DE60128135T2

DE60128135T2 - Synthese von nicht-peptidischen polymerderivaten mit hohem molekulargewicht

Info

Publication number: DE60128135T2
Application number: DE60128135T
Authority: DE
Inventors: Antoni Huntsville KOZLOWSKI; Xioaming Madison SHEN; Michael David Huntsville BENTLEY; Zhihao Madison FANG
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: ATE360659T1; ES2284726T3; AU2002246705B2; KR20030068178A; CA2431977A1; EP1345982B1; CA2431977C; US20020082345A1; KR100807141B1; DE60128135D1; US6774180B2; JP2004525212A; EP1345982A2; WO2002059179A2; WO2002059179A3; MXPA03005460A; TW593427B

Description

Die Erfindung betrifft Derivate von Poly(ethylenglycol) und verwandten Polymeren und Verfahren zu deren Synthese. Insbesondere betrifft die Erfindung Derivate mit hohem Molekulargewicht und Verfahren zur Herstellung von Derivaten mit hohem Molekulargewicht.
Eine kovalente Bindung des hydrophilen Polymers Poly(ethylenglycol), abgekürzt PEG, das auch als Poly(ethylenoxid), abgekürzt PEO, bekannt ist, an Moleküle und Oberflächen ist in der Biotechnologie und Medizin von beträchtlichem Nutzen. In seiner häufigsten Form ist PEG ein lineares Polymer, das an jedem Ende endständige Hydroxylgruppen aufweist: HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH
Das vorstehende Polymer α, ω-Dihydroxypoly(ethylenglycol) kann in Kurzform als HO-PEG-OH dargestellt werden, wobei das Symbol -PEG- die folgende Struktureinheit: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- bedeutet, wobei n typischerweise im Bereich von etwa 3 bis etwa 4000 liegt.
PEG wird im Allgemeinen als Methoxy-PEG-OH, oder kurz mPEG, verwendet, wobei ein Ende die vergleichsweise inerte Methoxygruppe ist, während das andere Ende eine Hydroxylgruppe ist, die leicht einer chemischen Modifikation unterliegt. Die Struktur von mPEG ist nachstehend angegeben. CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH
Die Copolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid sind hinsichtlich ihrer Chemie mit PEG nahe verwandt, und PEG kann in vielen seiner Anwendungen durch sie ersetzt werden. HO-CH₂CHRO(CH₂CHRO)_nCH₂CH₂-OH wobei R=H oder Alkyl, wie CH₃.
PEG wird im Allgemeinen auch in mehrarmigen Formen verwendet, in denen lineare PEGs an einen zentralen Kern gebunden sind: R(-O-PEG-OH)_n wobei R ein Kern ist, der sich zum Beispiel von Pentaerythritol- oder Glycerololigomeren ableitet. PEGs können auch mit abbaubaren Verknüpfungen in der Hauptkette hergestellt werden.
PEG ist ein Polymer, das die Eigenschaften Löslichkeit in Wasser und in vielen organischen Lösungsmitteln, fehlende Toxizität und fehlende immunogene Aktivität aufweist. Eine Anwendung von PEG besteht darin, das Polymer kovalent an unlösliche Moleküle zu binden, um das erhaltene PEG-Molekül-„Konjugat" löslich zu machen. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, dass der wasserunlösliche Arzneistoff Paclitaxel wasserlöslich wird, wenn er an PEG gekoppelt ist. Greenwald et al., J. Org. Chem., 60: 331-336 (1995).
Um PEG an ein Molekül, wie ein Protein, zu koppeln, ist es oft erforderlich, das PEG zu „aktivieren", um ein Derivat des PEG mit einem funktionellen Rest am Ende herzustellen. Der funktionelle Rest kann sich mit bestimmten Einheiten an dem Protein, wie einer Aminogruppe, reagieren, wodurch ein PEG-Protein-Konjugat erzeugt wird. Es sind viele aktivierte Derivate von PEG beschrieben worden. Ein Beispiel für ein derartiges aktiviertes Derivat ist der „aktive" Succinimidylsuccinatester: CH₃O-PEG-O₂C-CH₂CH₂-CO₂-NS wobei NS =
Nachstehend wird die aktive Succinimidylester-Einheit als -CO₂ NS dargestellt. Derartige aktivierte PEGs können auch aus den vorstehend beschriebenen mehrarmigen Formen oder aus verzweigten Formen, wie (PEG-O-CO-NH)₂LYS-NS hergestellt werden, wie in Harris et al., US-5.932.462 , das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist, beschrieben.
Funktionelle Reste können durch direkte Umwandlung der Hydroxyl-Ausgangsgruppe in andere Formen oder durch Bindung organischer Spacergruppen an die Hydroxylgruppe an das Ende von PEG gebunden werden. Zum Beispiel wird das vorstehende Succinat-PEG durch Bindung von Bernsteinsäureanhydrid an PEG hergestellt. Ähnlich kann Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden, um PEG-Glutarat, PEG-O₂C-CH₂CH₂CH₂-CO₂H, herzustellen. Selbst größere aliphatische Spacer können zugegeben werden. Wie in Okamoto et al., Eur. Polym. J., 19, 341-346 (1983) beschrieben, kann PEG durch Umsetzen von PEG-OH mit ONC-(CH₂)₆-NCO und anschließendes Umwandeln des verbleibenden Isocyanats in das Aminoprodukt PEG-O₂CNH-(CH₂)₆-NH₂ in ein PEG-Amin umgewandelt werden.
Da die Anwendungen der PEG-Chemie anspruchsvoller geworden sind, besteht ein zunehmender Bedarf nach hochreinen PEG-Derivaten mit hohem Molekulargewicht. Die Synthese dieser Verbindungen ist wegen der Schwierigkeit des Entfernens polymerer Verunreinigungen, die sich während der mehrstufigen Herstellung anreichern, kompliziert. Aus kleinen Molekülen bestehende Verunreinigungen werden normalerweise leicht durch einfache Verfahren, wie Fällung, entfernt. Polymere Nebenprodukte mit hohem Molekulargewicht sind jedoch im Allgemeinen ziemlich schwierig zu entfernen und erfordern die Verwendung zeitaufwändiger und teurer Chromatographieverfahren. Auf dem Fachgebiet besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Herstellung von PEG-Derivaten mit hohem Molekulargewicht.
Die Erfindung betrifft aktivierte Polymerderivate, wie in den Ansprüchen im Anhang definiert, und Verfahren zu deren Herstellung. Sie schließt Ausführungsformen ein, in denen ein kleines bifunktionelles Oligo(ethylenglycol)-Derivat („OEG"-Derivat) oder ein ähnliches Oligomer oder kleines Polymer kovalent mit einem großen Poly(ethylenglycol)polymer-Derivat („PEG"-Derivat) oder einem ähnlichen Polymer verknüpft ist. Auf diese Weise können die meisten chemischen Umwandlungen an der oligomeren oder kleinen Polymerverbindung durchgeführt werden. Große polymere Verunreinigungen sind schwieriger vom gewünschten Produkt abzutrennen als kleinere, und die Produkte dieser Umsetzungen, die mit diesen Polymeren verbunden sind, schließen typischerweise nicht umgesetzte Reagenzien, bifunktionelle Komponenten, die zu einer Vernetzung führen können, teilweise umgesetzte Komponenten und andere polymere Verunreinigungen ein. Die Erfindung vermeidet diese Verunreinigungen durch Verringerung der Anzahl der zur Erzeugung des großen Polymers erforderlichen Reaktionen.
Dadurch kann wie nachstehend gezeigt eine komplizierte Polymerverbindung durch Umsetzen eines komplizierten Oligomers, zum Beispiel Y'-OEG-Y, wobei Y und Y' aktive Einheiten sind, mit einer einfachen Polymerverbindung mit hohem Molekulargewicht, zum Beispiel mPEG-Z, wobei sich Z mit einem von Y oder Y' reagiert, wobei ein neuer Verknüpfungsrest X zwischen dem größeren PEG und dem kleineren PEG hergestellt wird, in einem Schritt hergestellt werden. Auf diese Weise reichern sich polymere Verunreinigungen nicht an. Y und Y' können identisch oder verschieden sein, sollten aber so gewählt werden, dass die beiden Einheiten verträglich sind und nicht miteinander reagieren.
In einer typischen Umsetzung zur Herstellung eines monofunktionellen großen Moleküls mit hohem Molekulargewicht wird ein Monomethoxypoly(ethylenglycol) mit einem kleineren PEG-Polymer umgesetzt, wobei der funktionelle Rest Z an dem monofunktionellen größeren PEG-Polymer mit dem funktionellen Rest Y' an dem heterobifunktionellen kleineren Polymer reagiert. Das Produkt mit hohem Molekulargewicht behält den aktiven Rest Y. Die Recktanten sind durch einen Rest X verknüpft, der durch die Umsetzung der Einheiten Z und Y' gebildet wird. Diese Umsetzung kann folgendermaßen veranschaulicht werden: mPEG-Z + Y'-OEG-Y → mPEG-X-OEG-Y
Zum Beispiel kann eine mPEG-Propionsäure mit einem Molekulargewicht von 32.000, welche eine Verbindung ist, die typischerweise in mehreren Schritten aus mPEG-OH hergestellt wird, in einem einzigen Schritt durch Umsetzen eines aktivierten mPEG-Carbonats 30.000, das in einem Schritt aus mPEG-OH hergestellt wurde, mit α-Amino-ω-propionsäure mit einem Molekulargewicht von 2000 hergestellt werden. Die meisten der chemischen Umwandlungen können am kleinen, kostengünstigen, einfacher zu reinigenden PEG 2000 durchgeführt werden.
Bei der Durchführung der Erfindung können monofunktionelle, homobifunktionelle und heterobifunktionelle große Moleküle hergestellt werden, wenngleich nicht unbedingt alle mit gleichwertigen Ergebnissen. Umsetzungen, die dazu neigen, in der größeren Polymerkomponente des Produktmoleküls zu Komplikationen zu führen, können den Wirkungsgrad des Verfahrens verringern, wenn Verunreinigungen mit vielfachen Reaktionsschritten zunehmen.
In einer etwas verallgemeinerten Ausführungsform, die ein Poly(ethylenglycol)polymer mit höherer Spezifität zeigt, kann die Struktur der erfindungsgemäßen Produkte folgendermaßen beschrieben werden: R-(OCH₂CH₂)_n-X-(CH₂CH₂-O)_m-Y
Die vorstehende Struktur wird durch Umsetzen von R-(OCH₂CH₂)_n-Z mit Y'-(CH₂CH₂-O)_m-Y hergestellt, wobei Z einen mit Y' reaktiven Rest bedeutet und weder Y noch R mit Z oder Y' reaktiv sind.
R kann eine abdeckende ("capping") Einheit bedeuten, einschließlich verschiedener Alkyleinheiten, typischerweise Methoxy, die an PEG gebunden ist. R kann auch ein reaktiver Rest oder ein geschützter reaktiver Rest Y'' sein, wobei zu irgendeinem gewünschten späteren Zeitpunkt die Schutzgruppe vom reaktiven Rest entfernt werden und dieser für eine Umsetzung verfügbar sein kann. Y und Y'' können identisch sein, wenn Y'' ein geschützter Rest ist oder ein anderer Rest, der an den zur Herstellung des Produktmoleküls verwendeten Umsetzungen nicht teilhat, war. Funktionelle Reste schließen einen Aldehyd, ein Maleimid, einen aktiven Ester, ein Thiosulfonat oder ein Amin ein, sind aber nicht darauf beschränkt. X ist ein kleiner hydrophiler Verknüpfer, wie ein Amid oder ein Carbamat; n steht für etwa 200 bis 2000, und m steht für etwa 1 bis 120. X ist vorzugsweise eine kleine und hydrophile Einheit, welche die chemischen und physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers mit hohem Molekulargewicht nicht nachteilig beeinflussen wird.
In einer anderen Ausführungsform kann ein großes Polymersegment, das bifunktionell ist oder eine zusätzliche Funktionalität aufweist, an einer oder mehreren Funktionalitäten mit kleineren Molekülen verknüpft sein. Nach Wunsch kann die Funktionalität des großen Produktmoleküls vom großen Polymersegment oder vom kleineren Oligomer- oder Polymersegment stammen. Die Polymerhauptkette kann Reste oder Verknüpfer, die der Hydrolyse oder dem enzymatischen Abbau unterliegen, enthalten, die in die Hauptkette eingebaut sind, falls zur gesteuerten Abbaubarkeit des Produktmoleküls gewünscht.
Die vorstehenden Polymersegmente können allgemein als (Poly)_a für das größere Polymersegment und als (Poly)_b für das kleinere Polymersegment bezeichnet werden, wobei die Polymersegmente unabhängig ausgewählt sind aus Poly(alkylenglycol), insbesondere Poly(ethylenglycol), Poly(olefinalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(hydroxyalkylmethacrylamid), Poly(hydroxyalkylmethacrylat), Poly(sacchariden), Poly(α-hydroxysäure), Poly(vinylalkohol), Polyphosphazen, Polyoxazolin, Poly(N-acryloylmorpholin) und Copolymeren, Terpolymeren und Gemischen davon.
Daher kann ein Polymer mit hohem Molekulargewicht aus einem Polymer mit niedrigerem Molekulargewicht, aus dem Verunreinigungen mit viel geringeren Schwierigkeiten entfernt werden können, und einem Polymer mit höherem Molekulargewicht, das nicht einer Reihe von Umsetzungen oder komplexen Reinigungsschritten zum Entfernen polymerer Verunreinigungen unterworfen wurde, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun nachstehend ausführlicher beschrieben. Diese Erfindung kann jedoch in vielen verschiedenen Formen ausgeführt werden und sollte nicht als auf die hier angeführten Ausführungsformen beschränkt angesehen werden; diese Ausführungsformen werden vielmehr zur Verfügung gestellt, um diese Offenbarung genau und vollständig zu gestalten und werden den Umfang der Erfindung dem Fachmann vollständig vermitteln.
Definitionen
Die Begriffe „funktioneller Rest", „aktive Einheit", „aktivierender Rest", „reaktive Stelle", „Endgruppe", „chemisch reaktiver Rest" und „chemisch reaktive Einheit" werden auf dem Fachgebiet und hier verwendet, um eindeutige, definierbare Teile oder Einheiten eines Moleküls zu bezeichnen. Die Begriffe sind auf dem chemischen Fachgebiet in gewissem Maße synonym und werden hier verwendet, um die Teile von Molekülen zu bezeichnen, die eine gewisse Funktion oder Aktivität ausüben und mit anderen Molekülen reaktiv sind. Der Begriff „aktiv" bedeutet, wenn er in Verbindung mit funktionellen Resten verwendet wird, diejenigen funktionellen Reste, die sich leicht mit elektrophilen oder nuldeophilen Resten an anderen Molekülen umsetzen, im Gegensatz zu den Resten, die zur Umsetzung starke Katalysatoren oder höchst unpraktikable Reaktionsbedingungen erfordern (d.h. „nicht reaktive" oder „inerte" Reste). Auf dem Fachgebiet ist zum Beispiel selbstverständlich, dass der Begriff „aktiver Ester" die Ester einschließt, die sich leicht mit nukleophilen Resten, wie Aminen, umsetzen. Beispielhafte aktive Ester schließen N-Hydroxysuccinimidylester oder 1-Benzotriazolester ein. Typischerweise wird sich ein aktiver Ester in einem wässrigen Medium innerhalb von Minuten mit einem Amin umsetzen, während bestimmte Ester, wie Methyl- oder Ethylester, einen starken Katalysator erfordern, um sich mit einem nukleophilen Rest umzusetzen.
Der Begriff „Alkyl" bedeutet Kohlenwasserstoffketten, typischerweise mit einer Länge im Bereich von etwa 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen, und schließt gerade und verzweigte Ketten ein. Die Kohlenwasserstoffketten können gesättigt oder ungesättigt sein. Der Begriff „substituierter Alkylrest" bedeutet einen Alkylrest, der mit einem oder mehreren nicht störenden Substituenten, wie C₃-C₆-Cycloalkyl, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl und dergleichen; Acetylen; Cyano; Alkoxy, z.B. Methoxy, Ethoxy und dergleichen; Niederalkanoyloxy, z.B. Acetoxy; Hydroxy; Carboxyl; Amino; Niederalkylamino, z.B. Methylamino; Keton; Halogen, z.B. Chlor oder Brom; Phenyl; substituiertes Phenyl und dergleichen, substituiert ist, wobei die Substituenten nicht auf diese beschränkt sind.
Hier bedeutet „nicht-peptidisch" eine Polymerhauptkette, die im Wesentlichen frei von Peptidverknüpfungen ist. Die Polymerhauptkette kann jedoch eine geringe Zahl an Peptidverknüpfungen, die in Abständen entlang der Länge der Hauptkette verteilt sind, wie zum Beispiel nicht mehr als etwa 1 Peptidverknüpfung pro etwa 50 Monomereinheiten, einschließen.
Ein „Polymerkonjugat" bedeutet eine wasserlösliche Polymerhauptkette, die kovalent an ein biologisch aktives Molekül, wie hier definiert, gebunden ist. In dem Fall, in dem ein Polymerkonjugat mit einem zweiten Polymer umgesetzt wird, um eine verlängerte Polymerhauptkette zu bilden, bezieht sich der Begriff „Polymerkonjugat" auf die gesamte Länge des an den biologischen Wirkstoff gebundenen Polymers, unabhängig davon, ob die Verbindung der Polymere durch eine peptidische oder eine andere Verknüpfung erfolgt.
Der Begriff „Verknüpfung", „Verknüpfer" oder „Verknüpfungsrest" bedeutet hier Reste oder Bindungen, die normalerweise als Folge einer chemischen Umsetzung gebildet werden und typischerweise kovalente Verknüpfungen sind. Hydrolytisch stabile Verknüpfungen bedeutet, dass die Verknüpfungen in Wasser im Wesentlichen stabil sind und sich bei verwendbaren pH-Werten, z.B. unter physiologischen Bedingungen, über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise unbegrenzt, nicht mit Wasser umsetzen. Hydrolytisch instabile oder abbaubare Verknüpfungen bedeutet, dass die Verknüpfungen in Wasser oder in wässrigen Lösungen, einschließlich zum Beispiel Blut, abbaubar sind. Enzymatisch instabile oder abbaubare Verknüpfungen bedeutet, dass die Verknüpfung durch ein oder mehrere Enzyme abgebaut werden kann.
Der Begriff „biologisch aktives Molekül", „biologisch aktive Einheit", „biologischer Wirkstoff" oder „Arzneistoff" bedeutet hier jede Substanz, die physikalische oder biochemische Eigenschaften eines biologischen Organismus, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Viren, Bakterien, Pilze, Pflanzen, Tiere und Menschen, beeinflussen kann. Insbesondere schließen hier verwendete biologisch aktive Moleküle alle Substanzen ein, die zur Diagnose, Heilung und Linderung, Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Menschen oder anderen Tieren oder zur anderweitigen Verbesserung des physischen oder psychischen Wohlbefindens von Mensch oder Tier bestimmt sind. Beispiele für biologisch aktive Moleküle schließen Peptide, Proteine, Enzyme, Arzneistoffe aus kleinen Molekülen, Farbstoffe, Lipide, Nukleoside, Oligonukleotide, Zellen, Viren, Liposome, Mikropartikel und Micellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Klassen von biologischen Wirkstoffen, die zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, schließen Antibiotika, Fungizide, antivirale Mittel, entzündungshemmende Mittel, Zytostatika, Herz-Kreislaufmittel, Anxiolytika, Hormone, Wachstumsfaktoren, Steroidmittel und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Begriffe „Polymer mit niedrigem Gewicht" und „Polymer mit niedrigem Molekulargewicht" bedeuten allgemein eine lineare, verzweigte, mehrarmige oder gegabelte Polymerhauptkette, umfassend ein wasserlösliches und nicht-peptidisches Polymer mit 1 bis etwa 120 Wiederholungseinheiten. Diese Polymere weisen typischerweise 1 bis 2 funktionelle Reste, die sich typischerweise an gegenüberliegenden Enden auf einem linearen Polymer befinden, bis zu etwa 300, die sich an den Enden von hochverzweigten oder mehrarmigen Strukturen befinden können, obgleich sich eine geringere Anzahl entlang der Polymerhauptkette befinden kann, auf. Geeignete Polymere sind ausgewählt aus Poly(alkylenglycol), wie Poly(ethylenglycol) (PEG), Poly(propylenglycol) (PPG), Copolymeren aus Ethylenglycol und Propoylenglycol und dergleichen, Poly(oxyethyliertem Polyol), Poly(olefinalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(hydroxypropylmethacrylamid), Poly(α-hydroxysäure), Poly(vinylalkohol), Polyphosphazen, Polyoxazolin, Poly(N-acryloylmorpholin) und Copolymeren, Terpolymeren, Derivaten und Gemischen davon. Es ist selbstverständlich, dass in den vorstehenden oligomere und sogar monomere Längen eingeschlossen sind. Obwohl das Molekulargewicht des kleinen Polymers oder Oligomers variieren kann, liegt es typischerweise im Bereich von etwa 100 Da bis etwa 10.000 Da, abhängig natürlich vom Molekulargewicht der einzelnen Wiederholungseinheiten. Im Fall von PEG weist eine PEG-Monomereinheit ein Molekulargewicht von etwa 44 Da auf, und Polymere mit niedrigem Gewicht werden ein Molekulargewicht von etwa 44 Da bis etwa 5280 Da aufweisen. Molekulargewichte von 2000, 3200, 3400 und 5000 sind im Allgemeinen im Handel erhältlich. Der Fachmann wird erkennen, dass die vorstehende Liste der im Wesentlichen wasserlöslichen und nicht-peptidischen Polymerhauptketten keineswegs vollständig ist, sondern nur der Veranschaulichung dient, und dass alle Polymermaterialien mit den vorstehenden Qualitäten betrachtet werden.
Die Begriffe „Polymer mit hohem Gewicht" und „Polymer mit hohem Molekulargewicht" bedeuten allgemein eine lineare, verzweigte oder mehrarmige Polymerhauptkette, umfassend ein wasserlösliches und nicht-peptidisches Polymer mit mehr als etwa 200 Wiederholungseinheiten. Diese Polymere weisen typischerweise 1 bis 2 funktionelle Reste, die sich typischerweise an gegenüberliegenden Enden auf einem linearen Polymer befinden, bis zu etwa 300, die sich entlang der Polymerhauptkette oder an den Enden von hochverzweigten oder mehrarmigen Strukturen befinden können, auf. Gegabelte Strukturen, in denen ein Ende verzweigt ist, um zwei Funktionalitäten bereitzustellen, werden ebenfalls betrachtet. Es sind die gleichen Polymere geeignet, wie diejenigen, aus denen das Polymer mit niedrigem Gewicht gewählt wird. Obwohl das Molekulargewicht des Polymers variieren kann, beträgt es typischerweise mehr als etwa 8.000 Da, abhängig natürlich vom Molekulargewicht der einzelnen Monomereinheiten. Im Fall von PEG weisen Polymere mit hohem Gewicht ein Molekulargewicht oberhalb etwa 8.800 Da auf. Im Handel erhältliche PEGs schließen diejenigen mit einem nominalen Molekulargewicht von 10.000, 12.000, 15.000, 18.000 und 20.000, 30.000, 40.000 und höher, ein. Verzweigte PEGs mit höheren Molekulargewichten sind leicht erhältlich. Der Fachmann wird erkennen, dass die vorstehende Liste der im Wesentlichen wasserlöslichen und nicht-peptidischen Polymerhauptketten keineswegs vollständig ist sondern nur der Veranschaulichung dient, und dass alle Polymermaterialien mit den vorstehenden Qualitäten betrachtet werden.
Hier bedeutet „PEG" allgemein eine lineare, mehrarmige oder verzweigte Polymerhauptkette, umfassend ein wasserlösliches und nicht-peptidisches Polymer mit CH₂CH₂O-Wiederholungseinheiten. Das Polymer α, ω-Dihydroxypoly(ethylenglycol) kann in Kurzform als HO-PEG-OH dargestellt werden, wobei das Symbol -PEG- die folgende Struktureinheit -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- bedeutet, wobei n typischerweise im Bereich von etwa 3 bis etwa 2000 liegt. Die PEG-Familie von Polymeren weist im Allgemeinen die Eigenschaften Löslichkeit in Wasser und in vielen organischen Lösungsmitteln, fehlende Toxizität und fehlende immunogene Aktivität auf. Der Begriff PEG ist als umfassend und als Poly(ethylenglycol) in jeder seiner linearen, verzweigten oder mehrarmigen Formen einschließend anzusehen, einschließlich Alkoxy-PEG, bifunktionellem PEG, gegabeltem PEG, verzweigtem PEG, Seitengruppen-PEG oder PEG mit abbaubaren Verknüpfungen.
PEG ist in jeder der hier beschriebenen Formen typischerweise klar, farblos, geruchlos, wasserlöslich, wärmestabil, inert gegenüber vielen chemischen Agenzien, hydrolysiert nicht oder baut sich nicht ab (wenn er nicht speziell dafür ausgelegt ist) und ist im Allgemeinen nicht toxisch. Poly(ethylen)glycol wird als biologisch verträglich angesehen, was bedeutet, dass PEG mit lebenden Geweben oder Organismen koexistieren kann, ohne Schäden zu verursachen. Insbesondere weist PEG im Wesentlichen keine immunogene Aktivität auf, was bedeutet, dass PEG nicht darauf abzielt, eine Immunantwort im Körper hervorzurufen. Wenn es an ein Molekül gebunden ist, das irgendeine erwünschte Funktion im Körper hat, wie ein biologischer Wirkstoff, zielt das PEG darauf ab, den Wirkstoff zu maskieren und kann eine Immunantwort verringern oder verhindern, so dass ein Organismus die Gegenwart des Wirkstoffs tolerieren kann. PEG-Konjugate zielen nicht darauf ab, eine wesentliche Immunantwort hervorzurufen oder Blutgerinnung oder andere unerwünschte Wirkungen zu verursachen.
Statistische oder Blockcopolymere aus Ethylenoxid und Propylenoxid sind nachstehend dargestellt und können auch als Polymerhauptkette entweder der Polymere mit hohem oder der Polymere mit niedrigem Gewicht der Erfindung verwendet werden, wobei -PEG- ersetzt ist durch: -CH₂CHRO(CH₂CHRO)_cCH₂CHR und wobei jeder der Reste R unabhängig H oder CH₃ bedeutet und c wie vorstehend für m und n beschrieben ist, abhängig davon, ob das Molekül klein oder groß ist.
Der Begriff „Polymerderivat" wird manchmal verwendet, um das erfindungsgemäße Polymerprodukt mit hohem Gewicht zu beschreiben, in dem ein Polymersegment mit hohem Gewicht und ein Polymersegment mit niedrigem Gewicht durch eine Verknüpfung verbunden sind. Der Begriff dient nur der Einfachheit und wird wenn es angebracht ist verwendet, um das Polymerprodukt von seinen Polymerkomponenten mit hohem und niedrigem Gewicht zu unterscheiden.
In einer in der Erfindung verwendbaren Form ist das Polymer mit hohem Molekulargewicht lineares PEG mit einer endständigen Hydroxylgruppe an einem Ende und einem endständigen funktionellen Rest Z am anderen Ende: HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Z
Das vorstehende Polymer kann in Kurzform als HO-PEG-Z dargestellt werden, wobei das Symbol -PEG- die folgende Struktureinheit bedeutet: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- wobei für das Polymer mit hohem Gewicht n größer ist als 200 und typischerweise im Bereich von etwa 200 bis 2000 liegt. Dieses Polymer kann auch allgemeiner als R-(Poly)_a-Z bezeichnet werden, wobei (Poly)_a für die erfindungsgemäße große Polymerkomponente steht und R die abdeckende Einheit oder ein geeigneter reaktiver Rest oder ein geschützter reaktiver Rest Y'' ist.
Ein anderer Typ von PEG, der als erfindungsgemäßes Polymer mit hohem Gewicht, (Poly)_a, verwendbar ist, ist Methoxy-PEG-Z oder kurz mPEG-Z, in dem ein Ende die vergleichsweise inerte Methoxygruppe ist, während das andere Ende der funktionelle Rest Z ist. Die Struktur von mPEG wird dargestellt durch: CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Z wobei n wie vorstehend beschrieben ist. Die Verwendung eines mPEGs mit einem funktionellen Rest Z oder mit von Z verschiedenen aktiven Stellen des Polymers, die durch Alkyl, Aryl oder andere nicht reaktive Reste oder Schutzgruppen abgedeckt sind, verhindert die Autopolymerisation des Polymers mit hohem Gewicht und die unerwünschte Kombination des Polymers mit hohem Gewicht mit anderen Molekülen im Reaktionsgemisch.
Der funktionelle Rest Z des Polymers mit hohem Gewicht ist so gewählt, dass der Rest Z bei der Umsetzung leicht eine kovalente Bindung mit einer entsprechenden reaktiven Spezies Y oder Y', die sich an dem Polymer mit niedrigem Gewicht befindet, bildet, wodurch eine Verknüpfung X zwischen dem Polymer mit hohem Gewicht und dem Polymer mit niedrigem Gewicht gebildet wird. Geeignete funktionelle Reste werden nachstehend diskutiert.
In einer beispielhaften Form, die bei der Durchführung der Erfindung verwendbar ist, ist das Polymer mit niedrigem Molekulargewicht ein lineares PEG-Polymer mit einem endständigen funktionellen Rest Y oder Y' an einem Ende, der bei der Umsetzung mit der Z-Komponente des Polymers mit hohem Gewicht leicht einen hydrolytisch stabilen Verknüpfungsrest bilden kann, und einem zusätzlichen funktionellen Rest Y oder Y', der mit einem biologischen Wirkstoff eine kovalente Bindung bilden kann oder zu einer Form modifiziert werden kann, die eine kovalente Bindung mit einem biologischen Wirkstoff bilden kann: Y'-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-Y
Das vorstehende Polymer kann in Kürze als Y'-PEG-Y bezeichnet werden, wobei das Symbol -PEG- die folgende Struktureinheit bedeutet: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂- wobei für das Polymer mit niedrigem Gewicht m im Bereich von 1 bis etwa 120 liegt und typischerweise weniger als etwa 60 beträgt. Allgemeiner kann das Polymer als Y'-(Poly)_b-Y bezeichnet werden, wobei (Poly)_b für die erfindungsgemäße kleine Polymerkomponente steht. Die funktionellen Reste Y' und Y des Polymers mit niedrigem Gewicht sind so gewählt, dass sie sich unter Reaktionsbedingungen nicht leicht miteinander verbinden, wodurch eine Autopolymerisation des Polymers mit niedrigem Gewicht vermieden wird. Akzeptable Reste Y' und Y werden nachstehend vollständiger spezifiziert.
Die Polymerhauptketten können auch eine verzweigte Struktur, typischerweise mit einer zentralen verzweigenden Kerneinheit und einer Vielzahl an Polymerketten, vorzugsweise linearen Polymerketten, die mit dem zentralen Kern verknüpft sind, umfassen. In einer Ausführungsform wird PEG in einer verzweigten Form verwendet, hergestellt zum Beispiel durch Zugabe von Ethylenoxid zu verschiedenen zentralen Polyolkernstrukturen, wie Glycerol, Glycerololigomeren, Pentaerythritol und Sorbitol. Jedes Polyol, das eine Vielzahl an Hydroxylgruppen bereitstellt, die für eine Konjugation an Polymerketten verfügbar sind, kann bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Die verzweigende Polyolkernstruktur kann etwa 3 bis 100 verfügbare Hydroxylgruppen bereitstellen, und stellt typischerweise etwa 3 bis 20 bereit, so dass die verzweigte Polymerstruktur etwa 3 bis 100 Polymerketten aufweist. Die verzweigten Poly(ethylenglycol)moleküle dieses Typs können in allgemeiner Form als R(-PEG-OH)_a dargestellt werden, wobei sich R von einer zentralen Kerneinheit, wie Glycerol, Glycerololigomeren oder Pentaerythritol, ableitet und „a" die Anzahl der Arme, typischerweise etwa 3 bis 20, bedeutet.
Zur Verwendung als Polymer mit hohem Molekulargewicht werden die Hydroxylgruppen des verzweigten PEGs normalerweise vor der Kombination mit dem Polymer mit niedrigem Gewicht zu funktionellen Resten Z umgewandelt. Verzweigte oder mehrarmige Polymere mit hohem Gewicht weisen die Form R(-PEG-Z)_a auf und können abhängig vom Grad der Verzweigung oder von der Zahl der Arme mit aktiven Resten etwa 3 bis 20 der erfindungsgemäßen Polymere mit niedrigem Gewicht binden. Die zentrale Kerneinheit des verzweigten Moleküls kann sich von jeder aus einer Reihe von Aminosäuren, wie Lysin, ableiten, wobei die zentrale Kerneinheit typischerweise zwei oder mehr Stellen, z.B. Aminogruppen, zur Bindung von Polymerketten zur Verfügung stellt. Mehrarmige PEG-Moleküle, wie die in US-Patent Nr. 5.932.462 , das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist, beschriebenen, können auch als Polymerhauptkette verwendet werden.
Die Polymerhauptkette des Polymers mit hohem Molekulargewicht kann in einer anderen Ausführungsform gegabeltes PEG umfassen. Ein Beispiel für gegabeltes PEG wird durch PEG-ACHZ₂ dargestellt, wobei A einen Verknüpfungsrest und Z eine aktivierte Endgruppe, die durch eine Atomkette mit definierter Länge an CH gebunden ist, bedeutet. Die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US99/05333 , dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, offenbart verschiedene gegabelte PEG-Strukturen zur Verwendung in einer Ausführungsform der Erfindung. Die Atomkette, welche die funktionellen Reste Z mit dem verzweigenden Kohlenstoffatom verknüpft, dient als ein Verbindungsrest (tethering group) und kann zum Beispiel Alkylketten, Etherketten, Esterketten, Amidketten und Kombinationen davon umfassen. Die funktionellen Reste Z können in der vorliegenden Erfindung zur Reaktion mit einem der funktionellen Reste Y oder Y' am Polymer mit niedrigem Gewicht verwendet werden, um eine Verknüpfung zwischen den Polymeren mit niedrigem Gewicht und den Polymeren mit hohem Gewicht zu bilden.
Die Polymerhauptkette sowohl des Polymers mit niedrigem Gewicht als auch des Polymers mit hohem Gewicht kann fallweise ein Seitengruppen-PEG-Molekül mit funktionellen Resten Z, Y oder Y', die eher entlang der Länge der PEG-Hauptkette als an das Ende der PEG-Kette kovalent gebunden sind, umfassen. Die reaktiven Seitengruppen können direkt oder durch eine Verknüpfungseinheit, wie Alkylen, an die PEG-Hauptkette gebunden werden.
Im Falle eines Polymers mit hohem Gewicht mit mehr als einem funktionellen Rest Z bestehen entlang des Polymers viele Stellen, an die der entsprechende funktionelle Rest Y oder Y' an dem Polymer mit niedrigem Gewicht binden kann. Die daraus hergestellten Polymerderivate werden der Einfachheit halber dargestellt als: PEG-[X-(CH₂CH₂O)_m-Y]_q wobei PEG ein lineares Poly(ethylenglycol), Alkoxypoly(ethylenglycol), ein verzweigtes Poly(ethylenglycol) oder ein gegabeltes Poly(ethylenglycol) ist, wobei das PEG einen Polymerisationsgrad von mindestens etwa 200, vorzugsweise von mehr als etwa 1000 und vorzugsweise von weniger als etwa 2000 aufweist, X die Verknüpfungseinheit ist, m 1 bis etwa 120 und vorzugsweise weniger als 60 bedeutet, Y ein funktioneller Rest, einschließlich eines endständigen elektrophilen oder nukleophilen Rests, zur Bindung an einen biologischen Wirkstoff ist und q die Anzahl der Polymerendgruppen ist und 1 bis 500 bedeuten kann. Wenn q 2 ist, können die Reste Y identisch oder verschieden sein, aber wenn q viel größer ist als 3 oder 4, würden die Reste Y normalerweise alle der gleiche Rest sein. Allgemeiner kann in der vorstehenden Struktur PEG (Poly)_a bedeuten, und die Monomereinheit CH₂CH₂O kann durch (Poly)_b ausgedrückt werden und schließt ähnliche kleine Polymere wie vorstehend definiert, Copolymere, Oligomere und dergleichen ein.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Formen von PEG kann jedes der vorstehenden Polymere auch mit einer oder mehreren schwachen oder abbaubaren Verknüpfungen in der Hauptkette hergestellt werden. Zum Beispiel kann PEG mit Esterverknüpfungen in der Polymerhauptkette, die der Hydrolyse unterliegen, hergestellt werden. Wie nachstehend dargestellt, führt diese Hydrolyse zu einer Spaltung des Polymers in Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht: -PEG-CO₂-PEG- + H₂O → -PEG-CO₂H + HO-PEG-
Ähnlich kann eine Polymerhauptkette durch eine schwache oder abbaubare Verknüpfungseinheit kovalent an einen biologischen Wirkstoff gebunden sein. Zum Beispiel hydrolysieren Esterverknüpfungen, die durch die Umsetzung von PEG-Carbonsäuren oder aktivierten PEG-Carbonsäuren mit Alkoholresten an einem biologischen Wirkstoff gebildet wurden, im Allgemeinen unter physiologischen Bedingungen, wobei der Wirkstoff freigesetzt wird.
Andere hydrolytisch abbaubare Verknüpfungen, die entweder als abbaubare Verknüpfung innerhalb einer Polymerhauptkette oder als abbaubare Verknüpfung, die eine Polymerhauptkette an einen biologisch aktiven Wirkstoff bindet, verwendbar sind, schließen ein: Carbonatverknüpfungen; Iminverknüpfungen, die zum Beispiel aus der Reaktion eines Amins und eines Aldehyds stammen (siehe z.B. Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1): 582-3 (1997), das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist); Phosphatesterverknüpfungen, die zum Beispiel durch Umsetzen eines Alkohols mit einem Phosphatrest gebildet werden; Hydrazonverknüpfungen, die typischerweise durch Umsetzen eines Hydrazids und eines Aldehyds gebildet werden; Acetalverknüpfungen, die typischerweise durch Reaktion zwischen einem Aldehyd und einem Alkohol gebildet werden; Orthoesterverknüpfungen, die zum Beispiel durch Reaktion zwischen einem Formiat und einem Alkohol gebildet werden; Peptidverknüpfungen, die durch eine Aminogruppe, z.B. an einem Ende eines Polymers, wie PEG, und einer Carboxylgruppe eines Peptids gebildet werden; und Oligonukleotidverknüpfungen, die zum Beispiel durch einen Phosphoramiditrest, z.B. am Ende eines Polymers, und eine 5'-Hydroxylgruppe eines Oligonukleotids gebildet werden.
Viele andere Polymere sind ebenfalls für die Erfindung geeignet. Polymerhauptketten, die nicht-peptidisch und wasserlöslich sind, die anstelle von PEG auf die vorstehend spezifizierte Weise verwendet werden können, sind andere Poly(alkylenglycole), wie Poly(propylenglycol) (PPG), Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol und dergleichen, Poly(olefinalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(hydroxyalkylmethacrylamid), Poly(hydroxyalkylmethacrylat), Poly(saccharide), Poly(α-hydroxysäure), Poly(vinylalkohol), Polyphosphazen, Polyoxazolin, Poly(N-acryloylmorpholin), wie in US-Patent Nr. 5.629.384 , das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist, beschrieben, und Copolymere, Terpolymere und Gemische davon
Komponenten, welche den Verknüpfungsrest X bilden
Wie erwähnt können das Verfahren und das erhaltene funktionalisierte Polymer dargestellt werden durch: R-(Poly)_a-Z + Y'-(Poly)_b-Y → Y-(Poly)_b-X-(Poly)_a-X-(Poly)_b-Y
Z ist eine funktionalisierte Endgruppe des Polymers mit hohem Gewicht, (Poly)_a, und Y und Y' sind funktionalisierte Endgruppen des Polymers mit niedrigem Gewicht, (Poly)_b. R kann eine funktionalisierte Endgruppe Z, wenn die Herstellung eines homobifunktionellen Polymers, wie dargestellt, gewünscht wird, oder einen geschützten aktiven Rest zur späteren Kopplung an ein anderes kleineres aktiviertes Polymer, das mit einem anderen Rest Y'' aktiviert ist, wenn ein heterofunktionelles großes Polymer gewünscht wird, einschließen.
Verschiedene reaktive Reste Y, Y', Y'' und Z schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: N-Succinimidylcarbonat (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,281,698 , 5,468,478 ), Amin (siehe z.B. Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)), Hydrazid (siehe z.B. Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)), Succinimidylpropionat und Succinimidylbutanoat (siehe z.B. Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, S. 170-181, Harris & Zaplipsky Hrsg., ACS, Washington, DC, 1997; siehe auch US-Patent Nr. 5,672,662 ), Succinimidylsuccinat (siehe z.B. Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) und Joppich et al. Macromol. Chem. 180:1381 (1979)), Succinimidylester (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,670,417 ), Benzotriazolcarbonat (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,650,234 ), Glycidylether (siehe z.B. Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)), Oxycarbonylimidazol (siehe z.B. Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)), p-Nitrophenylcarbonat (siehe z.B. Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985) und Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)), Aldehyd (siehe z.B. Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984), US-Patent Nr. 5,824,784 , US-Patent Nr. 5,252,714 ), Maleimid (siehe z.B. Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984)) und Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)), Orthopyridyldisulfid (siehe z.B. Woghiren et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)), Acryloyl (siehe z.B. Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)), Vinylsulfon (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.900.461 ). Alle vorstehenden Literaturstellen sind hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Die Endgruppen Z und die mit Z reaktiven Reste Y, Y' oder Y'' werden so gewählt, dass die Endgruppeneinheiten komplementär sind, was bedeutet, dass die Endgruppen unter Reaktionsbedingungen leicht miteinander reagieren, wobei ein Verknüpfungsrest X gebildet wird, der typischerweise unter physiologischen Bedingungen hydrolytisch stabil ist. Es ist die Bildung des Verknüpfungsrests X, der das Polymer mit hohem Molekulargewicht an das Polymer mit niedrigem Molekulargewicht bindet, wodurch ein funktionalisiertes Gesamtpolymerderivat mit hohem Molekulargewicht gebildet wird.
Y, Y' und Y'' können identisch oder verschieden sein, solange sie nicht miteinander reaktiv sind. Außerdem sollte sich mindestens ein reaktiver Rest Y oder Y' nicht mit Z umsetzen, um eine Funktionalität für das fertige Polymer bereitzustellen.
Die funktionellen Reste oder chemisch reaktiven Reste am Polymer mit niedrigem Gewicht können ausgewählt sein aus Hydroxyl, geschütztem Hydroxyl, aktivem Ester, aktivem Carbonat, Acetal, Aldehyd, Aldehydhydraten, Alkenyl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, aktivem Sulfon, Amin, geschütztem Amin, Hydrazid, geschütztem Hydrazid, Thiol, geschütztem Thiol, Carbonsäure, geschützter Carbonsäure, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleimid, Vinylsulfon, Dithiopyridin, Vinylpyridin, Iodacetamid, Epoxid, Glyoxalen, Dionen, Mesylaten, Tosylaten, Thiosulfonat und Tresylat.
Reaktive Endgruppen können ausgewählt sein aus einem oder aus einer Kombination der folgenden: -(CH₂)_rCO₂H, -(CH₂)_r'CO₂NS, -(CH₂)_r'CO₂Bt, -(CH₂)_rCH(OR)₂, -(CH₂)_rCHO, -(CH₂)₂-NH₂, -(CH₂)_rM, -(CH₂)_r-S-SO₂-R, wobei r für 1-5 steht, r' für 0-5 steht, R für Aryl oder Alkyl steht, NS für N-Succinimidyl steht, Bt für 1-Benzotriazolyl steht und M für N-Maleimidyl steht.
Typischerweise ist die Verknüpfungseinheit X hydrophil und kurz. Der Verknüpfungsrest könnte jedoch aus hydrophoben Komponenten hergestellt werden, solange der Verknüpfungsrest, ob hydrophil oder hydrophob, die Eigenschaften des Polymers nicht wesentlich verändert. Das heißt, im Fall von PEG sollte der Verknüpfungsrest die vorstehend in der Definition von PEG angegebenen Eigenschaften nicht verändern.
Reaktionsbedingungen
Geeignete Lösungsmittel, die ein Medium für die Umsetzung der Z- und Y-, Y'- oder Y''-Endgruppen bei der Bildung des Verknüpfungsrests X bereitstellen, schließen Toluol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Benzol, Xylole und Lösungsmittel mit ähnlichen Eigenschaften ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen modifizierten und konjugierten Polymere mit niedrigem Gewicht mit höherem Wirkungsgrad und mit besseren Ergebnissen filtriert, getrennt und gereinigt werden können, als ähnlich modifizierte oder konjugierte Polymere mit hohem Gewicht der Vergangenheit. Im Allgemeinen ist es einfacher, Gemische aus Polymeren mit niedrigem Gewicht in Komponentenspezies zu trennen als ähnliche Polymere mit höherem Gewicht.
Eine Endgruppenmodifikation und -konjugation ist im Allgemeinen ein Mehrstufenverfahren, wobei jede Stufe der Funktionalisierung zu polymeren Verunreinigungen führt. Wenn die Reinigung wirkungslos ist, was der Fall sein kann, wenn es sich um Polymere mit hohem Gewicht handelt, reichern sich die Verunreinigungen während der Funktionalisierung des Polymers auf einen nicht annehmbaren Wert an. Indem die Funktionalisierungs- und Reinigungsverfahren zuerst an einem Polymer mit niedrigem Gewicht durchgeführt werden und das gereinigte Polymer mit niedrigem Gewicht anschließend gemäß dieser Erfindung mit einem Polymer mit hohem Gewicht verbunden wird, werden mit dem Polymer mit hohem Molekulargewicht verbundene Verfahrensschritte minimiert, was zu einem funktionalisierten oder konjugierten Polymerderivat mit hohem Gewicht mit insgesamt wünschenswerter Reinheit führt.
Verfahren zur Erzeugung des erfindungsgemäßen aktivierten Polymers mit hohem Molekulargewicht.
Ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymer mit hohem Molekulargewicht mit mindestens einem funktionellen Rest Z ist kovalent an ein typischerweise oligomeres wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymer mit niedrigem Molekulargewicht, das mindestens zwei funktionelle Reste, Y' und Y, aufweist, die identisch oder verschieden sein können, solange Y nicht mit Y' reaktiv ist und Z sich mit mindestens einem von Y oder Y' umsetzt, gebunden. Die Erfindung verkörpert auch die Konjugation des Polymerderivats mit einem biologischen Wirkstoff, nachdem das funktionalisierte Polymerderivat gemäß der Erfindung hergestellt wurde.
Im Allgemeinen werden das Verfahren und das erhaltende funktionalisierte Polymer dargestellt durch: (Poly)_a-Z + Y'-(Poly)_b-Y → (Poly)_a-X-(Poly)_b-Y wobei (Poly)_a mindestens etwa 200, typischerweise mindestens etwa 1000 und noch typischer zwischen 1000 und 2000 Wiederholungseinheiten aufweist und (Poly)_b bis etwa 120 und typischerweise weniger als 60 Wiederholungseinheiten aufweist. Y und Y' können identisch oder verschieden sein, solange Y' nicht mit Y reaktiv ist, und bedeuten funktionelle Reste, und X ist ein Verknüpfungsmolekül, das durch die Umsetzung von Z und den Komponenten Y oder Y' gebildet wird. Im vorstehenden Beispiel ist Z mit Y' reaktiv, wobei eine Verknüpfung X gebildet wird. (Poly)_a kann zusätzlich funktionalisiert werden, um ein homobifunktionelles Polymer mit reaktiven Resten Y an jedem Ende herzustellen. Wenn der zusätzliche Rest vor einer Umsetzung geschützt ist, kann die Schutzgruppe vom erhaltenen Polymerkonjugat entfernt werden, um ein heterobifunktionelles Polymer herzustellen.
Die erhaltenen erfindungsgemäßen Polymerderivate umfassen ein wasserlösliches Polymersegment mit hohem Molekulargewicht, das kovalent über einen Verknüpfungsrest mit einem wasserlöslichen Polymersegment mit niedrigem Molekulargewicht verbunden ist. Das Polymersegment mit niedrigem Molekulargewicht weist eine funktionalisierte Endgruppe Y zusätzlich zur Endgruppe, welche die Verknüpfung mit dem Polymersegment mit hohem Gewicht bereitstellt, auf. Die zusätzliche funktionalisierte Endgruppe Y auf dem Polymersegment mit niedrigem Gewicht stellt einen Verknüpfungsrest für eine kovalente Bindung mit einem biologischen Wirkstoff oder für die Umwandlung in einen derartigen Rest bereit.
Die folgenden werden als die Erfindung nicht einschränkende Beispiele der Erfindung angeführt.
Beispiel 1: Synthese von α-t-Boc-amino-ω-methansulfonat-PEG (3400)
α-N-t-Boc-amino-ω-hydroxy-PEG (3400) (MG 3318 Da, 4,0 g, 0,0012 Mol) (Shearwater Corp.) wurde in Chloroform (80 ml) an einem Rotationsverdampfer bei 35°C zur Trockene azeotrop destilliert, und Chloroform (50 ml) wurde zum Restsirup zugegeben. Die Lösung wurde unter Argon auf 4°C abgekühlt, und Triethylamin (0,31 ml, 0,0022 Mol) wurde eingespritzt, gefolgt von einem langsamen Einspritzen von Methansulfonylchlorid (0,15 ml, 0,0019 Mol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Argon gerührt, währenddessen sich das Bad auf Raumtemperatur erwärmen konnte. Wasserfreies Natriumcarbonat (4,0 g) wurde zum Reaktionsgemisch zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Isopropanol (40 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 3,7 g α-t-Boc-amino-ω-methansulfonat-PEG (3400). NMR (DMSO-d₆): 1,37 ppm (s, -OC(CH₃)₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,31 ppm (t, -CH₂SO₂-), 6,76 ppm (-CH₂NH-CO-). Dieses Beispiel zeigt, wie der funktionelle Rest Y des Polymers mit niedrigem Gewicht, α-N-t-Boc-amino-ω-hydroxy-PEG (3400), mit einer gutem Ausbeute an modifiziertem Polymer mit niedrigem Gewicht modifiziert wird.
Beispiel 2: Synthese von α-t-Boc-amino-ω-p-toluolthiosulfonat-PEG (3400)
α-t-Boc-amino-ω-methansulfonat-PEG (3400) (das Produkt aus Beispiel 1) (1,0 g, 0,30 mMol) wurde in Chloroform (30 ml) an einem Rotationsverdampfer bei 35°C zur Trockene azeotrop destilliert, und wasserfreies Ethanol (15 ml) wurde zum Restsirup zugegeben. Kalium-p-toluolthiosulfonat (292 mg, 1,25 mMol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde unter Argon über Nacht unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer bei 40°C entfernt, und der Rückstand wurde im Vakuum 30 Minuten getrocknet. Das Rohprodukt wurde in 100 ml 1 M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄-Pufferlösung (10 Gew.-% NaCl enthaltend) bei einem pH-Wert 5,8 gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit Dichlormethan (100 ml × 3) extrahiert. Die Dichlormethanphase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Filtrat an einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockene eingeengt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Isopropanol/Ether (40 ml/20 ml) gefällt, durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,7 g α-t-Boc-amino-ω-p-toluolthiosulfonat-PEG (3400). NMR: (DMSO-d₆): 1,37 ppm (s, -OC(CH₃)₃), 2,43 ppm (s, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 6,76 ppm (t, -CH₂NH-CO-), 7,49 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 7,82 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar). Dieses Beispiel zeigt wieder, wie der funktionelle Rest Y des Polymers mit niedrigem Gewicht, α-t-Boc-amino-ω-methansulfonat-PEG (3400), mit einer gutem Ausbeute an modifiziertem Polymer mit niedrigem Gewicht modifiziert wird.
Beispiel 3: Synthese von α-NH₂-ω-p-toluolthiosulfonat-PEG (3400)
α-t-Boc-amino-ω-p-toluolthiosulfonat-PEG (3400) (das Produkt aus Beispiel 2) (0,7 g) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (3,5 ml) und Trifluoressigsäure (3,5 ml) unter Argon gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt und zur Trockene eingeengt. Isopropanol (20 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,6 g α-NH₂-ω-p-toluolthiosulfonat-PEG (3400) NMR (DMSO-d₆): 2,43 ppm (s, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 2,95 ppm (t, -OCH₂CH₂NH₂), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 7,49 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 7.82 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar). Dieses Beispiel zeigt wieder, wie der funktionelle Rest Y des Polymers mit niedrigem Gewicht, α-t-Boc-amino-ω-toluolthiosulfonat-PEG (3400), mit einer gutem Ausbeute an modifiziertem Polymer mit niedrigem Gewicht modifiziert wird.
Beispiel 4: Synthese von mPEG(23,4 kDa)-p-toluolthiosulfonat
mPEG(20 kDa)-1-benzotriazol (813 mg, MG 21 kDa, 0,039 mMol) (Shearwater Corp.) und PEG(3400)-α-NH₂-ω-p-toluolthiosulfonat (das Produkt aus Beispiel 3) (MG 3805 Da, 200 mg, 0,053 mMol) wurden in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) unter Argon gelöst, und Triethylamin (30,8 μl, 0,22 mMol) wurde eingespritzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann zur Trockene eingeengt. 2-Propanol (10 ml) wurde zugegeben, und das ausgefällte Produkt wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 843 mg. Das rohe mPEG(23,4 kDa)-p-toluolthiosulfonat (560 mg) in 50 ml entionisiertem Wasser wurde auf eine mit 50 ml Poros-Medium gepackte Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 100 ml entionisiertem Wasser eluiert. Natriumchlorid (15 g) wurde zum Eluenten zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde mit Dichlormethan (100 ml × 3) extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, und das Filtrat wurde an einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockene eingeengt. Ethylether (50 ml) wurde zugegeben, um das Produkt auszufällen. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 495 mg mPEG(23,4 kDa)-p-toluolthiosulfonat. NMR (DMSO-d₆): 2,43 ppm (s, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 7,23 ppm (t, -NHCOO-), 7,49 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar), 7,82 ppm (dd, CH₃-CH₂=CH₂/Ar). Dieses Beispiel zeigt die Kombination eines Polymers mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-1-benzotriazol, mit einem modifizierten Polymer mit niedrigem Gewicht, PEG(3400)-α-NH₂-ω-p-toluolthiosulfonat, durch Umsetzen des funktionellen Rests Z, Benzotriazol, mit dem funktionellen Rest Y', Amin, wobei ein Verknüpfungsrest zwischen den Polymersegmenten mit hohem Gewicht und mit niedrigem Gewicht gebildet wird.
Beispiel 5: PEG-ylierung von α1-Antitrypsin
Zu einer Lösung von α1-Antitrypsin (1 mg, Sigma, MG 25 kDa) in 100 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,2, 1 ml) wurden 2,8 mg mPEG-p-toluolthiosulfonat (das Produkt aus Beispiel 4) (24 kDa) zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Eine Kapillarelektrophorese zeigte, dass das PEG-α1-Antitrypsin-Konjugat mit 36%-iger Ausbeute gebildet wurde. Eine SDS-Gelelektrophorese zeigte die Gegenwart des PEG-Konjugats ebenfalls. Die Behandlung des PEG-Konjugats mit β-Mercaptoethanol führte zur Bildung von α1-Antitrypsin, was durch Gelelektrophorese belegt wurde und daher auf die Gegenwart einer Disulfidverknüpfung im PEG-α1-Antitrypsin-Konjugat hinweist. Dieses Beispiel zeigt die Kombination eines biologischen Wirkstoffs, α1-Antitrypsin, mit dem Polymerderivat mit hohem Gewicht aus Beispiel 4 über die funktionalisierte Endgruppe Y, p-Toluolthiosulfonat.
Beispiel 6: mPEG(22 kDa)-propionsäure
Zu einer Lösung von mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat (2,0 g, 0,0001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (20 ml) wurden PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäure (0,24 g, 0,00012 Mol) (Shearwater Corporation) und Triethylamin (0,060 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einer Argonatmosphäre gerührt. Danach wurde das Gemisch filtriert, und das Lösungsmittel wurde zur Trockene verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst und mit Isopropylalkohol gefällt. Das nasse Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,9 g. NMR (d₆-DMSO): 2,44 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Eine Anionenaustauschchromatographie ergab mPEG(22 kDa)-propionsäure (93%) und mPEG-20 kDa (7%). Dieses Beispiel zeigt die Kombination eines Polymers mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat, mit einem Polymer mit niedrigem Gewicht, PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäure, über das funktionalisierte Carbonat Z und Aminoendgruppen Y'.
Beispiel 7. mPEG(22 kDa)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von mPEG(22 kDa)-propionsäure (das Produkt aus Beispiel 6) (1,1 g, 0,000050 Mol) in wasserfreiem Methylenchlorid (10 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (0,0063 g, 0,000055 Mol) zugegeben, gefolgt von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 M Lösung in Methylenchlorid, 0,05 ml, 0,000055 Mol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Danach wurde das Gemisch filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst, mit Isopropylalkohol gefällt und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 0,9 g. NMR (d₆-DMSO): 2,81 ppm (s, -CH₂-CH₂- (Succinat)), 2,92 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,03 ppm (m, -CH₂-O(C=O)), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation des funktionellen Rests Y des in Beispiel 6 hergestellten Polymers von Propionsäure zu Propionsäure-N-hydroxysuccinimidester.
Beispiel 8: PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäuremethylester
Zu einer Lösung von PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäure (10 g, 0,0050 Mol) (Shearwater Corporation) in wasserfreiem Methylenchlorid (100 ml) wurden 1-Hydroxybenzotriazol (0,30 g), 4-(Dimethylamino)pyridin (1,0 g), Methylalkohol (3,2 g, 0,100 Mol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 M Lösung in Methylenchlorid, 7,5 ml, 0,0075 Mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Danach wurde das Gemisch auf etwa 50 ml eingeengt, filtriert und zu 800 ml kaltem Diethylether zugegeben. Das ausgefällte Produkt wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 9,5 g. NMR (d₆-DMSO): 2,53 ppm (t, -CH₂-COO-), 2,95 ppm (t, -CH₂-Amin), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation der funktionellen Endgruppe Y des Polymers mit niedrigem Gewicht, PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäure, von Propionsäure zu Propionsäuremethylester.
Beispiel 9: mPEG(32 kDa)-propionsäuremethylester
Zu einer Lösung von mPEG(30 kDa)-benzotriazolcarbonat (3,0 g, 0,0001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (20 ml) wurden PEG(2 kDa)-α-amino-ω-propionsäuremethylester (das Produkt aus Beispiel 8) (0,24 g, 0,00012 Mol) und Triethylamin (0,060 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Danach wurde das Gemisch filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst, mit Isopropylalkohol gefällt und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 2,8 g. NMR (d₆-DMSO): 2,53 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des in Beispiel 8 hergestellten Polymers mit niedrigem Gewicht mit dem Polymer mit hohem Gewicht, mPEG(30 kDa)-benzotriazolcarbonat, über Z, Benzotriazolcarbonat, und funktionelle Aminogruppen Y'.
Beispiel 10: mPEG(32 kDa)-propionsäure
mPEG(32 kDa)-propionsäuremethylester (das Produkt aus Beispiel 9) (2,8 g, 0,000082 Mol) wurde in 20 ml entionisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 0,5 M NaOH-Lösung auf 12,0 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei einem pH-Wert 12,0 ± 0,1 gerührt. Danach wurde Natriumchlorid (3 g) zugegeben, und der pH-Wert wurde mit 5%-iger Phosphorsäure auf 3 eingestellt. Das Produkt wurde mit Methylenchlorid 3 Mal extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit wasserfreiem Magnesiumchlorid getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 1,6 g. NMR (d₆-DMSO): 2,44 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-).
Die Anionenaustauschchromatographie ergab mPEG(32 kDa)-propionsäure (97,5%), mPEG-30 kDa (2,5%). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation des funktionellen Rests Y des in Beispiel 9 hergestellten Polymers von Propionsäuremethylester zu Propionsäure.
Beispiel 11: mPEG(32 kDa)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von mPEG(32 kDa)-propionsäure (Produkt aus Beispiel 10) (1,6 g, 0,000050 Mol) in wasserfreiem Methylenchlorid (10 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (0,0063 g, 0,000055 Mol) zugegeben, gefolgt von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 M Lösung in Methylenchlorid, 0,05 ml, 0,000055 Mol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt, filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst, mit Isopropylalkohol gefällt und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 0,9 g. NMR (d₆-DMSO): 2,81 ppm (s, -CH₂-CH₂- (Succinat)), 2,92 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PBG-Hauptkette), 4,03 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation des funktionellen Rests Y des in Beispiel 9 hergestellten Polymers von Propionsäure zu Propionsäure-N-hydroxysuccinimidester.
Beispiel 12: mPEG(23,4 kDa)-buttersäure
Zu einer Lösung von mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat (2,0 g, 0,0001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (20 ml) wurden PEG(3,4 kDa)-α-amino-ω-buttersäure (0,45 g, 0,00012 Mol) (Shearwater Corporation) und Triethylamin (0,060 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einer Argonatmosphäre gerührt. Danach wurde das Gemisch filtriert und das Lösungsmittel bis zur Trockene verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst, mit Isopropylalkohol gefällt, und das Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 2,2 g. NMR (d₆-DMSO): 1,72 ppm (q, CH ₂-CH₂-COO-), 2,24 ppm (t, -CH₂-COO-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Die Anionenaustauschchromatographie ergab mPEG(23,4 kDa)-buttersäure (92%), mPEG-20kDa (8%). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des Polymers mit niedrigem Gewicht, PEG(3,4 kDa)-α-amino-ω-buttersäure, mit dem Polymer mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat, über das Benzotriazolcarbonat Z und funktionelle Aminogruppen Y'.
Beispiel 13: mPEG (22 kDa)-buttersäure-N-hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von mPEG(23,4 kDa)-buttersäure (Produkt aus Beispiel 12) (1,17 g, 0,000050 Mol) in wasserfreiem Methylenchlorid (10 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (0,0063 g, 0,000055 Mol) zugegeben, gefolgt von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (1,0 M Lösung in Methylenchlorid, 0,05 ml, 0,000055 Mol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt, filtriert, und das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst, mit Isopropylalkohol gefällt und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 1,0 g. NMR (d₆-DMSO): 1,83 ppm (q, CH ₂-CH₂-COO-), 2,70 ppm (t, -CH₂-COO-), 2,81 ppm (s, -CH₂-CH₂- (Succinat)), 2,92 ppm, 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,03 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation des funktionellen Rests Y des in Beispiel 12 hergestellten Polymers von Buttersäure zu Buttersäure-N-hydroxysuccinimidester
Beispiel 14: mPEG(20 kDa)-amin
Zu einer Lösung von mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat (2,0 g, 0,0001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (20 ml) wurde Triethylenglycoldiamin MG = 148,21 (0,3 g, 0,0020 Mol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel bis zur Trockene verdampft und das Rohprodukt in Methylenchlorid gelöst und mit Isopropylalkohol gefällt. Das Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 1,8 g. NMR (d₆-DMSO): 2,64 ppm (t, -CH₂-Amin-), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Die Kationenaustauschchromatographie ergab mPEG(20 kDa)-amin (97,5%). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des Polymers mit niedrigem Gewicht, Triethylenglycoldiamin, mit dem Polymer mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat, über das Benzotriazolcarbonat Z und funktionelle Aminogruppen Y'.
Beispiel 15: PEG(3,4 kDa)-α-amino-ω-propionaldehyddiethylacetal
Zu einer Lösung von PEG(3,4 kDa)-α-hydroxy-ω-propionaldehyddiethylacetal (NOF) (1,0 g, 0,000294 Mol) in einem Gemisch aus Toluol (20 ml) und Dichlormethan (5 ml) wurden Triethylamin (0,07 ml, 0,000502 Mol, 171% der stöchiometrischen Menge) und Methansulfonylchlorid (0,028 ml, 0,000362 Mol, 123% der stöchiometrischen Menge) zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde über Nacht in einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde zu einem Gemisch aus 16 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid und 1,6 g Ammoniumchlorid zugegeben und 42 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde mit Dichlormethan (3 Mal 20 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde mit 5 ml 1 M Salzsäure und 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Danach wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 0,78 g PEG(3,4 kDa)-α-aminhydrochlorid-ω- propionaldehyddiethylacetal erhalten wurden. NMR (d₆-DMSO): 1,10 ppm (t, CH₃-, Acetal), 1,74 ppm (q, -OCH₂ CH ₂CH-, Acetal), 2,94 ppm (t, -CH₂-Aminhydrochlorid), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,55 ppm (t, -CH-, Acetal), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation der funktionellen Endgruppe Y' des Polymers mit niedrigem Gewicht, PEG(3,4 kDa)-α-hydroxy-ω-propionaldehyd von einer Hydroxy- zu einer Aminogruppe.
Beispiel 16: mPEG(23,4 kDa)-propionaldehyddiethylacetal
Zur einer Lösung von mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat (2,0 g, 0,0001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (20 ml) wurde PEG(3,4 kDa)-α-amino-ω-propionaldehyddiethylacetal (0,36 g, 0,000106 Mol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einer Argonatmosphäre gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel bis zur Trockene verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst und mit Isopropylalkohol gefällt. Das nasse Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 1,8 g. NMR (d₆-DMSO): 1,10 ppm (t, CH₃-, Acetal), 1,74 ppm (q, -OCH₂ CH ₂CH-, Acetal), 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 4,55 ppm (t, -CH-, Acetal), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des in Beispiel 15 hergestellten Polymers mit niedrigem Gewicht, PEG(3,4 kDa)-α-amino-ω-propionaldehyddiethylacetal, mit dem Polymer mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat, über das Benzotriazolcarbonat Z und funktionelle Aminogruppen Y'.
Beispiel 17: mPEG(23,4 kDa)-propionaldehyd
mPEG(23,4 kDa)-propionaldehyddiethylacetal (Produkt aus Beispiel 16) (1,8 g) wurde in 20 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 M Natriumhydroxid wurde verwendet, um den pH-Wert der Lösung auf 7 einzustellen. Das Produkt wurde mit Methylenchlorid extrahiert, der Extrakt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Ausbeute: 1,6 g. NMR (d₆-DMSO): 2,60 ppm (dt, -OCH₂ CH ₂CH-, Aldehyd), 3,24 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (m, -CH₂-O(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-), 9,65 ppm (t, -CH, Aldehyd). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation des funktionellen Rests Y des in Beispiel 16 herstellten Polymers von Propionaldehyddiethylacetal zu Propionaldehyd.
Beispiel 18: Verzweigtes PEG2(43,4 kDa)-propionaldehyddiethylacetal
Zu einer Lösung von verzweigtem PEG2(40 kDa)-N-hydroxysuccinimidester (1,0 g, 0,000025 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (8 ml) wurden PEG(3,4 kDa)-α-aminhydrochlorid-ω-propionaldehyddiethylacetal (0,12 g, 0,0000352 Mol) und Triethylamin (0,01 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einer Argonatmosphäre gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel bis zur Trockene verdampft. Das Rohprodukt wurde in Methylenchlorid gelöst und mit Diethylether gefällt. Das nasse Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 0,83 g. NMR (d₆-DMSO): 1,10 ppm (t, CH₃-, Acetal), 1,74 ppm (q, -OCH₂ CH ₂CH-, Acetal), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,55 ppm (t, -CH-, Acetal). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des Polymers mit niedrigem Gewicht, PEG(3,4 kDa)-α-aminhydrochlorid-ω-propionaldehyddiethylacetal mit dem verzweigten Polymer mit hohem Gewicht, PEG2(40 kDa)-N-hydroxysuccinimidester, über den N-Hydroxysuccinimidester Z und funktionelle Aminhydrochloridgruppen Y'.
Beispiel 19: Verzweigter PEG2(43,4 kDa)-propionaldehyd
Verzweigtes PEG2(43,4 kDa)-propionaldehyddiethylacetal (Produkt aus Beispiel 18) (0,4 g) wurde in 10 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 M Natriumhydroxid wurde verwendet, um den pH-Wert der Lösung auf 7 einzustellen. Das Produkt wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Ausbeute: 0,35 g. NMR (d₆-DMSO): 2,60 ppm (dt, -OCH₂ CH ₂CH-, Aldehyd), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 9,65 ppm (t, -CH, Aldehyd). Dieses Beispiel zeigt die Modifikation der Endgruppe Y des in Beispiel 18 hergestellten Polymers von Propionaldehyddiethylacetal zu Propionaldehyd.
Beispiel 20: mPEG(20 kDa)-Maleimid
Zu einer Lösung von mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat (20,0 g, 0,001 Mol) (Shearwater Corporation) in Methylenchlorid (200 ml) wurden Maleimidtriethylenglycolamin TFA (0,68 g, 0,002 Mol) und 4-Methylmorpholin (0,44 ml, 0,004 Mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel bis zur Trockene verdampft, und es wurde mit Isopropylalkohol (1000 ml) gefällt. Der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und über Nacht im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 19,5 g. NMR (d₆-DMSO): 3,11 ppm (q, -CH ₂-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH₃), 3,51 ppm (s, PEG-Hauptkette), 4,04 ppm (t, -CH₂-O(C=O)-), 7,04 (s, -(C=O)-CH=CH-(C=O)-), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Dieses Beispiel zeigt die Kombination des Polymers mit hohem Gewicht, mPEG(20 kDa)-benzotriazolcarbonat, mit dem Polymer mit niedrigem Gewicht, Maleimidtriethylenglycolamin TFA, über das Benzotriazolcarbonat Z und funktionelle Aminogruppen Y'.

Claims

Aktiviertes Polymerderivat, wobei das Polymerderivat ein oder mehr erste wasserlösliche, nicht-peptidische Polymersegmente mit mindestens etwa 200 Wiederholungseinheiten umfasst, welche kovalent durch mindestens eine Verknüpfungseinheit an mindestens ein zweites wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymersegment mit nicht mehr als etwa 120 Wiederholungseinheiten gebunden ist, wobei die Einheiten der ersten und zweiten Polymersegmente gleich oder verschieden sein können, wobei die mindestens eine Verknüpfungseinheit die Eigenschaften des Polymerderivats nicht wesentlich verändert, wobei das Polymerderivat mindestens eine aktive Einheit aufweist, ausgewählt aus elektrophilen Einheiten und nuldeophilen Einheiten, welche sich auf einem der ersten und zweiten Polymersegmente befinden, und wobei die ersten und zweiten Polymersegmente unabhängig ausgewählt sind aus Poly(alkylenglycol), Poly(olefinalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(hydroxyalkylmethacrylamid), Poly(hydroxyalkylmethacrylat), Poly(sacchariden), Poly(α-hydroxysäure), Poly(vinylalkohol), Polyphosphazen, Polyoxazolin, Poly(N-acryloylmorpholin) und Copolymeren, Terpolymeren und Gemischen davon.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei die mindestens eine aktive Einheit eine einzelne Einheit ist, die sich auf dem zweiten Polymersegment befindet.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das erste Polymersegment weiterhin einen geschützten funktionellen Rest umfasst.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das erste Polymersegment etwa 200 bis 2000 Wiederholungsmonomereinheiten aufweist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das erste Polymersegment etwa 200 bis 700 Wiederholungseinheiten aufweist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das zweite Polymersegment 1 bis etwa 120 Wiederholungseinheiten aufweist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das zweite Polymersegment etwa 40 bis 80 Wiederholungseinheiten aufweist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Polymersegmente Poly(ethylenglycol) sind.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei die Verknüpfungseinheit zwischen den ersten und zweiten Polymersegmenten eine hydrophile Einheit, ausgewählt aus einer Amid- oder Carbamatverknüpfung, ist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei die aktive Einheit ausgewählt ist aus Hydroxyl, geschütztem Hydroxyl, aktivem Ester, aktivem Carbonat, Acetal, Aldehyd, Aldehydhydraten, Alkenyl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, aktivem Sulfon, Amin, geschütztem Amin, Hydrazid, geschütztem Hydrazid, Thiol, geschütztem Thiol, Carbonsäure, geschützter Carbonsäure, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleimid, Vinylsulfon, Dithiopyridin, Vinylpyridin, Iodacetamid, Epoxid, Glyoxalen, Dionen, Mesylaten, Tosylaten, Thiosulfonat und Tresylat.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei die Polymersegmente ausgewählt sind aus linearen, verzweigten und mehrarmigen Polymersegmenten.
Aktiviertes Polymerderivat, wobei das Polymerderivat ein lineares Monomethoxypoly(ethylenglycol)segment mit etwa 200 bis 700 Wiederholungseinheiten umfasst, welche kovalent durch mindestens eine Amid- oder Carbamat-Verknüpfungseinheit an ein Ende eines linearen Poly(ethylenglycol)segments gebunden sind, welches 1 bis 120 Wiederholungsmonomereinheiten aufweist, und wobei das Poly(ethylenglycol)segment mit 1 bis 120 Wiederholungsmonomereinheiten mindestens eine aktive Einheit, ausgewählt aus elektrophilen Einheiten und nukleophilen Einheiten an ihrem Ende, das dem Poly(ethylenglycol)segment mit 200 bis 700 Wiederholungsmonomereinheiten gegenüberliegt, einschließt.
Polymerderivat, ausgewählt aus Monomethoxypoly(ethylenglycol)-p-toluolthiosulfonat; Monomethoxypoly(ethylenglycol)propionsäure; Monomethoxypoly(ethylenglycol)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester; Monomethoxypoly(ethylenglycol)propionsäuremethylester; Monomethoxypoly(ethylenglycol)butansäure; Monomethoxypoly(ethylenglycol)butansäure-N-hydroxysuccinimidester; Monomethoxypoly(ethylenglycol)butansäuremethylester; Monomethoxypoly(ethylenglycol)amin; Monomethoxypoly(ethylenglycol)propionaldehyd; Monomethoxypoly(ethylenglycol)propionaldehyddiethylacetal; Dimonomethoxypoly(ethylenglycol)lysinpropionaldehyd; Dimonomethoxypoly(ethylenglycol)lysinpropionaldehyddiethylester; und Monomethoxypoly(ethylenglycol)maleimid, wobei das Polymerderivat ein Molekulargewicht von mindestens etwa 10000 Dalton aufweist und mindestens zwei unterschiedliche, durch einen Verknüpfungsrest verbundene Poly(ethylenglycol)segmente aufweist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 13, das mit einem biologisch aktiven Molekül konjugiert ist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1 mit der Struktur (Poly)_a-X-(Poly)_b-Y, wobei (Poly)_a ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymersegment mit mehr als etwa 200 Wiederholungseinheiten ist, X eine Verknüpfungseinheit ist, die die Eigenschaften des Polymerderivats nicht wesentlich verändert, (Poly)_b ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymersegment mit 1 bis etwa 120 Wiederholungseinheiten ist, welches mit (Poly)_a identisch oder von ihm verschieden sein kann, und Y eine elektrophile oder nukleophile Einheit ist.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1 mit der Struktur Y-(Poly)_b-X-(Poly)_a-X-(Poly)_b-Y, wobei (Poly)_a ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymersegment mit mehr als etwa 200 Wiederholungseinheiten ist, X eine Verknüpfungseinheit ist, die die Eigenschaften des Polymerderivats nicht wesentlich verändert, (Poly)_b ein wasserlösliches, nicht- peptidisches Polymersegment mit 1 bis etwa 120 Wiederholungseinheiten ist, und wobei Y eine elektrophile oder nukleophile Einheit ist.
Polymer gemäß Anspruch 1, wobei die aktive Einheit ausgewählt ist aus -(CH2)_rCO₂H, -(CH₂)_r'CO₂NS, -(CH₂)_r'CO₂Bt, -(CH₂)_rCH(OR)₂, -(CH₂)_rCHO, -(CH₂)₂-NH₂, -(CH₂)_rM, -(CH₂)_r-S-SO₂-R, wobei r für 1-5 steht, r' für 0-5 steht, R für Aryl oder Alkyl steht, NS für N-Succinimidyl steht, Bt für 1-Benzotriazolyl steht und M für N-Maleimidyl steht.
Polymer gemäß Anspruch 1, wobei eines oder beide der ersten und zweiten Polymersegmente ferner Reste zwischen den Monomeren umfassen, die sich hydrolytisch oder enzymatisch abbauen.
Polymer mit der Zusammensetzung PEG-[X-(CH₂CH₂O)_m-Y]_q, wobei: PEG ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymer ist, ausgewählt aus einem linearen Poly(ethylenglycol), Alkoxypoly(ethylenglycol), einem verzweigten Poly(ethylenglycol) und einem gegabelten Poly(ethylenglycol), mit oder ohne hydrolytisch oder enzymatisch abbaubaren Verknüpfungen, wobei das Poly(ethylenglycol) mindestens 200 Wiederholungsmonomereinheiten aufweist, X eine Verknüpfungseinheit ist, m für 1 bis etwa 120 steht, Y eine Einheit mit einem endständigen elektrophilen oder nuldeophilen Rest ist, und q für 1 bis etwa 500 steht.
Polymer gemäß Anspruch 19, wobei Y ausgewählt ist aus Hydroxyl, geschütztem Hydroxyl, aktivem Ester, aktivem Carbonat, Acetal, Aldehyd, Aldehydhydraten, Alkenyl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, aktivem Sulfon, Amin, geschütztem Amin, Hydrazid, geschütztem Hydrazid, Thiol, geschütztem Thiol, Carbonsäure, geschützter Carbonsäure, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleimid, Vinylsulfon, Dithiopyridin, Vinylpyridin, Iodacetamid, Epoxid, Glyoxalen, Dionen, Mesylaten, Tosylaten, Thiosulfonat und Tresylat.
Polymer gemäß Anspruch 19, wobei für q = 2 steht, Y unabhängig ausgewählt ist aus Hydroxyl, geschütztem Hydroxyl, aktivem Ester, aktivem Carbonat, Acetal, Aldehyd, Aldehydhydraten, Alkenyl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, aktivem Sulfon, Amin, geschütztem Amin, Hydrazid, geschütztem Hydrazid, Thiol, geschütztem Thiol, Carbonsäure, geschützter Carbonsäure, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleimid, Vinylsulfon, Dithiopyridin, Vinylpyridin, Iodacetamid, Epoxid, Glyoxalen, Dionen, Mesylaten, Tosylaten, Thiosulfonat und Tresylat.
Polymer gemäß Anspruch 19, wobei Y ausgewählt ist aus -(CH₂)_rCO₂H, -(CH₂)_r'CO₂NS, -(CH₂)_r'CO₂Bt, -(CH₂)_rCH(OR)₂, -(CH₂)_rCHO, -(CH₂)₂-NH₂, -(CH₂)_rM, -(CH₂)_r-S-SO₂-R, wobei r für 1-5 steht, r' für 0-5 steht, R für Aryl oder Alkyl steht, NS für N-Succinimidyl steht, Bt für 1-Benzotriazolyl steht und M für N-Maleimidyl steht.
Polymer gemäß Anspruch 19, wobei X eine Amid- oder Carbamat-Verknüpfung ist.
Polymer gemäß Anspruch 19, wobei das Poly(ethylenglycol) etwa 200 bis 2000 Wiederholungseinheiten aufweist.
Polymer mit der Zusammensetzung R-(OCH₂CH₂)_n-X-(CH₂CH₂O)_m-Y, wobei: R ausgewählt ist aus einem Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und einer funktionellen Einheit mit einem endständigen elektrophilen oder nukleophilen Rest, n größer als 200 ist, m zwischen 1 und etwa 120 ist, X eine Verknüpfungseinheit ist, und Y eine Einheit mit einem endständigen elektrophilen oder nukleophilen Rest ist, welcher mit R identisch oder davon verschieden sein kann.
Verfahren zur Bildung eines wasserlöslichen, nicht-peptidischen Polymers mit mindestens einem funktionellen Rest, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen eines ersten wasserlöslichen, nicht-peptidischen Polymers, zusammengesetzt aus mindestens etwa 200 Wiederholungseinheiten und mit mindestens einem ersten funktionellen Rest, Bereitstellen eines zweiten wasserlöslichen, nicht-peptidischen Polymers, zusammengesetzt aus 1 bis etwa 120 Wiederholungseinheiten und mit mindestens einem zweiten funktionellen Rest, wobei der zweite funktionelle Rest mit dem ersten funktionellen Rest des Polymers mit hohem Gewicht reaktiv ist, wobei mindestens eines der ersten und zweiten Polymere ferner einen funktionellen Rest umfasst, der weder mit den ersten noch den zweiten funktionellen Resten reaktiv ist, und wobei die ersten und zweiten Polymersegmente unabhängig ausgewählt sind aus Poly(alkylenglycol), Poly(olefinalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(hydroxyalkylmethacrylamid), Poly(hydroxyalkylmethacrylat), Poly(sacchariden), Poly(α-hydroxysäure), Poly(vinylalkohol), Polyphosphazen, Polyoxazolin, Poly(N-acryloylmorpholin) und Copolymeren, Terpolymeren und Gemischen davon, und Umsetzen der ersten und zweiten funktionellen Reste, wobei die ersten und zweiten Polymere kovalent gebunden werden, um ein wasserlösliches, nicht-peptidisches Polymer mit mindestens einem funktionellen Rest bereitzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die ersten und zweiten funktionellen Reste ausgewählt sind aus N-Succinimidylcarbonat, Amin, Hydrazid, Succinimidylpropionat und Succinimidylbutanoat, Succinimidylsuccinat, Succinimidylester, Benzotriazolcarbonat, Glycidylether, Oxycarbonylimidazol, p-Nitrophenylcarbonat, Aldehyd, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Acrylol und Vinylsulfon.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei der funktionelle Rest, der nicht mit den ersten und zweiten funktionellen Resten reaktiv ist ausgewählt ist aus Hydroxyl, geschütztem Hydroxyl, aktivem Ester, aktivem Carbonat, Acetal, Aldehyd, Aldehydhydraten, Alkenyl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, aktivem Sulfon, Amin, geschütztem Amin, Hydrazid, geschütztem Hydrazid, Thiol, geschütztem Thiol, Carbonsäure, geschützter Carbonsäure, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleimid, Vinylsulfon, Dithiopyridin, Vinylpyridin, Iodacetamid, Epoxid, Glyoxalen, Dionen, Mesylaten, Tosylaten, Thiosulfonat und Tresylat.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die ersten und zweiten funktionellen Reste in Gegenwart eines Lösungsmittels umgesetzt werden, ausgewählt aus Toluol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Benzol, Xylon und Kombinationen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die Polymere jeweils Poly(ethylenglycol) sind, ausgewählt aus monofunktionellen und bifunktionellen linearen, verzweigten, mehrarmigen und gegabelten Formen.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das erste Polymer ein lineares Methoxypoly(ethylenglycol) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 26, ferner umfassend den Schritt des Konjugieren des funktionellen Rests, der gegenüber den ersten und zweiten funktionellen Resten nicht reaktiv ist, mit einem biologischen Wirkstoff.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei der biologische Wirkstoff ausgewählt ist aus einem Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Oligonukleotid, einer DNS, RNS und einem Lipid.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das erste Polymer einen geschützten reaktiven Rest umfasst, und welches ferner den Schritt des Entfernens der Schutzgruppe von den kovalent gebundenen Polymeren mit niedrigem und hohem Gewicht, um eine zusätzliche Funktionalität herzustellen, umfasst.
Polymerderivat gemäß Anspruch 1, wobei das zweite Polymersegment ein Molekulargewicht von mindestens 100 Dalton aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das zweite Polymer ein Molekulargewicht von mindestens 100 Dalton aufweist.