KR100447047B1 - 음성적 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드화합물의 합성 및 사용 - Google Patents

음성적 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드화합물의 합성 및 사용 Download PDF

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Abstract

아릴 치환되고 아릴 및 (3-옥소-1-프로펜일)-치환된 벤조피란, 벤조티오피란, 1,2-디히드로키놀린, 및 5,6-디히드로나프탈렌 유도체는 레티노이드 음성적 호르몬 및/또는 길항제형 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 RAR 길항제는 수용체 사이트상에서 RAR 어고니스트의 활성을 방지하거나 감소할 목적으로, 인간을 포함하는 포유 동물에 투여될 수 있다. 특히, RAR 어고니스트는 레티노이드 또는 비타민 A 또는 비타민 A 전구체에 의해 유발된 중독이나 부작용을 방지하거나 완화하는 레티노이드 약품으로 투여 또는 공통 투여된다. 레티노이드 음성적 호르몬은 다른 레티노이드 및 핵 수용체 어고니스트의 활성을 강화하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, AGN 193109으로 불리는 레티노이드 음성적 호르몬은 시험관 내에서의 트랜색티베이션 에세이에서 다른 레티노이드 및 스테로이드 호르몬의 효과를 증가시킨다. 부가하여, 트랜색티베이션 에세이는 음성적 호르몬 활성을 갖는 화합물을 식별하는데에 사용될 수 있다. 이들 에세이는 호르몬의 능력에 기초하여 연속적인 전사 활성체 영역을 갖도록 설계된 키메릭 레티노이드 수용체의 활성을 하향 조정한다.

Description

음성적 호르몬 및/또는 길항제 활성을 갖는 레티노이드 화합물의 합성 및 사용{SYNTHESIS AND USE OF RETINOID COMPOUNDS HAVING NEGATIVE HORMONE AND/OR ANTAGONIST ACTIVITIES}
본 발명은 레티노이드 음성적 호르몬 및/ 또는 레티노이드 길항제형 생물학적 활성을 갖는 생물학적 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 4-아릴치환 벤조피란, 4-아릴 치환된 벤조티오피란, 4-아릴 치환 1,2-디히드로키놀린 및 치환 3-옥소-1-프로펜일 군으로 치환될 수 있는 8-아릴 치환 5,6-디히드로나프탈렌 유도체에 관한 것이다. 이들 새로운 화합물은 레티노이드 길항제형 활성을 가지며 포유 동물의 레티노이드 및 비타민 A와 비타민 A 전구체를 처리 및 방지하는 데에 사용되며 레티노이드를 갖는 포유 동물의 치료의 보조약으로서 사용되어 바람직하지 않은 부작용을 방지하거나 완화시킨다. 본 발명은 또한 다른 레티노이드 및 스테로이드 호르몬의 생물학적 작용을 증가시키고 리간드되지 않은 레틴산 수용체의 기본 활성을 방지하기 위한 레티노이드 음성적 호르몬의 사용에 관한 것이다.
[배경 기술]
레티노이드형 활성을 갖는 합성물은 본 기술에 잘 공지되어 있으며, 여러 미국 및그 외 특허나 과학 간행물에 개시되어 있다. 레티노이드형 활성이 인간을 포하하는 포유 동물에 대해 유용하여, 여러 질병에 관련된 증후를 치료하거나 완화시키는 것이 일반적으로 공지되어 있다.
레티노이드(비타민 A 및 그 유도체)는 다양한 생물학계에서는, 세포 증심 및 분열에 대한 효과를 포함하여, 광범위한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이 활성은 피부 병 및 암을 포함하는 여러 질병의 치료에 유용하게 된다. 종래 기술은 레티노이드형 생물학적 활성을 갖는 다수의 화학적 합성물을 개발하였으며, 수많은 특허 및 화학 잡지가 이러한 합성물을 설명하고 있다. 관련되는 특허 문헌으로는 미국 특허 번호 4,980,369, 5,006,550, 5,015,658, 5,045,551, 5,089,509, 5,134,159, 5,162,546, 5,234,926, 5,248,777, 5,246,578, 5,272,156, 5,278,318, 5,234,744, 5,346,895, 5,346,915, 5,348,972, 5,348,975, 5,380,877, 5,399,561, 5,407,937, (본 출원과 동일한 양도인에게 양도됨)을 포함하고, 이들은 특히 레티노이드형 생물학적 활성을 갖는 크로만, 티로크로, 및 1,2,3,4-테트라히드로키놀린 유도체에 관련된다. 부가하여, 몇 개의 출원은 본 출원의 양도인에게 양도되어 있으며, 이들은 또한 레티노이드형 활성을 갖는 다른 합성물에 관한 것이다.
미국 특허 번호 4,740,519 (슈로트 등), 4,826,969 (마이그난 등), 4,326,055 (레오리거 등), 5,130,335 (칸드라라트나 등), 5,037,825 (클라우스 등), 5,231,113 (칸드라트나 등), 5,324,840 (칸드라타나), 5,344,959 (칸드라라트나), 5,130,335 (칸드라라트나 등), 공개된 유럽 특허 출원 번호 0 176 034 A (구스트 등), 0 350 846 A (클라우스 등), 0 176 032 A (프릭켈 등), 0 176 033 A (프릭켈 등), 0 253302 A (클라우스 등), 0 303 915 A (브라이스 등), 영국 특허 출원 GB 2190378 A (클라우스 등), 독일 특허 출원 번호 DE 3715955 A1 (클라우스 등), DE 3602473 A1 (구스트 등) 및 논문 J. Amer. Acad. Derm. 15 : 756-764(1986) (스폰 등), Chem. Pharm, Bull. 33 : 404-407(1985) (Shudo 등), J. Med Chem, 31 : 2182-2192(1988) (카게시카 등), 합성 레티노이드의 화학 및 생물 CRC Press Inc. 1990 pp. 334-335, 354 (다우슨 등)은, 테트라히드로나프틸 모이어티를 포함하며 레티노이드형 또는 관련 생물학적 활성을 갖는 화합물을 설명하거나 이에 관련되는 것이다. 미국 특허 번호 4,391,731(볼러 등)은 액정 합성물에 사용되는 테트라히드로나프탈렌 유도체를 설명하고 있다.
J. Med. Chem 32 : 834(1989)의 카게시카 등에 의한 논문은 레티노이드형 활성을 갖는 특정 6-(3-옥소-1-프로펜일)-1,2,3,4-테트라메틸-1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌 유도체 및 관련 플라본 합성물을 설명하고 있다. Chem. Pharm. Bull. 33-404(1985)에서 슈도 등과 Cancer Research 47 : 3523(1987)에서 제탄 등에 의한 논문은 다른 3-옥소-1-프로펜일 유도체 (칼콘 합성물) 및 이들의 레티노이드형 또는 관련 생물학적 활성을 설명하거나 이에 관련된 것이다.
불행하게도, 레티노이드형 활성을 가지는 합성물은 또한 두통, 유전자 기형, 점막 피부 γ, 지혈 이상증, 피부 자극, 두통 및 간독소를 포함하는, 약물 투여량 수준에 따라 수많은 부작용을 유발한다. 이들 부작용은 질병을 치료하기 위한 레티노이드의 수용성 및 유용성을 제한하게 된다.
현재 포유 동물 (및 그 외 유기체)에 두 개의 주요 형태의 레티노이드 수용체가 존재한다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 이 두 개의 주요 형태의 수용체는 각각 RAR 및 RXR로 나타낸다. 각 형태 내에는 부형태가 있는데; RAR에는 부형태를 RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ가 있고, RXR에는 부형태가 RXR-α, RXR-β, 및 RXR-γ가 있다. 두 형태의 수용체는 이들의 리간드 결합 특성에 따라 서로 분간할 수 있는 전사 요소이다. 모든 trans-RA(ATRA)는 RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ를 포함하는 레틴산 수용체(RAR)의 클래스를 결합 및 활성화한다. 다른 라간드, 9-cis-RA(9C-RA)는 RAR 및 레티노이드 X 수용체(RXR)의 맴버를 결합 및 활성화한다.
또한 두 개의 주 레티노이드 수용체 형태 및 몇가지 부형태의 분포는 포유동물의 유기 조직의 여러 조직과 유기물에서는 균일하지 않은 것으로 알려져 있다. 더구나, 일반적으로, 바람직하지 않은 레티노이드의 부작용이 RAR 수용체 부형태중 하나 이상에 의해 완화되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 레티노이드 수용체에 어고니스트형 활성을 갖는 화합물중에서, 특히 주 형태중 하나에 대해서, 그리고 한 형태의 수용체 내에서 하나 이상의 부형태에 대해서, 바람직한 약제 특성으로 고려되고 있다.
비교적 최근에는 동일한 수용체의 어고니스트에 의해 트리거된 반응을 트리거하지 않고 RAR 수용체에 결합되는 화합물이 개발되고 있다. 따라서 '레티노이드' 반응을 트리거하지 않는 RAR 수용체에 결합되는 화합물 또는 용액가 생물학적 에세이 및 시스템에서 RAR 어고니스트의 활성을 차단(또는 다소의 정도로)할 수 있다. 더욱 특히, 이 분야의 과학 및 특허 문헌에 관련하여 보면, 발간된 PCT 출원 WO 94/14777이 RAR 레티노이드 수용체에 결합되며 여드름, 건선, 류머티스, 및 비루스성 전염과 같은 특정 질병의 치료에 사용되는 것으로 알려진 특정 헤테로클릭 카르복실산 유도체를 개시하고 있다. 요시무라 등의 J Med. Chem. 38 : 3163-3173(1995)에 의한 논문에 유사한 것이 개시되어 있다. 가네꼬 등의 Med. Chem Res. 1 : 220 : 225(1991); 에펠 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 7129-7133 1992년 8월 Cell Biology; 에카르드 등의 Toxicology Letters 70 : 299-308(1994); 케이델 등의 Molecular and Cellular Biology 14 : 287-298(1994); 및 이롤스 등의 J. Med. Chem. 37 : 1508-1517(1994)가 하나 이상의 RAR 레티노이드 부형태에 길항제형 활성을 갖는 화합물을 개시하고 있다.
레티노이드 화합물로 치료하는 데에 따른 부작용에 부가하여, 높은 수준의 비타민을 함유하는 특성한 물고기나 동물의 간을 소화하거나 비타민제의 과다 복용으로 인한, 비타민 A 또는 비타민 A 전구체 과다 복용으로 인한 심각한 상태가 종종 발생한다. 비타민 A 과복용 증후군으로 관찰되는 만성 중독은 두통, 습진, 골절상, 디스리피데미아스 등을 포함한다. 최근에, 비타민 A 아날로그, 즉 레티노이드로 관찰되는 중독은 비타민 A 과다 증후군을 재발시켜, 통상적인 생물학적 원인, 즉 RAR 활성화를 제시하고 있다. 이들 중독은 현재 주로 보호성 수단에 의해 그리고 간, 비타민제 또는 레티노이드이든지, 유발성제에의 노출을 방지함으로써 치료된다. 중독중 어떤 것은 시간이 지남에 따라 해소되는 한편, 다른 것은 영구적이다.
일반적으로 말하면, 특정 해독제가 약물로 인한 중독의 가장 좋은 치료일 뿐만 아니라, 현존하는 수천 가지 중에서 약 24개의 화학물질이 공지된 해독제이다. 특정 해독제는 비타민 A 과다복용 및 레티노이드 중독의 치료에 좋은 것이 있다. 실재로, 효력이 있는 레티노이드의 사용이 증가됨에 따라 레티노이드 중독의 해독제가 생명을 구할 수도 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 화학식 1을 제공한다.
여기에서 X는 S, O, NR'이고 여기에서 R'은 H 또는 1 내지 6 탄소의 알킬이고,
X는 [C(R1)2)2]n 이고 여기에서 R1은 독립적으로 H 또는 1 내지 6 탄소의 알칼이고, n은 10과 2 사이의 정수이고;
R2는 수소, 1 내지 6 탄소의 하측 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 1 내지 6 탄소의 플루오루 치환 알킬, OH, SH, 1 내지 6 탄소의 알콕시, 또는 1 내지 6 탄소의 알킬티오이고;
R3은 수소, 1 내지 6 탄소의 일부 알킬 또는 F이고;
m은 0-3의 값을 갖는 정수이고;
o는 0-3의 값을 갖는 정수이고;
Z는 -C≡C-,
-N=N-,
-N=CR1-,
-CR1=N,
-(CR1=CR1)n, 여기에서 n'은 0-5의 값을 갖는 정수이다.
-CO-NR1-,
-CS-NR1-,
-NR1-CO,
-NR1-CS,
-COO-,
-OCO-,
-CSO-,
-OCS-,
Y는 페닐 또는 나프틸군 또는 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸일, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸일로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 헤테로아릴이고, 상기 페닐 및 헤테로아릴군은 하나 또는 두 개의 R2군으로 선택적으로 치환될 수 있고,
Z가 -(CR1=CR1)n'-이고 n'이 3, 4, 또는 5이면 Y는 상기 (CR1=CR1)n'군과 B 사이의 직접 원자가 결합(direct valence bond)을 나타낸다.
A는 (CH2)q이고 여기에서 q가 0-5이고, 3-6 탄소를 갖는 하측 분기된 체인알킬, 3-6 탄소를 갖는 키를로알킬, 2-6 탄소 및 1 또는 2개의 이중 결합을 갖는 알케닐, 2-6 탄소와 1 또는 2개의 삼중 결합을 갖는 알키닐;
B는 수소, COOH 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2R11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O, 또는 삼중 하측 알킬실릴, 여기에서 R7는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알킬기, 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 시클로알킬기 또는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알케닐기이고, R8은 1 내지 10 탄소의 알킬군 또는 알킬군이 1 내지 10 탄소 또는 5 내지 10 탄소의 시클로알킬군을 갖는 트리메틸실릴알킬이거나, R8은 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 1 내지 10 탄소의 알킬군이거나, 5-10 탄소의 시클로알킬군이거나, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R11은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐, R12는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이고, R13은 2-5 탄소의 이가 알킬 라디칼이고,
R14는 (R15)r-페닐, (R15)r-나프틸, 또는 (R15)r-헤테로아릴이고 여기에서 헤테로아릴군은 2 내지 9개의 탄소를 함유하고, O, S, 및 N로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3 헤테로원자를 가지며, r은 0-5의 값을 갖는 정수이고,
R15은 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8,OR8, CN, 및 1 내지 10 탄소를 갖는 알킬군, 1 내지 10 탄소를 갖는 플루오루 치환 알킬, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3의 이중 결합을 갖는 알케닐군, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3개의 삼중 결합을 갖는 알키닐군, 또는 알킬군이 독립적으로 1 내지 6 탄소를 갖는 트리알킬실일 또는 트라알킬시릴록시군이다.
본 발명은 화학식 101의 화합물을 제공한다.
여기에서, X는 S, O, NR'이고 여기에서 R' 또는 1 내지 6 탄소의 알킬이고,
X는 [C(R1)2]n 이고 여기에서 R1은 독립적으로 H 또는 1 내지 6 탄소의 알킬이고, n은 10과 2 사이의 정수이고; R2는 수소, 1 내지 6 탄소의 하측 알킬, F, Cl, Br, CF3, 1 내지 6 탄소의 플루오루 치환 알킬, OH, SH, 1 내지 6 탄소의 알콕시, 또는 1 내지 6 탄소의 알킬티오이고;
R3은 수소, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬 또는 F이고;
m은 0-3의 값을 갖는 정수이고;
o는 0-3의 값을 갖는 정수이고;
Y는 페닐 또는 나프틸군 또는 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸일, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸일로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 헤테로아릴이고, 상기 페닐 및 헤테로아릴군은 하나 또는 두 개의 R2군으로 선택적으로 치환될 수 있거나,
A는 (CH2)q이고 여기에서 q가 0-5이고, 3-6 탄소를 갖는 하측 분기된 체인알킬, 3-6 탄소를 갖는 시클로알킬, 2-6 탄소 및 1 또는 2개의 이중 결합을 갖는 알케닐, 2-6 탄소와 1 또는 2개의 삼중 결합을 갖는 알키닐;
B는 수소, COOH 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O, 또는 삼중 하측 알킬실릴, 여기에서 R7는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알킬기, 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 시클로알킬기 또는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알케닐기이고, R8은 1 내지 10 탄소의 알킬군 또는 알킬군이 1 내지 10 탄소 또는 5 내지 10 탄소의 시클로알킬군을 갖는 트리메틸실릴알킬이거나, R8은 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 1 내지 10 탄소의 알킬군이거나, 5-10 탄소의 시클로알킬군이거나, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R11은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐, R12는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이고, R13은 2-5 탄소의 이가 알킬 라디칼이고,
R14는 (R15)-페닐, (R15)-나프틸, 또는 (R15)-헤테로아릴이고 여기에서 헤테로아릴군은 2 내지 9개의 탄소를 함유하고, O, S, 및 N로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3 헤테로원자를 가지며, r은 0-5의 값을 갖는 정수이고,
R15는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, 및 1 내지 10 탄소를 갖는 알킬군, 1 내지 10 탄소를 갖는 플루오르 치환 알킬, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3의 이중 결합을 갖는 알케닐군, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3개의 삼중 결합을 갖는 알키닐군, 또는 알킬군이 독립적으로 1 내지 6 탄소를 갖는 트라알킬실일 또는 트라알킬시릴록시군이다.
R16은 H, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬이고;
R17은 H, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬, OH 또는 COOR11이고,
p는, p가 1이면 R17치환군은 없고, m이 0과 2 사이의 정수라는 가정하에, 제로 또는 1이다.
본 발명의 화합물은 특정 질병의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 레티노이드의 특정 부작용을 방지하기 위해 사용된다. 이 목적을 위해 본 발명의 화합물은 레티노이드와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 레티노이드제 또는 비타민 A의 과다 복용 또는 중독으로 인한 만성 중독의 치료에 또한 효과적이다.
본 발명은 포유 동물을 포함하는 생체계의 모든 또는 약간의 RAR 수용체 사이트를 차단하여, 상기 수용체 사이트에 대한 RAR 어고니스트의 작용을 방지하기 위한 RAR길항제의 사용에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 레티노이드(비타민 A 또는 비타민 A 전구체를 포함)만성 중독 및 레티노이드 치료법의 부작용의 방지 및 치료를 위한 RAR 어고니스트의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 특정 형태로는, 포유 동물의 병리학적인 상태를 치료하는 방법을 제공하고 있다. 취급되는 상태는 레틴산 수용체 활성에 관련된다. 이 방법은 다음의 레틴산 수용체 부형태; RARα, RARβ 및 RARγ 중 하나에 결합할 수 있는 레티노이드 길항제 또는 음성적 호르몬을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 길항제 또는 레가티브 호르몬은 포유 동물의 병리학적 상태를 치료하는 데에 효과적인 양으로 투여된다.
만성 레티노이드 또는 비타민 A 중독의 해독제로서 RAR 길항제가 포유 동물에게 투여될 수 있다. 투여 루트에 필요한 오직 하나의 조건은 목표 조직에 대해 길항제를 이송해야만 하는 것이다. RAR 길항제는 그 자체거나 엑시피언트(excipient)와 결합하여 형성될 수 있다. RAR 길항제는 형성시 솔루션일 필요는 없다.
레티노이드에 의한 치료의 보조물로서 그리고 투여되는 레티노이드제의 하나 이상의 부작용을 방지하기 위해서, RAR 길항제가 유사하게 투여될 수 있다. RAR 길항제와 RAR 어고니스트는 동일한 투여 경로로 투여될 필요는 없다. 중요한 점은 충분한 양의 RAR 길항제가 RAR 어고니스트에의 노출 동안에 관심 있는 조직에 연속적으로 존재해야 하는 것이다. 레티노이드 중독의 방지를 위해서는, RAR 길항제가 RAR 어고니스트로의 치료와 동시에 또는 그 이전에 투여되는 것이 가장 좋다. 많은 경우 RAR 길항제는 어고니스트와는 다른 루트로 투여되게 된다. 예를 들어 엔터럴 투여된 레티노이드의 피부 부작용이 국소적으로 투여된 RAR 길항제에 의해 방지 또는 완화될 수 있다.
본 발명의 다른 형태는 레티노이드 음성적 호르몬을 식별하는 방법이다. 이 방법은 제결합 레티노이드 수용체의 결합에 대한 전사 반응하는 수용체 유전자를 함유하는 주입 세포를 얻는 단계-상기 재결합 레티노이드 수용체는 완전한 레티노이드 수용체의 DNA 결합 영역에 대해 적어도 프로테인 영역 위치 C-터미널을 갖고-; 치료되지 않는 주입 세포에서의 리포터 유전자 표현의 기본 레벨을 측정하는 단계-첨가된 레티노이드가 없을 때 상기 치료되지 않은 주입 세포가 전파되고-; 상기 주입 세포를 레티노이드 화합물로 치료하여 음성적 호르몬 활성을 시험하는 단계; 치료된 세포에서의 리포터 유전자 표현으로 주입 세포를 치료하는 단계; 치료된 세포에서의 리포터 유전자 표현의 레벨을 측정하는 단계; 치료된 세포와 치료되지 않은 세포에서 측정되는 리포터 유전자 표현의 레벨을 비교하는 단계; 및 치료되지 않은 세포에서 측정되는 리포터 유전자 표현의 기본 레벨과 비교되는 치료된 세포에서의 리포터 유전자 표현의 저레벨을 생성하는 레티노이드를 레티노이드 음성적 호르몬으로서 식별하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정한 바람직한 실시예에서는, 상기 완전한 레티노이드 수용체는 RARα, RARβ, 및 RARγ 부형태이다. 다른 실시예에서는, 완전한 수용체는 RARα, RARβ, 및 RARγ 부형태이다. 재결합 수용체는 또한 재결합 RAR 또는 RXR 수용체일 수 있다. 어떤 실시예에서는 재결합 수용체는 연속적인 전사 활성체 영역을 갖는 키레믹 레티노이드 수용체이다. 이런 연속적인 전사 활성체 영역은 네트 음성적 전하를 갖는 복수의 아미노산을 포함하거나, 헤르페스심플렉스 비루스 VP-16 전사 활성체 영역과 같은 바이러스 전사 활성체 영역의 아미노산 시퀀스를 갖는다. 연속적 전사 활성체 영역이 네트 음성적 챠지를 갖는 실시예에서는, 레티노이드 수용체가 재결합될 수 있으며 레틴산 반응 요소가 아닌 시스-조정 요소에 특정한 DNA 결합 영역과 같은 DNA 결합 영역으로부터 삭제된다. 이들 요소는 에스트로겐 반응 요소를 포함한다. 주입 세포는 활성화 챠콜-추출 세럼을 포함하는 것과 같이, 내생 레티노이드가 제거된 성장 매체에서 번식되는 것이 바람직하다. 이 방법에서는, 리포터 유전자가 루시페라제 유전자일 수 있고, 이 경우, 측정 단계는 루미노메트리를 포함한다. 리포터 유전자는 β-갈락토시다제 유전자일 수 있으며, 이 경우 측정 단계는 β-갈락토시다제 에세이를 포함할 수 있다. 주입 세포는 그린 몽키 세포 또는 사람의 세포와 같은 주입 포유 동물 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 형태는 포유 동물에게 투여되는 스테로이드 수퍼패밀리 수용체의 약제학적 활성을 강화하는 방법이다. 이 방법은 스테로이드 수퍼패밀리 수용체 어고니스트의 약제학적 활성을 강화하는 데에 유효한 투여량의 레티노이드 음성적 호르몬을 포함하는 화합물을 스테로이드 수퍼패밀리 수용체 어고니스트를 포유 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 이 약제학적 활성은 안티-AP-1 활성을 측정함으로써와 같이, 시험관 내의 리포터 유전자 트랜스-활성 에세이에서 측정할 수 있다. 강화되는 약제학적 활성은 망막 색소 상피에서 측정 가능한 형태의 활성과 같은, 반증식성 활성일 수 있다. 스테로이드 수퍼패밀리 수용체 어고니스트는 다음중 어느 것일 수 있다 : 레티노이드 수용체 어고니스트, 비타민 D 수용체 어고니스트, 글루코티코이드 수용체 어고니스트, 티로이드 호르몬 수용체 어고니스트. 페로시몬증식체 활성 수용체 어고니스트 또는 에스트로겐 수용체 어고니스트. 레티노이드 수용체 어고니스는 모두-트랜스-레틴산 또는 13-시스 레틴산과 같은 RAR 어고니스트일 수 있다. 레티노이드 수용체 어고니스트는 또한 RXR 어고니스트일 수 있다. 바람직한 비타민 D 수용체 어고니스트는 1,25-디히드록시비타민 D3이다. 바람직한 글루코티코이드 수용체 어고니스트는 덱사메타손이다. 바람직한 타이로이드 호르몬 수용체 어고니스트는 3,3'5-트리요오드티로닌이다. 레티노이드 음성적 호르몬은 RAR 지정 레티노이드 음성적 호르몬이고, 이것은 약 30nM보다 작은 분해 상수를 갖는 것이 바람직하다. RAR 지정 레티노이드 음성적 호르몬의 예로는 AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389, 및 AGN 193871을 포함한다. 약제학적으로 유효한 투여량의 레티노이드 음성적 호르몬을 포함하는 합성물은 스테로이드 수퍼패밀리 어고니스트와 동시에 공동 투여할 수 있으며 공동 투여 이전에 결합될 수 있다. 이들은 별개의 화합물로서 공동 투여될 수 있다.
정의
본 발명의 목적을 위하여, RAR 안타고니스트는 Kd를 1 마이크로몰러(Kd>1 μM) 미만일 때 하나 이상의 RAR 부형태에 결합하지만 수용체 공동 주입 에세이의 RAR 부형태 조정 유전자의 전사 작용을 유발하지 않는 화학 물질로서 정의된다. 종래에는, 길항제가 어고니스트의 활성을 금지하는 화학제이다. 따라서, 수용체 길항제의 활성은 종래에는 어고니스트의 활성을 금지하는 작용 덕분에 측정된다.
RAR 어고니스트는 Kd가 1 마이크로몰 (Kd>1μM) 미만일 때 하나 이상의 RAR 수용체 부형태에 결합하며 수용체 공동 주입 에세이의 RAR 부형태 조정 유전자의 전사 작용을 유발하는 화학 물질로서 정의된다. 'RAR 어고니스트'는 RAR에 부가한 다른 수용체, 예를 들어, RXR 수용체에 결합하고/ 하거나 활성화시킬 수 있는 화학 물질을 포함한다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 음성적 호르몬 또는 역 어고니스트는 어느 리간드의 부재시에도 발생하는 기본 상태에 상대적인 비활성 상태를 수용체가 수용하도록 하는 수용체의 리간드이다. 따라서, 길항제가 어고니스트의 활성을 금지할 수 있는 한편, 음성적 호르몬이 어고니스트의 부재시 수용체의 형태를 변경할 수 있는 리간드이다. 음성적 호르몬 또는 역 어고니스트의 개면은 Nature 374 : 272(1995)에서 본드 등에 의해 개발되었다. 더욱 상세하게는, 본드 등은 비활성 형태와 동시성인 활성 형태 사이의 평행에 리간드되지 않은 β2-아드레노셉터가 존재한다는 것을 제시했다. 어고니스트는 활성 형태의 수용체를 안정화하는 것이다. 역으로, 역 어고니스트는 비활성 형태를 안정화하는 것으로 생각된다. 따라서, 길항제가 어고니스트를 금지하는 덕분에 활성을 가지지만, 음성적 호르몬은 활성 형태에 대해 리간드되지 않은 수용체의 동시 반전을 금지하여 어고니스트의 부재시 활성을 부가적으로 가질 수 있다. 길항제의 서브세트만이 음성적 호르몬으로서 작용하게 된다. 여기에서 설명되는 바와 같이, AGN 193109은 안타고니스트와 음성적 호르몬이다. 이제까지, 어떤 다른 레티노이드도 음성적 호르몬 활성을 갖는 것으로 나타나지 않는다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 두 개의 제약학적으로 활성인 화합물의 공동 투여는 체외든 체내이든지, 두 개의 다른 화학물질의 이송에 관련된다. 공동 투여는 개별적인 약제의 동시 이송; 약제의 혼합물의 동시 이송; 더구나 제 1 약자에 뒤이어 제 2 약제의 이송에 관련된다. 모든 경우, 공통 투여되는 약제는 서로에 관련하여 작용하게 된다.
알킬은 노멀 알킬, 분기 사슬 알킬 및 시클로알킬로 일으킨 모든 그룹을 포함한다. 알케닐은 노멀 알케닐, 하나 이상의 비포화 위치를 갖는 분기 사슬 아케닐 및 시클로알케닐군을 포함한다. 유사하게, 알키닐은 노멀 알키닐, 및 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 분기 사슬 알키닐군을 포함한다.
저급 알킬은 노멀 저급 알킬의 경우 1 내지 6 탄소를 가지며 3 내지 6 탄소를 저급 분기 사슬과 시클로알킬군으로 사용 가능한 알킬군을 광범위하게 정의한다. 저급 알케닐은 노멀 저급 알케닐군에 대해 2 내지 6 탄소, 및 분기 사슬 및 시클로 저급 알케닐군에 대해 3 내지 6 탄소를 갖는 것으로 정의된다. 저급 알키닐은 또한 노멀 저급 알키닐군에 대해 2 내지 6 탄소를, 분기 사슬 저급 알키닐군에 대해 4 내지 6 탄소를 갖는 것으로 정의된다.
'에스테르'는 유기 화학체에 사용되는 것으로 정의할 때 어느 화합물도 포함하는 것으로 하여 사용된다. 이것은 유기 및 무기 에스테르를 포함한다. B(화학식 1 또는 화학식 101)는 -COOH이면, 이 용어는 1-6 탄소를 갖는 지방족 알콜을 갖는 알콜 또는 티올로의 치료로 유도된 것을 포함한다. 에스테르는 B가 -CH2OH인 경우의 화합물로부터 유도되면, 이 용어는 인황계 및 설퍼계 산 또는 R11이 치환 또는 비치환된 지방족, 방향족, 헤테로방향족, 또는 지방 방향족군인 경우의 식 -CH2OCOR11을 포함하는 에스테르를 형성할 수 있는 유기산으로부터 유도된 화합물을 포함한다.
본 출원에서는 기재되지 않았다고 해도, 바람직한 에스테르가 10개 또는 수개의 탄소 분자의 포화 방향족 알콜 또는 산이나 5 내지 10 탄소 분자의 포화 방향족 순환 알콜 및 산으로부터 유도된다. 특히 바람직한 방향족 에스테르는 저급 알킬 산과 알콜로부터 유도된 것이다. 또한 페닐 또는 저급 알킬 페닐 에스테르가 바람직하다.
아미드는 유기 화학 물질에서 사용되는 용어이다. 이 경우 비치환 아미드와 모든 지방족 및 방향족 모노-와 디-치환 아미드를 포함한다. 이 출원에서는 기재하지 않고 있지만, 바람직한 아미드는 10 또는 수개의 탄소 분자의 포화 지방족 라디칼 또는 5 내지 10 탄소 분자의 포화 지방족-순환 라디칼로부터 유도된 모노-및 디-치환 아미드이다. 특히 바람직한 아미드는 치환 및 비치환된 저급 알킬 아민으로부터 유도된 것이다. 또한 치환 및 비치환된 페닐 또는 저급 알킬페닐 아민으로부터 유도된 모노-및 비치환 아미드이다.
아세탈 및 케탈은 K가 (-OR)2일 때 식 -CK의 라디칼을 포함한다. 여기에서, R은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이다. 또한, K는 -OR7O-이고 여기에서 R7은 2-5 탄소 분자의 저급 알킬, 직선 사슬 또는 분기 사슬이다.
제약학적으로 허용되는 염이 염을 형성할 수 있는 기능, 예를 들어 산 기능을 갖는본 발명의 화합물용으로 마련될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 페어런트 화합물의 활성을 보유하며 투여되는 대상에 어떠한 역효과도 부여하지 않는 염이다.
제약학적으로 허용되는 염은 유기 또는 무기 염기로부터 유도될 수 있다. 이 염은 모노 또는 폴리발렌트 이온일 수 있다. 특히 유기 이온, 소듐, 포타슘, 칼슘, 또는 마그네슘이 관심 대상이다. 유기 염은 아민, 특히 모노-, 디-, 및 트라이알킬 아민 또는 에타놀 아민과 같은 암모늄 염으로 만들어질 수 있다. 산 부가 염을 형성할 수 있기에 충분한 질소가 있은 경우, 메틸 요오드와 같은 비유기 또는 유기산 또는 알킬제로 형성될 수 있다. 바람직한 염은 히드로클로드산, 황산 또는 인황산과 같은 비유기산으로 형성되는 것이다. 모노-, 디- 및 트리-산과 같은 다수의 간단한 유기산이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물중 어떤 것은 trans 및 cis(E 및 Z) 동소체를 가질 수 있다. 부가하여, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 키럴 중심을 포함할 수 있으며 이에 따라서 에난티오머와 디아스테레오머 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 영역은 모든 동소체에 자체와, cis 및 trans 동소체의 혼합물, 디아스테레오머의 혼합물 및 에난티오머의 레세믹 혼합물도 포함하는 것이다. 본 출원에서는 화합물의 구성(cis, trans, 또는 R이나 S)에 대한 특정한 언급이 없으면, 이런 동소에의 혼합물이나, 동소체중 하나인 것으로 한다.
도 1은 AGN 193109의 화학 구조를 나타낸다.
도 2a-2f는 AGN 193109가 RAR에서의 ATRA-의존 트랜생티베이션을 방지한 일련의 선 그래프이다. 도 2a 및 2b 는 RAR-β 수용체에서의 활성을 나타내고; 도 2e 및 2f 는 RAR-γ 수용체에서의 활성을 나타낸다. 도 2a, 2c 및 2e 에서는, 열린 사각형은 레틴산 치료를 나타내며 완전 원은 AGN 193109 치료를 나타낸다. 도 2b, 2d 및 2f 에서는, 단선은 10-8M ATRA 및 다양한 논동의 AGN 193109로의 치료 후 측정되는 루시페라제 활성을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b 는 리포터 플라즈미드 ERE-tk-Luc와 표현 플라즈미드 ER-RAR-α가 주입된 CV-1 세포에서 검출되며 ATRA(도 3a) 또는 AGN 193109(도 3b)로 자극되는 루시페라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 점은 세개의 독립적인 루시페라제 정량의 평균 ± SEM를 나타낸다. 다른 양의 공동 주입 ER-RAR-α (0.05, 0.1, 및 0.2 μg/well)을 사용하여 실행되는 주입 결과를 각 도면에서 나타낸다.
도 4a 및 4b 는 리포터 플라즈미드 ERE-tk-Luc와 표현 플라즈미드 ER-RAR-β가 주입된 CV-1 세포에서 검출되며 ATRA(도 4a) 또는 AGN 193109(도 4b)로 자극되는 루시페라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 지점은 세개의 독립적인 루시페라제 정량의 평균 ± SEM를 나타낸다. 다른 양의 공동 주입 ER-RAR-β (0.05, 0.1, 및 0.2 μg/well)을 사용하여 실행되는 주입 결과를 각 도면에서 나타낸다.
도 5a 및 5b 는 리포터 플라즈미드 ERE-tk-Luc와 표현 플라즈미드 ER-RAR-γ이 주입된 CV-1 세포에서 검출되며 ATRA(도 5a) 또는 AGN 193109(도 5b)로 자극되는 루시페라제 활성을 나타내는 선 그래프이다. 데이터 점은 세개의 독립적인 루시페라제 정량의 평균 ± SEM를 나타낸다. 다른 양의 공동 주입 ER-RAR-γ (0.05, 0.1, 및 0.2 μg/well)을 사용하여 실행되는 주입 결과를 각 도면에서 나타낸다.
도 6 은 ERE-tk-Luc 리포터 플라즈미드 및 ER-RAR-α 키메릭 수용체 표현 플라즈마 단독으로 또는 RAR-γ-VP-16 표현 플라즈미드와 함께 공동 주입된 CV-1 세포의 ATRA 및 AGN 193109 투여량을 나타낸다. ER-RAR-α 공동 주입된 세포는 ATRA (사각형) 및 AGN 193109 (다이아몬드)로 치료된다. 세포는 ER-RAR-α 및 RAR-γ-VP-16의 결합으로 공동 주입된 세포가 ATRA (원형) 및 AGN 193109 (삼각형)으로 치료된다.
도 7 은 ERE-tk-Luc 리포터 및 ER-RAR-γ 표현 구성으로 주입되어 10-8M의 ATRA과 수평축으로 나타낸 농도에서의 시험 화합물로 치료된 CV-1 세포의 용해질에 기록된 루시페라제 활성 수단을 나타내는 선 그래프이다. 상기 시험 화합물은 AGN 193109 (사각형), AGN 193357 (개방 다이아몬드), AGN 193385 (원형), AGN 193389 (삼각형), AGN 193840 (빗금친 사각형) 및 AGN 192870 (채워진 다이아몬드)이다.
도 8 은 ERE-tk-Luc 리포터 및 RAR-γ-VP-16 및 ER-RXR-α 표현 구성으로 주입되어 10-8M의 ATRA과 수평축으로 나타낸 농도에서의 시험 화합물로 치료된 CV-1 세포의 용해질에 기록된 루시페라제 활성 수단을 나타내는 선 그래프이다. 상기 시험 화합물은 ATRA (개방 사각형), AGN 193109 (개방 원형), AGN 193174 (개방 삼각형), AGN 193199 (빗금친 사각형), AGN 193385 (빗금친 원형), AGN 193389 (역삼각형), AGN 193840 (대각선으로 채워진 사각형) 및 AGN 193871 (반 채워진 다이아몬드)이다.
도 9a, 9b, 및 9c 는 AGN 193109가 RAR (그림자진 박스)와 활성 에세이의 내용에서 설명되는 음성적인 공통활성제 프로테인(-) 사이의 상호 작용을 조정할 수 있도록 하는 기구를 개략적으로 나타낸다. 도 9a 는 음성적인 공통활성제와 양성적인 공통 활성제 프로테인(+)이 RAR와의 결합 평형을 이루고 있는 것을 나타낸다. 라간드의 부재시 기본 수준의 리포터 유전자 전사가 결과된다. 도 9b 에서 설명하는 바와 같이, RAR 어고니스트의 부가로 RAR과의 양성적인 공통 활성제 프로테인의 결합을 조장하여 상향 조정되는 리포터 유전자 전사가 결과되게 한다. 도 9c 에서 설명하는 바와 같이, AGN 193109의 부가로 RAR과의 음성적인 공통 활성제 프로테인의 결합을 조장하여 리포터 유전사 전사를 방지한다.
도 10 은 AGN 193109의 농도를 10-8M으로 고정하고 AGN 191183 농도(10-10내지 10-12M)의 함수로서 TPA-유도된 Str-AP1-CAT 표현의 방지를 나타내는 막대 그래프이다. AGN 191183 만으로 행해지는 실험의 결과는 빗금친 막대로 나타내는 한편, 스트립된 막대는 AGN 193109 및 AGN 191183의 결합으로 처리한 결과를 나타낸다.
도 11 은 AGN 193109이 RAR이 활성과 다른 핵 수용체 멤버를 상승시킬 수 있는 기구를 개략적으로 나타낸다. 이 도면에서 나타낸 바와 같이, 유도된 RAR(AB-C-DEF 영역을 갖는 개방 장방형)은, 제한적인 공급으로 존재하는 음성적인 공통 활성제 프로테인(ncp)이 RAR상에 시퀘스터되어 두 개의 상태 : RAR+ncp 및 RAR-ncp를 만들기 때문에 안티-AP1 에세이의 RAR 리간드에의 감응이 증가한다. 비-RAR 핵 요소 (AB-C-DEF 영역을 갖는 그림자진 장방형)는 ncp가 AGN 193109의 활성에 의해 RAR에 스퀘스터되기 때문에 코그네이트(cogante) 리간드에 대한 감응을 증가시킨다. 핵 수용체의 모듈러 영역은 'AB' (리간드 독립 트랜색티베이션 영역), 'C' (DNA 결합 영역), 'DEF' (리간드 대조 트랜색티베이션 영역과 이량중합 영역)으로 표준 명명법을 사용하여 지정된다.
도 12 는 MTV-DR3-Luc 리포터 플라즈미드로 감염된 CV-1 세포의 1,25-디히드록시비타민 D3투여량 반응에 대한 AGN 193109의 효과를 나타내는 선 그래프이다. 감염제는 1,25-디히드록시비타민 D3(채워진 사각형), 1,25-디히드록시비타민 D3및 10-8M AGN 193109 (채워진 삼각형), 및 1,25-디히드록시비타민 D3및 10-7M AGN 193109 (채워진 원형)으로 치료된다.
도 13 은 TPA 유도된 Str-AP1-CAT 활성의 1,25-디히드록시비타민 D3-조정 방지에 대한 AGN 193109(10nM) 공동 투약의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 채워진 막대는 1,25-디히드록시비타민 D3만으로 치료된 세포의 CAT 활성의 방지를 나타낸다. 개방된 막대는 1,25-디히드록시비타민 D3와 AGN 193109의 조합으로 치료된 세포의 CAT 활성의 방지를 나타낸다.
도 14 는 RAR-γ 및 RAR 반응성 MTV-TREp-Luc 리포터 구성으로 공동 전사된 HeLa 세포에 대한 AGN 193109만으로 및 AGN 191183과 결합한 효과를 나타내는 선그래프이다. 그래프에서 설명되는 약품 치료는 : AGN 193109 단독(사각형), 10-10M에서 AGN 191183과 결합한 AGN 193109, 및 10-9M에서 AGN 191183과 결합한 AGN 193109이다.
도 15 는 EGF (채워진 사각형)에 응답하지만 한정된 매체만에(개방된 원형) 응답하지는 않고 증식된 ECE16-1 세포를 나타내는 선 그래프이다. ANG 193109 단독으로 치료된 세포는 채워진 삼각형으로 나타낸다. 채워진 원은 10nM AGN 193109 및 0-1000nM AGN 193109으로 치료된 세포에 대해 성취된 결과를 나타낸다.
도 16 은 AGN 191183 레티노이드 어고니스트의 존재나 부재시 CaSki 세포의 증식에 대한 AGN 193109의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 모든 샘플 그룹은 한정된 매채(DM) 단독에서 생식되는 샘플을 제외하고는 표피 성장 요소(EGF)의 20ng/ml를 수용한다. 스트립 막대는 AGN 193109의 존재시 생식되는 샘플을 나타낸다. 채워진 막대는 1000nM의 AGN 193109의 존재시 생식되는 샘플을 나타낸다. 이 과정에서 사용되는 AGN 191183의 농도를 수평축에서 나타낸다.
도 17 은 AGN 193109는 망막 착색 상피 (RPE) 세포에 대한 ATRA의 반증식 활성을 가지는 것을 나타내는 투여량 반응 곡선을 나타낸다. ATRA 단독으로 치료된 샘플은 채워진 사각형으로 나타낸다. ATRA 및 AGN 193109(10-7M)의 결합으로 치료된 샘플은 채워진 원으로 나타낸다. 여러 샘플을 치료하는 데에 사용되는 ATRA 농도를 수평축으로 나타낸다.
도 18 은 13-cis-RA 및 ATRA가 RPE 세포 성장을 금지하고, AGN 193109이 13-cis-RA의 반증식 활성을 가지는 것을 나타내는 투여량 반응 곡선이다. 투여량 반응에 나타난 여러 샘플 치료는 13-cis-RA 단독 (채워진 사각형), AGN 193109(10-6M)과 결합하여 13-cis-RA (채워진 원형), AGN 193109(10-8M)과 결합하여 13-cis-RA (채워진 삼각형), 및 ATRA (채워진 다이아몬드)를 포함한다. 13-cis-RA과 ATRA의 농도를 수평축에서 나타낸다.
도 19 는 AGN 193109이 일차 RPE 세포 배양시 덱사메타손의 반증식 활성을 가지는 것을 나타내는 투여량 응답 곡선이다. 투여량 반응에 나타난 여러 샘플 치료는 ATRA (채워진 사각형), 덱사메타손 단독 (채워진 원형), AGN 193109(10-8M)과 결합한 덱사메타손 (채워진 삼각형), AGN 193109(10-6M)과 결합한 덱사메타손 (채워진 다이아몬드)를 포함한다. 샘플 치료에 사용된 ATRA의 농도를 수평축에서 나타낸다.
도 20 은 AGN 193109이 일차 RPE 세포 배양시 티로이드 호르몬(T3)의 반증식 활성을 가지는 것을 나타내는 투여량 응답 곡선이다. 투여량 반응에 나타난 여러 샘플 치료는 ATRA (채워진 사각형), T3단독 (채워진 원형), AGN 193109(10-8M)과 결합한 T3(채워진 삼각형), AGN 193109(10-6M)과 결합한 T3(채워진 다이아몬드)를 포함한다. 샘플 치료에 사용된 T3및 ATRA의 농도를 수평축에서 나타낸다.
레티노이드 길항제형 생물학적 활성을 갖는 아릴 치환 벤조피란, 벤조티오피란, 1,2-디히드로퀴놀린 및 5,6-디히드로나프탈렌 유도체
화학식 1의 기호 Y에 대해서는, 본 발명의 바람직한 화합물은 Y가 페닐, 피리딜, 티에닐 또는 푸릴인 것이다. 더욱 바람직한 것은 Y가 페닐 또는 피리딜이고, 더욱 바람직한 것은 Y가 페닐이다. Y(페닐) 및 Y(피리딜)군에 대한 치환제가 관련되는 한, 화합물은 페닐군의 Z 및 A-B군으로 1,4(파라) 치환되고, 피리딘 링이 Z 및 A-B군으로 2,5 치환되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 화합물에서는 Y군에 대한 선택적 R2치환체가 없거나, 선택적인 R2치환체는 플루오르(F)이다.
바람직한 화합물의 A-B군은 (CH2)n-COOH 또는 (CH2)n-COOR8이고, 여기에서 n과 R8은 상기와 같이 정의된다. 더욱 바람직하게는 n은 제로이고 R8은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이거나, n은 제로이고 B는 COOH 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물의 바람직한 예에서 X는 [C(R1)2]n이고, 여기에서 n은 1이다. 그러나, n이 제로(인데인 유도체)이고 X가 S 또는 O(벤조티오피란 또는 벤조피란 유도체)인 화합물이 또한 바람직하다. X가 [C(R1)2]n이고 n이 1일 때, 1 내지 6 탄소의 알킬이 바람직하고, 메틸이 더욱 바람직하다.
화학식 1의 화합물의 테트라히드로나프탈렌, 벤조피란, 벤조피오피란 또는 디히드로퀴놀린 성분의 방향족부에 부착된 R2군은 H, F, 또는 CF3-이고, R3는 수소 또는 메틸이 바람직하고, 수소가 더욱 바람직하다.
화학식 1에서 나타낸 화합물의 군 Z에 대해서는, 복수의 바람직한 예에서 Z는 아세틸레닉 결합(Z= -C≡C-)를 나타낸다. 그러나, '링커군' Z는 또한 다이아조군(Z= -N≡N-), 오레피닉 또는 폴리오레피닉군(Z= -CR1≡CR1-)n, 에스테르(Z= -COO-), 아미드(Z= -CO-NR2-) 또는 티오아미드(Z= -CS-NR2-) 결합이 바람직하다.
R14군을 보면, R14가 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 2-티에닐, 및 2-티아졸일인 화합물이 바람직하다. R15군(R14군의 치환체)은 H, 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 트리플루오르메틸, 클로라인, 저급 알콕시, 또는 히드록시가 바람직하다.
현재 본 발명의 가장 바람직한 화합물을 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 5a에 관련하여 표 1에서 나타낸다.
레티노이드 안타고니스트형 생물학적 활성을 갖는 아릴 및 (3-옥소-1-프로펜일)-치환 벤조피란, 벤조피오피란, 디히드로키놀린 및 5,6-디히드로나프탈렌 유도체
화학식 101의 기호 Y에 대해서는, 본 발명의 바람직한 화합물은 Y가 페닐, 피리딜,티에닐 또는 푸릴인 것이다. 더욱 바람직한 것은 Y가 페닐 또는 피리딜이고, 더욱 바람직한 것은 Y가 페닐이다. Y(페닐) 및 Y(피리딜)군에 대한 치환제가 관련되는 한, 화합물은 페닐군이 -CR16=CR17- 및 A-B군으로 1,4(파라) 치환되며, 피리딘 링이 -CR16=CR17- 및 A-B군으로 2,5치환된 화합물이 바람직하다. '피리딘' 명명법의 2,5 위치의 치환은 '질소산' 명명법의 6-위치의 치환에 대응한다. 본 발명의 바람직한 화합물에서는 Y군에 대한 선택적인 R2치환체가 없다.
바람직한 화합물의 A-B군은 (CH2)n-COOH 또는 (CH2)n-COOR8이고, 여기에서 n과 R8은 상기와 같이 정의된다. 더욱 바람직하게는 n은 제로이고 R8은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이거나, n은 제로이고 B는 COOH 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 화합물의 바람직한 예에서 X는 [C(R1)2]n이고, 여기에서 n은 1이다. 그러나, n이 제로(인데인 유도체)이고 X가 S 또는 O(벤조티오피란 또는 벤조피란 유도체)인 화합물이 또한 바람직하다. X가 [C(R1)2]n이고 n이 1일 때, 1 내지 6 탄소의 알킬이 바람직하고, 메틸이 더욱 바람직하다.
화학식 101의 화합물의 테트라히드로나프탈렌, 벤조피란, 벤조티오피란 또는 디히드로퀴놀린 성분의 방향족부에 부착된 R2군은 H, F, 또는 CF3-이고, R3는 수소 또는 메틸이 바람직하고, 수소가 더욱 바람직하다.
R14군을 보면, R14가 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 2-티에닐, 및 2-티아졸일인 화합물이 바람직하다. R15군(R14군의 치환체)은 H, 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 트리플루오르메틸, 클로라인, 저급 알콕시, 또는 히드록시가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 화합물을 화학식 102와 관련하여 표 2 에서 설명한다.
화합물 R15* R8*
101 CH3 H
102 CH3 Et
103 H H
104 H Et
생물학적 활성, 투여 모드
상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 RAR 수용체 부형태의 길항제이다. 이것은 본 발명의 화합물이 하나 이상의 RAR 수용체 부형태에 결합하지만, 동일한 수용체의 어고니스트에 의해 트리거되는 반응을 트리거하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물중 어떤 것은 모든 세 개의 RAR 수용체 부형태의 길항제이고, 이들은 'RAR 팬 길항제'로 불린다. 어떤 다른 것은 오직 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 부형태의 길항제이다. 본 발명의 영역 내의 어떤 화합물은 하나 또는 두 개의 RAR 수영체 부형태의 부분 어고니스트이고 나머지 부형태의 길형제이다.본 발명의 화합물은 RXR 수용체에 결합하지 않으므로, RXR의 어고니스트도 길항제도 아니다.
억제 또는 완화되길 희망하는 부작용의 위치 및 특성에 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 오직 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 부형태의 길항제일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 어떤 화합물은 하나 또는 두 개의 RAR 수용체 부형태의 부분 어고니스트이고 나머지 부형태의 길항제일 수 있다. 이러한 화합물은 일반적으로 말하면, 과다 복용 중독이나 부작용에 책임이 있는, RAR 수용체 부형태에 대해 길항제가 효과를 미치는 경우 이용 가능하다. 이와 관련하여 일반적으로 말하면, 아래 설명된 공동 주입 에세이에서 화합물이 수용체 조정 리포터 유전자의 전사 작용을 유발하지 않지만 Kd값이 1μM 이하인 수용체에 결합하는 경우 임의의 수용체 부형태의 길항제로 고려된다.
화합물이 RAR 길항제이므로 본 발명에 따라 사용될 수 있는지는, 다음의 에세이에서 검사될 수 있다.
RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ, RXR-α 수용 부형태의 어고니스트형 활성을 시험하며, Feigner P. L. 및 Holm M. Focus Vol 11, No. 2(1989)에 의해 발간된 저작물에 근거하여 키메릭 수용체 트랜색티베이션 에세이가 1994년 8월 18일자 공고된 PCT 출원 번호 WO94/17796에 상세히 설명되어 있다. 이 공보는 1993SUS 2월 11일자 출원된 미국 특허 출원 번호 08/016,404에 대응하며, 이것은 미국 특허 번호 5,455,265로 특허되어 있다. 화합물은, 본 발명의 이용시 RAR 길항제로서 작용하기 위해서는, 임의의 수용체 부형태 (RAR -α, RAR-β, 및 RAR-γ)를 통해 리포터 유전자의 작용을 유발하지 않아야 한다.
본 발명의 화합물의 길항제/어고니스트형 활성, 또는 몇가지 레티노이드 수용체 부형태에 결합하는 능력을 측하는 홀로리셉터 트랜색티베이션 에세이 및 리간드 결합 에세이가 PCT 출원 번호 WO93/11755(특히 페이지 30-33 및 37-41)에 기재되어 있다. 홀로리셉터 트랜색티베이션의 설명은 이하와 같다.
홀리리셉터 트랜색티베이션 에세이
CV1 세포(5,000 세포/웰)는 헤이만 등 Cell 68 : 397-406의 황화 칼슘 과정으로 자동화된 96 웰 포맷으로 RAR 리포터 플라즈미드 MTV-TREp-LUC(50 ng)로 감염된다. RAR-α, 및 RAR-γ 트랜섹티베이션 에세이에 대해서는, 적당한 RXR 표현 벡터(10ng)와 함께 RXR-반응 리포터 플라즈미드 CRBPII-tk-LUC(50ng)이 헤이만 등과 알레그레토 등의 J. Biol. Chem. 268 : 26625-26633에서 설명한 바와 같이 사용된다. RAR-β 트랜색티베이션 에세이에 대해서는, RAR-β 표현 벡터(10mg)와 함께 RXR 반응성 리포터 플라즈미드 CPRE-tk-LUC(50mg)을 사용한다. 이들 리포터는 각각 인간의 CPBPII로부터의 DRI 요소와 프로모터로부터의 특정한 CRI 요소를 함유한다. β-갈락토시다제(50ng) 표현 벡터는 주입시 내부 대조로서 사용되어 주입 효율의 변형을 평준화한다. 세포는 6시간 동안 세배로 주입되고, 뒤이어 36시간 동안 레티노이드로의 인큐베이션하여, 루시페라제와 β-칼락토시다제 활성을 위해 추출물이 에세이된다. 홀로리셉터 트랜색티베이션에 대한 상세한 과정은 상술한 헤이만 등과 알레그레토 등에 설명되어 있다. 이 에세이에서 얻은 결과는 이들이 또한 키메릭수용체 트랜색티베이션 에세이에 있기 때문에, EC50번호로 표현된다. 리간드 결합 에세이의 결과는 Kd번호로 표시된다.
화합물은 홀로리셉터 트랜색티베이션 에세이에서는, 본 발명에서 사용되는 RAR 길항제로서 작용되기 위해서는, 임의의 수형체 부형태 (RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ)를 통해 리포터 유전자의 작용을 유발해서는 안 된다. 동일한 수용체 부형태가 화합물에 의해 활성화되지 않는다면, 결합된 수용체 부형태의 길항제로서 작용할 수 있도록 하기 위해서 Kd를 1 마이크로몰러(Kd>1μM) 미만일 때 적어도 하나의 RAR 수영체 부형태에 화합물은 결합해야 한다.
표 3 은 홀로리셉터 트랜색티베이션 에세이의 결과를 표 4는 이 에세이에서 특정 예시의 화합물에 대해서, 모든 트랜스 레틴산에 대한 시험 화합물의 효율을 설명한다. 표 5는 본 발명의 특정 예시된 화합물의 리간드 결합 에세이의 결과를 나타낸다.
표 3에서 0.0은 이 에세이에서 모든 트랜스 레니노이드산 보다 20% 이하로 덜 활성적인 화합물을 나타낸다.
표 5에서 0.0은 1000nM 보다 더 큰 값을 나타낸다.
표 3, 4, 5에서 요약된 시험 결과로부터 알 수 있은 바와 같이, 여기에 표시된 예시의 화합물은 RAR 수용체 부형태의 길항제이지만, RXR 수용체 부형태에 친화력을 갖지 않는다. (본 발명의 다른 화합물은 모두가 아닌 약간의 RAR 수용체 부형태의 길항제이고 나머지 RAR 부형태의 어고니스트일 수 있다.) 이 특성으로 인해, 본 발명의 화합물은 생물학적 어세이에서 RAR 어고니스트이 활성을 차단하는 데에 사용될 수 있다. 인간을 포함하는 포유 동물에서는, 본 발명의 화합물이 RAR 어고니스트로 공동 투여될 수 있으며, 바람직하게는 RAR 어고니스트의 역효과를 바람직할 수 있다. 본 발명의 화합물은 높은 수준의 비타민 A를 함유하는 특정 물고기나 동물의 간의 소화로 인해 그리고 비타민 A제의 과다 복용으로 인한, 비타민 A 과다복용, 급성 또는 만성을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 과다 비타민 A 증후군(두통, 피부 벗겨짐, 골절 중독)으로 관찰되는 중독은 다른 레티노이드로 관찰되는 중독과 유사하거나 동일한 것은 잘 알려져 있는데, 이는 일반 생물학적 원인, 즉 RAR 활성을 암시한다. 본 발명의 화합물은 RAR 활성을 방지하기 때문에, 상술한 중독을 치료하는 데에 적당하다.
본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물이 피부에 국소적으로 투여될 때, RAR 어고니스트 레티노이드로 유도된 피부 염증을 방지할 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 화합물이 피부에 국소적으로 투여되어, RAR 어고니스트 화합물이 투여된 환자나 동물들의 피부 염증을 방지한다. 본 발명의 화합물은 미리 존재하는 레티노이드 중독으로부터의 회복을 가속화하며, 공동 투여된 레티노이드로 인한 하이퍼트리클리세리데미아를 방지하며, RAR 어고니스트 (레티노이드)에 의해 유도된 골절 중독을 차단할 수 있다.
일반적으로 말하면, 본 발명에 따라 포유 동물에의 치료를 위한 도포시, 길항제 화합물은 유발성 요인이 중단된 후에, 과도 복용이나 장기간의 노출로 인한 비타민 A, 비타민 A 전구체의 해독제 또는 레티노이드 중독의 해독제로서 전체적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 다르게는, 레티노이드가 치료에 도움을 주도록 하는 경우와, 공통 투여된 길항제가 레티노이드의 하나 이상의 부작용을 완화하거나 제거하는 경우, 길항제 화합물이 본 발명에 따른 레티노이드 약품이 공동 투여된다. 이 형태의 도포시 길항제는 위치 지정 방식, 예를 들어 공동 투여된 레티노이드가 전체적으로 주어지는 동안 크림이나 로션을 국소적으로 도포하여 투여된다.
본 발명에 따른 도포를 위해서는, 길항제 화합물은 본 기술에 잘 알려진 제약학적으로 허용가능한 부형제 및 부형제를 사용하여, 테블릿, 필, 캡슐, 솔루션, 서스팬션, 크림, 오인트먼트, 젤, 연고, 로션 등과 같은 제약적인 합성물에 결합된다. 예를 들어 국소적 형성을 마련은, 레밍턴의 약제 과학, 에디션 17, 맥 발간사, 이스톤, 펜실바니아에서 잘 기술되어 있다. 국소적 도포를 위해서는, 길항제 화합물이 또한 분말이나 스프레이, 특히 에어로졸 형태로 투여될 수 있다. 약품이 계통적으로 투여되게 되면, 분말, 필, 태블릿 등으로 또는 구강 투여에 적합한 시럽으로 조제될 수 있다. 정맥내 또는 복강내의 투여를 위해서는, 길항제 화합물이 주사 투입될 수 있는 솔루션 또는 서스팬션으로 마련된다. 특정 경우에는, 주입으로 길항제 화합물을 형성하는 것이 유용할 수 있다. 또한 특정 경우에는, 피부 아래의 침전 또는 관절 내 주사를 위한 좌약 형상이나 확장 해제 형상의 길항제 화합물을 형성하는 것이 유용할 수 있다.
길항제 화합물은 본 발명에 따른 유효 투여량으로 투여될 것이다. 이 농도는 특정 상태의 저감에 효과적이거나 그 확장으로 지연시키는 농도로 한다. 본 발명에 따른 레티노이드 유도 중독 또는 부작용을 막기 위해 길항제 화합물을 투여할 때, 길항제 화합물이 피부 염증과 같은 특정 상태의 발생을 방지하기 위한 예방 차원으로 사용된다.
유용한 예방 차원의 농도는 상태에 따라 그리고 치료받는 상태의 심각도나 환자의 치료 적응도에 따라 다르다. 따라서, 하나의 온도가 균일하게 사용되지 않고, 치료되고 있는 만성이나 급성 레티노이드 중독 또는 그 관련 상태의 특성에 따라 변형이 필요하다. 이러한 농도는 루틴 실험으로 거쳐 얻을 수 있다. 그러나, 밀리리터 당 길항제 화합물을 0.01과 1.0 밀리그램 사이로 함유하는 형상이 국소 도포에 유효한 농도를 구성한다. 계통적으로 투여되면, 하루에 체중 1kg 당 0.01과 5mg 사이의 양이 치료 결과에 효과적인 것으로 예측된다.
RAR 어고니스트 유도 중독의 방지 또는 치료를 위한 RAR 길항제의 이용에 기본적인 것은 RAR 어고니스트에 의한 수용체의 활성를 방지하는 것이다. RAR 길항제의 두 가지 도포 사이의 주된 차이는 레티노이드 중독의 존재나 부재이다. 대부분의 예는 레티노이드 중독을 방지하기 위해 레티노이드를 사용하는 것이지만, 여기에서 설명하는 일반적인 방법은 레티노이드 중독의 치료를 위해 도포되는 것이다.
레티노이드 중독 및/또는 레티노이드 약품의 부작용을 방지 또는 치료하기 위해 RAR 길항제의 사용을 검증하는 실험
[실시예 1]
국소 도포된 어고니스트에 의해 유도된 피부 염증을 국소 도포된 길항제로 치료한다.
AGN 191183으로 지정된, 화합물 4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]벤존산이 RAR 어고니스트로서 종래 알려져 있다. ('AGN' 번호는 화합물의 식별을 위해 본 발명의 양도인에 의해 이용되는 지정된 참조 번호이다.)
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(페닐)-2-나트탈레닐)에티닐]벤존산(AGN 192869, 또한 지정된 화합물 60a)이 화합물로 이하 그 제조를 설명한다. 이 화합물은 RAR 길항제이다.
국소적으로 투여된 RAR 어고니스트, AGN 191183으로 유도된 피부 염증은 털이 없는 쥐에 또한 투여되는 RAR 길항제, AGN 192869로 차단될 수 있다.
더욱 특별하게는 피부 염증이 피부 벗겨짐이나 찰상의 매일 평가로 반정량적인 값으로 측정된다. 숫자, 즉 국소적 염증 점수는 실험 도중 동물에 유도된 피부 염증을 말한다. 국소적 염증 점수는 다음과 같이 계산된다. 국소적 염증 점수는 복합 벗겨짐 스크오와 복합 찰상 점수의 합이다. 복합 스크어는 벗겨짐 및 찰상에 대해 0-9 및 0-8의 범위에 각각 있으며, 최대 심각도, 발발 시기, 및 평균 심각도가 고려된다.
높은 점수는 심각도가 높은 것으로 하면, 벗겨짐의 심각도는 5점으로 찰상의 심각도가 4점으로 스크어된다. 복합 점수의 최대 심각 성분은 관찰 도중에 임의의 동물에 주어진 하루중 최대 심각도 점수일 수 있다.
발발 시기의 점수에 대해서는, 0 내지 4에 이르는 스크오가 다음과 같이 지정된다.
삼각도 2 이상의 벗겨짐이나 찰상이 나타나는 시기
(날짜) 발발시기 점수
8 0
6-7 1
5 2
3-4 3
1-2 4
평균 심각도의 점수는 관찰 날짜로 나눈 매일의 벗겨짐이나 마찰의 합이다. 약품 화합물은 첫 치료시 효과를 낼 가능성이 없기 때문에, 치료 첫날이 계산되지 않는다.
복합 벗겨짐과 마찰 점수를 계산하기 위해서는, 평균 심각도와 발발 시가 점수를 합하여 2로 나눈다. 이 결과를 최대 심각도 점수에 더한다. 복합 벗겨짐과 마찰 점수는 전체 국소 염증 점수를 제공하도록 더해진다. 각 동물은 국소적 염증 점수를 받아, 일군의 동물의 개별 점수의 평균 ±SD로서 나타낸다.
암컷의 털이 없는 쥐 [Crl : SKH1-hrBR] (생후 8-12주, n=6)이 아세톤, AGN 193109, AGN 192869, 또는 AGN 192869와 191183의 결합으로 5일 연속하여 국소적으로 치료된다. 각 화합물의 투여량은 표 7과 같다. 치료는 총량 4ml/kg(~0.1ml)로 피부에 도포된다. 쥐는 마지막 치료, 즉 8일 후 3일째 까지 벗어짐과 찰상이 매일 관찰된다.
실시예 1의 국소적 염증 점수를 표 7에서 나타낸다. 1.5mg/kg/d(그룹 F)의 투여량의 아세톤 (부형제)이나 AGN 192869 (길항제)은 관찰 가능한 국소적 염증을 유발한다. AGN 191183, RAR 어고니스트는 1.025mg/kg/d의 투여량에서 완만한 국소적 염증을 유발한다. 그러나, AGN 191183 유도 국소적 염증은 AGN 192869에 의해 투여량에 좌우되는 방식으로 방지되고, AGN 192869을 50배 몰 과다로 염증이 거의 완전히 없어진다. 이것은 국소적 RAR 길항제가 국소적 RAR 어고니스트에 의한 피부 염증을 차단하는 것을 증명한다. RAR 어고니스트 유도성 피부 염증의 완전 차단은 RAR 길항제가 화합물 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤존산 (AGN 193109, 또한 화합물 60으로 도포시 지정)과 같이 효력이 있을 때 길항제 대 어고니스트의 몰 비율을 낮게 하여 성취된다.
[실시예 2]
구강 도포된 어고니스트에 의해 유도된 피부 염증의 국부적으로 도포된 길항제로차단된다.
효력이 있는 RAR 어고니스트 AGN 191183(4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]벤존산) 및 효력이 있는 RAR 길항제 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤존산(AGN 193109, 화합물 60)이 실시예에서 사용되고, 실험 동물(쥐)의 체중이 RAR 어고니스트 노출의 마터로 사용된다.
암컷 털 없는 쥐 (생후 8-12주, n=6)의 그룹이 옥수수 기름이나 옥수수 기름(5ml/kg)에 부유된 AGN 191183(0.26ml/kg)의 삽관법으로 치료된다. 쥐는 동시에 부형제 (97.6% 아세톤/2.4% 디메틸설퍼사이드)이나 부형제(6ml/kg)내의 AGN 193109의 솔루션으로 등 피부 상에 국소적으로 치료된다. 여러 치료 그룹에 대한 특정 투여량을 표 8에서 나타낸다. 4일 연속하여 매일 투여한다. 쥐는 마지막 치료 후 1일 째 까지 실시예 1에서 설명한 바와 같이 국소적 염증 이 나타난다. 퍼센트 체중 변화는 초기 체중으로 나눈 초기 중량(하루째)으로부터 최종 중량(5일째)를 나누고, 100%를 곱하여 계산한다. 국소적 염증 점수는 실시예 1에서 설명한 바와 같이 계산한다.
여러 그룹에 대한 국소적 염증 점수와 중량 손실을 표 8에서 나타낸다. 국소적 및 구강 부형제, 즉 아세톤 및 옥수수 기름과 함께 치료하면 국소적 염증이나 체중 손실을 유발하지 않는다. 유사하게, 구강 부형제와 국소적 길항제 AGN 193109로의 치료는 국소적 염증이나 체중 손실을 유발하지 않는다. 구강 AGN 191183 자체가 체중 손실과 피부 염증을 유도한다. AGN 191183 유도된 피부 염증은 적은 양의 AGN193109와 결합할 때 감소되며 많은 양의 AGN 193109에 의해 차단되지만, 차단은 완전하지 않다. 따라서, AGN 193109의 피부 중독을 차단하는 것이 바람직하다. 낮은 레벨의 AGN 193109은 계통적으로 흡수되므로 AGN 193109에 의해 유도된 체중 손실을 부분적으로 차단한다. 그러나, 이러한 흡수는 인간과 같이 침투성이 낮은 피부를 갖는 종에게는 덜 나타난다. 다르게는, AGN 193109에 의한 체중 손실 방지는 AGN 193109 유도된 피부 염증의 완화에 기인될 수 있다.
따라서, 실시예 2는 국소적으로 투여된 RAR 길항제가 구강 투여된 RAR 어고니스트에 의해 유도된 피부 염증을 바람직하게 차단하는 데에 사용될 수 있는 것을 증명한다.
[실시예 3]
국소적으로 도포된 길항제는 존재하던 레티노이드 중독으로부터의 회복을 가속화한다.
이 실시예에서는, 중량 손실이 RAR 어고니스트 AGN 191183에 의한 국소적 치료로유도된 다음에 시험 동물이 부형제이나 RAR 길항제 AGN 193109로 국소적으로 치료된다.
암컷 털이 없는 쥐 (생후 8-12주, n=5)이 2일 동안 매일 부형제 (97.6% 아세톤/2.4% DMSO, 4ml/kg)내의 AGN 193109 (0.13mg/kg/d)로 국소적으로 치료된다. 이들 동일한 쥐의 그룹의 3일째에 시작하여 3일 연속하여 매일 부형제이나 부형제(4ml/kg)내의 AGN 193109 (0.13mg/kg/d)로 국소적으로 치료된다. 1-5일째와 8일째에 쥐의 체중을 단다. 체중은 평균 ±SD로 표현된다. 언페어의 투-테일드 t-테스트를 이용하여 평균을 통계학적으로 비교한다. 차이는 P<0.05로 상당한 것으로 보인다.
실시예 3에서 체중의 시간 경과를 표 9에서 나타낸다. 두 그룹의 쥐의 체중은 1일과 2일 째에 AGN 191183 치료의 결과로서 2일과 3일째에 평행하게 저하된다. 그러나, AGN 193109 치료는 4일과 5일째에 부형제 치료에 상대적으로 체중이 상당히 증가한다. 이들 데이타는 AGN 191183 유도된 체중 손실로부터의 회복이 AGN 193109로의 뒤어은 치료에 의해 가속된다는 것을 나타낸다. 체중의 8일째 두 그룹의 쥐 사이가 다르지 않는데, 이는 두 그룹에서 임의의 충분한 시간 내에 완전히 회복이 성취될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, RAR 길항제는 RAR 어고니스트 유도형 중독이 RAR 길항제 치료 이전에 있는 경우에도, 즉 RAR 어고니스트 중독 시나리에서도, RAR 어고니스트 유도형 독소를 경감하는 데에 효과적이다.
[실시예 4]
구강 투여된 길항제는 구강 공동 투여된 레티노이드 어고니스트에 의해 유도된 하이퍼트라이클리세리디데미아를 차단한다.
5-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸나프탈렌-2-일)프로펜-1-일]-2-티오펜카르복실산이 공지된 RAR/RXR 팬-어고니스트로서 AGN 191659로 지정된다. 이 화합물은 쥐의 급성 하이퍼트라이클리세리데미아를 유도하는 데에 사용되며, AGN 193109 화합물 60이 공동으로 구강 투여되어 AGN 191659 유도된 하이퍼트라이클리세리데미아를 차단한다.
숫컷 피셔 쥐(생후 6-7주, n=5)는 옥수수 기름(부형제), AGN 191659, AGN 193109 또는 AGN 191659와 AGN 193109의 결합의 삽관법으로 치료된다. AGN 191659 및 AGN 193109는 옥수수 기름 내의 미세 부유물로 주어진다. 투여량을 포함하는 실험을 표 10에서 나타낸다.
이산화탄소 마취하에서 하위 대정맥으로부터 혈액을 회수한다. 세럼이 저속의 원심 분리로 혈액에서 분리된다. 전체 세럼 트라이클리세리드가 한 용구로서 상용되는 표준 분광 광도계 종단점 에세이로 측정된다. 세럼 트라이클리세리드 레벨은 평균 ±SD로 표현된다. 평균은 중요한 차이를 찾으면 더넷의 시험에 따른 한 방향의 분석으로 비교된다. 차이는 P<0.05에서 중요한 것으로 보인다.
표 10에서 나타낸 바와 같이, AGN 191659 자체는 부형제 치료에 상대적으로 세럼 트라이클리세리드의 증가를 유발한다. AGN 193109 자체는 세럼 트라이클리세리드를 증가시키지 않는다. 중요하게는, 1 : 1 및 5 : 1의 몰 비율로 AGN 193109 및 AGN 191659의 결합한 것은 대조와 상당히 다르지 않은 레벨로 세럼 트라이클리세리드를 감소시킨다.
실시예 4는 RAR 길항제가 공통 투여된 레티노이드에 의해 유도된 하이퍼트라이클리세리데미아를 차단하는 데에 사용될 수 있음을 보여준다.
[실시예 5]
비경구적으로 도포된 길항제는 비경구적으로 공동 투여된 레티노이드 어고니스트에 의해 유도된 골절 중독을 차단한다.
실시예 5는 RAR 길항제가 RAR 어고니스트에 의해 유도된 골절 중독을 차단할 수 있음을 보여준다. 이 예에서는, 구니아 돼지에서, AGN 193109이 공통 투여된 RAR 어고니스트, AGN 191183에 의해 유도된 골단판 밀폐를 막는데에 사용된다.
숫컷 하틀리 구니아 돼지 (생후~3주, n=4)의 그룹은 부형제 (20% 디메틸설폭사이드/80% 폴리에틸렌 글리콜-300), AGN 191183 (0.06mg/ml), 또는 AGN 193109 (0.34mg/ml)와 결합한 AGN 191183 (0.06mg/ml)으로 비경구적으로 주입된다. 침투 펌프는 14일 동안 연속적으로 시간 당 ~5㎕를 운송하도록 설계된다.
동물은 주입 후 14일 후에 이산화탄소 질식으로 안락사된다. 남은 경골이 10% 버퍼된 포말린 내에 놓는다. 경골은 3-4일 동안 의산/포말린 수용액에의 노출로 디캘시화되고, 파라핀부를 마련한다. 표준적인 방법으로 헤마톡실린과 에오신으로 뼛조각이 착색된다. 경골 골단판이 검사되어 밀폐되거나 밀폐되지 않는 것으로 점수 매겨진다. 골단판 밀폐는 골단 성장판 연골의 연속성의 중단으로 정의된다.
네 개의 부형제 치료된 구니아 돼지중 어떤 것도 실험 종료 까지 골단판 밀폐를 나타내지 않는다. 이것은 구니아 돼지 경골의 가장 먼 골단판이 동물이 적어도 생후 10개월일 때 까지 보통 밀폐되지 않기 때문에 기대된다. AGN 191183 치료된 구니아 피그 네마리 모두는 부분 또는 완전 골단판 밀폐를 나타낸다. 그러나, AGN 191183과 AGN 193109의 결합으로 치료된 구니아 피그 모두는 골단판 밀폐를 보이지 않는다. 따라서, 5배 몰 초과의 AGN 193109는 이들 화합물이 비경구적으로 공동투약될 때 AGN 191183 유도된 골절 중독을 완전히 차단한다.
RAR 길항제 화합물
화합물4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤존산(AGN 193109, 화합물 60)및 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤존산(AGN 192869, 화합물 60a)가 본 발명에 따라 RAR 수용체를 차단하기 위한 상술한 동물 시험에서 사용되는 RAR 길항제의 예이다. 다음의 화학식의 화합물이 본 발명에 따라 사용되는 부가의 RAR 길항제 화합물의 일반 예이다.
[화학식 1]
화학식 1에서 X는 S, O, NR'이고 여기에서 R'은 H 또는 1 내지 6 탄소의 알킬이고,
X는 [C(R1)2]n 이고 여기에서 R1은 H 또는 1 내지 6 탄소의 알칼이고, n은 0 또는 1이고;
R2는 수소, 1 내지 6 탄소의 하측 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 1 내지 6 탄소의 플루오루 치환 알킬, OH, SH, 1 내지 6 탄소의 알콕시, 또는 1 내지 6 탄소의 알킬티오이고;
R3은 수소, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬 또는 F이고;
m은 0-3의 값을 갖는 정수이고;
o는 0-3의 값을 갖는 정수이고;
Z는 -C≡C-,
-N=N-,
-N=CR1-,
-CR1=N,
-(CR1=CR1)n여기에서 n'은 0-5의 값을 갖는 정수이다.
-CO-NR1-,
-CS-NR1-,
-NR1-CO,
-NR1-CS,
-COO-,
-OCO-,
-CSO-,
-OCS-,
Y는 페닐 또는 나프틸군 또는 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸일, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸일로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 헤테로아릴이고, 상기 페닐 및 헤테로아릴군은 하나 또는 두개의 R2군으로 선택적으로 치환될 수 있고,
Z가 -(CR1=CR1)n'-이고 n'이 3, 4, 또는 5이면 Y는 상기 (CR1=CR1)n'군과 B사이의 직접 원자가 결합을 나타낸다.
A는 (CH2)q이고 여기에서 q가 0-5이고, 3-6 탄소를 갖는 하측 분기된 체인일킬, 3-6 탄소를 갖는 시클로알킬, 2-6 탄소 및 1 또는 2개의 이중 결합을 갖는 알케닐, 2-6 탄소와 1 또는 2개의 삼중 결합을 갖는 알키닐;
B는 수소, COOH 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2R11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O, 또는 삼중 하측 알킬실릴, 여기에서 R7는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알킬기, 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 시클로알킬기 또는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알케닐기이고, R8은 1 내지 10 탄소의 알킬군 또는 알킬군이 1 내지 10 탄소 또는 5 내지 10 탄소의 시클로알킬군을 갖는 트리메틸실릴알킬이거나, R8은 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 1 내지 10 탄소의 알킬군이거나, 5-10 탄소의 시클로알킬군이거나, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R11은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐, R12는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이고, R13은 2-5 탄소의 이가 알킬 라디칼이고,
R14는 (R15)-페닐, (R15)-나프틸, 또는 (R15)-헤테로아릴이고 여기에서 헤테로아릴군은 2 내지 9개의 탄소를 함유하고, O, S, 및 N로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3 헤테로원자를 가지며, r은 0-5의 값을 갖는 정수이고,
R15는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, 및 1 내지 10 탄소를 갖는 알킬군, 1 내지 10 탄소를 갖는 플루오르 치환 알킬, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3의 이중 결합을 갖는 알케닐군, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3개의 삼중 결합을 갖는 알키닐군, 또는 알킬군이 독립적으로 1 내지 6 탄소를 갖는 트라알킬실일 또는 트라알킬시릴록시군이다.
합성 방법-아릴 치환 화합물
식 1의 예시된 RAR 길항제 화합물은 여기에서 설명되는 합성 화학 경로로 만들어질 수 있다. 합성 화학 물질은 여기에서 설립된 조건이 화학식 1로 나타낸 모든 화합물로 일반화될 수 있는 특정 실시예이다.
[반응 기구 1]
[반응 기구 1 (연속)]
반응 기구 1은 화학식 1의 화합물의 합성을 설명하는 것으로 여기에서 Z그룹은 에티닐 기능(-C≡C-)이고 X는 [C(R1)2]n이고 여기에서 n은 1이다. 다시 말해, 반응 기구 1은 본 발명의 에티닐 치환 디히드로나프탈렌 유도체의 합성을 설명한다. 이 기구에 따르면, 테트라히드로나프탈렌-1-화학식 6의 하나의 화합물이 화학식 7의 브로모 유도체를 제공하도록 브롬화된다. 화학식 6의 화합물은 화학식 1에 관련하여설명되는 바와 같이, 원하는 R1, R2, 및 R3치환제를 이송한다. 화학식 6의 화합물의 바람직한 예는 3,4-디히드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논이다. 1-보로모-3-페닐프로판으로부터 이 화합물을 합성하는 바람직한 루트는 본 출원의 실험 부분에서 설명한다.
화학식 7의 화합물은 (트리메틸실일)에티닐-치환 3,4-디히드로-나프탈렌-1(2H)-하나의 화학식 8의 화합물을 제공하도록 (트리메틸실일)아세텔렌과 반응된다. (트리메틸실일)아세텔렌과 반응은 통상 불활성 가스(아르곤) 분위기에서 산 수용체(트리에틸아민)인 식 Pd(PPh3)2Cl2를 갖는 적당한 촉매인, 제 1 구리 요드의 존재시 고온(약 100℃)하에서 실행된다. 통상의 반응 시간은 약 24시간이다. (트리메틸실일)에티닐-치환 3,4-디히드로-나프탈렌-1(2H)-화학식 8의 하나의 화합물이 다음에 에티닐 치환된 3,4-디히드로-나프탈렌-1(2H)-화학식 9의 하나의 화합물을 제공하기 위해서, 메타놀과 같은 알코올 솔벤트내의 염기(수소화 포타슘 또는 탄화 포타슘)과 반응한다. 식 9의 화합물은 통상 불활성 가스(아르곤) 분위기에서 트리에틸아민과 같은 산 수용체인, 식 Pd(PPh3)2Cl2를 갖는 적당한 촉매인, 제 1 구리 요드의 존재시 방향성 또는 헤테로방향성 리전트 X1-Y(R2)-A-B'(화학식 10)과 결합된다. 다르게는, 화학식 9의 화합물의 아연 염(또는 다른 적당한 금속 염)이 Pd(PPh3)4또는 유사한 것의 존재시 화학식 10의 리전트와 결합될 수 있다. 통상, 리전트 X1-Y(R2)-A-B'(화학식 10)과의 결합 반응은 실온이나 약간 상승된 온도에서 실행된다. 일반적으로 말해서, 에티닐아릴 유도체 또는 그 아연 염과 할로겐 치환 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 사이의 결합이 미국 특허 번호 5,246,456에서 설명된다. 화학식 11의 화합물은 본 발명의 예시적인 화합물의 전구체 또는 B'그룹에서 보호되는 유도체이고, 보호 그룹이 본 기술에서 잘 알려진 반응으로 이들로부터 제거될 수 있다. 화학식 11의 화합물은 본 기술에서 잘 알려진 반응 및 변형으로 예시된 화합물의 다른 전구체로 변환될 수 있다. 이러한 반응은 '동조체 및 유도체'로의 변환으로 반응 기구 1에서 나타낸다. 몇가지 예시의 화합물의 합성으로 구체화된 이러한 변환은 에스테르 그룹 (B와 B'가 에스테르임)의 비누화되어 자유 카르복실산과 그 염을 제공한다.
화학식 10의 할로겐 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 화합물은 일반적으로 말해서 본 기술에 잘 알려진 반응으로 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 예는 4-요오드벤젠산의 에스테르화에 의해 성취될 수 있는 에틸 4-요드벤조화이다. 다른 예는 에스테르화에 뒤이어, 6-클로로니코틴산에 대해 할로겐 교환 반응을 실행하여 성취될 수 있는 에틸 6-요오드니코틴화이다. 더욱 일반적으로 말하면, 화학식 11의 화합물의 유도와 그 후에 화학식 9의 화합물로 반응할 수 있는 화학식 10의 아릴 및 헤테로아릴 화합물의 합성에 관련하여, 다음의 잘 알려진 주원리 및 합성 방법을 이용할 수 있다.
카르복실산은 염화 수소 또는 염화 티오닐과 같은 산 촉매의 존재시 적당한 알코올의 용액 내에 산을 리플럭싱하여 에스테르화된다. 다르게는, 디사이클로헥실 카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재시 적당한 알코올로 응축될 수 있다. 에스테르는 종래의 수단으로 정화된다. 아세틸 및 케텔은 Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, p.810에 지술된 방법으로 용이하게 제조된다. 알코올, 알데히드 및 케톤 모두는 McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 및 Pretecting Groups, Ed. Greene, John Wiley ＆ Sons, 1981에 기술된 것과 같은 공지된 방법에 의하여 각각 에테르 및 에스테르, 아세텔 또는 케텔을 각각 형성하여 보호될 수 있다.
반응 기구 1의 결합 반응 전에 화학식 10의 화합물의 n의 값을 증가시키기 위해서는, 방향성 또는 헤테로방향성 카르복실산이 Arndt-Eistert 조건 또는 다른 호모로게이션 과정하에서 연속 처리로 호모로게이션된다. 다르게는, 카르복실산이 아닌 유도체가 적당한 공정에 의해 또한 호모로게이트될 수 있다. 호모로게이트된 산은 이전 문단에서 말한 일반적인 공정으로 에스테르화된다.
A가 하나 이상의 이중 결합을 갖는 알케닐인 화학식 10의 화합물(또는 중간물이나 예시된 화합물)은 실제의 유기 화학자에게는 잘 알려진 합성 기수에 의해 제조될 수 있다; 예를 들어, 위티그(Wittig) 및 유사한 반응에 의해, 또는 알파-할로-아릴알킬-카르복실산, 에스테르 또는 유사한 카르복알데히드로부터 하롤겐을 제거한 이중 결합의 도입으로 제조될 수 있다. A 그룹이 삼중 결합인 화학식 10의 화합물은 리튬 디이소프로필아미드와 같은 강한 염기를 갖는 대응하는 방향성 메틸 케톤의 반응, 디에틸 클로로인산염과의 반응 및 뒤이은 리튬 디이소프로필아미드의 첨가로 제조될 수 있다.
화학식 11의 화합물로부터 유도된 산과 염은 대응하는 에스테르로부터 용이하게 얻을 수 있다. 알칼리 금속 염기와의 기본 비누화로 산을 제공하게 된다. 예를 들어, 화학식 11의 에스테르는 예를 들어, 수산화 리튬 또는 수산화 포타슘의 염기의 3몰 과다로, 실온에서의 불활성 분위기하에서 알카놀과 같은 폴라 솔벤트에 용해될 수 있다. 용액은 15와 20시간 사이로 연장된 시간 동안 종래의 수단에 의해 교반되고, 냉각, 산화 및 가수 분해질이 회수된다.
아미드는 대응하는 에스테르 또는 카르복실산으로부터 본 기술에 공지된 적당한 아미드화로 형성될 수 있다. 이러한 화합물을 만드는 한 방법은 산을 염화산으로 전환한 다음에 수산화 암모늄 또는 적당한 아민을 갖는 화합물을 처리하는 것이다.
알코올은 대응하는 산을 염화 티오닐을 갖는 염화 산으로 또는 그 외 수단(J. March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGrau-Hill Book Company)으로 변환한 다음에, 염화산을 붕산화 소듐으로 환원하여 제조된다. 다르게는, 에스테르는 감온에서 수소화 리튬 알루미늄으로 환원될 수 있다. 윌리암슨 반응 조건하에서 적당한 알키 할로겐화물로 이들 알코올을 알킬화하면 대응하는 에테르를 제공하게 된다. 이들 알코올은 산 촉매 또는 디클로헥실카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재시 적당한 산과 반응하여 에스테르로 변환될 수 있다.
알데히드는 염화 메틸렌 내의 피리디늄 이크로메이트(corey, E. J., Schmidt, G., Ter. Lett. 399, 1979) 또는 염화 메틸렌 내의 디메틸 설폭사이드/염화 메틸렌 내의 염화 옥사일(Omura, K., Swern. D., Tetrahedrom 34 : 1651(1978)과 같은 산화제를 이용하여 대응하는 일차 알코올로부터 마련된다.
케톤은 알킬 그리그나드 리전트 또는 산화에 뒤이은 유사한 리전트로 알데히드를처리하여 적당한 알데히드로부터 제조될 수 있다.
아세탈 또는 케탈은 March, Ibid, p.810에서 기술된 방법으로 대응하는 알데히드 또는 케톤으로부터 제조될 수 있다.
B가 H인 화학식 10의 화합물은 대응하는 할로겐화된 방향성 또는 헤테로 방향성 화합물로부터 제조될 수 있고, 바람직하게 할로겐은 I이다.
다시 반응 기구 1을 보면, 화합물 11의 화합물은 저온(-78℃ 및 0℃)에서 테트라히드로푸란과 같은 불활성 에테르형 솔벤트 내의 소듐 비스(트리메닐실릴)아미드 및 2-[N,N-bis(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘과 반응한다. 이것은 통상 비분리된 소윰 염 중간물을 화학식 12로서 괄호로 나타낸 반응 기구 1에서 나타낸다. 반응은 화학식 13에서 나타낸 트리플루오로메틸설포닐옥시가 결과된다. (Tf=SO2CF3). 화학식 13의 화합물은 아릴 또는 헤테로아일 화합물 R14H로부터 유도된 유기 금속 유도체와의 반응에 의해 화학식 14에서 나타낸 본 발명의 예시 화합물로 변환되어, 유기 금속 유도체의 화학식은 R14Met, 바람직하게는 R14Li가 된다. (R14는 화학식 1에 따라 정의됨) 유기 금속 유도체, 바람직하게는 화학식 R14Li의 리튬 유도체가 통상 염화 아연(ZnCl2) 및 테트라키스(트리페닐포스파인)-팔라듐(O) (Pd(PPh3)4)의 존재시 불활성 에테르형 솔벤트에서 실행된다. 유기 리튬 리전트 R14Li는 상용되지 않는다면, 본 기술의 알려진 관행에 따라서 에테르형 솔벤트내에 화합물 R14H(또는 할로겐 유도체 R14-X1, 여기에서 X1은 할로겐)로부터 제조될 수 있다. 리전트 R14Li와 화학식 13의 화합물 사이의 반응에 대한 온도 범위는 일반적으로 말해 약 -78℃에서 50℃의 범위에 있다. 화학식 14의 화합물은 상술한 반응에 따라서 다른 동종체와 유도체로 변환될 수 있다.
반응 기구 1에서 나타낸 중간물 7-브롬-테트라히드로나프탈렌-1-하나의 화학식 7의 혼합물이 또한 식 R14MgBr(R14는 화학식 1에 따라 정의)의 그리그나드(Grignard) 리전트로 변환될 수 있다. 3가 알코올은 산에 의한 처리로 탈수되어 화학식 16의 3,4-디히드로-7-브롬나프탈렌 유도체를 공급하고, 이것은 본 발명의 부가적인 화합물(반응 기구 6, 7, 및 8)의 합성의 중간물이 된다.
[반응 기구 2]
반응 기구 2를 참조하면, 이들 화합물의 합성 경로가 화학식 1에 관련하여 설명되고 여기에서 X는 S, O 또는 NR'이고 Z그룹은 에티닐 기능(-C≡C-)이다. 반응 순서에서 시작 물질은 화학식 17에서 나타낸 구조의 브롬페닐, 브롬티오페닐 또는 브롬아닐린이다. 본 명세서를 간략화하기 위해서, X는 벤조티오피란 유도체의 제조를 위해서 일차적으로 설퍼로 할 수 있다. 그러나 여기에서 설명된 기구가 또한 당업자에게 명백하게 되는 변형과 함께 벤조피란(X=0) 및 디히드로키놀린(X=NR')의 제조에 적당한 것을 염두에 두어야 한다. 따라서, 화학식 17의 화합물, 바람직하게는파라 브롬티오페닐, 파라 브롬페닐 또는 파라 브롬아닐린이 화학식 18의 3-브롬 카르복실산과 기본 조건하에서 반응된다. 이 반응 기구에서 기호는 화학식 1과 관련하여 설명된 의미를 갖는다. R3이 수소인 화학식 18의 리전트에 대한 일 예는 3-브롬프로피오닉산이다. 화학식 18의 3-브롬카르복실산과의 반응으로 화학식 19의 화합물이 된다. 후자는 산에 의한 처리로 순환되어 6-브로모티오크로만-4-하나의 유도체(X는 S) 또는 화학식 20의 6-브롬크로만 유도체(X는 0)을 생성한다. 화학식 20의 브롬 화합물은 동일한 조건 하에서 동일한 반응 순서를 거치는데, 이것은 화학식 7의 브롬 화합물을 본 발명의 화합물로 변환하는 반응 기구 1에서 설명한다. 따라서, 여기에서 간단히 요약한 바아 같이, 화학식 20의 브롬 화합물은 (트리메틸실일)아세틸렌과 반응하여, 6-(트리메틸실일)에티닐 치환 티오크로만-4-one 또는 화학식 21의 크로만-4-one 화합물을 제공한다. 화학식 21의 6-(트리메틸실일)에티닐 치환 티오크로만-4-one 화합물은 염기(수산화 포타슘 또는 탄화 포타슘)과 반응하여 화학식 22의 에티닐 치환 6-에티닐 치환 티오크로만-4-one 화합물을 제공한다. 화학식 22의 화합물은 반응 기구 1과 동일한 반응으로 설명된 것과 동일한 조건하에서 방향성 또는 헤테로방향성 리전트 X1-Y(R2)-A-B'(화학식 10)과 결합된다.
화학식 23의 화합물은 소듐 비스(트리메틸실일)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오르메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘과 반응 기구 1에서 설명한 유사한 반응과 동일한 조건하에서 반응하여, 화학식 24에서 나타낸 4-트리플루오르메틸설포닐옥시 벤조티오피란 또는 벤조피란 유도체를 만든다. 화학식 24의 화합물은 반응 기구 1에 따라 설명한 바와 같이, 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기금속 유도체와의 반응에 의하여, 화학식 25에서 나타낸 화합물로 변환된다.
반응 기구 1의 중간물인 화학식 7의 7-브롬-테트라히드로나프탈렌-1-one 화합물의 사용과 동일하게, 중간물 6-브롬티오크로만-4-화학식 20의 하나의 화합물이 반응 기구 6, 7, 및 8에서 후술하는 바와 같이, 본 발명의 영역 내의 다른 화합물의 제조에 사용될 수 있다. 화학식 25의 화합물은 반응 기구 1과 관련하여 설명한 반응에서 다른 동종체와 유도체로 변환된다.
[반응 기구 3]
반응 기구 3은 화학식 1에 관련하여 X는 [C(R1)2]n이고, n은 0이고 Z 그룹은 에티닐 기능(-C≡C-)인 화합물에 대한 합성 루트를 개시한다. 이 기구에 따라서, 화학식 26의 6-브롬-2,3-디히드로-1H-인덴-1-one 유도체가 반응 기구 1 및 2과 관련하여 설명된 반응과 동일한 반응 순서 (트리메틸실일아세틸렌과의 반응으로 시작)대로 반응하여, 화학식 27-30의 중간물, 화학식 31의 인덴 유도체를 제공한다. 반응 기구 3의 영역 내에서의 바람직한 실시예에서, 시작 물질은 화학 문헌 (Smith 등의 Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123-131)에 따라 유용한 6-브롬-2,3-디하이드-3,3-디메틸-1H-인덴-1-one이다. 6-브롬-2,3-디히드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-one과 같은 화학식 26의 화합물이 상술한 바와 같이, 본 발명에 이용되는 다른 예시의 화합물의 합성에 사용될 수 있다.
[반응 기구 4]
반응 기구 4를 참조하여, 화학식 1에 따라 Z=-(CR1=CR1)n'이고, n'은 3, 4, 또는 5이고, Y는 (CR1=CR1)n'그룹과 B 사이의 직접 원자가 결합을 나타내는 예시의 화합물의 합성 경로를 설명한다. 이 합성 경로는 X그룹이 [C(R1)2]n이고 n이 1 (디히드로나프탈렌 유도체)일 때의 예로 설명된다. 그렇지만, 반응 기구 4에서 설명되는 반응과 합성 방법이 또한 X가 S, O, NR(벤조티오피란, 벤조피란 또는 디하이드키놀린 유도체) 또는 [C(R1)2]n이고 n이 0(인덴 유도체)인 유도체에 적용 가능하고 당업자에게는 변형이 명백하다는 것을 이해해야만 한다.
반응 기구 4에 따르면, 1, 2, 3, 4-화학식 32의 테트라히드로나프탈렌 유도체는 프리델 크래프트 조건하에서 염화산(R1COCl)과 반응하고, 최종의 아세틸화된 것은 예를 들어 Jones 산화 반응에서 산화되어, 동소체 6- 및 7-아세틸-1(2H)-화학식 23의 나프탈렌 유도체를 생성한다. 이 반응의 바람직한 예에서는, 화학식 32의 개시 화합물은 본 출원의 실험부에서 설명되는 공정에 따라 제조될 수 있는 1, 2, 3, 4-테트라히드로-1, 1-디메틸나프탈렌(임의의 화합물)이다. 7-아세틸-1(2H)-화학식 23의 나프탈레논 유도체가 산의 존재시 에틸렌 글리콜과 반응하여, 환외 케톤 성분의 옥소 기능을 화학식 34의 케탈 유도체로서 보호한다. 화학식 34의 케탈은 그 후에 화학식 R14MgBr(화학식 1과 관련하여 설명됨)의 그리그나드 리전트와 반응하여, 화학식 35의 3가 알코올을 생성한다. 그 후에 디옥솔란(dioxolane) 보호 그룹이 제거되고 3가 알코올이 산에 의한 처리로 탈수되어 화학식 36의 3,4-디히드로-7-아세틸나프탈렌 유도체를 제공한다. 화학식 36의 화합물의 케톤 기능은 화학식 37의 포스포네이트 리전트과 강한 알칼린 조건하에서 아너 에몬스(Horner Emmons)(또는 유사한 것) 반응을 거쳐, 환원후 화학식 38의 알데히드 화합물을 생성한다. 강한 알칼린 조건하에서 화학식 39의 리전트와의 또 다른 아너 에몬스 반응은 화학식 40의 화합물을 제공한다. 후자는 상술한 반응에 따라서 다른 동종체와 유도체로 전환된다. 바람직한 화합물의 제조에 사용되는 화학식 37의 아너 에몬스 리전트의 특정예는디에틸시아노메틸포스포네이트이고; 화학식 39의 아너 에몬스 리전트는 디에틸-(E)-3-에톡시카르보닐-2-메틸알일포스포네이트이다.
[반응 기구 5]
반응 기구 5는 Z그룹이 아조 그룹(-N≡N-)인 화합물을 제조하는 합성 공정을 개시한다. 반응 기구 4에서와 같이 이 공정은 X그룹이 [C(R1)2]n이고 n은 1(디히드로나프탈렌 유도체)인 예로 설명된다. 그렇지만, 설명되는 합성 방법이 또한 본 발명에서 사용되는 모든 아조 화합물, 즉 X가 S, O, NR(벤조티오피란, 벤조피란 또는 디히드키놀린 유도체) 또는 [C(R1)2]n이고 n이 0(인덴 유도체)인 유도체에 적용 가능하고 당업자에게는 변형이 명백하다는 것을 이해해야만 한다. 따라서, 니트로 군은 표준 질화 조건하에서 화학식 6의 개시 화합물로 유도되어, 3,4-디히드로-7-니트로-1(2H)-화학식 41의 나프탈렌 유도체를 생성한다. 후자의 화합물은 3,4-디히드로-7-아미노-1(2H)-화학식 41의 나프탈렌 유도체로 환원된 후에 아조 화합물을 제조하기 위해 보통 이용되는 조건하에서 화학식 ON-Y(R2)-A-B(화학식 43)의 니트로소 화합물과 반응된다. 화학식 43의 니트로서 화합물은 본 기술에 알려진 반응에 따라서 성취될 수 있다. 바람직한 화합물의 합성에 사용되는 화합물의 특정예로는 에틸 4-니트로소벤조에이트이다. 화학식 44의 아조 화합물은 그 후에 소듐 비스(트리메틸실일)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오루메틸설포니)이미노]-5-클로로피리딘과 반응하여 화학식 45에서 나타낸 4-트리플루오르메틸설포닐록시 유도체를 생성한다. 화학식 45의 화합물은 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기 금속 유도체와의 반응에 의하여, 화학식 46에서 나타낸 아조 화합물로 변환된다. 이들 후자의 두 반응, 즉 4-트리플루오르메틸설포닐록시 유도체로의 변환과 뒤이은 유기 금속 유도체와의 반응은 반응 기구 1, 2, 및 3에 따라 상술되었으며 예시된 RAR 길항제 화합물로 만드는 몇가지의 바람직한 합성 공정에서 사용된다.
[반응 기구 6]
반응 기구 6은 화학식 1에 관련하여 Z그룹이 COO- 또는 COMR1(R1은 H가 바람직함)인 화합물을 제조하는 합성 공정을 개시한다. 이들 에스테르 및 아미드 유도체는 반응 기구 1에서 설명된 바와 같이 성취될 수 있는 화학식 16의 3,4-디히드로-7-화학식 16의 브롬나프탈렌 유도체로부터 제조된다. 따라서, 화학식 16의 화합물은 저온에서 테트라히이드로퓨란과 같은 불활성 에테르형 솔벤트에서, t-뷰틸리튬과 같은 강한 염기와 반응되고, 이산화 탄소가 첨가되어 화학식 47의 5,6-디히드로-2-나프탈렌카르복실산 유도체를 제공한다. 화학식 47의 화합물은 X2가 OH 또는 NR1군을 나타내고, R1이 수소인 화학식 X2-Y(R2)-A-B-(화학식 48)의 화합물과 반응된다. 화학식48의 화합물은 본 기술에 따라 성취될 수 있은 아릴 또는 헤테로아릴 히드록시 또는 아미노 유도체임이 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 화학식 47과 화학식 48간의 반응은 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 및 4-디메틸아미노피리딘의 존재시 둘의 결합과 같은, 여러 공지의 에스테르 또는 아미드 형성 조건하에서 실행될 수 있다. 다르게는, 화학식 47의 화합물은 염기 존재시 화학식 48의 화합물과의 결합을 위해 대응하는 염화산으로 변환될 수 있다. 화학식 49의 아미노 또는 에스테르 화합물은 상술한 바와 같이, 다른 동종체 및 유도체로 변환될 수 있다. 반응 기구 6이 화학식 1의 X군이 [C(R1)2]n이고 n이 1(디히드로나프탈렌 유도체)인 예로 도시 및 설명되고 있지만, 여기에 설명된 프로세스는 벤조피란, 벤조티오피란, 디히드키놀린 및 인덴 유도체에도 적용할 수 있다.
화학식 1에서 Z가 -OCO-, -NR1CO, 또한 대응하는 티오에스테르 및 티오아미드 동종체인 본 발명의 화합물을 브롬 기능을 아미노 또는 히드록실 군으로 대체한 화학식 16의 화합물로부터 유도된 중간물로부터 미국 특허 번호 5,324,744의 개시에 따라서 제조할 수 있다.
[반응 기구 7]
반응 기구 7은 화학식 1에 관련하여 Z가 -(CR1-CR1)n'이고 n'이 0인 화합물의 제조를 위한 현재 바람직한 합성 공정을 나타낸다. 화학식 50의 화합물은 화학식 16의 화합물과 화학식 10의 할로 화합물로부터 유도된 그리그나드 리전트 간의 결합 반응에서 성취된다. 결합 반응은 테트라히드로퓨란과 같은 불활성 에테르형 솔벤트내의 아연 염과 니켈 촉매의 존재시 행해진다. 화학식 50의 화합물은 상술한 바와 같이, 다른 동종체와 유도체로 변환될 수 있다.
[반응 기구 8]
반응 기구 8은 Z가 -(CR1-CR1)n'이고 n'이 1인 화합물의 제조를 위한 현재 바람직한 합성 공정을 나타낸다. 더욱 상세하게는, 반응 기구 8은 디히드로나트탈렌 유도체이고 Z그룹이 (-CH≡CH-) 기능을 나타내는 화합물을 제조하기 위한 공정이다. 그러나, 여기에서 설명된 일반 방법은 당업자에게는 명백한 바와 같이, 유사한 벤조피란, 벤조티오피란, 디히드로키놀린 화합물에, 그리고 비닐군이 치환되는 화합물로도 확장될 수 있다. 따라서, 반응 기구 7 및 8에 따라서, 브롬-1(2H)-화학식 7의 나프탈렌 유도체가 불활성 가스(아르곤) 분위기에서 화학식 Pd(PPh3)을 갖는 적당한 촉매의 존재시 구조 -CH2=CH-Y(R2)-A-B(화학식 51)의 비닐 유도체와 반응한다. 이 반응 조건은 화학식의 리전트와 화학식 9의 아세틸렌 유도체의 결합과 유사하고,이 반응 형태는 헥(Heck) 반응으로서 공지되어 있은 것이다. 화학식 51의 비닐 유도체는 본 기술에 따라 성취될 수 있으며, 본 기술에 사용되는 바람직한 화합물의 합성에 사용되는 리전트의 예로는 에틸 4-비닐벤조에이트가 있다.
헥 결합 반응물은 화합식 52의 에테닐 유도체이고, 이것은 그 후에 소듐 비스(트리메틸실일)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오르메틸설포티)아미노]-5-클로로피리딘으로 처리에 의해 본 발명에서 사용되는 화합물로 변환되어 화학식 53의 4-트리플루오르메틸설포닐옥시 유도체를 생성하고, 뒤이어 상술한 바와 같이 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기 금속 유도체와 반응한다. 결과된 화학식 54의 화합물은 다른 동종체 및 유도체로 변환될 수 있다.
화학식 54의 화합물은 휘티그 또는 아너 에몬스 반응을 이용하는 합성 기구를 통해 성취된다. 예를 들어, 화학식 33의 중간물(반응 기구 4 참조)은 미국 특허 번호 5,324,840에서 유사한 아너 에몬스 반응으로 설명되는 바와 같이, 브롬화 트리페닐포스포늄(위티그) 리전트 또는 더욱 바람직하게는 구조 (EtO)2PO-CH2-Y(R2)-A-B의 디에틸포스포네이트(아너 에몬스)와 반응한다. 방금 설명한 아너 에몬스 반응은 화학식 52의 구조와 유사한 중간 화합물을 제공하고, 화학식 52의 화합물에 대해 반응 기구 8에서 설명한 반응의 순서에 의해 화학식 54의 화합물로 전환된다.
합성 방법-아릴 및 (3-옥시-1-프로펜일)-치환 화합물
화학식 101의 예시된 RAR 길항제 화합물은 여기에서 설명된 합성 화학 경로로 제조된다. 합성 화학자는 여기에 기재한 조건이 화학식 101에 의해 나타낸 어느 화합물에도 일반화될 수 있는 실시예라는 것을 이해할 것이다.
[반응 기구 101]
[반응 기구 101 (계속)]
반응 기구 101은 X가 [C9R1)2]n'이고 p가 제로이고 R17이 H 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기인 화학식 10의 화합물의 합성을 설명한다. 다시 말해, 반응 기구 101은 3,4-디히드로 나프탈렌 유도체인 본 발명의 화합물의 합성을 설명한다. 이 기구에 따르면, R3과 R2군(화학식 101에 관련하여 정의된 것)으로 적당히 치환되는 화학식 103의 테트라히드로나프탈렌 화합물은 개시 물질로서 작용한다. 화학식 103의 화합물의 바람직한 예는 1,3,3,4-테트라히드로-1, 1-디메틸-나프탈렌이고, 이것은 화학 문헌(Mathur 등의 Tetrahidron, 1985, 41:1509)에 기술되어 있다. 1-브롬-3-테닐프로판으로부터 이 화합물의 합성을 위한 경로는 본 출원의 실험부에서 설명된다.
화학식 103의 화합물은 구조 R16CH2COCl(R16은 화학식 101에 관련하여 정의됨)을 갖는 염화산과의 프리델 크래프트형 반응으로 행해진 후에 초산에서 삼산화 크로뮴으로 산성화되어 동소체 6 및 7 아릴 -3,4-디히드-1(2H)-나프탈레논 유도체를 제공한다. 본 발명의 관점에서 관심 있는 6-아크릴 유도체를 반응 기구 101에서 구성식(화학식 104)로 나타낸다. 본 발명의 바람직한 화합물의 제조시 R1군은 메틸이고, R2, R3및 R16은 H이고, 따라서 화학식 104에 따른 중간물은 3,4-디히드로-4,4-디메틸-6-아세틸-1(2H)-나프탈레논이다.
화학식 104의 화합물의 환외 케톤 기능은 예를 들어, 산에서 에틸렌 글리콜로의 처리에 의하여 케탈로서 보호되어, 화학식 105의 1,3-디옥솔아닐 유도체를 제공한다. 화학식 105의 화합물은 다음에 식 R14MgBr(R14는 화합식 101에 관련하여 정의됨)의 그리그나드 리전트와 반응하여 1,2,3,4-테트라히드로-1-히드록시-화학식 106의 나프탈렌 유도체를 제공한다. 화학식 106의 화합물의 환외 케톤 기능은 산에 의한 처리로 보호 제거되어 화학식 107의 화합물을 제공한다.
화학식 105의 화합물로부터 화학식 107의 화합물을 얻는 다른 방법으로는 화학식 105의 화합물을 저온에서(-78℃ 및 0℃) 테트라히드로푸란과 같은 불활성 에테르형 솔벤트에서 소듐 비스(트리메틸실일)아미드 및 2-[N,N-비스(트리플루오르메틸설포니)아미노]-5-클로로피리딘(Tf=SO2CF3)으로 반응하는 것이 있다. 이 반응은 반응 기구 101에서는 나타내지 않은 소듐염 중간물을 거친다. 전체 반응에서 트리플루오르메틸설포닐옥시 유도체가 결과되고, 그 후 아릴 또는 헤테로아릴 화합물 R14H로부터 유도된 유기 금속 유도체와의 반응하여, 유기 금속 유도체의 식은 R14Met, 바람직하게는 R14Li가 된다. (R14는 화학식 1에 따라 정의됨) 유기 금속 유도체, 바람직하게는 화학식 R14Li의 리튬 유도체가 통상 염화 아연(ZnCl2) 및 테트라키스(트리페닐포스파인)-팔라듐(O)(Pd(PPh3)4)의 존재시 불활성 에테르형 솔벤트에서 실행된다. 유기 리튬 리전트 R14Li는 상용되지 않는다면, 본 기술의 알려진 관행에 따라서 에테르형 솔벤트 내에 화합물 R14H(또는 할로겐 유도체 R14-X1, 여기에서 X1은 할로겐)로부터 제조될 수 있다. 리전트 R14Li와 트리플루오르메틸설포닐옥시 유도체 사이의 반응에 대한 온도 범위는 일반적으로 말해 약 -78℃에서 50℃의 범위에 있다.
본 발명의 화합물은 화학식 107의 케톤 화합물과 화학식 108의 알데히드 또는 케톤 사이의 응축 결과로 형성된다. 본 발명의 예시된 화합물의 제조시 화학식 108의 리전트는 4-카르복시벨잘데히드(R17-H)이다. 화학식 108의 영역 내이며 응축반응과 본 발명의 영역 내의 화합물의 합성에 적당한 다른 리전트의 예로는: 5-카르복시-피리딘-2-알데히드, 4-카르복시-피리딘-2-알데히드, 4-카르복시-티오펜-2-알데히드, 5-카르복시-티오펜-2-알데히드, 4-카르복시-푸란-2-알데히드, 5-카르복시-푸란-2-알데히드, 4-카르복시아세토페논, 2-아세틸-피리딘-5-카르복실산, 2-아세틸-피리딘-4-카르복실산, 2-아세틸-티오펜-4-카르복실산, 2-아세틸-티오펜-5-카르복실산, 2-아세틸-푸란-4-카르복실산, 및 2-아세틸-푸란-5-카르복실산이 있다. 후자의 화합물은 화학 문헌에 따르면 유용하다; 예를 들어 Decroix 등의 J. Chem. Res.(S), 4: 134(1978); Dawson 등의 J. Med. Chem. 29:1282(1983); 및 Queguiner 등의 Bull Soc. Chimique de France No. 10 pp. 3678-3683(1969). 화학식 107과 화학식 108의 화합물 간의 응축 반응은 알코올 솔벤트의 염기의 존재시 실행된다. 반응은 수산화 소듐의 존재시 에타놀에서 실행된다. 당업자는 알돌 응축으로서 이 응축 반응으로, 그리고 여기에서 Claisen-Schmidt 반응으로서 기술된 바람직한 예의 경우로 인식할 것이다. (March: Advanced Organic chimistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, pp.694-695 McGraw Hill(1968)을 참조하면 된다) 화학식 109의 화합물은 본 발명의 영역 내에 있으며, 다른 변형 과정을 거쳐 본 발명의 화합물이 결과된다. 다르게는, 화학식 108의 A-B군은 유기 화학자의 기술 내에서 공지되어 있은 특성의 합성 변형 후에만, 화학식 101에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 영역 내에 있은 군일 수 있다. 예를 들어, A-B군에서 실행되는 반응은 보호 해제 단계, 동종화, 에스테르화, 비누화, 아미드 형성 등일 수 있다.
일반적으로 말하면, 화학식 109의 화합물의 데리베티제이션 및/또는 화학식 108의 아릴 및 헤테로아릴 화합물의 합성에 관련하여서는, 다음의 공지된 원리 및 합성론을 이용할 수 있다.
위에서 나타낸 바와 같이, 카르복실산은 염화 히드로겐 또는 염화 티오닐과 같은 산 촉매의 존재시 적당한 알코올의 용액에 산을 리플럭싱하여 에스테르화된다. 다르게는, 카르복실산은 디사이클로헥실카르복디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재시 적당한 알코올로 응축될 수 있다. 에스테르는 March, Advanced Organic Chemistry, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, p.810에 기술된 방법으로 용이하게 제조된다. 알코올, 알데히드 및 케톤은 모두 McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 및 Protection Groups, Ed, Greene, John Wiley ＆ Sons, 1981에서 기술된 것과 같은 공지의 방법으로 각각 에테르 및 에스테르, 아세탈 또는 케탈을 형성하여 보호될 수 있다.
반응 기구 101의 응축 반응을 실해하기 전의 화학식 108의 화합물에서 n의 값을 증가하기 위해서(화학식 108에 대응하는 화합물은 상용되지 않음) 방향성 또는 헤테로방향성 카르복실산은 안드트-이스테르트 조건 또는 그 외 동종화 공정에 의해서 연속 처리에 의해 동종화될 수 있다. 다르게는, 카르복실산이 아닌 유도체은 적당한 공정으로 동종화될 수 있다. 동종화된 산은 이전의 문전의 일반적 공정으로 에스테르화될 수 있다.
A가 하나 이상의 이중 결합을 갖는 알케닐군인 화학식 108의 화합물은 예를 들어, 유기 화학자에게 잘 알려진 합성 기구; 예를 들어 위티그와 유사한 반응에 의해, 또는 알파-할로-아릴알킬-카르복실산, 에스테르 또는 유사한 카르복시알데히드로부터 할로겐을 제거한 이중 결합을 유도하여 이에 의해 제조될 수 있다. A군이 삼중 결합을 갖는 화학식 108의 화합물은 리튬 디이소프로필아미드와 같은 강한 염기를 갖는 대응하는 방향성 메틸 케톤의 반응, 디에틸 클로로포스페이트와의 반응 및 뒤이은 리튬 디이소프로필아미드의 부가로 제조될 수 있다.
화학식 109의 화합물로부터 유도된 산과 염은 응축 반응의 결과로서 또는 대응하는 에스테르로부터 직접 성취될 수 있다. 알칼리 금속계로의 기본적인 비누화는 산을 제공하게 된다. 예를 들어, 화학식 109의 에스테르는 예를 들어, 수산화 리튬 또는 수산화 포타슘의 염기의 약 3몰 과다로, 실온에서 불활성 분위기하에서 알카놀과 같은 폴라 솔벤트에 용해된다. 용액은 15시간과 20시간 사이로 연장된 시간동안 교반되고, 냉각, 산화 및 냉각, 산화 및 가수 분해질이 회수된다.
아미드는 대응하는 에스테르 또는 카르복실산으로부터 본 기술에 공지된 적당한 아미드화로 형성될 수 있다. 이러한 화합물을 만드는 한 방법은 산을 염화산으로 전환한 다음에 수산화 암모늄 또는 적당한 아민을 갖는 화합물을 처리하는 것이다.
알코올은 대응하는 산을 염화 티오닐을 갖는 염화 산으로 또는 그 외 수단(J. March, Advanced Organic Chimistry, 2nd Edition, McGrau-Hill Book Company)으로 변환한 다음에, 염화산을 붕산화 소윰으로 환원하여 제조된다. 다르게는, 에스테르는 감온에서 수소환 리튬 알루미늄으로 환원될 수 있다. 윌리암슨 반응 조건하에서 적당한 알키 할로겐화물로 이들 알코올을 알킬화하면 대응하는 에스테르를 제공하게 된다. 이들 알카올은 산 촉매 또는 디클로헥실카르보디이미드 및 디메틸아미노피리딘의 존재시 적당한 산과 반응하여 에스테르로 변활될 수 있다.
알데히드는 염화 메틸렌 내의 피리디늄 이크로메이트 (Corey, E. J., Schmidt, G., Ter. Lett. 399, 1979) 또는 염화 메틸렌 내의 디메틸 설폭사이드/염화 메틸렌 내의 염화 옥사일 (Omura, K,. Swern, D., Terahedrom 34: 1651(1978))과 같은 산화제를 이용하여 대응하는 일차 알코올로부터 마련된다.
케톤은 알킬 그리그나드 리전트 또는 산화에 뒤이은 유사한 리전트로 알데히드를 처리하여 적당한 알데히드로부터 제조될 수 있다.
아세탈 또는 케탈은 March, Ibid, p.810에서 기술된 방법으로 대응하는 알데히드 또는 케톤으로부터 제조될 수 있다.
[반응 기구 102]
[반응 기구 102 (계속)]
반응 기구 102에 관련하여서는, 본 발명의 화합물의 합성 경로가 설명되는데, 화학식 101에 따라 p는 제로이고, 응축된 링 구조의 방향성부의 R2는 OH이고 R17은 OH이다. 당업자들은 이들 화합물이 에놀 형상의 β-디케톤인 것을 용이하게 인식할 것이다. 반응 기구 102는 또한 p가 1인 본 발명의 화합물의 합성 경로를 설명한다. 당업자들은 후자의 화합물이 플라본인 것을 용이하게 인식할 것이다. 따라서, 이 기구에 따르면, 화학식 110의 1,2,3,4-테트라히드로-6-메톡시나프탈렌-1-one 유도체가 옥소 기능을 게미널 디알킬군 R1R1과 대체하도록 CH2Cl2와 같은 적당한 솔벤트에 사염화 티타늄의 존재시 디알킬 아연(R1Zn)과 반응하여, 화학식 111의 화합물을 생성한다 (여기에서 R1은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이다). 반응 기구 102에 따라 만들어진 본 발명의 화합물의 바람직한 실시에에서는 R3군은 수소이고 R1은 메틸이다. 따라서 디알킬 아연 리전트는 디메틸 아연이고, 화학식 110의 개시 물질은 1,2,3,4-테트라히드로-6-메톡시나프탈렌-1-one이다. 후자의 화합물은 예를 들어, Aldrech Chemical Company에서 시판되고 있다. 화학식 111의 1,2,3,4-테트라히드로-1,2-디알킬-6-메톡시 나프탈렌 유도체가 그 후에 아세트산과 아세트 안히드리드의 삼산화 크로뮴으로 산성화되어 화학식 112의 1,2,3,4-테트라히드로-3,4-디알킬-7-메톡시 나프탈렌 유도체를 제공한다. 화학식 112의 케톤 화합물은 그리그나드 리전트(R14MgBr, R14는 화학식 101과 관련하여 설명)와 반응하여 화학식 113의 1-히드록시-1-아릴-3,4-디히드로-3,4-디알킬-7-메톡시 나프탈렌 유도체를 생성한다. 화학식 113의 히드록시 화합물은 산에서 가열하여 제거되어, 화학식 114의 이히드로나프탈렌 화합물을 생성한다. 메틸군은 CH2Cl2와 같은 적당한 솔벤트에서 3취화 브롬에 의한 처리에 의해 화학식 114의 화합물의 페놀릭 메틸 에테르 기능으로부터 제거된 후, R16CH2CO군을 도입하는 아실화제로 아실화되어, 화학식 115의 화합물을 제공한다. 바람직한 실시예에서는 R16은 H이고, 따라서 아실화제는 염화 아세틸 또는 아세트 무수물이다. 아세틸화 반응은 피리딘과 같은 기본 솔벤트에서 행해진다. 화학식 115의 아세틸화된 페놀 화합물은 온도 상승시 염화 알루미늄과 반응하여, 프라이즈(Fries) 구성이 되게 하여 화합물 116의 1-아릴-3,4-디알킬-3,4-디히드로-6-아크릴-7-히드록시-나프탈렌 화합물을 생성한다. 염화산 리전트 Cl-CO-Y(R2)-A-B(또는 유사한 아크릴제)에서는 기호 Y, R2, 및 A-B가 화학식 101과 관련하여 정의된 의미이다. 이 기구에 따른 본 발명의 바람직한 화합물의 제조시 이 리전트는 ClCOC6H4COOEt이다.
화학식 117의 화합물은 피리딘에서 포타슘 히드록시드와 같은 강한 염기로 반응하여 분자 내의 클라이젠(Claisen) 응축 반응의 결과로 화학식 118의 화합물을 생성한다. 화학식 118의 화합물은 본 발명의 영역과 화학식 101의 영역내에 있으며, 여기에서 응축된 링 성분의 방향성부에서 R2치환제에 대해 OH가 있으며 R17이 OH이다. 상술한 반응과 이전에 설명한 프라이즈 구성에 관련하면 이들 가능한 반응기구가 여기에 기술된 반응을 완전히 설명할 목적으로, 그리고 여기에 설명된 반응을 실행하는 당업자는 작업을 용이하게 하도록 설명된다. 그렇지만, 본 발명은 반응 기구와 원리에 의해 제한되는 것이 아니고 청구범위는 이에 제한되어서는 안된다.
화학식 118의 화합물은 아세트산과 같은 적당한 프로토닉 솔벤트에서 설퍼산과 같은 강산과 반응하여, 화학식 119의 플라본 화합물을 생성한다. 화학식 119의 화합물은 p가 1인 화합물 101의 영역 내인 본 발명의 화합물이다. 화합물 118과 119의 화합물은 반응 기구 101과 관련하여 설명한 바와 같이, 다른 반응 및 변형을 받아 다른 동종체와 유도체를 제공한다. 이것은 동종체와 유도체에의 변환으로서 반응 기구 102에서 나타낸다.
[반응 기구 103]
반응 기구 103에 관련하면, 화학식 101에 따라 X는 S, O 또는 NR'이고, p는 제로이고, R17은 H 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기인 본 발명의 화합물을 만드는 합성 경로를 나타낸다. 그러나, 반응 기구 102에서 나타낸 합성의 일반 원리를 이용하면, 현재 나타낸 합성 공정은 X는 S, O 또는 NR'이고, p는 1이거나, X는 S, O 또는 NR'이고, p는 제로이고, 응축 링 성분의 방향성부의 R2군이 OH이고 R17이 OH인 경우 본 발명의 화합물을 얻기 위해서 당업자에게 변형될 수 있다.
반응 기구의 개시 화합물은 페놀, 티오페놀 또는 화학식 120의 아닐린 유도체이다. 본 바람직한 본 발명의 화합물에서 R2와 R16군은 모두 수소이고, 화학식 120의 개시 화합물은 화학 문헌(Nuyken 등의 Polym. Bull(Berlin) 11:165(1984))에서 알려진 3-에테닐-티오페놀 또는 3-에테닐-페놀이다. 본 명세서를 간략화하기 위해서, X는본 발명의 벤조티오피란 유도체의 제조를 위한 설퍼로 간주할 수 있다. 그러나, 여기에서 설명하는 기구는 또한 본 발명의 영역 내의 벤조피란(X=0) 및 디히드로키놀린(X=NR')의 제조에 적당하고, 당업자는 이런 변형을 용이하게 행할 수 있다. 따라서, 화학식 120의 화합물은 화학식 121의 3-브로모 카르복실산과 기본 조건하에서 반응한다. 이 반응 기구에서 기호는 화학식 101과 관련하여 설명한 의미를 갖는다. R3가 수소인 화학식 121의 리전트의 예는 3-브로모프로피오닉산이다. 화학식 121의 3-브로모카르복실산과의 반응은 화학식 122의 화합물이 된다. 후자는 화학식 123의 7-에테닐-티오크로만-4-one 유도체(X는 S) 또는 7-에테닐-크로만 유도체(X는 O)이다. 화학식 123의 7-에테닐-티오크로만-4-one 유도체 또는 7-에테닐-크로만 유도체는 Pd(Ⅱ)Cl2와 CuCl2의 존재시 산화되어 화학식 124의 대응 7-아크릴(케톤) 화합물을 제공한다. 당업자들은 후자의 반응이 워커 (Wacker) 산화인 것을 알 것이다. 화학식 124의 화합물의 환외 케톤군은 예를 들어 산에서의 에틸렌 글리콜의 처리에 의해서 케탈의 형태로 보호되어, 화학식 125의 1,3-디옥소라닐 유도체를 제공한다. 그 후에 화학식 125의 화합물이 반응 기구 101에서 화학식 105의 화합물로 설명된 것과 유사한 반응의 순서를 거친다. 따라서, 화합물 125의 1,3-디옥소라닐 유도체는 식 R14MgBr의 그리그나드 리전트와 반응하여 벤조티오피란(X는 S), 벤조피란(X는 O)을 제공하고, 이것은 그 후에 산에서 탈수되어 벤조티오피란(X는 S), 벤조피란(X는 O) 또는 화학식 127의 디히드로키놀린(X=NR') 유도체를 제공한다. 화학식 127의 케톤 화합물은 알돌 응축(클라이젠-슈미트)에서 화학식 108의 리전트와 염기 존재시 반응하여 화학식 128의 화합물을 제공한다. 화학식 129의 화합물은 반응 기구 101 및 102에 관련하여 설명한 바와 같이, 동종체 및 유도체로 변환될 수 있다.
2-히드록시-2-메틸-5-페닐펜타인
무수성 Et2O 200㎖의 마그네슘 터닝 13.16g의 혼합물에 Et2O 100㎖의 용액에서 1-브로모-3-페닐 프로판 100.0g(0.492mol)을 첨가한다. 용액 5-10㎖을 첨가한 후에 이 첨가는 그라그나드 리전트의 형성이 진행중일 때 정지한다. 나머지 취화물은 다음에 1시간 동안 첨가된다. 그리그나드 리전트는 35℃에서 20분간 교반된 다음에 31.64g(0.541mol)의 아세톤이 45분 동안 첨가된다. 이 반응은 0℃로 냉각되기 전에 실온에서 밤새 교반되어 20%의 HCl의 첨가로 산성화된다. 수용층은 Et2O(3×200㎖)으로 추출되고 결합된 유기층은 물로 세정되고, MgSO4로 건조되기 전에 수용성 NaCl 포화된다. 감압하에서 솔벤트의 제거와 나머지 63.0g(72%)를 페일-옐로우 오일로 증류, bp 99-102℃/0.5mmHg, 1H NMR(CDCl3): δ 7.28-7.18(5H, m), 2.63(2H, t, j=7.5 Hz), 1.68(2H, m), 1.20(6H, s).
1,2,3,4-테트라히드로-1,1-디메틸나프탈렌
메타네설포닉산 400㎖에 P2O5(55.3g, 0.390mol)의 혼합물은 모든 고형이 용해 될 때까지 아르곤하에서 105℃로 가열된다. 최종 용액은 실온으로 냉각되고 2-히드록시-2-메틸-5-페닐펜테인(63.0g, 0.4354mol)이 천천히 교반하면서 첨가한다. 4시간 후 반응의 아이스 1L상으로 용액을 주의 깊게 부어 냉각된다. 진행중일 때 정지한다.나머지 취화물은 다음에 1시간 동안 첨가된다. 최종 혼합물이 Et2O(4×125㎖)으로 추출되어 결합된 유기층은 물로 세정되고, 수용성 NaHCO3포화되고, MgSO4로 건조되기 전에 수용성 NaCl 포화된다. 감압에 이어 무색 오일로서의 제품 51.0g(90%)의 증류에 의한 용액의 농도, bp 65-67℃/1.1mmHg, 1H NMR(CDCl3): δ 7.32(1H, d, j=7.4Hz), 7.16-1.07(3H, m), 2.77(2H, t, j-6.3 Hz), 1.80(2H, m), 1.66(2H, s), 1.28(6H, s).
3,4-디히드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 A)
빙상 아세트산 350㎖와 아세트 무수물 170㎖의 용액이 0℃로 냉각되고 CrO3, 25.0g(0.25mol)이 적은양 천천히 첨가된다. 최종 혼합물은 120㎖의 벤젠이 첨가되기 전에 30분간 교반된다. 1,2,3,4-테트라히드로-1,1-디메틸나프탈렌이 30㎖ 벤젠에 용액으로서 천천히 첨가된다. 이 첨가 완료후 0℃에서 4시간 동안 교반된다. 이 용액은 H2O(200㎖)로 희석되고, Et2O(5×50㎖)으로 추출된다. 결합된 유기층은 물로 세정되고, 수용성 NaCO3포화되고, MgSO4로 건조되기 전에 수용성 NaCl 포화된다. 감압하에서 솔벤트의 제거 및 제품 16.0g(74%)을 페일-옐로우 오일로서 증류, bp 93-96℃/0.3mmHg, 1H NMR(CDCl3): δ 8.02(1H, dd, j=1.3, 7.8Hz), 7.53(1H, m), 7.42(1H, d, j=7.9Hz), 7.29(1H, m), 2.74(2H, t, j=6.8Hz), 2.02(2H, t, j=6.8Hz), 1.40(6H, s).
3,4-디히드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논(화합물 B)
유효 환류 냉각기와 건조관, 및 첨가 깔대기가 설치된 100㎖의 스리 넥 플라스크에는 AlCl39.5g(71.4mmol)과 3㎖의 CH2Cl2의 혼합물이 충전된다. 3,4-디히드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논(5.0g, 28.7mmol)이 실온에서 혼합물을 교반하면서 한방울씩 첨가된다. 취소, 55.g(34.5mol)이 다음에 매우 천천히 첨가되고, 최종 혼합물이 실온에서 2시간 교반된다. (주의, 교반이 정지되면, 혼합물은 교반 재시작 때까지 70℃로 가열된다. 이 반응은 냉 6M HCl을 천천히 첨가하여 냉각된다. 이 혼합물은 Et2O로 추출되고, 결합된 유기층은 물로 세정되고, 수용성 NaHCO3포화되고, MgSO4로 건조되기 전에 수용성 NaCl 포화된다. 감압하에서 솔벤트의 제거 및 제품 5.8g(80%)을 페일-옐로우 오일로서 증류, bp 140℃/0.4mmHg, 1H NMR(CDCl3): δ 8.11(1H, d, J=3.0Hz), 7.61(1H, dd, J=3.0, 9.0Hz), 7.31(1H, d, j=9.0Hz), 2.72(2H, t, J=6.0Hz), 2.01(2H, t, j=6.0Hz), 1.28(6H, s).
1,2,3,4-테트라히드로-1-히드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 C)
THF 25㎖와 마그네슘 터닝 13.16g의 혼합물에 40브로모톨루엔(5.40g, 31.8mol)의 용액을 두 부분으로 첨가한다. 이 반응은 2㎖의 용액의 첨가로 시작되어, 뒤이어 첨가 깔대기를 거쳐 나머지 용액을 천천히 부가한다. 이 혼합물은 1시간 동안 실온에서 교반된 다음에, 이 용액은 카눌레를 이용하여 제 2 플라스크로 이송된다. 최종 그리그나드 리전트에는 15㎖의 THF에서 용액으로서 3,4-디히드로-4,4-디메틸-7-브로로-1(2H)-나프탈레논(화합물 B)가 첨가된다. 최종 용액은 밤새 리플럭스되도록가열되고, 실온으로 냉각되어, 냉 10%의 HCl의 첨가로 캔칭된다. Et2O의 추출에 이어 H2O을 갖는 유기층이 세정되고 수용성 NaCl 포화된 다음에 MgSO4로 건조된다. 감압하에서 솔벤트의 제거는 칼럼 크로마토그래피 이후에 무색의 제품을 제공하는 오일을 제공한다(hexanes/EtOAc, 96:4). 1H NMR(CDCl3): δ 7.36(1H, dd, J-2.1, 7.6Hz), 7.26(3H, m), 7.12(3H, s), 2,34(3H, s), 2.24-2.04(2H, m), 1.81(1H, m), 1.55(1H, m), 1.35(3H, s), 1.30(3H, s)
3,4-디히드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈레논(화합물 D)
딘-스탁 트랩(Dean-Stark trap)을 갖는 플라스크에는 1,2,3,4-테트라히드로-1-히드록시-1-)4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로로나프탈렌(화합물 C) 3.4g(9.85mmol) 및 벤젠 40㎖가 충전된다. p-톨루엔설포닉산 모노히드레인의 촉매양이 첨가되어 최종 용액이 2시간 동안 리플럭스되도록 가열된다. 실온으로의 냉각시, Et2O가 첨가되고 용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaHCO3포화되고, MgSO4로 건조되기 전에 수용성 NaCl 포화된다. 감압하에서 솔벤트의 제거는 칼럼 크로마토그래피(100% hexane/silica gel)가 무색의 고체로서 타이틀의 화합물을 만든다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.32(1H, dd, J=2.1, 8.2Hz), 7.21(5H, m), 7.15(1H, d, J=2.1Hz), 5.98(1H, t, J=4.7Hz), 2.40(3H, s), 2.32(2H, d, J=4,7Hz), 1.30(6H, s).
7-에티닐-3,4-디히로-4,4-디메틸나프탈렌-1(2H)-one(화합물 E)
트리메틸아민 150㎖에 3,4-디히드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나트탈레논(화합물B) 7g(27.6mmol)의 용액에 비스(트리페닐포스파인)팔라듐(Ⅱ) 클로라이드 0.97g(1.3mmol) 및 제 1 구리 요오드 0.26g(1.3mmol)을 첨가한다. 용액 혼합물은 5분간 아르곤이 부어진 다음에 (트리메틸실일)아세틸렌 39㎖(36.6mmol)이 첨가된다. 이 반응 혼합물은 압력관에 밀봉되어 24시간 동안 미리 가열된 오일 조(100℃)에 놓인다. 반응 혼합물은 다음에 셀라이트(Celite)를 통해 필터되고, Et2O로 세정되고, 바큐(vacuo)에서 여과 집중되어 7-(트리메틸실일)에티닐-3,4-디히드로-4,4-디메틸나프탈렌인-1(2H)-one를 제공한다. 50㎖ 메타놀에의 TMS-아세틸렌 화합물의 수용액은 0.6g(4.3mol)의 KxCO3부가된다. 화합물은 분위기 온도에서 8시간 동안 교반된 다음에 필터링된다. 여과물은 바큐에 집중되고, Et2O로 희석되고, 물, 10% HCl 및 브라인으로 세정되고, MgSO4로 건조되고, 바큐에 집중된다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정화로 표제의 화합물이 백색 고체로 생성된다. PR(CDCl3): δ 1.39(6H, s), 2.02(2H, t, J=7.0Hz), 2.73(2H, t, J=7.0Hz), 3.08(1H, s), 7.39(1H, d, J=8.2Hz), 7.61(1H, dd, J=1.8Hz), 8.14(1H, d, J=9.18Hz)
에틸-4-요오드벤조에이트
100㎖ 에타놀의 4-요오드벤존산 10g(40.32mmol)의 서스팬션에 2㎖ 염화티오닐이 부가된 다음에 3시간 동안 가열된다. 솔벤트는 바큐에서 제거되고 잔류물이 100㎖ 에테르에 용해된다. 에테르 용액은 포화 NaHCO3및 포환 NaCl 용액으로 세정되고 건조된다(MgSO4). 솔벤트는 다음에 바큐에서 제거되고 잔류된 구겔로 (Kugelrohr)가 증류되어(100℃; 0.55mm) 타이틀의 화합물을 무색으로 제공한다. PMR(CDCl3): δ 1.42(3H, t, J~7Hz), 4.4(2H, q, J~7Hz), 7.8(4H).
6-요오드니콘틴산
요오드화 소듐(20.59g, 137.40mmol)은 아르곤하에서 -78℃로 냉각된 다음에 요오드화수소산(97.13g, 759.34mmol)이 첨가된다. 냉각조가 제거되고 서스팬션이 5분간 교반된다. 이 혼합물에 6-클로니콘틴산(22.09g, 140.20mmol)이 부가되고 최종 혼합물은 교반하면서 분위기 온도로 천천히 가열된다. 혼합물은 24시간 동안 125℃에서 리플럭스하도록 가열되고 분위기 온도로 냉각되고 0℃에서 아세톤(500㎖)으로 부어진다. 황색 고체는 여과로 농축되어 1N 수용성 NaHSO3용액 200㎖로 세정된다. 메타놀로부터의 재결정화는 백색 결정으로 타이틀의 화합물을 만든다: mp 177-179℃ [lit. mp. 187-192, Newkome 등의 'Reductimve Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives: J. Org. Cheml 51: 953-954(1986). 1H NMR(DMSO-d6): δ 8.81(1H, J=0.8, 2.4Hz), 8.01(1H, dd, J=0.8, 8.2Hz), 7.91(1H, dd, J=2.4, 8.2Hz)
에틸 6-요오드니콘티노에이트
디클로로메탄(100㎖) 내의 6-요오드니콘틴산(23.38g, 94.20mmol)의 서스팬션 에디클로메탄(250㎖)내의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르복디이미드 히드로클로라이드(19.86g, 103.6mmol)의 용액이 첨가된다. 이 혼합물에는 에타놀(12.40g, 269.27mmol)이 첨가되고 뒤이어 디메틸아미노피리딘(1.15g, 9.41mmol)이 첨가된다.혼합물은 24.5시간 동안 50℃로 가열되고, 바큐에 집중되고, 물(200㎖)로 희석된 다음에 에틸 에테르(550㎖)로 추출된다. 결합된 유기 페이즈가 세정되고 수용성 NaCl로 세정되고 건조되고(MgSO4) 황색 고체로 농축된다. 플래시 크로마토그래피에 의한 정화로 타이틀의 화합물을 백색 고체를 제공한다: mp 48-49℃; 1H NMR(CDCl3): δ 8.94(1H, d, J=2.1(Hz), 7.91(1H, dd, J=2.1, 8.2Hz), 7.85(1H, d, J=8.2Hz), 4.41(2H, q, J=7.1Hz), 1.41(3H, t, J=7.1Hz).
에틸 4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 F)
아르곤 증기로 15분간 플러시된 7-에티닐-3,4-디히로-4,4-디메틸나프탈렌-1(2H)-one(화합물 E) 4g(21.7mmol)의 용액과, 100㎖의 에틸 4-요오드벤조에이트 6g(21.7mmol)의 용액에 5g(7.2mmol)의 비스(트리페닐포스파인)팔라듐(Ⅱ) 클로라이드와 1.4g(7.2mmol)의 제 1 구리 요오드가 첨가된다. 이 혼합물은 5분간 아르곤으로 플러시된 다음에 18시간 동안 분위기 온도에서 교반된다. 이 반응 혼합물은 셀라이트로 필터링되고 여과물은 바큐에서 응축된다. 플래시 크로마토그래피에 의한 정화로 타이틀의 화합물을 백색 니들로 제공한다: PMR(CDCl3): δ 1.41(3H, t, J=7.2Hz), 1.41(6H, s), 2.04(2H, t, J=6.5Hz), 2.76(2H, t, J=6.6Hz), 4.40(2H, q, J=7.2Hz), 7.44(1H, d, J=8.2Hz), 7.59(2H, d, J=8.4Hz), 7.68(3H, dd, J=1.8, 8.2Hz), 8.04(2H, d, J=8.2Hz), 8.15(1H, d, J=1.8Hz).
에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)
THF 5.6㎖ 내의 소듐 비스(트리메킬시일)아미드 291.6mg(1.59mmol)의 냉 용액(-78℃)에는 THF 4.0㎖ 내의 에틸-4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 F)의 용액이 첨가된다. 반응 혼합물은 35분간 -78℃에서 교반된 다음에 THF 4.0㎖내의 5-클로로(2-비스-트리플루오르메틸설포니)이미드의 601.2mg(1.59mmol)의 용액이 첨가된다. 1시간 동안 -78℃에서 교반된 후에, 이 용액은 0℃로 가열되고 2시간 동안 교반된다. 이 반응물은 포화된 수용성 NH4Cl의 부가로 캔칭된다. 이 혼합물은 EtOAc(50㎖)fh 추출되고 결합된 유기층은 5%의 수용성 NaOH, 물 및 브라인으로 세정된다. 유기 페이즈가 Na2SO4로 건조된 다음에 바큐에서 황색 오일로 농축된다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정화로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 만든다.: 1H PMR(CDCl3): δ 8.04(2H, dd, J=1.8, 8.4Hz), 7.60(2H, dd, J=1.8, 8.4Hz), 7.51(2H, m), 7.32(1H, d, J=8.0Hz), 4.40(2H, q, J=7.1Hz), 6.02(1H, t, J=5.0Hz), 2.44(2H, d, J=5.0Hz), 1.43(3H, t, J=7.1Hz), 1.33(6H, s).
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)
4-이티오톨루엔 용액은 t-부틸 리튬 189.0mg(1.74㎖, 2.96mmol)에 의해 THF 2.0㎖dml 4-부로모톨루엔 253.6mg(1.482mmol)의 냉 용액(-78℃)으로 마련된다. 30분간의 교반 후에 THF 3.0㎖의 4-브로모톨루엔 253.6mg(1.977mmol)의 용액이 첨가된다. 최종 용액은 실온으로 가열되고, 30분간 교반되고, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐)에티닐]안식향산염(화합물 G) 472.9mg(0.988mmol)과 THF 4.0㎖ 내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 50mg(0.04mmol)의 용액에 커뉼러를 통해 첨가된다. 최종 용액은 45분간 50℃에서 가열되고 실온에서 냉각되고 염 수용성 NH4Cl로 희석된다. 이 혼합물은 Et2O(40㎖)로 추출되고 결합된 유기층이 물과 브라인으로 세정된다. 유기 페이즈는 MgSO4로 건조되고 바큐에서 황색 오일로 응축된다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정화는 타이틀의 화합물을 무색 고체로 만든다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 1.35(6H, s) 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 2.36(2H, d, J=4.7Hz), 2.42(3H, s), 4.38(2H, q, J=7.1Hz), 5.99(1H, t, J=4.7Hz), 7.35(2H, m), 7.52(2H, t, J=8.5Hz), 7.98(2H, d, J=8.5Hz).
에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-페닐-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1a)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G) 203.8mg(0.43mmol)가 페닐리튬 58.2mg(0.36㎖, 0.69mmol), 염화 아연116.1mg(0.85mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 13.8mg(0.01mmmol)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. PMR(CDCl3): δ 1.36(6H, s) 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 2.37(2H, d, J=4.7Hz), 4.38(2H, q, J=7.1Hz), 6.02(1H, t, J=4.7Hz), 7.20(1H, d, J=1.5Hz), 7.27(1H, m), 7.39(6H, m), 7.52(2H, d, J=8.5Hz), 7.98(2H, d, J=8.2Hz).
에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 2)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 284.800(2.09mmol) 및 THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 3-메틸페닐 리튬을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.99(2H, d, J=8.4Hz), 7.51(2H, d, J=8.4Hz), 7.39-7.14(7H, m), 5.99(1H, t, J=4.7Hz), 74.37(21H, q, J=7.1Hz), 2.60(3H, s), 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.39(3H, d, J=7.1Hz), 1.34(6H, s).
에틸 4-[5,6-디히드-5,5-디메틸-8-(2-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 3)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G) 200.0mg(0.418mmol)가 염화 아연 199.4mg(1.463mmol) 및 THF 4.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 2-메틸페닐 리튬 (2.0㎖의 THF내의 2-메틸브로모벤젠 178.7mg(1.045mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 133.9mg을 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.97(2H, d, j=8.4Hz), 7.50(2H, d, J=8.4Hz), 7.49-7.19(6H, m), 6.81(1H, d, J=1.6Hz), 5.89(1H, t, j=4.5Hz), 4.36(2H, q, J=7.1Hz), 2.43-2.14(2H, dq, J=3.7, 5.4Hz), 2.15(3H, s), 1.29-1.34(9H, m).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 4)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 249.0mg(1.827mmol) 및 THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 3.5-디메틸페닐 리튬(2.0㎖의 THF내의 3,5-디메틸브로모벤젠 249.0mg(1.305mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 167.7mg(1.54㎖, 2.62mmol)를 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.98(2H, d, J=8.4Hz), 7.52(2H, d, J=8.4Hz), 7.40-7.33(2H, m), 7.20(1H, d, J=1.6Hz), 7.00(1H, s), 6.97(2H, s), 5.97(1H, t, J=4.8Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.36(6H, s), 2.34(2H, d, J=4,8Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.37(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-에티페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 5)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 249.0mg(1.827mmol) 및 THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 4-메틸페닐 리튬(2.0㎖의 THF내의 4-에틸브로모벤젠 244.0mg(1.305mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 167.7mg를 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.99(2H, d, j=8.4Hz), 7.51(2H, d, J=8.4Hz), 7.42-7.124(7H, m), 5.99(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, j=7.1Hz), 2.71(2H, q, J=7.6Hz), 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.34(6H,s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-(1,1-디메틸페닐)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 6)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.52mmol)가 염화 아연 142.4mg(1.045mmol) 및 4-테르트-부틸페닐 리튬(1.0㎖내의 THF내의 4-테르트-부틸브로모벤젠 167.0mg(0.78mmol)의 냉수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.5M 수용액)의 100.6mg(0.97㎖, 1.57㎖를 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.99(2H, d, J=8.4Hz), 7.55(2H, d, J=8.4Hz), 7.28-7.45(7H, m), 6.02(1H, t, J=4.9Hz), 4.38(2H, q, J=7.2Hz), 2.36(2H, q, J=4.9Hz), 1.59(3H, s), 1.40(3H, t, J=7.2Hz), 1.39(9H, s), 1.35(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 7)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.52mmol)가 염화 아연 249.0mg(1.827mmol) THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 4-클로로페닐 리튬(2.0㎖의 THF내의 4-클로로-1-브로모벤젠 252.4mg (1.305mmol)의 냉 수용액(-78℃)에테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 167.7mg(1.54㎖, 2.62mmol)를 부가하여 제조) 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.98(2H, d, J=8.4Hz), 7.53(2H, d, J=8.4Hz), 7.40-7.27(6H, m), 7.12(1H, d, J=1.6Hz), 6.00(1H, t, J=4.8Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.35(2H, d, J=4.8Hz), 1.40(2H, t, J=7.1Hz), 1.34(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 8)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 249.0mg(1.827mmol) 및 THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 4-메톡시페닐 리튬(2.0㎖의 TFT내의 4-메톡시-1-브로모벤젠 244.1mg(1.305mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 167.7mg(1.54㎖, 2.62mmol)를 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.98(2H, d, J=8.4Hz), 7.52(2H, d, J=8.6Hz), 7.40-7.21(5H, m), 6.95(2H, d, J=8.7Hz), 5.97(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 4.34(3H, s), 2.34(2H, d, J=4,7Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.34(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오르메틸페닐]-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 9)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 G) 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 249.0mg(1.827mmol), THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 4-트리플루오르메틸페닐 리튬(2.0㎖의 THF내의 4-트리플루오르메틸브로모벤젠 296.6mg(1.305mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 167.7mg(1.54㎖, 2.62mmol)를 부가하여 제조)을 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.98(2H, d, J=8.5Hz), 7.67(2H, d, J=8.3Hz), 7.54-7.36(6H, m), 7.10(1H, d, J=1.6Hz), 6.06(1H, t, J=4.8Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.38(2H, d, J=4,8Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.35(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딘)-2)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 10)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 142.4mg,(1.045mmol) 및 2-리티오피리딘(1.0㎖의 THF내의 2-브로모피리딘 123.8mg(0.784mmol)의 냉수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.5,M 수용액)의 100.6mg(0.97㎖, 1.57mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(d6-아세톤): [δ8.64(1H, m), 7.99(2H, d, J=8.5Hz), 7.85(1H, ddd, J=1.8, 7.7, 9.5Hz), 7.58(2H, d, J=8.4Hz), 7.50(1H, d, J=7.7Hz), 7.47(2H, d, J=1.1Hz), 7.35(2H, m), 6.32(1H, t, J=4.8Hz), 4.34(2H, d, J=7.2Hz), 2.42(2H, d, J=7.4Hz), 1.35(3H, t, J=7.0Hz), 1.35(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 11)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 170.0mg(0.35mmol)가 염화 아연 142.4mg(1.045mmol) 및 3-리티오피리딘(1.0㎖의 THF내의 3-브로모피리딘 123.8mg(0.784mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.5M 수용액)의 100.2mg(0.92㎖, 1.56mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 8.63-8.61(2H, dd, J-1.7Hz), 7.99(2H, d, J=8.4Hz), 7.67(1H, dt, J=7.9Hz), 7.52(2H, d, J=8.4Hz), 7.43-7.34(3H, m), 7.10(1H, d, J=8.4Hz), 7.67(1H, dt, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.40(2H, d, J=4.7Hz), 1.390(3H, t, J=7.1Hz), 1.36(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-메티닐-5-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 12)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G),의 250.0mg(0.522mmol)가 염화 아연 142.4mg(1.045mmol) 및 2-메틸-5-리티오피리딘 (1.0㎖의 THF내의 2-메틸-5-브로모피리딘 134.8mg(0.784mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 100.5mg(0.92㎖, 1.57mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 8.50(1H, d, J=2.2Hz), 7.99(2H, d, J=8.3Hz), 7.56(1H, dd, J=2.3, 8.0Hz), 7.53(2H, d, J=8.4Hz), 7.43(2H, dd, J=2.3, 8.0Hz), 7.37(2H, d, J=7.2Hz), 7.21(1H, d, J=8.1Hz), 7.11(1H, d, J=1.5Hz), 6.04(1H, t, J=4.7Hz), 4.38(2H, q, J=7.2Hz), 2.63(3H, s), 2.38(2H, d, J=4.6Hz), 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 1.35(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-(2,2-디메틸에틸)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 H)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 150.0mg(0.314mmol)가 염화 아연 150.0mg(1.10mmol), THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 3-((2,2-디메틸에틸)디메틸실록시)페닐 리튬 (2.0㎖의 THF내의 3,-(92,2-디메틸에틸)디메틸실록시)브로모벤젠의 226.0mg(0.7847mol)의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 100.2mg(0.92㎖, 1.564mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 7.98(2H, d, J=8.4Hz), 7.51(2H, d, J=8.4Hz), 7.40-7.22(4H, m), 6.95(1H, d, J=7.6Hz), 6.84-6.82(2H, m), 6.00(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=4.7Hz), 2.35(2H, q, J=7.1Hz), 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.34(3H, s) 0.99(9H, s), 0.23(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-4((2,2-디메틸에틸)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 I)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 210.0mg(0.439mmol)가 염화 아연 209.0mg(1.53mmol), THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.02mmol), 및 4-((2,2-디메틸에틸)디메틸실록시)페닐 리튬 (2.0㎖의 THF내의 4-((2,2-디메틸에틸)디메틸실록시)페닐 리튬의 냉 수용액(-78℃)에 테르트-브틸리튬(펜타인 1.7M 수용액)의 140.3mg(1.30㎖, 2.19mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다.1H NMR(CDC13): δ 7.98(2H, d, J=8.4Hz), 7.51(2H, d, J=8.4Hz), 7.39-7.25(3H, m), 7.21(2H, d, J=8.5Hz), 5.87(2H, d, J=8.5Hz), 5.96(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.33(2H, d, J=4.7Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.33(6H, s), 1.01(9H, s), 0.25(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-히드록시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 13)
실온에서 THF 1.0㎖에 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-(2,2-디메틸에틸)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 H) 60.0mg(0.114mmol)의 수용액에 불화 테트라부틸암모늄(THF에서 1M 수용액) 91.5mg(0.35㎖, 0.35mmol)이 부가된다. 밤새 교반한 후, 이 수용액은 EtOAc로 희석되고 H2O로 세정되고 수용성 NaCl로 포화된 후에, MgSO4로 건조된다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 뒤이어 칼럼 크로마토그래피(4:1, 헥산:EtOAc)되어, 무색의 고체인 타이틀의 화합물을 제공한다. 1H NMR(CDC13): δ 7.98(2H, d, J=7.8Hz), 7.52(2H, d, J=8.3Hz), 7.39-7.21(4H, m), 6.93(1H, d, J=7.5Hz), 6.84(1H, d, J=7.1Hz), 6.01(1H, t, J=4.7Hz), 4.91(1H, s), 4.39(2H, q, J=7.1Hz), 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.34(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-히드록시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 14)
실온에서 THF 1.0㎖에 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-((2,2-디메틸에틸)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 I) 50.0mg(0.095mmol)의 수용액에 불화 테트라부틸암모늄(THF에서 1M 수용액) 73.2mg(0.29㎖, 0.29mmol)이 부가된다. 밤새 교반한 후, 이 수용액은 EtOAc로 희석되고 H2O로 세정되고 수용성 NaCl로 포화된 후에, MgSO4로 건조된다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 뒤이어 칼럼 크로마토그래피(4:1, 헥산:EtOAc)되어, 무색의 고체인 타이틀의 화합물을 제공한다. 1H NMR(CDC13): δ 7.98(2H, d, J=8.2Hz), 7.52(2H, d, J=8.3Hz), 7.41-7.20(5H, m), 6.88(2H, d, J=8.4Hz), 5.96(2H, t, J=4.5Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.34(2H, q, J=4.5Hz), 1.39(2H, t, J=7.1Hz), 1.34(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 15)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 264.0mg(0.552mmol)가 염화 아연 150.0mg(1.10mmol), THF 4.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 14mg(0.012mmol), 및 5-메틸티아졸-2-일리튬(5.0㎖의 THF내의 5-메틸티아졸의 82.0mg(0.83mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸리튬(펜타인 1.55M 수용액)의 53.2mg(0.53㎖, 0.83mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 7.99(2H, d, J=7.8Hz), 7.88(1H, d, J=1.5Hz), 7.55(2H, d,J=7.8Hz), 7.54(1H, s), 7.45(1H, dd, J=1.5, 8.0Hz), 7.35(1H, d, J=7.9Hz), 6.48(1H, t, J=4.8Hz), 4.38(2H, q, J=7.1Hz), 2.51(3H, s), 2.38(2H, d, J=4.8Hz), 1.40(3H, s), 1.32(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 15a)
2-리티오티아졸의 수용액은 THF의 1.0㎖에서 티아졸 53.4mg(0.63mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸-리튬(헥산에서의 1.5M 수용액)의 41.2mg(0.42㎖, 0.63mmol)을 첨가하여 제조된다. 이 수용액은 30분간 교반된 다음에 THF의 1.5㎖에서의 염화 아연의 114.9mg(0.84mmol)의 수용액이 첨가된다. 이 최종 수용액은 실온에서 가열되고, 30분간 교반된 다음에 오가노직이 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 200.0mg(0.42mmol)의 수용액에 커뉼러를 통해 첨가된다. 최종 수용액은 45분간 50℃에서 가열되고, 실온으로 냉각된 후 수용액 NH4C1로 희석된다. 이 혼합물은 EtOAc(40㎖)로 추출되고 결합된 유기층은 물과 함수로 세정된다. 유기 상은 Na2SO4에서 건조되어 황색 오일로 시험관 내에 응축된다. 칼럼 크로마토그래피(실리카, 20% EtOAc-헥산)에 의한 정화는 타이틀의 화합물을 무색 오일로서 생성한다. PMR(CDC13): δ 1.35(6H, s), 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 2.42(2H, d, J=4.8Hz), 4.38(2H, q, J=7.1Hz), 6.57(1H, t, J=4.8Hz), 7.33(1H, d, J=3.3Hz), 7.36(1H, d, J=8.0Hz), 7.46(1H, dd, J=1.7, 8.1Hz), 7.55(2H, d, J=8.4Hz), 7.87(1H, d,J=1.7hz), 7.92(1H, d, J=3.3Hz), 8.00(2H, d, J=8.4Hz).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 16)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 295.0mg(0.617mmol)가 염화 아연 168.0mg(1.23mmol), THF 6.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 16mg(0.014mmol), 및 4-메틸티아졸-2-일리튬(6.0㎖의 THF에서의 4-메틸티아졸의 92.0mg(0.93mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸리튬(펜타인 1.55M 수용액)의 59.6mg(0.60㎖, 0.93mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 8.00(2H, d, J=8.4Hz), 7.80(1H, d, J=1.7Hz), 7.55(2H, d, J=8.4Hz), 7.45(1H, dd, J=1.7, 8.0Hz), 7.35(1H, dd, J=8.0Hz), 6.87(1H, d, J=8.0Hz), 6.87(1H, s), 6.52(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.2Hz), 2.54(3H, s), 2.39(2H, d, J=4.7Hz), 1.40(3H, t, J=7.2Hz), 1.33(3H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 17)
에틸 4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염 (화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 200.0mg(0.418mmol)가 염화 아연 110.0mg(0.84mmol), THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 12mg(0.011mmol), 및 4,5-디메틸티아졸-2-일리튬 (2.0㎖의 THF에서의 4,5-디메틸티아졸의 71.0mg(0.63mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸리튬(펜타인 1.55M 수용액)의 40.2mg(0.39㎖, 0.63mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDC13): δ 8.00(2H, d, J=8.4Hz), 7.82(1H, d, J=1.7Hz), 7.54(2H, d, J=8.4Hz), 7.43(1H, dd, J=1.7, 8.0Hz), 7.33(1H, dd, J=80Hz), 6.45(1H, t, J=4.9Hz), 4.38(2H, q, J=7.1Hz), 2.41(3H, s), 2.40(3H, s), 2.37(2H, d, J=4.9Hz), 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 1.32(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸-5-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 18)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-메티닐-5-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 12) 81.7mg(0.194mmol) 및 THF/물(3:1, v/v) 3㎖에서의 LiOH-H2O 40.7㎖(0.969mmol)의 수용액을 실온에서 밤새 교반한다. 이 반응은 포화된 수용성 NH4Cl의 첨가로 켄칭되어 EtOAc로 추출된다. 이 결합된 유기층은 물과 함수로 세정되고, Na2SO4에서 건조되어 배큐에서 응축되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 제공한다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 8.41(1H, d, J=1.9Hz), 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.63(1H, dd, J=2.3, 7.9Hz), 7.59(2H, d, J=8.3Hz), 7.49(2H, m), 7.33(1H, d,J=7.8Hz), 6.95(1H, s), 6.11(1H, t, J=4.5Hz), 2.52(3H, s), 2.37(3H, d, J=4.6Hz), 1.31(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 19)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 10) 80.0mg(0.196mmol) 및 THF/물(3:1, v/v) 3㎖에서의 LiOH-H2O 20.6㎖(0.491mmol)의 수용액을 실온에서 밤새 교반한다. 이 반응은 포화된 수용성 NH4Cl의 첨가로 켄칭되어 EtOAc로 추출된다. 이 결합된 유기층은 물과 함수로 세정되고, Na2SO4에서 건조되어 배큐에서 응축되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 제공한다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 8.64(1H, m), 7.94(2H, d, J=8.3Hz), 7.87(1H, dt, J=1.7, 7.8Hz), 7.58(2H, d, J=8.3Hz), 7.50(1H, d, J=8.2Hz), 7.47(2H, s), 7.37(1H, m), 7.25(1H, s), 6.30(1H, t, J=4.6Hz), 2.39(1H, d, J=4.6Hz), 1.31(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 20)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 2) 30.0mg(0.071mmol) 및 THF 2㎖의 수용액에 NaOH(1.0m 수용액) 28.0mg(0.70mmol, 0.7㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.5Hz), 7.59(2H, d, J=8.5Hz), 7.46(2H, s), 7.32-7.13(4H, m), 7.10(1H, s), 6.98(1H, t, J=4.5Hz), 2.34(3H, s), 2.31(2H, d, J=4.5Hz), 1.30(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 21)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-에틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 5) 47.0mg(0.108mmol) 수용액에 NaOH(1.0m 수용액) 28.0mg(0.70mmol, 0.7㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.59(2H, d, J=8.3Hz), 7.46(2H, s), 7.29-7.21(4H, m), 7.02(1H, s), 60.1(1H, t, J=4.5Hz), 2.64(2H, q, J=7.5Hz), 2.33(2H, d, J=4.5Hz), 1.29(6H, s), 1.22(3H, t, J=7.5Hz).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 22)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메톡시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 8) 80.0mg(0.183mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 40.0mg(1.00mmol, 1.0㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어,Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.60(2H, d, J=8.3Hz), 7.45(2H, s), 7.24(2H, d, J=8.6Hz), 7.02-6.89(3H, m), 5.98(1H, t, J=4,4Hz), 3.79(3H, s), 2.31(2H, d, J=4.7Hz), 1.29(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오르메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 23)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-트리플루오르메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 9) 70.0mg(0.183mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 60.0mg(1.50mmol, 1.5㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.80(2H, d, J=8.1Hz), 7.61-7.47(6H, m), 6.97(2H, s), 6.16(1H, t, J=4.5Hz), 2.37(2H, d, J=4.6Hz), 1.30(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 24)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3,5-디메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 4) 90.0mg(0.207mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 48.0mg(1.20mmol, 1.2㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.2Hz), 7.59(2H, d, J=8.2Hz), 7.45(2H, m), 7.00(1H, s), 6.97(1H, s), 5.97(1H, t, J=4.5Hz), 2.31(2H, d, J=4.5Hz), 1.29(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 25)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-클로로페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 7) 80.0mg(0.181mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 48.0mg(1.20mmol, 1.2㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.60(2H, d, J=8.3Hz), 7.51-7.48(4H, m), 7.34(2H, d, J=8.4Hz), 6.97(1H, s), 6.07(1H, t, J=4.5Hz), 2.34(2H, d, J=4.6Hz), 1.29(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 26)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-피리딜)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 11) 45.0mg(0.110mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 48.0mg(1.20mmol, 1.2㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 8.60(1H, d, J=4.6Hz), 8.55(1H, s), 7.90(1H, d, J=7.5Hz), 7.60(2H, d, J=8.3Hz), 7.51-7.46(3H, m), 6.94(1H, s), 6.14(1H, t, J=4.5Hz), 2.37(2H, d, J=4.5Hz), 1.31(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 27)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 3) 80.0mg(0.190mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 60.0mg(1.50mmol, 1.50㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(DMSO): δ 7.89(2H, d, J=8.4Hz), 7.57(2H, d, J=8.4Hz), 7.46(2H, s), 7.29-7.14(4H, m), 6.59(1H, s), 5.90(1H, t, J=8.4Hz), 2.39(2H, m), 2,60(3H, s), 1.39(3H, s), 1.29(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3-히드록시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 28)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(3((2,2-디메틸페닐)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 H) 40.0mg(0.076mmol) 수용액에 NaOH(1.0M수용액) 40.0mg(1.00mmol, 1.00㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 7.90(2H, d, J=8.3Hz), 7.49(2H, d, J=8.4Hz), 7.35(2H, s), 7.15-7.07(2H, m), 6.77-6.69(3H, m), 5.92(1H, t, J=4.7Hz), 2.25(2H, d, J=4.7Hz), 1.23(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-히드록시페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 29)
EtOH 3㎖ 및 THF 2㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4((2,2-디메틸페닐)-디메틸실록시)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 I) 75.0mg(0.143mmol) 수용액에 NaOH(1.0M 수용액) 60.0mg(1.50mmol, 1.50㎖)가 첨가된다. 이 수용액은 2시간 동안 50℃에서 가열되고, 냉온으로 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 8.01(2H, d, J=8.3Hz), 7.59(2H, d, J=8.4Hz), 7.45(2H, s), 7.20-7.17(3H, m), 6.92-6.89(2H, m), 5.97(1H, t, J=4.7Hz), 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.34(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 30)
실온에서 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 15)(100mg, 0.23mmol) 및 EtOH 4㎖의 수용액에 NaOH(1㎖, 1M, 1mmol)이 첨가된다. 이 수용액은 1시간 동안 50℃에서 가열되고, 배큐에서 응축된다. 잔류물은 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 수용액에 서스팬드되어 1M의 수용성 HCl로 5pH로 산성화된다. 이 층은 분리되어 유기층이 함수로 세정되고, (Na2SO4)에서 건조되고, 필터되고 솔벤트가 감압하에서 제거되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 7.96(1H, d, J=1.7Hz), 7.95(2H, d, J=8.0Hz), 7.65(2H, d, J=8.0Hz), 7.53(1H, d, J=1.7, 8.0Hz), 7.46(1H, d, J=8.0Hz), 6.59(1H, t, J=4.5Hz), 2.50(3H, s), 2.39(2H, d, J=4.5Hz), 1.27(6H, s).
4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸일)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 30a)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 15a) 33.9mg (0.08mmol) 및 THF/물(3:1, v/v) 3㎖에서의 LiOH-H2O 8.5㎖(0.20mmol)의 수용액을 실온에서 밤새 교반한다. 이 반응은 염 수용성 NH4Cl의 첨가로 켄칭되어 EtOAc로 추출된다. 이 결합된 유기층은 물과 함수로 세정되고, Na2SO4에서 건조되어 배큐에서 응축되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 제공한다.
PMR(d6-DMSO): δ 1.29(6H, s), 2.42(2H, d, J=4.6Hz), 6.68(1H, t, J=4.68Hz), 7.51(2H, m), 7.62(1H, d, J=8.2Hz), 7.77(1H, d, J=3.3Hz), 7.93(2H, d,J=8.2Hz), 7.98(1H, d, J=3.3Hz).
4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 31)
실온에서 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 16)(145.0mg, 0.34mmol) 및 EtOH 4㎖의 수용액에 NaOH(1㎖, 1M, 1mmol)이 첨가된다. 이 수용액은 1시간 동안 50℃에서 가열되고, 배큐에서 응축된다. 잔류물은 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 수용액에 서스팬드되어 1M의 수용성 HCl로 5pH로 산성화된다. 이 층은 분리되어 유기층이 함수로 세정되고, (Na2SO4)에서 건조되고, 필터되고 솔벤트가 감압하에서 제거되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 7.94(1H, d, J=8.1Hz), 7.87(1H, d, J=1.6Hz), 7.63(2H, d, J=8.3Hz), 7.50(1H, dd, J=1.6, 8.1Hz), 7.45(1H, d, J=8.1Hz), 7.27(1H, s), 6.58(1H, t, J=4.8Hz), 2.43(3H, s), 2.37(2H, d, J=4.8Hz), 1.26(6H, s).
4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 32)
실온에서 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 15)(58.0mg, 0.13mmol) 및 EtOH 4㎖의 수용액에 NaOH(1㎖, 1M, 1mmol)이 첨가된다. 이 수용액은 1시간 동안 50℃에서 가열되고, 배큐에서 응축된다. 잔류물은 CH2Cl2와 에테르(5:1)의 수용액에 서스팬드되어 1M의 수용성 HCl로 5pH로 산성화된다. 이 층은 분리되어 유기층이 함수로 세정되고, (Na2SO4)에서 건조되고, 필터되고 솔벤트가 감압하에서 제거되어 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 7.94(2H, d, J=8.4Hz), 7.86(1H, d, J=1.6Hz), 7.61(2H, d, J=8.3Hz), 7.50(1H, dd, J=1.6, 8.0Hz), 7.45(1H, d, J=8.0Hz), 6.51(1H, t, J=4.9Hz), 2.37(3H, s), 2.36(2H, d, J=4.6Hz), 1.26(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸-2-티에닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 33)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 170.0mg(0.366mmol)가 염화 아연 202.0mg(1.48mmol), THF 2.0㎖내의 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 24mg(0.022mmol), 및 5-메틸-2-리티오티오펜(2.0㎖의 THF내의 2-메틸티오펜의 89.8mg(0.915mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산의 2.5M 수용액)의 58.6mg(0.36㎖, 0.915mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.00(2H, d, J=8.3Hz), 7.59(1H, d, J=1.7Hz), 7.55(2H, d, J=8.2Hz), 7.43(1H, dd, J=1.7, 8.0Hz), 7.35(1H, d, J=8.0Hz), 6.87(1H, d, J=3.5Hz), 6.74(1H, d, J=2.8Hz), 6.15(1H, d, J=4.8Hz), 4.38(2H, q, J=7.1Hz),2.52(3H, s), 2.32(2H, d, J=4.8Hz), 1.40(3H, t, J=7.1Hz), 1.32(6H, s).
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 33a)
에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오르메틸설포니)옥시-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 G)의 250.0mg(0.52mmol)가 염화 아연 186.8mg(1.37mmol), 테트라키스(트리페닐포스파인)팔라듐(O) 37.1mg(0.03mmol), 및 2-리티오티오펜 ( THF 1.0㎖내의 티오펜 86.5mg(1.03mmol)의 냉 수용액(-78℃)에 n-부틸리튬(헥산의 1.5M 수용액)의 65.9mg(0.69㎖, 1.03mmol)를 부가하여 제조)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. PMR(CDC13): δ 1.33(3H, t, J=7.1Hz), 2.38(2H, d, J=4.7Hz), 4.34(2H, q, J=7.2Hz), 6.25(1H, t, J=7.1Hz), 2.38(2H, d, J=4.7Hz), 4.34(2H, q, J=7.2Hz), 6.25(1H, t, J=4.7Hz), 7.13(2H, m), 7.47(4H, m), 7.62(2H, d, J=8.5Hz), 8.00(2H, d, J=8.5Hz).
4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5-메틸-2-티에닐)-2-나프탈렌일)에티닐]벤조산(화합물 34)
EtOH 3㎖ 및 THF 1㎖에서의 에틸-4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(5메틸-2-티에닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 33) (35.0mg, 0.082mmol) 수용액에 수용성 NaOH(1㎖, 1M, 1mmol)가 첨가된다. 이 수용액은 밤새 실온에서 가열되고, 10% HCl로 산성화된다. EtOAc의 추출에 뒤이어, Na2SO4에서의 건조되고, 감압하에서 솔벤트의 제거로 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 8.03(2H, d, J=8.6Hz), 7.63(2H, d, J=8.6Hz), 7.54-7.48(3H, m), 6.89(1H, m), 6.18(1H, t, J=4.7Hz), 2.49(3H, s0, 2.35(2H, d, J=4.7Hz), 1.32(6H, s).
4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 34a)
4-[5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티아졸)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 30)의 제조를 위해 동일한 일반 공정을 이용하면, 에틸 4-[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(2-티에닐)-2-나프탈렌일(에티닐]안식향산염(화합물 33a)의 70.0mg(0.17mmol)가 H2O에서의 LiOH 17.8mg(0.42mmol)를 사용하여 타이틀의 화합물(무색 고체)로 변환된다. PMR(d6-DMSO): δ 1.27(6H, s), 2.33(2H, d, J=4.9Hz), 6.23(1H, t, J=4.9Hz), 7.14(2H, m), 7.38-7.56(4H, m), 7.61(2H, d, J=8.3Hz), 7.92(2H, d, J=8.3Hz).
5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K)
EtOH 2.0㎖에서의 3,4-디히드로-1-(4-메틸페닐)4,4-디메틸-7-브로로나프탈렌(화합물 D)(250.0mg, 0.764mmol)의 수용액이 -78℃로 냉각되고 t-부틸리튬 1.0㎖(1.68mmol, 펜탄에서의 1.7M 수용액)이 천천히 첨가된다. -78℃에서 1시간 동안 교반된 후 가스 CO2(드라이아이스의 증발로 발생되어, 건조관을 통과)가 1시간 동안 반응을 거쳐 버블된다. 이 수용액은 실온으로 가열되어 반응이 10% HCl로 켄칭된다. EtOAc의 추출에 뒤이어 이 결합된 유기층을 H2O로 세정하고, MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고 헥산으로 고체를 가열하여 타이틀의 화합물을 무색 고체로 얻는다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.94(1H, dd, J=1.8, 8.1Hz), 7.76(1H, d, J=1.8Hz), 7.45(1H, d, J=8.1Hz), 7.24(4H, m), 6.01(1H, t, J=4.7Hz), 2.40(3H, s), 2.36(2H, d, J=4.7Hz), 1.35(6H, s).
에틸-3-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 35)
DMF의 6.0㎖에서의 에틸 4-아미노안식향산염에서의 5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K) 115.0mg(0.70mmol), 1-(3-e디메틸아미노프로필(-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드의 145.0mg(0.76mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘의 92.4mg(0.76mmol)의 수용액이 실온에서 밤새 교반된다. 에틸 아세테이트가 첨가되고, 최종 수용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaHCO3로 포화되고, 이 포화된 수용성 NaCl은 다음에 MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 이 제품은 칼럼 크로마토그래피(10 내지 15% EtOAc/헥산)에 의해 무색 고체로서 분리된다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.02(2H, d, J=8.7Hz), 7.72(2H, m), 7.65(2H, d, J=8.7Hz), 7.52(1H, d, J=1.8Hz), 7.48(1H, d, J=8.0Hz), 7.25(4H, m), 6.15(1H, t, J=7.1Hz), 2.40(3H, s), 2.38(2H, d, J=4.9Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.37(6H, s).
4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 36)
EtOH의 3.0㎖ 및 THF의 4.0㎖에서의 에틸 4-[[5,6-디히드로, 5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 35) 26.5mg(0.06mmol)의 수용액에, 240.1mg의 NaOH(6.00mmol, 2M 수용액의 3.0㎖)가 첨가된다. 실온에서 72시간 동안 교반된 후, 이 반응물은 10% HCl의 첨가로 켄칭된다. EtOAc의 추출, NgSO4에서의 유기층의 건조로, 감압하에서 솔벤트를 제거 후에 고체를 얻게 된다. CH3CN으로부터의 결정화는 무색 고체로서 타이틀의 화합물을 제공한다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 10.4(1H, s), 7.91-7.81(5H, m), 7.54(1H, d, J=8.1Hz), 7.45(1H, d, J=1.7Hz), 7.23(4H, m), 6.04(1H, t, J=4.7Hz), 2.35(5H, s), 1.33(6H, s).
에틸-4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸-페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]옥시]-안식향산염(화합물 37)
DMF의 2.0㎖에서의 에틸 4-아미노안식향산염에서의 5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K) 25.0mg(0.086mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드의 21.4mg(0.112mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘의 12.6mg(0.103mmol)의 수용액이 실온에서 밤새 교반된다. 에틸 아세테이트가 첨가되고, 최종 수용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaHCO3로 포화되고, 이 포화된 수용성 NaCl은 다음에 MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 이 제품은 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)에 의해 연한 황색 고체로서 분리된다. 1H NMR(CDC13): δ 8.08(2H, d, J=8.1Hz), 8.05(1H, dd, J=1.8, 8.1Hz), 7.89(1H, d, J=1.8Hz), 7.50(2H, d, J=8.1Hz), 7.22(5H, m), 6.05(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.39(2H, d, J=4.7Hz), 2.38(3H, s), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.37(6H, s).
2-트리메닐시일레틸 4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]옥시]-안식향산염(화합물 38)
DMF의 4.0㎖에서의 에틸 4-아미노안식향산염에서의 5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K) 76.0mg(0.319mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드의 80.0mg(0.417mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘의 51.0mg(0.417mmol)의 수용액이 실온에서 밤새 교반된다. 에틸 아세xp이트가 첨가되고, 최종 수용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaHCO3로 포화되고, 이 포화된 수용성 NaCl은 다음에 MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 이 제품은 칼럼 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)에 의해 무색의 고체로서 분리된다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.08(2H, d, J=8.8Hz), 8.05(1H, dd, J=1.8, 8.1Hz), 7.50(1H, d, J=8.1Hz), 7.26-7.18(6H, m), 6.05(1H, t, J=4.7Hz), 4.42(2H, t, J=8.4Hz), 2.40(2H, d, J=4.7Hz), 2.39(3H, s), 1.38(6H, s), 0.09(9H, s).
4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]옥시]-벤조산(화합물 39)
THF의 2.0㎖에서의 2-트리메닐시일레틸 4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]옥시]-안식향산염(화합물 38)의 110.0mg(0.213mmol) 및 테트라부틸암모늄 플로라이드의 167.3mg(0.640mmol, THF에서의 1M 수용액 0.64㎖)의 수용액이 실온에서 밤새 교반된다. 에틸 아세테이트가 첨가되고, 최종 수용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaCl로 포화된 다음에 MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 이 잔류 고체를 EtOAc와 CH3CN으로 세정하여 무색의 고체를 얻는다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 8.10(2H, d, J=8.8Hz), 8.06(1H, dd, J=2.0, 8.1Hz), 7.82(1H, d, J=1.9Hz), 7.64(1H, d, J=8.1Hz), 7.35(2H, d, J=8.6Hz), 7.25(4H, m), 6.08(1H, t, J=4.7Hz), 2.42(2H, d, J=4.7Hz), 2.35(3H, s), 1.39(6H, s).
에틸 2-플루오르-4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]옥시]-안식향산염(화합물 40)
DMF의 5.0㎖에서의 5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌카르복실산(화합물 K)의 115.0mg(0.41mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드의 102.0mg(0.53mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘 65.0mg(0.53mmol)의 수용액이 1시간 동안 50℃에서 교반된 다음에 실온에서 밤새 교반된다. 에틸 아세테이트가 첨가되고, 최종 수용액은 H2O로 세정되고, 수용성 NaCl로 포화된 다음에 MgSO4로 건조한다. 감압하에서 솔벤트를 제거하고, 이 제품을 칼럼 크로마토그래피에 의해 무색의 고체로 분리한다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.96(1H, s), 7.89(1H, t, J=8.4Hz), 7.70(2H, m), 7.52(1H, d, J=1.9Hz), 7.45(1H, d, J=8.1Hz), 7.23(5H, m),6.04(1H, t, J=4.8Hz), 4.36(2H, q, J=-7.1Hz), 2.38(3H, s), 2.35(2H, d, J=4.8Hz), 1.39(3H, t, J=7.1Hz), 1.36(6H, s).
2-플루오르-4-[[(5,6-디히드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-벤조산(화합물 41)
EtOH의 3.0㎖ 및 THF의 2.0㎖에서의 에틸 4-[[5,6-디히드로, 5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 40) 41.6mg(0.091mmol)의 수용액에, 40.0mg의 NaOH(1.00mmol, 1M 수용액의 310㎖)가 첨가된다. 실온에서 밤새 교반한 후, 이 반응물은 10% HCl의 첨가로 켄칭된다. EtOAc의 추출, NgSO4에서의 유기층의 건조로, 감압하에서 솔벤트를 제거 후에 고체를 얻게 된다. CH3CN으로부터의 결정화는 연한 황색으로서 타이틀의 화합물을 제공한다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 9.84(1H, s), 7.94-7.83(3H, m), 7.64(1H, dd, J=2.0Hz), 7.53(2H, d, J=8.1Hz), 7.23(4H, s), 6.04(1H, t, J=4.7Hz), 2.38(2H, d, J=4.7Hz), 1.35(6H, s).
에틸4[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 42)
12.0㎖의 벤젠의 121.0mg(0.30mmol)의 [2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3-디티아-2,4-디포스페탄-2,4-2황화물][로웨슨(Lawesson)의 시약]과 110.0mg(0.25mmol)의 에틸4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 35)의 용액이 밤새 리플럭스(reflux)되었다. 실온으로 냉각된 후, 그 혼합물이 필터링되어 감압하에서 여과액이 농축되었다. 황색 고체인 타이틀 화합물이 칼럼 크로마토그래피(10내지 25%의 EtOAc/헥산)에 의해 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.92(1H, s), 8.06(2H, t, J=8.5 Hz), 7.88-7.70(3H, m), 7.42(2H, d, J=8.1Hz), 7.18(4H, m), 6.03(1H, t, J=4.7Hz), 4.37(2H, q, J=7.1Hz), 2.38(3H, s), 2.36(2H, d, J=4.7Hz), 1.56(3H, t, J=7.1Hz), 1.35(6H, s).
4-[[5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산(화합물 43)
2.0㎖의 THF와 2.0㎖의 EtOH의 84.0mg(0.184mmol) 에틸4[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 42)의 용액에 60.0mg의 NaOH(1.50mmol, 1.5㎖의 1M 수용액)을 첨가하였다. 실온에서 밤새 뒤섞은 후, 10%의 HCl을 첨가하여 반응을 제지하였다. 감압하에서 용매를 제거한 후, EtOAc를 추출하고, MgSO4상의 유기층을 건조시켜 고체를 얻었다. CH3CN으로부터의 결정화에 의해 황색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 10.96(1H, s), 8.05(4H, m), 7.72(1H, dd, J=2.0, 8.0Hz), 7.54(1H, s), 7.46(1H, d, J=8.1Hz), 7.20(4H, m), 6.04(1H, t, J=4.7Hz), 2.38(2H, d, J=4.7Hz), 2.33(3H, s), 1.35(6H, s).
2-아세틸-6-브로모나프탈렌(화합물 L)
400㎖의 니트로벤젠의 34.0g(0.255mol)의 알루미늄 염화물과 44.0g(0.212mol)의 2-브로모나프탈렌의 냉(10℃) 혼합물에 21.0g(267mmol)의 아세틸 염화물을 첨가하였다. 뒤섞인 혼합물을 기계적으로 실온까지 가열하고, 18시간 동안 40℃로 가열하였다. 아이스 배스(ice bath)에서 0℃로 냉각한 후, 12 M HCl(70㎖)을 첨가하여 반응을 제지하였다. 층을 분리하고 유기상(organic phase)을 물과 희석 수성 Na2CO3Kugelrohr 증류수로 세정한 후, 10% EtOAc-헥산으로부터의 재결정화에 의해 황갈색 고체인 23g의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.44(1H, br, s), 8.04-8.10(2H, m), 7.85(1H, d, J=8.5Hz), 7.82(1H, d, J=8.8Hz), 7.64(1H, d, J=8.8Hz), 2.73(3H, s).
6-브로모-2-나프탈렌카르복실산(화합물 M)
50㎖ 물의 소듐 수산화물(6.4g, 160.6mmol)과 소듐 치아염소산염(62㎖, 물의 5.25%, 3.6g, 48.18mmol)의 용액에 50㎖의 1,4-디옥산의 2-아세틸-6-브로모나프탈렌(화합물 L) 4g,(16.06mmol)의 용액을 첨가하였다. 황색 용액을 오일 배스에서 70℃로 가열하고, 대기 온도로 냉각한 후, 에틸 에테르(2×50㎖)로 추출하였다. 수성층을 NaHSO3용액으로 희석한 후(Kl 지시 용액이 무색일 때까지), 1N 황산으로 산성화하여(pH<2) 흰색 침전물을 얻었다. 이 혼합물을 에틸 에테르로 추출하고, 화합된 유기상을 포화된 수성 NaCl로 세정하고, 건조시킨 후(MgSO4), 농축시켜 고체인 3.54g(88%)의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(DMSO-d6): δ 8.63(1H, br, s), 8.32(1H, d, J=2.0Hz), 8.10(1H, d, J=8.8Hz), 8.00-8.05(2H, m), 7.74(1H, dd, J=2.0, 8.8Hz).
에틸 6-브로모-2-나프탈렌카르복실레이트(화합물 N)
에타놀(30㎖, 23.55g, 511.0mmol)의 6-브로모-2-나프탈렌카르복실산(화합물 M)3.1g(12.43mmol)의 용액에 18M 황산(2㎖)을 첨가하였다. 이 용액을 30분동안 리플러스하고, 실온으로 냉각하였으며, 펜탄(100㎖)과 물(100㎖)사이에 반응 혼합물을 분리하였다. 수성상(aqueous phase)이 펜탄(100㎖)으로 추출되었으며, 화합유기층이 포화 수성 NaCL(100㎖)로 세정되고 건조(MgSO4) 농축되어 황색이 도는 흰색의 고체를 생성하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카, 10% EtOAc-헥산)에 의한 정화에 의해 흰색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDC13): δ 8.58(1H, br, s), 8.10(1H, dd, J=1.7, 9Hz), 8.06(1H, d, J=2Hz), 7.83(1H, d, J=9Hz), 7.80(1H, d, J=9Hz), 7.62(1H, dd, J=2.9Hz).
에틸(E)-4-[2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 O)
4.0㎖의 트리에틸아민(25분동안 아르곤으로 살포함으로써 가스 제거된)의 510.0mg(2.90mmol)의 에틸 4-안식향산염비닐과 520.0mg(2.00mmol)의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-브로모-1(2H)-나프탈레논(화합물 B)의 용액에 대해 124.0mg(0.40mmol)의 트리스(2-메틸페닐)포스핀을 첨가한 후, 44.0mg(0.20mmol)의 팔라듐(Ⅱ)아세테이트를 첨가하였다. 최종 용액을 95℃로 2.5시간동안 가열하고 실온으로 냉각한 후 감압하에서 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)에 의한 정화에 의해 무색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.19(1H, d, J=2.0Hz), 8.03(2H, d, J=8.4Hz), 7.69(1H, dd, J=2.0, 8.2Hz), 7.57(2H, d, J=8.4Hz), 7.45(1H, d, J=8.2Hz), 7.20(2H, s), 4.39(2H, q,J=7.1Hz), 2.76(2H, t, J=6.5Hz), 2.04(2H, t, J=6.5Hz), 1.41(3H, t, J=7.1Hz, 6H, s).
에틸(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 P)
10㎖의 THF의 440.0mg(2.40mmol)의 소듐 비스(트리메틸시릴)아미드의 냉(-78℃)에 대해 25.0㎖의 THF의 용액과 같이 700.0mg(2.00mmol)의 에틸(E)-4-[2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 O)를 첨가하였다. -78℃에서 1.5시간동안 섞은 후, 960.0mg(2.40mmol)의 2[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-크로로피리딘을 일부에 첨가하였다. 30분 후, 이 용액을 0℃로 가열하고 3시간 동안 섞었다. 포화 수성 NH4Cl을 첨가함으로써 반응을 제지하고 EtOAc로 추출하였다. 화합된 추출물을 5% 수성 NaOH로 세정하고, 건조시킨 후(Na2SO4), 용매를 감압하에서 제거하였다. 칼럼 크로마토그래피(7% EtOAc/헥산)에 의해 무색 고체인 타이틀 화합물이 얻어졌다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.04(1H, d, J=8.4Hz), 7.57(2H, d, J=8.4Hz), 7.52(1H, s), 7.49(1H, d, J=8.0Hz), 6.00(1H, t, J=4.9Hz), 4.39(2H, q, J=7.1Hz), 2.43(2H, d, J=4.9Hz), 1.41(3H, t, J=7.1Hz), 1.32(6H, s).
에틸(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 44)
2.5㎖의 THF의 374.5mg(2.20mmol)의 용액에 대해 130.7mg의 t-부틸리튬(2.04mmol;1.20㎖의 1.7M 펜탄 용액)을 첨가하여 -78℃에서 4-리티오톨루엔의 용액을 마련하였다. 30분 후, 2.0㎖의 THF의 313.4mg(2.30 mmol)의 ZnC12의 용액을 첨가하였다. 최종 용액을 실온까지 데워, 1.25 시간동안 섞은 후, 캐뉼러(cannula)를 거쳐 2.0㎖의 THF의 29.0mg(0.025mmol)의 테트라아키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)과 285.0mg(0.590mmol)의 에틸(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 P)의 용액에 첨가하였다. 최종 용액을 실온에서 1시간동안, 그 후 55℃에서 2시간동안 섞었다. 실온까지 냉각한 후, 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 제지하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였으며, 화합된 추출물을 5% 수성 NaOH와 포화 수성 NaCl로 세정하고, Na2SO4상에서 건조시킨 후, 감압하에서 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)에 의해 무색 고체인 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.96(2H, d, J=8.1Hz), 7.47(2H, d, J=8.1Hz), 7.43-7.16(7H, m), 7.07(1H, d, J=16.3 Hz), 6.93(1H, d, J=16.3Hz), 5.97(1H, t, J=4.7Hz), 4.39(2H, q, J=7.0Hz), 2.41(3H,s), 2.33(1H, d, J=4.7Hz), 1.38(3H, t, J=7.0Hz), 1.33(6H, s).
(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산 화합물 45
4.0㎖의 THF의 64.0mg(0.190 mmol)의 에틸(E)-4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에테닐]-안식향산염(화합물 44)의 용액에 대해 30.0mg의 LiOH(0.909mmol, 1.0㎖의 1.1M 용액)과 1.0㎖의 MeOH를 첨가하였다. 이 용액을55℃로 3시간동안 가열하고, 실온까지 냉각하며, 감압하에서 농축시켰다. 잔여물을 H2O에 용해시키고 헥산으로 추출하였다. 수성층을 10% HCl로 pH 1까지 산성화시키고 Et2O로 추출하였다. 화합된 유기층을 포화 수성 NaCl로 세정하고 EtOAc로 희석하여 순수한 용액을 제공하고 Na2SO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 무색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 7.86(2H, d, J=8.4Hz), 7.66(2H, d, J=8.4Hz), 7.58(1H, dd, J=1.7, 8.1Hz), 7.28(1H, d, J=16.5Hz), 7.23(4H, s), 7.08(1H, d, J=1.7Hz), 7.07(1H, d, J=16.5Hz), 5.97(1H, t, J=4.6Hz), 2.35(3H, s), 2.31(1H, d, J=4.6Hz), 1.29(6H, s).
에틸-4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]-안식향산염(화합물 47)
1.0㎖의 THF의 32.0mg(0.187 mmol)의 4-브로모톨루엔의 용액을 -78℃까지 냉각하고 24.0mg의 t-부틸리튬(0.375mmol), 0.22㎖의 1.7M 펜탄 용액)을 천천히 첨가하였다. 이 황색 용액을 30분 동안 섞고, 이때 29.8mg(0.219mmol)의 ZnCl2를 1.0㎖ THF의 용액으로서 첨가하였다. 최종 용액을 실온까지 데우고 30분 후 1.0㎖ THF의 2.9mg(0.003mmol)의 테트라아키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)과 29.0mg(0.062mmol)의 에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-5-인데닐)에티닐]안식향산염(화합물 FF)을 함유하는 제2 플라스크에 첨가하였다. 최종 용액을 50℃까지 1시간동안 데운 후 실온에서 4시간동안 섞었다. 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 제지한 후 Et2O로 추출하였다. 화합된 유기층을 물과 포화 수성 NaCl로 세정하고,MgSO4상에서 건조시킨 후, 감압하에서 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피(10% Et2O/헥산)에 의해 무색 고체인 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(300MHz, CDCl3): δ 8.03(2H, d, J=8.5Hz), 7.66(1H, s), 7.58(2H, d, J=8.5Hz), 7.50(2H, d, J=8.0Hz), 7.46(1H, d, J=7.9Hz), 7.38(1H, d, J=7.7Hz), 7.28(2H, d, J=9Hz), 6.43(1H,s), 4.40(2H, q, J=7.2Hz), 2.43(3H, s), 1.41(3H, t; + 6H, s).
4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]안식향산(화합물 48)
0.5㎖의 THF/H2O(3:1 v/v)의 10.0mg(0.025mmol)의 에틸-4-[2-(1,1-디메틸-3-(4-메틸페닐)-5-인데닐)에티닐]안식향산염(화합물 47)용액에 대해 5.2mg(0.12mmol) LiOH와 H2O를 첨가하였다. 실온에서 48 시간동안 섞은 후, 이 용액을 헥산으로 추출하고 수성층을 포화 수성 NH4Cl로 산성화하였다. 고체 NaCl을 첨가하고 최종 혼합물은 EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 (Na2SO4)로 건조시키고 감압하에서 농축시켜 무색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(300MHz, d6-DMSO): δ 7.95(2H, d, J=8.3Hz), 7.65(2H, d, J=8.3Hz), 7.57(2H, m, 7.49(3H, m), 7.30(2H, d, J=7.9Hz), 6.61(1H, s), 2.36(3H, s), 1.36(6H, s).
3-(4-브로모티오페녹시)프로피온산
20.0㎖의 가스 제거된 H2O의 1.44g(35.7mmol)의 NaOH의 용액(아르곤으로 살포된)에 대해 6.79g(35.7mmol)의 4-브로모티오페놀을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서30분간 섞었다. 제 2 플라스크를 2.26g(16.3mmol)의 K2CO3와 15㎖의 가스 제거된 H2O로 채웠다. 이 용액에 대해 부분적으로 5.00g(32.7mmol)의 3-브로모프로피온산을 첨가하였다. 최종 칼륨 카르복실레이트 용액을 소듐 티오레이트 용액에 첨가하고, 최종 혼합물을 실온에서 48시간동안 섞었다. 이 혼합물을 필터링하고 여과물을 벤젠으로 추출하고, 화합된 유기층을 디카드(dicard)하였다. 수성층을 10% HCl로 산성화하고 EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 포화 수성 NaCl로 세정하고, MgSO4상에서 건조시키고 감압하에서 농축하였다. 최종 고체가 Et2O-헥산으로부터 재결정화되어 황색을 띤 흰색의 결정인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.43(2H, d, J=8.4Hz), 7.25(2H, d, J=8.4Hz), 3.15(2H, t, J=7.3Hz), 2.68(2H, t, J=7.3Hz).
2,3-디하이드로-6-브로모-(4H)-1-벤조티오피란-4-1
60㎖의 메탄설포닉산의 3.63g(13.9mmol)의 3-(4-브로모티오페녹시)프로피온산의 용액을 75℃로 1.5시간동안 가열하였다. 실온까지 냉각한 후 이용액을 H2O로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 2N 수성 NaOH, H2O, 및 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 황색 고체를 얻었으며, 이로부터 생성물이 칼럼 크로마토그래피(3% EtOAc-헥산)에 의해 엷은 황색 고체로서 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.22(1H, d, J=2.1Hz), 7.48(1H, dd, J=2.1,8.3Hz), 7.17(1H, d, J=8.5Hz), 3.24(2H, t, J=6.4Hz), 2.98(2H, t, J=6.7Hz).
2,3-디하이드로-6-(2-트리메틸실릴레티닐)-(4H)-1-벤조티오피란-4-1
6.0㎖의 Et2NH과 15.0㎖ THF의 78.3mg(0.41mmol)과 1.00g(4.11mmol) 2,3-디하이드로-6-브로모-(4H)-1-벤조티오피란-4-1의 용액을 5분간 아르곤으로 살포한다. 이 용액에 대해 288.5mg(0.41mmol)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 염화물에 이어서 2.0㎖(1.39g, 14.2mmol)의 (트리메틸실릴)아세틸렌을 첨가하였다. 최종 용액을 실온에서 3일간 섞은 후 셀라이트(Celite)의 패드를 통해 필터링하고, 이것을 EtOAc로 세정하였다. 여과물을 H2O와 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조하였다. 칼럼 크로마토그래피(4% EtOAc-헥산)에 의해 오렌지색 오일인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.13(1H, d, J=1.9Hz), 7.36(1H, dd, J=2.1, 8.2Hz), 7.14(1H, d, J=8.2Hz), 3.19(2H, d, J=6.3Hz), 2.91(2H, d, J=6.3Hz), 0.21(9H, s).
2,3-디하이드로-6-에티닐-(4H)-1-벤조티오피란-4-1
15㎖의 MeOH의 100.0mg(0.72mmol) K2CO3와 600.0mg(2.25mmol)의 2,3-디하이드로-6-(2-트리메틸실릴에티닐)-(4H)-1-벤조티오피란-4-1을 함유하는 용액을 실온에서 20시간 동안 섞었다. 이 용액을 H2O로 희석하고 Et2O로 추출하였다. 화합된 유기층을 H2O와 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조하였다. 감압하에서 용매를 제거함으로써 오렌지색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.17(1H,d, J=1.8Hz), 7.40(1H, dd, J=1.8, 8.2Hz), 7.19(1H, d, J=8.2Hz), 3.22(2H, t, J=6.3Hz), 3.08(1H, s), 2.94(2H, d, J=6.3Hz).
에틸 4-[2-(6-(2,3-디하이드로-(4H)-1-벤조티오피란-4-오닐)에티닐]안식향산염
15㎖의 Et2NH과 3㎖ THF의 594.0mg(2.15mmol)의 에틸 4-요오드벤조에이트와 405.0mg(2.15mmol) 2,3-디하이드로-6-에티닐-(4H)-1-벤조티오피란-4-1의 용액을 아르곤으로 15분간 살포하였다. 이 용액에 대해 503.0mg(0.72mmol)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 염화물과 137.0mg(0.72mmol) Cul을 첨가하였다. 이 용액을 20시간동안 실온에서 섞은 후 셀라이트의 패드를 통해 필터링하고 EtOAc로 세정하였다. 감압하에서 용매를 제거함으로써 갈색 고체를 얻었다. 칼럼 크로마토그래피(3% EtOAc-섹산)는 오렌지색 고체인 타이틀 화합물을 제공하였다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 8.15(1H, d, J=2.0Hz), 8.02(2H, d, J=8.5Hz), 7.69(2H, d, J=8.5Hz), 7.61(1H, dd, J=2.1, 8.3Hz), 7.40(1H, d, J=8.2Hz), 4.35(2H, q, J=7.1Hz), 3.40(2H, t, J=6.3Hz), 2.96(2H, t, J=6.3Hz), 1.37(3H, t, J=7.1Hz).
에틸 4-[2-(6-(4-(트리플루어로메틸설포닐)옥시-(2H)-1-벤조티오피라닐)에티닐]안식향산염
-78℃로 냉각된 3.0㎖의 THF의 221.9mg(1.21mmol)의 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드의 용액에 대해 4.0㎖ THF의 370.0(1.10mmol)의 에틸(4-[2-(6-( 2,3-디하이드로-(4H)-1-벤조티오피란-4-오닐)에티닐]안식향산염을 첨가하였다. 30분 후, 4.0㎖ THF의 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노)-5-클로로피리딘을 천천히 첨가하였다. 천천히 실온까지 데우고 5시간 후 포화 수성 NH4Cl을 첨가함으로써 반응을 제지하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 화합된 유기층을 5% 수성 NaOH, H2O 및 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후, 칼럼 크로마토그래피(4% EtOAc-헥산)에 의해 엷은 황색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 8.12(2H, d, J=8.5Hz), 7.66(2H, d, J=8.5Hz), 7.56(1H, d, J=1.7Hz), 7.49(1H, dd, J=1.7, 8.1Hz), 7.40(1H, d, J=8.1Hz), 6.33(1H, t, J=5.7Hz), 4.35(2H, q, J=7.1hz), 3.82(2H, d, J=5.7Hz), 1.37(3H, t, J=7.1Hz).
에틸 4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]안식향산염[화합물 49]
-78℃에서 2.0㎖의 THF의 120.8mg(0.70mmol)과 4-브로모톨루엔의 용액에 대해 88.4mg(1.38mmol, 0.81㎖의 1.7M 펜탄 용액)의 t-부틸리튬을 첨가하였다. 30분후, 2.0㎖ THF의 131.6mg(0.97mmol) ZnCl2의 용액을 첨가하고 최종 엷은 황색 용액을 실온까지 데웠다. 40분간 섞은 후, 이 용액을 129.2mg(0.28mmol)의 에틸 4-[2-(6-4-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]안식향산염, 14.0mg(0.012mmol)테트라아키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O), 및 2.0㎖ THF를 함유하는 제 2 플라스크에 첨가하였다. 최종 용액을 50℃에서 5시간동안 가열하고, 실온으로 냉각한 후, 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 제지하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 화합된 유기층을 H2O 및 포화 수성 NaCl로 세정한 후 (MgSO4)상에서 건조시켜 오렌지색 오일로 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(3 내지 5% EtOAc- 헥산)에 의해 무색 고체인 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(d6-아세톤): δ 7.98(2H, d, J=8.3Hz), 7.58(2H, d, J=2.1, 8.2Hz), 7.44-7.38(2H, m), 7.26-7.15(5H, m), 6.14(1H, t, J=5.8Hz), 4.34(2H, q, J=7.1Hz), 3.53(2H, d, J=5.8Hz), 2.37(2H, s), 1.35(3H, t, J=7.1Hz).
4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]-안식향산(화합물 50)
2.0㎖의 EtOH과 2.0㎖ THF의 29.0mg(0.07mmol) 에틸 4-[2-(6-(4-(4-메틸페닐)-(2H)-1-벤조티오피라닐))에티닐]안식향산염[화합물 49]의 용액에 대해 160.0mg(4.00몰, 2.0㎖의 2M 수용액)을 첨가하였다. 최종 용액을 35℃에서 2시간 동안 섞은 후 실온으로 냉각하여 다시 2시간동안 섞었다. 10% 수성 HCl을 첨가함으로써 반응을 제지하고 EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 H2O와 포화 수성 NaCl로 세정하고 Na2SO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 고체를 얻고, 이 고체를 CH3CN으로 세정하고 고 진공하에서 건조시켜 엷은 황색 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(d6-DMSO): δ 7.90(2H, d, J=8.4Hz), 7.59(2H, d, J=8.4Hz), 7.40(4H, m), 7.25-7.13(4H, m), 7.02(1H, d, J=1.7Hz), 6.11(1H, t, J=5.7Hz), 3.54(2H, d, J=5.7Hz), 2.34(3H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 R); 및 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 S)
디클로로메탄(55㎖)의 알루미늄 염화물(26.3g, 199.0mmol)의 냉(0℃) 혼합물에 대해 클로로메탄(20㎖)의 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌(24.4g, 152mmol) 및 아세틸 염화물(15g, 192mmol)을 20분이상 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도까지 데우고 4시간동안 섞었다. 얼음(200g)을 반응 플라스크에 첨가하고 혼합물을 에테르(400㎖)로 희석하였다. 층을 분리하고 유기상을 10% HCl(50㎖), 물(50㎖), 10% 수성 소듐 바이카르보네이트, 및 포화 수성 NaCl(50㎖)로 세정한 후, MgSO4상에서 건조시켰다. 이 용매를 증류에 의해 제거하여 벤젠(50㎖)에 용해되는 황색 오일을 얻었다.
초산(240㎖)와 무수 초산(120㎖)의 냉(0℃) 용액에 대해 아르곤하에서 20분 이상 소량의 크롬트리옥사이드(50 G, 503mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30분간 0℃에서 섞고 벤젠(120㎖)로 희석하였다. 앞서 마련된 벤젠 용액을 20분 이상 부가 깔때기를 통해 섞으면서 첨가하였다. 8시간 후, 0℃에서 이소프로파놀(50㎖)에 이어서 물을 주위깊게 첨가함으로써 반응을 제지한다. 15분후, 반응 혼합물을 에테르(1100㎖)와 물(200㎖)로 희석한 후, 고체 소듐 중탄산염(200g)으로 중화하였다. 에테르층을 물(100㎖)과 포화 수성 NaCl(2×100㎖)로 세정하고, MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)에 의해 분리되는 이성체 디케톤(diketones)의 혼합물을 제공하였다. (화합물 R): 1H NMR(CDCl3): δ 8.55(1H, d, J=2.0Hz), 8.13(1H, dd, J=2.0, 8.3Hz), 7.53(1H, d, J=8.3Hz), 2.77(2H, t, J=6.6Hz), 2.62(3H, s), 2.05(2H, t, J=6.6Hz), 1.41(6H, s), (화합물S) : 1H NMR(CDCl3): δ 8.10(1H, d, J=8.1Hz), 8.02(1H, d, J=1.6Hz), 7.82(1H, dd, J=1.6, 8.1Hz), 2.77(2H, t, J=7.1Hz), 2.64(3H, s), 2.05(2H, t, J=7.1Hz), 1.44(6H, s)
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-1(2H)-나프탈레논
(화합물 T)
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 R)(140.0 ㎎,0.60 m㏖), 에틸렌 글리콜(55.0 ㎎, 0.90 m㏖), p-톨루엔설포닉산 모노하이드레이트(4㎎) 및 벤젠(25 ㎖)의 혼합물을 딘 스타크(Dean-Stark) 장치를 사용하여 12시간동안 리플럭스하였다. 10% 수성 소듐 중탄산염을 첨가하여 반응을 제지하고 에테르(2×75 ㎖)로 추출하였다. 화합된 유기층을 물(5 ㎖)과 포화 수성 NaCl(5 ㎖)로 세정하고 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 오일인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.10(1H, d, J = 2.0 ㎐), 7.64(1H, dd, J = 2.0, 8.2 ㎐), 7.40(1H, d, J = 8.2 ㎐), 3.97-4.10(2H, m), 3.70-3.83(2H, ms), 2.73(2H, t, J = 6.5 ㎐), 2.01(2H, t, J = 6.5 ㎐), 1.64(3H, s), 1.39(6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))나프탈렌(화합물 U)
2 ㎖ THF의 195.4 ㎎(1.00 m㏖)p-토루릴마그네슘브로마이드(1.0 ㎖; 1M 에테르 용액)의 용액에 대해 5 ㎖의 THF의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-1(2H)-나프탈레논(화합물 T) 135.0 ㎎, 0.52 m㏖의 용액을 첨가하였다.이 용액을 16시간동안 리플럭스하고 실온으로 냉각한 후 에테르(50 ㎖)로 희석하였다. 이 용액을 물(5 ㎖), 포화 수성 NH4Cl(5 ㎖)로 세정하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피(5 % EtOAc/헥산)에 의해 고체인 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.37(2H, d), 7.21(1H, s), 7.13(2H, d, J = 8.5 ㎐), 7.08(2H, d, J = 8.5 ㎐), 3.88-3.99(2H, m), 3.58-3.75(2H, m), 2.34(3H, s), 2.12-2.30(2H, m), 1.79-1.90(1H, m), 1.57(3H, s), 1.48-1.58(1H, m), 1.38(3H,s), 1.31(3H, s).
3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-아세틸나프탈렌(화합물 V)
1,2,3,4-테드라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))나프탈렌(화합물 U) 130.0 ㎎(0.38 m㏖), p- 톨루엔설포닉산 모노하이드레이트(4 ㎎) 및 벤진(5 ㎖)의 혼합물을 16시간동안 리플럭스하였다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 에테르(100 ㎖)로 희석하고 10% 수성 소듐 중탄산염, 물, 및 포화 수성 NaCl로 세정하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하여 고체인 타이틀 화합물을 제공한다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.83(1H, dd, J = 1.8, 8.0 ㎐), 7.66(1H, d, J = 1.8 ㎐), 7.45(1H, d, J = 8.0 ㎐), 7.25(2H, d, J = 8.5 ㎐), 7.22(2H, d, J = 8.5 ㎐), 6.03(1H, t, J = 6.3 ㎐), 2.47(3H, s), 2.41(3H, s), 2.37(2H, d, J = 6.3 ㎐), 1.36(6H, s).
(E)-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2-부텐니트라일(화합물 W)
THF(6㎖)의 NaH(48.0 ㎎, 2.00 m㏖)의 슬러리에 대해 디에틸시아노메틸포스포네이트(450.0 ㎎, 250 m㏖)를 첨가하였다. 40분 후, THF(4㎖)의 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-아세틸나프탈렌(화합물 V) 95.0 ㎎, (0.33 m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 섞고, 에테르(100 ㎖)로 희석하고, 물, 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피(3 % EtOAc/헥산)에 의해 고체인 타이틀 화합물을 제공하였다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.39(1H, d, J = 1H), 7.32(1H, dd, J = 2.0, 8.1 ㎐), 7.20-7.25(4H, brs), 7.15(1H, d, J = 2.0 ㎐), 6.03(1H, t, J = 6.0 ㎐), 5.44(1H, s), 2.42(3H, s), 2.36(2H, d, J = 6.0 ㎐), 2.35(3H, s), 1.35(6H, s).
(E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2-부테날(화합물 X)
디클로로메탄(4 ㎖)의 (E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2-부텐니트라일(화합물 W) 84.0 ㎎, 0.29 m㏖의 냉 용액(-78℃)에 대해 0.50 ㎖, (0.50 m㏖)의 디이소부틸알루미늄하이브리드(1M 디클로로메탄 용액)을 첨가하였다. 1시간 도아안 섞은 후 에테르(100 ㎖)로 희석된 2- 프로파놀(1 ㎖)을 첨가함으로써 (-78℃)에서 반응을 제지하였다. 실온으로 데운 후, 용액을 물, 10% HCl, 및 포화 수성 NaCl로 세정하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 감압하에서 용매를 제거하여 오일인 타이틀 화합물을 제공한다. 1H NMR(CDCl3): δ 10.12(1H, d, J = 7.9 ㎐), 7.43(2H, s), 7.19-7.28(5H, m), 6.27(1H, d, J = 7.9 ㎐), 6.03(1H,t, J = 4.8 ㎐), 2.47(3H, s), 2.42(3H, s), 2.37(2H, d, J = 4.8 ㎐), 1.37(6H, s).
에틸(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2,4,6-옥타트리에노에이트(화합물 51)
THF(2 ㎖)의 디에틸-(E)-3-에톡시카르보닐-2-메틸알릴포스포네이트[J. Org. Chem. 39:821(1974)에 의해 마련된] 264.0 ㎖, (1.00 m㏖)의 냉((-78℃) 용액에 대해 26.0 ㎖(0.41 m㏖, 0.65㎖)의 헥산의(1.6M 용액) n-부틸리튬을 첨가하고 곧이어 THF(3 ㎖의 (E)-3-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2-부테날(화합물 X) 82.0 ㎎, 0.26m㏖을 첨가하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 에테르(60 ㎖)로 희석하고, 물(5 ㎖), 포화 수성 NaCl(5 ㎖)로 세정하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후, 칼럼 크로마노그래피(5 % EtOAc/헥산, 1% EtOAc/헥산을 사용하는 HPLC가 후속함)에 의해 오일인 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(아세톤-d6): δ 7.36-7.43(2H, m), 7.18-7.27(4H, m), 7.17(1H, d, J = 1.7 ㎐), 7.08(1H, dd, J = 11.2, 15.2 ㎐), 6.46(1H, d, J = 11.2 ㎐), 6.38(1H, d, J = 15.2 ㎐), 5.98(1H, t, J = 4.7 ㎐), 5.78(1H, s), 4.10(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.35(3H, s), 2.33(3H, s), 2.32(2H, d, J = 4.7 ㎐), , 2.12(3H, s), 1.31(6H, s), 1.22(3H, t, J = 7.1 ㎐).
(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2,4,6-옥타트리에논산(화합물 52)
THF(1 ㎖)의 에틸(E,E,E)-3-메틸-7-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)-2,4,6-옥타트리에노에이트(화합물 51) 85.0 ㎎, 0.20 m㏖의 용액에 대해 12.0 ㎎(0.50 m㏖)의 LiOH(0.5 ㎖, 1M 용액)을 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 섞고, 에테르(60 ㎖)로 희석하고, 10 % HCl(1 ㎖)로 산성화하였다. 이 용액을 물과 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후 고체인 타이틀 화합물이 제공되며, 이것은 아세톤으로부터의 재결정화에 의해 정화되었다. 1H NMR(아세톤-d6): δ 7.35-7.45(2H, m), 7.19-7.28(4H, m), 7.17(1H, d, J = 1.8 ㎐), 7.09(1H, dd, J = 11.5, 15.1 ㎐), 6.48(1H, d, J = 11.5 ㎐), 6.42(1H, d, J = 15.1 ㎐), 5.99(1H, t, J = 4.7 ㎐), 5.82(1H, s), 2.36(3H, s), 2.33(2H, d, J = 4.7 ㎐), 2.32(3H, s), 2.13(3H, s), 1.32(6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-니트로-1(2H)-나프탈레논(화합물 Y)
-5℃(아이스 NaCl 배스)에서의 1.7 ㎖(3.0 g, 30.6 m㏖, 18M) H2SO4에 대해 783.0 ㎎(4.49 m㏖)의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-1(2H)-나프탈레논을 천천히 첨가하였다. 426.7 ㎎(6.88 몰, 0.43 ㎖, 16M) HNO3와 1.31 g(0.013 mol, 0.74 ㎖, 18 M) H2SO4의 용액을 천천히 첨가하였다. 20분후, 얼음을 첨가하고 최종 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 화합된 추출물을 감압합에서 농축하여 잔여물을 제공하고 이로부터 엷은 황색 고체의 타이틀 화합물이 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)에 의해 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.83(1H, d, J = 2.6 ㎐), 8.31(1H, dd, J = 2.8,8.9 ㎐), 7.62(1H, d, J = 8.7 ㎐), 2.81(2H, t, J = 6.5 ㎐), 2.08(2H, t, J = 6.5 ㎐), 1.45(6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아미노-1(2H)-나프탈레논(화합물 Z)
5.0 ㎖의 EtOAc의 230.0 ㎎(1.05 m㏖) 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-니트로-1(2H)-나프탈레논(화합물 Y)의 용액을 24시간동안 H2의 1 atm하에서 10% Pd-C의 촉매량으로 실온에서 섞었다. 촉매를 셀라이트의 패드에 의한 여과에 의해 제거하고, 여과물을 감압하에서 농축하여 어두운 녹색 오일인 타이틀 화합물을 제공한다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.30(1H, d, J = 2.7 ㎐), 7.22(1H, d, J = 8.4 ㎐), 6.88(1H, dd, J = 2.7, 8.5 ㎐), 2.70(2H, t, J = 6.6 ㎐), 1.97(2H, t, J = 6.6 ㎐), 1.34(6H, s).
에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 AA)
5.0 ㎖ 결정성 초산의 198.7 ㎎(1.05 m㏖) 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아미노-1(2H)-나프탈레논(화합물 Z)의 용액에 대해 180.0 ㎎(1.00 m㏖)의 에틸 4-니트로소벤조에이트를 첨가하였다. 최종 용액을 밤새 실온에서 섞은 후 감압하에서 농축하였다. 적색 고체인 잔여 오일로부터 칼럼 크로마토그래피(15% EtOAc-헥산)에 의해 생성물을 분리하였다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.57(1H, d, J = 2.0 ㎐), 8.19(2H, d, J = 8.4 ㎐), 8.07(1H, d, J = 8.0 ㎐), 7.94(2H, d, J = 8.4 ㎐), 7.58(1H, d, J = 8.6 ㎐), 4.41(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.79(2H, t, J = 6.6 ㎐), 2.07(2H, t, J =7.02 ㎐), 1.44(6H, s), 1.42(3H, t, J = 7.1 ㎐).
에틸4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 BB)
-78℃에서 2.0 ㎖ THF의 90.4 ㎎ 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드(0.48 m㏖,0.48 ㎖의 1.0M THF 용액)의 용액에 대해 2.0 ㎖ THF의 153.0 ㎎(0.437 m㏖)의 에틸 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5-디메틸-8-옥소-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 AA)를 첨가하였다. 어두운 적색 용액을 -78℃에서 30분간 섞은 후 204.0㎎(0.520 m㏖)의 2-[N,N-비스(트리플루오로메틸설포닐)아미노]-5-클로로피리딘을 2.0 ㎖ THF로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 데우고 3시간 후 H2O를 첨가함으로써 반응을 제지하였다. 유기층을 감압하에 적색 오일로 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(25% EtOAc/헥산)에 의해 생성물이 적색 오일로서 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.21(2H, d, J = 8.6 ㎐), 7.96(2H, d, J = 8.6 ㎐), 7.94(2H, m), 7.49(1H, d, J = 8.2 ㎐), 6.08(1H, t, J = 2.5 ㎐), 4.42(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.49(2H, d, J = 4.8 ㎐), 1.44(3H, t, J = 7.1 ㎐), 1.38(6H, s).
에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)아조]-안식향산염(화합물 46a)
1.0 ㎖의 THF의 84.0 ㎎(0.491 m㏖)의 4-브로모톨루엔의 냉용액(-78℃)에 62.9 ㎎(0.58 ㎖, 0.98 m㏖)의 t-부틸 리튬(1.7 M 펜탄 용액)을 첨가함으로써 4-리티오톨루엔 용액을 마련하였다. 30분동안 섞은 후, 2.0 ㎖의 THF의 107.0 ㎎(0.785 m㏖)의 염화 아연의 용액을 첨가하였다. 최종 용액을 실온으로 데우고, 30분간 섞은후, 캐뉼러를 거쳐 2.0 ㎖의 THF의 25 ㎎(0.02 m㏖)의 테트라아키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)과 94.7 ㎎(0.196 m㏖)의 에틸4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 BB)의 용액에 첨가하였다. 최종 용액을 1.5시간동안 50℃에서 가열하고, 실온으로 냉각하여 포화 수성 NH4Cl로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc(40 ㎖)로 추출하고 화합된 유기층을 물과 소금물로 세정하였다. 유기상을 Na2SO4상에서 건조하고, 감압하에서 농축시켜, 칼럼 크로마토그래피(25% EtOAc/헥산)에 의해 적색 고체로서 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.21(2H, d, J = 8.6 ㎐), 7.96(2H, d, J = 8.6 ㎐), 7.94(2H, m), 7.49(1H, d, J = 8.2 ㎐), 6.08(1H, t, J = 2.5 ㎐), 4.42(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.49(2H, d, J = 4.8 ㎐), 1.44(3H, t, J = 7.1 ㎐), 1.38(6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 46b)
THF(2 ㎖)와 에탄올(1 ㎖)의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)아조]-안식향산염(화합물 46a) 16.5 ㎎, 0.042 m㏖의 용액에 대해 80.0 ㎎(2.00 m㏖)의 NaOH(2.0 ㎖, 1M 수용액)을 첨가하였다. 이 혼합물을 12시간 동안 실온에서 섞고, 10 % HCl로 세정한 후, EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 물과 포화 수성 NaCl로 산성화한 후, MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고, EtOAc/헥산으로부터 잔여물을 재결정시켜 적색 고체로서 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(아세톤-d6): δ 8.19(2H, d, J = 8.4 ㎐), 7.92(2H, d, J = 8.5㎐), 7.88(2H, dd, J = 2.1, 6.1 ㎐), 7.66(1H, s), 7.64(2H, d, J = 2.3 ㎐), 7.28(4H, d, J = 3.0 ㎐), 6.09(1H, t, J = 2.5 ㎐), 2.42(2H, d, J = 4.8 ㎐), 2.39(3H, s), 1.40(6H, s).
6-(2-트리메틸시릴)에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-1(화합물 CC)
100 ㎖의 가스 제거된 Et3N(아르곤으로 20분간 살포된)의 815.0 ㎎(3.41 m㏖)6-브로모-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1-인덴-1-1의 용액(스미스 외 공저, Org. Prep. Proced. Int. 1978 10 123-131 참조)에 대해 259.6 ㎎(1.363 m㏖)의 구리(Ⅰ) 요오드화물, 956.9 ㎎(1.363 m㏖)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ)염화물, 및 3.14 g(34.08㎎(m㏖)의 (트리메틸시릴)아세틸렌을 첨가하였다. 이 혼합물을 70℃에서 42시간동안 가열하고, 실온으로 냉각한 후, 실리카 겔의 패드를 통해 필터링하고 에테르로 세정하였다. 여과물을 물, 1M HCl, 물과 마지막으로 포화 수성 NaCl로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 이 용액을 농축시킨 후, 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔; 10% Et2O상에서 건조시켰다. 감압하에서 이 용액을 농축시킨 후, 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔; 10% Et2O-헥산)에 의해 갈색 오일의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(300 ㎒, CDCl3): δ 7.79(1H, d, J = 1.4 ㎐), 7.69(1H, dd, J = 1.6, 8.3 ㎐), 7.42(1H, d, J = 8.5 ㎐), 2.60(2H, s), 1.41(6H, s), 0.26(9H, s).
6-에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-1(화합물 DD)
28 ㎖의 MeOH의 875.0 ㎎(3.41 m㏖) 6-(2-트리메틸시릴)에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-1(화합물 CC)의 용액에 대해 197.3 ㎎(1.43 m㏖)의 K2CO3를 일부 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 6시간동안 섞은 후 셀라이트의 패드를 통해 필터링하고 여과물을 감압하에서 농축하였다. 잔여 오일을 실리카 겔 상에 배치하고 5% EtOAc/헥산으로 세정하여 무색 오일의 타이틀 생성물을 제공한다. 1H NMR(300 ㎒, CDCl3): δ 7.82(1H, s), 7.72(1H, dd, J = 1.6, 7.8 ㎐), 7.47(1H, d, J = 8.4 ㎐), 3.11(1H, s), 2.61(2H, s), 1.43(6H, s).
에틸 4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-7-옥소-2-인데닐)에티닐]안식향산염(화합물 EE)
5 ㎖ Et3N의 429.7 ㎎(1.520 m㏖) 에틸 4-요오드벤조에이트와 280.0㎎(1.520 m㏖) 6-에티닐-2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인덴-1-1(화합물 DD)의 용액을 아프곤으로 40분간 살포하였다. 이 용액에 대해 271.0㎎(1.033 m㏖)의 트리페닐포스핀, 53.5 ㎎(0.281 m㏖)의 구리(Ⅰ)요오드화물, 및 53.5 ㎎(0.076 m㏖)의 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ)염화물을 첨가하였다. 최종 혼합물을 2.5시간동안 가열하여 리플럭스하고 실온으로 냉각한 후 Et2O로 희석하였다. 셀라이트의 패드를 통해 여과한 후, 여과물을 H2O, 1M HCl, H2O 및 포화 수성 NaCl로 세정하고나서, MgSO4상에서 건조시키고, 감압하에서 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(15% EtOAc-헥산)에 의해 엷은 황색 고체의 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR(300 ㎒, d6-아세톤): δ 8.05(2H, d, J = 8.6 ㎐), 7.87(1H, dd, J = 1.4, 8.1 ㎐), 7.75(2H, m), 7.70(2H,d, J = 8.5 ㎐), 4.36(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.60(2H, s), 1.45(6H, s), 1.37(3H, t, J = 7.1 ㎐).
에틸 4-[2-(1,1-디메틸-3-(트리플루오로메틸-설포닐)옥시-5-인데닐)에티닐]안식향산염(화합물 FF)
0.5 ㎖ THF의 88.0 ㎎(0.48 m㏖)의 소듐 비스(트리메틸시릴)아미드의 용액을 -78℃로 냉각하고 145.0 ㎎(0.436 m㏖)의 에틸 4-[2-(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-7-옥소-2-인데닐)에티닐]안식향산염(화합물 EE)를 1.0 ㎖ THF의 용액으로서 첨가하였다. 30분후, 181.7 ㎎(0.480 m㏖)의 2-(N,N-비스(트리플루오로메탄설포닐)아미노)-5-클로로-피리딘을 1.0 ㎖ THF의 용액으로서 첨가하였다. 반응물을 실온까지 천천히 데우고 5 시간 후 포화 수성 NH4Cl을 첨가하여 반응을 제지하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 화합된 유기층을 5% 수성 NaOH, H2O 및 포화수성 NaCl로 세정한 후, (MgSO4)상에서 건조시키고 감압하에서 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(10% Et2O-헥산)에 의해 무색 고체의 생성물을 분리하였다. 1H NMR(300 ㎒, d6-아세톤): δ 8.05(2H, d, J = 8.3 ㎐), 7.69(2H, d, J = 8.4 ㎐), 7.63(2H, s), 7.55(1H, s), 4.36(2H, q, J = 7.1 ㎐), 1.44(6H, s), 1.37(3H, t, J = 7.1 ㎐).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 60)
12 ㎖의 THF/물(4:1, v/v)의 35.6 ㎎(0.848 m㏖)의 LiOH-H2O와 142.6 ㎎(0.339 m㏖)의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 1)의 용액을 실온에서 밤새 섞었다. 반응 혼합물을 헥산으로 추출하고 헥산 프랙션(fraction)을 5% 수성 NaOH로 추출하였다. 수성층을 1MHCl과 호합하여 산성화시킨 후, EtOAc와 Et2O로 추출하였다. 화합된 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고 진공에서 농축하여 무색 고체의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR( d6-DMSO): δ 7.91(2H, d, J = 8.4 ㎐), 7.60(2H, d, J = 8.4 ㎐), 7.47(2H, s), 7.23(4H, q, J = 8.1 ㎐), 7.01(1H, s), 6.01(1H, t, J = 4.6 ㎐), 2.35(3H, s), 2.33(2H, d, J = 4.8 ㎐), 1.30(6H, s).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-페닐-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 60a)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아조릴)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 30a)의 제조와 동일한 과정을 사용하여, 27.0 ㎎(0.07 m㏖)의 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-페닐-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 1a)를 H2O의 5.9 ㎎(0.14 m㏖)의 LiOH를 사용하여 타이틀 화합물(무색 고체)로 변환시켰다. PMR( d6-DMOS): δ 1.31(6H, s), 2.35(2H, d, J = 4.5 ㎐), 6.05(1H, t, J = 4.5 ㎐), 7.00(1H, s), 7.33(2H, d, J = 6.2 ㎐), 7.44(4H, m), 7.59(2H, d, J = 8.1 ㎐), 7.90(2H, d, J = 8.1 ㎐).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-{1,1-디메틸에틸)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 61)
6 ㎖의 THF/물(3:1, v/v)의 18.1 ㎎(0.432 m㏖)의 LiOH-H2O와 80.0 ㎎(0.173 m㏖)의에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-{1,1-디메틸에틸)페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 6)의 용액을 실온에서 밤새 섞었다. 반응 혼합물을 헥산으로 추출하고, 잔여 수성층을 1M HCl로 산성화한 후, EtOAc로 추출하였다. 화합된 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고 진공에서 농축하여 무색 고체의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR( d6-DMSO): δ 7.82(2H, d, J = 8.2 ㎐), 7.44(6H, m), 7.25(2H, d, J = 8.3 ㎐), 7.02(1H, s), 6.01(1H, t, J = 4.6 ㎐), 2.32(2H, d, J = 4.7 ㎐), 1.32(9H, s), 1.29(6H, s).
에틸 2-플루오로-4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 62)
12.0 ㎖의 벤젠의 57.7 ㎎(0.143 몰)의 [2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3-디티아-2,4-디포스페탄-2,4-2황화물][로웨슨의 시약]과 54.4 ㎎(0.119 m㏖) 에틸 2-플루오로-4-[[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 40)의 용액을 밤새 리플럭스하였다. 실온으로 냉각한 후, 이 혼합물을 필터링하고 여과물을 감압하에서 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(10 내지 25% EtOAc/헥산)에 의해 황색 고체로서 타이틀 화합물을 분리하였다. 1H NMR( CDCl3): δ 9.08(1H, s),7.92(1H, br, s), 7.90(1H, t, J = 8.2 ㎐), 7.66(1H, dd, J = 2.0, 6.0 ㎐), 7.38(3H, m), 7.18(4H, m), 6.01(1H, t, J = 4.7 ㎐), 4.35(2H, q, J = 7.1 ㎐), 2.36(3H, s), 2.33(2H, d, J = 4.7 ㎐), 1.38(3H, t, J = 7.1 ㎐), 1.33(6H, s).
2-플루오로-4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산(화합물 63)
1.0 ㎖의 THF와 1.0 ㎖의 EtOH의 46.5 ㎎(0.98 m㏖) 에틸 2-플루오로-4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)티오카르보닐]아미노]-안식향산염(화합물 62)의 용액에 대해 55㎎NaOH(1.4 m㏖)과 1.0 ㎖의 H2O를 첨가하였다. 실온에서 밤새 섞은 후 EtOAc를 첨가하고, 10% HCl을 첨가함으로써 반응을 제지하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출한 후, 화합된 유기층을 H2O와 포화 수성 NaCl로 세정하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고, CH3CN으로부터 결정화한 후에, 엷은 황색 고체의 타이틀 화합물을 얻었다. 1H NMR(d3-아세톤): δ 11.05(1H, s), 8.02(1H, m), 7.99(1H, t, J = 8.3 ㎐), 7.75(1H, m), 7.69(1H, dd, J = 2.0, 6.1 ㎐), 7.52(1H, s), 7.46(1H, d, J = 8.1 ㎐), 7.21(4H, m), 6.04(1H, t, J = 4.8 ㎐), 2.37(2H, d, J = 4.8 ㎐), 2.33(3H, s), 1.36(6H, s).
에틸 5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(4-메틸페닐)-[2,2'-바이나프탈렌]-6-카르복실레이트(화합물 64)
THF(2.1 ㎖)와 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-7-브로모나프탈렌(화합물 D) 0.45 g, 1.40 m㏖의 용액을 아르곤하의 실온에서 마그네슘 터닝(turnings)(0.044 g, 1.82 m㏖)에 첨가하였다. 에틸렌 디브로마이드를 두 방울 첨가하고, 서서히 흐려져 황색을 띠게 되는 용액을 1.5 시간동안 가열하여 리플럭스한다. 제2 플라스크에 아연 염화물(0.210 g, 1.54 m㏖)에 첨가하고, 이것을 고진공하에서 녹이고, 실온으로 냉각한 후, THF(3㎖)에 용해시킨다. 그리그나드(Grignard) 시약을 제2 플라스크에 첨가하고, 30분후 실온에서, THF(2 ㎖)과 에틸 6-브로모-2-나프탈렌카르복실레이트(화합물 N) 0.293 g, (1.05 m㏖)의 용액을 첨가하였다. 제3 플라스크에 Ni(PPh3)4와 THF의 용액을 다음과 같이 마련하였다: THF(3.5 ㎖)의 PPh3(0.66 g, 2.5 m㏖)과 NiCl2(PPh3)2(0.82 g, 1.25 m㏖)의 용액에 대해 디이소부틸 알루미늄 하이브리드와 헥산(2.5 ㎖, 2.5 m㏖)의 1M 용액을 첨가하고, 최종 용액을 총 부피 15 ㎖로 THF로 희석하고 실온에서 15분간 섞었다. 세 개의 0.60 ㎖의 Ni(PPh3)4용액을 15분 간격으로 제2 플라스크에 첨가하였다. 최종 현탄액을 실온에서 2시간 동안 섞었다. 5 ㎖ 1N 수성 HCl을 첨가함으로써 반응을 제지하고 1 시간동안 섞은 후 에틸 아세테이트로 생성물을 추출하였다. 유기층을 소금물과 화합시켜 세정하고, MgSO4로 건조시킨 후, 필터링하여 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물이 헥산으로부터 결정화되어 130 ㎎의 순수한 물질을 제공한다. 모액(mother liquor)을 감압하에서 농축하고 실리카 겔 크로마토그래피(95:5-헥산:에틸 아세테이트)에 의해 잔여물을 정화하여 170 ㎎의 무색 고체의 타이틀 화합물(전체 수율 = 300 ㎎, 65 %)을 추가로 얻었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.57(s, 1H), 8.05(dd, 1H, J = 1.7, 80. ㎐), 7.84-7.95(dd, 3H), 7.66(dd, 1H, J = 1.7, 8.5 ㎐), 7.58(dd, 1H, J = 2.0,8.0 ㎐), 7.48(d, 1H, J = 8.0 ㎐), 7.43(d, 1H, J = 2.0 ㎐), 7.32(d, 2H, J = 8.0 ㎐), 7.21(d, 2H, J = 8.0 ㎐), 6.04(t, 1H, J =4.8 ㎐), 4.44(q, 2H, J = 7.1 ㎐), 2.40(s, 3H), 2.39(d, 2H, J = 4.8 ㎐), 1.45(t, 3H, J = 7.1 ㎐), 1.39(s, 6H).
5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(3-메틸페닐)-[2,2'-바이나프탈렌]-6-카르복실산(화합물 65)
에틸 5',6'-디하이드로-5',5'-디메틸-8'-(4-메틸페닐)-[2,2'-바이나프탈렌]-6-카르복실레이트(화합물 64) 0.19 g, 0.43 m㏖, EtOH(8 ㎖) 및 1N 수성 NaOH(2 ㎖)의 용액을 60℃로 3시간동안 가열하였다. 이 용액을 0℃로 냉각하고 1N HCl로 산성화하였다. 생성물을 에킬 아세테이트로 추출하고, 유기층을 물과 소금물로 화합하여 세정하고, MgSO4상에서 건조시킨 후, 필터링하여 용매를 진공속에 제거하였다. 잔여물이 THF/에틸 아세테이트로부터 0℃에서 재결정화되어 25 ㎎의 순수한 물질을 제공한다. 모액을 감압하에서 농축하고 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(100 % 에틸 아세테이트)에 의해 정화하여 125 ㎎의 무색 고체의 타이틀 화합물(전체 수율 = 160 ㎎, 90 %)을 추가로 제공한다. 1H NMR(DMSO-d6): δ 8.57(s, 1H), 8.11(d, 1H, J = 8.7 ㎐), 7.96-7.82(dd, 3H), 7.65(d, 2H, J = 7.6 ㎐), 7.50(d, 1H, J = 7.9 ㎐), 7.28(s, 1H), 7.26(d, 2H, J = 8.3 ㎐), 7.21(d, 2H, J = 8.3 ㎐), 6.01(t, 1H, J = 4.5 ㎐), 3.34(br, s, 1H), 2.31(s, 3H), 2.31(d, 2H, J = 4.5 ㎐), 1.31(s, 6H).
에틸 -4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈렌일)에티닐]-안식향산염(화합물 66)
에틸 -4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(4-메틸페닐)-2-나프탈렌일)에티닐]-안식향산염(화합물 1) 의 제조와 동일한 과정을 사용하여, 250.0 ㎎(0.52 m㏖)의 에틸-4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(트리플루오로메틸설포닐)옥시-2-나프탈렌일)에티닐]-안식향산염(화합물 G)를 142.4 ㎎(1.045 m㏖)의 아연 염화물, 24.1 ㎎(0.02 m㏖)의 테트라아키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O) 및 2-리티오푸란[53.4 ㎎(0.52 ㎖, 0.78 m㏖)의 n-부틸리튬(헥산의 1.5M 용액)을 1.0 ㎖의 THF의 53.4 ㎎(0.784 m㏖)의 푸란의 냉 용액(-78℃)에 첨가함으로써 마련된]을 사용하여 타이틀 화합물(무색 고체)로 변환시켰다. PMR(CDCl3): δ 1.32(6H, s), 1.41(3H, t, J = 7.1 ㎐), 2.35(2H, d, J = 5.0 ㎐), 4.39(2H, q, J = 7.1 ㎐), 6.41(1H, t, J = 5.0 ㎐), 6.50(2H, s), 7.36(1H, d, J = 8.0 ㎐), 7.45(1H, dd, J = 1.7, 8.0 ㎐), 7.49(1H, s), 7.57(2H, d, J = 8.2 ㎐), 7.63(1H, d, J = 1.7 ㎐), 8.02(2H, d, J = 8.2 ㎐).
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 67)
4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-티아조릴)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산(화합물 30a)의 제조와 동일한 과정을 사용하여, 에틸 4-[(5,6-디하이드로-5,5-디메틸-8-(2-푸릴)-2-나프탈렌일)에티닐]안식향산염(화합물 66)을 H2O의 16.0 ㎎(0.38 m㏖)의 LiOH를 사용하여 타이틀 화합물로 변환시켰다. PMR(d6-DMOS): δ 1.26(6H, s), 2.33(2H, d, J = 4.9 ㎐), 6.41(1H, t, J = 4.9㎐), 6.60(2H,m), 7.45-7.53(3H, m), 7.64(2H, d, J = 8.3 ㎐), 7.75(1H, d, J = 1.6 ㎐), 7.93(2H, d, J = 8.3 ㎐).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 100C) 및 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 100D)
디클로로메탄(55 ㎖)의 알루미늄 염화물(26.3 g, 199.0 m㏖s)의 냉(0℃) 혼합물에 대해 디클로로메탄(20㎖)의 1,2,3,4-테트라하이드로-1,1-디메틸나프탈렌(24.4 g, 152 m㏖s)와 아세틸염화물(15 g, 192 m㏖s)을 20분 이상 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도까지 데운 후 4 시간동안 섞었다. 반응 플라스크에 얼음(200g)을 넣고 혼합물을 에테르(400 ㎖)로 희석하였다. 수성 유기층을 분리하여 유기상을 10% HCl(50 ㎖), 물(50 ㎖), 10＆ 수성 소듐 비카르보네이트, 및 포화 수성 NaCl(50 ㎖)로 세정한 후 MgSO4상에서 건조시켰다. 증류에 의해 용매를 제거하여 벤젠(50 ㎖)에 용해되는 황색 오일을 제공한다.
초산(240 ㎖)과 무수 초산(120 ㎖)의 냉(0℃) 용액에 대해 아르곤하에서 20분 이상 크롬 3산화물(50 g, 503 m㏖)을 소량 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 0℃에서 섞고 벤젠(120 ㎖)로 희석하였다. 20분 이상 부가 깔대기를 사용하여 섞으면서 앞서 마련된 벤젠 용액을 첨가하였다. 8 시간 후, 0℃에서 이소프로파놀(50 ㎖)을 주의깊게 첨가하고 이어서 물(100 ㎖)을 첨가함으로써 반응을 제지하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 에테르(1,100 ㎖)와 물(200 ㎖)로 희석한 후, 고체 소듐 비카르보네이트(200 g)로 중화하였다. 에테르층을 물(100 ㎖)와 포화 수성 NaCl(2×100 ㎖)로세정하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 크로마토그래피(5% EtOAc/헥산)에 의해 분리되는 이성체의 디케톤의 혼합물을 제공한다. (화합물 100C): 1H NMR(CDCl3): δ 8.55(1H, d, J = 2.0 ㎐), 8.13(1H, dd, J = 2.0, 8.3 ㎐), 7.53(1H, d, J = 8.3 ㎐), 2.77(2H, t, J = 6.6 ㎐), 2.62(3H, s), 2.05(2H, t, J 2.0, 8.3 ㎐), 7.53= (1H, d, J = 8.3 ㎐), 2.77(2H, t, J = 6.6 ㎐), 2.62(3H, s), 2.05(2H, t, J = 6.6 ㎐), 1.41(6H, s). (화합물 100D): 1H NMR CDCl3): δ 8.10(1H, d, J = 8.1 ㎐), 8.02(1H, d, J = 1.6 ㎐), 7.82(1H, dd, J = 1.6, 8.1 ㎐), 2.77(2H, t, J - 7.1 ㎐), 2.64(3H, s), 2.05(2H, t, J = 7.1 ㎐), 1.44(6H, s).
3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-1(2H)-나프탈레논(화합물 100E)
50 ㎖ 벤젠의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-7-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 100C) 및 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-아세틸-1(2H)-나프탈레논(화합물 100D)의 1:5 혼합물 1.80 g(8.34 m㏖)의 용액을 20.0 ㎎(0.11 m㏖)의 P-톨루엔설폰산 모노하이드 레이트와 517.7 ㎎(8.34 m㏖)의 에틸렌 글리콜과 화합하였다. 최종 용액을 18 시간 동안 가열하여 리플럭스하고, 실온으로 냉각시킨 후, 감압하에서 농축하였다. 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc-헥산)에 의해 무색 오일의 타이틀 화합물이 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 8.01(1H, d, J = 8.2 ㎐), 7.51(1H, s), 7-43(1H, dd, J = 1.7, 6.4 ㎐), 4.07(2H, m), 3.79(2H, m), 2.74(2H, t, J = 6.5 ㎐), 2.04(2H, t, J =7.1 ㎐), 1.67(3H, s), 1.46(6H, s).
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-나프탈레논(화합물 100F)
20 ㎖ THF의 496.2 ㎎(2.54 m㏖) p-토릴마그네슘브로마이드의 용액(2.54 ㎖; 에테르의 1M 용액)에 대해 THF(5 ㎖)의 3,4-디하이드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-1(2H)-나프탈레논(화합물 100E, 200.0 ㎎, 0.769 m㏖)를 첨가하였다. 이 용액을 16 시간동안 리플럭스하고, 실온으로 냉각한 후, 물, 포화, 수성 NH4Cl로 세정하고, MgSO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc/헥산)에 의해 무색 고체의 타이틀 화합물을 제공하였다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.49(1H, d, J = 1.7 ㎐), 7.19(2H, m), 7.10(2H, d, J = 7.9 ㎐), 7.04(1H, d, J = 8.2 ㎐), 4.05(2H, m), 3.80(2H, m), 2.34(3H, s), 2.21(1H, m), 2.10(1H, m), 1.88(1H, m), 1.65(3H, s), 1.54(1H, m), 1.39(3H, s), 1.33(3H, s).
3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌(화합물 100G)
1,2,3,4-테트라하이드로-1-하이드록시-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-나프탈레논(화합물 100F 160.0 ㎎, 0.52 m㏖), p-톨루엔설폰산 모노하이드레이느(4 ㎎) 및 30 ㎖ 벤젠의 용액을 12 시간동안 리플럭스하였다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 에테르(100 ㎖)로 희석하고 10% 수성 소듐 비카르보네이트, 물 및 포화 수성 NaCl로 세정하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 감압하에서 용매를 제거하여 타이틀 화합물을 제공하며, 이것은 칼럼 크로마토그래피(10%, EtOAc-헥산)에 의해 황색 오일로서 분리되었다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.97(1H, d, J = 1.8 ㎐), 7.67(1H, dd, J = 1.7, 6.4 ㎐), 7.22(4H, s), 7.13(1H, d, J = 8.1 ㎐), 6.10(1H, d, J = 4.5 ㎐), 2.59(3H, s), 2.40(3H, s), 2.38(2H, d, J = 4.7 ㎐), 1.38(6H, s).
4-[3-옥소-3(7,8-디하이드로-5-(4-메틸페닐)-8,8-디메틸-2-나프탈렌일)-1-프로펜일]-안식향산(화합물 101)
MeOH의 4.0 ㎖의 78.7 ㎎(0.272 m㏖) 3,4-디하이드로-1-(4-메틸페닐)-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌(화합물 100G)의 용액에 대해 53.1 ㎎(0.354 m㏖)의 4-카르복시벤잘데하이드 및 80. ㎎(2.00 m㏖; 2.0 ㎖의 1M 수성 NaOH)를 첨가하였다. 최종용액을 실온에서 12 시간동안 섞고, 감압하에서 농축한 후, 잔여 오일을 EtOAc에 용해시켰다. 이 용액을 10% HCl로 처리하고, 유기층을 H2O와 포화 수성 NaCl로 세정한 후, Na2SO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하여 CH3CN으로부터의 재결정화에 의해 정화되는 무색 고체의 타이틀 화합물을 제공한다. 1H NMR(아세톤-d6): δ 8.00(7H, m), 7.83(1H, d, J = 15.6 ㎐), 7.24(4H, s), 7.13(1H, d, J = 8.1 ㎐), 6.12(1H, t, J = 4.5 ㎐), 2.42(2H, d, J = 4.8 ㎐), 2.38(3H, s), 1.41(6H, s).
3,4-디히드로-1-페닐-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌(화합물 100H)
THF의 10 ㎖에서의 3,4-디히드로-4,4-디메틸-6-(2-(2-메틸-1,3-디옥소라닐))-1(2H)-나프탈렌(화합물 100E)의 508.0㎎의 수용액에, 페닐마그네슘 브로마이드496.2㎎ (2.54m㏖; Et2O에서의 1M 수용액의 2.54 ㎖)가 첨가된다. 최종 수용액은 8 시간동안 리플럭스되도록 가열되고, H2O가 첨가되어 30분간 가열이 계속된다. THF는 감압하에서 제거되고 수용성 잔류물이 EtOAc로 추출된다. 결합된 유기층이 NaSO4에서의 건조되고, 감압하에서 응축되어, 칼럼 크로마토그래피(10% EtOAc-헥산)에 의해 잔류물로부터 분리된 무색 오일의 타이틀의 화합물을 얻는다. 1H NMR(CDCl3): δ 7.97(1H, d, J = 1.8 ㎐), 7.67(2H, dd, J = 2.1, 8.0 ㎐), 7.34(5H, m), 7.10(1H, d, J = 8.1 ㎐), 6.12(1H, d, J = 4.6 ㎐), 2.59(3H, s), 2.39(2H, d, J=4.8 Hz), 1.38(6H, s).
4-[3-옥소-3-(7,8-디히드로-5-페닐-8,8-디메틸-2-나프탈렌일)-1-프로펜일]-안식산향염(화합물 103)
EtOH의 5.0ml 및 THF의 10ml에서의 3,4-디히드로-1-페닐-4,4-디메틸-6-아세틸나프탈렌(화합물 100H) 115.0mg의 수용액에, NaOH 120.0mg (3.00mmol; 1M 수용액의 3.04ml)가 첨가된다. 최종 황색 수용액은 12시간동안 실온에서 교반된다. 수용액은 6% 수용성 HC1로 산성화되고 EtOAc로 추출된다. 결합된 유기층은(MgSO4)로 건조되고, 감압하에서 응축되어, 타이틀의 화합물을 칼럼 크로마토그래피(50% EtOAc-헥산)에 의해 연한 황색의 고체로서 타이틀의 화합물을 얻는다. 1H NMR(CDC13): δ 8.13(2H, d J=7.7Hz), 8.04(1H, s), 7.81(1H, d, J=15.5Hz), 7.55(3H, m), 7.60(1H, d, J=15.5Hz), 7.35(5H, m), 7.14(1H, d, J=8.1Hz), 6.15(1H, d, J=8.1Hz), 2.41(2H, d, J=4.2Hz), 1.41(6H, s).
핵 수용체 어고니스트 강화 방법
개괄 및 도입부
우리는 음성적 호르몬 활성을 나타내는 레티노이드 길항제의 부형태가 다른 레티노이드 및 스테로이드 수용체 수퍼패밀리 호르몬의 생물학적 활성을 강화하는 데에 사용될 수 있다는 것을 알았다. 이들 다른 레티노이드 및 스테로이드 수용체 수퍼패밀리 호르몬은 내생 호르몬 또는 조제약일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 레티노이드 음성적 호르몬과 결합하여 사용될 때, 특정 조제 레티노이드 어고니스트의 활성은 특정 생물학적 효과를 나타낼 때 더욱 활성적이 될 수 있다. 이러한 약 투여시의 결합은 적은 양의 조제된 레티노이드가 더욱 효과를 내어 사용될 수 있기 때문에 조제된 레티노이드의 부작용을 최소화할 수 있다.
더욱 특별하게는, AGN 193109, 도 1에서 나타낸 구조를 갖는 합성 레티노이드는 예상치 않은 조제 활성을 나타내는 것을 알았다. AGN 193109은 레티노이드 반응 유전자의 전사를 자극하거나 이들 수용체를 활성화하지 않고 핵 수용체의 RAR 부형태에 대해 높은 친화력을 나타낸다. 대신에, AGN 193109은 레티노이드 어고니스트에 의해 RAR의 활성을 나타내므로 레티노이드 길항제로 행동한다.
부가하여, 레티노이드 음성적 호르몬이 우리는 특정 병의 증후군을 대조하기 위해서 레티노이드 어고니스트 또는 스테로이드 호르몬의 공동 투여 없이 사용될 수 있는 것을 알았다. 더욱 상세하게 설명하면, 레티노이드 음성적 호르몬은 리간드되지 않은 RAR에 반응하는 유전자의 고레벨의 기본 전사를 하향-조정할 수 있다. 예를 들면, 대조되지 않은 셀룰러 전사가 리간드되지 않은 RAR에 반응하는 유전자의 활성으로부터 유발되게 되면, 이 유전자 활성은 RAR를 비활성화시키는 레티노이드 음성적 호르몬의 투여에 의해 저감될 수 있다. 따라서, 리간드되지 않은 RAR의 활성에 따른 셀룰러 증식은 음성적 호르몬에 의해 방지된다. 리간드되지 않은 RAR의 방지는 종래의 길항제를 이용하여 성취될 수 있다.
우리는 AGN 193109이 RAR 기초 활성을 억제할 수 있으며 다른 레티노이드 및 스테로이드 수용체 수퍼패밀리 호르몬 어고니스트의 활성을 강화할 수 있다. 본 발명의 내용에서는, 음성적 호르몬의 존재시, 어고니스트의 농도 감소는 어고니스트 단독으로 성취될 수 있는 동일한 양적 반응을 끌어내는 경우, 호르몬 어고니스트는 AGN 193109과 같은 음성적 호르몬에 의해 강화된다. 양적 반응은 예를 들어, 리포터 유전자 에세이에서 측정된다. 따라서, 특정 투여량이나 농도로 사용될 때의 원하는 반응을 끌어내는 치료상의 레티노이드는, AGN 193109와 관련하여, 치료상의 레티노이드의 적은 투여량이나 농도가 치료상의 레티노이드가 단독으로 사용될 때의 치료상의 레티노이드의 많은 투여량이나 농도와 동일한 효과를 내는 데에 사용될 수 있으면, AGN 193109으로 강화된다. AGN 193109와의 공동 투여로 강화될 수 있는 어고니스트의 리스트는 RAR 어고니스트, 비타민 D 수용체 어고니스트, 글루코티코이드 수용체 어고니스트 및 타이로이드 호르몬 수용체 어고니스트를 포함한다. 더욱 특별하게는, 공동 투여로 강화될 수 있는 특정 어고니스트는: 13-시스레틴산, 합성 RAR 어고니스트 AGN 191183, 1,25-디히드록시비타민 D3, 덱사메타손 및 티로이드 호르몬(3, 3',5-트리요오드타이로닌)을 포함한다. 또한 여기에 기재된 것은 AGN193109의 공동 투여로 강화될 수 있는 다른 호르몬을 식별하는 데에 사용된다.
따라서, AGN 193109는 단순한 레티노이드 길항제로 가정되는 것이 아니라, 핵 수용체 족의 여러 맴버의 호라성을 강화할 수 있는 음성적 호르몬으로서 행동한다. 또한 우리는 음성적 호르몬 활성과 AGN 193109의 능력이 다른 핵 수용체 리간드의 활성을 강화하는 것으로 설명할 수 있는 가능한 기구를 개시한다. 이 기구는 레티노이드-의존 시그널링 경로에 참가하고 부가하여 새로운 음성적 조정 성분과 결합하는 것으로 알려진 요소에 관련된다.
당업자들은 AGN 193109 결합의 고친화성 타겟인 RAR이 여러 레티노이드 반응 유전자의 표현을 조정하는 전사 요소인 것을 알 것이다. RAR에 대한 시스(Cis)-조정 DNA 결합 위치는 레티노이드 의존 형식으로 전자 조정되는 근처의 유전자로 식별된다. 레티노이드 산 반응 요소(RARE)로 알려진, 이러한 DNA 사이트에의 RAR 결합이 잘 정의되어 있다. 중요하게는, RARE는 하나의 RAR 및 하나의 RXR으로 이루어지는 헤테로디머에 결합한다. 헤테로디머의 RXR 성분은 RAR/RXR 헤테로디머 및 RARE 사이의 고친화성 반응을 조장하는 역할을 한다.
후술하는 바와 같이, AGN 193109의 음성적 호르몬 활성에 관련한 우리의 연구는 RAR과의 추정되는 음성적 고액티베이터 프로테인(NCP)의 상호 작용을 포함하는 기구와 일치한다. 이 제안된 기구에 따르면, 이 상호 작용은 AGN 193109에 의해 안정화된다.
우리는 결론은 또한 AGN 193109이 AGN 193109에 의해 점유되는 RAR 이외의 핵 수용체와의 상호 작용을 위한 NCP의 세포 내의 유용성을 조절한다. AGN 193109은 NCP와결합하는 능력을 RAR과 공유하는 핵 수용체를 포함하는 전사 조정 경로를 강화할 수 있다. 이와 관련하여, AGN 193109은 다양한 핵 수용체 경로를 조정하는 능력, 종래의 레티노이드 길항제에 대해 예측할 수 없던 능력을 나타낸다. 따라서, AGN 193109은 내생 호르몬과 처방 치료를 포함하는 핵 수용체 리간의 활성을 강화하기 위한 약품으로 유용하다. 이 특정 실시예는 핵 수용체 음성적 호르몬 NCP와 결합하는 다른 핵 수용체의 활성을 강화한다는 일반 원리를 설명한다.
여기에서 설명된 것과 유사하거나 등가인 다른 재료 및 방법이 본 발명의 실험 또는 실행을 위해 사용될 수 있지만, 바람직한 실시예 및 재료를 이하 설명한다. 여기에서 설명하는 여러 핵산 제조를 실행하는 데에 사용될 수 있는 방법의 일반 참조는 Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1998) 및 Current protocols in Molecular Biology(Ausubel et al. eds., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscinece 1987). 본 발명의 형성을 이끄는 실험 및 결과의 설명은 이하와 같다 :
실시예 6은 AGN 193109이 고친화력으로 세 개의 RAR 각각과 결합하지만 레티노이드 의존 유전자 표현을 활성화하지 못한 것을 증명하는 방법을 설명한다.
[실시예 6]
AGN 193109이 고친화력으로 결합하지만 레티노이드 의존 유전자 표현을 활성화하지 못한다.
인간의 RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ, 수용체는 J. Biol. Chem. 262 : 26625(1993)에서 알레그레토 등에 의해 기술된 방법에 따라서 바큘로비루스 표현 시스템을 사용하여 재조합 프로테인으로서 각각 표현된다. 재조합 수용체 프로테인은 Cell 68 : 397(1992)에서 헤이만 등에 의해 설명된 [3H]-ATRA 대체 에세이를 사용하여 AGN 193109 결합 친화력을 결정하는 데에 이용된다. 해리 상스(Kds)는 Biochemical Pharmacology 22 : 3099(1973)에서 Cheng 등에 의해 설명된 공정에 따라 결정된다.
AGN 193109은 또한 RAR 표현 벡터와 순간적으로 공동 주입된 CV-1 세포에서 RAR를 활성하는 능력이 시험된다. 수용체 표현 벡터 pRShRAR-α, pRShRAR-β, pRShRAR-γ (Ishikawa 등의 Mol. Endocrinol. 4 : 837(1990)가 개별적으로 △MTV-TREp-Luc 리포터 플라즈미드와 공동 주입된다. 이 루시페라제 리포터 플라즈미등의 사용은 Cell 68 : 397(1992)에서 헤이만에 의해 개시되어 있다. △MTV-TREp-Luc 플라즈미드는 클로램페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 리포터 유전자가 루시페라제를 인코딩하는 폴리뉴클리오티드 시퀀스와 대체된다. 그린 원숭이 CV-1 세포의 주입이 Molecular Cloning에서 설명된 칼슘 포스페이트 공동 전사 방법을 사용하여 실행된다 : Alaboratory Manual(Sambrook 등의 eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). CV-1 세포는 12개의 웰 멀티 웰 플레이트에서 4×104의 밀도로 플레이트되어 표준 실험 공정에 따라 리포터 플라즈미드 0.7㎍과 리포터 플라즈미드 0.1㎍을 함유하는 칼슘 포스페이트 침전물로 순간 주입된다. 세포는 18시간 후에 세정되어 침전물을 제거하고 소과의 세럼이 추출된 10% 활성화 챠콜을 함유하는, 듀벨코의 수정 이글의 메체(DMEM)(Gibco)이 재공급된다. 세포는 부형제단독(에타놀) 또는 AGN 193109 (10-9내지 10-6M)로 18시간 동안 처리된다. 세포 용해질은 0.1MKPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA에서 제조된다. 루시페라제 활성은 루시페린 및 EG＆G Berthold 96-웰 플레이트 루미노미터를 이용하여 Mol. Cell. Biol. 7 : 725(1987)에서 de Wet등에 의해 설명된 바와 같이 측정된다. 보고된 루시페라제 값은 삼중 결정의 평균 ±SEM를 나타낸다.
표 11에서 나타낸 결과는 AGN 193109이 RAR-α, RAR-β, 및 RAR-γ 각각과 고친화력을 결합하지만, 레티노이드 의존 유전자 표현을 활성화하지 않은 것을 나타낸다. 더욱 상세하게는, AGN 193109은 2-3mM범위의 Kd값을 갖는 세 개의 리포터 각각과 결합한다. 이 단단한 결합에도 불구하고, AGN 193109은 ATRA에 의해 자극된 유도와 비교할 때 유전자 표현을 활성화하지 못한다. 따라서, AGN 193109(EC50)의 최대 유효 농도의 절반은 측정 불가능하다. 표에서는 나타내지 못했지만, AGN 193109이 RXR에 대해 측정가능한 친화력을 갖지 않음을 발견했다.
실시예 7은 AGN 193109이 ATRA 의존 유전자 표현의 길항제인 것을 증명하는 방법을 설명한다.
[실시예 7]
ATRA에 의한 AGN 193109 의존 RAR 활성 방지
ATRA 완화된 RAR 활성에 반대로 작용하는 AGN 193109의 능력은 Sambrook 등(Molecular Colning : A laboratory Manual Cold Spring Harbor lab Publ. 1989)에 의한 칼슘 포스페이트 공동 전사 방법에 의해 공동 주입된 CV-1 세포에서 조사된다. 성숙핵 표현 벡터 pRshRAR-α, pRshRAR-β, pRshRAR-γ은 홀렌버그 등에 의해 설명된 △MTV-Luc 리포터 플라즈미드로 공동 주입된다. 리포터 플라즈미드는 TRE-팔린드로믹 반응 요소의 두개의 복사물을 얻는다. 칼슘 포스페이트 주입은 실시예 6에서 설명된 바와 같이 동일하게 실행된다. 세포는 부형제 단독(에타놀), ATRA(10-9내지 10-6M), AGN 193109(10-9내지 10-6M), 또는 AGN 193109(10-9내지 10-6M)과 결합한 10-8M ATRA가 주입된다. 세포 용해질과 루시페라제 활성 측정은 실시예 6에서와 같이 실행된다.
이 공정의 결과는 루시페라제 값이 삼중 실험의 평균±SEM을 나타내는 도 2A 내지 2F에서 나타낸다. 더욱 상세하게는, 도 2A, 2C 및 2E에서 나타낸 결과는 ATRA가 주입된 세포의 자극은 루시페라제 활성의 투여량 반응 증가를 이끈다는 것을 나타낸다. 이것은 ATRA가 실험 시스템에서 세 개의 RAR 각각을 호라성화 하여 길항제의 활성을 검출하기 위한 비교 기준을 제공한다. 도 2B, 2D 및 2F에서 나타낸 그래프 결과는 10nM ATRA가 주입된 세포의 공동 처리 및 AGN 193109의 증가 농도가 루시페라제 활성의 방지로 이끈다는 것을 나타낸다. 특히, 동일한 양의 AGN 193109과 ATRA는 모든 세 개의 RAR 부형태에 대해서 ATRA 단독에 대해서만 50% 이상의 방지를 제공한다. 다른 농도의 AGN 193109의 존재시 ATRA 투여량 응답의 비교는 ATRA가 AGN 193109에 의해 경합적으로 방지되는 것을 나타낸다. 도 2의 모든 그래프에서 수평축은 레티노이드 농도의 로그를 나타낸다. 이들 결과는 AGN 193109가 강력한 RAR 길항제이다.
우리는 AGN 193109의 길항제 활성의 기초가 되는 기구를 밝히는 실험을 행하였다. 당업자들은 핵 수용체 활성이 리간드 결합에 의해 유도된 수용체의 형상 변경을 포함하는 것으로 알고 있다. 실제로, 프로테아제 보호 에세이의 결과는 핵 호르몬 어고니스트와 길항제가 수용체 프로테인이 다른 형상에 적용하게 되도록 한다는 것을 확인했다(Keidel 등의 Mo1. Cell, Bio1. 14:287(1994); Allan 등의 J. Bio1. Chem. 267:19513(1992). 우리는 AGN 193109 및 ATRA가 RAR-α 이 다른 형상에 적합하게 하는지를 판정하도록 이 에세이를 사용했다. AGN 193583, RAR-α 선택 길항제는 프로테아제 감도의 길항제 특정 패턴에 일치하도록 알려진 포지티브 대조로서 포함된다.
실시예 8은 AGN 193109 결합으로부터 결과된 RAR-α의 형상 변경을 검출하는 데에 사용되는 하나의 방법을 설명한다. 후술하는 바와 같이, 이 과정의 결과는 AGN 193109이 ATRA, RAR 어고니스트에 의해 유도된 것과 동일하고, 모델 RAR 길항제에 의해 유도된 것과는 다른 트립신의 패턴을 유도하는 것을 나타낸다.
[실시예 8]
프로테아제 보호 분석
벡터 pGEM3Z(파머시아)로 구성되고 RAR-α cDNA를 포함하는 플라즈미드는 시험관전사-전환 시스템(프로메가) 내의 TNT-결합된 레티쿠로사이트 용해질과 결합하여 사용되어 RAR-α로 라벨된 [35S]-메티오닌을 제조한다. 프로테인 RAR-α의 제한된 소화는 케이델에 의해 설명된 방법에 따라 실행된다. RAR-α로 라벨된[35S]-메티오닌을 함유하는 레티클로사이트 용해질의 부분 표본은 9μl의 체적에서 45분간 아이스상의 ATRA, AGN 193583 또는 AGN 193109로 인큐베이트된다. 모든 시도 동안 레티노이드 최종 농도는 ATRA 및 AGN 193109에 대해 100nM이고, AGN 193583에 대해서는 1000nM이다. 레티노이드의 최종 농도 간의 차이는 ATRA와 AGN 193109 (각각 RAR-α에서의 Kd를 2와 10nM를 가짐)과 AGN 193583(RAR-α에서의 Kd를 ≥100nM)의 상대적인 친화력의 약 10배차에 근거한다. 리간드 결합 후에, 거의 응축된 트립신의 1μl은 혼합물에 첨가되어 최종 농도 25, 50 또는 100μg/ml를 부여한다. 샘플은 10분간 실온에서 인큐베이트되고 트립신 소화는 SDS-샘플 버퍼로 정지된다. 샘플은 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동되어 표준 과정에 따라 방사선 사진 촬영된다.
어고니스트와 길항제는 리간드되지 않은 수용체의 소화로 성취되는 결과와는 다른 트립신 감도의 패턴을 만든다. 방사선 사진 결과는 트립신 농도 25, 50 및 100μl/ml는 레티노이드 첨가가 없을 때 실온에서 10분 내에 라디오라벨 RAR-α로 완전 소화됨을 나타낸다. ATRA의 사전 결합은 두 개의 주 프로테아제 저항 종의 출현을 이끈다. RAR-α 선택적 길항제 AGN 193583의 사전 결합은 ATRA 사전 결합으로부터 결과된 것보다 분자 중량이 적은 것으로 되어 있는 프로테아제 저항종을 만든다. 이 결과는 레티노이드 어고니스트와 길항제가 변경된 트립신 감도 덕분에 형상변경을 검출 가능하게 한다. 놀랍게도, AGN 193109의 사전 결합은 ATRA의 사전 결합에 의해 생긴 것과 구별 불가능한 프로테아제 보호 패턴을 만든다.
상기 결과는 AGN 193109이 RAR-α에 결합하여 그 형상으로 변경한다는 것을 확인시켜 준다. 이 형상 변경의 특성은 길항제(AGN 193583) 결합에 의해 생성된 변경 보다 어고니스트(ATRA)의 결합으로 결과된 것에 더욱 근접하게 유사하다. AGN 193109 의존 길항제의 기구는 독특한 것이 명백하다.
우리는 이 기구가 AGN 193109의 길항제 활성을 설명할 수 있다고 생각한다. 특히, 우리는 AGN 193109이 RAR/RXR 헤테로디머 형성을 방해하거나 RAR과 그 동족체 DNA 결합 위치 사이의 상호 작용을 방지하는지를 시험하기 위해서 표준 젤 전이 에세이를 사용한다.
실시예 9는 AGN 193109가 RAR/RXR 이량 중합을 방지하지 않고 또한 타겟 DNA에 대한 디머의 결합을 금지하지 않는 것을 나타내는 데에 사용되는 젤 전기 영동 이동 전이 에세이를 설명한다.
[실시예 9]
[젤 이동 분석]
시험관 내에서 전환된 RAR-α는, 35S-라벨된 메티오닌이 생략된 것을 제외하고는, 실시예 8에서 설명된 것과 같이 생성된다. 시험과 내에서 전환된 RXR-α은 만젤스도르프에 의해서 설명된 RAR-α cDNA를 포함하는 pBluescript(Ⅱ)(SK)-게 벡터를 시험관 내에서의 전사를 발생하기 위한 템플릿으로서 사용하여 유사하게 생성된다. 라벨된 RAR-α 및 RXR-α 단독이나 결합, 또는 이들의 단독이나 결합물에 AGN193109(10-6M)을 미리 결합한 것이 시퀀스 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3'(SEQ ID NO:1)를 갖는 엔드 라벨된 DR-5 RARE 이중 표준 프로브와 상호 작용하게 된다. 결합 혼합물은 비변성 폴리아크릴 아미드 젤 상에 전기 영동되어 표준 과정에 따라 방사선 사진 촬영된다. 젤 상의 모든 레인에 공통인 방사선 사진에 나타난 하나의 지연 종은 레티클로사이트 용해질에 나타나는 정의되지 않은 프로브 결합 요소를 나타낸다. RAR/RXR 결합만이 레티노이드 수용체 특정 지연종을 발생한다. RAR 단독이나 RXR 단독은 프로브에 결합하여 이 이전된 종을 생성한다. AGN 193109의 존재는 이 상호 작용을 감소시키지 않는다.
이들 결과는 AGN 193109이 RAR-α의 호모 또는 헤테로 이량 중합 특성을 변경시키지 않는다. 또한 AGN 193109는 코그네이트 결합 위치를 함유하는 DNA 세그먼트와 수용체 디머와의 상호 작용을 방지하지 않는다.
AGN 193109에 특징이 있는 특성에 비추어, 이 길항제가 리간드되지 않은 RAR의 활성을 방지하는지를 조사한다. 이 결정에 사용되는 수용체/리포터 시스템은 레티노이드 어고니스트의 첨가가 있을 때 고레벨의 활성을 나타낸다. 더욱 상세히 설명하면, 이들 공정은 ER-RAR 키메릭 수용체 및 ERE-tk-Luc 리포터 시스템을 이용한다. ERE-tk-Luc 플라즈미드는 클레인-히트파스 등에 의해서 설명한 바와 같이, 플라즈미드 tk-Lucdml HSV 티미딘 카나제 프로모터 및 루시페라제 리포터의 상류측에서 결찰된, 제노푸스 비텔로진(Xenopus vitellogenin) A2 유전자의 에스트로겐 반응 5'-플랭킹 영역의 -397 내지 -87을 포함한다. ER-RAR 키메릭 수용체는 RAR의 'D-E-F' 영역에 용융되는 에스트로겐 수용체 DNA 결합 영역으로 이루어진다. 당업자들은레티노이드 유도 활성 기능을 제공하고, RXR과의 헤테로디머리제이션을 위한 접촉 위치를 제공하기 위해서, 레티노이드에 결합하는 'D-E-F' 영역을 이해할 것이다. 따라서, 이 리포터 시스템에서의 루시페라제 표현은 주입된 키메릭 수용체 구성의 활성에 따라 다르다.
실시예 10은 AGN 193109이 리간드되지 않은 RAR에 기인하는 기초 유전자활성을 방지하는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 개시한다. 이들 공정은 레티노이드 어고니스트의 첨가가 없을 때 실행된다. 이하의 결과는 AGN 193109이 음성적 호르몬 활성을 나타내는 것을 먼저 나타낸다.
[실시예 10]
순간 공동 주입된 셀 라인의 레티노이드 조정 리포터의 기초 유전자 활성의 억제
CV-1 세포는 ERE-tk-Luc 리포터 플라즈미드 및 ER-RAR-α, ER-RAR-β, ER-RAR-γ 표현 플라즈미드가 공동 주입된다. ERE-tk-Luc 플라즈미드는 제누푸스 레비스 비텔로제닌(Xenopus laevis vitellogenin) A2 유전자의 에스트로겐 반응 프로모터 요소를 포함하고, CAT 리포터 유전자가 폴리뉴클레오티드 시퀀스 엔토딩 루시페라제에 의해 치환되는 것을 제외하고는, Cell 46:1053(1986)에서 케인-히트패스 등에 의해 설명된 리포터 플라즈미드와 동일하다. 공동 주입시 이용되는 ER-RAR-α, ER-RAR-β, ER-RAR-γ 키메릭 리포터-엔코딩 폴리뉴클레오티드는 Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)에서 그라우프너 등에 의해 설명된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 Cell 45:721(1986)에서 엘리스에 의해 서령된 pECE 표현 벡터에 리게이트되어 SV-40 프로모터의 전사 대조 하에서 표현된다. 칼슘 포스페이트 주입은 리포터 플라즈미드 0.5㎍/웰 또는 수용체 플라즈미드 0.05㎍, 0.10㎍ 또는 0.2㎍/웰을 이용하여 실시예 6에서 설명된 바와 같이 정확하게 실행된다. 세포는 18시간 동안 부형제 단독(에타놀), ATRA(10-9내지 10-6M), 또는 AGN 193109(10-9내지 10-6M)이 주입된다. 셀 용해질 및 루시페라제 호라성 측정은 실시에 6에서 설명된 바와 같이 실행된다.
도 3A, 4A, 및 5A에서 나타낸 결과는 ATRA는 모든 주입제에서 루시페라제 표현을 강하게 도입하는 것을 확인하여 준다. 세 개의 주입된 키메릭 RAR 이소포머에 대한 루시페라제의 기초 수준의 표현은 약 7,000 내지 40,000 상대적 라이트 유닛(rlu)의 범위 내에 있다. 따라서, 세 개의 키메릭 수용체는 ATRA에 의해 활성가능하다. 더욱 상세하게는, 모든 세 개의 수용체는 ATRA와 결합하여 루시페라제 리포터 유전자의 활성 전사가 ERE-tk-Luc 플라즈미드 상에 놓이게 된다.
도 3B, 4B, 및 5B는 어느 레티노이드 어고니스트의 부재시 성취되는 AGN 193109 투여량 응답을 나타낸다. ER-RAR-α(도 3B)는 AGN 193109에 의해 영향을 받지 않는 반면, ER-RAR-β, ER-RAR-γ 키메릭 수용체(도 4B 및 도 5B)는 루시페라제 리포터 활성의 AGN 193109의 투여량 응답 감소를 나타낸다.
우리는 AGN 193109의 음성적 호르몬 활성을 연속적인 전사 활성제 영역을 갖도록 하는 키메릭 RAR-γ 수용체에 의해 완화된 유전자 표현을 억제하는 능력을 시험함으로써 조사하였다. 더욱 상세하게 설명하면, 우리는 두 형태의 루시페라제 리포터 시스템에서, RAR-γ-VP-16으로 불리는 HSV VP-16의 산 활성체 영역에 용융된 RAR-γ 키메릭 수용체를 사용하였다. 첫 번것은 ER-RARs 및 ER-RAR-α가 공동 주입된 ERE-tk-Luc로 이루어진다. 두 번째 것은 ERE-tk-Luc 리포터 대신에 △MTV-TREp-Luc를 이용한다.
실시예 11은 AGN 193109이 RAR의 전사 활성체 영역의 활성을 억제할 수 있는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다. 그 결과는 AGN 193109이 오고니스트 부재시 RAR-의존 유전자 표현을 억제하고 AGN 193109이 음성적 호르몬 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있는 것을 증명하고 있다.
[실시예 11]
순간 주입된 세포의 RAR-VP-16의 억제
CV-1 세포는 ERE-tk-Luc 리포터 플라즈미드 0.5㎍/웰, 및 Er-RAR-α 키메릭 리포터 표현 플라즈미드 0.1㎍/웰, 및 RAR-γ-VP-16 표현 플라즈미드의 0.1㎍ 또는 0.1㎍/웰 표현 플라즈미드를 이용하여 실시예 6에서 설명된 칼슘 포스페이트 공동 주사 기술에 따라 순간 공동 주입된다. 키메릭 수용체 ER-RAR-α는 에스트로겐 수용체 DNA 결합 영역에 용융된 RXR-α(맨젤스도르프 등의 Nature 345:2240229(1990))의 호르몬 결합 영역의 (아미노산 181 내지 458)로 이루어지며 Cell 45:721(1986)에서 엘리스 등에 의해 설명된 표현 벡터 pECE에 기초한 SV-40으로부터 표현된다. RAR-γ-VP-16은 EMBO J.12:2349(1993)에서 나그팔 등에 의해 설명된 VP16RAR-γ1과 동일하며, 완전 길이의 RAR-γ의 아미노 터미누스에 용융되는 HSV의 VP-16 프로테인의 활성 영역을 갖는 키메릭 프로테인을 엔코드한다. 18시간의 이전 주입시, 세포는 포스페이트 버퍼 염(PBS)으로 세정되고 레티노이드를 제거하도록 챠콜로 추출된10%의 FBS(제미니 생체 물품)을 함유하는 DMEM(지브코-BRL)이 공급된다. 세포는 18시간 동안 부형제나 에타놀 단독 내의 적당히 희석된 AGN 193109 또는 ATRA가 주입된 다음에, PBS로 세정되고 0.1MKPO4(pH 7.8), 10% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA를 사용하여 용해된다. 루시페라제 활성은 루시페린과 EG＆G 버톨드 96-웰 플레이트 루미노미터를 사용하여, Mol, Cell, Biol. 7:725(1987)에서 드 웨트 등에 의해 설명된 방법에 따라 측정된다. 루시페라제 값은 삼중 측정의 평균 ±SEM를 나타낸다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, CV-1 세포는 ERE-tk-Luc 리포터 구성으로 주입되고, ER-RAR-α 키메릭 표현 플라즈미드는 ATRA 내지 9C-RA의 이성화로 인하여, ATRA에 의해 루시페라제의 약한 활성을 나타낸다. 리포터와 키메릭 수용체 플라즈미드의 혼합물이 주입되지만 AGN 193109으로 처리된 세포는 푸시페라제 활성에 대해 효과를 나타내지 않는다. AGN 193109는 RXR에 결합하지 않기 때문에, 후자의 결과가 예측된다. CV-1 세포는 ERE-tk-Luc 리포터가 유사하게 주입되지만 ER-RXR-α의 ER-RAR 키메릭 수용체 표현 플라즈미드의 치환으로 ATRA 처리에 이은 루시페라제 활성의 유도를 나타낸다.
반대로, 주입 화합물의 ER-RXR-α 및 ERE-tk-Luc과 RAR-γ-VP-16의 포함으로 레티노이드 첨가가 없을 때 측정된 기초 루시페라제 활성을 증가시킨다.
ER-RXR-α이 주입된 세포를 사용하여 성취된 결과와 비교하여, ER-RXR-α/ER-RXR-γ-VP-16 공동주입제에서 관찰되는 기초 루시페라제 활성의 증가는, 재결합되는 ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16 프로테인이 동성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 헤테로디머와 시스-조정 에스트로겐 반응 요소의 상호 작용은 ERE-tk-Luc 리포터의 프로모터 영역에 대한 VP-16 활성 영역의 타켓팅을 유도한다. 이러한 프리플리 주입된 세포를 ATRA로 처리하는 것은 고레벨에 대한 루시페라제 활성의 증가를 이끈다. 그러나, AGN 193109으로의 트리플 주입제의 처리는 루시페라제 활성의 투여량 의존 감소를 유발한다. 중요하게는, 도 6은 ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16이 공동 주입된 세포의 AGN 193109 처리는 루시페라제 활성의 억제를 이끌고 약 10-8M AGN 193109에서 최대 방지의 루시페라제 활성의 억제가 발생한다.
AGN 193109이 RXR 존재시 RAR-γ-VP-16의 연속적인 전사 활성 기능을 억제하는 관찰은 AGN 193109의 RAR의 결합이 트랜스-액팅 음성적 공동작용제 프로테인의 결합을 촉진하는 음성적 형태를 안정화하는 RAR의 형상 변경을 유도하는 모델로 설명된다. AGN 193109/RAR 컴플렉스가 NCP로 결합될 때, RAR은 활성된 RAR에 통상 반응하는 유전자의 전사를 상향 조정할 수 없게 된다. 우리의 모델을 또한 NCP의 세포 내의 저장소가 특정 컨텍스트에서 농도를 제한하고 AGN 193109 자극된 RAR과의 컴플렉션 덕분에 제거될 수 있음을 제안한다.
도 6에서 나타낸 결과는 10-6M AGN 193109에서도, ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16 프로테인이 리포터 유전자의 전사를 활성화하기 위한 헤테로디머 경합체를 형성하도록 상호 작용하는 것을 나타낸다. 더욱 상세하게는, 최대 방지를 제공하는 데에 충분한 농도(10-8내지 10-6M)에서, ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16으로 주입되어 AGN 193109이 처리된 세포는 약 16,000rlu의 루시페라제 활성을 제공한다. 루시페라제 활성의고레벨은 10-6M AGN 193109의 존재시에도 ER-RXR-α 및 RAR-γ-VP-16을 표현한 세포에서 성취된다는 사실은, 두 재결합 리포터 사이의 상호 작용의 지속성을 증명한다. AGN 193109에 의한 RAR-γ-VP-16의 억제는 NCP 상호 작용의 조정이 VP-16 활성과 공동 지배될 수 있음을 암시한다. 따라서, 우리는 AGN 193109 의존 방식으로 레티노이드에 의해 통상 조정되지 않는 유전자의 표현을 조정할 수 있음을 알았다.
AGN 193109 조정 가능한 유전자의 후보는 non-RAR 요소로 이루어지는 전사 요소 컴플렉스에 의해 활성화되는 것을 포함하고, 여기에는 non-RAR 요소는 활성을 위한 RAR 어고니스트를 필요로 하지 않는다. RAR 어고니스트로의 자극은 이러한 유전자의 표현에 대해 효과를 갖지 않지만, AGN 193109의 투여는 AGN 193109/RAR/NCP를 포함하는 비활성 전사 컴플렉스의 형성을 조장할 수 있다. 따라서, AGN 193109 레티노이드 음성적 호르몬의 부가는 다른 레티노이드 비감각 유전자의 전사를 하향 조정할 수 있다.
이 동일한 기구는 HL-60 세포의 조직 트랜스글루타미나재(TGase) 유전자의 활성을 억제할 수 있다. 5개 및 7개의 염기 쌍으로 이격된 세 개의 카노니컬 레티노이드 하프 위치로 이루어지는 레티노이드 반응 요소는 이 유전자의 전사 대조 영역에서 식별된다. TGase는 RXR-선택적 어고니스트로 유도될 수 있지만, RAR-선택적 어고니스트에 반응하지 않는다. TGase 레티노이드 반응 요소는 RAR/RXR에 의해 결합된다. 흥미롭게도, AGN 193109은 RXR 어고니스트에 의해 유도된 TGase활성을 억제할 수 있다. 이 AGN 193109 완화 억제는 헤테로디머의 NCP를 RAR에 시퀘스터하여, 관련RXR 의 활성을 억제하기 위한 음성적 호르몬의 능력으로 고려될 수 있다.
우리는 또한 RAR-γ-VP-16 및 표현 구성과 RAR-γ-VP-16 대신에 △MTV-TREp-Luc 리포터 플라즈미드 및 ERE-tk-Luc 리포터 플라즈미드와 결합한 ER-RXR-α 표현 구성을 이용하여 실시예 11 하에서 제시된 것과 동일한 결론을 지지하는 결과를 성취했다. 상술한 결과와 일치하게, 우리는 AGN 193109이 이 키메릭 수용체가 리포터 플라즈미드의 프로모터 영역의 에스트로겐 반응 요소에 간접적으로 결합하는 대신에 레틴산 수용체 반응 요소에 직접 결할될 때 RAR-γ-VP-16 활성을 억제한다. 이들 연구는 음성적 호르몬 활성을 갖는 약품을 식별하기 위한 에세이가 특정 리포터 플라즈미디의 이용으로 제한받을 필요가 없음을 증명한다. 대신에, 레티노이드 음성적 호르몬을 식별하는 데에 유용한 실험으로 구체화된 중요 특성은 연속적인 전사 활성 영역을 포함하도록 한 RAR의 활성을 억제하는 화합물의 능력을 검출하는 것을 포함한다.
일반적으로, 레티노이드 호르몬은 수용체의 DNA 결합 영역에 대한 레티노이드 수용체 위치 C-터미널의 최소한의 영역을 포함하는 레티노이드 수용체 또는 키메릭 수용체에 의한 직접 또는 간접 결합에 전사 반응하는 리포터 유전자의 기초 레벨의 표현을 주입된 세포 내에서 억제하는 레티노이드 화합물의 부형태로서 식별 될 수 있다. 이것은 레티노이드 음성적 호르몬을 식별하는 데에 사용되는 스크린 방법에 적용된다. 발명된 스크린 방법의 여러 실시예에서는, 음성적 호르몬을 볼 수 있는 수용체의 구조는 변경 가능하다. 더욱 상세하게 설명하면, 레티노이드 수용체는 RAR 또는 RXR 부형태중 어느 것일 수 있다. 수용체는 선택적으로 연속적인 전사 활성체 영역을 포함하도록 할 수 있다. 음성적 호르몬을 스크린하는 데에 사용되는 레티노이드 수용체는 네이티브 수용체에 내생하는 DNA 결합 영역의 치환 체로서 이종성 DNA 결합 영역을 포함한다. 그러나, 제2 수용체가 스크린 방법에서 사용되고, 제2 수영체가 음성적 호르몬을 볼 수 있는 레티노이드 수용체로 이량화될 수 있을 때, 이 레티노이드 수용체는 전사 대조 영역에 자체가 결합되는 제2 수용체와의 이량화를 통해 간접적으로 리포터 유전자의 전사 대조 영역에 링크될 수 있기 때문에 DNA 결합 영역을 필요로 하지 않는다.
스크린 방법의 실행시, 리포터의 기초 표현의 억제를 위한 화합물의 능력은 통산 시험관 내의 에세이에서 측정된다. 기초 표현은 외생으로 첨가된 레티노이드 어고니스트가 존재하는 조건하에서 주입된 세포에서의 리포터 표현의 기초 레벨을 나타낸다. 선택적으로, 시험관 내에 세포를 배양하는 데에 사용되는 세럼의 챠콜 추출과 같은 공정을 통해 주입된 세포의 환경으로부터 내생 레티노이드 리간드를 제거하는 단계를 취할 수 있다.
스크린 방법에 따라 유용한 리포터 유전자의 예는 면역 화학 수단에 의해 검출될 수 있는 루시페라제, 베타 갈락토시다제, 클러램패니콜 아세틸 트랜스페라제 또는 세포 표면 안티젠을 엔코딩한 것을 포함한다. 실제, 리포터 유전자의 성직을 본 방법의 동작성에 중요한 것으로 생각되지는 않는다. 그러나, 리포터 구성의 전사 조정 영역은 음성적 호르몬을 볼 수 있는 전사 요소의 타겟인 하나 이상의 시스-조정 요소를 포함해야 한다. 예를 들어, RAR 음성적 호르몬을 식별하려고 하면, 리포터 구성의 전사 조정 영역은 RAR-함유 프로테인에 의해 결합될 수 있는 시스-조정 요소를 함유할 수 있다. 이 예에서는, RAR의 DNA 결합 영역과 리포터 구성의 전사 조정 영역의 시스-조정 요소 사이에 일치성이 있어야 한다. 따라서, 시스-조정 에스트로겐 반응 요소에 결합할 수 있는 연속적인 전사 활성체 영역과 키메릭 RAR이 스크린 방법에서 이용되면, 리포터 구성의 전사 조정 영역은 에스트로겐 반응 요소를 함유해야 한다.
리포터 에세이와 관련하여 유용한 레티노이드 수용체(RAREs)와 직접 결합하는 시스-조정 요소의 예는, The Retinoid Receptors in The Tetinoids: Bioiogy, Chimistry anc Medicine, 2nd edition, eds, Sporn et al, Raven Press, Ltd, New Yord(1994)에서 말겔스도르프 등에 의해 기재되어 있다. 키메릭 수용체와 간접적으로 결합하는 시스-조정 요소의 예는, 프로테인의 DNA 결합 영역이 레티노이드 수용체에 부착된 DNA 결합 영역으로 이루어지는 키메릭 수용체에 결합될 수 있는 DNA 결합 프로테인용 DNA 결합 위치를 포함한다. 키메릭 수용체 내에 만들어질 수 있으며 시스-조정 요소를 인식하게 되는 이종성 DNA 결합 영역의 특정 예는 레스트로겐 반응 요소를 인식하는 것을 포함한다. 따라서, 스크린 방법과 관련하여 유용한 키메릭 수용체의 레티노이드 수용체 프로테인은 레티노이드 수용체의 DNA 결합을 포함할 필요가 없고 레티노이드 수용체의 최소한의 리드간 결합 영역을 포함해야 한다.
시스-조정 요소에 결합하는 간접 레티노이드 수용체의 다른 예는 시스-조정 요소에 결합할 수 있으며 레티노이드 수용체와 이량화하는 프로테인의 사용을 포함한다. 이 경우, 레티노이드 수용체는 DNA 결합을 담당하는 프로테인과의 결합에 의해서만시스-조정 요소와 결합한다. 이러한 시스템의 예는 RAR과의 이량화를 담당하는 RXR의 최소한의 영역을 함유하여, RXR에 용융되는 이종성 DNA 결합 영역으로 이루어지는 용융 프로테인의 사용을 포함한다. 공동 도입된 RAR은 시스-조정 요소에 결합되는 용융 프로테인과 이량화할 수 있다. 루이는 시스 조정 요소와 RAR의 간접 결합을 유발하기 위하여 RAR과 이량화되는 어느 시스-조정 요소 결합 프로테인도 또한 음성적 스크린 방법의 이용에 적합하게 됨을 가정할 수 있다.
스크림 방법의 바람직한 실시예에서는, 레티노이드 음성적 호르몬은 기초 활성이 증가한 RAR 전사 인자의 기초 표현을 억제하는 레티노이드로서 식별된다. 스크린 방법의 동작성에 필수적이진 않지만, 다음의 실시예에서 이용되는 RAR는 연속 적인 전사 활성 영역을 포함한다. 이 키메릭 수용체의 사용은 리포터 유전자의 기초 표현이 어느 레티노이드의 부재시도 상승될 수 있게 하는 수단을 제공한다. 우리가 상술한 공정에서 순간 주입을 이용하고 있어도, 키메릭 수용체를 연속적으로 표현하는 안정되게 주입된 세포 라인은 스크린 방법과 관련하여 유용할 수 있다.
다음의 예에서 설명하는 바와 같이, 연속적 전사 활성 영역을 갖는 키메릭 레티노이드 수용체는 에스트로겐 반응 시스-조정 요소에 특정한 DNA 결합 영역을 포함하도록 한 제2의 수용체과 이종성 이량화 가능하다. 이 경우 연속적인 전사 활성체 영역을 갖는 키메릭 레티노이드 수용체가 DNA 타켓 시퀀스와 결합하는 제2 수용체와의 결합을 통해 리포터 유전자 표현을 간접적으로 조절하는 시스-조정 영역과 결합한다. 더욱 특별하게는, 제2 수용체는 에스트로겐 반응 요소를 인식하는 DNA 결합 영역을 포함하도록 설계되어 있다. 상류측 프로모토 영역의 에스트로겐 반응 요소를 갖는 리포터 유전자는 연속적인 전사 활성체 영역을 갖는 주입 키메릭 수용체 부재시 레티노이드 어고니스트에 반응하지 않는다. 따라서, 모든 리포터 유전자 활성은 주입된 수용체에 있다고 생각한다. 에스트로겐 반응 요소 DNA 결합 영역과 에스트로겐 반응 요소 시스-조정 요소를 결합하여 사용한 것은 오직 설명만을 위한 것이다. 당업자들은 non-RARE 시스-조정 요소에 대해 특이성을 갖는 수용체의 다른 결합도 본 발명의 스크린 방법의 실용에 유용하게 된다.
스크린 방법에 관련하여 유용한 세포는 주입될 수 있는 유카로틱 세포일 수 있다. 세포는 인간, 영장류 동물 또는 설치류 동물과 같은 동물의 세포일 수 있다. 우리는 다른 배향 세포 라인이 또한 성공적으로 사용될 수 있는 것을 제외하고는, CV-1 세포를 사용하여 매우 양호한 결과를 성취했다. 당 기술에서 공지된 다수의 종래 주입 방법은 연속적인 전사 활성체 영역을 갖는 키메릭 레티노이드 수용체를 엔코딩하는 표현 구조를 도입하는 데에 사용될 수 있다.
연속적 전사 활성체 영역은 중성 pH 조건하에서 음성적 챠지로 표현되는 전체 산 특성을 가질 수 있는 복수의 아미노산으로 이루어진다. 예를 들어, 연속적 전사 호라성체는 또한 바이러스 전사 인자에서 발견될 수 있는 아미노산 시퀀스를 가질 수 있다. 연속적 전사 활성체 영역을 갖는 전사 인자를 헤프페스 심플렉스 바이러스 16이다. 그러나, 다른 바이러스 또는 합성 전사 활성체 영역은 연속적 전사 활성체 영역을 갖는 키메릭 레티노이드 수용체를 엔코딩하는 표현 구조에 사용될 수 있다.
후설하는 바와 같이, 우리는 레티노이드 음성적 호르몬을 식별하는 데에 사용되는 일반 스크린 방법을 개발했다. 이 스크린 방법은 음성적 호르몬과 간단한 길항제를구별하는 수단을 제공한다. 표 12는 RAR-γ에 대한 친화력을 나타내는 몇 가지 레티노이드 화합물을 보여주고 있으며, ATRA가 순간 공동 주입 프랜섹터 베이션 에세이에서 이 수용체를 크랜색티베이트하지 않는 예외가 있다. 따라서 우리는 어떤 것이 RAR-γ 길항제이며, 이들 길항제중 어떤 것이 음성적 호르몬 활성을 나타내는지를 결정하기 위해서 이들 화합물을 시험했다.
실시예 12는 길항제인 레티노이드 화합물을 식별하고, 음성적 호르몬 활성을 나타내는 길항제의 부형태를 식별하는 데에 사용되는 방법을 설명한다.
[실시예 12]
레티노이드 음성적 호르몬의 에세이
4×104CV-1 세포는 Molecular Cloning에서 설명된 칼슘 포스페이트 공동 전사 광정에 의해 주입된다: 0.5㎍ EAE-tk-Luc 리포터 플라즈미드와 0.1㎍ ER-RAR-γ (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)) 키메릭 압축 플라즈미드를 사용한 A Laboratory Manual (Sanbrook et al. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). 18시간 후에, 세포는 PBS로 세정되고 10% 활성 챠콜 추출 FBS (Gemini Bio-Products)을 함유하는 DMEM (Gibco-BRL)이 공급된다. 세포는 에타놀내의 10-8M ATRA 또는 에타놀 단독으로 처리된다. 또한 ATRA 시험된 세포는 표 12에서 리스트된 10-9, 10-8, 10-7, 또는 10-6M의 화합물로 처리된다. 18시간 후, 세포는 PBS로 세정되고, 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA에서용해된다. 루시페라제 활성은 Mol. Cell. Biol. 7:725(1987)에서 드웨트 등에 의해 설명되는 바와 같이 측정된다.
a 바큘로비루스 표현된 RAR-γ에의3H-ATRA 결합과 챙-푸르소프 방정식의 적용으로 결졍된 상대성 친화력(Kd)
b △MTV-TREp-Luc 및 RS-RAR-γ으로의 순간 공동 주입된 CV-1 세포에서 측정된 EC50
도 7과 표 12에서 부분적으로 나타낸 결과로 나타낸 바와 같이, ATRA를 제외하고, 표 12의 모든 화합물은 RAR-γ에서의 레티노이드 길항제이다.
표 12에서 분류되는 RAR-γ 길항제는 또한 Molecular Cloning에서 설명된 칼슘 포스페이트에 따라 주입된다: 0.5㎍ ERE-tk-Luc 리포터 플라즈미드와 0.1㎍ ER-RAR-γ (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554(1991)) ALC 0.2㎍ RAR-γ-VP-16 (Nagpal et al. EMBO J. 12:2349(1993) 키메릭 표현 플라즈미드를 사용한 A Laboratory Manual (Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). 18시간 후에, 세포는 PBS로 세정되고 10% 활성 챠콜 추출 FBS (Gemini Bio-Products)을 함유하는 DMEM (Gibco-BRL)이 공급된다. 세포는 에타놀내의 10-8M ATRA 또는 에타놀 단독으로 처리된다. 또한 ATRA 시험된 세포는 표 12에서 리스트된 10-9, 10-8, 10-7, 또는 10-6M의 화합물로 처리된다. 18시간 후, 세포는 PBS로 세정되고, 0.1M KPO4(pH 7.8), 1.0% TRITON X-100, 1.0mM DTT, 2mM EDTA에서 용해된다. 루시페라제 활성은 Mol. Cell. Biol. 7:725(1987)에서 드웨트 등에 의해 설명되는 바와 같이 측정된다.
도 8에서 나타낸 바와 같이, 표 12의 레티노이드 길항제는 RAR-γ-VP-16 키메릭 레티노이드 수용체의 연속적인 전사 활성 기능에 대한 효과로 두 분류로 분리될 수 있다. AGN 193174, AGN 193199 및 AGN 193840을 포함하는 하나의 그룹은 이들이 ATRA 길항제인 경우에도 RAR-γ-VP-16 활성을 억제하지 않는다. 반대로 AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 및 AGN 193871은 RAR-γ-VP-16 연속적인 활성의 투여량 의존 억제를 나타낸다. 따라서, 양 그룹의 화합물이 RAR-γ 길항제인 반면, 제2 그룹의 것들 만이 음성적 호르몬 활성을 나타낸다. 이 에세이는 레티노이드 음성적 호르몬을 단순한 레티노이드 길항제와 구별하도록 한다.
상술한 실험 결과는 AGN 193109이 음성적 호르몬을 형성하는 기준과 일치 하는 것을 증명한다. 더욱 상세히 설명하면, 실시예 11은 AGN 193109이 외생 첨가 레티노이드 리간드의 부재시에도 RAR에서 금지 활성을 가하는 능력을 갖는 것을 증명하고 있다. 이와 같이, 이 화합물은 RAR과 ATRA 및 AGN 191183과 같은 길항제 사이의 상호작용의 차단에 좌우되지 않는 생물학적 작용을 갖는다. 이들 연구는 AGN 193109이 RAR과 NCP 사이의 상호 작용을 안정화한다는 결론에 이르게 한다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, NCP/RAR/PCP 산호 작용은 평행 상태에서 존재한다. 어고니스트는 PCP 상호 작용을 증가하고 NCP 상호 작용의 감소하는 작용을 하는 반면, 역 어고니스트 또는 음성적 호르몬 NCP을 안정화하고 PCP 상호 작용을 감소시킨다. 이전에 나타낸 바와 같이, 우리의 실험은 다른 수용체에 대한 NCP의 설 내의 유효성은 AGN 193109 투여로 조절될 수 있음을 보여준다. 더욱 상세하게 설명하면, 우리는 AGN 193109은 RAR와 NCP 와의 컴플렉션을 조장하여, RAR 이외의 전사 요인과의 상호 작용에 유용한 NCP의 셀 내 저장소를 감소시킨다.
우리는 다음에 AP-1 의존 유전자 표현의 어고니스트 조정 방지에 대한 AGN 193109의 효과를 조사했다. Endor. Rev. 145:651(1993)에서, Pfhal은 레티노이드 어고니스트가 유전자 표현을 하향 조정할 수 있음을 개시하고 있다. Endocr. Rev. 145:651(1993)에서, Pfhal은 레티노이드 오고니스트가 관련된 AP-1 활성의 방지와 관련되는 기구에 의한 유전자 표현을 하향 조정할 수 있는 것을 개시한다. 우리는 AGN 193109이 AP-1 활성을 측정하도록 설계된 모델 시스템의 레티노이드 어고니스트와 관련하여 사용될 때 두 효과중 하나를 가진다고 생각했다. 먼저, AGN 193109는 어고니스트의 효과에 반대하므로, AP-1 활성의 어고니스트-의존 방지를 경감한다. 다르게는, AGN 193109은 어고니스트의 활성을 강화시키므로, AP-1 활성의 어고니스트 의존 방지를 증대시킨다.
실시예 13은 AGN 193109이 레티노이드 어고니스트의 앤티-AP-1 활성을 강화시킴을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다. 후술하는 바와 같이. AGN 193109 레티노이드 어고니스트는 AP-1 의존 유전자 표현을 방지한다. AGN 193109과 레티노이드 어고니스트의 결합은 AP-1 의존 유전자 표현을 방지한다. 자체로, AGN 193109은 반 AP-1 활성을 가지 않는다.
[실시예 13]
AGN 193109는 레티노이드 어고니스트의 앤티-AP-1 활성을 강화한다
HeLa 세포에는 LIPOFECTAMINE(Life Tenhnologies, Inc)를 사용하여, Nature 33:624(1987)에서 Giguere 등에 의해 설명된, Str-AP1-CAT 리포터 유전자 구조 1㎍과 플라즈미드 pRS-hRARα 0.2㎍으로 주입된다. Str-AP1-CAT는 pBLCAT3 (Natrisean et al., Mol. Cell. Biol. 6:1679(1986)의 HindⅢ-BanHI 위치들 사이에서 쥐의 스트로멜리신-1 프로모터(매트리샨 등, Mol. Cell. Biol. 6:1679(1986)의 위치 -84 내지 +1 대응하는 DNA 프래그먼트를 클로닝하여 준비된다. 스트로멜리신-1 프로모터의 시퀀스는 하나의 증진기 요소(Nicholson et al. EMBO J. 9:4443(1990)로서 AP1 모티프를 포함한다. 이 프로모터 시퀀스는 다음과 같은 두개의 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 준비한다:
5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCCAG-3'(SEQ ID NO:2), 및
5'-CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCAGAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3'(SEQ ID NO:3)
주입, 적당한 화합물로의 처리 및 CAT 활성의 측정을 포함하는 공정은 J. Biol. Chem. 270:923(1995) 에서 Nagpal 등에 의해 기술된 바와 같이 실행된다.
이들 공정의 결과는 AGN 193109가 레티노이드 어고니스트 AGN 191183의 안티-AP-1 활성을 강화한다는 것을 나타낸다. 더욱 상세하게는, AGN 191183의 10-12내지 10-10M의 농도 범위에서는 TPA-유도 Str-AP1-CAT 표현을 금지하지 않는다. 10-10내지 10-8M의 농도 범위의 AGN 193109의 처리는 AP-1 조정 리포터 활성을 금지하지 않는다. 그러나, 도 10의 결과는 10-12내지 10-10M의 농도 범위에서의 AGN 193109(10-8M)과 AGN 191183의 결합물로의 주입제의 자극 작용은 12% 내지 21%의 양에 의해 TPA 도입된 Str-AP1-CAT 표현을 방지하는 것을 나타낸다. 따라서, AGN 193109는 이 레티노이드 어고니스트가 AP-1 활성을 방지하지 않는 조건하에서 AGN 191183의 앤티-AP-1 활성을 강화한다.
우리는 AGN 193109이 RAR에 대한 NCP의 AGN 193109 의존 시퀘스트레이션을 포함하는 기구에 의해 AP-1 활성의 어고니스트 조정 억제를 강화하는 것을 알았다. RAR SMS 또한 1,25-디하이드록시비타민 D3글루코코디코이드, 티로이드호르몬, 에스트로겐 및 프로게스테론의 수용체를 포함하는 핵 수용체의 수퍼패밀리에 속한다. NCP와 결합하는 능력은 핵 수용체 수퍼패밀리의 여러 맴버 중에서 공유될 수 있다는 것은 가정이다. 이것은 핵 수용체의 수퍼패밀리와 상호 작용하는 하나 이상의 리간드의 반-AP-1 활성을 강화하는 것을 색악하게 한다.
이전의 실시예에서 제시한 이 결과는 AGN 193109이 레티노이드 어고니스트의 앤티-AP-1 활성을 강화하는 것을 나타낸다. 더욱 상세하게 설명하면, AGN 193109는 AGN 193109의 앤티-AP-1활성이 검출될 수 있는 임계 투여량을 저하시킨다. AGN 193109 자체가 앤티-AP-1 활성을 갖지 않기 때문에, 핵 수용체 어고니스트에 대한 효과는 상승하게 된다. 우리는 또한 AGN 193109 음성적 호르몬이 1,25-디히드록시비타민 D3, 비타민 D3수용체용 자연 리간드를 강화함을 알았다.
이전 실시예에서의 AGN 193109와 AGN 191183 사이에 관찰된 시너지는 레티노이드 어고니스트의 안티-AP-1 활성과 이 활성의 AGN 193109 조정 강화가 여러 기구에서 결과되는 것을 암시한다. 두 약품의 호라성 기구가 동일하기 때문에, AGN 193109과 어고니스트의 결합의 효과가 부가되게 된다. 대신에, 이 결합물은 이 연구 이전에 예측되지 않는 효과가 두 약품 단독 보다 더 효과가 있는 것으로 나타났다.
RAR 어고니스트의 AGN 193109-조정 강화는 레티노이드 어고니스트의 것보다 AGN 193109의 100배 몰 과다를 이용하여 실행된다. 따라서, 많은 RAR이 어고니스트 결합에 유용한 매우 소수의 RAR 만을 남기고 AGN 193109에 의해 결합되어야 한다. 이 사실에도 불구하고, AGN 193109에 의해 결합되지 않은 RAR 집단은 레티노이드 어고니스트에 결합할 수 있으며 리포터 유전자 표현의 방지로서 측정 가능한 어고니스트의 의존 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 우리의 데이터는 AGN 193109으로 유도되는 RAR의 이종성을 암시한다.
RAR과 NCP의 상호 작용을 조장하는 능력을 갖는 AGN 193109의 음성적 호르몬 활성은 AGN 193109과 게티노이드 어고니스트 사이의 시너지를 이해하는 기본을 제공한다. 우리의 결과는 AGN 193109의 세포 처리가 RAR과 NCP의 결합을 조장하는 모델과 완전히 일치하므로, 세포 내에서 자유 NCP와 자유 RAR 의 개수를 감소시킨다. 이것은 기능적으로 뚜렷한 두 집단의 RAR이 생성되게 한다. 제1 집단은 NCP와 결합된 RAR로 나타낸다. 이러한 AGN 193109/RAR/NCP 컴플렉스는 레티노이드 어고니스트에 의해 활성하될 수 없다. 제2 집단은 NCP로 결합되지 않고 어고니트스와의 상호 작용에 유용하게 유지되는 RAR로 이루어진다. 후자는 NCP가 삭제된 환경에서 자유 RAR을 나타내도록 'RAR＊'로 지정된다.
'RAR＊'는 평행 결합을 통해 NCP와의 결합 가능성을 감소시키고 예를 들어, 안티-AP-1 활성으로 측정 가능한 레티노이드 어고니스트에 대한 감도 증가를 갖는다. 이것은 NCP의 셀 내 저장소는 AGN 193109 투여 덕분에 삭제되는 한편, PCP의 저장소는 삭제되지 않기 때문이다. 따라서, 자유 RAR＊는 레티노이드 어고니스트에 결합하며 NCP가 삭제된 환경에서 PCP 인자와 상호 작용할 수 있다. 이들의 각 어고니스트에 대한 다른 핵 수용체의 감도를 증가시키는 AGN 193109의 능력은 AGN193109/RAR 콤플렉스와 상호 작용하는 동일한 NCP 와 상호 작용하도록 이들 여러 핵 수용체의 능력 덕분이다. 이러한 핵 수용체 패밀리 멤버에 대한 AGN 193109 조정 능력은 도 11에서 개략적으로 나타냈다.
이 기구 모델은 AGN 193109은 레티노이드 어고니스 이외의 핵 수용체 리간드의 활성을 조정할 수 있음을 예측할 수 있게 한다. 다음 예에서 설명한 바와 같이, 우리는 AGN 193109이 시험관 내의 트랜색티베이션 에세이에서 1,25-디히드록시 비타민 D3의 활성을 강화시킨다는 것을 확인했다.
실시예 14는 AGN 193109이 시험관 내의 트랜색티베이션 에세이에서 1,25-디히드록시바타민 D3의 활성을 증진시키는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 개시 하고 있다.
[실시예 14]
AGN 193109은 1,25-디히드록시비타민 D3활성을 강화한다
Hela 세포는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413(1987)에서 Felgner 등에 의해 설명된 양이온 리포솜 조정 주입 공정을 사용하여 주입된다. 5×104세포가 12웰의 멀티웰 플레이트에서 플레이트되어 10% FBS가 추가된 DMEM에서 성장된다. 세포는 LIPOFECTAMINE 리전트(Life Tehnologies, Inc.) 2㎍/웰을 사용하여 세럼 없는 매체에서, 리포터 플라즈미드 △MTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68:397(1992))와, 플라즈미드 pGEM3Z (Pharmacia Inc.) 0.3㎍을 최종 DNA 농도를 웰 당 1.0㎍가 되게 하는 캐리어 DNA로서 결찰되는 쥐 어스테오폰틴 유전자(Ferrara et al. J. Biol.Chem. 269:2971(1994))로부터 1,25-디히드록시비타민 D3반응 요소 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3'(SEA ID NO:4)의 두 복사물을 함유하는, 리포터 플라즈미드 MTV-VDRE-Luc 0.7㎍가 주입된다. 주입 6시간 후에, 세포는 최종 농도 10%에서 챠콜 추출된 FBS을 함유하는 성장 매체가 공급된다. 주입 18시간 후에 세포는 최종 농도 10-8또는 10-7M에서 에타놀에 부형제 단독(에타놀) 또는 AGN 193109 으로 처리된다. 6시간 후에, 1,25-디히드록시비타민 D3는 10-10내지 10-7M의 죄총 농도에 에타놀이 부가된다. 세포는 1,25-디히드록시비타민 D3처리 후 18시간 후에 용해되어 수확한다. 푸시페라제 활성을 상술한 바와 같이 측정한다. 이 실험은 1,25-디히드록시비타민 D3의존 유전자 표현을 모니터링하고 양측정하는 방법을 가능하게 한다.
도 12에서 나타낸 결과는 1,23-디히드록시비타민 D3단독을 사용하여 성취한 결과와 비교할 때, 1,25-디히드록시비타민 D3와 공동 투여된 AGN 193109이 투여량 반응 곡선을 좌측으로 이전시키는 것을 나타내고 있다. 이것은 시험관 내의 트랜색 티베이션 에세이에서 1,25-디히드록시비타민 D3의 효과를 강화하는 것을 확인시켜 준다. 더욱 상세하게 설명하면, 도 12는 10-10nM 만큼 낮은 AGN 193109 농도는 약 10배 더 활성적인 1,25-디히드록시비타민 D3이 됨으로 그래프로 설명한다. 1,25-디히드록시비타민 D310-8M이 약 2,000 rlu의 루시페라제 표현을 생성하는 데에 필요한 반면, 비타민이 10-8내지 10-7M에서 AGN 193109와 공통 투여될 때 동일한 1,25-디히록시비타민 D3의 10분의 1만이 동일한 루시페라제 출력을 생성하는 데에 필요하다. 도 12의 그래프 상에서 나타내지는 않았지만, 거의 동일한 결과가 10-9M과 10-8M의 AGN 193109 농도를 사용하여 성취된다. 따라서, AGN 193109과의 공동 투여는 음성적 호르몬의 부재시 유사한 효과를 생성하는 데에 필요한 1,25-디히드록시비타민 D3의 양을 상당히 저감시킨다.
놀랍게도, 상기 공정이 비타민 D 수용체(VDR) 표현 플라즈미드의 공동 주입이 반복될 때, 1,25-디히드록시비타민 D3의 활성을 강화하기 위한 AGN 193109의 능력이 일치하여 감소한다. 우리는 VDR의 과도 표현이 1,25-디히드록시비타민 D3활성을 강화하는 AGN 193109의 능력에 효과를 미칠 수 있는 것을 나타내는 것으로 이 결과를 해석했다. 따라서, 조직 특성 형태에서 다를 수 있는 리드간 수용체의 셀 간 농도는 수용체에 결합하는 리드간의 활성을 강화하는 AGN 193109의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 적정한 NCP는 비타민 D3반응의 조정으로 인한 모델과 일치하며, 상기한 바와 같은 모델을 지지한다.
다음 예에서 설명한 바와 같이, 우리는 또한 AGN 193109이 1,25-디히드록시 비타민 D3의 안티-AP-1 활성을 강화하는 것을 확인했다. AGN 193109 활성의 능력에 대한모델은 NCP가 이 약품의 존재시 RAR과의 결합을 자극함으로써 이를 설명한다. 내생 비타민 D는 1,25-디히드록시비타민 D3리드간에 더욱 민감하게 되고, 그 결과 Str-AP1-CAT 리포터로부터의 표현을 방지하는 이 리간드의 능력을 증가 시킨다.
실시예 15는 AGN 193109이 1,25-디히드록시 비타민 D3의 앤티-AP-1 활성을 강화하는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다.
[실시예 15]
AGN 193109는 1,25-디히드록시비타민 D3의 앤티-AP-1 활성을 강화한다
Hela 세포는 J. Biol. Chem. 270:923(1995)에서 Nagpal 등에 설명된 방법에 따라 LIPOEFECTAMINE를 사용하여 Str-AP10CAT 1㎍이 주입된다. 주입된 세포는 10-8M AGN 193109의 존재시 AGN 193109 단독(10-9내지 10-7M), 1,25-디히드록 시비타민 D3단독(10-12내지 10-7M)또는 1,25-디히드록시 비타민 D3(10-12내지 10-7M)으로 처리된다.
이들 과정의 결과는 AGN 193109가 TPA 유도된 AP-1 활성을 방지하는 1,25-디히드록시비타민 D3의 능력을 강화하는 것을 나타낸다. 10-9내지 10-7M의 농도 범위에서 사용될 때, AGN 193109는 측정 가능한 앤티-AP-1 활성을 갖지 않는다. 도 13에서 나타낸 결과는 10-8내지 10-7M 농도 범위에서만 TPA 자극되는 활성을 억제하는 것을 나탄낸다.10-8M AGN 193109 의 존재시 TPA 자극된 CAT 활성의 1,25-디히드록시비타민 D3에서 측정 가능하고 1,25-디히드록시비타민 D3처리만에 비교하여 10-8및 10-7M 투여량에서 활성이 증가하는 것을 나타낸다. 1,25-디히드록시비타민 D3조정된 안티-AP-1 활성의 AGN 193109 의존 조정은 RAR에 대한 NCP 시퀘스터레이션이 NCP를 다른 핵 수용체 패밀리 맴버와의 상호 작용에 대해 무효로 만드는 모델과 일치한다. 따라서, 수용체는 1,25-디히드록시비타민 D3처리에 더욱 민감하게 된다.
RAR 조정 트랜색티베이션 및 앤티-AP-1 활성의 기구는 다를 가능성이 있다. 이 결론은 앤티-AP-1 활성을 방지하지 않고 완전히 트랜색티베이션을 방지한다는 것에 기초한 것이다. 따라서 우리는 AGN 193109 처리로 조정되는 RAR＊ 형성의 모델을 지지하는 증거를 얻고 싶었다. 이를 성취하기 위해서, 우리는 시험관 내에서의 트랜색티베이션 에세이에서 RAR 특정 어고니스트 AGN 191183 의 활성을 강화할 수 있는지를 조사했다.
실시예 16는 AGN 193109이 RAR 특정 어고니스트, AGN 193109 의 활성을 강화하는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다. 이 과정의 결과는 특정 분위기 하에서 AGN 193109이 RAR 특정 레티노이드의 효능을 강화하고, AGN 193109이 RAR＊형성을 조장한다는 증거를 제공한다.
[실시예 16]
AGN 193109 공통 투여에 의한 레티노이드 효과의 강화
Hela 세포는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413(1987)에서 Felgner 등에 의해 설명된 양이온 리포솜 조정 주입 공정을 사용하여 주입된다. 5×104 세포가 12 웰의멀티웰 플레이트에서 플레이트되어 10% FBS가 추가된 DMEM에서 성장된다. 세포는 LIPOFECTAMINE 리전트(2㎍/웰, Life Tehnologies, Inc.)를 사용하여 세럼 없는 매체에서, 리포터 플라즈미드 △MTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68:397(1992)) 내에 삽입된 TREpal 반응 요소 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3'(SEQ ID NO:5)의 두 복사물과, RAR-γ표현 플라즈미드 pRShRAR-γ (Ishikaws et al. Mol. Endocrinol. 4: 837(1990)의 0.1㎍을 함유하는, 리포터 플라즈미드 MTV-VDRE-Luc의 0.7㎍가 주입된다. 주입 6시간 후에, 세포는 최종 농도 10%에서 챠콜 추출된 FBS을 함유하는 성장 매체가 공급된다. 주입 18시간 후에 세포는 최종 농도 10-11내지 10-8M에서 에타놀에 부형제 단독(에타놀) 또는 AGN 193109으로 처리된다. 6시간 후에, AGN 193109에는 0, 10-10또는 10-9M의 최종 농도로 에타놀이 첨가된다. 세포는 AGN 191183 처리 18시간 후에 수확되어 로시페라제 활성이 상술한 바와 같이 측정된다.
예비 실험은 10-9M AGN 193109가 HeLa 세포에서 10-9M AGN 191183에의 반응을 금지할 때 비교적 효과가 없음을 나타낸다. 이것은 CV-1 세포에서 10-8M ATRA를 방지하는 10-9M AGN 193109의 능력과 대조된다( 도 2).
도 14에서 나타낸 결과는 AGN 193109이 RAR＊의 형성을 자극한다는 예측을 지지한다. AGN 193109의 길항제와 음성적 호르몬 활성의 특성과 일치하게, AGN 193109의 처리는 이중 상의 투여량 반응 곡선이 생기게 한다. 최저 투여량의 AGN 193109 (10-11및 10-10M)은 AGN 191183 단독의 것 보다 루시페자제 활성의 자극이 결과된다. 이 효과는 RAR＊이 AGN 193109에 의해 발생되는 것을 암시한다. 이것은 또한 AGN 193109 처리 단독에서 볼 수 있으며, RAR＊은 내생 리간드에 반응할 수 있음을 암시한다. AGN 191183은 합성 레티노이드 어고니스트이며, ATRA와 같이 RAR을 통해 전사를 활성화 한다. 실시예 7에서 AGN 193109를 ATRA로 대체한 것은 질적으로 유사한 결과를 제공한다. (즉, AGN 193109는 10nM AGN 191183의 효과에 길항하게 된다). 실시예 16은 AGN 193109은 RAR 어고니스트의 길항제로서 기능하는 한편, AGN 193109 공동 투여는 RAR 어고니스트에 의해 조정되는 활성을 강화하는 복용 조건을 쉽게 식별할 수 있음을 설명한다. 실시예 16에서 사용되는 화합물의 투여량은 실시예 7에서 설명된 과정에서 사용되는 투여량 보다 더 작은 것이 중요하다. 우리는 AGN 193109 처리는 RAR 이질성 유전자 RAR 대 RAR＊을 유도할 수 있음을 제안했다. 명백한 이질성 ( 즉, 강화 능력)은 트랜색티베이션 대 AP-1 억제시 다른 윈도우를 갖는 것으로 보인다. 곡선이 이중 상인 이유는, AGN 193109 양이 증가함에 따라, 어고니스트를 결합하는 데에 유용한 RAR은 비례적으로 작아지기 때문이다. 이것은 AP-1 억제의 경우로 나타나지 않지만 우리는 이 차이가 동일한 수용체 종에 의한 트랜색티베이션 및 AP-1 억제의 두 기구를 반영해야 한다는 것을 생각하게 한다.
임상 결과는 몇 레티노이드가 전암성 및 악성 경부 병변의 성장을 방지하는 데에 유용한 것을 확인했다. 이 결론을 지지하는 예시적 연구는 West. J. Med. 145:192(1986)에서 Graham 등에 의해, J. Natl. Cancer Inst. 84:241(1992)에서Lippman 등에 의해, Invest. New Drugs 4:24191986)에 의해 발간되었다.
유사한 결론은 여러 레티노이드의 반증식성 효과를 측정하기 위해 배양된 세포를 사용하는 시험관 내 연구의 결과에 의해 지지된다. 더욱 상세하게 설명하면, Cancer Res, 51:3982(1991)에서의 Agarwal 등은 경부 이형성의 초기 단계를 모델화 하는 ECE16-1 세포 라인을 이용하고 레틴산은 표피 성장 인자(EGF)의존 세포 증식을 방지하는 것을 증명한다.
실시에 17은 AGN 193109 이 ECE16-1 세포 라인의 증식을 방지하는 AGN 191183 레티노이드 어고니스트의 활성에 길항할 수 있는 것을 증명하는 방법을 설명한다.
[실시예 17]
AGN 193109은 ECE16-1 세포의 레티노이드의 반증식성 세포에 내성이 있다
ECE16-1 세포는 DMEM:F12 (3:1), 비필수의 아미노산, 5% FBSS, 5㎍/㎖의 트랜스페린, 3,3',5 트리이도타이로닌(티로이드 호르몬 또는 T3'), 0.1nM 콜레라 중독, 2mM L- 글루타민, 1.8×10-4M 아데닌 및 10ng/㎖을 함유하는 완전 매체에서 ㎠당 1×1-4 세포의 밀도에서 성숙된다. 세포는 밤새 플레이트에 부착된 다음에 DMEM:F12 (3:1), 2mM L-글루타민, 비필수 아미노산, 0.1% 소의 세럼 알루민, 1.8×10-4M 아데닌, 5㎍/㎖의 트랜스페린, 2nM T3, 50㎍/㎕ 아스코르빈산, 100㎕/㎖ 스트렙토마이신, 100 units/㎖ 펠리신 및 50㎕/㎖ 글루타미신을 포함하는 매체에 전이 된다. 정의된 매체(DM)는 10ng/㎖ EGF 가 첨가된다. EGF 처리된 세포는 0,0.1, 1.0, 10,100 또는 1000nM AGN 193109 또는 1000nM AGN 193109 단독과 결합하여 AGN 193109 레티노이드 어고니스트의 10nM 를 수용한다. 삼일 간의 처리 후에, 세포는 Cancer Res. 54:3160(1994)에서 Hembree 등에 의해 설명한 바와 같이 증식되고 세포 개수는 cCOULTER 카운터를 이용하여 결정된다.
도 15에서 나타낸 결과는 ECE16-1 세포가 EGF에 반응하지만 정의된 매체 단독으로는 제외하고 증식되는 것을 증명한다. 이것은 J. Cell. Physic. 160:265(1994)에서 Andreatta-van Leyen 등에 의해, 그리고 cancer Res. 54:3160(1994)에서 Hembree 등에 의해 발간된 연구를 확인시켜준다. 10nM AGN 191183 alc 0nM AGN 193109 의 부가는 EGF 조정 증식을 완전히 방지한다. 따라서, AGN 191183은 효력 있는 반증식성 레티노이드이다. AGN 193109 농도를 0nM 에서 10nM로 증가하는 것은 AGN 193109 조정 성장 방지에 약 50%로 내성이 있다. AGN 193109 의 10배 몰 과다가 AGN 191183의 반증식 효과에 완전히 역행한다. 1000nM AGN 193109 단독으로의 세포 처리는 EGF 조정 증식 증가에 대한 효과를 갖지 않는다. 이 결과는 AGN 193109는 레티노이드의 반증식성 효과에 길항 하지만 AGN 191183과 같은 레티노이드에 의한 성장 방지에 민감한 경구 상피를 나타내는 세포를 처리하는 데에 사용될 때 그 자신의 반증식성 활성을 갖지 않는다. AGN 193109 이 ECE16-1 모델 시스템을 사용하여 AGN 191183 의 반증식성 활성을 강화한다는 증거가 없다.
ECE16-1 세포 라인에 의해 나타낸 모델 시스템과 대조하여, 경구 이형성과 관련된 셀 증식이 레티노이드 어고니스트에 의해 방지되는 다른 예가 있다. 예를 들면, Cancer Res. 54:2109(1994)에서 Agarwal 등은 레티노이드 치료에 반응하지 않는 경구 투여에 대한 모델로서 CaSki 세포의 사용을 설명한다. 후술하는 바와 같이, 세포 증식을 방지하기 보다는 레티노이드 처리가 CaSki 세포의 성장 비율에 대한 효과를 갖지 않는다. 다음의 예는 이 세포 라인의 증식 속도에 대한 AGN 193109 음성적 호르몬의 효과를 설명한다. 이 결과는 AGN 193109이 레티노이드 어고니스트의 반증식성 효과에 반응하지 않는 경구 투여 세포의 증식을 방지할 수 있는 것을 증명한다.
실시예 18은 AGN 193109 이 AGN 191183과 같은 레티노이드의 반증식성 효과에 반응하지 않는 경구 투여의 성장을 방지하는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다. AGN 193109는 레티노이드의 첨가 없이 반증식성 활성을 표시한다.
[실시예 18]
AGN 193109은 CaSki 경구암-유도 세포 라인의 증식 속도를 억제한다
우리는 10-6M의 농도에서 EGF의 단독 또는 AGN 191183 레티노이드 어고니스트 및/ 또는 AGN 193109 음성적 호르몬과의 결합의 CaSki 세포 증식 효과를 시험한다. 세포 증식 에세이는 ECE16-1 세포를 포함하는 연구에 대해 상술한 바와 같이 설명한다. EGF 는 10ng/㎖의 최종 농도를 부여하기 위한 레티노이드 처리 배양 물에 부가된다. 세포는 총 3일간 10-6AGN 193109의 존재나 부재시 AGN 191183(10-10내지 10-6M) 으로 처리된다. 매체는 신선한 매체로 대체되고 두 개의 레티노이드 화합물 각각은 매일 적당하게 대체된다. 세포 개수는 상술한 바와 같이 COULTER 카운터를 이용하여 결정된다.
도 16에서 나타낸 결과는 CaSki 세포는 레티노이드 어고니스트의 효과에 무 반응성이고 AGN 193109이 레티노이드 첨가 없이 반증식성 활성을 나타내는 것을 나타낸다. 이 결론은 AGN 191183 없음을 나타내는 스트립된 바와 정의된 성장 매체('DM') 단독을 나타내는 개방 바의 비교에 근거한 것이다. AGN 191183 처리는 CaSki 투여 세포 라인에 대한 반증식성 활성을 갖지 않는다. 레티노이드 어고니스트 농도의 1000배 증가가 증식 복도에서 약 20% 증가와 관련되기 때문에 우리는 베티노이드 어고니스트와 관련된 셀 증식 속도의 약간의 증가를 카운트하지 않았다. 따라서 AGN 191183 어고니스트는 CaSki 세포의 증식 속도에 대해 어떤 효과도 갖지 않는다.
도 16에서 나타낸 결과는 AGN 193109이 CaSki 경구암 세포 라인의 증식을 방지한다는 것을 나타낸다. 이 결론 '0' AGN 191183 블랙바와 '0' AGN 191183 스트립 바로 나타나는 측정의 비교에 근거한 것이다. 따라서, AGN 193109는 AGN 191183과 단은 레티노이드 어고니스트에 의해 정장이 방지되지 않은 경구 투여 세포를 처리하는 데에 사용될 때 레티노이드 어고니스트의 첨가 없을 때 생물학적 반응을 자극할 수 있다.
AGN 193109 음성적 호르몬이 셀 증식을 방지할 수 있는 우리의 발견은 리간드되지 않은 RAR이 증식에 필요한 유전자의 표현을 조정하는 모델과 일치한다. AGN 191183과 같은 RAR 어고니스트는 효과가 거의 없거나, 셀 증식을 약간 조장 하지만, AGN 193109은 반증식성 효과를 갖는다. AGN 193109 음성적 호르몬은 RAR 에 결합하여 NCP 결합을 조장하여 RAR이 비활성 형상에 일치화 한다. 우리의 모델에 따르면, 이것은 리간드되지 않은 RAR DP 의해 조정되는 유전자 활성을 억제한다. 리간드되지 않은 RAR 의 활성을 하향 조정하는 AGN 193109의 능력은 RAR과 NCP의 결합을 조장하는 능력으로부터 결과된다.
당업자들은 망막 분리에 이은 세포 성장의 원하지 않는 시퀀스를 제어하는데에 유용하다는 것을 이해할 것이다. 망막 분리 후에, 망막 착색 상피(RPE)는 역분화되고, 증식하며 부망막 공간에 이동한다. 이 공정은 망막 분리에 목적을 등 과정의 성공에 역효과를 주지 않는다. Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 32:65(1991)에서 Campochiaro 등은 ATRA와 같은 RAR 어고니스트는 일차 인간의 RPE 배양의 성장에 대한 반증식성 효과를 나타내는 것을 증명한다. 레티노이드 어고니스트는 망막 재부착 수술 후에 망막 분리의 빈도를 감소시키는 것으로 나타났다(Fekrat et al. Opthamology 102:41291994)). 다음의 예에서 개시하는 바와 같이, 우리는 일차 인간의 RPE 배양시 성장을 억제하기 위한 AGN 193109 음성적 호르몬의 능력을 분석했다.
실시예 19 AGN 193109이 인간의 망막 착색 상피의 일차 배양시 레티노이드 길항제의 반증식성 효과를 강화하는 것을 증명하는 데에 사용되는 방법을 설명한다.
[실시예 19]
AGN 193109 이 ATRA의 반증식성 활성을 강화한다
인간의 망막 착색 상피(RPE)의 일차 배양은 Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 32:65(1991)에서 Campochiaro 등에 의해 기술된 방법에 따라 만들어 진다. 5×104 세포는 5% FBSS를 함유하는 DMEM(Gibco)에서 24웰의 멀티웰 플레이트의 16㎜ 웰에서 플레이트된다. 세포는 에타놀 부형제 단독, 에타놀 내의 , ATRA(10-10내지 10-6M), 에타놀 내의 AGN 193109(10-10내지 10-6M), ATRA(10-10내지 10-6M) 및 10-6M AGN 193109 으로 처리된다. 세포는 전체 5일간의 처리 동안 매일 이들 화합물의 적당한 농도를 함유하는 신선한 매체가 공급된다. 세포는 트립신의 소화에 의해 플레이트로부터 제거되고 세포의 개수는 전자 세포 카운터로 카운트된다.
도 17에서 나타낸 결과는 AGN 193109이 RPE 세포에 대한 ATRA의 반증식성 활성을 강화하는 것을 나타낸다. ATRA로의 일차 RPE 세포 처리는 RPE 세포 증식의 투여량 의존 감소를 이끌어내고, 대조 배양에 상대적으로 10-6M ATRA에서 약 40% 감소한다. 기대치 않게도, ATRA(10-8내지 10-6M)과 10-6M AGN 193109 의 결합은 ATRA 단독 보다 더 강한 반증싱성 활성을 갖는다. 따라서, AGN 193109 공동 처리는 ATRA의 반증식성 효과를 강화시킨다. 더욱 상세히 설명하면, 도면에서 나타낸 결과는 10-8M ATRA의 반증식성 효과가 10-7M AGN 193109 과 결합하여 10-10 M ATRA만을 사용하여 성취할 수 있음을 나타낸다. 따라서, AGN 193109 는 약 100배 만큼 ATRA의 반증식성 활성을 강화시킨다.
개별적 실험에서 ATRA(10-11내지 10-6M)의 반증식성 효과와 ATRA과 다시 10-6M AGN 193109 과의 효과의 비교는 AGN 193109의 존재시 ATRA에 대한 일차 RPE 세포의 감도의 증가를 증명한다. 이 스스템에서, AGN 193109는 단독으로 사용할 때 레티노이드 길항제로서 기능하지 않고 반증식성 효과를 나타내지도 않았다. 그러나, AGN 193109 공동 투여는 레티노이드 어고니스트의 반증식성 활성을 강화한다.
AGN 193109는 상술한 RPE 세포 증식을 측정하는 조건과 기술을 사용하여 일차 RPE 배양물에서 12-cis 레틴산(13-cis RA)의 반증식 효과를 강화하는 능력이 시험된다. 13-cis RA는 치료에 중요하다. 더욱 특히, 13-cis RA는 여드름(Peck et al. n. Engl. F. Med. 300:329(1977); Jones et al. Br. J. Dermatol. 108:333(1980))과, 인터페론 2α(Lippman et al. J. Natl. Cancer Inst. 84:241(1991); Moore et al. Seminars in Hematology 31:31(1994))의 함께 치료하는 피부와 경관의 스쿼머스 편평 상피 세포 악성 종양을 포함하는, 몇가지 질병 상태의 치료에 유용하다.
도 18에 제공된 결과는, 13-cis RA(10-12내지 10-6M)과 ATRA(10-12내지 10-6M)모두 효과적으로 RPE 세포 성장을 억제함을 나타낸다. 특히, 13-cis 이성체는 ATRA와 비교하여 이 분석 평가에서 대략 2 오더 크기로 덜 효과적이었다. 상기한 ATRA와 AGN 193109의 공동 투여를 사용하여 얻어진 결과와 마찬가지로, 13-cis RA(10-12내지 10-6M)과 AGN 193109(10-8또는 10-6M 중의 하나)의 공동 투여는 RPE 세포 증식의 억제를 조정하는데 있어서의 13-cis RA의 효력을 현저히 증가시켰다. 13-cis RA 단독으로 처리하는 경우에 반해, AGN 193109 의 공동 투여는 13-cis RA의 효력을 향상시켰다. 이로써, AGN 193109은 13-cis RA의 반증식성 활성을 강화한다.
다음으로, 일차 RPE 세포 배양의 다른 핵 수용체 호르몬의 활성을 강화하는 AGN 193109의 효능을 텍스트하였다. 텍사메타손 (합성 글루코코르티코이드(glucocorticoid)수용체 어고니스트)는 효능있는 항염증약과 면역 억제용으로 임상적으로 사용된 화합물 종류중의 하나이다. 갑상선 호르몬(T3;3,3',5'-트리요도티로닌)은 갑상선 기능 부전증의 처리에 호르몬 대체 요법으로 주로 사용된 천연 갑상선 호르몬 수용체 어고니스트이다. 이들 실험에서 사용된 방법은 ATRA와 13-cis RA를 사용하는 처리와 관련하여 상술할 방법과 동일한다.
이들 처리의 결과는, AGN 193109와 핵 수용체 어고니스트의 공동 투여는 핵 수용체 어고니스트의 반증식성 활성을 강화시킴을 가리킨다. 보다 구체적으로, 도 19에 제공된 결과는, 덱사메타손(10-11내지 10-6M 또는 ATRA(10-12내지 10-6M)중의 하나를 사용하는 RPE 세포의 단일 약품 처리로는 RPE 세포 증식을 억제하는 것이 거의 불가능함을 나타낸다. 그러나, 덱사메타손(10-11내지 10-6M) 및 10-8또는 10-6M AGN 193109를 사용하는 RPE 세포의 처리는, ATRA를 사용하는 처리로 인한 억제에 가까운 정도로 RPE 세포 증식을 억제하였다. 마찬가지로, 도 20에 제공된 결과는, AGN 193109은 갑상선 호르몬의 반증식성 활성을 강화시킴을 나타낸다. 덱사메타손을 사용하여 얻어진 결과와 마찬가지로, RPE 세포의 증식은 갑상선 호르몬(10-11내지 10-6M)의 단일 약품 처리에 내성이 있었다. 그러나, 갑상선 호르몬(10-11내지 10-6M)과 AGN 193109(10-8또는 10-6M)를 사용하는 RPE 세포의 공동 처리는 갑상선 호르몬 의존 방식으로 RPE 세포 증식을 억제하였다. 따라서, AGN 193109는 일차 RPE 배양을 이러한 핵 수용체 어고니스트의 반증식성 효과에 민감하게 해줌을 확인하였다. AGN193109 이 이러한 효과를 조정하게 하는 메카니즘은 NCP/RAR 상호 작용의 변조를 수반하였다.
또한, 본 발명자들은 레티노이드 어고니시스트에 민감한 기타의 실험 시스템에 서의 마커(marker) 유전자의 표현상의 AGN 193109의 효과를 실험하였다. MRP8과 스트로멜리신 양자는 각종 생물학적 시스템에서의 레티노이드 어고이스트에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 월킨슨 등의 연구자[J. Cell Sci. 91:221(1988)]와 메디슨 등의 연구자[J. Invest. Dermatol. 99:299(1991)]는, MRP8 유전자 표현이 건선(psoriasis)의 경우 증강됨을 개시하고 있다. 이에 반해, MRP8 유전자 표현은 인간의 건선 피부(Nagpal et al., 1995), 인간의 케라티노사이트 라프트(keratinocyte raft) 배양[Chandraratna et al. J. Invest. Dermatol. 102:625(1994)] 및 배양된 인간의 신생 포피(foreskin) 케라티노사이트[Thacher et al. J. Invest. Dermatol. 104:594(1995)]의 레티노이드 어고니스트 AGN 190168에 의해 억제되었다. 한편, 스트로멜리신 mRNA 레벨은 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트의 AGN 190168와 같은 레티노이드 어고니스트에 의해 억제됨이 알려져 있다[Nagpal et al. J. Biol. Chem. 270:923(1995)]. 본 발명자들은 AGN 193109 레티노이드 어고니스트 또는 AGN 193109 중의 하나를 사용하는 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트의 처리에 이어지는 이들 유전자의 규칙적인 표현을 분석하였다.
실시예 20은, AGN 193109가 배양된 케라티노사이트의 MRP-8 표현을 억제함을 설명하기 위해 사용되는 방법을 개시한다.
[실시예 20]
AGN 193109는 케라티노사이트의 MRP-8 표현을 억제함
나그팔 등[Nagpal et al. J. Biol. Chem. 270:923(1995)]에 의해 개시된 처리에 따라 일차 포피 케라티노사이트가 분리되어 클로네틱스(Clonetics)로부터 얻어지는 케라티노사이트 성장 배양기(KMG)에서 배양되었다. AGN 191183(10-7) 또는 AGN 193109(10-6)로 처리한 3일 후, 총 세포 RNA는 표준 방법에 따라 처리되어 제어된 케라티노사이트로부터 분리되었다. mRNA는 cDNA내로 연전사된 후, 글리세르알데히드 포스페이트 탈 수소 효소(GAPDH) 하우스키핑 유전자 또는 MRP-8 중의 하나를 특정하는 프리머(primers)를 사용하여 PCR 증폭 프로토콜의 주형(template)으로서 기능하였다. GAPDH 프리머는 배열 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'(SEQ ID NO:6)과 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'(SEQ ID NO:7)를 가진다. MRP-8 프리머는 배열 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3'(SEQ ID NO:8)과 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3'(SEQ ID NO:9)를 가진다. MRP-8 증폭 반응(10μ1)으로부터의 분취량(aliquot)은 12 사이클에서 시작하여 21 사이클에서 끝나는 매 PCR 사이클 후에 제거되었다. 마찬가지로, GAPDH 증폭 반응의 분취량은 15 사이클에서 시작하여 24 사이클에서 끝나는 매 PCR 사이클 후에 제거되었다. 샘플은 2% 아가로우스상에서 전기 영동으로 분리되었으며 분리된 증폭 생성물은 에티듐 브로마이드 오염에 의해 겸출되었다. 증폭 생성물의 오염 강도는 주어진 프리머 세트를 특정하는 개시 mRNA의 양을 측정하는 역할을 한다.
이러한 처리 결과는, AGN 191183과 AGN 193109 양자는 독립적으로 케라티노사이트의 MRP-8 표현을 억제함을 나타낸다. 오염된 GAPDH 증폭 생성물의 강도는 AGN 191183과 AGN 193109 처리 케라티노사이트를 제어함으로써 분리된 개시 물질을 나타내는 겔의 레인(lsnes)에서 실질적으로 동일하다. GAPDH 증폭 생성물을 나타내는 약한 밴드(bands)는 PCR 증폭의 18 사이클 후에 제거된 샘플에 대응하는 레인에서 가장 먼저 검출가능하다. 겔의 여러 레인 중의 오염 강도가 동등하다는 것은, 모든 샘플에 대해 동등한 양의 개시 물질이 사용되었음을 나타낸다. 따라서, MRP-8 증폭 생성물을 나타내는 오염 밴드의 강도의 차이는 여러 개시 샘플중의 MRP-8 mRNA 표현의 차이를 나타낼 수 있다. MRP-8 증폭 신호는 AGN 191183(10-7M) 처리 배양에서 억제되었다. 배양된 케라티노사이트의 AGN 193109(10-6M) 처리도 오염된 증폭 생성물의 낮은 강도에 의해 판단되는 바와 같이 MRP8을 억제하였다.
다음의 예에서 예시되는 바와 같이, AGN 193109도 케라티노사이트의 제 2 마커 유전자의 압축을 억제하였다. 배양된 인간의 신생 포피 케라티노사이트의 RAR 특정 어고니스트에 의해 스트로멜리신 mRNA 표현이 하향 조절됨이 개시되었다[Nagpal et al., J. Biol. Chem. 270:923(1995)]. 또한, AP-1 프로모터 요소는 스트로멜리신-1 유전자의 레티노이드 의존 음성적 조절의 역할을 함이 개시되었다 [Nicholson et al.(EMBO J. 9:4443(1990)]. 이와 같이, AGN 193109가 이러한 유전자의 표현을 변환시킬 수 있는지의 여부를 결정하는 것을 관심사로 하였다.
예 21은 외인성으로 부가된 레티노이드 어고니스트의 부재시 AGN 193109이 스트로멜리신-1 유전자 표현을 억제함을 설명하기 위해 사용되는 방법을 개시한다.
[실시예 21]
AGN 193109은 배양 케라티노사이트의 스트로멜리신-1 표현을 억제함
일차 포피 케라티노사이트는 RAR 어고니스트 AGN 191183(10-7M) 또는 AGN 193109(10-6M)으로 24시간동안 처리 또는 모의 (mock) 처리 되었다. 나그팔등[Nagpal et al., J. Biol. Chem. 270:923(1995)]에 의해 개시된 바와 같이, 모의 처리 및 레티노이드 처리된 케라티노사이트로부터 마련된 총 RNA는 역전사되고 최종 cDNA가 β액틴 또는 스트로멜리신-1 올리고 프리모를 사용하여 PCR 증폭되었다. PCR 증폭의 18 사이클로부터 개시되는 매 3 사이클 후에 PCR 증폭 반응으로부터의 샘플(10μ1)이 제거되었다. 이 샘플은 2% 아가루우상에서 전기 영동으로 분리 되었으며 에티듐 브로마이드 오염후에 검출되었다.
이러한 처리 결과는, AGN 193109는 외인성으로 부가되는 레티노이드 어고니스트의 부재시 스트로멜리신-1 유전자 표현을 억제함을 나타낸다. 보다 구체적으로는, β 액틴 증폭 생성물을 나타내는 에티듐 오염 밴드는 PCR의 18 사이클후에 아가로우스 겔을 용이하게 검출할 수 있었다. 모든 밴드 강도는 증폭 반응의 추가 사이클과 함께 증가되었지만, 오염 밴드는 AGN 191183 처리 세포를 나타내는 샘플에서 다소 강도가 감소되었다. 이것은, AGN 191183로 처리된 세포에 대응한 개시 샘플에 약간 더 적은 양의 RNA가 제공되었음을 가리킨다. 이 결과는 또한, PCR 증폭의 33 사이클에서 개시되는 모의 처리된 케라티노사이트에서 스트로멜리신-1 mRNA를 검출가능함을 가리킨다. 스트로멜리신-1 mRNA 표현은, 모의 처리된 샘플로부터 도출된 샘플과 비교할 때의 보다 약한 밴드 강도에 의해 판단되는 바와 같이 AGN 191183(10-7M) 후에 억제되었다. β액틴 증폭 생성물의 강도로 정규화 될 때, MRP-8 표현의 측정에서 얻어진 결과와 일치하여, 케라티노사이트의 AGN 193109(10-6M) 처리는 스트로멜리신-1 mRNA 레벨의 하향 조절을 야기한다. 실제로, AGN 193109 처리에 의해 자극된 하향 조절은 RAR 어고니스트 AGN 191183에 의한 케라티노사이트의 처리로 인한 하향 조절과 구별되지 않는다.
AGN 193109는 공동 투여된 수퍼패밀리(superfamily) 어고니스트의 활성을 변조하는 것과 관련하여 다음의 세 가지 효과가 가능하다. 첫째, AGN 193109는 효과를 갖지 않을 수 있다. 둘째, AGN 193109는 어고니스트의 효과을 반관시켜, 어고니스트의 활성을 감소시킬수 있다. 마지막으로, AGN 193109는 어고니스트의 활성ㅇㄹ 강화 시켜 어고니스트에 의해 생성되어 측정된 효과를 고무시킬 수 있다.
AGN 193109에 의해 변조될 수 있는 활성을 갖는 화합물을 레티노이드 수용체 어고니스트 및 스테로이드 수용체 수퍼패밀리의 다른 멤버에 결합되는 어고니스트를 포함한다. 후자의 카테고리에 속하는 어고니스트는 비타민 D 수용체 어고니스트, 글루코코르티코이드 수용체 어고니스크 및 갑상선 호르몬 수용체 어고니스트를 포함한다. 현재 미지의 리간드(ligands)를 갖는 오펀(orphan) 수용체, 에스트로겐 수용체 및 페록시섬(peroxisome) 증식 활성 수용체가 AGN 193109에 의해 강화될 수 있다. 스테로이드 수퍼패밀리 어고니스트가 RAR 어고니스트인 경우, AGN 193109는 그어고니스트의 활성을 반감시키거나 강화할 수 있다. AGN 193109와 함께 사용된 어고니스크가 RAR 이외의 핵 수용체에 결합될 수 있는 화합물인 경우, AGN 193109의 공동 투여는 효과가 없거나 혹은 어고니스트에 대하여 시스템을 민감화하여 어고니스트의 활성이 강화되게 할 수 있다.
특정 시스템에서, 세 가지 가능성 있는 활성 AGN 193109를 결정하는 예시적인 처리는 다음과 같다. 이 설명은 스테로이드 수용체 수퍼패밀리 어고니스트와의 AGN 193109 공동 투여에 대해 가능한 각각의 결과를 예시한다. AGN 193109의 효능을 평가하여 핵 수용체 어고니스트의 활성을 변조하는데 유용한 생물학적 시스템은 살아있는 유기체를 이용하는 확립된 조직 배양 세포 라인, 바이러스성으로 변화된 세포 라인, ex-vivo 일차 배양 세포 및 in vivo 연구 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 시스템에서의 AGN 193109의 생물학적 효과의 측정은 각종 생물학적 종점(endpoints)의 결정을 포함할 수 있다. 이들 종점은 세포 증식 분석, 프로그램된 세포 죽음(apoptosis) 분석, 유전자 표현 평가를 통한 세포의 분화 상태의 분석, 누드마우스에 종양을 형성하기 위한 세포 효능의 분석 및 리포터 유전자 구조의 일시 또는 안정한 도입후의 유전자 표현 분석을 포함한다.
예시적인 목적을 위하여, mRNA 'X'와 같이 지정된 mRNA종은 기관 'Z'로 부터 분리된 일차 배양된 'Y' 세포의 유전자 'X'로부터 표현된다. 일부의 'Y' 세포 유전상의 마커가 유지되는 표준 배양 조건하에서, 유전자 'X'의 표현을 포함하여, 레티노이드 어고니스트의 추가는 다수의 'X' mRNA를 감소시킨다. 유전자 X표현의 분석은 노던(Northern) 분석과 같은 RNA 블로팅(blotting)절차, 리보뉴클레아제 보호 또는폴리메라아제 체인 반응을 거친 다수의 X mRNA 레벨의 측정 및 세포 mRNA의 분리를 통하여 평가될 수 있다. 기관 Z로부터 분리된 후, 일차 Y세포는 적당한 성장 배양기에서 배양된다. 그 후, 일차 배양은 세포군의 확장을 위하여 조직 배양판내에 놓여진다. 이러한 단계는 제 개의 샘플군으로의 세포의 분리를 용이하게 하여, 여러 투여량(doses)의 레티놀 어고니스트 및 AGN 193109가 전달될 수 있게 한다. 제1군은 단지 제어구, 수용 전달 수단일 것이다. 제 2군은 에타놀에 전달된 10-11내지 10-6M의 범위의 최종 농축을 제공하기에 충분한 양의 RNR 어고니스트, 레티논산(retionic acid)을 수용할 것이다. 가장 낮은 투여량은 시스템의 감도에 따라 경험적으로 결정될 필요가 있다. 이러한 결정은 당업자에게는 일상적인 실험 범주내에 속한다. 제 3군은 제 2군의 세포를 처리하는데 사용된 것과 동일한 투여량의 핵 수용체 어고니스트와 AGN 193109의 일정한 투여량 모두를 수용할 것이다. 제 3군의 세포를 처리하는데 사용된 AGN 193109의 투여량도 경험적으로 결정되어야 하나, RAR 아유형(subtypes)에 대한 AGN 193109의 유연 상수(Kd)에 가까워야 한다(즉, 적어도 10-8M). 제 4군은 최소한 제 3군의 어고니스트 공통 투여에 사용된 것을 포함하는 투여량의 AGN 193109수용할 것이다. 이러한 도우징 양생법(regimen)에 대한 다른 방법으로서, 제 2군으로서 특정된 바와 같이, 상기 예에서 설명한 레티노이드 어고니스트 대신 AGN 193109를 사용하고, 제2 및 제 4군으로 특정된 바와 같이, AGN 193109 대신에 일정 투여량의 레티노이드 어고니스트를 사용할 수도 있다. 적절한 기간 후, 세포는 어고니스트 활성의 인디케이터로서 측정되는 생물학적 종점의 결정을 위해 적합한 방식으로 채취되어야 한다.
예를들어, 유전자 표현의 조절에 따른 레티논산에서의 AGN 193109의 효과의 분석은 상술한 각각의 네 프로토콜에 따라 처리된 세포로부터 채취된 mRNA 풀(pool)에서의 다수의 mRNA 종 X의 비교를 수반하게 된다. 대조(control) 세포로부터 도출된 RNA는 X mRNA의 베이스라인 표현을 결정하도록 작용할 것이며, 비억제에 대응하는 조건을 재연할 것이다. 레티논산으로 처리된 세포로부터 도출된 mRNA 풀에서 측정된 레벨과 이 레벨을 비교하여, 유전자 표현상의 이러한 어고니스트의 효과를 결정할 수 있다. 이어서, 레티논산 처리로부터 야기되는 특정 mRNA의 억제의 양적 레벨은 AGN 193109 단독으로 혹은 레티논산과 AGN 193109의 결합과 병행하여 처리되는 세포로부터의 mRNA 다수와 비교될 수 있다. 이러한 일반화된 예는 레티노이드 어고니스트에 의해 억제된 유전자의 표현상의 공동 투여된 AGN 193109의 효과의 분석을 예시하지만, 이 예는 레티노이드 어고니스트에 의해 야기되는 유전자상의 공동 투여된 AGN 193109의 효과의 분석을 설명하기도 한다. AGN 193109가 특정 시스템에서 어고니스트로서, 음성적 호르몬으로서 또는 효과 없이 작용할 것인지의 여부를 결정하는 큰 특징은 AGN 193109의 존재 및 부재시의 효과의 크기에 대한 양적 비교를 수반할 것이다.
AGN 193109가 공동 투여된 어고니스트의 활성을 강화시키는 예는, 레티논산과의 AGN 193109 공동 처리가 레티논산 단독으로 처리된 세포에서 측정된 레벨에 비해 더 억제되는 X mRNA 표현의 레벨을 야기하는 경우를 포함한다. 보다 구체적으로는, Y축상의 생물학적 효과(즉, mRNA 다수의 억제) 대 X축상의 어고니스트의 투여량(대수적 스케일)의 투여량 반응 곤선을 비교함으로써 AGN 193109 공동처리의 존재 및 부재에 있어서의 X mRNA 다수의 어고니스트 조정 억제를 비교한다. 어고니스트에 대한 생물학적 반응을 민감하게 하여, 어고니스트의 활성을 강화시키는 AGN 193109의 효능은 투여량 반응 곡선의 왼쪽 방향의 이동으로 나타날 것이다. 즉, AGN 193109의 존재시, 어고니스트 단독을 사용하여 얻을 수 있는 것과 동일한 생물학적 효과를 얻는데에 보다 적은 어고니스트가 요구된다.
공통 투여된 어고니스트의 길항 작용을 조정하는 AGN 193109의 예는, 레티논산과 AGN 193109의 공동 처리가 레티논산 단독으로 처리된 세포에서 측정되는 경우와 비교하여 덜 억제되는 X mRNA의 레벨을 야기하는 경우를 포함한다. AGN 193109의 존재 및 부재의 어고니스트의 로그(log) 투여량 대 X mRNA 억제의 투여량 반응 곡선의 비교는 투여량 반응 곡선의 우측으로의 이동을 설명할 것이다. 보다 구체적으로는, AGN 193109의 존재시, 어고니스트 단독으로 처리하는 경우 얻을 수 있는 생물학적 효과와 동일한 효과를 얻기 위하여 보다 많은 어고니스트가 필요할 것이다.
AGN 193109가 길항 또는 강화를 조정하는 상기 예는 레티노이드 어고니스트와 AGN 193109의 공통투여에 대한 실험 결과를 기술한다. 그러나, 만일 AGN 193109와 공통 투여된 어고니스트가 RAR 이외의 스테로이드 수용체 수퍼패밀리중의 한 멤버와 결합하여 활성화시킬 수 있는 어고니스트이면, 어고니스트를 반감시키는 대신, AGN 193109가 어고니스트의 활성에 영향을 미치지 않게 되는 것도 가능하다. 이러한 어고니스트와 AGN 193109의 공동 처리가 어고니스트 단독으로 처리된 세포에서 측정되는 것과 동일한 mRNA 표현의 레벨을 야기하면, RAR:NCP 회합의 조장을 거쳐 NCP의 유용성에 영향을 미치는 AGN 193109의 효능은 이 시스템에 작용하지 않을 것이다. 이는, AGN 193109가 공동 투여된 어고니스트에 영향을 미치지 않는 예이다.
[길항 작용의 예]
레티노이드 어고니스트와 공통 투여되는 AGN 193109의 효과를 결정하는 상기 일반화된 예에서 개시된 방법은 예 7하에 기재된 절차에 예시화된다. CV-1 세포는 세개의 레티논산 수용체 중의 하나와 공동 주입되며, MTV-TREp-Luc 리포터 구조를 유도가능한 레티노이드 어고니스트는 에타놀(대조, 1군), 최종 농도 10-9내지 10-6M의 AGN 193109(2군), 10-8M의 레티논산과 공동 투여된 최종 농도 10-9내지 10-6M의 AGN 193109(3군) 또는 레티논산(10-8M, 4군) 중의 하나로 투여된다. 1군 루시페라세 활성을 4군의 루시페라제 리포터 유전자의 표현을 야기하는 레티노이드 어고니스트 레벨을 결정할 수 있다. 3군의 세포에서의 루시페라세 리포터 유전자 표현을 4군의 세포에서 측정된 것과 비교함으로써, AGN 193109가 이 시스템에서 레티노이드 어고니스트의 길항 물질로서 작용함을 알 수 있다.
[길항 작용의 예]
레티노이드 어고니스트와 공동 투여된 AGN 193109의 효과를 결정하기 위한일반화된 예에 개시된 방법은, 예 17에서 AGN 193109가 ECE-16-1 변형된 경부 상피 세포에서 EGF 자극된 세포 증식의 레티노이드 어고니스트 조정 억제의 길항 물질로서 작용하는 것을 결정하는데 마찬가지로 사용되었다. 이 과정에서, EGF 단독으로 처리된 대조 샘플(1군), 최종 농도 10-10내지 10-6M에서의 EGF와 AGN 193109의 조합으로 처리된 샘플(2군), 10-8M에서의 레티노이드 어고니스트 AGN 191183의 단일 투여량과 공동 투여된 최종 농도 10-10내지 10-6M에서의 EGF와 AGN 193109의 조합으로 처리된 샘플(3군), 및 10-8M에서의 AGN 191183과 EGF의 조합으로 처리된 샘플(4군)을 포함한다. 3일간의 처리 후, 세포 증식 비율이 결정되었다. EGF를 포함하지 않은 매체의 세포를 노출시키는 추가적인 대조 처리를 포함하므로, EGF에 의해 증식되도록 세포가 자극되는 측정이 가능하였다. 1군의 세포수를 4군의 세포수와 비교함으로써, RAR 어고니스트 AGN 191183이 ECE-16-1 세포의 EGF 자극 증식을 억제함을 측정할 수 있었다. 3군과 4군의 비교에 의해, AGN 193109가 이 시스템에서 RAR 어고니스트의 활성을 반감시킴을 알 수 있다.
[강화 작용의 예]
레티노이드 어고니스트와 공동 투여된 AGN 193109의 효과를 측정하기 위한 일반화된 예에 개시된 방법은 예 14에도 사용되어, MTV-VDRE-Luc 리포터 유전자를 유도가능한 1,25-디하이드록시비타민 D3와 주입되는 HeLa 세포의 핵 수용체 어고니스트의 활성을 AGN 193109가 강화시킴을 측정한다. 주입된 세포의 처리는, 매체 단독(대조, 1군), 최종 농도 10-10내지 10-7M의 1,25-디하이드록시 비타민 D3(2군), 최종농도 108또는 10-7M의 AGN 193109과 공동 투여된 최종 농도 10-10내지 10-7M의 1,25-디하이드록시 비타민 D3(2군), 및 최종 농도 10-8또는 10-7M의 AGN 193109과 공동 투여된 최종 농도 10-10내지 10-7M의 1,25-대하이드록시비타민 D3(3군), 및 최종 농도 10-8또는 10-7M의 단일 처리제로서의 AGN 193109(4군)을 포함하였다. 1군(대조) 세포에서 측정된 루시페라제와 2군 세포에서의 루시페라세를 비교함으로써, 1,25-디하이드록시비타민 D3자극 루시페라제 활성은 투여량에 의존적임을 측정할 수 있다. 4군의 세포(AGN 193109 단일 처리제)에서 측정된 루시페라제 활성을 3군의 세포(AGN 193109 공동 투여)에서 측정된 루시페라제 활성과 비교함으로써, 마찬가지로, AGN 193109의 주어진 농도에 존재하는 1,25-디하이드록시비타민 D3자극 루시페라제 활성은 투여량에 의존적임을 측정할 수 있다. 이 경우, 제로값은 AGN 193109 단독으로 처리된 세포(4군)에서의 루시페라제 활성을 나타내었다. 이러한 도우싱 지배(dosing regimen)는 세 개의 1,25-디하이드록시비타민 D3투여량 반응 곡선의 비교를 가능하게 하였다. AGN 193109의 부재시의 1,25-디하이드록시비타민 D3의 투여량 반응 곡선을 AGN 193109(10-8또는 10-7M)의 공통 투여를 나타내는 곡선과 비교함으로써, 하프 맥시멀(half-maximal) 반응에서의 왼쪽 방향 이동에 의해 증명되는 바와 같이 어고니스트 활성의 강화를 설명할 수 있다.
[강화 작용의 예]
레티노디드 어고니스트와 공동 투여된 AGN 193109의 효과를 측정하기 위한 일반화된 예에 개시된 방법은 예 19도에도 사용되어, 인간의 망막 색소 상피 세포의 일차 배양에서의 RAR 어고니스트의 증식 활성을 AGN 193109가 강화시킴을 측정한다. 세포의 처리는, 에타놀 매체 단독(1군), 최종 농도 10-10내지 10-6M의 레티논산(2군), 10-6M AGN 193109와 공동 투여된 최종 농도 10-10내지 10-6M의 레티논산(3군), 및 최종 농도 10-10내지 10-6M의 AGN 193109 단독(4군)을 포함하였다. 1군과 2군의 세포를 사용하여 얻어진 분석 결과를 비교하여, 레티논산에 의한 이들 세포의 증식 억제는 투여량에 의존적임을 측정할 수 있다. 마찬가지로, 3군의 세포와 1군의 세포를 사용하여 얻어진 결과를 비교하여, 공동 투여된 AGN 193109의 존재시 레티논산에 의한 이들 세포의 증식의 억제는 투여량에 의존적임을 측정할 수 있다. 4군은, 단일 처리제로서 사용된 경우, AGN 193109는 이들 세포의 증식율을 실질적으로 변경시킬 수 없음을 증명하였다. 2군과 3군에서 발생된 세포 증식의 레티논산 조정 억제의 투여량 반응 곡선을 비교하는 것은, AGN 193109가 RAR 어고니스트의 반증식성 효과에 대해 일차 RPE 세포를 민감하게 하여 RAR 어고니스트의 활성을 강화한다는 결론에 대한 기반을 제공하였다.
상술한 바와 같이, 아가왈 등의 연구자[Agarwal et al., Cancer Res. 54:2108(1994)]는, HPV 불멸 ECE-16-1 세포의 성장과는 달리, CaSki 세포 성장은 레티노이드 어고니스트로의 처리에 의해 억제되지 않았음을 도시하였다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 예기치않게 CaSki 세포 성장은 레티노이드 어고니스트 부재시의 AGN 193109에 의해 억제되었음을 발견하였다. 다음의 예는CaSki 세포 종양의 증식을 억제하기 위하여 AGN 193109가 어떻게 사용될 수 있는 지를 예시한다.
[실시예 22]
AGN 193109의 투여에 따른 누드 마우스에 있어서의 CaSKi 세포 종양 성장의 억제
1×106CaSKi 세포가 누드마우스의 각 패널에 주입되었다. 당업자들에서 있어서 자명한 기술을 사용하여 종양 형성이 평가된다. 주입 후, 쥐들은 임의로 대조군과 실험군으로 나뉘어진다. 대조군은 플라시보를 받는다. 실험군은 AGN 193109로 투여된다. 플라시보로 투여된 동물의 옥수수 기름을 위내로 삽관한다. 실험 동물은 치료 기간동안 매일 옥수수 기름의 10μMol/kg AGN 193109를 받는다. 눈금캘리버를 사용하여 종양 체적이 입방 밀리리터로 측정된다. 종양 체적은 시간의 함수로서 좌표상에 정해진다. 연구 기간동안의 종양 크기와 수에 의해 판단되는 바와 같이, AGN 193109를 받는 쥐의 종양은 대조쥐의 종양에 비해 그 성장률이 현저히 감소된다. 이 결과는, 생체내에서, 레티노이드 어고니스트의 투여를 포함하는 치료에 내성이 있는 진보적인 경부 암종(cervical carcinoma)의 성장을 억제함을 나타낸다.
상술한 바와 같이, CaSKi 세포는 레티노이드 어고니스트 치료에 반응하지 않는 경부 종양의 모델이다. 그러나, 본 명세서상에서, CaSKi 세포 성장은 레티노이드 어고니스트로 부재시의 AGN 193109에 의해 억제되었다. CaSKi 세포의 증식을 억제하는 AGN 193109의 효능은, AGN 193109가 레티노이드 어고니스트 치료에 반응없는 경부 암종을 치료하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 다음의 예는 경부암종의 치료에AGN 193109의 치료상의 강화를 평가하기 위해 사용될 수 있는 한 방법을 예시한다.
[실시예 23]
경부 암종을 갖는 환자에 있어서의 AGN 193109의 치료상의 강화 평가
진보적인 경부 암종이 있는 환자에 대해 먼저 설명한다. 당업자에게 있어서 자명한 방법으로 경부 생체 검사가 행해진다. 외식(外植)된 종양으로부터의 세포는 표준 기술에 따른 조직 배양으로 세 개의 샘플군으로 나누기에 충분한 세포 수를 제공한다. 이를 위하여, 아가왈 등[Agarwal et al., Cancer Res. 54:2108(1994)]에 의한 배양 조건을 사용한다. 제1군의 대조군으로서 남겨져 매체(에타놀)만을 수용한다. 제 2군은 10-10내지 10-6M의 농도의 RAR 어고니스트 레티논산으로 처리된다. 제 3 군은 10-10내지 10-6M 범위의 투여량의 AGN 193109로 처리된다. 세포는 신선한 성장 배양기를 매일 공급받으며 각각의 샘플군마다 적당하게 상술한 레티노이드를 제공받는다. 3일후 전기적 세포 카운터를 사용하여 세포를 카운트한다. 대조 배양의 세포 수를 레티논산 처리된 배양의 세포 수와 비교함으로써, RAR 어고니스트는 배양된 경부 암종 세포의 성장률을 실질적으로 억제하지 않음을 알 수 있다. 이에 반해, AGN 193109로 처리된 세포에서는, 대조군의 세포수와 비교하여, 셀 수가 투여량에 따라 감소되었다. AGN 193109 처리가 배양된 경부 암종 세포 증식을 억제한다는 이와 같은 결과는, AGN 193109가 신진 대사 질환을 앓는 경부 암종 환자를 치료하기 위하여 유용한 치료제임을 시사한다.
일차 종양을 제거하기 위한 수술을 받은 경부 암종 환자로서 신진대사 질환을 앓는환자가 이러한 징후에 있어서의 AGN 193109의 치료상의 이익을 설명하기 위한 무작위의 임상 연구가 참가되었다. 환자들은 2군으로 나뉘어진다. 제1군은 대조군인 반면 제 2군은 AGN 193109로 치료된다. 당업자에게 있어서 자명한 모든 기술에 따라, AGN 193109는 조제상 허용가능한 성분(excipient)과 결합되어 조직 투여에 적합한 합성물을 생성한다. 대조군은 플라시보 형성물로 투여되며, 실험군은 AGN 193109 음성적 호름몬을 포함하는 형성물로 투여된다. 환자의 투약은 최대한 견딜수 있는 양으로 석달 내지 일년의 기간동안 격일로 행해진다. 연구 결과는 질환이 없는 생존자들의 측정을 통해 정해진다. AGN 193109를 받은 사람들은, 그들의 신진 대사 질환의 완전한 완화를 나타내는 환자들의 불균형적인 수를 포함하여, 질환 없는 생존자들에서 현저한 증가를 나타낸다. 이와 같은 결과는, AGN 193109가 레티논산과 같은 레티노이드 어고니스트의 반증식성 효과에 반응하지 않는 경부 암종의 생체내 치료를 위한 치료상의 유연성을 가짐을 나타낸다.
상술한 바와 같이, AGN 193109는 인간의 망막 색소 상피 세포의 일차 배양에 있어서의 RAR 어고니스트의 반증식성 활성을 강화시킨다. 따라서, 보다 적은 양의 RAR 어고니스트는 동일한 치료상의 종점을 얻기 위하여 요구될 것이므로, 생체내에 RAR 어고니스트와 AGN 193109를 공동 투여함으로써 어고니스트의 치료율을 증가시킬 수 있을 것이다. 또한, AGN 193109는 글루코코르티코이드와 갑상선 호르몬 수용체 어고니스트의 반증식성 효과에 대한 인간의 망막 색소 상피 세포의 일차 배양을 민감화하는 것이 증명되었다. 다음의 PVR의 쥐 모델은 갑상선 호르몬 수용체 어고니스트 또는 RAR 어고니스트(13-cis 레티논산)과 AGN 193109의 공동투여를 통해 얻어진증진된 치료율을 증명하기 위한 두 개의 개별 연구에 이용될 것이다. 특히, 센 등[Sen et al., Arch. Opthalmol, 106:1291(1988)]에 의해 발표된 망막 재분리의 쥐 모델이 사용되어, 생체내에서 일차 RPE 세포의 증식을 억제하는 레티노이드 어고니스트가 생체내에서 망막 분리의 빈도도 억제함을 증명하였다[Araiz et al., Invest. Opthalmol. 34:522(1993)]. 이로써, 망막 분리를 방지하는 방법에 대해, 레티노이드 어고니스트의 생체외 및 생체내 사이의 상호 관계가 이미 확립되었다. 다음의 예는 망막 분리를 방지하기 위한 치료상의 적용에 AGN 193109가 어떻게 사용되는지를 예시한다.
[실시예 24]
AGN 193109를 사용하여 PVR(proliferative Vitreoretinopathy)의 치료에 있어서의 스테로이드 수퍼패밀리 수용체 어고니스트의 치료상의 강화를 증진시킴
먼저, 센 등[Sen et al., Arch. Opthalmol. 106:1291(1998)]에 의해 개시된 방법에 따라 쥐 눈의 투명한 공동내로 인간의 RPE 세포가 주입된다. 공동내 주입후, 쥐는 5군으로 나뉘어진다. 제1군(대조군)은 매체만을 수용한다. 제 2군은 단일치료제로서 레티논산(100 μg)을 수용한다. 제 3군은 단일 치료제로서 AGN 193109(100 μg)를 수용한다. 제 4군은 제 2군에 투여된 양의 1/10(10 μg)의 RAR 어고니스트(레티논산)를 수용한다. 제 5군은 AGN 193109(100 μg)과 레티논산(10 μg)을 함께 수용한다. 쥐들은 7, 14, 28일의 간접 검안경 검사(indirect ophthalmoscopy)에 위해 검사되며 수축 망막 분리의 빈도와 강도에 대해 분류된다. 100 μg 레티논산으로 주입된 군의 쥐들에서는, AGN 193109 또는 레티논산(10 μg)만을 받은 쥐 또는 대조군에 비해 망막 분리의 빈도와 강도가 현저히 감소되었다. AGN 193109와 레티논산(10 μg)을 함께 투여받은 군의 쥐들에서는, 대조군, AGN 193109또는 레티논산(10 μg)의 경우에 비해 레티놀 분리의 빈도 및 강도가 현저히 감소되었다. 이와 같은 결과는, AGN 193109가 PVR의 생체내 모델에서의 RAR 어고니스트 레티논산의 치료율을 향상시킴을 나타낸다.
다음으로, 쥐 눈의 투명한 공동내로 인간의 RPE 세포를 주입한 후, 이 쥐들을 4군으로 나눈다. 제1군(대조군)은 매체만을 수용한다. 제 2군은 단일 치료제로서 갑상선 호르몬(100 μg)을 수용한다. 제 3군은 단일 치료제로서 AGN 193109(100 μg)로 투여된다. 제 4군은 AGN 193109(100 μg)과 갑상선 호르몬(100 μg)이 함께 투여된다. 쥐들은 7, 14, 28일의 간접 검안경 검사에 의해 검사되며 수축 망막 분리의 빈도와 강도에 대해 분류된다. 4군의 망막 분리의 빈도와 강도를 비교함으로써, AGN 193109 또는 갑상선 호르몬의 단일 치료제는 대조군의 쥐와 비교할 때 망막분리를 억제하지 않음을 증명한다. 이에 반해, AGN 193109와 갑상선 호르몬이 함께 투여된 군의 쥐들에서는, 망막 분리의 빈도와 강도가 현저히 감소된다. 이와 같은 결과는, AGN 193109가 PRV의 생체내 모델에서의 갑성선 호르몬의 치료율을 향상시킴을 나타낸다.
다음의 예는 망막 재부착 수술에 따른 환자를 치료하기 위해 사용된 RAR 어고니스트의 치료율을 향상시키기 위하여 AGN 193109가 어떻게 사용될 수 있는지를 예시한다.
[실시예 25]
RAR 어고니스트 13-cis 레티논산의 치료율 증진
PVR로부터 발생한 망막 분리를 보유한 성인 지원자에 관해 설명한다. 개개인은 본 기술 분야에서 표준화되어 있는 기술은 사용하여 분리 수술을 받는다. 그후, 환자들을 5군으로 나눈다. 대조군은 막막 분리 수술을 받고 레티노이드 화합물을 받지 않은 환자들로 이루어진다. 제 2군은 수술후 4주동안 매일 2회 구강을 통해 40mg 13-cis 레티논산을 받는다. 3군은 수술 후 4주동안 구강을 통해 AGN 193109를 받는다. 4군은 수술 후 4주 동안 매일 2회 구강을 통해 4mg 13-cis 레티논산을 받는다. 5군은 수술후 4주동안 매일 2회 구강을 통해 40mg AGN 193109와 4mg 13-cis 레티논산을 함께 받는다. 페크랏 등[Fekrat et al., Ophthalmology 102:412(1995)]에 의해 개시된 바와 같은 약제 효능의 치료 프로토콜과 평가가 수행된다.
당업자들에게 있어서 자명한 안과학상의 검사 기술은 사용하여 9 개월동안 5군 모두의 수술 후 환자에 대한 망막 재분리의 빈도 및 강도를 감시하였다. 구강을 통해 40mg 13-cis 레티논산을 받은 환자들에서는, 대조군 환자, 구강을 통해 매일 2회의 4 mg 13cis 레티논산을 받은 환자, 또는 구강을 통해 매일 2회의 40 mg AGN 193109를 받은 환자에 비해, 망막 재분리의 발생율이 현저히 감소되었다. 수술후 4주 동안 매을 2회 구강을 통해 매일 2회 구강을 통해 40 mg AGN 193109와 4 mg 13-cis 레티논산을 함께 받은 환자군을 조사함에 따라, 이 환자군의 치료 결과는 수술 후 4주 동안 매일 2회 구강을 통해 40 mg 13-cis 레티논산을 받은 환자의 경우와 동일하거나 그 이상임을 확인하였다. 이와 같은 결과는, AGN 193109 음성적 호르몬은 PVR 환자에 있어서의 망막 재분리의 빈도 및 강도를 감소시킴으로써 RAR 어고니스트의 치료율을 향상시킴을 의미한다.
핵 수용체 음성적 호르몬을 식별하는 일반화된 분석
이상, AGN 193109는 RAR 핵 수용체의 기본 전사 활성을 억제할 수 있는 음성적 호르몸으로서 작용할 수 있음을 설명하였다. 또한, 음성적 호르몬 활성을 갖는 것들로부터의 단순한 길항 물질인 RAR 리간드를 구별하는 ER-RxR-α와 RAR-y-VP-16 수용체 표현 플라스미드 및 ERE-tk-Luc 루시페라제 리포터 플라스미드와 공동 주입되는 CV-1 세포를 사용하는 분석을 설명하였다.
이로써, RAR 음성적 호르몬은 RAR과 NCP의 상호 작용을 증진시킴으로써 RAR-조정 전사 활성의 억제를 조정함을 확인하였다. 또한, AGN 193109는 핵 수용체의 스테로이드 수퍼패밀리의 멤버들간의 NCP간의 상호 공유의 일치된 방식으로 기타의 핵 수용체의 길항 물질의 효과를 강화할 수 있음을 확인하였다. 이와 같이, 리간드는 이들 비 RAR 핵 수용체에서 음성적 호르몬 활성을 갖는 화합물을 식별하도록 디자인되어 스크린(screen)될 수 있다.
ERE-tk-Luc 루시페라제 리포터 플라스미드 및 ER-RXR-α와 RAR-y-VP-16 수용체 표현 플라스미드와 공동 주입된 CV-1 세포의 사용에 기초한 RAR 음성적 호르몬 스크린에 대한 본 방법이 적절히 채용되어, RAR-y-VP-16의 RAR-y의 절반이 페록시섬 증식 활성 수용체(PPAR), 비타민 D 수용체(VDR), 갑상선 호르몬 수용체(T3R) 또는 RXR과 헤테로다이머라이징(heterodimerizing)할 수 있는 기타의 스테로이드 수퍼패밀리 핵 수용체로 변환되게 할 수 있다. 이러한 플라스미드와 공동 주입된 CV-1 세포는 높은 레벨의 루시페라제 활성을 나타낼 것이다. RAR-y 절반에 대해 대체된 수용체의 리간드 결합 영역을 결합시킬 수 있는 리간드는, 루시페라제 활성을 억제하는 그들의 효능을 측정함으로써, 음성적 호르몬 활성에 대해 용이하게 스크린될 수 있다.
RXR과 헤테로다이머라이징하지 않는 스테로이드 수퍼패밀리 핵 수용체(예를들어, 클루코코르티코이드와 에스트로겐 수용체)에 대하여, 이종 구조의 프로모터 요소와 루시페라제 또는 기타의 리포터 유전자의 연합된 적당한 글루코코르티코이드 혹은 에스트로겐 반응 요소로 이루어지는 루시페라제 리포터 플라스미드와 GR-VP-16 또는 ER-VP-16 수용체를 사용하여 동일한 최종 결과를 얻을 수 있다. 일반화된 음성적 호르몬 스크린 분석의 본질적인 특징은, 역 어고니스트가 스크린되는 특정 핵 수용체에 적어도 리간드 결합 영역의 포함, 및 리포터 유전자의 프로모터에 대한 핵 수용체 리간드 결합 영역을 국부화하는 방법에 있다. 이것은, 수용체의 자연 DNA 결합 영역을 사용하거나, 또 따른 방법으로서, 이종 DNA 결합 영역을 갖고 이종 DNA 결합 영역에 의해 인지되는 DNA 조절 요소의 제어하에 있는 리포터 유전자의 사용에 대응하는 키메릭(chimeric) 수용체를 구성함으로써 달성된다. 바람직한 실시예에서, 역 어고니스트스크린되는 핵 수용체를 표한하는 플라스미드는, 높은 기본 활성을 가능하게 하기 위하여, HSV VP-16 확성 영역과 같은 구성적인 활성 영역을 포함하는 퓨전 단백질로서 이 핵 수용체를 표현할 것이다. 이와 같은 높은 기본 활성을 분석 감도를 효과적으로 증가시킬 것이며, 이에 의해 추가된 핵 수용체 어고니스트 부재시의 기본 전사 활성을 억제하는 핵 수용체 리간드의 분석을 가능하게 한다.
다음의 예는 갑상선 호르몬 수용체에서 음성적 호르몬 활성을 갖는 화합물에 대한 스크린에 사용될 수 있는 한 방법을 예시한다.
[실시예 26]
갑상선 호르몬 수용체 음성적 호르몬 식별 방법
CV-1 세포가 루시페라제 리포터 플라스미드 ERE-tk-Luc 및 플라스미드 ER-RXR-α와 T3R-VP-16과 공동 주입된다. RAR-y-VP-16의 RAR-y 절반이 갑상선 호르몬 수용체 cDNA에 의해 대체된 점을 제외하면, T3R-VP-16은 플라스미드 RAR-y-VP-16과 동일하다. 이와 같이, T3R-VP-16은 갑상선 호르몬 수용체의 N-말단과 맞추어진 HSV VP-16의 활성 영역을 포함하는 퓨전 단백질을 나타낸다. 이를 위하여, 표준 주입 및 세포 배양 방법이 사용된다. 주입 후, 세포는 헹구어져, 활성화된 목탄으로 추출된 10% 태아 송아지 장액을 포함하는 성장 배양기에 공급된다. 세포는 매체 단독(에타놀), 갑성선 호르몬(10-9내지 10-10M), 또는 화합물 TR-1(10-9내지 10-6M)으로 처리된다. TR-1은 갑상선 호르몬 수용체에 대해 강한 친화력을 나타내지만 갑상선 호르몬 반응 리포터 유전자와 갑상선 호르몬 수용체 표현 플라스미드를 사용하는 일시 공종 주입 활성화 분석에서 주입된 갑상선 호르몬 수용체를 활성화시키지 않은 합성 갑상선 호르몬 수용체 리간드이다. 또한, TR-1은 갑상선 호르몬 조정 활성화를 반감시킬 수 있으며, 즉 갑상선 수용체 길항 물질이다.
ERE-tk-Luc, ER-RXR-α 및 T3R-VP-16과 주입된 CV-1로부터의 루시페라제 활성의 분석에 의해, 매체 처리된 세포에서의 루시페라제 리포터 활성의 높은 기본 레벨을증명할 수 있다. 갑상선 호르몬으로 처리된 세포는 투여량에 따라 루시페라제 활성을 약간 증가시킨다. TR-1로 처리된 세포는 투여량에 따라 루시페라제 활성을 감소시킨다. 이것은, 예컨대 갑상선 호르몬 수용체와 NCP의 상호 작용이 증진됨에 따라, TR-1이 갑상선 수용체 역 어고니스트 활성을 나타냄을 의미한다.
인간의 일차 망막 색소 상피 세포의 증식율은 RAR 어고니스트의 처리에 의해 억제된다. 망막 재부착 수술후의 레티노이드 치료의 사용에서 이러한 관찰의 치료상의 가치가 증명되었다. 이상에서, AGN 193109 RAR 음성적 호르몬은 공동 투여과정의 13-cis 레티논산과 ATRT의 반증식 효과에 대하여 일차 RPE 세포를 민감화할 수 있음을 설명하였다. 또한, AGN 193109도 기타의 핵 수용체 어고니스트의 반 증식성 효과에 대해 RPE 세포를 민감화할 수 있다. 보다 구체적으로, AGN 193109는 글루코코르티코이드 어고니스트, 덱사메타손, 및 갑상선 호르몬 어고니스트 3,3',5-트리요도티로닌, T3의 반증식성 효과에 대해 RTE 세포를 민감화하였다. 이러한 데이터는, 핵 수용체 패밀리의 멤버들간에 공유된 NCP의 유용성을 AGN 193109가 조정한다는 본 발명에 따른 작업 모델과 일치한다. 갑상선 호르몬 수용체 역 어고니스트 TR-1로 ROE 세포를 처리하면 공유된 NCP의 유용성도 변경시켜, RAR 어고니스트 13-cis 레티논산과 같은 비 갑상선 수용체 어고니스트와의 공동투여는 단일 치료제로서의 13-cis 레티논산에 비해 RPE 배양상의 반증식성 효과를 증가시킬 것이다.
다음의 예는 일차 RPE 셀을 RAR 어고니스트의 반증식성 활성에 대해 보다 민감하게 하기 위해 사용될 수 있는 한 방법을 예시한다. 특히, 이 예는 음성적 호르몬과 공동 투여에 의해 RAR 어고니스트의 활성이 어떻게 강화될 수 있는지를 예시한다.
[실시예 27]
TR-1 갑상선 호르몬 역 어고니스트의 공통 투여에 의한 RAR 어고니스트의 반 증식성 효과에 대한 일차 망막 색소 상피 세포의 민감화
표준 방법에 따라 인간의 일차 RPE 세포가 얻어져 배양된다. 배양된 셀은 4군으로 나뉘어져 다음과 같이 처리된다. 1군은 매체 단독(에타놀)을 수용한다. 2군은 10-11내지 10-6M 농도의 13-cis 레티논산으로 처리된다. 3군은 10-11내지 10-1M 농도의 갑상선 호르몬 역 어고니스트 TR-1로 처리된다. 4군은 10-11내지 10-1M 농도의 13-cis 레티논산과 TR-1으로 공동 처리된다. 세포는 신선한 성정 배양기로 재공급되어 총 5일의 처리동안 이틀 걸러 적당한 화합물로 재처리된다. 전기적 세포 카운터를 사용하여 배양된 세포 수를 측정함으로써 실험 기간동안의 증식율이 정해진다.
TR-1 처리 세포(3군)은 대조군(1군)과 본질적으로 동일한 세포 증식율을 나타내며 측정된 배양물의 성장율에 역 어고니스트가 영향을 미치지 않는다. 13-cis 레티논산(2군)으로 처리된 세포에서는, 투여량에 따라 세포 수가 감소된다. 투여량에 따른 4군 세포(13-cis RA과 TR-1 공동 투여)의 세포 증식의 감소와 3군에 얻어진 것을 비교하면, 2군 세포에 비해 4군 세포에서 RAR 어고니스트의 투여량 반응 곡선의 왼쪽 방향으로의 이동에 의해 측정되는 바와 같이, 13-cis 레티논산의 반증식성 효과에 대해 RPE 배양물을 민감화하는데 기여하는 TR-1 갑상선 호르몬 수용체 역 어고니스트의 효능이 증명된다.
레티노이드 음성적 호르몬은 다른 레티노이드 및 핵 수용체 어고니스트의 활성을 강화하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, AGN 193109으로 불리는 레티노이드 음성적 호르몬은 시험관 내에서의 트랜색티베이션 에세이에서 다른 레티노이드 및 스테로이드 호르몬의 효과를 증가시킨다. 부가하여, 트랜색티베이션 에세이는 음성적 호르몬 활성을 갖는 화합물을 식별하는데에 사용될 수 있다. 이들 에세이는 호르몬의 능력에 기초하여 연속적인 전사 활성체 영역을 갖도록 설계된 키메릭 레티노이드 수용체의 활성을 하향 조정한다.
(1) GENERAL INFORMATION (i) APPLICANT: Klein, Elliott S. Johnson, Alan T. Standeven, Andrew M. Beard, Richard L. Gillett, Samuel J. Duong, Tien T. Nagpal, Sunil Vuligonda, Vidyasagar Teng, Min Chandraratna, Roshantha A. (ii) TITLE OF THE INVENTION: SYNTHESIS AND USE OF RETINOID COMPOUNDS HAVING NEGATIVE HORMONE AND/OR ANTAGONIST ACTIVITIES (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Knobbe, Martens, Olson & Bear (B) STREET: 620 Newport Center Drive 16th Floor (C) CITY: Newport Beach (D) STATE: CA (E) COUNTRY: U.S.A. (F) ZIP: 92660 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Diskette (B) COMPUTER: IBM Compatible (C) OPERATING SYSTEM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Version 1.5 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 08/522,778 (B) FILING DATE: 01-SEP-1995 (A) APPLICATION NUMBER: 08/522,779 (B) FILING DATE: 01-SEP-1995 (A) APPLICATION NUMBER: 08/542,648 (B) FILING DATE: 13-OCT-1995 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Altman, Daniel E (B) REGISTRATION NUMBER: 34,115 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: ALRGN.058A (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 714-760-0404 (B) TELEFAX: 714-760-9502 (C) TELEX: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: TCAGGTCACC AGGAGGTCAG A 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 101 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: AGAAGCTTAT GGAAGCAATT ATGAGTCAGT TTGCGGGTGA CTCTGCAAAT ACTGCCACTC 60 TATAAAAGTT GGGCTCAGAA AGGTGGACCT CGAGGATCCA G 101 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 101 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: CTGGATCCTC GAGGTCCACC TTTCTGAGCC CAACTTTTAT AGAGTGGCAG TATTTGCAGA 60 GTCACCCGCA AACTGACTCA TAATTGCTTC CATAAGCTTC T 101 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 28 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: GTACAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: TCAGGTCATG ACCTGA 16 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: ACGCGTCCGG AAGACCTGGT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: (vi) ORIGINAL SOURCE: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: ATTCTGCAGG TACATGTCCA 20

Claims (22)

  1. 다음 화학식의 화합물로서,
    여기에서, X는 [C(R1)2]n이고 여기에서 R1은 H 또는 1 내지 6 탄소의 알킬이고, n은 0과 2 사이의 정수이고;
    R2는 수소, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬, F, Cl, Br, I, CF3, 1 내지 6 탄소의 플루오르 치환 알킬, OH, SH, 1 내지 6 탄소의 알콕시, 또는 1 내지 6 탄소의 알킬티오이고;
    R3은 수소, 1 내지 6 탄소의 저급 알킬 또는 F이고;
    m은 0-3의 값을 갖는 정수이고;
    o은 0-3의 값을 갖는 정수이고;
    Z는 -(CR1=CR1)n'-이고 n'은 0, 또는 2-5의 값을 갖는 정수이고,
    Y는 페닐 또는 나프틸군, 또는 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 티아졸일, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 피라졸일로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 헤테로아릴이고, 상기 페닐 및 헤테로아릴군은 하나 또는 두 개의 R2군으로 선택적으로 치환될 수 있거나,
    Z가 -(CR1=CR1)n'- 이고 n'이 3, 4, 또는 5이면 Y는 상기 (CR2=CR2)n'군과 B 사이의 직접 원자가 결합을 나타내고,
    A는 (CH2)q이고 여기에서 q가 0-5이고, 3-6 탄소를 갖는 저급 분기된 알킬, 3-6 탄소를 갖는 시클로알킬, 2-6 탄소 및 1 또는 2개의 이중 결합을 갖는 알케닐, 2-6 탄소와 1 또는 2개의 삼중 결합을 갖는 알키닐;
    B는 수소, COOH 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, COOR8, CONR9R10, -CH2OH, CH2OR11, CH2OCOR11, CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7OR13O, 또는 알킬군이 독립적으로 1 내지 6 탄소를 갖는 트리알킬실릴, 여기에서 R7는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알킬기, 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 시클로알킬기 또는 1 내지 5개의 탄소를 함유하는 알케닐기이고, R8은 1 내지 10 탄소의 알킬군 또는 알킬군이 1 내지 10 탄소를 갖는 트리메틸실릴알킬 또는 5 내지 10 탄소의 시클로알킬군이거나, R8은 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R9및 R10은 독립적으로 수소, 1 내지 10 탄소의 알킬군이거나, 5-10 탄소의 시클로알킬군이거나, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐이고, R11은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기, 페닐 또는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기를 가지는 알킬 치환된 페닐, R12는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기이고, R13은 2-5 탄소의 2가 알킬 라디칼이고,
    R14는 (R15)r-페닐, (R15)r-나프틸, 또는 (R15)r-헤테로아릴이고 여기에서 헤테로아릴군은 2 내지 9개의 탄소를 함유하고, O, S, 및 N로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3 헤테로원자를 가지며, r은 0-5의 값을 갖는 정수이고,
    R15는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, NH(R8), COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, 및 1 내지 10 탄소를 갖는 알킬군, 1 내지 10 탄소를 갖는 플루오르 치환 알킬군, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3개의 이중 결합을 갖는 알케닐군, 1 내지 10 탄소와 1 내지 3개의 삼중 결합을 갖는 알키닐군, 또는 알킬군이 독립적으로 1 내지 6 탄소를 갖는 트리알킬실릴 또는 트리알킬실릴옥시군인 것을 특징으로 하는 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서, n'은 3인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, n'은 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서, n'은 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 4 항에 있어서, A는 (CH2)q이고 q는 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서, B는 COOH 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, COOR8또는 CONR9R10인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 3 항에 있어서, n은 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, Y는 나프틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 나프틸군이 2,6 치환되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 9 항에 있어서, A는 (CH2)q이고 q는 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서, B는 COOH 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염, COOR8또는 CONR9R10인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 1 항에 있어서, X는 S인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 12 항에 있어서, Z는 -C≡C-인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 13 항에 있어서, Y는 페닐인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 14 항에 있어서, R14는 (R15)r-페닐인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서, R15는 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 알킬기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 16 항에 있어서, A는 (CH2)q이고 q는 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제 17 항에 있어서, B는 COOH, COOR8, 또는 그 약제학적으로 가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 18 항에 있어서, m은 0인 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 다음의 화학식을 갖는 화합물.
    [여기에서, R15는 1 내지 6 탄소의 저급 알킬이고, R8*은 H, 1 내지 8 탄소의 저급알킬 또는 상기 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염이다]
  21. 제 20 항에 있어서, R15는 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제 21 항에 있어서, R8*은 H 또는 상기 화합물의 약제학적으로 가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물.
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