksan) uzyskano tytułowy związek w postaci białego ciała stałego. 1H NMR (CDCl3): δ 8,58 (1H, br s), 8,10 (1H, dd, J = 1,7, 9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 2 Hz), 7,83 (1H, d, J = 9 Hz), 7,80 (1H, d, J = 9 Hz), 7,62 (1H, dd, J = 2,9 Hz).
(E)-4-(2-(5,6,7,8-te1aahydao-5,5-dimetylo~8~okso-2-naftalenylo)etenylo]benzoesan etylu (związek O)
Do roztworu 520,0 mg (2,00 mmol) 3,4~dihydra-4,4-dimetylo-7-bromo-1(2EΓ)~nafta!eno (związek B) i 510,0 mg (2,30 mmol) 4-winylobenzoesanu etylu w 4,0 ml trietyloaminy (odgazowanej przez przedmuchiwanie argonem przez 25 minut), dodano 124,0 mg (0,40 mmol) tris(2metylofenylo)fosfiny, następnie 44,0 mg (0,20 mmol) octanu palladu(II). Wytworzony roztwór ogrzewano do 95°C przez 2,5 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie metodą kolumnowej chromatografii (10% EtOAc/heksany) uzyskano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCla): δ 8,19 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,20 (2H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,76 (2H, t, J = 8,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz, i 6H, s).
(E)-4~[2-[5,6-dihydro-5,5~dimetylo-8~etaifluorometylosulfonylo)oksy-2-naftalenylo)etenylo]benzoesan etylu (związek P)
Do zimnego (-78°C) roztworu 440,0 mg (2,40 mmol) bis(tr^:met^i^osililo)amidku sodu w 10,0 ml THF dodano 700,0 mg (200 mmol) (E)~4-(2-(5,6,7,8~tetaahydro-5,5~dimetylo-8~ okso-2-naftalenylo)etenylo]benzoesanu etylu (związek O) jako roztworu w 25,0 ml THF. Po wymieszaniu w temperaturze -78°C przez 1,5 godziny dodano w jednej porcji 960,0 mg (240 mmol) 2[NENLbίs(tritluorometyk^sufί-nrylo)amino']-5·-chloropirγdynty. Po 30 minutach roztwór ogrzano do 0°C i mieszano przez 3 godziny. Reakcję przerwano dodatkiem nasyconego wodnego roztworu NH4O i ekstrahowano EtOAc. Połączone ekstrakty przemyto 5% wodnym roztworem NaOH, wysuszono (Na2 SO4) i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Tytułowy związek wydzielono w postaci bezbarwnego ciała stałego metodą kolumnowej chromatografii (7% EtOAc/heksany). 1H NMR (CDCl 3): δ 8,04 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (1H, s), 7,49 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,10 (1H, d, J = 16,4 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz),
2,43 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
(Ej-4-[2-(5,6-dihyyiO-5,5-dimetYlo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etenylo]benzoesan etylu (związek 44)
Roztwór 4~litotoluenu wytworzono w temperaturze -78°C przez dodanie 130,7 mg t-butylolitu (2,04 mmol; 1,20 ml 1,7 M roztworu w pentanie) do roztworu 374,5 mg (2,20 mmol) 4-baomotoluenu w 2,5 ml THF. Po 30 minutach dodano roztwór 313,4 mg (2,30 mmol) ZnCl2 w 2,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do pokojowej temperatury, mieszano przez
1,25 godziny i następnie dodano przez rurkę do roztworu 285,0 mg (0,590 mmol) ^)-4-(2-(5,6dihydla'l-5.5-dimetylo-8--(riffuorometγ'losulfonylo)oksy~2~naftalenylo)etenyk-]be.ιnzoesanιl etylu (związek P) i 29,0 mg (0,025 mmol) tetrakis(trifenylofosfiino)panadu(0) w 2,0 ml THF. Wytworzony roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez godzinę i następnie w temperaturze 55°C przez 2 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej reakcję zatrzymano przez dodanie nasyconego wodnego roztworu NH4Cl. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc i połączone ekstrakty przemyto 5% wodnym roztworem NaOH, nasyconym wodnym roztworem NaCl i wysuszono nad Na2SO4, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Tytułowe związek wydzielono metodą kolumnowej chromatografii (10% EtOAC/heksany) w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCl 3): δ 7,96 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,47 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,43-7,16 (7H, m), 7,07 (1H, d, J = 16,3 Hz), 6,93 (1H, d, J = 16,3 Hz), 5,97 (1H, t, J =
4,7 Hzz) 4,33» (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,41 ((H, s)) 2,33 ((H, d, J = 4,^ Hz)) 138 ((H, t, J = 7,0 Hz), 1,33 (6 H, s).
Kwas (E)-4-[2-(5,6-dihydn^,5-dimetylo^-(4-metylofenylo)-2~naftaenylo)etenylo]benzoesowy (związek 45)
188 705
Do roztworu 65,0 mg (0,190 mmol) (E)i4-[2i(5,6-dihydrOi5,5-dimetylo-8-(4i metylofenylo^-naftalenylo^tenylo^enzoesanu etylu (związek 44) w 4,0 ml THF dodano 30,0 mg LiOH (0,909 mmol, 1,0 ml 1,1 M roztworu) i 1,0 ml MeOH. Roztwór ogrzewano do 55°C przez 3 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w H 2 O i ekstrahowano heksanami. Warstwę wodną zakwaszono do pH 1 10% HCl i ekstrahowano Et2 O. Połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, rozcieńczono EtOAc z wytworzeniem przejrzystego roztworu i wysuszono nad Na2SO4. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (dó-DMSO): δ 7,86 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,41 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,28 (1H, d, J = 16,5 Hz), 7,23 (4H, s), 7,08 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,07 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,31 (1H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
4i[2-(1,1-dimetylo-3-(4imetylofenylo)i5iindenylo)etynylo]-benzoesan etylu (związek 47)
Roztwór 32,0 mg (0,187 mmol) 4ibromotoluenu w 1,0 ml THF oziębiono do -78°C i ptow<^ł^ dodano 2-4,0 mg 1-131^x10111,^ (0,375 mmol, 0,22 ml 1,! M roztworu w pentanie). Żółty roztwór mieszano przez 30 minut, po czym dodano 29,8 mg (0,219 mmol) ZnCĘ jako roztwór w 1,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do temperatury pokojowej i po 30 minutach dodano do drugiej kolby zawierającej 29,0 mg (0,062 mmol) 4-[2i(1,1-dimttylo-3(tπiiuorometylϋsuliΌnyło)ok.syi5-indtnylo)ttynylo]benzoesanu etylu (związek FF) i 2,9 mg (0,003 mmol) tttrakis(trifenylofbsfmo)palladu(0) w 1,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzewano do 50°C przez godzinę i następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Reakcję przerwano dodatkiem nasyconego wodnego roztworu NH4Cl, a następnie ekstrahowano Et2O. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą, nasyconym wodnym roztworem NaCl i wysuszono nad MgSO4, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Tytułowy związek wydzielono jako bezbarwny olej metodą kolumnowej chromatografii (10% Et2O/heksany). 1H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 8,03 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (1H, s), 7,58 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,38 (1H, d, J 5 = 7,7 Hz), 7,28 (2H, d, J = 9 Hz), 6,43 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,43 (3H, s), 1,41 (3N, t; + 6H, s).
Kwas 4i[2-(1,1idimetylo-3-(4-metyloienylo)-5iindenylo)etynylo]]btnzoesoW’'y (związek 48)
Do roztworu 10,0 mg (0,025 mmol) 4-[2-(1,1-dimetylo-3-(4-metylofenylo)-5indenylo^tynylo^enzoesanu etylu (związek 47) w 0,5 ml THF/H2O (3:1 objętościowo) dodano 5,2 mg (0,12 mmol) LiOH H2O. Po wymieszaniu w temperaturze pokojowej przez 46 godzin roztwór ekstrahowano heksanami i warstwę wodną zakwaszono nasyconym wodnym roztworem NH4Cl. Dodano stałego NaCl i wytworzoną mieszaninę ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne wysuszono (Na2 SO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku jako bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (300 MHz, d6-DMSO): δ 7,95 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, m), 7,49 (3H, m),
7,30 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,61 (1H, s), 2,36 (3H, s), 1,36 (6 H, s).
Kwas 3 -(4-bromotiofenoksy)propionowy
Do roztworu 1,44 g (35,7 mmol) NaOH w 20,0 ml odgazowanej H2O (przedmuchanej argonem) dodano 6,79 g (35,7 mmol) 4-bromotiofenolu. Wytworzoną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Drugą kolbę napełniono 2,26 g (16,3 mmol) K?CO3 i 15 ml odgazowanej H2O. Do tego roztworu dodano (porcjami) 5,00 g (327 mmol) kwasu --bromopropionowego. Wytworzony roztwór karboksylanu potasu dodano do roztworu tiolanu sodu i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Mieszaninę przesączono i przesącz ekstrahowano benzenem, a połączone organiczne warstwy odrzucono. Warstwę wodną zakwaszono 10% HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone organiczne warstwy przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymane ciało stałe rekrystalizowano z Et2O heksanów i otrzymano związek tytułowy w postaci białawych kryształów. 1H NMR (CDCl 3): δ 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,4 Hz), 3,15 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,68 (2H, t, J = 7,3 Hz).
188 705
2.3- dihydro-8-bromo-(4H)-1-benzotiopiran-4-on
Roztwór 3,63 g (13,9 mmol) kwasu 3-(4-bromotiofenoksy)-propionowego w 60 ml kwasu metanosulfonowego ogrzewano do 75 °C przez 1,5 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej roztwór rozcieńczono H2O i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto 2N wodnym roztworem NaOH, H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, a następnie wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano żółte ciało stałe, które oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (3 % EtOAc-heksany) i uzyskano bladożółte ciało stałe. 1H NMR (CDCl 3): δ 8,22 (1H, d, J = 2-1 Hz), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,17 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,24 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,98 (2H, t, J = 6,7 Hz),
2.3- dihydro-6-(2-trimetylosililoetynylo)-(4H)-1-benzotiopiran-4-on
Roztwór 1,00 g (4,11 mmol) 2,3-dihydro-6-bromo-(4H)-1-benzotiopiran-4-onu i 78,3 mg (0,41 mmol) Cul w 15,0 ml THF i 6,0 ml Et2NH przedmuchano argonem przez 5 minut. Do tego roztworu dodano 2,0 ml (1,39 g, 14,2 mmol) (trii^ι^^t^]^o^ililo)aeetyleru, następnie 288,5 mg (0,41 mmol) chlorku bis(trifeIrylofc>sfino)palladu(Π). Wytworzony ciemny roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez, 3 dni i następnie przesączono przez warstwę celitu, który przemyto EtOAc. Przesącz przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl i wysuszono nad MgSO4. Tytułowy związek wydzielono w postaci pomarańczowego oleju metodą chromatografii kolumnowej (4% EtOAc - heksany). 1H NMR (CDCl 3): δ 8,13 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,19 (2H, d, J = 6,3 Hz), 2,91 (2H, d, J = 6,3 Hz), 0,21 (9H, s).
2.3- dihydro-6-etynylo-(4H)-1-benzotiopiran-4-on
Roztwor zawierający 600,0 mg (2,25 mmol) 2,3-dihydro-6-(2-trimetylosililoetynylo)(4H)-1-benzatiopiran-4-onu i 100,0 mg (0,72 mmol) K2CO3 w 15 ml MeOH mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 godzin. Roztwór rozcieńczono H2O i ekstrahowano Et2O. Połączone warstwy organiczne przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, po czym wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek jako pomarańczowe ciało stałe. 1H NMR (CDCI3) : δ 8,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,40 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,22 (2H, t, J = 8,3 Hz), 3,08 (1H, s), 2,94 (2H, t, J = 6,3 Hz).
4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1-benzotiopiran-4-onylo))etynylo]-benzoesan etylu
Roztwór 405,0 mg (215 mmol) 2,3-dihydro-6-etynylo-(4H)-1-benzotiopiran-4-onu i 594,0 mg (2,15 mmol) 4-jodobenzoesanu etylu w 15 ml EtyN i 3 ml THF przedmuchano argonem przez 15 minut. Do tego roztworu dodano 503,0 mg (0,72 mmol) chlorku bis(trifenylofosfmo)palladu(II) i 137,0 mg (0,72 mmol) Cul. Otrzymany roztwór mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej i następnie przesączono przez warstwę celitu, który przemyto EtOAc. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano brunatne ciało stałe. Po chromatografii kolumnowej (3% EtOAc-heksany) uzyskano tytułowy związek w postaci pomarańczowego ciała stałego. 1H NMR (d6-aceton): δ 8,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz),
7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,40 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,96 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,37 (3H,t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(6-(4-(trifluorometylosulfonylo)oksy-(2H)-1-benzotiopirarylo))etynylo]benzoesan etylu
Do roztworu 221,9 mg (1,21 mmol) bis(tr^^m^^tt^ll^^ililo)-amidku sodu w 3,0 ml THF oziębionego do -78°C dodano 370,0 mg (1,10 mmol) 4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1-benzotiopiran-4-onylo))etynylo]benzoesanu etylu w 4,0 ml THF. Po 30 minutach powoli dodano roztwór 2-[N,N-bis(triΠuoromeiyίosuiforylo)amiro)-5-ehioropirydyry w 4,0 ml THF. Mieszaninę powoli ogrzano do temperatury pokojowej i po 5 godzinach zatrzymano przez dodanie nasyconego wodnego roztworu NH4 Cl. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc i połączone organiczne warstwy przemyto 5% wodnym roztworem NaOH, H2 O i nasyconym wodnym roztworem NaCl przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie po chromatografii kolumnowej (4% EtOAc-heksany) uzyskano tytułowy związek jako bladożółte ciało stałe. 1H NMR (d6-aceton): δ 8,12 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,56 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,40 (1H, d,
188 705
J = 8,1 Hz), 6,33 (1H, t, J = 5,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,82 (2H, d, J = 5,7 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(6-(4-(4-metylofeyylo)-(2H)-1-benzotiopirayylo))-etynylo]benzoesay etylu (związek 49)
Do roztworu 120,8 mg (0,70 mmol) 4-bromotoluenu w 20 ml THF w temperaturze -78°C dodano 88,4 mg (1,38 mmol, 0,81 ml 1,7 M roztworu w pentanie) t-butylolitu. Po 30 minutach dodano roztwór 131,6 mg (0,97 mmol) ZnCh w 20 ml THF i wytworzony bladożółty roztwór ogrzano do temperatury pokojowej. Po mieszaniu przez 40 minut otrzymany roztwór dodano do drugiej kolby zawierającej 129,2 mg (0,28 mmol) 4-[2-(6-(4(trifluorometylosulfonylo)oksy-(2H)-1-benzotiopiranylo))-etyyylo]benzoesanu etylu, 14,0 mg (0,012 mmol) tetrakis(trifenylofosfino)palladu(0), i 2,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzewano do 50°C przez 5 godzin, oziębiono do temperatury pokojowej i reakcję przerwano dodatkiem nasyconego wodnego roztworu NH4CL Mieszaninę ekstrahowano EtOAc i połączone warstwy organiczne przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono (MgSO4) i zatężono do pomarańczowego oleju. Tytułowy związek wydzielono w postaci bezbarwnego ciała stałego metodą chromatografii kolumnowej (3 do 5% EtOAcheksany). 1H NMR (dó-aceton): δ 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44-7,38 (2H, m), 7,26-7,15 (5H, m), 6,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,53 (2H, d, J =
5,8 Hz), 2,37 (2H, s), 1,35 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Kwas 4-[2-(6-(4-(4-metylofeyylo)-(2H)-1-beyzotiopiranylo))-etynylo]benzoesowy (związek 50)
Do roztworu 29,0 mg (0-07 mmol) 4-[2-(6-(4-(4-metylofenylo)-(2H)-1-benzotiopiranylo))etynylo]beyzoesayu etylu (związek 49) w 2,0 ml tHf i 2,0 ml EtOH dodano 160,0 mg (4,00 mmol, 2,0 ml 2 M roztworu wodnego). Wytworzony roztwór mieszano w temperaturze 35°C przez 2 godziny, a następnie oziębiono do temperatury pokojowej i mieszano przez dodatkowe 2 godziny. Reakcję przerwano dodatkiem 10% wodnego roztworu HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl i wysuszono nad Na2SO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano ciało stałe, które przemyto CH3CN i wysuszono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci bladożółtego ciała stałego. 1H NMR (dó-DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40 (4H, m), 7,257,13 (4H, m), 7,02 (1H, d, J = 1,7 Hz), 6,11 (1H, t, J = 5,7 Hz), 3,54 (2H, d, J = 5,7 Hz), 2,34 (3H, s).
3,4-dihydro-4,4-dimetyło-7-acetylo-1(2H)-naftalenon (związek R) i 3,4-dihydro-4,4-dimetylo6-acetylo-1(2HS-naftalenon (związek S)
Do zimnej (0°C) mieszaniny chlorku glinu (26,3 g, 199,0 mmol) w dichlorometanie (55 ml) dodano chlorek acetylu (15 g, 192 mmol) i 1,2.3,4-tetrahydro-1.1-dimetylonaftalen (24,4 g, 152 mmol) w dichlorometanie (20 ml) w czasie 20 minut. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury otoczenia i mieszano przez 4 godziny. Lód (200 g) dodano do kolby reakcyjnej i mieszaninę rozcieńczono eterem (400 ml). Warstwy oddzielono i fazę organiczną przemyto 10% HCl (50 ml), wodą (50 ml), 10% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i nasyconym wodnym roztworem NaCl (50 ml) przed osuszeniem nad MgSO4. Rozpuszczalnik usunięto przez destylację i otrzymany żółty olej rozpuszczono w benzenie (50 ml).
Do zimnego (0°C) roztworu kwasu octowego (240 ml) i bezwodnika octowego (120 ml) dodano trójtlenek chromu (50 g, 503 mmol) w małych porcjach w czasie 20 minut pod argonem. Mieszaninę mieszano przez 30 minut w temperaturze 0°C i rozcieńczono benzenem (120 ml). Stosując wkraplacz podczas mieszania w ciągu 20 minut dodano wytworzonego wcześniej roztworu w benzenie. Po 8 godzinach reakcję przerwano ostrożnie dodając izopropanolu (50 ml) w temperaturze 0°C, następnie wody (100 ml). Po 15 minutach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem (1100 ml) i wodą (200 ml), następnie zobojętniono stałym wodorowęglanem sodu (200 g). Warstwę eterową przemyto wodą (100 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (2 x 100 ml) i wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano mieszaninę izomerycznych diketonów, którą rozdzielono metodą chromatografii (5% EtOAc/heksany). (Związek R): 1H NMR (CDCl3): δ 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,41 (6H, s). (związek S): 1H NMR
188 705 (CDCl3): δ 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
3.4- dibzdro-4.4-diIaetylo-7-(2-(2-Iaetylo-.1,3-dionsolśnyly))-1 (2H)-naftalenon (związek T)
Mieszaninę 3<4-dibydro-7,7-dimetylo-7-acetylo-((2H)-naftalenon (zkiąrkk R) (140,0 mg, 0,60 mmol), glikol etylenowy (55,0 mg, 0,90 mmol), monohydrat kwasu p-tyluenosulfonowego (4 mg) i benzenu (25 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia z użyciem aparatu Deana-Starka przez 12 godzin. Reakcję przerwano dodatkiem 10% wodnego roztworu wodorowęglanu sodu i ekstrahowano eterem (2 x 75 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (5 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (5 ml) i wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy związek jako olej. 1H NMR (CDCl3): δ 8,13 (1H, d, J = 20 Hz), 4,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,40 (1H, d, J =
8,2 Hz^ 3,97-4,10 m)) 3,70-3,83 (^2^, i) 2,^^ t, J = 6,5 Hz^ 2,<^^ t, J = 6,5
Hz), 1,64 (3H, s), 1,39 (6H, s).
(,2,3<4-tktrśbzdro-(-hydroksy-(-(7-metylofknylo)-7,7-dimktyło-7-(2-(2-metylo-(<3-diynsolanylo))nafalkn (związek U)
Do roztworu (95<7 mg (1,00 mmol) bromku p-tolilomagnkzu (1,0 ml; 1M roztwór w eterze) w 2 ml THF dodano roztworu 3,7-diby-'dro-4,4-dίmetyk'o7-(2-(2-metylo-1.,3-dionsylanylo))-1(2H)-naftalknonu (związek T) (35,0 mg, 0,52 mmol) w 5 ml THF. Roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 16 godzin, oziębiono do temperatury pokojowej i rozcieńczono eterem (50 ml). Roztwór przemyto wodą (5 ml), nasyconym wodnym roztworem NH4Cl (5 ml) i wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczślninók pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografii kolumnowej (5% EtOAc/heksany) uzyskano tytułowy związek jako ciało stałe. 1H NMR (CDO3): δ 7,34 (2H, d), 4,21 (iH, s), 4,(3 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,08 (2H . d . J 8. 8,5 Hz) . 3,88-3,99 (2H . m). 3,58-3775 (2H. m). 2,34 (3H . s). W^O (2H , m), 1,79-1,90 (1H, m), 1,57 (3H, s), MS-bd (1H, m), 1,38 (3H, s), 1,31 (3H, s). 3,7-dlhydro-1-(7-metylofenyly)-4,4-dimetyly-7-acetylonaftślkn (związek V)
Mieszaninę 1,2.3,4-tktrahyriyυ-( -hy·^^^-1 -(4-metzZyftnykl)-7,7-dimetykl-7-(2-22-metyZo(,3-diyksolanyly))naftalenu (związek U) 130,0 mg (0,38 mmol), monohydratu kwasu p,ιτΙποικ^ιι! tonowego (4 mg) i benzenu (5 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 16 godzin. Po oziębieniu do temperatury prnojywkj mieszaninę reakcyjną rozcieńczyny eterem (100 ml) i przemyto 10% wodnym roztworem wydyrywęglanu sodu, wodą, i nasyconym wodnym roztworem NaCl. Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku w postaci ciała stałe go. 1H NMR (CDCl3): δ 7,83 (1H, dd, J = 1,8, 8,0 Hz), 7,66 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,3 Hz), 2,77 (3H, s), 2,41 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 6,3 Hz), 1,36 (6H, s).
(E)-3-((,6-dibydro-5,5-dimktylo-8-(4-metylofenylo)-2-nafaJenyly)-2-butenyni1rzl (rkiąrek W)
Do zawiesiny NaH (48,0 mg, 2,00 mmol) w THF (6 ml) dodano dietylocyjanymetzlofysfonian (450,0 mg, 2,50 mmol). Po 40 minutach dodano roztwór 3,7-dibydyo-1-(7-metyiofenyio)7.4- dlmktyZo-7-acetyZonaftślenu (związek V) 95,0 mg, (0,33 mmol) w THF (4 ml). Mlksraninę mieszano przez 16 godzin, rozcieńczono eterem (100 ml) i przemyto wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl przed osuszeniem nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografii kolumnowej (3% EtOAc/heksany) uzyskano tytułowy związek jako ciało stałe. 1H NMR (CDCh): δ 4,39 (1H, d, J = 1H), 7,32 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,20-7,25 (4H, brs), 7,15 (1H, d, J = 20 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,44 (1H, s), 2,42 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 6,0 Hz), 2,35 (3H, s), 1,35 (6H, s).
(H)-J-^(^, 6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)-2-butenal (związek X)
Do zimnego roztworu (-78°C) (E)-3-(5,6-dlbz'dryy-5,5-dimetylo-8-(4-meΐγlofenyZ(r)-2naaftalenyloj-d-butenrnltiyZu (związek W) 84,0 mg, 0,29 mmol) w dichlorometanie (4 ml) dodano 0,50 ml (0,50 mmol) wodorku diizobut^loglinu (1M roztwór w dichlorometanie). Po wymieszaniu przez godzinę reakcję przerwano w temperaturze -78°C dodatkiem 2-propśnolu (1 ml) rozcieńczony eterem (100 ml). Po ogrzaniu do temperatury pokojowej, roztwór przemyto wodą, 10% HCl i nasyconym wodnym roztworem NaCl. Warstwę organiczną, wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytu52
188 705 łowego związku jako oleju. 1H NMR (CDCl3): δ 10,12 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,43 (2H, s), 7,197,28 (5H, m), 6,27 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,03 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,42 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,37 (6 H, s).
(E,E,E)-3-metylo-7-(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftałenylo)-2,4,<6-olk:atrienian (związek 51)
Do zimnego (-78°C) roztworu dietylo-(E)-3-etoksykarbonylo-2-metyloallilofosfonianu [wytworzonego według J. Org. Chem. 39: 821 (1974)] 264,0 mg, (1,00 mmol) w THF (2 ml) dodano 26,0 mg (0,41 mmol, 0,65 ml) n-butylolitu w heksanach (1,6 M roztwór) i natychmiast dodano (E)-3-(5t6-dlhydro-5,5-dimetylo-8-(4-metyk-ferylo)-2-ral'taltryk))-2-butenalu (związek X) 82,0 mg, 0,26 mmol) w THF (3 ml). Po 1 godzinie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem (60 ml), przemyto wodą (5 ml), nasyconym wodnym roztworem NaCl (5 ml) i wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem tytułowy związek wydzielono jako olej metodą kolumnowej chromatografii (5% EtOAc/heksany, następnie HPLC z użyciem 1% EtOAc/heksany). 1H NMR (aceton-d6): δ 7,36-7,43 (2H, m),
7.18- 7,27 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 11,2, 15,2 Hz), 6,46 (1H, d, J =
11,2 Hz), 6,38 (1H, d, J = 15,2 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,78 (1H, s), 4,10 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,12 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Kwas (E,E,E)-3-metylo-7-(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-nafta.lenylo)-2,4,6oktatrienowy (związek 52)
Do roztworu (E,E,E)-3-metylo-7-(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftαlenylo)-2,0,6--kiyatrienian (związek 51) 85,0 mg, 0,20 mmol) w THF (1 ml) i metanolu (1 ml) dodano 12,0 mg (0,50 mmol) LiOH (0,5 ml, 1M roztwór). Mieszaninę mieszano przez 6 godzin, rozcieńczono eterem (60 ml), zakwaszono 10% HCl (1 ml). Roztwór przemyto wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl, po czym wysuszono nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tutyłowy związek jako ciało stałe, które oczyszczono przez rekrystalizację z acetonu. 1H NMR (aceton-d6): δ (7,35-7,45 (2H, m),
7.19- 7,28 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 11,5, 15,1 Hz), 6,48 (1H, d, J =
11,5 Hz), 6,42 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,82 (1H, s), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,32 (3H, s), 2,13 (3H, s), 1,32 (6H, s).
3,0-dlhydro-4,4-dimetyk)-7-mtro-1(2H)-raftalenor (związek Y)
Do 1,7 ml (3,0 g, 30,6 mmol, 18M) H2 SO4 w temperaturze -5°C (łaźnią lód-NaCl) powoli dodano 783,0 mg (4,49 mmol) 3,4-dihydro-4t4-dlmetylo-3(2H)-naftαlenoru. Powoli dodano roztwór 426,7 mg (6,58 mmol, 0,43 ml, 16 M) HNO 3, i 1,31 g (0,013 mol, 0,74 ml, 18 M) H2SO4. Po 20 minutach dodano lód i powstałą mieszaninę ekstrahowano EtOAc. Połączone ekstrakty zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem pozostałości, z której metodą chromatografii kolumnowej (10% EtO-Ac/heksany) wydzielono tytułowy związek, bladożółte ciało stałe. 1H NMR (CDCls): δ 8,83 (1H, d, J = 2,6 Hz), 8,31 (1H, dd, J = 2,8,
8,9 EH), 77,2 (1H, d, J = 8,1 ife), 2,88 (2H, t,J == 6,5 ife), 2,08 (2H, t, J = 6^5 ife), (,44 (6H, ss.
3,4-dihydro-4,47dimctylo-7-amino-1(2H)-naftαlenon (związek Z)
Roztwór 230,0 mg (1,05 mmol) 3,0-dihydro-4,4-dimetyΊo-7-nitro-1(2H)-nafta.lenonu (związek Y) w 5,0 ml EtOAc mieszano w temperaturze pokojowej z katalityczną ilością 10% Pd-C pod ciśnieniem 1atm H2 przez 24 godziny. Katalizator usunięto przez filtrację przez warstwę celitu, przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano tytułowy związek jako ciemnozielony olej. 1H NMR (CDCl3): δ 7,30 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,22 (1H, d, J = 8,4 Hz), 6,88 (1H, dd, J = 2,7, 8,5 Hz), 2,70 (2H, t, J - 6,6 Hz), 1,97 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimetylo-8-okso-2-nafttalenylo)azo]benzoesan etylu (związek AA)
Do roztworu 198,7 mg (1,05 mmol) 3t0-dlhydro-4,0-dlmetylo-7-amino-2(2H)-naftalenonu (związek Z) w 5,0 ml lodowatego kwasu octowego dodano 380,0 mg (1,00 mmol) 4nitrozobenzoesami etylu. Wytworzony roztwór mieszano przez noc w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt wydzielono z resztowego oleju jako czerwone ciało stałe, metodą kolumnowej chromatografii (15% EtOAc - heksany). 1H NMR (CDCl 3): δ 8,57 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,94 (2H, d, i88 705
J = 8,4 Hz), 7,58 (iH, d, J = 8,6 Hz), 4,4i (2H, q, J = 7,i Hz), 2,79 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,07 (2H, t, J = 7,02 Hz), i,44 (6H, s), i,42 (3H, t, J = 7,i Hz).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetllcc-8-(trifluoromctyίosulforylo)--0ksy-2-naίltacrιyloCaz0]benzoesar etylu (związek BB)
Do roztworu 90,4 mg bis(trimetylosililo)amidku sodu (0,48 mmol, 0,48 ml i,0 M roztworu THF) w 2,0 ml THF w temperaturze -78°C, dodano i53,0 mg (0,437 mmol) 4-[(5,6,7,8tterahydro5,5-dimetylo-8-okso-2-naftalenylo)azo]benzoesanu etylu (związek AA) w 20 ml THF. Ciemnoczerwony roztwór mieszano w temperaturze -78°C przez 30 minut i następnie dodano 204,0 mg (0,520 mmol) 2-[N,N-bis(ttifluorometylosulfonylo)amino]-5-chloropirydyny jako roztworu w 2,0 ml THF. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do pokojowej temperatury i po 3 godzinach zatrzymano reakcję przez dodanie H2O. Organiczną. warstwę zatężono do czerwonego oleju pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt wydzielono metodą chromatografii kolumnowej (25% EtOAc/heksany) w postaci czerwonego oleju. iH NMR (CDCl 3): δ 8,2i (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (iH, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (iH, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,i Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), i,44 (3H, t, J = 7,i Hz), i,38 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)azo]berzoesan etylu (związek 46a)
Roztwór 4-litotoluenu wytworzono przez dodanie 629 mg (0,58 ml, 0,98 mmol) tbutylolitu (i,i M roztwór w pentanie) do zimnego roztworu (-78°C) 84,0 mg (0,49i mmol) 4bromotoluenu w i,0 ml THF. Po wymieszaniu przez 30 minut dodano roztworu i07,0 mg (0,785 mmol) chlorku cynku w 2,0 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzano do pokojowej temperatury, mieszano przez 30 minut i dodano przez rurkę do roztworu 94,7 mg (0,i96 mmol) 4[(5l6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(trifluorometylosulfonylo)oksy-2-naftalenylo)ίazo]benzoesanu etylu (związek BB) i 25 mg (0,02 mmol) tetrakis('trifenylofosfino)palladu(O) w 20 ml THF. Wytworzony roztwór ogrzewano w temperaturze 50°C przez i,5 godziny, oziębiono do pokojowej temperatury i rozcieńczono nasyconym wodnym roztworem NH4Cl. Mieszaninę ekstrahowano EtOAc (40 ml) i połączone organiczne warstwy przemyto wodą i solanką. Fazę organiczną wysuszono nad Na2SO4, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i tytułowy związek wy dzielono jako czerwone ciało stałe metodą kolumnowej chromatografii (25% EtOAc-heksany) iH NMR (CDCI3): δ 8,2i (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (iH, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (iH, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,i Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), i,44 (3H, t, J = 7,i Hz), i,38 (6 H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-rafialenylo')azo]benzoesow'y (związek 46b)
Do roztworu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftaenylo)azo]benzoesanu etylu (związek 46a) i6,5 mg, 0,042 mmol) w THF (2 ml) i etanolu (iml) dodano 80,0 mg (200 mmol) NaOH (2,0 ml, iM roztwór wodny). Mieszaninę mieszano przez i2 godzin w temperaturze pokojowej, zakwaszono i0% HCl i ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono nad MgSO4. Po usunięciu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrysttdizacją. pozostałości z EtOAC/heksanu uzyskano tytułowy związek jako czerwone ciało stałe. iH NMR (acetond6): δ 8,i9 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (2H, dd, J = 2,i, 6,i Hz),7,66 (iH, s), 7,64 (2H, d, J = 2,3 Hz), 7,28 (4H, d, J = 3,0 Hz), 6,09 (3H, t, J = 25 Hz), 242 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,39 (3H, s), i,40 (6 H, s)
8-(2-trimetylosililo)etynylo-2,3-dihydro-3,3-dimetylo-1H-irden-1-on (związek CC)
Do roztworu 8i5,0 mg (3,4i mmol) 6-bromo-2,3-dihydro-3,3-dimetylo-iH-inden-i-onu (patrz Smith i in. Org. Prep. Proced. Int. i978 i0 i23-i3i) w i00 ml odgazowanej Et3N (przedmuchiwane argonem przez 20 minut) dodano 259,6 mg (i,363 mmol) jodku miedzi(I),
956,9 mg (i,363 mmol) chlorku bis(trifenylofosfino)palladu(II), i 3,i4 g (34,08 mmol) (trimetylosililo)acetylenu. Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 70°C przez 42 godziny, oziębiono do temperatury pokojowej, przesączono przez warstwę żelu krzemionkowego i przemyto eterem. Przesącz przemyto wodą, i M HCl, wodą i na koniec nasyconym wodnym roztworem NaCl, po czym wysuszono nad MgSO4. Po zatężeniu roztworu pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie po chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy; 10% Et20 - heksany) uzyskano tytułowy związek w postaci brunatnego oleju. iH NMR (300 MHz, CDCE):
188 705 δ 7,79 (1H, d, J = 1,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 1,6, 8,3 Hz), 7,42 (1H, d, J = 8,5 Hz), 2,80 (2H, s), 1,41 (6 H, s), 0,26 (9H, s).
6-ttynylo-2,3idihydro-3,3-dimetylo-1H-inden-1iOn (związek DD)
Do roztworu 875,0 mg (3,41 mmol) 6-(2itrimetylosililo)ttynylo-2,--dihy'drOi3,3-dimetyk>111-inden-konu (związek CC) w 28 ml MeOH dodano 197,3 mg (1,43 mmol) K2CO3 w jednej porcji. Po mieszaniu przez 6 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę przesączono przez warstwę celitu i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały olej umieszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym i eluowano 5% EtOAc-heksany z wytworzeniem tytułowego produktu jako bez barwnego oleju. 1H NMR (300 MHz, CDCh): δ 7,82 (1H, s), 7,72 (1H, dd, J = 1,8,7,8 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,11 (1H, s), 2,61 (2H, s), 1,43 (6H, s).
4i[2-(5,6idihydro-5,5idimetylo-7-okso-2-indenylo)etynylo]btnzotsan etylu (związek EE)
Roztwór 280,0 mg (1,520 mmol) 6-ttynylOi2,--dihydro-3,3-dimetylo-1Hiinden-1-on (związek DD) i 419,6 mg (1,520 mmol) 4ijodobtnzoesanu etylu w 5 ml EhN przedmuchano argonem przez 40 minut. Do tego roztworu dodano 271,0 mg (1,033 mmol) trifenylofosfiny, 53,5 mg (0,281 mmol) jodku miedzi(I) i 53,5 mg (0,076 mmol) chlorku bis(trifenylofosfino)palladu(II). Powstałą mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 25 godzin, oziębiono do temperatury pokojowej i rozcieńczono Et2O. Po przesączeniu przez warstwę celitu przesącz przemyto H2O, 1 M HCl, H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ci śnieniem. Tytułowy związek wydzielono jako bladożółte ciało stałe metodą chromatografii kolumnowej (15% EtOAc-heksany). 1H NMR (300 MHz, d6aceton): δ 8,05 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,87 (1H. dd, J = 1,4, 8,1 Hz), 7,75 (2H, ml, 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (2H, s), 1,45 (6H, s), 1,37 13H, t, J = 7,1 Hz).
4- [2-(1,1 riimetyk>3-(tniluoromttylosuIfony'lo)oksyi·5-mdenylo)etynylo]btnzoes£nl etylu (związek FF)
Roztwór 88,0 mg (0,48 mmol) bis(trimetylosililo)amidku sodu w 0,5 ml THF oziębiono do -78°C i dodano 145,0 mg (0,436 mmol) 4i['2i(5,6-dihydro-5,5-dimetylOi7-oksOi2-irldti nylo^tynylo^enzoesanu etylu (związek EE) jako roztworu w 1,0 ml THF. Po 30 minutach dodano 181,7 mg (0,480 mmol) 2-(N,N-bis(trifluorometanosufbnylo)amino)i5iChloro-pirydyny jako roztworu w 1,0 ml THF. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do powolnego ogrzania do temperatury pokojowej i zatrzymano po 5 godzinach przez dodanie nasyconego wodnego roztworu NH4 Cl.
Mieszaninę ekstrahowano EtOAc i połączone warstwy organiczne przemyto 5% wodnym roztworem NaOH, H2O i nasyconym wodnym roztworem NaCl, następnie wysuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt wydzielono w postaci bezbarwnego ciała stałego metodą kolumnowej chromatografii (10% Et2O-heksany). 1H NMR (300 MHz, dó-aceton): δ 8,05 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,63 (2H, s), 7,55 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Kwas 4i[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)etynylo]be]nzoesowy (związek 60)
Roztwór 142,6 mg (0,339 mmol) 43[(5,6idihydrOi5,5-dimttylo-8-(4imetylofenyΊo)-2i naftalenylojetynylojbenzoesanu etylu (związek 1) i 35,6 mg (0,848 mmol) LiOH-^O w 12 ml THF/wody (4:1, objętościowo), mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano heksanami i heksan ową. frakcję ekstrahowano 5% wodnym roztworem NaOH. Warstwy wodne połączono i zakwaszono 1M HCl, następnie ekstrahowano EtOAc i Et2O. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku jako bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,91 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,47 (2H, s), 7,23 (4H, q, J = 8,1 Hz), 7,01 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,8 Hz),
1,30 (6 H, s).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-fenylo-2-naftalenylo)-etynylo]benzoesowy (związek (60a)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu kwasu 4i[(5,6-dihydro-5,5dimetylo-8-(2-tiazolUo)©inaftakmylo)etynyk)-benzoesowego (związek 30a), 27,0 mg (0,07 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8 ifenyloi2-nafalenylo)ittynylo]btnzoesanu etylu (związek la) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stale) stosując 5,9 mg (0,14 mmol)
188 705
LiOH w H2O. PMR (d6-DMSO): δ 1,31 (6H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,5 Hz), 6,05 (1H, t, J = J = J - 4,5 Hz), 7,00 (1H, s), 7,33 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,44 (4H, m), 7,59 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,1 Hz).
Kwas 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-(l,l-dimetyloetylo)-fenylo)-2-naftdenylo)etynylo]benzoesowy (związek (61)
Roztwór 80,0 mg (0,173 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-(l, 1-dimetyloetylo)fenylo)-2-naftalenylo)etynylo] benzoesanu etylu (związek 6) i 18,1 mg (0,432 mmol) LiOHH2O w 6 ml THF/wody (3:1, objętościowo) mieszano przez, noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano heksanami i pozostałą warstwę wodną zakwaszono 1 M HCl, i następnie ekstrahowano EtOAc. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując tytułowy związek w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,82 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44 (6H, m), 7,25 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,02 (1H, s), 6,01 [3H, t, J = 4,6 Hz), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (9H, s), 1,29 (6H, s).
2-fluoro-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)tiokarbonylo]aminojbenzoesan etylu (związek 62)
Roztwór 54,4 mg (0,119 mmol) 2-fluoro-4-[[(5,6-dihy<±ro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)2-naftalenylo)karbonylo] aminojbenzoesanu etylu (związek 40) i 57,7 mg (0,143 mmol) [2,4-bis(4metoksyfenylo)-l,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disiarczkuj (reagent Lawessona) w 12,0 ml benzenu ogrzewano w temperaturze wrzenia przez noc. Po oziębieniu do temperatury pokojowej mieszaninę przesączono i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Tytułowy związek wydzielono metodą kolumnowej chromatografii (10 do 25% EtOAc/heksany) jako żółte ciało stałe. 1H NMR (CDCty): δ 9,08 (1H, s), 7,92 (1H, br s), 7,90 (iH. t, J = 8,2 Hz), 7,66 (1 H, da, J = 2,0, 6,0 Hz), 7,38 (3H, m), 7,18 (4H, m), 6,01 (1 H, t,J = 4,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
Kwas 2-fluoro-4-[[(5,6~dihydro-5,5-dimetylo-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)tiokarbonylo]aminojbenzoesowy (związek 63)
Do roztworu 46,5 mg (0,098 mmol) 2-fluoro-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimetyło-8-(4-metylofenylo)-2-naftalenylo)tiokarbonylo]amino]benzoesanu etylu (związek 62) w 1,0 ml EtOH i 1,0 ml THF dodano 55 mg NaOH (1,4 mmol) i 1,0 ml H2O. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez noc dodano EtOAc i reakcję zatrzymano przez dodanie 10% HCl. Ekstrahowano EtOAc i przemyto połączone warstwy organiczne H2O, nasyconym wodnym roztworem NaCl i suszono nad MgSO<. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem dało ciało stałe, które po krystalizacji z CH3CN uzyskano tytułowy związek jako blado-żółte ciało stałe. 1H NMR (d6-aceton): δ 11,05 (1H, s), 6,02 (1H, m), 7,99 (1H, t, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, m), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 7,52 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,21 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,37 (2H, d, J - 4,8 Hz), 2,33 (3H, s), 1,36 (6H, s).
5',6'-dihydro-5',5'-dimetylo-8'-(4-metylofenylo)-[2,2'-binaftaleno]-6-karboksylan etylu (związek 64)
Roztwór 3,4-dihydro-l-(4-metylofenylo)-4,4-dimetylo-7-bromonaftalenu (związek D) 0,45 g, 1,40 mmol) i THF (2,1 ml) dodano do opiłków magnezu (0,044 g, 1,82 mmol) w temperaturze pokojowej pod argonem. Dodano dwie krople dibromku etylenu i roztwór, który powoli stał się mętny i żółty, ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,5 godziny. Do drugiej kolby dodano chlorek cynku (0,210 g, 1,54 mmol), który stopiono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem, oziębiono do temperatury pokojowej i rozpuszczono w THF (3 ml). Do drugiej kol by dodano odczynnika Grignarda i po 30 minutach w temperaturze pokojowej do dano γοζΕυοπλ ó-bromo-T-naftalenok^boksylanu etylu (związek N) 0,293 g, (1,0ί5 i THF (2 ml). W trzeciej kolbie wytworzono roztwór Ni(PPh3)4 i THF jak następuje: do roztworu NiCty(PPh3)2 (0,82 g, 1,25 mmol) i PPh3 (0,66 g, 2,5 mmol) w THF (3,5 ml) dodano 1M roztworu wodorku diizobutyloglinu i heksanów (2,5 ml, 2,5 mmol). Wytworzony roztwór rozcieńczono THF do całkowitej objętości 15 ml i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Trzy 0,60 ml próbki roztworu Ni(PPh3)4 dodano co 15 minut do drugiej kolby. Powstałą zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Reakcję przerwano dodatkiem 5 ml IN wodnego roztworu HCl i mieszano przez godzinę przed ekstrakcją produktów
188 705 octanem etylu. Warstwy organiczne połączono, przemyto solanką, wysuszono (MgS O4), przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość krystalizowano z heksanów z wytworzeniem 130 mg czystej substancji. Ciecz macierzystą zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (95:5-heksany.:octan etylu) z wytworzeniem dodatkowych 170 mg tytułowego związku (łączną wydajność - 300 mg, 64%) jako bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (CDCl3) δ 8,57 (s, 1H), 8,05 (dd, 1H, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,84-7,95 (nałożone d, 3H), 7,66 (dd, 1 H, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,58 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,43 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,32 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,04 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 4,44 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,39 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 1,45 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 1,39 (s, 6 H).
Kwas -',6'-dihydro-5',5'-dimetylo-8'-~4-metylofenylo)-[2,2'~binaftałeno]-6-kara^oksyl<-wy (związek 65)
Roztwór -',6'-dihydro-5',5'-dimetyli--8'-~4-meΐylofenyio)-[2,2'-bmaftąieno]-6-kąab-)ksy'iąnu etylu (związek 64) 0,19 g, 0,43 mmol), EtOH (8 ml) i 1N wodnego roztworu NaOH (2 ml) ogrzewano do 60°C przez 3 godziny. Roztwór oziębiono do 0°C i zakwaszono 1N wodnym roztworem HCl. Produkt ekstrahowano do octanu etylu i warstwy organiczne połączono, przemyto wodą, solanką, wysuszono (MgSO4), przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rekrystiizowano z THF/octan etylu w temperaturze 0°C z wytworzeniem 35 mg czystej substancji. Ciecz macierzystą zątężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałości oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (100% octanu etylu) z wytworzeniem dodatkowych 125 mg tytułowego związku (łączna wydajność -160 mg, 90%) w postaci bezbarwnego ciała stałego. 1H NMR (DMSO-d6) δ 8,57 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,96-7,82 (nałożone d, 3H), 7,65 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,28 (s, 1H), 7,26 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,01 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 3,34 (br s, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,31 (d, 2H, J = 4,5 Hz), 1,31 (s, 6H)
4~[(5,6-dihydlΌ~5,--dimeΐyio~8~e2~furyio)~2-naftąlenyIo)~etynylo]benzoesan etylu (związek (66)
Stosując tę samą, ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu 4~[e5,6~dihy'dao-5,5-dimetylo~--(4metylofenylo^-naftalenykrietynylotyenzoesanu etylu (związek 1), 250,0 mg (0,52 mmol) 4-[(5,6dihyγiro-5,5-dimetylo-8-~(riffuo-ometylo-ulfonyyo-)Oksy-22naafaleny'lo-)tynyllolbenzoesąnu etylu (związek G) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stałe) stosując 142,4 mg (1,045 mmol) chlorku cynku, 24,1 mg (0,02 mmol) tetrakis(ΐrifenylfósfino)pąiiadu(0) i 2~iitofuaanu (wytworzonego przez dodanie 53,4 mg (0,52 ml, 0,78 mmol) n-butylolitu (1,5 M roztwór w heksanie) do zimnego roztworu (-78°C) 53,4 mg (0,784 mmol) foranu w 1,0 ml THF). PMR (CDCl3): δ 1,32 (6 H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 5,0 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,41 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,50 (2H, s), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,45 (3H, dd, J =
1,7, 8,0 Hz), 7,49 (1H, s), 7,57 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,63 (1H, d, J = 1,7 Hz), 8,02 (2H, d, J =
8,2 Hz).
Kwas 4-[(5,6-dihy-dao--,5-dimetyΊo-8-e2~fuaylo)-2~nafΐtąenylo)etynylo|benzoesowy (związek (67)
Stosując tę samą ogólną procedurę, jak przy wytwarzaniu kwasu 4-[(5,6-dihydro~5,5dimetylo---(2-tiązoliio)~2~naftąlenyIo)etynylo]benzoesowego (związek 30a), 4~[(5,ć>^diFιydro~ -,5-dimetyio---(2-fuayio)-2-naftaienyio)etynylo]benzoesan etylu (związek (66) przekształcono w tytułowy związek (bezbarwne ciało stale) stosując 16,0 mg (0,38 mmol) LiOH w H2O. PMR (d6-DMSO): δ 1,26 (6 H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,41 (1H, t, J = 4,9 Hz), 6,60 (2H, m), 7,45-7,53 (3H, m), 7,64 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, d. J = 1,6 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Sposób wzmacniania agonistów receptorów jądrowych
Stan aktualny i wprowadzenie
Odkryliśmy, ze podzbioru antagonistów retinoidów, który' wykazuje negatywną aktywność wobec hormonu, można użyć do wzmacniania aktywności biologicznej innych retinoidów i hormonów nadrodziny receptorów steroidowych. Te inne retinoidy i hormony nadrodziny receptorów steroidu mogą być albo hormonami endogenicznymi albo czynnikami farmaceutycznymi. W ten sposób np. stosując w połączeniu z negatywnym hormonem retinoidowym, pewne aktywności farmaceutycznych agonistów retinoidów można uczynić bardziej aktywnymi w wywoływaniu specyficznych skutków biologicznych. Korzystnie, ta próba łączenia, jeśli chodzi o podawanie leku, może zminimalizować niepożądane efekty uboczne
188 705 retinoidów farmaceutycznych, ponieważ niższe dawkowanie retinoidów larmaceutycznych można stosować z polepszoną skutecznością.
Szczególniej, odkryliśmy, że AGN 193109, syntetyczny retinoid, posiadający strukturę ukazaną w fig. 1, wykazuje unikalną i nieoczekiwaną aktywność farmakologiczną. AGN 193109 wykazuje wysokie powinowactwo z podklasą RAr receptorów jądrowych bez aktywacji tych receptorów czy stymulacji transkrypcji genów odpowiedzi na retinoid. Zamiast tego, AGN 193109 hamuje aktywację RAR przez agonistów retinoidów i przez to zachowuje się jak antagonista retinoidów.
Dodatkowo, odkryliśmy, ze negatywne hormony retinoidów możną stosować bez równoczesnego podawania agonistów retinoidów lub hormonu steroidowego, w celu kontroli pewnych symptomów chorobowych. Konkretniej, negatywny hormon retinoidowy ujawniony tutaj, może regulować przez obniżanie wysoki poziom transkrypcji podstawowej genów, odpowiadających na wolne RAR. Jeśli np., niekontrolowana proliferacja komórkowa wynika z aktywności genów, odpowiadających na wolne RAR, wtedy tę aktywność genu można zmniejszyć przez podanie negatywnego hormonu retinoidowego, który inaktywnuje RAR. W wyniku tego, proliferację komórkową zależną od aktywności wolnych RA.R, można hamować przez negatywny hormon. Inhibicji wolnych RAR nie można osiągnąć przy użyciu konwencjonalnych antagonistów.
Istotnie, odkryliśmy, że AGN 193109 może zarówno hamować podstawową aktywność RAR jak i czasem może wzmacniać aktywność innych agonistów retinoidów- i hormonów nadrodziny steroidów. W kontekście wynalazku, uważa się, że agonistę hormonu wzmacnia hormon negatywny, taki jak AGN 193109 jeśli, w obecności hormonu negatywnego, mniejsze stężenie agonisty wywołuje zasadniczo taką samą odpowiedź ilościową jak odpowiedź możliwą do uzyskania z samym agonistą. Odpowiedź ilościową można np. mierzyć w oznaczeniu genu reporterowego in vitro. W ten sposób, retinoid terapeutyczny, który wywołuje żądaną odpowiedź, stosowany w poszczególnym dawkowaniu lub stężeniu, jest wzmacniany przez AGN 193109 jeśli, w połączeniu z aGn 193109, niższe dawkowanie lub stężenie retinoidu terapeutycznego można stosować do wytworzenia zasadniczo tego samego skutku jak wyższa dawka lub stężenie retinoidu terapeutycznego, gdy ten retinoid terapeutyczny stosuje się sam. Wykaz agonistów, których można wzmacniać przez podawanie równoczesne z AGN 193109, obejmuje agonistów RAR, agonistów receptora witaminy D, agonistów receptora glukokortykoidów i agonistów receptora hormonów tarczycowych. Szczególniej, specyficznymi agonistami, których można wzmacniać przez podawanie równoczesne, są: AtRa, kwas 13-cis retinowy, agonista syntetycznego RAR AGN 191183, 1,25-dihydroksywitamina D3, deksametazom i hormon tarczycowy (3,3',5-trijodotyronina). Ujawnia się tu także sposób, którego można użyć do identyfikacji innych hormonów·', które można wzmacniać przez równoczesne podanie AGN 193109.
W ten sposób, AGN 193109 zachowuje się w sposób niespodziewany dla pojedynczego antagonisty retinoidu lecz jako negatywny hormon, który wzmacnia aktywność różnych członków rodziny receptorów jądrowych. Ujawniamy także prawdopodobny mechanizm, który można zaliczyć zarówno do aktywności hormonu negatywnego jak i zdolności AGN 193109 do wzmacniania aktywności innych ligandów receptorów jądrowych. Mechanizm ten obejmuje elementy, znane z tego, że uczestniczą w szlakach sygnalizacyjnych zależnych od reitnoidu i dodatkowo obejmują nowy regulatorowy składnik negatyw-ny.
Przeciętny specjalista doceni, że RAR, które są celami o wysokim powinowactwie dla wiązania AGN 193109, są czynnikami transkrypcji, które regulują ekspresję różnych genów, odpowiadających na retinoidy. Cis-regulatorowe miejsca wiązania DNA dla RAR, zidentyfikowano w pobliżu genów, które są regulowane transkrypcjonalnie w sposób zależny od retinoidu. RAR, wiążące się z takimi miejscami w DNA, znanymi jako elementy odpowiedzi na kwas retinowy (RARE), zostały dobrze określone. Istotnie, RARE wiążą heterodime^ry, składające się z jednego rAr i jednego RXR. Składnik RXR heterodimeru fuykcjoyuje. aby pobudzać interakcję o wysokim powinowactwie pomiędzy heterodimerem RAR/RXR i RARE (Mangelsdorf i in., The Retinoid Receptors w The Retinoids: Biology, Chemistry i Medicine, drugie wydanie, wydawcy Sporn i in., Raven Press Ltd., Nowy Jork 1994.
188 705
Jak wyszczególniono poniżej, nasze rozwiązania, które odnoszą się do aktywności negatywnego hormonu AGN 193109 są zgodne z mechanizmem, obejmującym interakcję przypuszczalnego białka negatywnego koaktywatora (NCP) z RAR. Zgodnie z proponowanym mechanizmem, tę interakcję stabilizuje AGN 193109.
Nasze wyniki wskazują dalej, że AGN 193109 może modulować wewnątrzkomórkową dostępność NCP dla interakcji z receptorami jądrowymi innymi niż RAR, które są zajęte przez AGN 193109. Wynika stąd, że AGN 193109 może wzmacniać szlaki regulatorowe transkrypcji, obejmujące receptory jądrowe, które dzielą z RAR zdolność do wiązania NCP. Pod tym względem, AGN 193109 wykazuje zdolność do modulacji różnych szlaków receptorów jądrowych, aktywność, której nie przewiduje się dla zwykłych antagonistów retinoidów. W związku z tym, AGN 193109 jest użyteczny jako środek do wzmacniania aktywności ligandów receptorów jądrowych, włączając zarówno hormony endogeniczne jak i przepisane leki. Ta specyficzna postać realizacji ilustruje ogólniejszą zasadę, że każdy negatywny hormon receptora jądrowego będzie wzmacniać aktywność innych receptorów jądrowych, które współzawodniczo wiążą NCP.
Mimo, ze można użyć inych materiałów i metod podobnych lub równoważnych do opisanych tutaj w praktyce lub testowaniu według niniejszego wynalazku, opisuje się teraz zalecany sposoby i materiały. Ogólne odniesienia i metody, których można użyć do przeprowadzenia różnych manipulacji kwasem nukleinowym oraz procedur tu opisanych, można znaleźć w Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook i in., wyd. Cold Spring Harbor Lab. Publ. 1989) oraz Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i in., wyd. Greene Publishing Associates i Wiley-Interscience 1987). Następuje opis doświadczeń i wyników, które prowadziły do stworzenia niniejszego wynalazku.
Przykład 6 opisuje sposoby użyte do pokazania, że AGN 193109 wiązał każdy z trzech RAR z wysokim powinowactwem lecz zawiódł przy aktywacji ekspresji genu zależnej od retinoidu.
Przykład 6
AGN 193109 wiąże RAR z wysokim powinowactwem lecz nie transaktywuje ekspresji genowej zależnej od retinoidu
Ludzkie receptory RAR-a, RAR-β i RAR-γ poddano oddzielnie ekspresji jako białka rekombinowane, przy użyciu układu ekspresji bakulowirusa, zasadniczo zgodnie z Allegretto i in., w J. Biol. Chem. 268: 26625 (1993). Rekombinowanych białek receptora użyto oddzielnie do określenia powinowactwa wiązania AGN 193109 przy użyciu testu przesunięcia [3 H]ATRA opisanego przez Heymana i in., w Cell 68:397 (1992). Określono stałe dysocjacji (Kd) zgodnie z procedurą opisaną przez Chenga i in., w Biochemical Pharmacology 22:3099 (1973).
Testowano także AGN 193109 pod względem jego zdolności do transaktywacji RAR w komórkach CV-1 krótkotrwale kotransfekowanych wektorami ekspresji RAR i konstrukcjami genu reporterowego, odpowiadającego na retinoid. Wektory ekspresji receptora pRShRAR-α (Giguere i in., Nature 330:624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook i in., Nature 333:669 (1988)) oraz pRShRAR-γ (Ishikawa i in., Mol. Endocrinol. 4:837 (1990)), kotransfekowano oddzielnie za pomocą plazmidu reportera AMTV-TREp-Luc. Użycie tego plazmidu reporterowego lucyferazy ujawnił Heyman i in. w Cell 68:397 (1992). Plazmid AMTV-TREpLuc jest zasadniczo identyczny z konstrukcją reporterową AMTV-TREp-CAT opisaną przez Umesono i in. w Nature 336:262 (1988), z wyjątkiem tego, że gen reporterowy acetylotrasferazy chloramfenikolu (CAT) podstawiono sekwencją polinukleotydową, kodującą lucyferazę świetlika. Transfekcję komórek CV-1 małpy zielonej przeprowadzono przy użyciu metody koprecypitacji fosforanu wapnia opisanej w Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook i in., wyd. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Komórki CV-1 powleczono z gęstością 4 x 10 0/studzierkę w wielostudzienkowych płytkach o 12 studzienkach i krótkotrwale transfekowano precypitatem fosforanu wapnia, zawierającym 0,7 pg plazmidu reporterowego i 0,1 pg plazmidu receptora, zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Komórki przemyto po 18 godzinch, aby usunąć precypitat i ponownie dodano pożywkę Eagla modyfikowaną przez Dulbecco (DMEM)(Gibco), zawierającą 10% płodową surowice bydlęcą ekstrahowaną aktywowanym węglem drzewnym (Gemini Bio-Products). Komórki traktowano samym
188 705 nośnikiem (etanol) lub AGN 193109 (W9 do 106 M) przez 18 godzin. Lizaty komórkowe wytworzono w 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 10% TRITON Χ-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Aktywność lucyferazy mierzono jak opisano u Weta i in., Mol. Cell Biol. 7:725 (1987), przy użyciu lucyfery ny świetlika (Analytical Lumincscence Laboratory) oraz luminometru o 96 studzienkach EG&G Berthold. Opisane wartości lucyferazy przedstawiały średnią ±SEM potrójnych doświadczeń.
Wyniki przedstawione w tabeli 11 wskazywały, że AGN 193109 wiązał każdy z RAR-α, RAR-β i RAR-y z wysokim powinowactwem, lecz nie aktywował ekspresji genowej zależnej od retinoidu. Konkretniej, AGN 193109 wiązał każdy z trzech receptorów, z wartościami Kd w zakresie 2-3 nM. Mimo tego silnego wiązania AGN 193109 zawiódł jeśli chodzi o aktywację ekspresji genowej w porównaniu z indukcjami stymulowanymi przez ATRA. W związku z tym, stężenie AGN 193109, dające połowę maksymalnej skuteczności (EC 50) było niemożliwe do zmierzenia. Chociaż nie przedstawiliśmy tego w tabeli, odkryliśmy, że AGN 193109 nie miał możliwego do zmierzenia powinowactwa dla RXR.
Tabela 11
Wiązanie AGN 193109 i transaktywacja RAR
RAR-α RAR-β RAR-γ
EC 50 (nM) Brak aktywności Brak aktywności Brak aktywności
Kd (nM) 2 2 3
Przykład 7 opisuje metody użyte do pokazania, ze AGN 193109 jest antagonistą ekspresji genowej zależnej od ATRA.
Przykład 7
Inhibicja zależna od AGN 193109 transaktywacji RAR przez ATRA
Zdolność AGN 193109 do antagonizacji RAR, w której pośredniczy ATRA, prześledzono w komórkach CV-1 kotrasfekowanych sposobem koprecypitacji fosforanu wapnia Sambrooka i in. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Eukariotyczne wektory ekspresji pRShRAR-α (Giguere i in. Nature 330:624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook i in. Nature 333:669 (1988)) i pRSHRAR-γ (Ishikawa i in. Mol. Endocrinol. 4:837 (1990)) kotransfekowano plazmidem reporterow-ym: AMTV-Luc opisanym przez Hollenberga i in. (Cell 55:899 (1988)). W szczególności, plazmid reporterowy zawierał dwie kopie palindromicznego elementu odpowiedzi TRE. Transfekeje fosforanem wapnia przeprowadzono dokładnie jak opisano w przykładzie 6. Komórki potraktowano dawką samego nośnika (etanol), ATRA (109 do 10'6 M), AGN 193109 (10‘9 do 10‘6 M) lub W8 M ATRA w połączeniu z AGN 193109 (10’9 do 10'6 M), przez 18 godzin. Pomiary aktywności lizatów komórkowych i lucyferazy przeprowadzono także jak w przykładzie 6.
Wyniki tych procedur przedstawia się w fig. 2A do 2F, gdzie wartości lucyferazy reprezentuje średnia ± SEM potrójnych określeń. Konkretniej, wyniki przedstawione w fig. 2A, 2C i 2E wskazują, ze stymulacja komórek transfekowanych ATRA prowadziła do wzrostu aktywności lucyferazy w odpowiedzi na dawkę. Potwierdziło to, że ATRA aktywował każdy z trzech RAR w układzie doświadczalnym i zapewniał podstawę do porównań dla detekcji aktywności antagonisty. Wyniki graficzne przedstawione w fig. 2B, 2D i 2F wskazywały, ze równoczesne traktowanie transfekowanych komórek 10 nM ATRA i zwiększające się stężenia AGN 193109 prowadziły do inhibicji aktywności lucyferazy. Zwłaszcza równe dawki AGN 193109 i ATRA dawały inhibicję większą niż 50% w stosunku do samego ATRA dla wszystkich trzech podtypów RAR. Porównanie z odpowiedzią na dawkę ATRA w obecności różnych stężeń AGN 193109 wskazywały, że ATRA był współzawodniczę hamowany przez AGN 193109. Szczególnie, poziome osie na wszystkich wykresach ukazanych w fig. 2 przedstawiają logarytm stężenia retinoidu. Wyniki te dowiodły, że AGN 193109 był silnym antagonistą RAR.
Następnie przeprowadziliśmy doświadczenia, w celu wyjaśnienia mechanizmu, będącego podstawą aktywności antagonistycznej AGN 193109. Fachowey docenią, że uważa się, iż i88 705 aktywacja receptora jądrowego związana jest ze zmianą konformacji receptora, którą indukuje wiązanie liganda. W istocie, wyniki testów zabezpieczenia proteazy potwierdziły, iż agoniści i antagoniści hormonów jądrowych powodują, że białka receptorowe przybierają różne konformacje (Keidel i in. Mol. Cell. Biol. i4:287 (i994); Allan i in. J. Biol. Chem. 267:i95i3 (i992)). Użyliśmy takiego testu do określenia czy AGN i93i09 i ATRA powodowały przybieranie różnych konformacji przez RAR-α. AGN i93583, antagonista selektywny RAR-α. włączono jako kontrolę pozytywną, o której wiadomo, że nadaje specyficzny dla antagonisty wzór wrażliwości na proteazy.
Przykład 8 opisuje metodę, której użyto do wykrycia zmian konformacji w RAR-α będących wynikiem wiązania AGN i93i09. Jak przedstawiono poniżej, wyniki tej procedury nieoczekiwanie wskazały, że AGN i93i09 prowadził do wzoru wrażliwości na trypsynę, który był zasadniczo identyczny z indukowaną przez ATRA, agonistę RAR, i w przeciwieństwie do indukowanej przez modelowego antagonistę RAR. Odkrycia te sugerowały, że AGN i93i09 posiadał właściwości odmienne od innych antagonistów retinoidów.
Przykład 8
Analiza zabezpieczenia proteazy
Plazmidu zmontowanego w wektorze pGEM3Z (Pharmacia) i zawierającego cDNA RAR-α (Giguere i In. Nature 330:624 (i987)), użyto w łączeniu z układem in vitro transkrypcji-translacji lizatu retikulocytów·' sprzężonego z TNT (Promega), aby wytworzyć RAR-α znakowany pS]-metioniną. Ograniczone trawienie proteolityczne znakowanego białka RAR-α przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Keidela i in. w Mol. Cell Biol. i4:287 (i94). Równe ilości lizatu retikulocytów, zawierające znakowany znakowany [35S]-metionmą RAR-α inkubowano albo z ATRA, AGN i93583 albo AGN i93i09 na lodzie przez 45 minut w całkowitej objętości 9 μΐ. Ostateczne stężenie retinoidu dla wszystkich prób wynosiło 100 nM dla ATRA i AGN i93i09 oraz i000 nM dla AGN i93583. Różnica między końcowymi stężeniami retinoidów opierała się na blisko 100 -krotnej różnicy we względnym powinowactwie ATRA i AGN i93i09 (posiadających Kd przy RAR-α, wynoszące odpowiednio 2 i i0 nM) oraz AGN i93583 (posiadającym Kd przy RAR-α, wynoszące > i00 nM). Po związaniu liganda, do mieszaniny dodano 1 μΐ odpowiednio stężonej trypsyny, co dało końcowe stężenia, wynoszące 25, 50 lub i00 μg/ml. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez i0 minut i zatrzymano trawienie trypsyną przez dodanie buforu do próbek SDS. Próbki poddano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym i autoradiografii zgodnie ze standardowymi procedurami.
Zarówno agonista jak i antagonista prowadził do odmiennych wzorów wrażliwości na trypsynę, które były różne od wyniku otrzymanego przez trawienie wolnego receptora. Wyniki autoradiograficzne wskazały, ze stężenia trypsyny, wynoszące 25, 50 i i00 μg/ml całkowicie strawiły znakowane radiologicznie RAR-α w i0 minut w temperaturze pokojowej, przy nieobecności dodanego retinoidu. Wstępne wiązanie ATRA prowadziło do pojawienia się dwóch głównych rodzajów opornych na proteazę. Wiązanie wstępne antagonisty selektywnego wobec RAR-α AGN i93583 dało wzrost rodzaju opornego na proteazę, który miał niższy ciężar cząsteczkowy od tego otrzymanego w wyniku wstępnego wiązania ATRA. Wynik ten pokazał, że agonista i antagonista prowadzą do zmian konformacyjnych możliwych do wykrycia przez cechę zmienionej wrażliwości na trypsynę. Niespodziewanie, wstępne wiązanie AGN i93i09 dało wzrost dla wzoru zabezpieczenia proteazowego, który był niemożliwy do odróżnienia od tego wytwOrzonego przez wstępne wiązanie ATRA.
Wyniki przedstawione powyżej potwierdziły, że AGN i93i09 wiązał RAR-α i zmienił jego konformację. Co ciekawe, charakter tej zmiany konformacji ściślej przypominał ten uzyskany w wyniku wiązania agonisty (ATRA) niż; zmianę wytworzoną przez wiązanie antagonisty (AGN i93583). Wyraźnie mechanizm antagonizmu zależnego od AGN i93i09 był jedyny w swoim rodzaju.
Rozważyliśmy możliwy mechanizm, który mógł wytłumaczyć aktywność antagonisty AGN i93i09. W szczególności użyliśmy standardowego testu przesunięcia w żelu, aby zbadać czy AGN i93i09 zakłócił formowanie się heterodimeru RaR/RXR, czy hamował interakcję miedzy RAR i jego pokrewnym miejscem wiązania DNA.
188 705
Przykład 9 opisuje test przesunięcia przez ruchomość elentiΌfyyetycrną w żelu, użyty do pokazania, że AGN 193109 ani nie hamował dimeryzacji RAR/RXR ani nie hamował wiązania dimerów z docelowym DNA.
Przykład 9
Analiza przesunięcia w żelu
Wytworzono RAR-α przez translację in vitro, zasadniczo jak opisano w przykładzie 8 z wyjątkiem tego, że pominięto metioninę znakowaną 35S. Podobnie wytworzono RXR-a przez translację in vitro, przy użyciu wektora w oparciu o pBlukscript (II) (SK), zawierającego cDNA RŻR-α opisane przez Mangelsdorfa i in. w Nature 37(:224-229 (1990) jako matrycy do utworzenia transkryptów in vivo. Znakowane RAR-α i RKR-α same lub w połączeniu, lub wstępnie zwiąrśnk z AGN 193109 (10’6 M) albo samym albo w połączeniu, pyzystawiony do oddziaływania z znakowaną na końcu sondą o podwójnym łańcuchu RARE DR-5, posiadającą sekwencję 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3' (SEQ ID nr:1). Mieszaninę wiążącą poddano elektroforezie na niedenaturującym żelu pyllśnrylamidowym i śutyi·adirgrśίii zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Pojedyncze opóźnione rodzaje, pojawiające się na autoradiygrafie, które były zwykłe dla wszystkich przebiegów na żelu, reprezentowały nikokrkślyny czynnik, wiążący się z sondą obecny w lizacie retikulycytów. Tylko połączenie RAR/RXR dało wzrost opóźnionym rodzajom specyficznym dla receptorów retinyidów. Ani sam RAR ani sam RXR nie wiązały sondy, aby wytworzyć ten przesunięty rodzaj. Obecność AGN 193109 nie zaburzała tej interakcji.
Wyniki te wskazały, że AGN 193109 nie zmieniał znacząco właściwości albo homo- albo hktkrodlmeryzαcjl RAR-α. Dalej, AGN 193109 nie hamował interakcji dimerów receptora z segmentami DNA, zawierającymi pokrewne miejsce wiązania.
Zważywszy unikalne właściwości, które cbaraktety'zokał AGN 193109, badaliśmy dalej czy ten antagonista mógłby dodatkowo hamować aktywność wolnych RAR. Układ receptyr/repyytey użyty do wykonania tego określenia korzystnie wykazał wysoki poziom istotnej aktywności przy nieobecności dodanego agonisty retinoidu. Konkretniej, procedury te stosowały chimeryczny receptor ER-RAR i układ yeprrterowy ERE-tk-Luc. Plazmid ERE-tk-Luc obejmuje region -397 do -87 regionu oskrzydlającego 5', odpowiadającego na estrogeny, genu A2 witkllogkniny Xknypus< opisanego przez Klkinś-Hitpassa i in. W Cell 46:(053-(061 (1986), przyłączonego w górę od promotora kinazy tymidynowej HSV i genu reporterow-ego lucyferazy plazmidu tk-Luc. Chimeryczne receptory ER-RAR składały się z domeny wiążącej DNA receptora estrogenu połączonej z domeną „D-E-F” RAR. Fachowcy docenią to działanie domeny „D-E-F” w wiązaniu rktinyidu< aby zapewnić możliwe do indukcji przez retinoid działanie transaktywacyjne oraz aby zapewnić miejsce kontaktowe dla betkrydimkryzαcji z RXR. W ten sposób, ekspresja lucyferazy w tym układzie reporterowym była zależna od aktywacji transfekowanej chimerycznej konstrukcji receptora.
Przykład 10 opisuje metodę użytą do pokazania, że AGN 193109 hamował podstawową aktywność genu przypisywaną wolnym RAR. Procedury te przeprowadzono przy nieobecności dodanego agonisty retinoidu. Wyniki przedstawione poniżej dostarczają pierwszego wskazania, ze AGN 193109 wykazał aktywność hormonu negatywnego.
Przykład 10
Represja podstawowej aktywności genowej reportera regulowanego przez retinoid, w krótkotrwale transferowanych liniach komórkowych
Komórki CV-1 transfknowśno równocześnie plazmidem reporterowym ERE-tk-Luc i albo plazmidami ekspresji ER-RAR-α, ER-RAR-β albo ER-RAR-γ. Plazmid ERE-tk-Luc rświerśł element promotyrokz, odpowiadający na estrogen genu A2 witellogeniny Xenopus IśwIs i był zasadniczo identyczny z plazmidem reporterowym opisanym przez KleinaHitpassa i in. w Cell 76:1053 (^Só), z wyjątkiem tego, że gen reporterowy CAT podstawiono sekwencją pyllnunlkytydywą< kodującą lucyfera^. Polinukleotydy, kodujące chimeryczne receptory ER-RAR-α, ER-RAR-β i ER-RAR-γ stosowane w kotransfekcji, opisano u Graupnera i in. Biochem. Biopbzs. Res. Comm. (1991). Te polinukleotydy przyłączono do wektora ekspresji pECE opisanego przez Ellisa i in. w Cell 45:721 (1986) i spowodowano ekspresję pod kontrolą promotora 8^40. Transfekcję fosforanem wapnia przeprowadzono
188 705 dokładnie jak opisano w przykładzie 6, stosując 0,5 pg/studzienkę plazmidu reporterowego oraz albo 0,05 pg, 0,10 pg albo 0,2 pg/studzienkę plazmidu reporterowego. Komórki potraktowano dawką samego nośnika (etanol), ATRA (10'9 do 10'6 M) albo AGN 193109 (10'9 do 10M) przez 18 godzin. Pomiary aktywności lizatów komórkowych i lucyferazy przeprowadzono jak opisano w przykładzie 6.
Wyniki przedstawione w fig. 3A, 4A i 5A potwierdziły, że ATRA silnie indukował ekspresję lucyferazy we wszystkich transfektantach. Podstawowy poziom ekspresji lucyferazy dla trzech transfekowanych chimerycznych izoform RAR mieścił się w zakresie od około 7000 do 40000 względnych jednostek świetlnych (rlu) i zależał nieco od ilości plazmidu receptorowego użytego w transfekcji. W ten sposób, trzy chimeryczne receptory można aktywować ATRA, tak jak oczekiwano. Konkretniej, wszystkie trzy receptory wiązały ATRA i aktywowały transkrypcję genu reporterowego zawartego w plazmidzie ERE-tk-Luc.
Fig. 3B, 4B i 5B przedstawiają krzywe odpowiedzi na dawkę AGN 193109 przy nieobecności żadnego egzogenicznego agonisty retinoidowego. Co ciekawe, ER-RAR-α (fig. 3B) zasadniczo nie był pod wpływem AGN 193109, podczas gdy chimeryczne receptory ERRAR-β i ER-RAR-γ (odpowiednio fig. 4B i 5B) wykazały mniejszą odpowiedź na dawkę AGN 193109 w aktywności reportera lucyferazy.
Prześledziliśmy dalej nagetywną aktywność hormonu AGN 193109 przez testowanie jego zdolności do represji ekspresji genowej, w której pośredniczy chimeryczny receptor RAR-γ zbudowany, aby posiadał konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji. Konkretniej, użyliśmy konstytutywnie aktywnego chimerycznego receptora RAR-γ połączonego z domeną aktywatora kwasowego HSV-VP-16, zwanego RAR-y-VP-16, w dwóch typach układów reporterowych lucyferazy. Pierwszy składał się z reportera ERE-tk-Luc kontransfekowanego ERRaR i ER-RAR-α. Drugi wykorzystywał reporter AMTV-TREp-Luc.
Przykład 11 opisuje metodę użytą do pokazania, że AGn 193109 mógł hamować aktywność domeny aktywatora transkrypcji RAR. Wyniki przedstawione poniżej zapewniły, że AGN 193109 mógł hamować ekspresję genową zależną od RAR przy nieobecności agonisty i potwierdziły, że AGN 193109 wykazywał negatywną aktywność hormonu.
Przykład 11
Represja aktywności RAR-VP-16 w komórkach krótkotrwale transfekowanych
Komórki CV- 1 krótkotrwale kotransfekowano zgodnie z techniką koprecypitecji fosforanem wapnia opisaną w przykładzie 6, przy użyciu 0,5 pg/studzienkę plazmidu reporterowego lucyferazy ERE-tk-Luc, 0,1 pg/studzienkę plazmidu ekspresji reportera chimerycznego ER-RXR-a, i albo 0 pg albo 0,1 pg/studzienkę plazmidu ekspresji RAR-y-VP-16. Chimeryczny receptor ER-RXR składał się z domeny wiążącej hormon (aminokwasy 181 do 458) RXR-a (Mangelsdorf i in. Nature 345:224-229 (1990), przyłączonej do domeny wiąż.ącej DNA receptora estrogenu (Graupner i in. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)) i spowodowano ekspresję z wektora ekspresji opartego o SV-40 pECE opisanego przez Ellisa i in. w Cell 45:721 (186). RAR-y-VP-16 jest identyczny z plazmidem ekspresji vP16RAR-y1 opisanym przez Nagpala i in. w EMBO J. 12: 2349 (1993), i koduje chimeryczne białka, posiadające domenę aktywacji białka VP-16 HSV przyłączoną do końca aminowego RAR-γ o pełnej długości. Osiemnaście godzin po transfekcji komórki przepłukano roztworem soli hoforowanej fosforanem (PBS) i potraktowano DMEM (Gibco-URL), zawierającym 10% FBS (Gemini BioProducts), który ekstrahowano za pomocą węgla drzewnego, aby usunąć retinoidy. Komórki potraktowano dawką odpowiednio rozcieńczonego AGN 193109 lub ATRA w nośniku etanolowym lub samym etanolu przez 18 godzin, potem przepłukano PBS i poddano lizie przy użyciu 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Aktywność lucyferazy mierzono zgodnie z metodą opisaną przez. Weta i in. w Moi. Cell Biol. 7:725 (1987), przy użyciu lucyferyny świetlika (Analytical Luminescence Laboratory) oraz luminometru o 960 studzienkach EG&G Berthold. Wartości lucyferazy reprezentowała średnia ±SEM potrójnych określeń.
Jak ukazano w fig. 6, komórki CV-1 transfekowane konstrukcją reportero wą i chimerycznym plazmidem ekspresji RAR-α wykazywały słabą aktywację aktywności lucyferazy przez ATRA, prawdopodobnie spowodowaną izomeryzacją ATRA do 9C-RA, naturalnego Uganda RXR (Heyman i in. Cell 68:397 (1982). Komórki transfekowane tą samą mieszaniną
188 705 chimerycznych plazmidów ekspresji lecz traktowane AGN 193109, nie wykazały żadnego wpływu na aktywność lucyferazy. Tak jak nie wiązanie się AGN 193109 z RXR, ten ostatni wynik był spodziewany. Komórki CV-1 podobnie transfckowane reporterem ERE-tk-Luc lecz z podstawieniem chimerycznego plazmidu ekspresji ER-RAR za pomocą ER-RXR-a, wykazały silną indukcję aktywności lucyferazy po traktowaniu ATRA.
Przeciwnie, inkluzja plazmidu ekspresji RAR-y^P-^ z plazmidami ER-RXR-a i EREtk-Luc w mieszaninie trasfekcyjnej dała w wyniku znaczny wzrost podstawowej aktywności lucyferazy jak zmierzono przy nieobecności jakiegokolwiek dodanego retinoidu. Ten wzrost podstawowej aktywności lucyferazy obserwowany dla kotrasfektantów ER-RKR-a/RAR-yVP-16, w porównaniu z wynikami otrzymanymi przy użyciu komórek transfekowarych samym ER-RKR-a, wskazały, że rekombinowane białka ER-RXR-a i RAR-y-kPHó mogły heterodimeryzować. Interakcja heterodimeru z cis-regulatorowym elementem, odpowiadającym na estrogen prowadziła do nacelowania domeny aktywacji VP-16 na region promotorowy reportera ERE-tk-Luc. Traktowanie tak potrójnie transfekowanych komórek ATRA prowadziło do niewielkiego wzrostu aktywności lucyferazy ponad wysoki poziom podstawowy. Jednakże traktowanie potrójnych transfektantów AGN 193109 dało w wyniku zmniejszenie aktywności lucyferazy w zależności od dawki. Co istotne, fig. 6 ukazuje, że traktowanie AGN 193109 komórek kotransfekowanych ER-RXR-a i RAR-y-VP-16 prowadziło do represji aktywności lucyferazy z maksymalną inhibicją, występującą przy około 10'8 M AGN 193109.
Nasza obserwacja, że AGN 193109 hamował konstytutywne działanie aktywacji transkrypcyjnej RARy-kT-N) w obecności RXR, tłumaczył model, w którym wiązanie AGN 193109 z RAR indukowało zmianę konformacyjną w RAR, która stabilizuje konformację negatywną, co ułatwia wiązanie przenoszonego negatywnego białka koaktywatora. Gdy kompleks AGN 193109/RAR wiąże się przez NCP. RAR jest niezdolny do podwyższania transkrypcji genów, które zwykle odpowiadająna aktywowane RAR. Nasz model proponuje dalej, ze wewnątrzkomórkowy rezerwuar NCP istnieje w ograniczonym stężeniu w pewnych kontekstach i można go wyczerpać przez cechę AGN 193109 stymulowanej kompleksach z RAR.
Wyniki przedstawione w fig. 6 wskazywały dodatkowo, ze nawet przy 10‘5 M AGN 193109, białka ER-RXR-a i RARy-kP-Ei mogły współdziałać w celu utworzenia heterodimerów kompetentnych do aktywacji tra^iskrypcji genu reporerowego. Konkretniej, komórki transfekowane białka ER-RXR-a i RAR-y~VP-l6 i traktowane AGN 193109 o stężeniu (10’8 - 10^’ M), wystarczającym do zapewnienia maksymalnej inhibicji, dały odczyty aktywności lucyferazy, wynoszące około 16 000 rlu. Odwrotnie, komórki transfekowane tylko ER-RXR-a i potem traktowane AGN 193109 o stężeniu tak dużym jak 10'6 M wykazały poziom ekspresji lucyferazy, wynoszący tylko około 8 000 rlu. Fakt, że wyższy poziom aktywności lucyferazy uzyskano w komórkach, które wykazywały zarówno ER-R^R-a i RAR~y~CP~16. nawet w obecności 1(f6 M AGN 193109, pokazał trwałość interakcji między dwoma rekombinowanymi receptorami. Aktywność represji RAR^-CP^ przez AGN 193109 sugerowała, że modulację interakcji NCP można kodominować za pomocą aktywacji VP-16. W związku z tym, wykazaliśmy, że możliwą jest modulacja ekspresji genów, które zwykle nie są regulowane przez retinoidy w sposób zależny od AGN 193109.
Kandydatów dla genów możliwych do regulowania przez AGN 193109 obejmują te, które są aktywowane przez kompleksy czyników transkrypcji, składające się z czynników nieRAR, asocjujących lub heterodimeryzujących z RAR, gdzie czynnik nie-RAR nie wymaga agonisty RAR do aktywacji. Podczas gdy stymulacja za pomocą agonisty RAR może nie mieć znaczącego wpływu na ekspresję takich genów, podanie z AGN 193109 może pobudzać tworzenie się nieaktywnych kompleksów transkrpcji, obejmujących AGN 193109/RAR/NCP. Skutkiem tego, dodanie retinoidowego negatywnego hormonu AGN 193109 może regulować w dół transkrypcję przeciwnego genu niewrażliwego na retinoid.
Ten podobny mechanizm może wytłumaczyć obserwację, że AGN 193109 może hamować aktywność genu t^^^glutamin^ tkankowej (Tgase) w komórkach HL-60. Element odpowiedzi na retinoid, składający się z trzech kanonicznych połowicznych miejsc rctinoidowych rozdzielonych 5 i 7 parami zasad, zidentyfikowano w .regionie kontroli transkrypcji tego genu. Podczas, gdy Tgase można indukować selektywnym agonistą RXR, nie odpowiada on na selektywnego agonistę RAR. Element odpowiedzi na retinoid Tgase wiąże się z heterodi64
188 705 merem RAR/RXR (Davies i in. w Press). Co ciekawe, AGN 193109 jest zdolny do represji aktywności Tgase indukowanej przez agonistów RXR. Tę represję, w której AGN 193109 można wytłumaczyć przez zdolność tego negatywnego hormonu do maskowania NCP na składnik RAR heterodimeru, hamując przez to aktywność towarzyszącego RXR.
Otrzymaliśmy także wyniki, które podtrzymują wnioski identyczne do przedstawianych w przykładzie 11, przez użycie RAR-y-VP-16 i konstrukcji ekspresji oraz plazmidu reporterowego AMTY-TREp-Luc zamiast konstrukcji ekspresji RAR-y-vP-16 i ER-RXR-a w połączeniu z plazmidem reporterowym ERE-tk-Luc. Zgodnie z wynikami przedstawionymi powyżej, odkryliśmy, że ak^wność RAR-y-VP-16 przy reporterze AMTV-TREp-Luc, hamował AGN 193109. Zatem, AGN 193109 hamował aktywność RAR-γ-VP-16t gdy ten chimeryczny receptor wiązał się bezpośrednio z elementem odpowiedzi na receptor kwasu retinowego zamiast pośredniego wiązania z elementem odpowiedzi na estrogen, w regionie promotora plazmidu reporterowego. Te odkrycia pokazały, że test do określania czynników, posiadających negatywną aktywność hormonu trzeba ograniczać przez użycie poszczególnego plazmidu reporterowego. Zamiast tego, krytyczna cecha realizowana przez układ doświadczalny użyteczny do identyfikacji negatywnych hormonów rettnoidowych, obejmuje wykrywanie zdolności związków do represji RAr zbudowanego do tego, aby zawierał konstytutywną domenę aktywacji transkrypcji.
Generalnie, negatywne hormony retinoidowe można identyfikować jako podzbiór związków retinoidowych, które hamują wewnątrz transfekowanej komórki podstawowy poziom ekspresji genu reporterowego, który jest transkrypcyjnie odpowiedzialny za wiązanie bezpośrednie lub pośrednie przez receptor retinoidowy lub chimeryczny receptor, obejmujący co najmniej domeny receptora retinoidowego położone C-terminalnie w stosunku do domeny wiążącej DNA tego receptora. To podejście adaptowano do metody skriningu użytecznej do identyfikacji negatywnych hormonów retinoidowych. W różnych postaciach realizacji wynalezionego sposobu skriningu, struktura receptora dla którego poszukuje się hormonu negatywnego, jest zmienna. Konkretniej, receptor retinoidowy· może albo podtypem RAR, albo RXR. Receptor można ewentualnie zbudować tak, aby zawierał konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji. Receptor retinoidowy użyty do przesiania pod względem hormonów negatywnych, ewentualnie zawiera domenę, wiążącą heterologiczny DNA jako substytut dla domeny, wiążącej DNA enogenicznego dla natywnego receptora. Jednakże gdy w sposobie skriningu stosuje się drugi receptor, i gdzie drugi receptor może dimeryzować z receptorem retinoidowym, dla którego szuka się hormonu negatywnego, wtedy ten receptor retinoidowy może nie wymagać domeny, wiążącej DNA, ponieważ można go dołączyć do regionu kontroli transkrypcji genu reporterowego bezpośrednio przez dimeryzację z drugim receptorem, który sam jest związany z regionem kontroli transkrypcji.
W praktycznym stosowaniu metody skriningu zdolność związku do represji podstawowej ekspresji reportera mierzy się typowo w teście in vitro. Ekspresja podstawowa przedstawia poziom linii podstawowej ekspresji reportera w komórkach transfekowanych w warunkach, gdzie nie dodaje się egzogenicznego agonisty retinoidowego. Ewentualnie, można przeprowadzić etapy w celu usunięcia endogenicznych ligandów retinoidów- ze środowiska transfekowanych komórek, poprzez procedury, takie jak ekstrakcja węglem drzewnym surowicy stosowanej w hodowli komórek in vitro.
Przykłady genów reporterowych użytecznych w związku z metodą skaningu, obejmują geny, kodujące lucyferazę, beta galaktozydazę, acetylotransferazę chloramfenikolu lub antygeny powierzchniowe, które można wykryć środkami immurochemicznymi. W praktyce, nie oczekuje się, że charakter genu reporterowego jest krytyczny dla operacyjności metody. Jednakże, regulatorowy region transkrypcyjny' konstrukcji reporterowej musi obejmować jeden lub więcej elementów cis-regulatorowych, które są celami czynników transkrypcji, dla których szuka się hormonów negatywnych. Przykładowo, jeśli żąda się hormonów negatywnych do identyfikacji RAR, to regulatorowy region transkrypcji konstrukcji reporterowej może zawierać element cis-regulatorowy, który może się wiązać przez białko, zawierające RAR. W tym przykładzie powinna istnieć zgodność między domeną, wiążącą DNA RAR i elementem cisregulatorowym regulatorowego regionu transkrypcji konstrukcji reporterowej. W ten sposób, jeśli chimeryczny RAR, posiadający konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji o domenę, wiążącą DNA, która może wiązać cis-regulatorowe elementy odpowiedzi na estrogen, i88 705 stosuje się w metodzie skriningu, wtedy regulatorowy region transkrypcji konstrukcji reporterowej powinien zawierać element odpowiedzi na estrogen.
Przykłady cis-regulatorowych elementów, które bezpośrednio wiążą receptory retinoidowe (RARE) użyteczne w związku z testem reportera, opisano u Mangelsdorfa i in. The Retinoid Receptors w The Retinoids: Biology, Chemistry i Medicine. 2-gie wydanie, wyd. Spom i in.. Raven Press Ltd, Nowy Jork (i994). Przykłady elementów cis-regulatorowych, które pośrednio wiążą receptory chimeryczne, obejmują miejsca, wiążące DNA dla każdego białka, wiążącego DNA, dla którego domenę białka, wiążącą DNA można włączyć do chimerycznego receptora, składającego się z tej domeny, wiążącej DNA dołączonej do receptora retinoidu. Konkretne przykłady domen, wiążących heterologiczny DNA, które można wbudować w chimeryczne receptory i które będą rozpoznawać heterologiczne elementy cisregulatorowe, obejmują te, które rozpoznają elementy odpowiedzi na estrogen. W ten sposób, część receptora retinoidowego receptora chimerycznego użyteczna w związku z metodą skriningu, nie musi zawierać wiązania DNA receptora retinoidowego lecz musi zawierać co najmniej domenę, wiążącą ligand receptora retinoidowego.
Dalszy przykład pośredniego wiązania receptora retinoidowego, obejmuje użycie białka, które może wiązać element cis-regulatorowy i dimeryzować z receptorem retinoidowym. W tym przypadku, receptor retinoidowy asocjuje z elementem cis-regulatorowym tylko przez asocjację z białkiem odpowiedzialnym za wiązanie DNA.
Przykładem takiego układu byłoby użycie białka połączonego, składającego się z domeny, wiążącej heterologiczny DNA połączonej z RXR, zawierającego co najmniej domenę RXR, odpowiedzialną za dimeryzację z RAR. Wprowadzone równocześnie RAR mogą dimeryzować z takim białkiem połączonym związanym z elementem cis-regulatorowym. Przewidujemy, ze każde białko, wiążące element cis-regulatorowy, które dimeryzuje z RAR dając w wyniku asocjację pośrednią RAR z elementem cis-regulatorowym, będzie także odpowiednie do użytku w metodzie skriningu hormonu negatywnego.
W zalecanej postaci realizacji metody skriningu, retinoćdowe hormony negatywne identyfikuje się jako te retinoidy, które hamują podstawową ekspresję budowanego czynnika transkrypcji RAR, posiadających zwiększoną aktywność podstawową. Budowany RAR użyty w następującym przykładzie zawierał konstytutywną domenę aktywacji transkrypcji mimo, ze nie zasadniczą dla opcracyjności metody skriningu. Użycie tego receptora chimerycznego korzystnie dostarczyło środka, którym można było podnieść podstawową ekspresję genu reporterowego przy nieobecności jakiegokolwiek retinoidu. Mimo, iż stosowaliśmy transfekcję krótkotrwałą w procedurach wyszczególnionych powyżej, linie komórkowe trarnsfekowane trwale, konstytutywnie wykazujące ekspresję receptora chimerycznego, były także użyteczne w związku z metodą skriningu.
Jak ujawniono w następującym przykładzie, chimeryczny receptor retinoidu, posiadający konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji, mógł dimeiyzować z drugim receptorem zbudowanym tak, ze zawierał domenę, wiążącą DNa specyficzną dla cis-regulatorowego elementu odpowiedzi na estrogen. W tym przypadku chimeryczny receptor retinoidowy, posiadający konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji, asocjuje z regionem cis-regulatorowym, kontrolującym ekspresję genu reporterowego pośrednio poprzez wiązanie się z drugim receptorem, który wiąże docelową sekwencję DNA. Bardziej szczegółowo, drugi receptor zbudowano tak, ze zawierał on domenę, wiążącą DNA, którą rozpoznawała element odpowiedzi na estrogen. Korzystnie, gen reporterowy, posiadający element odpowiedzi na estrogen w regionie w górę od promotora, nie odpowiadał na agonistę retinoidu przy nieobecności transfekowanego receptora chimerycznego, posiadającego konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji. W związku z tym, całą aktywność genu reporterowego przypisano transfekowanym receptorom. Połączone użycie domeny, wiążącej DNA elementu odpowiedzi na estrogen i elementu cis-regulatorowego elementu odpowiedzi na estrogen, ma przeznaczenie tylko ilustracyjne. Fachowcy zrozumieją, ze inne połączenia budowanych receptorów, posiadających specyficzność dla elementów cisregulatorowych nie-RARE, będą także użyteczne w praktyce wynalezionej metody skriningu.
Komórki uzyteczne w związku z metodą skriningu będą komórkami eukariotycznymi, które możną transfekować. Komórki mogą być komórkami zwierzęcymi, takimi jak komórki ludzkie, naczelnych lub gryzoni. Uzyskaliśmy bardzo dobre wyniki z użyciem komórek CV-i lecz racjonalnie sądzimy, że z powodzeniem można użyć innych hodowlanych linii komórko66
188 705 wych. Każdą, liczbę konwencjonalnych metod transfekcji znanych w tej dziedzinie, można użyć do wprowadzenia konstrukcji ekspresji, kodującej chimeryczny receptor retinoidu, posiadający konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji.
Konstytutywna domena aktywatora transkrypcji będzie się składała z wielu aminokwasów··', które prawdopodobnie będą posiadać ogólny charakter kwasowy reprezentowany przez ładunek ujemny w warunkach pH obojętnego. Przykładowo, konstytutywna domena aktywatora transkrypcji może mieć sekwencję aminokwasową która znajduje się także w wirusowych czynnikach transkrypcji. Przykładem wirusowego czynnika t^^mskrypcji, posiadającego konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji jest wirus 16 opryszczki. Jednakże inne wirusowe lub syntetyczne domeny aktywatora transkrypcji byłyby także użyteczne w montowaniu konstrukcji ekspresji, kodujących chimeryczny receptor retinoidowy, posiadający konstytutywną domenę aktywatora transkrypcji.
Jak opisano poniżej, rozwinęliśmy uogólnioną metodę skriningu użyteczną do identyfikacji negatywnych hormonów retinoidowych. Ta metoda skriningu dostarcza środków do rozróżnienia prostych antagonistów od hormonów negatywnych. Tabela 12 wymienia kilka związków retinoidowych, które wykazują silne powinowactwo do RAR-γ, a jednak, z wyjątkiem ATRA, nie transaktywują tego receptora w teście transaktywacji krótkotrwałej kotranfekeji. Przetestowaliśmy zatem te związki, aby określić, które były antagonistami RAR-γ i które, jeśli którekolwiek, z tych antagonistów wykazywały aktywność negatywnego hormonu.
Przykład 12 opisuje metodę użytą do identyfikacji związków retinoidowych, które były antagonistami, oraz podzbioru związków antagonistycznych, które wykazywały aktywność negatywnego hormonu.
Przykład 12
Test dla negatywnych hormonów retinoidowych.
x 104 Xomórek CV-1 transfekowfno przez proeedi^i.n^ t^r>l^ręcypite.cli fosforanf wapnia opisaną w Mzlceular Cloning: A Loborotory Manual i in. wyd. Cold Spring Harbor
Lab Publ. 1989) przy użyciu 0,5 pg plazmidu reporterowego RER-tk-Luc i 0,1 pg chimerycznego plazmidu ekspresji ER-RAR-y (Graupner i in. Bizehem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991). Po 18 godzinach komórki przepłukano PBS i potraktowano DMEM (Gibco-BRE), zawierającym 10% FBS ekstrahowanego aktyw-Owonym węglem drzewnym (Gemini Bio Products). Komórki traktowano 10'8 M ATRA w etanolu lub somym etanolem. Dodatkowo komórki traktowane ATRA traktowano 10'9, 10'8, 10'7 lub 10'6 M związków wymienionych w tabeli 12. Po 18 godzinach komórki przepłukano w PBS i poddano lizie w 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON Χ-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Aktywność lucyferazy mierzono jok opisano u Weta i in. w Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987).
Tabelo 12
Związek Kd (nM) @RAR-ya EC 50 (nM) @RAR-yb
ATRA 12 17
AGN 193109 (związek 60) 6 na
AGN 193174 (związek 34a) 52 na
AGN 193385 30 na
AGN 193385 (związek 23) 25 na
AGN 193389 (związek 25) 13 na
AGN 193840 40 na
AGN 193871 30 na
’ Względne powinowactwo (Kd) określone przez współzawodnictwo wiązania 3H-ATRA do RAR-γ o ekspresji w bakulowirusie, i stosowaniu równania Chenga-Prussofa.
b EC 50 mierzone w komórkach CV-1 krótkotrwale transfekowanych AMTV-TREp-Luc 1 RS-RAR-γ „na” oznacza brak aktywności
188 705
Jak wskazują wyniki przedstawione w części fig. 7 i w tabeli 12 z wyjątkiem ATRA, wszystkie związki wymienione w tabeli 12 były antagonistami retinoidów przy RAR-γ.
Antagonistów RAR-γ określonych w tabeli 12 poddano następnie skriningowi, aby określić które, jeśli w ogóle, były także retinoidowymi hormonami negatywnymi. 4 x 104 komórek CV-1 transfekowano zgodnie z procedurą fosforanu wapnia opisanej w w Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook i in. wyd. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989), przy użyciu 0,5 μg plazmidu reporterowego RER-tk-Luc i 0,1 μg chimerycznego plazmidu ekspresji ER-RAR-γ (Graupner i in. Biochem. Biopbzs. Res. Comm. 149:l554 (1991). Po 18 godzinach komórki przepłukano PBS i potraktowano DMEM (Gibco-BRL), zawierającym 10% FBS ekstrahowany aktywowanym węglem drzewnym (Gemini Bio-Products). Komórki traktowano 10'9, 10Ί, 10'7 lub 10'6 M każdego ze związków wymienionych w tabela 12. Traktowanie samym nośnikiem etanolowym służyło jako kontrola negatywna. Po 18 godzinach, komórki przepłukano w PBS i poddano lizie w 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Aktywność lucyferazy mierzono jak poprzednio u Weta i in. w Mol. Cell. Biol.7:725 (1987).
Jak ukazano w fig. 8, antagonistów retinoidów z tabeli 12 można rozdzielić na dwie klasy przez cechę ich wpływu na działanie konstytutywnej aktywacji transkrypcji cbimerzcznkgy receptora rettnoidowego RAR-y-VP-16. Jedna grupa, która obejmowała AGN 193(44< AGN 193199 i AGN 193840 nie hamowała aktywności RAR-y-VP-16 mimo, że były one antagonistami ATRA. Przeciwnie, AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 i AGN 193871 wykazywały represję w zalezności od dawki, konstytutywnej aktywności RAR-y-VP-16. Zatem, podczas gdy związki z obu grup były antagonistami RAR-γ, tylko te z drugiej grupy wykazywały aktywność hormonu negatywnego Ornacrknik to korzystnie rozróżniło retinoidowe hormony negatywne od prostych antagonistów yetinoidowycb.
Powyższe wyniki doświadczeń dowiodły, że AGN 193109 napotkał kryteria, które definiują hormon negatywny. Konkretniej, wyniki przedstawione w przykładzie 11 pokazały, ze AGN 193109 miał zdolność wywierania aktywności hamującej przy RAR nawet przy nieobecności egzogenicznie dodanych ligandów rktinoidowzch. Jako taki, związek ten posiadał aktywność biologiczną, która nie zależała od blokady interakcji między RAR i agonistami, takimi jak ATRA i AGN 191183. Odkrycia te doprowadziły nas do wniosku, ze AGN 193109 stabilizował interakcje między RAR i NCP. Jak pokazano na wykresie w fig. 9 interakcje NCP/RAR/PCP istnieją w stanie równowagi. Agonista służy do zwiększania interakcji PCP i zmniejszania interakcji NCP, podczas gdy odwrotny agonista lub hormon negatywny stabilizuje interakcje NCP i zmniejszą PCP. Jak zaznaczono poprzednio, nasze wyniki doświadczalne, sugerowały, że wewnątrzkomórkową dostępność NCP dla innych receptorów można modulować przez podanie AGN 193109. Konkretniej, odkryliśmy, że AGN (93(09 może pobudzać kompleksów NCP z RAR, zmniejszając przez to wewnątrzkomórkowy rezerwuar NCP dostępnego dla interakcji z czynnikami transkrypcji innymi niż RAR.
Zbadaliśmy następnie wpływ AGN 193109 na inhibicję, w której pośredniczy agoista, ekspresji genowej zależnej od aP-1. W Endocr. Rev. 14:651 (1993), Pfhal ujawnił, że agoniści retinoidów mogą obniżać ekspresję genową. W Endocr. Rev. (1993), Pfhal ujawnił, ze agoniści retinoidów mogą obniżać ekspresję genową przez mechanizm, który obejmował inhibicje aktywności AP-1. Założyliśmy, że AGN 193109 mógł mieć również dwa wpływy stosowany w połączeniu z agonistą rktinyidu w układzie modelowym przeznaczonym do pomiaru akt^ości AP-1. Po pierwsze, możliwe, że AGN 193109 antagonizował wpływ agonisty, łagodząc przez to inhibicję zależną od agonisty aktywności AP-1. Alternatywnie, możliwe, ze AGN 193109 wzmacniał aktywność agonistycmą wyolbrzymiając przez to inhibicję ζ.αι&ζ.η<^ od agonisty aktywności AP-1.
Przykład 13 opisuje metody użyte do pokazania, że AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 agonisty yetinoidywego. Jak ujawniono poniżej, agonista retinoidyky AGN 193109 słabo hamował ekspresję genową zależną od AP-1. Połączenie AGN (93(09 i agonisty retinoidywkgy silnie hamowało ekspresję genową zależną od AP-1. Sam AGN 193109 zasadniczo nie posiadał aktywności anty-AP-T
188 705
Przykład 13
AGN 193109 wzmacnia aktywność anty-AP-1 agonisty retinoidowego
Komórki HeLa transfekowano 1 pg konstrukcji genu reporterowego Str-AP1-CAT i 0,2 pg plazmidu pRS-hRARa, opisanego przez Giguere i in. w Nature 33:624 (1987)), przy użyciu LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.) Str-AP1-CAT wytworzono przez kloning fragmentu DNA, odpowiadającego pozycjom -84 do + 1 promotora stromeiizyny-1 szczura (Matrisian i in., Mol. CeU.Biol. 6:1679 (1986)) między miejscami HindlU-BamHI pBLCAT (Luckow i in., Nucl. Acids Res. 15:5490 (1987)). Ta sekwencja promotora stromelizyny-1 zawiera motyw AP1 jako jego jedyny element wzmacniający (Nicholson i in., EMBO J. 9:4443 (1990). Sekwencje promotora wytworzono przez „annealing” dwóch syntetycznych oligonukleotydów, posiadających sekwencje:
5'AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGATGCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACT
CTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCCAG-3' (SEQ ID nr 2) i 5'CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATT
TGCAGAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3, (SEQ ID nr 3).
Procedury, obejmujące transfekcję, traktowanie odpowiednimi związkami oraz pomiar aktywności CAT przeprowadzono jak opisano u Nagpala i in. J. Biol. Chem. 270:923 (1995).
Wyniki tych procedur wskazały, że AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 agonisty retinoidowego, AGN 191183. Konkretniej, w zakresie stężenia, wnoszącym od 10'12 do 10 M, AGN 191183 nie hamował ekspresji Str-AP1-CAT indukowanej przez TPA. Traktowanie AGN 193109 w zakresie stężeń od 10’10 do 10’8 M nie hamowało zasadniczo aktywności reporterowej, w której pośredniczy AP-1. Jednakże, wyniki przedstawione w fig. 10 wskazywały, ze stymulacja transfektantów połączeniem AGN 193109 (108 M) i AGN 191183 w zakresie stężeń od 10‘12 do 10'10 M, znacząco hamowała ekspresję Str-AP1-CAT indukowaną przez TPA, w ilości 12%-21%. Zatem, AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 AGN 191183 w warunkach, gdzie ten agonista retinoidowy zwykle nie hamował aktywności AP-1.
Dowiedliśmy, ze AGN 193109 wzmacniał represję aktywności AP-1, w której pośredniczy agonista, przez mechanizm, który prawdopodobnie obejmował maskowanie NCP zależne od AGN 193109, na RAR. RAR należą do nadrodziny receptorów jądrowych, które także obejmują receptory 1,25-dihydroksywitaminy D3, glukokortykoidu, hormonu tarczycy·, estrogenu i progesteronu. Rozsądnym przypuszczeniem było, że zdolność wiązania NCP mogą dzielić różni członkowie nadrodziny receptorów jądrowych. Prowadziło to nas do przypuszczenia, że AGN 193109 mógł wzmacniać aktywność anty-AP-1 jednego lub więcej ligandów, które oddziaływują z nadrodziną receptorów jądrowych.
Wyniki przedstawione w poprzednim przykładzie wyraźnie wskazywały; że AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 agonisty retinoidowego. Konkretniej, AGN 193109 obniżał dawkę progową, przy której aktywność anty-AP-1 AGN 191183 mogła być wykryta. Ponieważ sam AGN 193109 nie ma zasadniczo aktywości anty-AP-1, jego wpływ na agonistów receptorów jądrowych był synergistyczny. Odkryliśmy także, że negatywny hormon AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 L25-dihydroksywitaminy D3, naturalnego liganda receptora witaminy D3.
O')bserwowany synergizm między AGN 193109 i AGN 191183 w przykładzie poprzednim, z konieczności nasuwał wniosek, że aktywność anty-AP-1 agonisty retinoidowego oraz wzmacnianie aktywności, w którym pośredniczy AGN 193109, musi wynikać z różnych mechanizmów. Jeśli mechanizmy działania dwóch środków były identyczne, to tłumaczy, że efektywność połączenia AGN 193109 i agonisty była addytywna. Zamiast tego, okazało się, ze połączenie było skuteczniejsze niż którykolwiek środek pojedynczy, wpływ, którego możnabyło nie przewidzieć przed tym odkryciem.
Istotnie, wzmacnianie agonisty RAR, w którym pośredniczy AGN 193109, przeprowadzono przy użyciu około KlG-krotnego molarnego nadmiaru AGN 193109 ponad agonistę retinoidowego. W związku z tym, większość RAR powinna związać się z AGN 193109, pozostawiając bardzo niewiele RAR dostępnych dla wiązania agonisty. Mimo tego faktu, populacja RAR, która nie jest wiązana przez aGn 193109, jest dostępna do wiązania agonisty re188 705 tinoidowego i silnie stymuluje odpowiedź zależną od agonisty, możliwą do zmierzenia jako hamowanie ekspresji genu reporterowego. W ten sposób, nasze dane sugerowały możliwą heterogemczność RAR, które indukuje AGN 193109.
Aktywność hormonu negatywnego AGN 193109, przypisywaną jego zdolności do pobudzania interakcji RAR i NCP, dostarczała podstawy do zrozumienia synergii między AGN 193109 i agonistami retinoidowymi. Nasze wyniki były w pełni zgodne z modelem, w którym traktowanie AGN 193109 komórek pobudzało wiązanie RAR i NCP, zmniejszając przez to liczbę wolnego NCP i wolnego RAR wewnątrz, komórki. Daje to w wyniku, tworzenie dwóch populacji RAR, które są funkcjonalnie odmienne. Pierwszą populację reprezentują RAR asocjujące z NCP. Takich kompleksów AGN 193109/RAR/NcP nie można aktywować agonistą retinoidowym. Druga populacja składa się z RAR, których nie wiąże NCP i które pozostają dostępne do interakcji z agonistami. Tę drugą populację oznacza się „RAR*”, aby wskazać wolne RAR w środowisku zasadniczo pozbawionym NCP. RAR* mają mniejsze prawdopodobieństwo asocjacji z NCP poprzez równoważne wiązanie i mają większą wrażliwość na agonistów retinoidowych, możliwą do zmierzenia np. jako aktywność antv-AP-1. Jest tak, ponieważ podczas gdy wewnętrzny rezerwuar NCP wyczekuje się dzięki podawaniu AGN 193109, rezerwuar PCP nie zostaje wyczerpany. W związku z tym, wolne RAR* mogą wiązać agonistę retinoidowego i oddziaływać z czynnikami PCP w środowisku zasadniczo pozbawionym NCP.
Zdolność AGN 193109 do zwiększania wrażliwości innych receptorów jądrowych na ich odpowiednich agonistów, można przypisać zdolności tych różnych receptorów jądrowych do oddziaływania z tymi samymi NCP, które oddziałują z kompleksami AGN 193109/RAR. Ten model modulacji, w której pośredniczy AGN 193109 dostępności NCP dla członków rodziny receptorów jądrowych, przedstawiono schematycznie w fig. 11.
Ten model mechanizmu doprowadził nas do twierdzenia, że AGN 193109 może modulować aktywność ligandów receptorów jądrowych innych niż agoniści retinoidów. Jak zilustrowano w następującom przykładzie, potwierdziliśmy, że AGN 193109 wzmacnia aktywność 1,25-dihydroksywitaminy D3 w teście transaktywacji in vitro.
Przykład 14 opisuje sposoby użyte do pokazania, ze AGN 193109 wzmacnia aktywność aktywność 1,25-dihydroksywitaminy D 3 w teście transaktywacji.
Przykład 14
AGN 193109 wzmacnia aktywność 1,25-dihydroksywitaminy D 3
Komórki Hela transfekowano przy użyciu procedury transfekcji, w której pośredniczy liposom kationowy, opisanej przez Felgnera i in. w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). 5 x 104 komórek powleczono na wielopłytkowych płytkach o 12 studzienkach i hodowano w DMEME uzupełnionym 10% FBS. Komórki transfekowano równocześnie w pożywce pozbawionej surowicy, przy użyciu 2 pg/studzienkę odczynnika LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.) z 0,7 pg plazmidu reporterowego MTV-VDRE-Luc, zawierającego dwie kopie elementu odpowiedzi na
1.25- dihydroksywitaminę D 3 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTA-3' (SEQ ID nr: 4) z mysiego genu osteopontyny (Ferrara i in. J. Biol. Chem. 269:2971 (1994)) połączonym z plazmidem reporterowym aMtY-Luc (Heyman i in. w Cell 68:397 (1992)) oraz 0,3 pg plazmidu pGEMSZ (Pharmacia, Inc.) jako nośnika DNA, do końcowego stężenia DNA do 1,0 pg na studzienkę. Po sześciu godzinach transfekcji, komórki potraktowano pożywką hodowlaną, zawierającą FBS ekstrahowany węglem drzewnym o stężeniu końcowym 10%. Osiemnaście godzin po transfekcji komórki potraktowano samym nośnikiem (etanol) lub AGN 193109 w etanolu przy końcowym stężeniu albo 10‘8 albo 10'7 M. Sześć godzin później, dodano 1,25dihydroksywitaminę D3 w etanolu do końcowego stężenia W -107 M. Komórki poddano lizie i zebrano osiemnaście godzin po traktowaniu 1,2-7diilydroksywhaminą D 3. Aktywność lucyferazy mierzono jak opisano powyżej. Ten układ doświadczalny pozwolił na dogodną metodę monitoringu i analizę ilościową ekspresji genowej zależnej od 1,25-dihydroksywitaminy D 3.
Wyniki przedstawione w fig. 12 wskazały, ze w porównaniu z wynikami otrzymanymi przy użyciu samej 1,25-dihydroksywiyaminy D3, AGN 193109 podany równocześnie z samej
1.25- dihydroksywitaminą, D3 przesunął krzywą odpowiedzi na dawkę w lewo. Potwierdziło to, że AGN 193109 wzmacnia skuteczność 1,257dihydIΌksywitammy D3 w teście transakty70
188 705 wacji in vitro. Konkretniej, fig. 12 graficznie ilustruje, że stężenie AGN 193109 tak niskie jak 10-100 nM powodowało blisko 10-krotnie większą aktywność 1,25-dihydroksywitaminy D3. Podczas gdy stężenie, wynoszące 10'8 M 1,25-dihydroksywitaminy D3 było wymagane do wytworzenia ekspresji lucyferazy, wynoszącej około 2 000 rlu, potrzeba było tylko jednej dziesiątej 1,25-dihydroksywitaminy D3 do wytworzenia takiego samego wypływu lucyferazy, gdy witaminę podawano z AGN 193109 przy stężeniu 10’8-l 09 M. Mimo, że nie pokazano tego na wykresie w fig. 12, zasadniczo identyczne wyniki otrzymano przy użyciu stężeń AGN 193109, wynoszących 10' M i 10'8 M. W ten sposób równoczesne podanie AGN 193109 zasadniczo zmniejszyło ilość 1,25-dihydroksywitaminy D3 wymaganej do wytworzenia podobnego efektu, przy nieobecności hormonu negatywnego.
Co ciekawe, gdy powyższą procedurę powtórzono z kotransfekcją plazmidu ekspresji receptora witaminy D (VDR), zaistniał równocześnie wypadek zmniejszenia zdolności AGN 193109 do wzmacniania aktywności ilość 1,25-dihydroksywitaminy D3. Tłumaczyliśmy ten wynik jako wskazujący, że nadekspresja VDR może wpływać na zdolność AGN 193109 wzmacniania aktywności ilość 1,25-dihydroksywitaminy D3. W ten sposób wewnątrzkomórkowe stężenie receptora liganda, które może różnicować się w sposób specyficzno-tkankowy, może wpływać na zdolność AGN 193109 do wzmacniania aktywności liganda, który wiąże receptor. Było to znowu zgodne z modelem, w którym możliwe do mianowania NCP przyczyniały się do regulacji odpowiedzi witaminy D3 i podtrzymywały model przedłożony powyżej.
Jak zilustrowano w następującym przykładzie, potwierdziliśmy także, że AGN 193109 wzmacniał aktywność anty-AP-1 ilość 1,25-dihydroksywitaminy D3. Nasz model dla aktywności działania AGN 193109 tłumaczy tę obserwację przez wezwanie, że NCP asocjują z RAR w obecności tego leku. Receptory endogenicznej witaminy D obecne w komórkach HeLa prawdopodobnie powodowały większą czułość na ligand 1,25-dihydroksywitaminy D3, ze skutkiem wyolbrzymionej zdolności tego liganda do hamowania ekspresji z reportera StrAP1-CAT.
Przykład 15 opisuje sposoby użyte do pokazania, że AGN 193109 wzmacnia aktywność anty-AP-1 1,25-20 dihydroksywitaminy D3.
Przykład 15
AGN 193109 wzmacnia aktywność anty-AP-1 1,25-dihydroksywitaminy D3
Komórki HeLa transfekowano 1 pg Str-APl-CAT przy użyciu LIPOFECTAMINE zgodnie z metodą opisaną przez Nagpala i in. w J. Biol. Chem. 270:923 (195). Transfekowane komórki traktowano samym AGN 193109 (109-10'7 M), samą 1,25-dihydroksywitaminą D3 (10'12-l0'7 M) lub samą l,25-dihydroksywitaminąD3 (10 -10'7 M) w obecności 10'8 M AGN 193109.
Wyniki tych procedur wskazywały, że AGN 193109 wzmacniał zdolność 1,25dihydroksywitaminy D3 do hamowania aktywności AP-1 indukowanej TPA. Użyty pojedynczo w zakresie stężeń 10'9 do 10'7 M, AGN 193109 nie wykazywał wykrywalnej aktywności antyAP-1. Wyniki przedstawione w fig. 13 wskazywały, że 1,25-dihydroksywitamina D3 hamuje aktywność stymulowaną przez TPA tylko w zakresie stężenia 10'8 i 10'7. Analiza represji aktywności CAT stymulowanej przez TPA, w której pośredniczy 1,25-dihydroksywitamina D3, w obecności ΙΟ’8 M AGN 193109 wskazywała, że aktywność anty-Ap-1 jest wykrywalna przy 10'10 i 10'9 M 1,25-dihydroksywitaminy D3 i zwiększa aktywność przy dawkach 10'8 i 10'7 M w porównaniu z traktowaniem samą 1,25-dihydroksywitaminą D3. Ta modulacja zalezna od AGN 193109 aktywności anty-AP-1, w której pośredniczy 1,25-dihydroksywitamina D3, była zgodna z naszym modelem, w którym maskowanie NCP wobec RAR czyniła NCP niedostępnym dla interakcji z innymi członkami rodziny receptorów jądrowych. W związku z tym, receptory stały się bardziej wrażliwe na traktowanie l,25-dihydroksywitaminąD3.
Mechanizmy, będące podstawą transaktywacji, w której pośredniczy RAR oraz aktywność anty-AP-1 są prawdopodobnie odmienne. Wniosek ten opierał się na naszej obserwacji, ze wysokie dawki AGN 193109 całkowicie hamowały transaktywację bez zasadniczego hamowania aktywności anty-AP-1. Pragnęliśmy zatem zyskać dodatkowy dowód na potwierdzenie naszego modelu tworzenia RAR*, w którym pośredniczy traktowanie AGN 193109. Aby to osiągnąć, badaliśmy czy AGN 193109 mógł wzmacniać aktywność agonisty specyficznego dla RAR AGN 191183 w teście transaktywacji in vitro.
188 705
Przykład 16 opisuje sposoby użyte do pokazania, że AGN 193109 wzmacnia aktywność agonisty specyficznego dla RAR, aGn 191183. Wyniki tego postępowania wskazywały, że w szczególnych okolicznościach, AGN 193109 wzmacnia siłę retinoidu specyficznego dla RAR i dostarczyły silnego dowodu, że AGN 193109 pobudza tworzenie się RAR*.
Przykład 16
Wzmacnianie skuteczności retinoidu przez równoczesne podawanie AGN 193109
Komórki HeLa tra.nsfekowa.no przy użyciu procedury trusfckcyjnej, w której pośredniczy liposom kationowy, opisanej przez Felgnera i in. w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). 5 x 104 komórek powleczono w wielostudzienkowych płytkach o 12 studzienkach i hodowano w DMEM uzupełnionym. 10% FBS. Komórki transfe^-rno równocześnie w pożywce pozbawionej surowicy, przy użyciu odczynnika LIPOFECTAMINE (2 pg/studzienkę, Life Technologies, Inc.) za pomocą 0,7 pg plazmidu reporerowego MTY-TREp-Łuc, zawierającego dwie kopie elementu odpowiedzi TREpal 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (SEQ ID nr: 5) wprowadzonego do plazmidu reporterowego AMTV-Luc (Heyman i in. w Cell 68:397 (1992)) oraz 0,1 pg plazmidu ekspresji RAR-γ pRShRAR-y (Ishikawa i in. w Cell 4:837 (1990)). Po sześciu godzinach transfekcji, komórki potraktowano pożywką hodowlaną, zawierającą FBS ekstrahowany węglem drzewnym, o końcowym stężeniu 10%. Osiemnaście godzin po transfekcji, komórki traktowano samym nośnikiem (etanol) lub AGN 193109 w etanolu o końcowym stężeniu, wynoszącym 10--10-8 M. Sześć godzin później, dodano AGN 191183 w etanolu do końcowego stężenia albo 10'10 albo 10'^M. Komórki zebrano po osiemnastu godzinach traktowania AGN 191183 i zmierzono aktywność lucyfera/Ą' jak opisano powyżej.
Wstępne doświadczenia wskazały, że 109 M AGN 193109 było względnie nieefektywne w hamowaniu odpowiedzi wobec 10'9 M AGN 191183 w komórkach HeLa. Kontrastowało to ze zdolnością 10'9 M AGN 193109 do hamowania 10 ’9 M ATRA w komórkach C V-1 (fig. 2).
Wyniki przedstawione w fig. 14 popierały przypuszczenie, że AGN 193109 stymulował tworzenie RAR*. Zgodnie z naszą charakteryzacją, aktywności antagonisty i hormonu negatywnego AGN 193109, traktowanie AGN 193109 dało w wyniku dwufazową krzywą odpowiedzi na dawkę. Niższe dawki AGN 193109 (10-11 i 10'10 M) dały w wyniku stymulację aktywności lucyferazy ponad stymulację samym AGN 191183. Ten efekt sugeruje, że RAR* są tworzone przez AGN 193109. Osobliwie, widoczne to było także przy traktowaniu samym AGN 193109, sugerując, że RAR* może odpowiadać na ligand endogeniczny. AGN 191183 jest syntetycznym agonistą retinoidu i tak jak ATRA, aktywuje transkrypcję poprzez RAR. Podstawienie AGN 191183 ATRA w przykładzie 7 daje wyniki jakościowo podobne (to jest AGN 193109 antagonizowałby wpływ 10 nM AGN 191183). Przykład 16 ilustruje, że podczas gdy AGN 193109 może działać jako antagonista agonisty RAr, można łatwo określić warunki dawkowania, w których równoczesne podawanie AGN 193109 wzmacnia aktywację, w której pośredniczy agonista RAR. Trzeba zauważyć, że dawki związków użytych w przykładzie 16 są znacznie niższe od dawek użytych w procedurze opisanej w przykładzie 7. Zaproponowaliśmy, żeby traktowanie AGN 193109 mogło prowadzić do heterogenicznosci RAR, RAR kontra RAr*. Widoczna heterogeniczność (to jest zdolność do wzmacniania) ujawnia się w różnych okienkach jeśli chodzi o transaktywację przeciw represji AP-1. Powodem, dla którego krzywe są dwufazowe jest to, że ze zwiększającą się ilością AGN 193109, jest proporcjonalnie mniej RAR dostępnego do wiązania agonisty. Nie jest tak w przypadku represji AP-1 i pozostaje nam przypuszczać, że ta różnica musi odzwierciedlać dwa różne mechanizmy transaktywacji i represji AP-1 przez te same rodzaje receptorów.
Wyniki klinic/ne potwierdziły, że niektóre retinoidy są użyteczne do hamowania wzrostu przedrakowych i rakowych stanów chorobowych szyjki macicy. Przykładowe badania popierające ten wniosek opublikowali Graham i in. w West. J.Med. 145:192 (1986), Lippman i in. w J. Natl. Cancer Inst. 84:241 (1992) i Weiner i in. w Invest. New Drugs 4: 241 (1986)).
Podobne wnioski popierają, wyniki badań in vitro, które stosowały komórki hodowlane do oceny ilościowej wpływu antyproliferacyjnemu różnych retinoidów^. Konkretniej, Agarwal i in. w Caneer Res. 5513982 ((911 użył tmii komórkowee ECE16-1 do modehi wczesnych ttadiów dysplazji szyjki macicy i pokazał, że kwas retinowy może hamować proliferacje komórkową zależną od naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
188 705
Przykład i7 opisuje metody użyte do pokazania, że AGN 193109 może antagonizować aktywność agonisty retinoidowego AGN 191183, który hamował proliferację linii komórkowej ECE16-1.
Przykład i7
AGN i93i09 antagonizuje wpływ antyproliferacyjny retinoidów w komórkach ECE16-1
Komórki ECE16-1 posiano z gęstością i x i04 komórek na cm2 w kompletnej pożywce, zawierającej DMEM:Fi2 (3:1), aminokwasy nie podstawowe, 5% FBS, 5 μg/ml trasferyny, 2 nM 3,3',5'-trijodotyroniny (hormon tarczycowy lub „T3”), 0,1 nM toksyny cholery, 2 mM L-glutaminy, 1,8 x 10’1 adeniny i i0 ng/ml EGF. Komórki pozostawiono przez noc w celu przyczepienia się do płytek, a potem przesunięto do określonej pożywki, zawierającej DMEM:Fi2 (3:1), 2 mM L-glutaminę, aminokwasy nie podstawowe, 0,i% albuminę surowicy bydlęcej, 1,8 x i0“* M adeniny, 5 μg/ml transferyny, 2 nM T3, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 100 μg/ml streptomycyny, 100 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml gentamycyny. Określoną pożywkę (DM) uzupełniono i0 ng/ml EGF. Komórki traktowane EGF otrzymały i0 nM agonisty rettnoidowego AGN 191183 w połączeniu albo z 0, 0,1, 1,0, 10, 100 albo i000 nM AGN 193109 albo i000 nM samego aGn i93i09. Po trzech dniach traktowania, komórki zebrano jak opisano u Hambree i in. w Cancer Res. 54:3160 (1994) i liczbę komórek określono przy użyciu licznika COULTER.
Wyniki przedstawione w fig. i5 pokazały, że komórki ECEi6-i proliferowały w odpowiedzi na EGF lecz nie w samej określonej pożywce. Potwierdziło to odkrycia publikowane przez Andreatta-van Leyena i in. w J. Cell Physio. 160:265 (1994), oraz przez Hembree i in. w Cancer Res. 54:3160 (i994). Dodanie i0 nMAGN 191183 i 0 nM AGN 193109 całkowicie hamowało proliferację, w której pośredniczy EGF. A więc, AGN 191183 jest silnym retinoidem antyproliferacyjnym. Zwiększanie stężenia AGN 193109 od 0 nM do i0 nM antagonizowało wzrost inhibicji, w której pośredniczy AGN 191183 o około 50%. Dziesięciokrotny nadmiar molarności AGN 193109 całkowicie odwracał wpływ antyproliferacyjny AGN 191183. Traktowanie komórek i000 nM samego AGN 193109 nie miało wpływu na wzrost proliferacji, w której pośredniczy EGF. Wyniki te dowiodły, że AGN 193109 antagonizował wpływ antyproliferazyjny retinoidu lecz zasadniczo nie własną aktywność antyproliferacyjna do użytku w traktowaniu komórek, reprezentujących nabłonek szyjki macicy, który jest wrażliwy na inhibicję wzrostu spowodowaną przez retinoidy, takie jak AGN i9ii83. W szczególności, nie było dowodu, że AGN 193109 wzmacniał aktywność antyproliferacyjna agonisty AGN 19ii83 przy użyciu układu modelowego ECEi6-i.
W przeciwieństwie do układu modelowego reprezentowanego przez linię komórkową ECE16-1, istnieją inne przykłady, gdzie proliferacji komórkowej związanej z dysplazją szyjki macicy nie można hamować agonistą retinoidu. Przykładowo, Agarwal i in. w Cancer Res. 54:2108 (1994) opisywał użycie komórek CaSki jako modelu dla guzów szyjki macicy, które nie odpowiadają na terapię retinoidami. Jak ujawniono poniżej, traktowanie retmoidem istotnie raczej nie miało wpływu na tempo wzrostu komórek CaSki, niż hamowało proliferację komórkową. Następujący przykład kierował wpływ negatywnego hormonu AGN 193109 na tempa proliferacji tej linii komórkowej. Wyniki nieoczekiwanie dowiodły, że AGN 193109 może hamować proliferację komórek guzów szyjki macicy, które nie odpowiadają na antyproliferacyjry wpływ agonistów retinoidów.
Przykład 18 opisuje metody, użyte do pokazania, że AGN 193109 hamował wzrost linii komórek guza szyjki macicy, która nie odpowiada na antyproliferacyjny wpływ innych retinoidów, takich jak AGN 191183. Istotnie AGN 193109 wykazywał aktywność antyproliferacyjna przy nieobecności dodanego retinoidu.
Przykład 18
AGN 193109 hamuje tempo proliferacji linii komórkowej, pochodzącej od raka szyjki macicy CaSki
Testowaliśmy wpływ EGF na proliferację komórek CaSki, albo samych albo w połączeniu z agonistą retinoidowym AGN 191183 i/lub hormonem negatywnym AGN 193109, w stężeniu 10'6 M. Oznaczenia proliferacji komórkowej przeprowadziliśmy jak opisano powyżej dla badań, obejmujących komórki ECE16-1. EGF dodano do hodowli traktowanych retino188 705 idem, do końcowego stężenia 20 ng/ml. Komórki traktowano AGN 191183 (W10 do 10'6 M) w obecności lub przy nieobecnośei 10'6 M AGN 193109, przez cole trzy dni. Pożywki wymieniono no świeże i każdy z dwóch związków retinoidowych, odpowiednio, każdego dnia. Liczbę komórek zkre.ślapz przy użyciu licznika COULTER, jak opisano powyżej.
Wyniki przedstawione w fig. 16 wskazywały, ze komórki CoSki były zasadniczo oporne na wpływ agonisty retinoidowego, oraz że AGN 193109 wykazywał aktywność antyprzllfcracyjną przy niczbecpzści dodanego retinoidu. Obecność EGF w pożywkach hodowlanych stymulowała wzrost komórek CaSki. Wniosek ten opierał się na porównaniu prążkowanego słupko, reprezentuj ącego brak AGN 191183 i otwartego słupka, reprezentującego wzrost w samej określonej pożywce („DM”). Traktowanie AGN 191183 nie dawał aktywności antyprzlifcracyjnej na linię komórkową guza CaSki. Wykluczyliśmy jakikolwiek nieonoezny wzrost tempa proliferazji komórkowej związany z ogonistą retinoidu, ponieważ zwiększenie dziesięć tysięcy rozy stężenia agonisty retinoidzwego, związane było w przybliżeniu tylko z 20% zwększeniem tempa proliferacji. W ten sposób, agonistą aGn 191183 zasadniczo nie miał wpływu na tempo proliferacji komórek CaSki.
Wyniki przcdsta'wiznc w fig. 16 wskazywały tokże, że AGN 193109 hamował proliferację linii komórkowej nabłonka szyjki macicy CaSki. Wniosek ten opierał się na porównaniu pomiarów, uwidocznionych jako czarny słupek „0” AGN 191183 oraz prążkowany słupek „0” AGN 191183. W ten sposób, AGN 193109 był zdolny do stymulowania biologicznej odpowiedzi przy piezbeeności dodanego agonisty retinoidowegz, przy stoszwopiu do traktowania komórek guza szyjki macicy, których wzrostu nie hamował agonista r¢tίnoidzwy, taki jok AGN 191183.
Nasze odkrycie, ze negatywny hormon AGN 193109 mógł hamować proliferację komórkową, było zgodne z modelem, w którym wolny RAR pośredniczył w ekspresji genów wymaganych do proliferacji. Podczas gdy agonista RAR, taki jak AGN 191183 nie miał zasadniczo wpływu, lub być może pobudzał nicznoeonic proliferację komórkową. AGN 193109 miał wpływ antyproliferacyjny. Negatywny hormon AGN 193109 pkoρdopodzbple wiązał RAR, pobudzając przez to asocjacje NCP i powodując przybieranie przez RAR nieaktywniej konformacji. Zgodnie z naszym modelem, hamowało to aktywność genu, którą pozytywnie regulowały wolne RAR. Ta zdolność AGN 193109 do obniżania aktywności wolnych RAR, prawdopodobnie wynikała z jego zdolności do pobudzania asocjacji rAr i NCP.
Fachowcy docenią, że niektórzy agoniści retinoidów są użyteczni do kontrolowania niepożądopyeh skutków wzrostu komórek, który wynika z odwarstwienia się siatkówki. Po odwarstwieniu się siatkówki, nabłonek pigmentowony siatkówki (RPE) zdróżnicowuje się, prolifer-uje i migruje do przestrzeni podsiatkówkzwęj. Proces ten może negatywpie wpływać na sukces postępowania chirurgicznego, mającego no celu powtórne przyklejenie siatkówki. Compochiaro i in. w Invest. Ophtal & Vis.Sci. 32:65 (1991) pokazali, że agoniści RAR, tacy jak ATRA wykazywali wpływ ontyproliferaeyjpy na wzrost pierwotnych hodowli ludzkich RPE. Okazało się także, ze agoniści retinoidowi zmniejszają zakres odklejeń siatkówki następujących po operacji przyklejenia siatkówki (Fekrot i in. Ophtalmolzgy 102:412 (1994)). Jak ujawniono w następującym przykładzie, przeanalizowaliśmy zdolność negatywnego hormonu AGN 193109 do supresji wzrostu w pierwotnych hodowlach RPE człowieka.
Przykład 19 opisuje metody użyte do pokazania, ze AGN 193109 wzmacnia wpływ antyproliferacyjny antagonisty rctinzidu w pierwotnych hodowlach ludzkiego nabłonka pigmentowego siatkówki.
Przykład 19
AGN 193109 wzmacnia aktywność antypiOliferacYjną ATRA rlei'wztne hodowle ludzkiego nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) ustanowiono zgodnie z metodą opisano przez Campochiaro i in. Ipvest. Opthal & Vis.Sci 32:65 (1991). 5 x 104 komórek powleczono w 16 mm studzienkach wielostudzienkowych płytek o 24 studoiepkach DMEM IgU^co), zawierającym 5% FBS. Komórki sztucznie traktowano somym pzśnlkicm etanolowym, ATRA (10-™ do 106 M) w etanolu, AGN 193109 (10-10 do 10 6 M) w etanolu lub ATRA (10-10 do 10'6 M) i 10-5 M AGN 193109. Komórki odżywiano świeżą pożywką, zawierającą odpowiednie stężenia tych związków, co dwa dni przez całkowity okres
188 705 pięciu dni traktowania. Komórki usunięto z płytek przez delikatne trawienie trypsyną, a liczbę komórek obliczono za pomocą elektronicznego licznika komórek.
Wyniki przedstawione w fig. 17 wskazywały, że AGN 193109 dramatycznie wzmacniał aktywność antyproliferacyjną ATRA na komórki RPE. Traktowanie pierwotnych komórek RPE ATRA prowadziło do zmniejszenia w zależności od dawki, proliferacji komórkowej RPE, z blisko 40% zmniejszeniem przy 106 M samego ATRA w stosunku do hodowli kontrolnej. Traktowanie AGN 193109 zasadniczo nie zmieniało tempa wzrostu komórek RPE przy jakimkolwiek stężeniu testowanym w tej procedurze. Nieoczekiwanie, połączenie ATRA (10'ń do 10’ M) oraz 10’ M AGN 193109 miał silniejszą aktywność antyproliferacyjną niż sam ATRA. W ten sposób, równoczesne traktowanie AGN 193109 wzmacniało wpływ antyproliferacyjny ATRA. Konkretniej, wyniki, ukazane w fig. wskazywały, że wpływ antyproliferacyjny 10'8 M ATRA był możliwy do uzyskania przy użyciu tylko 10’l(i M ATRA w połączeniu z 10'7 AGN 193109. W ten sposób, negatywny hormon AGN 193109 korzystnie wzmacniał aktywność antyproliferacyjną ATRA blisko 100-krotnie.
W niezależnym doświadczeniu, porównanie wpływu antyproliferacyjnego ATRA (10’11 do ΙΟ-6 M) z wpływem ATRA oraz 10’6 M AGN 193109, znów pokazało widoczny wzrost wrażliwości pierwotnych komórek RPE na ATRA w obecności AGN 193109. W tym układzie, AGN 193109 ani nie działał jak antagonista retinoidu ani nie wykazywał wpływu antyproliferacyjnego, gdy używano go pojedynczo. Jednakże równoczesne podawanie AGN 193109 wzmacniało aktywność antyproliferacyjną agonisty retinoidowego.
AGN 193109 testowano pod względem jego zdolności do wzmacniania wpływu antyproliferacyjnego kwasu 13-cis retinowego (13-cis RA) w pierwotnych hodowlach RPE, przy użyciu warunków i technik do pomiaru proliferacji komórkowej RPE, opisanej powyżej. W szczególności, 13-cis RA jest klinicznie istotny. Konkretniej, 13-cis RA jest użyteczny w traktowaniu kilku stanów chorobowych, włączając trądzik (Peck i in. N. Engl. J. Med. 300:329 (1977); Jones i in. Br. J. Dermatol. 108:333 (1980)), oraz nowotwór komórek łuskowatych skóry i szyjki macicy w połączonym traktowaniu interferonem 2a (Lippman i in. J.Natl.Cancer Inst. 84:241 (1992); Moore i in. Seminars in Hematology 31:31 (1994)).
Wyniki przedstawione w fig. 18 wskazywały, ze zarówno 13-cis RA (10'12 do 10‘6 M) oraz ATRA (10'12 do 10'6 M) skutecznie hamowały wzrost komórek RPE. W szczególności, izomer 13-cis był blisko dwa rzędy wielkości mniej skuteczny w porównaniu z ATRA. Podobnie do wyników otrzymanych przy użyciu równoczesnego podawania AGN 193109 i ATRA (powyżej), równoczesnego podawania AGN 193109 (albo 10'8 albo 10’6 M) z 13-cis RA (10'12do 10’° M) dramatycznie zwiększał siłę 13-cis RA w pośredniczeniu w represji proliferacji komórek RPE. W przeciwieństwie do traktowania samym 13-cis RA, równoczesne podawanie AGN 193109 wzmacniało siłę 13-cis RA. W ten sposób, AGN 193109 wzmacniał aktywność antyproliferacyjną 13-cis RA.
Następnie testowaliśmy zdolność AGN 193109 do wzmacniania aktywności innych hormonów receptorów jądrowych w pierwotnych hodowlach komórek RPE. Deksametazon, syntetyczny agonista receptora glukokortykosteroidowego, jest jednym z członków klasy związków, których używano klinicznie ze względu na ich silne właściwości przeciwzapalne i immunosupresyjne. Hormon tarczycy (T3; 3,3',5'-trijodotyronina) jest agonistą naturalnego receptora hormonu tarczycy, używanym głównie do terapii substutycyjnej hormonu w leczeniu niedoczyności tarczycy. Metody użyte w tych doświadczeniach były identyczne jak opisane powyżej dla postępowania, obejmującego ATRA i 13-cis RA.
Wyniki tych procedur wskazywały, ze równoczesne podawanie AGN 193109 i agonistów receptorów jądrowych wzmacniało aktywność antyproliferacyjną agonistów receptorów jądrowych. Konkretniej, wyniki przedstawione w fig. 19 ukazały, że traktowanie pojedynczym środkiem komórek RPE, albo deksametazonem (10^1 do ΙΟ’6 M) albo ATRA (10’12 do ΙΟ’6 M) zasadniczo nie mogło hamować proliferacji komórek RPE. Jednakże, traktowanie komórek RPE deksametazonem (10 11 do 10 6 M) i albo 108 M albo 10 6 M AGN 193109 hamowało proliferację komórek RPE do rozmiaru, który był w przybliżeniu taki jak inhibicją powodowana przez traktowanie ATRA. Podobnie, wyniki przedstawione w fig. 20 wskazywały, ze AGN 193109 wzmacniał aktywność antyproliferacyjną hormonu tarczycy. Podobnie do wyników otrzymanych przy użyciu deksametazonu, proliferacja komórek RPE była oporna na trak188 705 towanie pojedynczym środkiem hormonem tarczycy (10-11 do 10'6 M). Jednakże równoczesne traktowanie komórek RPE hormonem tarczycy (10-11 ,o 10'6 M) i AGN 193109 (albo 10^ M albo 10-6 M) hamowało proliferację komórkową RPE w sposób zależny od hormonu tarczycy. Doszliśmy do wniosku, ze AGN 193109 czynił pierwotne hodowle RPE wrażliwymi na wpływ antyproliferacyjny tych agonistów receptorów jądrowych. Mechanizm, za pomocą którego AGN 193109 pośredniczył w tym wpływie, prawdopodobnie obejmował modulacje interakcji NCP/RAR.
Zbadaliśmy poza tym wpływ AGN 193109 na ekspresję genów markerowych w innych układach doświadczalnych, które były wrażliwe na agonistów retinoidu. Zarówno MRP8 jak i geny stromelizyny znane są z tego, że hamują je agoniści retinoidu w różnych układach biologicznych. Przykładowo, Wilkinson i in. w Cell Sci.91:221 (1988) i Madsen i in. w J. Invest. Dermatoł.99:299 (1992) ujawnili, ze ekspresja genowa MRP8 była podwyższona w łuszczycy. Odwrotnie, ekspresja genu MRP8 była hamowana przez agonistę retinoidowego AGN 190168 w ludzkiej skórze z łuszczycą (Nagpal i in. przedłożony 1995), w ludzkich hodowlach mas keratynocytów (Chandraratna i in. J. Invest. Dermatol. 102:625 (1994)) oraz w hodowlach ludzkich keratynocytów z napletka noworodka (Thacher i in. J. Invest.Dermatol. 104:594 (1995)). Nagpal i in., w J.Biol.Chem.270:923 (1995) ujawnił, że poziom mRNA stromelizyny był hamowany przez agonistów retinoidu, takich jak AGN 190168 w hodowanych ludzkich keratynocytach napletka noworodka. Analizowaliśmy regulowaną ekspresję tych genów po potraktowaniu w hodowanych ludzkich keratynocytach napletka noworodka albo agonistą retinoidu AGN 191183 albo AGN 193109.
Przykład 20 opisuje metody użyte do pokazania, że AGN 193109 hamował ekspresję MRP-8 w hodowanych keratynocytach.
Przykład 20
AGN 193109 hamuje ekspresję MRP-8 w keratynocytach
Pierwotne keratynocyty napletka izolowano zgodnie z procedurą opisano przez Nagpala i in. w J. Biol. Chem. 270:923 (1995) i hodowano w pożywce do hodowli keratynocytów (KGM), którą nabyto od Clonetic. Po 3 dniach traktowania AGN 191183 (WT’ M) lub AGN 193109 (106 M) izolowano całość komórkowego RNA z traktowanych i kontrolnych kerat^^cytów, zgodnie ze standardowymi metodami. mRNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA, który potem służył jako matryca w protokole powielania PCR przy użyciu primerów specyficznych albo dla genu gospodarza dehydrogenazy fosforanu gliceroaldehydu (GAPDH) albo MRP-8.
Primery GAPDH miały sekwencje
5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (SEQ ID nr: 6) oraz
5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' (SEQIDnr: 7).
Primery MRP-8 miały sekwencje '-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3 (SEQ ID nr· 8) oraz '-ATTCTGiC-AGGTACATGTCCA-3' (SEQ D> nr : 9).
Równą część z reakcji powielania MRP-8 (10 pl) usuwano po każdym cyklu powielania PCR, zaczynając od 12 cykli i kończąc na 21 cyklach. Podobnie, równą część reakcji powielenia GAPDH usuwano po każdym cyklu PCR, zaczynając przy 15 cyklach i kończąc przy 24 cyklach. Próbki poddano elektroforezie na 2% żelach agarozowych i rozdzielono produkty powielenia, wykryte przez barwienie bromkiem etidium. Intensywność barwienia produktów powielenia służyła jako ilościowy pomiar ilości, rozpoczynającego mRNA specyficznego dla danego zbioru primerów.
Wyniki tej procedury wskazywały, ze zarówno AGN 191183 jak i AGN 193109 niezależnie hamowały ekspresję MRP-8 w keratynocytach. Intensywność barwienia produktów powielenia GAPDH była zasadniczo równa w torach żelu, reprezentujących materiał wyjściowy izolowany z kontroli, keratynocyty traktowane AGN 191183 oraz AGN 193109. Słabe wstęgi, reprezentujące produkt powielenia GAPDH był z początku wykrywalny w przebiegach, odpowiadających próbkom usuniętym po 18 cyklach powielania PCR. Równoważne intensywności zabarwienia wśród różnych przebiegów-' żelu wskazywały, że dla wszystkich próbek użyto równoważne masy materiału wyjściowego. W związku z tym, różnice w intensywności zabarwienia wstęg, reprezentujących produkty powielenia MRP-8 wskazywały na
188 705 różnice ekspresji mRNA MRP-8 wśród różnych próbek wyjściowych. Jak oczekiwano, powielony sygnał MRP-8 był hamowany w hodowlach traktowanych AGN 191183 (10'7 M) w stosunku do nietraktowanej kontroli. Traktowanie hodowanych keratynocytów AGN 193109 (10‘6 M) także hamowało ekspresję MRP8 jak uznano przez mniejszą intensywność zabarwienia produktu powielenia.
Jak zilustrowano w następującym przykładzie, AGN 193109 także hamował ekspresję drugiego genu markerowego w keratynocytach. Nagpal i in. w J. Biol. Chem. 270:923 (1995) ujawnił, ze ekspresję mRNA stromelizyny obniżał agonista specyficzny dla KAR w hodowanych keratynocytach napletka ludzkiego noworodka. Nicholson i in. (EMBO J.9:4443 (1990)) ujawnił, ze element promotora AP-1 odgrywał rolę w negatywnej regulacji zależnej od retinoidu genu stromelizyny-1. W ten sposób, należało określić czy AGN 193109 mógł zmienić ekspresję tego genu.
Przykład 21 opisuje metody użyte do pokazania, że AGN 193109 hamował ekspresję genu stromelizyny-1 przy nieobecności egzogenicznie dodanego agonisty retinoidu.
Przykład 21
AGN 193109 hamuje ekspresje stromelizyyy-1 w hodowanych keratynocytach
Pierwotne keratynocyty z napletka albo traktowano sztucznie albo traktowano przez 24 godziny agonista RAR AGN 191183 (10‘7 M), albo AGN 193109 (106 M). Całkowity RNA otrzymany z traktowanych sztucznie i traktowanych retinoidem keratynocytów, poddano odwrotnej transkrypcji i uzyskany cDNA powielono w PCR przy użyciu oligo primerów β-aktyny lub stlΌmelizyyy-1, dokładnie jak opisano u Nagpala i in. w J. Biol. Chem. 270:923 (1995)). Próbkę (10 pl) z reakcji powielenia PCR usunięto po każdych trzech cyklach, zaczynając od 18 cykli powielenia PCR. Próbkę poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym i wykrywano po barwieniu bromkiem etidium.
Wyniki tych procedur wskazywały, ze AGN 193109 hamował ekspresję genu stromelizyny-1 przy nieobecności egzogenicznie dodanego agonisty retinoidu. Konkretniej, wstęgi zabarwione bromkiem etidium, reprezentujące produkty powielenia β-aktyny, były łatwo wykrywalne w żelach agarozowych po 18 cyklach PCR. Podczas gdy intensywność wszystkich całej wstęgi wzrastała z dodatkowymi cyklami reakcji powielenia, zabarwione wstęgi były nieco mniej intensywne w próbkach, reprezentujących komórki traktowane AGN 191183. Wskazywało to, że trochę mniejsza ilość RNA musiała być obecna w próbkach wyjściowych, odpowiadających komórkom traktowanym AGN 191183. Wyniki wskazywały także, że mRNA stromel.izyny-1 były wykrywalne w keratynocytach traktowanych sztucznie, zaczynając od 33 cykli powielenia PCR. Jak oczekiwano, ekspresję mRNA stromelizyny-1 hamowało traktowanie AGN 191183 (10'6 M) jak orzeczono na podstawie słabszej intensywności wstęg w porównaniu z próbkami, pochodzącymi z próbek traktowanych sztucznie. Po znormalizowaniu do intensywności produktów powielenia β-aktyny, zgodnie z wynikami uzyskanymi w pomiarach ekspresji MRP-8, traktowanie keratynocytów AGN 193109 (10‘6 M) dało w wyniku obniżenie poziomu mRNA stromelizyny-1. W istocie, obniżenie stymulowane traktowaniem AGN 193109 było nie do odróżnienia od obniżenia spowodowanego traktowaniem keratynocytów agonistą RaR AGN 191183.
Jak tu ujawniono, AGN 193109 może mieć każdy z trzech możliwych wpływów ze względu na modulację aktywności równocześnie podawanego agonisty nadrodziny steroidów. Po pierwsze, AGN 193109 może nie mieć wpływu. Po drugie, AGN 193109 może antagonizować wpływ agonisty, prowadząc przez to do zmniejszenia aktywności agonisty'. Wreszcie, AGN 193109 może wzmacniać aktywność agonisty, prowadząc przez to do stymulacji mierzonego wpływu wytworzonego przez agonistę.
193109, obejmuZwiązki, posiadające aktywność, którą można modulować przez ją agonistów receptora retinoidowego, który wiąże się z innymi członkami nadrodziny receptora steroidowego. Ta ostatnia kategoria agonistów obejmuje agonistów receptora witaminy D, agonistów receptora glukokortykoidów i agonistów receptora hormonu tarczycy. Receptory aktywowane proliferatorem peroksysomowym, receptor estrogenu oraz receptory sieroce, posiadające aktualnie nieznane ligandy, można także wzmacniać AGN 193109. W przypadku gdzie agonistą nadrodziny steroidów jest agonista RAR, AGN 193109 może albo antagonizować albo wzmacniać aktywność tego agonisty. W przypadku gdzie agonistą użytym w połą188 705 czeniu z AGN 193109 jest związek, który może się wiązać z receptorem jądrowym innym niż RAR, wspólne podawanie AGN 193109 albo nie będzie miało wpływu albo uwrażliwi układ na agonistę tak, że aktywność agonisty jest wzmacnianą.
Uogólnione przykładowe procedury określania, które z trzech możliwych aktywności AGN 193109 wystąpią w poszczególnch układach, są następujące. Opis ten ilustruje każde z możliwych wyjść dla podawania AGN 193109 równocześnie z agonistą nadrodziny receptora steroidowego. Biologiczne układy użyteczne do oceny zdolności AGN 193109 do modulowania aktywności agonisty receptora jądrowego, obejmują lecz bez ograniczenia: ustalone hodowlane linie tkankowe komórek, linie komórkowe transformowane wirusem, pierwotne hodowle komórkowe ex-vivo i badania in vivo, wykorzystujące żywe organizmy. Pomiary wpływu biologicznego AGN 193109 w takich układach mogły obejmować określanie każdego z różnych biologicznych punktów zakończenia. Te punkty zakończenia obejmują: analizę proliferacji komórkowej, analizę programowanej śmierci komórki (apoptozy), analizę stadium różnicowania się komórek poprzez oznaczenie ekspresji genowej, analizę zdolności komórek do tworzenia guzów u nagich myszy, oraz analizę ekspresji genów po krótkotrwałym lub stałym wprowadzeniu konstrukcji genu reporterowego.
Do celów ilustracyjnych, rodzaje mRCA oznaczone jako mRNA „X” poddaje się ekspresji z genu „X” w pierwotnie hodowanych komórkach „Y” izolowanych z narządu „Z”. W standardowych warunkach hodowli, gdzie zachowuje się kilka genetycznych markerów komórek „Y”, włączając ekspresje genu „X”, dodanie agonisty retinoidowego prowadzi do zmniejszenia obfitości mRNA „X”. Analizę ekspresji genu X można oszacować przez izolację komórkowego mRNA i pomiar wielkości poziomu mRNA X poprzez reakcję łańcuchową polimerazy, zabezpieczenie rybonukleazy lub procedury „blottingu” RNA, takie jak analizy Nothern. Po izolacji z narządu Z, pierwotne komórki Y hoduje się w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Pierwotne hodowle powleka się potem na płytkach do hodowli tkankowej w celu rozszerzenia populacji komórek. Etap ten ułatwia rozdzielenie komórek na cztery grupy próbek tak, że można otrzymać różne dawki agonisty retinoidowego oraz AGN 193109. Pierwsza grupa będzie kontrolną, otrzymującą, tylko nośnik. Druga grupa otrzyma agonistę RAR, kwas retinowy, zaopatrzy się ją w etanol, w ilościach wystarczających do zapewnienia końcowych stężeń w zakresie 101 - 10'6 M. Najniższa dawka może potrzebować empirycznego określenia w zależności od czułości układu. Takie określenia wchodzą w zakres rutynowych doświadczeń dla przeciętnego specjalisty. Trzecia grupa otrzyma zarówno agonistę receptora jądrowego w takich samych dawkach jak użyte do traktowania komórek w grupie w, jak i stałą dawkę AGN 193109. Dawkę AGN 193109 użytą do komórek w grupie 3 także trzeba będzie określić empirycznie, lecz powinna ona mieć zbliżoną stałą powinowactwa (Kd) AGN 193109 dla podtypów RAR (to jest co najmniej 10'8 M). Czwarta grupa otrzyma AgN 193109, w dawkach minimalnie obejmujących dawkę użytą dla równoczesnego podawania agonisty w grupie 3. Alternatywa do tego trybu dozowania zastąpiłaby AGN 193109 agonistą retinoidowym opisanym w poprzednim przykładzie, jak wyszczególniono dla grupy 2, oraz stałą dawkę agonisty retinoidowego w miejsce AGN 193109, jak wyszczególniono w grupach 3 i 4. Po stosownym okresie inkubacji, komórki powinno się zebrać w sposób odpowiedni dla określenia biologicznego punktu końcowego, mierzonego jako wskaźnik aktywności agonistycznej.
Przykładowo, analiza wpływu AGN 193109 na regulację ekspresji genowej zależną od kwasu retinowego, obejmowałaby porównanie ilości mRNA rodzajów X w puli mRNA zebranej z komórek traktowanych zgodnie z każdym z czterech protokołów opisanych powyżej. RNA, pochodzący z komórek kontrolnych będzie służyć do określenia podstawowej linii ekspresji mRNA X i będzie reprezentować warunki, odpowiadające brakowi ekspresji. Porównanie tego poziomu z mierzonym z puli mRNA, pochodzącym z komórek traktowanych kwasem retinowym, pozwoli na określenie wpływu tego agonisty na ekspresję genu. Poziomy represji specyficznego mRNA ocenione ilościowo, wynikające z traktowania kwasem retinowym, można porównać z ilościami mRNA z komórek traktowanych równolegle albo samym AGN 193109 albo AGN 193109 w połączeniu z kwasem retinowym. Chociaż ten uogólniony przykład ilustruje analizę wpływu aGn 193109 podawanego równocześnie, na ekspresję genu hamowanego przez agonistę retinoidowego, przykład mógł ewentualnie opisywać analizę
188 705 wpływu AGN 193109 podawanego równocześnie, na gen, który był indukowany przez agoniste retinoidowego. Krytyczną cecha przy określaniu czy AGN 193109 zachowa się jak agonista, jak hormon negatywny, czy nie będzie miał wpływu w poszczególnych układach, będzie obejmować ilościowe porównanie wielkości wpływu w obecności lub nieobecności AGN 193109.
Przykładem, w którym AGN 193109 wzmacniał aktywność agonisty podawanego równocześnie, będzie przypadek, w którym równoczesne podawanie AGN 193109 z kwasem retinowym dało w wyniku poziom ekspresji mRNA X, który dalej podlegał represji w stosunku do poziomu mierzonego w komórkach traktowanych, samym kwasem retinowym. Konkretniej, porównanie krzywej odpowiedzi na dawkę wpływu biologicznego (to jest represji ilości mRNA X) rysowanej na osi Y, kontra dawka agonisty (skala logarytmiczna) na osi X, pozwoli na porównanie represji, w której pośredniczy agonista ilości mRNA X w obecności i nieobecności równoczesnego podawania AGN 193109. Zdolność AGN 193109 do uwrażliwiania odpowiedzi biologicznej na agonistę, wzmacniającą przez to aktywność agonisty, będzie wskazana przez przesunięcie w lewo krzywej odpowiedzi na dawkę. Konkretniej, w obecności AGN i 93109, będzie trzeba mniej agonisty do otrzymania takiego samego skutku biologicznego możliwego do uzyskania przy użyciu samego agonisty.
Przykładem antagonizmu wspólnie podawanego agonisty, w którym pośredniczy AGN 193109, byłby przypadek, w którym wspólne podawanie AGN 193109 z kwasem retinowym daje w wyniku poziom ekspresji mRNA X o mniejszej represji w porównaniu z mierzonym w komórkach traktowanych samym kwasem retinowym. Porównanie krzywych odpowiedzi na dawkę represji mRNA X kontra dawka logarytmiczna agonisty w obecności lub nieobecności AGN 193109, pokaże przesuniecie na prawo krzywej odpowiedzi na dawkę. Konkretniej, w obecności AGN 193109 trzeba będzie więcej agonisty do uzyskania tego samego skutku biologicznego możliwego do uzyskania przy traktowaniu pojedynczym środkiem z samym agonistą.
Powyższe przykłady, w których AGN 193109 pośredniczy albo w antagonizmie albo wzmacnianiu, opisują doświadczalne wyjścia wspólnego podawania AGN 193109 z agonistą retinoidu. Jednakże jeśli agonista podawany wspólnie z AGN 193109 jest agonistą, umożliwiającym wiązanie i aktywację członka nadrodziny receptorów' steroidowych innego niż RAR, wtedy zamiast antagonizowania agonisty, jest możliwe, że AGN 193109 nie będzie miał wpływu na aktywność agonisty. Jeśli równoczesne podawanie AGN 193109 z takim agonistą daje w wyniku poziom ekspresji mRNA, równy poziomowi mierzonemu w komórkach traktowanych samym agonistą, to zdolność AGN 193109 do wpływania na dostępność NCP poprzez pobudzanie asocjacji RAR:NCP będzie słaba w tym układzie. Byłoby to przykładem, w którym AGN 193109 nie miał wpływu na podawanego równocześnie agonistę.
Przykład antagonizmu
Sposób ujawniony w powyższym uogólnionym przykładzie, określania wpływu AGN 193109 podawanego wspólnie z agonistą retinoidowym, ilustruje się przez procedurę opisaną w przykładzie 7. Komórkom CV-i kotransfekowanym jednym z trzech receptorów kwasu retinoidowego i konstrukcją reportera wą MTV-TREp-Luc możliwą do indukcji agonistą retinoidowym, podano dawkę albo etanolu (kontrola, grupa 1), AGN 193109 o końcowym stężeniu 10'9-10'fM (grupa 2), AGN 193109 o końcowym stężeniu 10^-10^ M podanego wspólnie z kwasem retinowym o 104 M (grupa 3), albo kwasu retinowego (10'8 M, grupą 4). Porównanie aktywności lucyferazy z grupy 1 z aktywnością z grupy 4 pozwoliło na określenie poziomu ekspresji agonisty retinoidowego genu reporterowego lucyferazy przy nieobecności dodanego AGN 193109. Porównanie ekspresji genu reporterowego lucyferazy w komórkach grupy 3 z pomiarem w komórkach z grupy 4 wskazywało, że AGN 193109 zachowywał się jak antagonista agonisty rettnoćdowego, w tym układzie.
Przykład antagonizmu
Sposób ujawniony w uogólnionym przykładzie, określania wpływu AGN 193109 podanego równocześnie z agonistą retinoidu, był podobny do użytego do określenia w przykładzie 17, gdzie AGN 193109 funkcjonował jak antagonista represji, w której pośredniczy agonista retinoidu, proliferacji komórkowej stymulowanej EGF w transformowanych komórkach nabłonka szyjki
188 705 macicy, ECE-16-1. W tej procedurze, traktowame komórek ECE-16-1 obejmowało próbkę kontrolną traktowaną samym EGF (grupa 1) poróbkę traktowaną EGF i AGN 193109 o końcowym stężeniu 10'δ M (grupa 2), próbkę traktowaną. połączeniem EGF i AGN 193109 193109 o końcowym stężeniu 10'6 M podaną równocześnie z pojedynczą dawką agonisty retinoidowego AGN 191183 o 10^ M (grupa 3) oraz próbkę traktowaną połączeniem EGF i AGN 191183 o 10-8 M (grupa 4). Po trzech dniach traktowania, określono tempo proliferacji komórkowej. Określenie, ze komórki były stymulowane do proliferacji przez eGf, było możliwe, ponieważ włączono dodatkowe taaktowacie kontrolne, w którym komórki poddano ekspozycji na określoną, pożywkę, która nie zawierała EGF. Porównanie liczby komórek w grupie z liczbą komórek w grupie 4 pozwoliło na ustaienie. że ągonlstą RAR AGN 191183 hamował proliferację stymulowaną EGF komórek ECE-16-1. Porównanie grupy 3 z grupą 4 wskazywało, że AGN 193109 antagonizował aktywność ągocisty RAR, w tym układzie.
Przykład wzmacniania
Sposobu ujawnionego w uogólnionym przykładzie, określania wpływu AGN 193109 podawanego wspólnie z agonistą użyto także w przykładzie 14 do ustalenia, ze
AGN 193109 w/macnią aktywność agonisty receptora jądrowego w komórkach HeLa transfekowanych genem reporterowym możliwym do indukcji 1,25-dihydroksywitaminą D3. Traktowanie t^^isifei^^wanych komórek obejmowało sam nośnik (kontrola, grupa 1), 1,25dihydroksywitaminę D3 o końcowym stężeniu 10-10-10-7 M (grupa 2), 1.25-dihydaoksy~ witaminę D3 o końcowym stężeniu 10-10-10-7 M podawaną równocześnie z AGN 193109 o końcowym stężeniu albo 10-8 albo 10-7 M (grupa 3), oraz AGN 193109 jako traktowanie pojedynczym środkiem, o końcowym stężeniu albo 10-8 albo 10— M (grupa 4). Porównanie aktywności lucyferazy mierzone w grupie 1 (kontrolnej) komórek z aktywnością w komórkach z grupy 2 pozwoliło określić, że stymulowana 1,25-di^yd:^^l^!^;ywit^mi^ą D 3 aktywność lucyferazy była zależna od dawki. Porównanie aktywności iucyferązy mierzonej w komórkach grupy 4 (traktowanie pojedynczym środkiem AGN 193109) z pomiarem z komórek grupy 3 (równoczesne podawanie AGN 193109), podobnie pozwoliło na określenie zależnej od dawki aktywności lueyfeaa/y stymulowanej 1,25-dihydroksywitaminą D3 w obecności danego stężenia AGN 193109. W tym przypadku, wartość zerowa reprezentowała aktywność lucyferazy w komórkach traktowanych samym AGN 193109 (grupa 4). Taki tryb dawkowania pozwalał na porównanie trzech krzywych odpowiedzi na dawkę 1,2--dihydroksywitąmmy D3. Porównanie krzywej odpowiedzi na dawkę 1,25~dihydaoksywitammy D3 przy nieobecności AGN 193109 z krzywą, reprezentującą równoczesne podawanie AGN 193109 (albo 10- albo 10-7 M) pokazało wzmącmąme aktywności ągomsty, o czym świadczy przesunięcie na lewo połowy maksymalnej odpowiedzi.
Przykład wzmacniania
Sposobu ujawnionego w uogólnionym przykładzie, określania wpływu AGN 193109 podawanego wspólnie z agonistą ^Ιμϊ,^ użyto dalej w przykładzie 19 do ustalema, że AGN 193109 wzmacnia aktywność ąntyprolifeaącyjcą agonisty RAR w pierwotnych hodowlach ludzkich komórek pigmentowanych cabłocką siatkówki. Traktowanie komórek obejmowało: sam nośnik etanolowy (grupa 1), kwas retinowy o końcowym stężeniu od 10' 10 do 10-6 M (grupa 2), kwas retinowy o końcowym stężeniu od 10^ do 10'6 M podany wspólnie z i(f6 M AGN 193109 (grupa 3) oraz sam AGN 19/3109 o końcowym stężeniu od 1040 do 106 M (grupa 4). Porównanie wyników testu otrzymanych przy użyciu komórek z grupy 1 i 2 pozwoliło na określenie inhibicji proliferacji tych komórek zależnej od dawki, przez kwas retinowy. Podobnie, porównanie wyników otrzymanych przy użyciu komórek z grupy 3 z grupą. 1 pozwoliło na określenie inhibicji proliferacji tych komórek w zależności od dawki, przez kwas retinowy w obecności podanego równocześnie AGN 193109. Grupa 4 pokazała niezdolność AGN 193109 do zasadniczej zmiany tempa proliferacji tych komórek przy traktowaniu pojedynczym środkiem. Porównanie krzywych odpowiedzi na dawkę represji proliferacji komórkowej, w której pośredniczy kwas retinowy, wytworzonej w grupach 2 i 3 zapewniło podstawę wniosku, że AGN 193109 uczulało pierwotne komórki RPE na wpływ antyprollferacyjny agonisty RAR, W'zmącniając przez to aktywność agonisty RAR.
188 705
Jak zaznaczono powyżej, Agarwal i in. w Cancer Res. 54:2108 (1984), ukazał, że wzrost komórek CaSki, w odróżnieniu od komórek ECE-16-1 unieśmiertelnionych HPV, nie był hamowany przez traktowanie agonistami retinoidu. Jak tu ujawniono, nieoczekiwanie odkryliśmy, że wzrost komórek CaSki był hamowany przez AGN 193109 przy nieobecności agonisty retinoidu. Następujący przykład ilustruje jak można użyć AGN 193109 do inhibicji wzrostu guzów z komórkami CaSki in vivo.
Przykład 22
Inhibicja wzrostu guza z komórkami CaSki u nagich myszy po podaniu AGN 193109
1x10 komórek CaSki wstrzyknięto do każdej grupy nagich myszy. Tworzenie się guza ocenia się przy użyciu technik, znanych fachowcom. Grupa kontrolna otrzymała placebo. Grupie testowej podano AGN 193109. Zwierzęta, którym podano placebo otrzymały dożołądkowo przez rurkę olej kukurydziany. Zwierzęta testowe otrzymały 20 pmoli/kg AGN 193109 w oleju kukurydzianym na dzień, przez okres leczenia. Objętość guza mierzy się w centymetrach sześciennych przy użyciu wyskalowanych macek. Objętość guza zaznacza się na wykresie jako funkcja czasu. Myszy, otrzymujące AGN 193109 wykazały guzy, o znacznie mniejszym tempie wzrostu w porównaniu z guzami u myszy kontrolnych, jak oceniano na podstawie wielkości i ilości guza przez okres badania. Wynik ten pokazuje in vivo, że AGN 193109 hamuje wzrost zaawansowanego raka szyjki macicy, który jest oporny na terapię, obejmującą podawanie agonisty retinoidowego.
Jak zaznaczono powyżej, komórki CaSki są modelem guzów szyjki macicy, które nie odpowiadają na terapię agonista retinoidu. Jednakże, ujawniliśmy tu, że wzrost komórek CaSki była hamowana przez AGN 193109 przy nieobecności traktowania agonistą retinoidu. Zdolność AGN 193109 do hamowania proliferacji komórek CaSki sugerowała, że AGN 193109 może być użyty do traktowania terapeutycznego raków szyjki macicy, które są niewrażliwe na terapię agonista retinoidu. Następujący przykład ilustruje sposób, który można stosować do oceny zdolności terapeutycznych AGN 193109 w leczeniu raka szyjki macicy
Przykład 23
Ocena zdolności terapuetycznych AGN 193109 u pacjentek z rakiem szyjki macicy
Najpierw identyfikuje się pacjentkę z zaawansowanym rakiem szyjki macicy. Biopsje szyjki uzyskuje się zgodnie z metodami, znanymi fachowcom. Komórki przeszczepione z guza rozprzestrzeniono w hodowli tkankowej zgodnie ze standardowymi technikami, aby zapewnić liczbę komórek, wystarczającą do podziału na trzy grupy próbek. Do tego celu stosuje się warunki hodowli opisane u Agarwala i in., w Cancer Res. 54:2108 (1994). Grupę pierwszą zachowuje się jako kontrolną i otrzymuje ona sam nośnik (etanol). Grupę drugą traktuje się agonistą RAR kwasem retinowym o stężeniu od 10'10 do 106 M. Trzecią grupę traktuje się AGN 193109 w dawkach w zakresie 10'3° do 106 M. Komórki odżywia się codziennie świeżą pożywką i zapewnia retinoidy opisane powyżej odpowiednio dla każdej grupy próbek. Komórki liczy się po trzech dniach przy użyciu elektrycznego licznika komórek. Porównanie liczby komórek w hodowlach kontrolnych z liczbą komórek w hodowlach traktowanych kwasem retinowym wskazuje, że agonista RAR nie hamuje istotnie tempa wzrostu hodowanych komórek raka szyjki macicy. Przeciwnie, komórki traktowane AGN 193109 wykazują zmniejszenie liczby komórek w zależności od dawki, w porównaniu z obliczeniami komórek z grupy kontrolnej. Wynik ten, w którym traktowanie AGN 193109 hamuje proliferację, hodowanych komórek raka szyjki macicy, wskazuje, że AGN 193109 będzie użytecznym środkiem terapeutycznym do leczenia pacjentek, mających chorobę przerzutową.
Pacjentki z rakiem szyjki macicy, które przeszły operację usunięcia pierwotnego guza i które mąjaŁ chorobę przerzutową, wzięto do badań klinicznych z przypadkowym doborem, mających na celu pokazanie korzyści terapeutycznych AGN 193109 w tym wskazaniu. Pacjentki dzieli się na dwie grupy. Pierwsza grupa jest grupą kontrolną, podczas gdy drugą grupę traktuje się AGN 193109. AGN 193109 łączy się z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, aby wytworzyć kompozycję odpowiednią do podawania układowego, wszystko zgodnie z technikami znanymi fachowcowi. Grupie kontrolnej podaje się preparat placebo, a grupie doświadczalnej podaje się preparat, zawierający negatywny hormon AGN 193109. Podaje się pacjentkom maksymalne tolerowane dawki i wykonuje się to codziennie przez okres od trzech
188 705 miesięcy do jednego roku. Wynik badania ocenia się ilościowo przez miarę przeżycia choroby w czasie. Osoby, otrzymujące AGN 193109 wykazują istotne zwiększenie przeżycia choroby, włączając niewspółmierną liczbę pacjentek, wykazujących pełną remisję ich choroby przerzutowej Wynik ten wskazuje, ze AGN 193109 ma wykorzystanie lecznicze do leczenia in vivo roków, nie odpowiadających na optyproliferaeyjny wpływ agonistów retinoidów, takich jak kwas retlnzwy.
Jak ujawniono powyżej, AGN 193109 wzmacniał aktywność ontyproliferacyjną agonistów RAR w picrwztnyeh hodowlach ludzkich komórkach nabłonka pigmentowanego siatkówki. W związku z tym, oczekuje się racjznolnic, że równoczesne podowanie in vivo AGN 193109 z agonistą RAR, zwiększy indeks terapeutyczny agonisty, ponieważ trzeba będzie mniejszej ilości ogonisty RAR do uzyskania tego samego efektu terapeutycznego. Dzdatkzwz, zkozołz się, ze AGN 193109 uczula pierwztpe hodowle ludzkich komórek nabłonka pigmentowanego siatkówki na wpływ antyprzliferaeyjpy ogonistów receptorów glukzkzrtykoidu i hormonu tarczycy. Następujący model króliczy pVr będzie wykorzystany w dwóch oddzielnych badaniach, aby pokazać zwiększony indeks terapeutyczny uzyskany przez równoczesne podawanie AGN 193109 odpowiednio z agonistą RAR (kwasem 13-cis retinowym) lub agznistą receptora hormonu tarczycy. W szczególności, modelu króliczego zdklejepla siatkówki publikowany przez Sen i in. w Areh.Opthalmol. 106:1291 (1988), użyto do pokazania, że agoniści retinoidu, którzy homują proliferację w pierwotnych komórkach RPE in vitro, hamują tokże częstość odklejania siatkówki in vivo (Arab i in. Invest. Optholmo. 34:522 (1993)). W ten sposób, ze względu na ich użycie jako środków' terapeutycznych w zapobieganiu odklejaniu siatkówki, ustalono już korelację między aktywnością in vitro i in vivo agonistów retinzi idu. Następujące przykłady ilustrują. jlk możno użyć AGN 193109 w zastosowaniach terapcui tycznych skierowanych na zapobieganie odklejoniu siatkówki.
Przykład 24
Użycie AGN 193109 do zwiększania zdolności terapeutycznych agonistów receptorów padrodziny steroidów w leczeniu proliferocyjnej witrczretipzpatli (PVR)
W pierwszym badaniu, wstrzyknięto ludzkie komórki RPE do jamy ciała szklistego oczu królika zgodnie z metodą opisaną przez Sena i in. w Akch.Opthalmzl. 106:1291 (1988). Po iniekcji do ciała szklistego, króliki podzielono na pięć grup. Pierwszą grupa (kontrolna) będzie otrzymywać sam nośnik zo pomocą lnickeji do cioła szklistego. Druga grupa otrzymuje kwos retinowy w leczeniu pojedynczym środkiem (100 pg) przez iniekcję do ciała szklistego. Trzecia grupa otrzymuje AGN 193109 joko leczenie pojedynczym środkiem (100 pg) przez iniekcję do ciała szklistego. Czwarto grupo otrzymuje przez inickeje do ciała szklistego, agonistę RAR (kwos retinowy) w dawce jednej dziesiątej ilości podonej grupie 2 (10 pg). Piąta grupa otrzymuje pzłąeoenie AGN 193109 (100 pg) i kwasu retinowego (10 pg) przez iniekcję do cioła szklistego. Zwierzęta otrzymują pojedynczą iniekcję do ciała szklistego odpowiedniego traktowania, jeden dzień po iniekcji do cioła szklistego ludzkich komórek RPE. Króliki bada się przez pośrednią oftalmoskopię w dniu 7, 14 i 28 i klasyfikuje się pod względem częstości i ciężkości trakcyjnego (t^^i^tionol) odklejenia siatkówki. Króliki z grupy, której wstrzyknięto 100 pg kwasu retinowego wykazują opoeznic mniejsze częstość i ciężkość odklejaeia siatkówki w porównaniu z królikami kontrolnym lub królikami, otrzymującymi albo AGN 193109 albo som kwas retieowy (10 pg). Króliki w grupie, której podano połączenie AGN 193109 i kwasu retipzwegz (10 pg) wykazują znacznie mniejszą częstość i ciężkość zdklcjonia siatkówki w porównaniu albo z grupą, kontrolną, AGN 193109 lub kwasu retinowego (10 pg). Wynik ten pokazuje, ze AGN 193109 poprawia indeks terapeutycopy ogonisty RAR kwasu rctinowegz w modelu in vivo PVR.
W drugim badoeiu, królikom wstrzyknięto najpierw ludzkie komórki RPE do jamy ciała szklistego oka, a potem podzielono na cztery grupy. Pierwsza grupo (kontrolna) otrzymuje som nośnik, przez iniekcję do cioła szklistego. Druga grupa otrzymuje hormon tarczycy jako traktowanie pojedynczym czynnikiem (100 pg), przez iniekcję do ciała szklistego. Trzeciej grupie podaje się AGN 193109 jako traktowoeie eoyppikicm pojedynczym (100 pg), przez iniekcję do ciała szklistego. Czwartej grupie podaje się połączenie AGN 193109 (100 pg) i hormonu tarczycy (100 pg). Króliki bada się przez pośrednią oftolmoskopię w dniu 7, 14 i 28 i klasyfikuje pod względem częstości i ciężkości trakcyjnego zdklejenia siatkówki. Po82
188 705 równanie częstości i ciężkości odklejenia siatkówki w czterech grupach pokazuje, że traktowanie czynnikiem pojedynczym albo AGN 193109 albo hormonem tarczycy nie hamuje odklejania siatkówki w porównaniu z królikami kontrolnymi. Przeciwnie, grupa królików, której podawano połączenie AGN 193109 i hormonu tarczycy, wykazywała znacznie mniejszy zakres i ciężkość odklejania siatkówki. Wynik ten pokazuje, że AGN 193109 poprawia indeks terapeutyczny hormonu tarczycy w modelu in vivo PVR.
Następujący przykład ilustruje jak można użyć AGN 193109 do wzmacniania indeksu terapeutycznego agonisty RAR użytego do leczenia pacjentów po operacji przyklejenia siatkówki.
Przykład 25
Zwiększanie indeksu terapeutycznego agonisty RAR kwasu 13-cis retinowego
Najpierw identyfikuje się populację dorosłych ochotników, mających odklejenie siatkówki, wynikające z PVR. Osoby przeszły operację przyklejenia przy użyciu technik standardowych w tej dziedzinie. Pacjentów podzielono potem na pięć grup. Grupa kontrolna składa się z pacjentów, którzy przeszli operację przyklejenia siatkówki i nie otrzymują żadnego związku retinoidowego. Druga grupa otrzymuje doustnie 40 mg kwasu 13-cis retinowego dwa razy na dzień przez cztery tygodnie po operacji. Trzecia grupa otrzymuje doustnie 40 mg AGN 193109 dwa razy na dzień przez cztery tygodnie po operacji. Piąta grupa otrzymuje doustnie 40 mg AGN 193109 w połączeniu z 4 mg kwasu 13-cis retinowego doustnie, dwa razy dziennie przez cztery tygodnie po operacji. Protokół traktowania i oceny skuteczności leku przeprowadza się zasadniczo jak opisano u Fekrata i in. w Opthalmology 102:412 (1995).
Częstość i ciężkość ponownego odklejenia siatkówki u pacjentów po operacji we wszystkich pięciu grupach monitoruje się przez okres dziewięciu miesięcy, stosując techniki badania oftalmologicznego, znane fachowcom. Pacjenci, otrzymujący doustnie 40 mg kwasu 13-cis retinowego wykazują znacznie mniejszy zakres ponownego odklejania siatkówki w porównaniu z pacjentami kontrolnymi, pacjentami, otrzymującymi doustnie 4 mg kwasu 13-cis retinowego dwa razy dziennie lub pacjentami, otrzymującymi doustnie 40 mg AGN 193109 dwa razy dziennie. Badanie grupy pcjentów, otrzymujących połączenie 40 mg AGN 193109 doustnie i 4 mg kwasu 13-cis retinowego doustnie dwa razy dziennie przez cztery tygodnie po operacji, pokazuje, że wynik terapeutyczny w tej grupie pacjentów jest równy lub lepszy od pacjentów, otrzymujących doustnie 40 mg kwasu 13-cis retinowego dwa razy dziennie przez cztery tygodnie po operacji. Wynik ten ukazuje, ze negatywny hormon AGN 193109 poprawia indeks terapeutyczny agonisty RAR przez właściwość zmniejszania częstości i ciężkości ponownego odklejenia siatkówki u pacjentów PVR.
Ogólny test do identyfikacji negatywnych hormonów receptorów jądrowych
Pokazaliśmy powyżej, że AGN 193109 może działać jak negatywny hormon, umożliwiający represję podstawowej aktywności transkrypcji receptorów jądrowych RAR. Dalej, opisaliśmy test przy użyciu komórek CV-1 kotransfekowanych plazmidem reporterowym lucyferazy ERE-tk-Luc i plazmidami ekspresji receptora ER-RXR-a i RAR-G-YP-16, do rozróżniania ligandów RAR, które są prostymi antagonistami, od posiadających aktywność hormonu negatywnego.
Wyciągnęliśmy wniosek, ze negatywne hormony RAR pośredniczą w represji aktywności transkrypcyjnej, w której pośredniczy RAR, przez pobudzanie zwiększonej interakcji między RAR i NCP. Dalej, pokazaliśmy, że AGN 193109 może wzmacniać wpływ agonistów innych receptorów jądrowych w sposób zgodny z wzajemnym podziałem NCP między członków nadrodziny steroidów receptorów jądrowych. Jako takie, ligandy można oznaczyć i przesiewać, aby zidentyfikować związki, posiadające aktywność hormonu negatywnego przy tych receptorach jądrowych nie-RAR.
Nasz sposób skriningu negatywnego hormonu RAR, w oparciu o użycie komórek CV-1 kotransfekowanych plazmidem reporterowym lucyferazy ERE-tk-Luc i plazmidami ekspresji receptora ER-RXR-a i RAR-G-YP-16, można adaptować generalnie tak, że cząstka RAR-γ plazmidu RAR-y-VP-16 podlega konwersji do receptora aktywowanego proliferatorem peroksysomu (PPAR), receptora witaminy D (VDR), receptora hormonu tarczycy (T3R) lub każdego inego receptora jądrowego nadrodziny steroidów, umożliwiającego heterodimeryzację z RXR. Komórki CV-1 kotransfekowane takimi plazmidami będą wykazywać ekspresję wy188 705 sokiego podstawowego poziomu aktywności iucyferazy. Ligandy, umożliwiające wiązanie domeny wiążącej ligand receptora, podstawiony cząstką RAR-γ, można łatwo przesiać pod względem aktywności negatywnego hormonu przez pomiar ich zdolności do represji aktywności .lucyferazy.
Dla receptorów jądrowych nadrodziny steroidów, które nie heterodimeryzują z RXR (np. receptory glukokortykosteroidów i estrogenu), te same wyniki można uzyskać przy użyciu receptorów GR-VP-16 i plazmidu reporterowego lucyferazy, składającego się z odpowiedniego elementu odpowiedzi na glukokortykosteroid lub estrogen połączony z heterologicznym elementem promotora oraz genu reporterowego lucyferazy lub innego. Zasadniczą cechą ogólnego testu skriiiingu hormonu negatywnego, jest inkluzja co najmniej domeny, wiążącej ligand poszczególnego receptora jądrowego, dla której odwrotny agonista ma być przesiewany, oraz sposób lokalizacji domeny, wiążącej ligand receptora jądrowego z promotorem genu reporterowego. Można to osiągnąć przy użyciu naturalnego miejsca wiązania DNA receptora lub ewentualnie przez zmontowanie chimerycznego receptora, posiadającego domenę wiązania heterologiczyego DNA i odpowiadające użycie genu reporterowego, który jest pod kontrolą elementu regulatorowego DNA, rozpoznawanego przez domenę, wiążącą heterologiczny DNA. W zalecanej postaci realizacji, plazmid, wykazujący ekspresję receptora jądrowego, dla którego przesiewa się odwrotnego agonistę, będzie wykazywać ekspresję tego receptora jądrowego jako białka połączonego, zawierającego konstytutywną domenę aktywacji, tak jak domena aktywacji HSV VP-16, w celu zapewnienia wysokiej aktywności podstawowej. Ta wysoka aktywność podstawowa będzie skutecznie zwiększać czułość testu, pozwalając przez to na analizę ligandów receptora jądrowego, który hamuje podstawową aktywność transkrypcyjjiąprzy nieobecności dodanego agonisty receptora, jądrowego,
Następujący przykład ilustruje sposób, którego można użyć do skriningu związków, posiadających aktywność hormonu negatywnego przy receptorze hormonu tarczycy.
Przykład 26
Sposób identyfikacji negatywnych hormonów' receptora hormonu tarczycy
Komórki CV-1 transfekuje się równocześnie plazmidem reportero wym lucyferazy ERRXR-a i T3R-YP-15. T3R-VP-16 jest identyczny z plazmidem RAR-y-VP-16, z wyjątkiem tego, że cząstkę RAR-γ RAR-y-VP-16 podstawiono cDNA receptora hormonu tarczycy. Jako taki T3R-VP-16 wykazuje ekspresję białka połączonego, zawierającego domenę aktywacji HSV-VP-16 w ramce z końcem N receptora hormonu tarczycy. Do tego celu używa się standardowych metod transfekcji i hodowli komórek. Po transfekcji, komórki przepłukuje się i odżywia pożywką hodowlana, zawierającą 10 % cielęcej surowicy płodowej, którą ekstrahowano aktywowanym węglem drzewnym. Komórki traktuje sie samym nośnikiem (etanol), hormonem tarczycy (W^do 1040 M) lub związkiem TR-1 (10'9 do 10'6 M). TR-1 jest synetycznym ligandem receptora hormonu tarczycy, który wykazuje silne powinowactwo do receptora hormonu tarczycy w badaniach wiązania współzawodniczego, lecz który nie aktywuje transfekowarnego receptora hormonu tarczycy w teście transaktywacji krótkotrwałą kotransfekcją przy użyciu genu reporterowego, odpowiadającego na hormon tarczycy oraz plazmidu ekspresji receptora hormonu tarczycy. Dalej, TR-1 jest zdolny do antagonizowania transaktywacji. w której pośredniczy hormon tarczycy i jako taki jest antagonistą, receptora tarczycy.
Analiza aktywności lucyferazy z komórki CV-1 transfekowanej ERE-tk-Luc, ER-RXRa i T3R-VP-16 pokazuje wysoki poziom podstawowy aktywności reportera lucyferazy w komórkach traktowanych nośnikiem. Komórki traktowane hormonem tarczycy ukazują lekki wzrost aktywności lucyferazy w sposób zależny od dawki. Komórki traktowane TR-1 wykazują zmniejszenie aktywności lucyferazy w zależności od dawki. Oznacza to, że TR-1 wykazuje aktywność odwrotnego agonisty receptora tarczycy, prawdopodobnie spowodowaną zwiększoną interakcją NCP z receptorem hormonu tarczycowego.
Współczynnik proliferacji pierwotnych komórek nabłonka pigmentowayego siatkówki człowieka, hamuje traktowanie agonistą RAR. Wartość terapeutyczna tej obserwacji została zademonstrowana w użytku w pooperacyjnej terapii retinoidem po operacji przyklejenia siatkówki. Pokazaliśmy powyżej, ze negatywny hormon RAR AGN 193109 może uczulać pierwotne komórki RPE na antyproliferacyjny wpływ ATRA i kwasu 13-cis retinowego w procedurach równoczesnego podawania. Dalej, okazało się także, że AGN 193109 uwrażliwia ko84
188 705 mórki RPE na antyproliferacyjny wpływ innych agonistów receptorów jądrowych. Konkretniej, AGN 193109 uwrażliwiał komórki RPE na antypr operacyjny wpływ agonistów glukokortykoidów, deksametazonu oraz agonisty hormonu tarczycy 3,3'.5^^^^!j<o^otyrorir^, T3. Dane te były zgodne z naszym działającym modelem, w którym AGn 193109 modulował dostępność NCP, dzieloną między członków rodziny receptorów jądrowych. Traktowanie komórek RPE odwrotnym agonistą receptora hormonu tarczycy TR-1 będzie podobnie zmieniać dostępność dzielonych NCP tak, ze równoczesne podawanie z agonistą nie tarczycowym, takim jak agonista RAR kwas 13-cis retinowy, doprowadzi do zwiększonego antyproliferacyjnego wpływu na hodowlę RPE w porównaniu z kwasem 13-cis retinowym jako traktowaniem pojedynczym czynnikiem.
Następujący przykład ilustruje metodę, której można użyć do uwrażliwienia pierwotnych komórek RPE na antyproliferacyjną aktywność agonisty RAR. W szczególności, przykład ten ilustruje dalej jak aktywność agonistów RAR można wzmacniać przez równoczesne podawanie z hormonem negatywnym.
Przykład 27
Uwrażliwienie pierwotnych komórek nabłonka pigmentowanego siatkówki na antyproliferacyjny wpływ agonistów RAR przez równoczesne podawanie odwrotnego agonisty hormonu tarczycy TR-1
Ludzkie pierwotne komórki RPE otrzymuje się i hoduje zgodnie ze standardowymi metodami. Hodowanie komórki dzieli się na cztery grupy i traktuje następująco. Grupa pierwsza otrzymuje sam nośnik (etanol). Grupę 2 traktuje się kwasem 13-cis retinowym o stężeniu w zakresie od 10'11 do 10’i) * * * * 6 M. Grupę 3 traktuje się odwrotnym agonistą hormonu tarczycy TR-1 o stężeniach w zakresie od 10’n do 104 M. Grupę 4 traktuje się równocześnie kwasem 13-cis retinowym o stężeniach w zakresie 10'n do 104 M TR-1. Komórki ponownie odżywia się świeżą pożywką hodowlaną i ponownie traktuje odpowiednim związkiem co dwa dni przez całkowity okres traktowania, wynoszący pięć dni. Tempo proliferacji w trakcie trwania doświadczenia ocenia się ilościowo przez pomiar liczby komórek w hodowli, przy użyciu elektrycznego licznika komórek.
Komórki traktowane TR-1 (grupa 3) wykazują tempa proliferacji komórkowej, zasadniczo takie same jak komórki kontrolne (grupa 1) i nie ma wpływu tego odwrotnego agonisty na zmierzone tempo wzrostu hodowli. Komórki traktowane kwasem 13-cis retinowym (grupa 2) wykazują zmniejszoną liczbę komórek w zależności od dawki. Porównanie zmniejszenia proliferacji komórkowej w zależności od dawki komórek z grupy 4 (równoczesne podawanie kwasu 13-cis retinowego i TR-1) z otrzymanym w grupie 3, pokazuje, że możliwość równoczesnego podawania odwrotnego agonisty receptora hormonu tarczycowego TR-1 uwrażliwiania hodowli RPE na antyproliferacyjny wpływ kwasu 13-cis retinowego jak zmierzono przez przesunięcie krzywej odpowiedzi na dawkę tego agonisty RAR, w lewo w grupie 4 w porównaniu z komórkami z grupy 2.
WYKAZ SEKWENCJI
1) INFORMACJE OGÓLNE:
i) ZGŁASZAJĄCY: ALLERGAN ii) TYTUŁ W^YnALAZKU: ZvwiąJik relmr)ddwv i ich zaatosowanie iii) LICZBA SEKWENCJI: 9 iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:
A) ADRESSEE: Knobe, Martens, Olson & Bear
B) ULICA: 620 Newport Center Drive 16th Floor
C) MIASTO: Newport Beach
D) STAN: CA
E) KRAJ: USA
F) KOD: 92660
188 705
v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:
A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka
B) KOMPUTER: Zgodny z IBM PC
C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS
D) OPROGRAMOWANIE: FastSEQ Version 1,5 vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:
A) NUMER ZGŁOSZENIA:
B) DATA ZŁOŻENIA:
C) KLASYFIKACJA:
vii) POPRZEDNIE DANE ZGŁOSZENIOWE:
A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/522 448
B) DATAZŁOŻENIA: 01 WRZEŚNIA 1995
A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/522 779
B) DATAZŁOŻENIA: 01 WRZEŚNIA 1995
A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/542 648
B) DATA ZŁOŻENIA: 13 PAŹDZ 1995
A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/613 863
B) DATA ZŁOŻENIA: 11 MARCA 1995 viii) INFORMACJE DLA PEŁNOMOCNIKA/POŚREDNIKA
A) NAZWISKO: Altman, Daniel E
B) NUMER REJESTRACYJNY: 34 115
C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: ALERGN.058A ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
A) TELEFON: 714-460-0407
B) TELEFAKS: 4(4-460-9502
C) TELEX:
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 1:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄTTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIZ : SEQ O nr: 1:
TCAGGTCACC AGGAGGTCAG 21
2) NFF(^IMA^C^ O SEQ ID rr : 2:
i) CECHY βΕΚν/ΕΝΟΙ:
A) DŁUGOŚĆ: 101 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa
188 705 ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 2:
AGAAGCTTAT GGAAGCAATT ATGAGTCAGT TTGCGGGTGA CTCTGAAAAT ACTGCCACTC 60 TATAAAAGTT GGGCTCAGAA AGGTGGACCT CGAGGATCCA C 101
2) INFOIRMACJE O SEQ ID nr; 3:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 101 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 3:
CTGGATCCTC GAGGTCCACC TTTCTGAGCC CAACTTTTAT AGAGTGGCAG TATTTGCAGA 60 GTCACCCGCA AACTGACTCA TAATTGCTTC CATAAGCTTC 100
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 4:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 4:
GTACAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA 28
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 5:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak
188 705 iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 5:
TCAGGTCATG ACCTGA 16
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 6:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 6:
CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA 24
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: Ί:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 7:
TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC 24
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 8:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 8:
ACGCGTCCGG AAGACCTGGT 20
188 705
2) INFORMACJE O SEQ ID nr: 9:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA iii) HIPOTETYCZNE: brak iv) ANTYSENSOWNE: brak
v) TYP FRAGMENTU:
xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 9:
ATTCTGCAGG TACATGTCCA 20
188 705
990000 180000 970000 960000 96Ó0009400009SOOOO990000990000 9000009000080000roooo60000300004000030000
30000 \ 90000 o
-8 -3 -6
DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
188 705 <
NJ ω
£ o
fc jooooo-i J80000770000teooooϊίΟΟΰΰJ400007300007900007700007000009000080000700006000080000- f
40000·' 30000\ 90000 70000
FIg. 4 A <
ω fc >
u
O fc
FIg —0— Ο.ΰί/ίβ —®— 0.70/tg —o™0.9O/t$
-9 -8 -7 -o
DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
4B DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
188 705 /50000 /30000/70000 /60000 /50000 /40000 /30000 /30000 //OOOÓ /00000 30000 30000 70000 60000 50000 40000
30000 \ 30000 /0000
, 0-3-3 -7 -6
JFj-G-. FG. dawka LOGARYTMICZNA (M)
Fig 5B. YfkNTiA LOGARYTMICZNA (M)
188 705 —0— ALFA, ODPOWIEDŹ NA DAWKĘ ATRA £A-RXff ALFA, ODPOWIEDŹ NA DAWKĘ AGN 193109 —o— £/ł-AXH alfa +ΜΚ 6AMMA- VXJ£, ODPOWIEDŹ NA DAWKĘ ATRA
---ALFA +ΑΜ 6AMMŹ-W/6,
ODPOWIEDŹ NA DA WKĘACN193109
—r-7
O -9 -8
DAWKA LOGARYTMICZNA (M) jFfG-. FG
AKTYWNOŚĆ LUCYFERAZY
DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
188 705 w
fc
U □
*tZ3
O
Μΰοο
-* s -r DAWKA LOGARYTMICZNA (M) ~-o--a£ti ffjjog J93ir4 ~®~ AGN i93J$9 —*>—A6Nft338£ ~*~a&tjt9389 ---o—fiCA/793830 88NJ9387J _rfiSL 8,
BRAK UGANDA
Θ jGst
DODANIE AGONISTY
DODANIE AGN 193109
188 705
Αβ
INHIBICJA (%)
JO.
\lo& μ]
ΜΗ J9H8S (PCP)
HCP
WP/GP @>
HCP
D£f
Ά&
Χιϊϋ.
rę.ęby.
+AGH 193109
188 705
AKTYWNOŚĆ LUCYFERAZY
188 705
700·
80&0-9!
υ
M £3 a
z £L·
4020-72 -7i -70 -9 -8 -7
FITG. 13 1,25 DIHYDROKSYWITAMINA D3 \L0& M]
AKTYWNOŚĆ LUCYFERAZY
DAWKA LOGARYTMICZNA (M)
188 705
ASM J9HS3
188 705
JO 90 90 90 90 90 [Μ]
STĘŻENIE RETINOIDU
13.
188 705
STĘŻENIE DEKSAMETAZONU LUB ATRA
&&. 20.
STĘŻENIE T3 LUB ATRA
100
188 705
LUCYFERAZA
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Związek retinoidowy o wzorze 1 wzór 1 w którym X oznacza S;
    Z oznacza -C=C-;
    Y oznacza grupę fenylową;
    B oznacza COOH lub COOEt; a R14 oznacza 4-MePh.
  2. 2. Związek retinoidowy o wzorze 1a wzór 1a w którym X oznacza -[C(R1)2]n, gdzie R1 oznacza H lub metyl, n = 0 lub 1;
    R3 oznacza H lub metyl;
    Z oznacza -C=C-, -N=N-, -CH=CH-, -CO-NH-, -CS-NH-, -COO-, -(CRt=CR1)n', gdzie n' = 3, a R1 ma wyżej określone znaczenie;
    Y oznacza gn^j^<ę fenylową ewentualnie podstawioną fluorem lub grupę nafiylową
    B oznacza COOH, COOEt lub COO(CH2)2 SiCHs; a
    R14 oznacza fenyl, ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami alkilowymi Cm, grupą CF3, OH, CH3O lub atomem Cl, lub oznacza pirydyl, tiazolil, tienyl ewentualnie podstawione jednym lub dwoma grupami metylowymi, albo furyl, przy czym gdy w grupie Xn stanowi 0, wówczas Z oznacza -C=C=, B oznacza COOH lub COOEt, R14 oznacza metylofenyl;
    gdy Z oznacza -(CRi=CRi)n, wówczas Y oznacza wiązanie między Z i B; a gdy Y oznacza naftyl, wówczas Z oznacza wiązanie.
  3. 3. Zastosowanie związku retinoidowego o wzorze 1 określonym w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia stanów patologicznych u ssaków, podatnych na leczenie retinoidowym antagonistą, wybranych z grupy obejmującej podrażnienie skóry, hipertriglicerydemię, toksyczność kości, guzy szyjki macicy, odklejenie siatkówki i łuszczycę.
  4. 4. Zastosowanie związku retinoidowego o wzorze 1a określonym w zastrz. 2 do wytwarzania leku do leczenia stanów patologicznych u ssaków, podatnych na leczenie retinoidowym antagonistą, wybranych z grupy obejmującej podrażnienie skóry, hipertriglicerydemię. toksyczność kości, guzy szyjki macicy, odklejenie siatkówki i łuszczycę.
  5. 5. Związek retinoidowy o wzorze 1 określonym w zastrz. 1 do leczenia stanów patologicznych u ssaków, podatnych na leczenie retinoidowym atagonistą wybranych z grupy obej188 705 mującej podrażnienie skóry, hipertriglicerydemię, toksyczność kości, guzy szyjki macicy, odklejenie siatkówki i łuszczycę.
  6. 6. Związek retinoidowy d wzorze la zkrnś lonym z zastrz. a, do leczenia stnnaw analogicznych u ssaków, podatnych na leczenie retinoidowym antagonistą, wybranych z grupy obejmującej podrażnienie skóry, hipkytriglicerydemię, toksyczność kości, guzy szyjki macicy, odklejenie siatkówki i łuszczycę.
PL96325249A 1995-09-01 1996-08-23 Związki retinoidowe i ich zastosowanie PL188705B1 (pl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52277895A 1995-09-01 1995-09-01
US52277995A 1995-09-01 1995-09-01
US54264895A 1995-10-13 1995-10-13
US08/613,863 US5776699A (en) 1995-09-01 1996-03-11 Method of identifying negative hormone and/or antagonist activities
PCT/US1996/013779 WO1997009297A2 (en) 1995-09-01 1996-08-23 Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL325249A1 PL325249A1 (en) 1998-07-06
PL188705B1 true PL188705B1 (pl) 2005-03-31

Family

ID=27504571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325249A PL188705B1 (pl) 1995-09-01 1996-08-23 Związki retinoidowe i ich zastosowanie

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5776699A (pl)
EP (2) EP0931786B1 (pl)
JP (1) JP4295357B2 (pl)
KR (3) KR100447046B1 (pl)
CN (2) CN1121379C (pl)
AT (2) ATE233726T1 (pl)
AU (1) AU713586B2 (pl)
BR (1) BR9610412A (pl)
CA (1) CA2230672C (pl)
CZ (1) CZ62198A3 (pl)
DE (2) DE69629399T2 (pl)
ES (2) ES2205380T3 (pl)
HK (1) HK1018771A1 (pl)
HU (2) HU0202511D0 (pl)
IL (5) IL153296A0 (pl)
NO (1) NO317562B1 (pl)
NZ (2) NZ319762A (pl)
PL (1) PL188705B1 (pl)
RU (1) RU2203884C2 (pl)
WO (1) WO1997009297A2 (pl)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7655699B1 (en) 1992-04-22 2010-02-02 Eisai Inc. Compounds having selective activity for retinoid X receptors, and means for modulation of processes mediated by retinoid X receptors
GB9222253D0 (en) * 1992-10-23 1992-12-09 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9304919D0 (en) * 1993-03-10 1993-04-28 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9304920D0 (en) * 1993-03-10 1993-04-28 Celltech Ltd Chemical compounds
DE69433594T2 (de) * 1993-12-22 2004-08-05 Celltech R&D Ltd., Slough Trisubstituierte phenyl-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als phosphodiesterase (typ iv) hemmstoffe
US6245774B1 (en) 1994-06-21 2001-06-12 Celltech Therapeutics Limited Tri-substituted phenyl or pyridine derivatives
US5958954A (en) * 1995-09-01 1999-09-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6942980B1 (en) * 1995-09-01 2005-09-13 Allergan, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9526245D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9526243D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5877207A (en) * 1996-03-11 1999-03-02 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
HUP9902645A3 (en) * 1996-03-18 1999-12-28 Eisai Co Ltd Fused-ring carboxylic acid derivatives
GB9608435D0 (en) * 1996-04-24 1996-06-26 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US6555690B2 (en) * 1996-06-21 2003-04-29 Allergan, Inc. Alkyl or aryl substituted dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
AU724541B2 (en) * 1996-06-21 2000-09-21 Allergan, Inc. Substituted tetrahydronaphthalene and dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
US5773594A (en) 1996-06-21 1998-06-30 Allergan Alkyl or aryl substituted dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
GB9619284D0 (en) * 1996-09-16 1996-10-30 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9622363D0 (en) * 1996-10-28 1997-01-08 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9625184D0 (en) * 1996-12-04 1997-01-22 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
WO1998028281A1 (en) * 1996-12-23 1998-07-02 Celltech Therapeutics Limited Fused polycyclic 2-aminopyrimidine derivatives, their preparation and their use as protein tyrosine kinase inhibitors
US5760276A (en) * 1997-03-06 1998-06-02 Allergan Aryl-and heteroarylcyclohexenyl substituted alkenes having retinoid agonist, antagonist or inverse agonist type biological activity
AU6955898A (en) 1997-04-11 1998-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Retinoid antagonists and uses thereof
AU749810B2 (en) 1997-11-12 2002-07-04 Basilea Pharmaceutica Ag Treatment of T-helper cell type 2 mediated immune diseases
JP2003523166A (ja) 1998-09-29 2003-08-05 ガミダ セル リミテッド 幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法
US6403638B1 (en) 1998-10-01 2002-06-11 Allergan Sales, Inc. 2,4-pentadienoic acid derivatives having selective activity for retinoid X (RXR) receptors
US6048873A (en) * 1998-10-01 2000-04-11 Allergan Sales, Inc. Tetrahdroquinolin-2-one 6 or 7-yl, tetrahdroquinilin-2-thione 6 or 7-yl pentadienoic acid and related derivatives having retinoid-like biological activity
US6147224A (en) * 1998-10-01 2000-11-14 Allergan Sales, Inc. 2,4-pentadienoic acid derivatives having selective activity for retinoid X (RXR) receptors
US6521641B1 (en) 1998-10-08 2003-02-18 Allergan, Inc. Male anti-fertility agents
WO2000019990A2 (en) * 1998-10-08 2000-04-13 Allergan Sales, Inc. Rar antagonists as male anti-fertility agents
WO2000025134A1 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Glaxo Group Limited Assays for ligands for nuclear receptors
US6326397B1 (en) 1998-11-10 2001-12-04 Hoffman-La Roche Inc. Retinoid antagonists and use thereof
US6054623A (en) * 1998-12-18 2000-04-25 Alliedsignal Inc. Hydroxythiol grignard reaction synthesis
MXPA01009027A (es) * 1999-03-08 2002-08-30 Basilea Pharmaceutica Ag Antagonistas de retinoide y uso de los mismos.
WO2000061233A2 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for the treatment and prevention of lung disease involving a specific rar-gamma agonist
AU4225500A (en) * 1999-04-14 2000-11-14 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for the treatment and prevention of lung disease
US6869959B1 (en) 1999-04-28 2005-03-22 Institute Of Medicinal Molecular Design Inc. Heterocyclic carboxylic acid derivatives
US6906057B1 (en) 1999-06-11 2005-06-14 Allergan, Inc. Methods for modulating FXR receptor activity
EP1185539B1 (en) 1999-06-11 2004-12-01 Allergan, Inc. Organosilyl compounds having nuclear hormone receptor modulating activity
AU6941200A (en) 1999-08-27 2001-03-26 Ligand Pharmaceuticals Incorporated 8-substituted-6-trifluoromethyl-9-pyrido(3,2-g)quinoline compounds as androgen receptor modulators
BR0013597A (pt) 1999-08-27 2002-07-16 Ligand Pharm Inc Compostos e métodos moduladores de receptor de androgênio
US6566372B1 (en) * 1999-08-27 2003-05-20 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Bicyclic androgen and progesterone receptor modulator compounds and methods
PE20010647A1 (es) * 1999-09-14 2001-06-23 Lilly Co Eli Moduladores de receptores de retinoide x (rxr) con perfil farmacologico mejorado
US20030114482A1 (en) * 1999-12-15 2003-06-19 Maurizio Pacifici Use of retinoid receptor antagonists or agonists in the treatment of cartilage and bone pathologies
US6313168B1 (en) * 1999-12-15 2001-11-06 Allergan Sales, Inc. Use of retinoid receptor antagonists in the treatment of cartilage and bone pathologies
AU2001290816A1 (en) 2000-09-13 2002-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Retinoic acid receptor antagonists as promoters of angiogenesis
US20030003517A1 (en) * 2001-03-22 2003-01-02 Klein Elliott S. Methods of detecting dissociated nuclear hormone receptor ligands
US20020193403A1 (en) * 2001-05-03 2002-12-19 Allergan Sales, Inc. Methods of treating hyperlipidemia
ES2421511T3 (es) 2001-12-21 2013-09-03 X Ceptor Therapeutics Inc Moduladores de LXR
US7482366B2 (en) 2001-12-21 2009-01-27 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Modulators of LXR
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (en) 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR EXPANSION OF STEM AND PRESERVATIVE CELLS AND EXPANDED CELL POPULATIONS THEREWITH OBTAINED
JP2005529626A (ja) * 2002-06-20 2005-10-06 センション，インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの検出および定量装置
WO2004014388A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Warner-Lambert Company Llc 6,6-fused heteroaryl derivatives as matrix metalloproteinase inhibitors
US7105566B2 (en) * 2002-10-22 2006-09-12 Allergan, Inc. Methods of treatment during vascular procedures
FR2847255B1 (fr) * 2002-11-18 2006-11-17 Galderma Res & Dev Nouveaux ligands antagonistes des recepteurs rars, leur procede de preparation et leur utilisation en medecine humaine ainsi qu'en cosmetique
AU2003298239A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-15 Galderma Research And Development, S.N.C. Novel ligands that are antagonists of raf receptors, process for preparing them and use thereof in human medicine and in cosmetics
WO2005011668A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoid components
US20050026949A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoids without regard to body weight
US20050026950A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using retinoids to achieve consistent bioavailability
WO2005011667A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoid components
US20070224278A1 (en) 2003-11-12 2007-09-27 Lyons Robert T Low immunogenicity corticosteroid compositions
US20050101582A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-12 Allergan, Inc. Compositions and methods for treating a posterior segment of an eye
US20050250737A1 (en) * 2003-11-12 2005-11-10 Allergan, Inc. Therapeutic ophthalmic compositions containing retinal friendly excipients and related methods
US20060141049A1 (en) * 2003-11-12 2006-06-29 Allergan, Inc. Triamcinolone compositions for intravitreal administration to treat ocular conditions
WO2005066115A2 (en) * 2003-12-26 2005-07-21 Allergan, Inc. Disubstituted chalcone oximes having rarϝ retinoid receptor antagonist activity
EP1706095B1 (en) 2004-01-20 2008-12-24 Allergan, Inc. Compositions for localized therapy of the eye, comprising preferably triamcinolone acetonide and hyaluronic acid
US8119154B2 (en) 2004-04-30 2012-02-21 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and related methods
US8591885B2 (en) * 2004-04-30 2013-11-26 Allergan, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor sustained release intraocular drug delivery systems
US20050244462A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Devices and methods for treating a mammalian eye
US20050244458A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for treating ocular neuropathies
US20050244461A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Controlled release drug delivery systems and methods for treatment of an eye
US20050244466A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Photodynamic therapy in conjunction with intraocular implants
US8673341B2 (en) 2004-04-30 2014-03-18 Allergan, Inc. Intraocular pressure reduction with intracameral bimatoprost implants
US20050244465A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Drug delivery systems and methods for treatment of an eye
US7993634B2 (en) * 2004-04-30 2011-08-09 Allergan, Inc. Oil-in-oil emulsified polymeric implants containing a hypotensive lipid and related methods
US8722097B2 (en) 2004-04-30 2014-05-13 Allergan, Inc. Oil-in-water method for making polymeric implants containing a hypotensive lipid
US20050244463A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for treating ocular vasculopathies
US8455656B2 (en) 2004-04-30 2013-06-04 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US7799336B2 (en) 2004-04-30 2010-09-21 Allergan, Inc. Hypotensive lipid-containing biodegradable intraocular implants and related methods
US9498457B2 (en) 2004-04-30 2016-11-22 Allergan, Inc. Hypotensive prostamide-containing biodegradable intraocular implants and related implants
US7771742B2 (en) 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
US20050244478A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Anti-excititoxic sustained release intraocular implants and related methods
US20050244472A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems containing excipients with reduced toxicity and related methods
US20070059336A1 (en) * 2004-04-30 2007-03-15 Allergan, Inc. Anti-angiogenic sustained release intraocular implants and related methods
US8425929B2 (en) * 2004-04-30 2013-04-23 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for preventing retinal dysfunction
US8147865B2 (en) * 2004-04-30 2012-04-03 Allergan, Inc. Steroid-containing sustained release intraocular implants and related methods
US20050244471A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Estradiol derivative and estratopone containing sustained release intraocular implants and related methods
BRPI0510485A (pt) 2004-04-30 2007-11-13 Allergan Inc implantes inibidores de tirosina cinase intravìtreos biodegradáveis
AU2005271700B2 (en) * 2004-07-12 2010-11-11 Allergan, Inc. Opthalmic compositions and methods for treating ophthalmic conditions
EP1621191A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-01 Werner Bollag Treatment of inflammatory diseases by RXR Antagonists
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
PT1937244T (pt) 2005-09-30 2018-11-07 Io Therapeutics Llc Tratamento do cancro com agonistas específicos de rxr
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
DK2026778T3 (en) * 2006-05-16 2019-01-07 Io Therapeutics Llc RAR ANTAGONIST OR INVERSE AGONIST FOR USE IN THE TREATMENT OF CHEMOTHERAPY AND / OR RADIATION THERAPY SIDE EFFECTS
US8969415B2 (en) 2006-12-01 2015-03-03 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems
JP5699414B2 (ja) * 2007-02-28 2015-04-08 ユニバーシティー オブ ケンタッキー リサーチ ファウンデイション レチノイン酸療法の効力を妨げることなくレチノイン酸療法の副作用を軽減する方法、および／又は、その効力を改善する方法
US7911053B2 (en) * 2007-04-19 2011-03-22 Marvell World Trade Ltd. Semiconductor packaging with internal wiring bus
US8082730B2 (en) * 2008-05-20 2011-12-27 Caterpillar Inc. Engine system having particulate reduction device and method
KR101041281B1 (ko) * 2009-05-18 2011-06-14 주식회사 니프코코리아 자동차의 에어벤트 다이얼
NZ628266A (en) 2009-11-09 2016-02-26 Allergan Inc Compositions and methods for stimulating hair growth
CN103732218A (zh) 2011-06-03 2014-04-16 阿勒根公司 类维生素a化合物至皮脂腺的靶向递送
CA2858882C (en) 2011-12-13 2021-02-02 Trustees Of Dartmouth College Autoimmune disorder treatment using rxr agonists
CA2863795A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Gamida-Cell Ltd. Culturing of mesenchymal stem cells
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US20140094512A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Nikolas Gunkel Method of modulating the degree of adipose tissue deposited intramuscularly
AU2014216112B2 (en) 2013-02-15 2019-02-21 Allergan, Inc. Sustained drug delivery implant
US10092535B2 (en) 2015-10-31 2018-10-09 Io Therapeutics, Inc. Treatment of nervous system disorders using combinations of RXR agonists and thyroid hormones
WO2017091762A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Io Therapeutics, Inc. Use of cyp26-resistant rar alpha selective agonists in the treatment of cancer
US10995052B2 (en) 2016-02-03 2021-05-04 Galderma Research & Development Biaromatic propynyl compounds, pharmaceutical and cosmetic compositions containing same, and uses thereof
US10835507B2 (en) 2016-03-10 2020-11-17 Io Therapeutics, Inc. Treatment of muscular disorders with combinations of RXR agonists and thyroid hormones
IL261669B2 (en) 2016-03-10 2023-12-01 Io Therapeutics Inc A combination of thyroid hormones and an RXR agonist for the treatment of autoimmune diseases
WO2017152725A1 (zh) * 2016-03-11 2017-09-14 中国科学院上海有机化学研究所 一种视黄酸类化合物、其制备方法、中间体及应用
CN107176945B (zh) * 2016-03-11 2021-06-08 中国科学院上海有机化学研究所 一种视黄酸类化合物、其制备方法、中间体及应用
AU2017278220C1 (en) 2016-06-10 2022-10-13 Io Therapeutics, Inc. Receptor selective retinoid and rexinoid compounds and immune modulators for cancer immunotherapy
IL272013B2 (en) 2017-07-13 2024-03-01 Io Therapeutics Inc A combination of a rexinoid and retinoid substance with immunomodulatory properties and immunomodulatory substances for cancer treatment
CA3073953A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Io Therapeutics, Inc. Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
US11517549B2 (en) 2017-09-20 2022-12-06 Io Therapeutics, Inc. Treatment of disease with esters of selective RXR agonists
US10966950B2 (en) 2019-06-11 2021-04-06 Io Therapeutics, Inc. Use of an RXR agonist in treating HER2+ cancers
CA3242047A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Io Therapeutics, Inc. Use of an rxr agonist in treating drug resistant her2+ cancers
MX2024006978A (es) 2021-12-07 2024-07-19 Io Therapeutics Inc Uso de un agonista de rxr y taxanos en el tratamiento de cáncer her2+.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
AU633045B2 (en) * 1988-12-23 1993-01-21 Salk Institute For Biological Studies, The Receptor transcription-repression activity compositions and methods
JP3001632B2 (ja) * 1990-03-20 2000-01-24 首藤 紘一 安息香酸誘導体の新規製造法
AU2579692A (en) * 1991-09-17 1993-04-27 Salk Institute For Biological Studies, The Receptor of the thyroid/steroid hormone receptor superfamily
EP0617020A1 (en) * 1992-04-02 1994-09-28 Shudo, Koichi, Prof. Dr. Carboxylic acid derivatives having retinoic acid-like activity
CA2133587C (en) * 1992-04-22 2008-11-18 Marcus F. Boehm Compounds having selectivity for retinoid x receptors
DK0638071T3 (da) * 1992-12-28 1997-10-27 Eisai Co Ltd Heterocykliske carboxylsyrederivater, der bindes til retenoidreceptorer (RAR)
CA2138000A1 (en) * 1994-01-03 1995-07-04 John E. Starrett, Jr. Retinoid-like compounds

Also Published As

Publication number Publication date
EP0931786A3 (en) 1999-09-01
KR100447047B1 (ko) 2004-09-07
IL153307A0 (en) 2003-07-06
IL123490A0 (en) 1998-09-24
HK1018771A1 (en) 2000-01-07
HUP9902337A2 (hu) 1999-10-28
WO1997009297A3 (en) 1997-08-28
HUP9902337A3 (en) 2000-02-28
KR100447046B1 (ko) 2004-11-17
CA2230672A1 (en) 1997-03-13
NZ500397A (en) 2001-06-29
DE69626528T2 (de) 2003-12-24
EP0853610B1 (en) 2003-03-05
NO980880L (no) 1998-04-27
AU7235496A (en) 1997-03-27
EP0931786A2 (en) 1999-07-28
KR20040004464A (ko) 2004-01-13
CN1360890A (zh) 2002-07-31
ATE233726T1 (de) 2003-03-15
KR20040004463A (ko) 2004-01-13
JP4295357B2 (ja) 2009-07-15
EP0853610A2 (en) 1998-07-22
IL123490A (en) 2010-05-17
ES2195014T3 (es) 2003-12-01
CA2230672C (en) 2006-10-31
PL325249A1 (en) 1998-07-06
NO980880D0 (no) 1998-02-27
CN1121379C (zh) 2003-09-17
CZ62198A3 (cs) 1998-11-11
KR100447045B1 (ko) 2004-09-07
DE69629399D1 (de) 2003-09-11
IL153306A0 (en) 2003-07-06
WO1997009297A2 (en) 1997-03-13
IL153296A0 (en) 2003-07-06
US5776699A (en) 1998-07-07
EP0931786B1 (en) 2003-08-06
NO317562B1 (no) 2004-11-15
IL153305A0 (en) 2003-07-06
DE69629399T2 (de) 2004-05-27
ES2205380T3 (es) 2004-05-01
DE69626528D1 (de) 2003-04-10
RU2203884C2 (ru) 2003-05-10
JP2002504887A (ja) 2002-02-12
BR9610412A (pt) 1999-07-06
HU0202511D0 (pl) 2002-09-28
AU713586B2 (en) 1999-12-02
KR19990044302A (ko) 1999-06-25
CN1209802A (zh) 1999-03-03
ATE246669T1 (de) 2003-08-15
NZ319762A (en) 2000-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL188705B1 (pl) Związki retinoidowe i ich zastosowanie
US6521624B1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US5877207A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US5958954A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6469028B1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or anatgonist activities
US6218128B1 (en) Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US6942980B1 (en) Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US20030219832A1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
JP2008280346A (ja) ネガティブホルモン活性および／または拮抗薬活性を有するレチノイド化合物の合成と使用

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090823