DE69628827T2 - Herstellung von Polyethern die Carboxylgruppen enthalten und biologisch aktive Substanzen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung aktivierter Polyalkylenoxide. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Polyalkylenoxidcarbonsäuren mit hoher Reinheit.
  • Hintergrund der Erfindung Die Konjugation wasserlöslicher Polyalkylenoxide mit therapeutischen Anteilen, wie z. B. Proteinen und Polypeptiden, ist bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,179,337, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Das '337-Patent offenbart, dass physiologisch aktive Polypeptide, die mit PEG modifiziert sind, für verlängerte Zeitspannen in vivo zirkulieren, eine reduzierte Immunogenität und Antigenität aufweisen.
  • Um Polyalkylenoxide zu konjugieren, müssen zunächst die Hydroxylendgruppen des Polymers in reaktive funktionelle Gruppen umgewandelt werden. Dieses Verfahren wird häufig als "Aktivierung" bezeichnet und das Produkt wird "aktiviertes Polyalkylenoxid" genannt.
  • Meistens hat sich die Forschung auf die covalente Anbindung von Polyalkylenoxiden (PAOs) an epsilon-Aminogruppen von Proteinen, Enzymen und Polypeptiden gerichtet. Die covalente Anbindung von Polyalkylenoxiden an Lysinaminogruppen wurde durch Verbindungsgruppen, wie z. B. Succinoyl-Nhydroxysuccinimidester, wie offenbart von Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175–86 (1984), Azlactone, Arylimidate und cyclische Imidthione bewirkt. Siehe US-Patent Nrn. 5,298,643, 5,321,095 und 5,349,001 als Beispiele. Der Inhalt von jedem dieser vorstehenden Patente ist durch Inbezugnahme hier inkorporiert. PAOs wurden auch mit Hydrazingruppen aktiviert, um das Polymer an aktivierte Kohlehydratgruppen zu koppeln.
  • Zusätzlich zu dem Vorstehenden wurde auch über die Umwandlung der terminalen Hydroxygruppen der PAOs, wie z. B. PEG, zu Carbonsäuren berichtet. PEG-Säuren sind mindestens in zwei Punkten nützlich. Zunächst können Carbonsäurederivate direkt zum Konjugieren von Nukleophilen über die zur Verfügung stehenden Hydroxyl- oder Aminobestandteile verwendet werden. Zweitens können PAO-Carbonsäuren als Intermediate zur Bildung von anderen Typen aktivierter Polymere verwendet werden. Zum Beispiel können m-PEG- Carbonsäuren zu dem Succinimidylesterderivat über N-Hydroxysuccinimid und ein Kondensationsmittel wie z. B. Diisopropylcarbodümid, umgewandelt wer den. Andere aktivierte PAOs können durch Umsetzung des aktiven Esters mit Hydrazin zur Erzeugung von PAO-Hydrazidderivaten hergestellt werden.
  • Der Hauptnachteil bei der Herstellung von Carbonsäurederivaten von Polyalkylenoxiden war die Schwierigkeit, hohe Erträge des reinen Produkts zu erhalten. Zum Beispiel beschreibt das Journal of Controlled Release, 10 (1989) 145–154 und das Polymer Bulletin, 18 (1987), 487–493 die Synthese von m-PEG-Säuren durch Umwandlung von mPEG-OH in einen Ethylester, gefolgt von einer Base-katalysierten Hydrolyse zur Bildung der Carbonsäure. Offensichtlich sollte dieser klassische Ansatz ohne Schwierigkeiten verlaufen. Tatsächlich stellt dieses Verfahren jedoch bestenfalls m-PEG-Säuren mit ungefähr 90%iger Reinheit bereit, wobei die Hauptverunreinigung das Startmaterial, mPEG-OH, ist. Zusätzlich ist die Abtrennung der gewünschten PEG- Säure aus dem Ausgangs-PEG-Alkohol sehr schwierig. Standardlaborverfahren wie eine Fraktionskristallisierung oder Säulenchromatographie sind nicht wirksam. J. Polymer Sci. Polymer Chem. Ed., Band 22, 341–352 (1984). Eine aufwendige Säulenionenaustausch- oder HPLC-Technik stellen eine Reinheit von bis 95% bereit, jedoch sind diese Verfahren für groß angelegte Prozesse nicht geeignet.
  • Die Herstellung eines PEG-konjugierten Produkts, manchmal als pegyliertes Produkt bezeichnet, unter Verwendung von unreinen PEG-Carbonsäuren führt zu einem Endprodukt, das mit mPEG-OH kontaminiert ist. Für niedermolekulare Peptide und organische Konjugate ist die Entfernung des Kontaminanten aufgrund der geringen Unterschiede im Molekulargewicht zu dem Kontaminanten, mPEG-OH, und dem gewünschten Polymer-Konjugat sehr schwierig. Zusätzlich reduziert die Verwendung von weniger reinen Polymer- Carbonsäurederivaten notwendigerweise den Ertrag der gewünschten Konjugate und erhöht die Herstellungskosten aufgrund der Notwendigkeit, aufwendige und teure Abtrennungsschritte durchzuführen.
  • Daher besteht ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Herstellung hochreiner Polyalkylenoxidcarbonsäuren. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit diesem Bedarf.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß einem Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Polyalkylenoxidcarbonsäuren. Die Verfahren beinhalten die Umsetzung eines Polyalkylenoxids mit einem tertiären Alkylhalogenacetat in Gegenwart einer Base zur Bildung eines intermediären tertiären Alkylesters von Polyalkylenoxidcarbonsäure und danach Umsetzung des intermediären tertiären Alkylesters mit einer Säure, wie z. B. Trifluoressigsäure, zur Bil dung einer Polyalkylenoxidcarbonsäure. Dieses Verfahren stellt in vorteilhafter Weise ein Material mit hohem Ertrag und Reinheit bereit.
  • In diesem Aspekt der Erfindung beinhalten die bevorzugten Polyalkylenoxide Polyethylenglykol und omega-Methoxypolyethylenglykol. Bevorzugte tertiäre Alkylhalogenacetate beinhalten t-Butylbrom- oder -chloracetat wie auch andere tertiäre Alkoholester der Halogenessigsäure. Die bevorzugten Basen, die in diesem Verfahren verwendet werden, beinhalten z. B. Kalium-t-butoxid, Butyllithium und ähnliche. Die Verfahren können unter Verwendung von Metall-t-butoxiden in einem Alkohol, wie z. B. t-Butanol, oder in anderen inerten Lösungsmitteln, z. B. Toluol, durchgeführt werden.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von ungefähr äquimolaren Verhältnissen des tertiären Alkylhalogenacetats zum Polyalkylenoxid durchgeführt werden. Es wird jedoch bevorzugt, dass das tertiäre Alkylhalogenacetat in einer Menge vorliegt, die größer ist als das Polyalkylenoxid auf molarer Basis.
  • Gemäß weiteren Aspekten der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von hochreinen alpha- und/oder omega-substituierten Polyalkylenoxiden, wie z. B. Mono- oder Bis-PEG-amfnen, PEG-amiden und PEG-estern einschließlich der Succinimidyl-, Methyl- und Ethylester bereitgestellt. Diese Aspekte beinhalten die Umwandlung der oben beschriebenen Polyalkylenoxidcarbonsäuren zu dem gewünschten terminal substituierten Polymer. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Polyalkylenoxid- biologisch aktiven nukleophilen Konjugaten offenbart. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die Polyalkylenoxidcarbonsäuren mit einem biologisch aktiven Nukleophil umgesetzt, so dass zwischen dem Polymer und dem biologisch aktiven Nukleophil eine Esterbindung gebildet wird. Zum Beispiel kann in diesem Aspekt der Erfindung Taxol-2'-PEG-monoester und 20- Campthothecin-PEG-ester hergestellt werden.
  • Einer der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung ist derjenige, dass die resultierenden Polyalkylenoxidcarbonsäuren mit hoher Reinheit hergestellt werden. Auf diese Weise werden die Produktkontaminanten, nämlich die Startmaterialien wie z. B. mPEG-OH nicht in höheren Mengen gefunden, d. h. sie werden in Mengen von weniger als 8% und vorzugsweise weniger als 1% und besonders bevorzugt weniger als 0,5% angetroffen. Im Ergebnis ist eine Abtrennung der gewünschten Carbonsäure von dem Startalkohol nicht nötig. Daher sind aufwendige Säulen- oder Ionenaustausch- oder HPLC-Techniken nicht nötig, um die gewünschte Carbonsäure bereitzustellen.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • 1. Polymersubstituenten und Polyalkylenoxide
  • Die Carbonsäurederivate der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise aus Poly(alkylenoxiden) (PAOs), wie z. B. Polyethylenglykol, hergestellt, die bei Raumtemperatur wasserlöslich sind. Innerhalb dieser Gruppe befinden sich omega-substituierte Polyalkylenoxidderivate, wie z. B. Methoxypoly(ethylenglykole) (mPEG-OH). Andere geeignete alkylsubstituierte PAO- Derivate beinhalten diejenigen, die monoterminale C1-C4-Gruppen enthalten. Lineare, nicht-antigene Polymere, wie z. B. Monomethyl-PEG-Homopolymere, werden bevorzugt. Alternativ sind auch Polyalkylenoxide, wie z. B. andere Poly(ethylenglykol)-Homopolymere, andere Alkylpoly(ethylenoxid)-Blockcopolymere und Copolymere von Blockcopolymeren von Poly(alkylenoxiden) geeignet. Die Polyalkylenoxide werden vorzugsweise vor ihrer Umwandlung zur Carbonsäure azeotropisch behandelt.
  • Die Polymere der vorliegenden Erfindung weisen ein Molekulargewicht von ungefähr 200 bis ungefähr 100.000 Dalton und vorzugsweise ungefähr 2.000 bis ungefähr 80.000 Dalton auf. Ein Malekulargewicht zwischen ungefähr 4.000 und ungefähr 50.000 Dalton wird jedoch mehr bevorzugt.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch mit alternativen polymeren Substanzen, wie z,B. Dextranen oder anderen ähnlichen nichtimmunogenen Polymeren durchgeführt werden, die in der Lage sind, als Monooder Biscarbonsäuren funktionalisiert oder aktiviert zu werden. Das Vorstehende ist nur illustrativ und soll die Art der nicht-antigenen Polymere, die für eine Verwendung hierin geeignet sind, nicht begrenzend beschränken.
  • 2. Synthese der Carbonsäurederivate
  • Die verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Polyalkylenoxidcarbonsäure beinhalten:
    • i) Umsetzung eines Polyalkylenoxids mit einem tertiären Alkoholhalogenacetat, wie z. B. t-Butylhalogenacetat, in Gegenwart einer Base zur Bildung eines t-Butylesters von Polyaikylenoxidcarbonsäure und
    • ii) Umsetzung des t-Butylesters mit einer Säure zur Bildung der Polyalkylenoxidcarbonsäure.
  • Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist derjenige, dass Polyalkylenoxide einfach in alpha- und/oder omega- Carbonsäuren über ein tert-Butylester-Zwischenprodukt mit extrem hoher Produktreinheit umgewandelt werden können. Polyalkylenoxide verschiedener Molekulargewichte, wie den in Sektion 1 oben dargestellten, können in ihre jeweiligen Anionen mit einer starken Base umgewandelt werden und danach mit kommerziell erhältlichen tert-Butylhalogenacetaten, wie z. B. t-Butylbromacetat, umgesetzt werden, um den tert-Butylester mit hohem Ertrag zu erhalten. Dieses Zwischenprodukt kann danach schnell mit sehr hohem Ertrag in die analoge Carbonsäure durch Verwendung einer Säure, wie z. B. Trifluoressigsäure, umgewandelt werden. Das Verfahren wird bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis ungefähr 50°C durchgeführt. In diesem Aspekt der Erfindung werden Temperaturen von ca. 10 bis ungefähr 40°C bevorzugt und Temperaturen von ungefähr 20 bis ungefähr 30°C werden besonders bevorzugt.
  • Geeignete tertiäre Alkylhalogenacetate weisen die folgende Formel
    Figure 00050001
  • worin X Chlor, Brom oder Iod bedeutet und R1-3 unabhängig gewählt sind aus C1-8-Alkylen, substituierten Alkylen oder verzweigten Alkylen, Arylen, wie z,B. Phenyl oder substituierten Phenylen.
  • Bevorzugte t-Butylhalogenacetate beinhalten t-Butylbromacetat, t-Butylchloracetat und t-Butyliodacetat. Solche t-Butylhalogenacetate sind z. B.
  • von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. erhältlich, Alternativ können Trityl- oder substituierte Arylester verwendet werden.
  • Der erste Schritt der Herstellung der Polyalkylenoxidcarbonsäuren der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Bildung einer Zwischenproduktes, t-Butylester von Polyalkylenoxidcarbonsäure. Dieses Zwischenprodukt wird durch Umsetzung eines Polyalkylenoxids mit einem t-Butylhalogenacetat wie oben beschrieben in Gegenwart einer Base gebildet. Die bevorzugte Base ist Kalium-t-butoxid, obwohl Alternativen, wie z. B. Butyllithium, Natriumamid oder Natriumhydrid, ebenfalls verwendet werden können. Zusätzliche Alternativen beinhalten Natriumethoxid und andere starke Basen. Diese Basen können in den hier beschriebenen Verfahren als Feststoff oder noch bevorzugter gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. t-Butanol, Benzol, Toluol, Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Hexan und ähnlichem verwendet werden.
  • Um das Zwischenprodukt zu bilden, wird das Polyalkylenoxid mit dem t-Butylhalogenacetat in einer Menge umgesetzt, die ungefähr im äquimolaren Verhältnis (1 : 1) vorliegt. Vorzugsweise ist das t-Butylhalogenacetat jedoch bei einem molaren Überschuss vorhanden, so dass eine vollständige Umwand lung des Polyalkylenoxids erreicht wird. So beträgt das molare Verhältnis von t-Butylhalogenacetat zu Polyalkylenoxid vorzugsweise mehr als 1 : 1.
  • Nachdem das t-Butylester-Intermediat gebildet wurde, kann das Carbonsäurederivat des Polyalkylenoxids einfach in Anteilen von mehr als 92%, bevorzugt mehr als 97%, noch bevorzugter mehr als 99% und besonders bevorzugt 99,5% Reinheit bereitgestellt werden. So werden Kontaminationen, insbesondere im Hinblick auf das Startmaterial, z. B. mPEG-OH, nur in Spurenmengen angetroffen. Gemäß bevorzugten Aspekten der Erfindung, wenn Mono- oder Bisethylenglykolcarbonsäuren hergestellt werden, beträgt die Menge des Startmaterial-Kontaminanten, der im Endprodukt angetroffen wird, weniger als 8%, vorzugsweise weniger als 3%, noch bevorzugter weniger als 1% und besonders bevorzugt weniger als 0,5 Gew.%.
  • Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird das t-Butylester-Intermediat mit mindestens einer äquivalenten Menge einer Säure umgesetzt, wie z. B. Trifluoressigsäure, optional in Gegenwart einer geringen Menge Wasser, um die terminal substituierte Carbonsäure des PAO bereitzustellen. Alternativ können verdünnte Salzsäure, d. h. ungefähr 1 N, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw. verwendet werden. Die überschüssige Menge ermöglicht dem Fachmann, das t-Butylester-Intermediat in das gewünschte Carbonsäurederivat umzusetzen und der Pufferkapazität von PEG oder einem verwandten Ausgangspolymermaterial entgegenzuwirken. Weiterhin wird das Intermediat vorzugsweise in das endgültige Carbonsäurederivat in Gegenwart eines 3- bis 5-fachen molaren Überschusses von Wasser, basierend auf dem Gewicht des t-Butylester- Intermediats, umgewandelt und die Reaktion wird in einem inerten Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, Chloroform, Ethylacetat usw., durchgeführt.
  • Das gewünschte Mono- oder Biscarbonsäurederivat wird erhalten, nachdem man eine ausreichende Zeitspanne wartet, um die Umwandlung des Intermediats zum schließlichen Säurederivat sicherzustellen, was ungefähr 3 h dauern kann. Die Reaktionszeit kann jedoch etwas variieren, abhängig von den besonderen Reaktanten und Reaktionsbedingungen. Weiterhin kann die Reaktion, die das t-Butyl-Intermediat in die gewünschte Carbonsäure umwandelt, bei Raumtemperaturen durchgeführt werden, d. h. bis 20 bis 30°C, obwohl Temperaturen von ungefähr 0 bis ungefähr 50°C verwendet werden können. Nach Umwandlung des Intermediats in die endgültige gewünschte Carbonsäure wird das Lösungsmittel, d. h. Methylenchlorid z. B., durch Destillation unter Verwendung von Techniken entfernt, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. Rotationsevaporation oder ähnlichem. Der resultierende Rest wird aus Methylenchlorid/Ethylether, Toluol/Ethylether oder Toluol/Hexan umkristallisiert, um das Endprodukt zu ergeben.
  • Nach Abschluss des neuen Verfahrens ist eine zusätzliche Reinigung durch konventionelle Verfahren nicht nötig, da die hier beschriebenen Verfahren die gewünschte Carbonsäure mit hoher Reinheit bereitstellen, d. h. vorzugsweise mehr als 99%, wodurch der Fachmann mit einer signifikanten Einsparung im Hinblick auf Zeit, Arbeit und Materialien versehen wird, wenn ein Polymer vom pharmazeutischen Grad gewünscht wird.
  • 3. Zusätzliche alpha- und/oder omega-Endbestandteile
  • Als weiterer Aspekt der Erfindung können die Mono- oder Biscarbonsäurederivate verwendet werden, um andere aktivierte Polyalkylenoxide bereitzustellen. Zum Beispiel können die terminalen Carbonsäuregruppen (die Gruppe) umgewandelt werden in:
    • I. Funktionelle Gruppen, die in der Lage sind, mit einer Aminogruppen zu reagieren, wie z. B.
    • a) Succinimidylester;
    • b) Carbonylimidazol;
    • c) Azlactone;
    • d) cyclische Imidthione;
    • e) Isocyanate oder Isothiocyanate; oder
    • f) Aldehyde.
    • II. Funktionelle Gruppen, die in der Lage sind, mit Carbonsäuregruppen und reaktiven Carbonylgruppen zu reagieren, wie z. B.:
    • a) primäre Amine; oder
    • b) Hydrazin- und Hydrazid-funktionelle Gruppen, wie z. B. Acylhydrazide, Carbazate, Semicarbazate, Thiocarbazate, usw.; oder
    • c) Alkohole, wie z. B. die von Ethylester abgeleiteten.
  • Die terminale Aktivierungsgruppe kann auch einen Spacer-Bestandteil beinhalten, der proximal zu den Polyalkylenoxid lokalisiert ist. Der Spacer-Bestandteil kann ein Heteroalkyl, ein Alkoxy, ein Alkyl mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen oder selbst eine zusätzliche Polymerkette sein. Die Spacer-Bestandteile können unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren zugefügt werden.
  • 4. Umwandlung der Carbonsäurederivate
  • Die Polymercarbonsäurederivate dienen auch als hochreine Intermediate, die zur Bildung zusätzlicher Polyalkylenoxidderivate verwendet werden können. Zum Beispiel können alpha- und/oder omega-PEG-carbonsäurederivate in die jeweiligen PEG-aminderivate durch Umwandlung der PEG-carbonsäure in ein Säurechloridintermediat vor Bildung des Amins durch Hoffinan-Abbau umgewandelt werden. Ähnlich können hochreine Amide, Hydrazine, andere Ester und ähnliche aus dem PAO-carbonsäureester aktivierten N- Hydroxysuccinimidester durch Kondensation mit dem geeigneten Reagens (Amide, Hydrazine usw.) unter Verwendung von Standardverfahren gebildet werden. Alternativ kann das Carbonsäurederivat in einen Succinimidylester durch Umsetzung der Carbonsäure mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid in Gegenwart einer Base umgewandelt werden.
  • Diese darauffolgenden Umwandlungsreaktionen sind im wesentlichen Standardverfahren, die dem Fachmann wahlbekannt sind. Ein wichtiger Aspekt dieses Merkmal der Erfindung ist die Tatsache, dass das Intermediat, z. B. PEG-carbonsäure, im wesentlichen rein ist (99+%) und so dem Fachmann ein im wesentlichen reines Endprodukt sicherstellt.
  • 5. Biologische aktive Materialien, die für die Konjugation geeignet sind
  • Die mit den Carbonsäurederivaten konjugierten Nukleophilen werden als biologisch aktiv beschrieben. Die Bezeichnung ist jedoch nicht auf biologisch oder pharmakologische Aktivitäten begrenzt. Zum Bespiel sind einige Nukleophilkonjugate, wie z. B. diejenigen, die Enzyme enthalten, in der Lage, Reaktionen in organischen Lösungsmitteln zu katalysieren. Ähnlich sind einige erfindungsgemäße Polymerkonjugate auch als Labordiagnostika geeignet. Ein Hauptmerkmal all dieser Konjugate ist dasjenige, das mindestens einen Teil der Aktivität, die mit dem nicht modifizierten biologisch aktiven Material assoziiert ist, erhalten bleibt.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das Nukleophil mit einer zur Verfügung stehenden Hydroxyleinheit, die eine Substitution ohne Verlust der Bioaktivität durchmachen kann, mit dem Carbonsäurederivat des Polymers umgesetzt, wie z. B. PEG-COOH, und zwar unter ausreichenden Bedingungen, um die Bildung einer Esterbindung zwischen den beiden Substituenten auszulösen. Als illustrative Beispiele werden unten Taxol- und Taxoter-Konjugate dargestellt:
    Figure 00080001
    Protaxol: R1 = C6H5; R2 = CH3CO
    Protaxoter: R1 = (CH3)3CO; R2 = H
  • Der korrespondierende Diester kann durch Umsetzung von mindestens ungefähr zwei Äquivalenten des gewünschten bioaktiven Materials pro Äquivalent PAD-disäure hergestellt werden. Details im Hinblick auf die Bildung dieser Konjugate werden in den Beispielen gefunden. Für illustrative Zwecke sind jedoch die Bedingungen, die allgemein als ausreichend angesehen werden, um die Bildung einer Esterbindung zwischen Nichtprotein oder Nichtpeptidmitteln und dem Polymer zu bilden, die Induktion der Lösung des Polymers und des Zielbestandteils in einem geeigneten Lösungssystem, d. h. Methylenchlorid, ungefähr bei Raumtemperatur, die Zugabe eines Säureaktivierungsmittels, wie z. B. DCC oder Isopropylcarbodiimid und einer Base, wie z. B. Pyridin. Wässrige Systeme werden andererseits in der Regel für die Zielbestandteile benötigt, die in der Lage sind, durch organische Systeme denaturiert zu werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Konjugation des aktivierten Polymers mit dem gewünschten Nukleophil durch Umsetzung des Polymers mit einem biologisch aktiven Nukleophil, enthaltend eine zur Verfügung stehende Aminogruppe, bewirkt, wenn die Carbonsäure zu einer alternativen terminalen funktionellen Gruppe umgewandelt wurde, wie z. B. einem Succinimidylester. Siehe auch z. B. US-Patent Nr. 5,122,614, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme eingeschlossen wird. Wenn andere Bindungsgruppen, wie die oben in Sektion 3 erwähnten, verwendet werden, können auf ähnliche Weise PAO-Konjugate durch Umsetzung des gewünschten aktivierten Polymers mit einem biologisch aktiven Material, enthaltend eine gewünschte Zielbindungsgruppe, d. h. NH2, COOH, usw. hergestellt werden. Es sollte verstanden werden, dass die zum Abschluss dieser Konjugierungsreaktionen verwendeten Bedingungen so gewählt sind, dass die optimale biologische Aktivität des Konjugats erhalten bleibt.
  • Die Konjugate sind biologisch aktiv und haben vielzählige therapeutische Anwendungen. Säugetiere, die einer Behandlung bedürfen, die ein biologisch aktives Material beinhaltet, können behandelt werden, indem eine effektive Menge eines Polymerkonjugats, enthaltend das gewünschte bioaktive Material, verabreicht wird. Zum Beispiel können an Säuger, die eine Enzymersatztherapie oder Blutfaktoren benötigen, Polymerkonjugate, enthaltend das gewünschte Material, verabreicht werden. Die Dosierungen solcher Konjugate sind Mengen, die ausreichen, um eine gewünschte therapeutische Wirksamkeit zu erreichen und werden dem Fachmann, basierend auf seiner klinischen Er-fahrung, klar sein.
  • Biologisch aktive Nukleophile von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten Proteine, Peptide, Polypeptide, Enzyme, organische Moleküle von natürlichem oder synthetischem Ursprung, wie z. B. medizinische Chemikalien und ähnliches, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
  • Enzyme von Interesse beinhalten Kohlenhydrat-spezifische Enzyme, proteolytische Enzyme, Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolysen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Ohne auf bestimmte Enzyme begrenzt zu sein, beinhalten Beispiele für Enzyme von Interesse Asparaginase, Arginase, Rrginindeaminase, Adenosindeaminase, Superoxiddismutase, Endotoxinasen, Catalasen, Chymotrypsin, Lipasen, Uricasen, Adenosindiphosphatase, Tyrosinasen und Bilirubinoxidase. Kohlenhydrat-spezifische Enzyme von Interesse beinhalten Glucoseoxidasen, Glucosidasen, Galactosidasen, Glucocerebrosidasen, Glucouronidasen, usw.
  • Proteine, Polypeptide und Peptide von Interesse beinhalten Hämoglobin, Serumproteine wie Blutfaktoren, einschließlich Faktoren VII, VIII und IX; Immunglobuline, Cytokine wie Interleukine, alpha-, beta- und gamma- Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, einschließlich den Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktoren, Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren und Phospholipase-aktivierendes Protein (PLAP), sind jedoch nicht darauf begrenzt. Andere Proteine von allgemeinem biologischen oder therapeutischen Interesse beinhalten Insulin, Pflanzenproteine wie Lectine und Ricine, Tumornecrosefaktoren, Wachstumsfaktoren, Gewebewachstumsfaktoren, TGFαs oder TGFßs und epidermale Wachstumsfaktoren, Hormone, Somatomedine, Erythropoietin, pigmentäre Hormone, Hypothalamus-Freisetzungsfaktoren, antidiuretische Hormone, Prolactin, Choriongonadotropin, Follikelstimulierendes Hormon, Thyroid-stimulierendes Hormon, Gewebsplasminogen-Aktivator und ähnliche. Immunoglobuline von Interesse beinhalten IgG, IgE, IgM, IgR, IgD und Fragmente davon.
  • Einige Proteine, wie z. B. die Interleukine, Interferone und Koloniestimulierenden Faktoren existieren auch in nicht-glycosylierter Form, in der Regel als Ergebnis einer Verwendung rekombinanter Techniken. Die nichtglycosylierten Versionen befinden sich auch unter den biologisch aktiven Nukleophilen der vorliegenden Erfindung.
  • Die biologisch aktiven Nukleophilen der vorliegenden Erfindung beinhalten auch jenen Teil eines Polypeptids, das eine in-vivo Bioaktivität zeigt. Dies beinhaltet Aminosäuresequenzen, Antisinnbestandteile und ähnliche, Antikörperfragmente, einzelkettige Antigenbindungsproteine, siehe z. B. US-Patent Nr. 4,946,778, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkor poriert ist, Bindemoleküle, einschließlich Fusionen von Antikörpern oder Fragmenten, polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper, katalytische Antikörper, Nucleotide und Oligonucleotide.
  • Die Proteine oder Teile davon können unter Verwendung von einem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Techniken hergestellt oder isoliert werden, wie z. B. die Gewebskultur, Extraktion aus tierischen Quellen oder durch rekombinante DNA-Techniken. Transgene Quellen der Proteine, Polypeptide, Rminosäuresequenzen und ähnliches werden auch in die Betrachtung mit einbezogen, Solche Materialien werden von transgenen Tieren erhalten, d. h. Mäusen, Schweinen, Kühen usw., wobei die Proteine in Milch, Blut oder Geweben exprimiert werden. Transgene Insekten und Baculovirusexpressionssysteme werden auch als Quellen in die Betrachtung mit einbezogen, Weiterhin befinden sich auch mutante Versionen von Proteinen, wie z. B. mutierte TNFs und mutierte Interferone im Umfang der Erfindung.
  • Andere Proteine von Interesse sind Allergenproteine, wie z. B. das Kreuzkraut, Antigen E, Honigbienengift, Milbenallergen und ähnliche. Geeignete biologische aktive Nukleophile sind nicht auf Proteine und Peptide begrenzt. Im wesentlichen jede biologisch aktive Verbindung ist im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Chemotherapeutische Moleküle wie z. B. pharmazeutische Chemikalien, d. h. Antitumormittel, kardiovaskuläre Mittel, antineoplastische Mittel, Antiinfektionsmittel, Beruhigungsmittel, Gastrointestinal-Mittel, das Zentralnervensystem aktivierende Mittel, Anal- getika, die Fertilität unterstützende oder kontrazeptive Mittel, antientzündliche Mittel, Steroid-Mittel, antiurämische Mittel, kardiovaskuläre Mittel, Vasodilatatoren, Vasoconstriktoren und ähnliche sind beinhaltet. Gemäß bevorzugten Aspekten der Erfindung wird das Carbonsäurederivat unter Bedingungen umgesetzt, die eine Esterbindung zwischen dem Polymer und dem chemotherapeutischen Bestandteil unterstützen. Besonders bevorzugte biologisch aktive Nukleophile beinhalten Taxol, Taxane, Taxotere, Camptothecin, Podophyllotoxitt, Hämoglobin, Glucocerebrosidase, Galactosidase, Arginase, Asparaginase, Arginindeaminase und Superoxiddismutase.
  • Das Vorstehende ist illustrativ für die biologisch aktiven Nukleophile, die für die Konjugation mit den Polymeren der Erfindung geeignet sind. Es sollte verstanden werden, dass die biologisch aktiven Materialien, die nicht spezifisch erwähnt sind, jedoch geeignete nukleophile Gruppen aufweisen, ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sein sollen und darin enthalten sind.
  • 6. Synthese von biologisch aktiven Konjugaten
  • Eine oder mehrere der Polymersäuren können an ein biologisch aktives Nukleophil durch Standard-chemische Reaktionen angebunden werden. Das Konjugat wird durch die folgende Formel dargestellt: mPAO-O-CH2-C(O)-(Y-Nukleophil) oder(Nukleophil-Y)-C(O)-CH2-O-(PAO)-O-CH2-C(O)-(Y-Nukleophil) worin:
    PAO ein wasserlösliches Polyalkylenoxid ist,
    m ist Methyl; und
    Y ist N(L), 0 oder S, worin L H, C1-12-Alkyl oder Aryl bedeutet.
  • Die Obergrenze der an das Nukleophil angebundenen PAOs wird durch die Anzahl der zur Verfügung stehenden Anbindungsstellen, d. h. der Hydroxylbestandteile, wenn die PAO-Säure verwendet wird und dem Grad der Polymeranbindung, den der Fachmann anstrebt, bestimmt. Der Konjugationsgrad kann modifiziert werden, indem die Reaktionsstöchiometrie unter Verwendung wohlbekannter Techniken variiert wird. Mehr als ein Polymer, konjugiert an das Nukleophil, kann erhalten werden, indem ein stöchiometrischer Überschuss des aktiven Polymers mit dem Nukleophil umgesetzt wird.
  • Die biologisch aktiven Nukleophile, wie z. B. Enzyme, Proteine und Polypeptide, können mit den aktivierten Polymeren in einem wässrigen Reaktionsmedium umgesetzt werden, das gepuffert sein kann, abhängig von den pH-Anforderungen des Nukleophils. Der optimale pH für die Reaktion liegt all-gemein zwischen ungefähr 6,5 und ungefähr 8,0 und vorzugsweise bei ca. 7,4 für proteinartige/Polypeptidmaterialien. Organische/chemotherapeutische Bestandteile werden in nichtwässrigen Systemen umgesetzt. Die optimalen Reaktionsbedingungen für die Stabilität des Nukleophils, eine Reaktionseffizienz usw., liegen in dem Bereich, der dem Fachmann gewöhnlich bekannt ist. Der bevorzugte Temperaturbereich liegt zwischen 4°C und 37°C. Die Temperatur des Reaktionsmediums kann nicht die Temperatur überschreiten, bei der das Nukleophil denaturieren oder zerfallen kann. Es wird bevorzugt, dass das Nukleophil mit einem Überschuss des aktivierten Polymers umgesetzt wird. Folgend auf die Reaktion wird das Konjugat wiedergewonnen und gereinigt, wie z. B. durch Diafiltration, Säulenchromatographie, Kombinationen davon oder ähnliches.
  • Beispiele
  • Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele illustrieren bestimmte Aspekte der Erfindung. Alle Teile und Prozentzahlen sind Gewichtsteile und Gewichtsprozentzahlen, wenn dies nicht anders festgehalten wird und alle Temperaturen sind in Grad Celsius ausgedrückt.
  • Materialien
  • sMethoxypoly(ethylenglykol) (m-PEG-OH), MW 5,000 Dalton, wurde von Union Carbide erhalten. PEG MW 20.000 und 40.000 Dalton wurden von Serva, Inc. erhalten. Die Lösungsmittel wurden von Aldrich Chemical of Milwaukee, Wisconsin erhalten. Jedes der in den Beispielen 1–11 hergestellten Produkte wurde strukturell durch Kohlenstoffl3-NMR bestätigt.
  • Beispiel 1
  • t-Butylester von m-PEG-(5.000)-carbonsäure Eine Lösung aus 75 g (0,015 mol) m-PEG-OH in 750 ml Toluol wurde mit Entfernung von 150 ml Destillat azeotropisch behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 30°C abgekühlt, gefolgt von einer Zugabe von 25 ml (0,025 mol) einer 1,0 molaren Lösung Kalium-t-butoxid in t-Butanol. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von einer Zugabe von 5,9 g (0,030 mol) t-Butylbromacetat. Die resultierende wol-kige Mischung wurde im Rückfluss erwärmt, gefolgt von einer Entfernung der Wärme und Rühren für 18 h bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite gefiltert und das Lösungsmittel durch Rotationsevaporation entfernt. Der Rest wurde aus Methylenchlorid/Ethylether zum Erhalt von 75,9 g umkristallisiert (98% Ausbeute). Die Reinheit des genannten Produkts wurde durch 13C-NMR bestimmt als oberhalb von 99% liegend; mPEG-OH < 1,0%. 13CNMR-Zuordnungen: (CH3)3C, 27,6 ppm; OCHS, 58,3 ppm; (CH3)3C, 80,6 ppm; C=O, 168,9 ppm .
  • Beispiel 2
  • mPEG(5.000)-carbonsäuresäure
  • Eine Lösung aus 10,0 g (2 mmol) eines m-PEG-carbonsäure-tbutylesters, 50 ml Trifluoressigsäure und 0,1 ml Wasser in 100 ml Methylenchlorid wurden 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann durch Rotationsevaporation entfernt, gefolgt von einer Umkristallisierung des Rests aus Methylenchlorid/Ethylether, um 9,4 g (95% Ausbeute) des Produkts zu erhalten. Die Reinheit des gewünschten Produkts wurde als oberhalb von 99% liegend bestimmt, mPEG-OH < 1,0%, 13C-NMR-Zuordnungen: OCHS, 58,3; C=O, 170,7 ppm.
  • Beispiel 3
  • t-Butylester von m-PEG(12.000)-carbonsäure
  • Eine Lösung aus 50 g (9,2 mmol) m-PEG-OH (12.000) in 750 ml Toluol wurde mit Entfernung von 150 ml Destillat azeotrop behandelt. Die Reak tionsmischung wurde dann auf 30°C abgekühlt, gefolgt von einer Zugabe von 6,3 ml (6,3 mmol) einer 1,0 molaren Lösung Kalium-t-butoxid in t-Butanol. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von einer Zugabe von 2,3 g (12,0 mmol) t-Butylbromacetat. Die resultierende wolkige Mischung wurde im Rückfluss erwärmt, gefolgt von einer Entfernung der Wärme und Rühren für 18 h bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite gefiltert und das Lösungsmittel durch Rotationsevaporation entfernt. Der Rest wurde aus Methylenchlorid/Ethylether zum Erhalt von 41,2 g (82% Ausbeute) umkristallisiert. Die Reinheit des genannten Produkts wurde durch 13NMR als oberhalb von 99$ liegend bestätigt; mPEG-OH < 1,O%. 13C-NMR-Zuordnungen: (CH3)3C, 27,5 ppm; OCHS, 58,4 ppm; (CH3)3C, 80,7 ppm; C=O, 169,0 ppm.
  • Beispiel 4
  • m-PEG(12.000)-carbonsäure
  • Eine Lösung aus 10,0 g (0,83 mmol) m-PEG(12.000)-carbonsäure-tbutylester, 50 ml Trifluoressigsäure und 0,1 ml Wasser in 100 g Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsevaporation dann entfernt, gefolgt von Pulverisierung in Ethylether zum Erhalt von 9,75 g (98 Ausbeute) des Produkts. Die Reinheit des genannten Produkts wurde durch 13CNMR als oberhalb von 99% liegend bestätigt; mPEG-OH < 0,1%. 13C-NMR-Zuordnungen: OCHS, 58,3 ppm; C=O, 170,6 ppm.
  • Beispiele 5, 6 und 7
  • Entsprechend den Verfahren gemäß Beispielen 3 und 4 wurden auch m-PEG-Säuren mit MW=2.000, 20.000 und 42.000 hergestellt. Die jeweiligen Produkte wurden als mehr als 99$ rein gefunden und in Ausbeuten (aus den Alkoholen) von 89% für MW 2.000, 52% für MW 20.000 und 76% für MW 42.000 gewonnen.
  • Beispiel 8
  • Di-t-butylester von PEG(40.000)-dicarbonsäure
  • Eine Lösung aus 50 g (1,3 mmol) PEG-(OH)2 in 750 ml Toluol wurde mit Entfernung von 150 ml Destillat azeotrop behandelt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 30°C abgekühlt, gefolgt von einer Zugabe von 4 ml (4,0 mmol) einer 1,0 molaren Lösung Kalium-t-butoxid in t-Butanol. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von einer Zugabe von 1,6 g (8,0 mmol) t-Butylbromacetat. Die resultierende wolkige Mischung wurde im Rückfluss erwärmt, gefolgt von einer Entfernung der Wärme und Rühren für 18 h bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite gefiltert und das Lösungsmittel durch Rotationsevaporation entfernt. Der Rest wurde aus Methylenchlorid/Ethylether zum Erhalt von 45,2 g (86% Ausbeute) umkristallisiert. Das genannte Produkt erwies sich jedoch als mehr als 99% rein, wobei das Startmaterial in einer Menge von weniger als 1,0% vorlag. 13CNMR-Zuordnungen: (CH3)3C, 27,7 ppm; (CH)3C, 80,9 ppm; C=O, 169,1 ppm.
  • Beispiel 9
  • PEG(40.000)dicarbonsäure
  • Eine Lösung von 20,0 g (0,5 mmol) PEG(40.000)carbonsäure-tbutylester, 100 ml Trifluoressigsäure und 0,1 ml Wasser in 200 ml Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann durch Rotationsevaporation entfernt, gefolgt von einem Umkristallisieren des Rests aus Methylenchlorid/Ethylether zum Erhalt von 16,9 g (84% Ausbeute) des Produkts. Die Reinheit des genannten Produkts wurde bei mehr als 99% liegend bestätigt. 13C-NMR-Zuordnungen: C=O, 170,9 ppm.
  • Beispiele 10 und 11
  • Gemäß den Verfahren der Beispiele 8 und 9 wurden auch PEG-disäuren mit einem MW = 6000 und 35.000 hergestellt. Die Ausbeuten (aus den Alkoholen) wurden als 77% für das MW 6.000-Derivat und 81% für das MW 35.000-Derivat bestimmt. In allen Fällen wurde die Reinheit des Endprodukts als oberhalb von 99% liegend angesehen.
  • Beispiel 12 – Vergleich
  • In diesem Beispiel wurden Proben von mPEG-COOH (MW 5.000) unter Verwendung des Ethylesters anstelle des t-Butylderivats der vorliegenden Erfindung hergestellt, um die substantiellen Unterschiede in der Reinheit zu demonstrieren, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Die prozentuale Reinheit wurde durch 13C-NMR bestimmt. Beispiel 12(a)
  • Ethyletter von m-PEG(5.000)carbonsäure
  • Eine Lösung aus 10,0 g (2,0 mmol) m-PEG-0H in 150 ml Toluol wurde mit Entfernung von 75 ml Destillat azeotropisch behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 40°C abgekühlt, gefolgt von einer Zugabe von 0,6 g (5,0 mmol) Kalium-t-butoxid. Die resultierende Mischung wurde 2 h bei 40°C gerührt, gefolgt von einer Zugabe von 3,3 g (20 mmol) Ethylbromacetat. Die resultierende Lösung wurde 18 h bei 40°C gerührt, gefolgt von einer Filtration durch Celite und Entfernung des Lösungsmittels aus dem Filtrat durch Rotationsevaporation. Der Rest wurde aus 2-Propanol zum Erhalt von 7,2 g (71% Ausbeute) umkristallisiert. 13C-NMR-Zuordnungen:CH3CH2, 13,12 ppm; (CH)3O, 57,83 ppm; CH3CH2, 59,47 ppm, C=O, 169,18 ppm. Unreinheit: m-PEG-CH2OH, 60,20 ppm.
  • Beispiel 12 (b)
  • m-PEG(5.000)carbonsäure
  • Eine Lösung aus 3,0 g (0,6 mmol) des Ethylesters von m-PEG(5.000)carbonsäure aus Beispiel 12(a) und 0,2 g (5,0 mmol) Natriumhydroxid in 25 ml Wasser wurden 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Salzsäure auf einen pH 2,0 angesäuert, gefolgt von einer Extraktion mit Methylenchlorid. Die kombinierten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und gefiltert, gefolgt von einer Entfernung des Lösungsmittels aus dem Filtrat durch Rotationsevaporation. Der Rest wurde aus 2-Propanol zum Erhalt von 2,4 g (80% Ausbeute) umkristallisiert. 13C NMR-Zuordnungen: (CH)3O, 57,91 ppm; C=O, 170,30 ppm, Unreinheit: m-PEG-CH20H, 60, 50 ppm.
  • Die durchschnittliche Quantität der m-PEG-OH-Unreinheit, die unter Verwendung von Präparationen gemäß der Standardliteratur von m-PEG-Säure gefunden werden, liegen durchschnittlich bei 17%. In acht Verfahren, die unter Verwendung der obigen Vergleichstechniken durchgeführt wurden, lag die Menge der Unreinheiten bei 9% bis 31%. Diese Ergebnisse wurden dann mit den Ergebnissen verglichen, die für das Produkt gemäß Beispiel 2 (m-PEG-COOH) erhalten wurden und sind unten dargestellt.
  • Figure 00160001
  • Wie aus dem Vorstehenden ableitbar ist, gibt es deutliche Vorteile, die durch Synthese des Carbonsäurederivats unter Verwendung des t-Butylesters bereitgestellt werden. Es kann auch festgestellt werden, dass die Ethylester-abgeleitete PEG-carbonsäure eine weitere Reinigung benötigt, bevor sie als geeignet für die Konjugationsreaktionen mit biologisch aktiven Nukleophilen angesehen werden konnte.
  • Beispiel 13
  • Herstellung eines 20-Camptothectin-PEG-5.000-esters
  • Die m-PEG-5.000-Säure (400 mg, 0,079 mmol) gemäß Beispiel 2 wurde unter Verwendung von Toluol azeotropisch behandelt und dann in 10 ml wasserfreiem Methylenchlorid bei Raumtemperatur gelöst und mit 1,3-Diisopropylcarbodiimid (18,1 μl, 0,119 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (14,5 mg, 0,119 mmol) und (S)-(+)-Camptothecin (41,32 mg, 0,119 mmol) bei 0°C behandelt. Die Reaktionslösung wurde über 30 min auf Raumtemperatur erwärmt und bei dieser Temperatur für 16 h gehalten. Die Reaktionslösung wurde dann mit 0,1 N HCl gewaschen, getrocknet und evaporiert, um einen gebrochenweißen Feststoff zu erhalten, der durch Chromatographie gereinigt wurde (Silikagel, McOH/CH2Cl2). Das gereinigte Material wurde aus CH2Cl2/Ether kristallisiert.
  • Beispiel 14
  • A. Taxol-2'-PEG-5.000-monoester-Herstellung
  • Die m-PEG-5.000-Säure (625 mg, 0,125 mmol) gemäß Beispiel 2 wurde azeotropisch behandelt und dann in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid bei Raumtemperatur gelöst. Die obige Lösung wurde mit 1,3-Diisopropylcarbodiimid (26 μl, 0,17 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (32 mg, 0,26 mmol) und Taxol (146 mg, 0,17 mmol) bei 0°C behandelt. Die Reaktionslösung wurde auf Raumtemperatur nach 30 min erwärmt und bei dieser Temperatur 16 h gehalten. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 0,1 N HCl gewaschen, getrocknet und evaporiert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der aus 2-Propanol kristallisiert wurde, um 585 mg (80% Ausbeute) des reinen Produkts zu ergeben.
  • Während beschrieben wurde, was zur Zeit angenommen wird, dass es sich um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung handelt, wird der Fachmann realisieren, dass Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne sich vom Geist der Erfindung zu lösen.

Claims (27)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Polyalkylenoxidcarbonsäure, umfassend: (i) Reagieren eines Polyalkylenoxids mit einem tertiären Al-kylhalogenacetat in Anwesenheit einer Base, um einen tertiären Alkylester einer Polyalkylenoxidcarbonsäure zu bilden, und (ii) Reagieren dieses tertiären Alkylesters mit einer Säure, um die Polyalkylenoxidcarbonsäure zu bilden.
  2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Polyalkylenoxid Polyethylenglykol ist.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei das Polyethylenglykol omega-Methoxypolyethylenglykol ist.
  4. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das tertiäre Alkylhalogenacetat
    Figure 00180001
    umfasst, worin X Chlor, Brom oder Iod ist, R1 bis R3 sind unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C1-8g-Alkyl, substituiertem C1-8-Alkyl oder verzweigtem C1-8-Rlkyl und Aryl.
  5. Verfahren gemäss Anspruch 4, wobei das tertiäre Alkylhalogenacetat tertiäres Butylhalogenacetat ist.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei das t-Butylhalogenacetat t-Butylbromacetat ist.
  7. Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei das t-Butylhalogenacetat t-Butylchloracetat ist.
  8. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Base Kalium-t-butoxid ist.
  9. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Base ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Butyllithum, Natriumamid und Natriumhydrid.
  10. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das molare Verhältnis von t-Butylhalogenacetat zu Polyalkylenoxid grösser als 1 : 1 ist.
  11. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Säure Trifluoressigsäure ist.
  12. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Säure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Schwefel-, Phosphor- und Salzsäure. die Formel
  13. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der Reaktionsschritt (ii) bei einer Temperatur von ca. 0 bis ca. 50°C durchgeführt wird.
  14. Verfahren gemäss Anspruch 13, wobei der Reaktionsschritt (ii) bei einer Temperatur von ca. 20 bis ca. 30°C durchgeführt wird.
  15. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der Reaktionsschritt (ii) in Anwesenheit von Wasser durchgeführt wird.
  16. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Polyalkylenoxid ein Molekulargewicht von ca. 200 bis ca. 100.000 hat.
  17. Verfahren gemäss Anspruch 16, wobei das Polyalkylenoxid ein Molekulargewicht von ca. 2.000 bis ca. 80.000 hat.
  18. Verfahren gemäss Anspruch 17, wobei das Polyalkylenoxid ein Molekulargewicht von ca. 4.000 bis ca. 50.000 hat.
  19. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Reinheit der Polyalkylenoxidcarbonsäure grösser als 92% ist.
  20. Verfahren gemäss Anspruch 19, wobei die Reinheit der Polyalkylenoxidcarbonsäure grösser als 97% ist.
  21. Verfahren gemäss Anspruch 20, wobei die Reinheit der Polyalkylenoxidcarbonsäure grösser als 99% ist.
  22. Verfahren gemäss Anspruch 1, weiter umfassend das Umwandeln der Polyalkylenoxidcarbonsäure in ein Amin-begrenztes Polyalkylenoxid.
  23. Verfahren gemäss Anspruch 1, weiter umfassend das Umwandeln der Polyalkylenoxidcarbonsäure in ein Succinimidylester-begrenztes Polyalkylenoxid.
  24. Verfahren gemäss Anspruch 1, weiter umfassend das Reagieren der Polyalkylenoxidcarbonsäure mit einem biologisch aktiven Nukleophil unter Bedingungen, die ausreichend sind, ein biologisch aktives Konjugat zu bilden, wobei das Polyalkylenoxid mit dem biologisch aktiven Nukleophil durch eine Esterbindung verbunden ist.
  25. Verfahren gemäss Anspruch 24, wobei das biologisch aktive Nukleophil Taxol ist.
  26. Verfahren gemäss Anspruch 24, wobei das biologisch aktive Nukleophil Campthotecin ist.
  27. Verfahren gemäss Anspruch 24, wobei das biologisch aktive Nukleophil Podophyllotoxin ist.
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