DE60318942T2

DE60318942T2 - Schutzreagenzien enthaltend aktive kohlenhydrate für chemische modifizierungen, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60318942T2
Application number: DE60318942T
Authority: DE
Inventors: Ralf KRÄHMER; Angela Ferse; Frank Leenders
Original assignee: Medical Enzymes AG
Current assignee: Medical Enzymes AG
Priority date: 2002-05-08
Filing date: 2003-05-07
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2023-05-08
Also published as: WO2003095496A1; JP2005538947A; AU2003227731A1; EP1507804B1; CA2485125A1; DE60318942D1; US20060127899A1; ATE385239T1; JP4555678B2; EP1507804A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft aktive Kohlenhydrat-enthaltende Schutzreagenzien, die dargestellt werden durch eine Kohlenhydrat-Zentraleinheit, die gebunden ist an eine Polymerkette an mindestens einer der Hydroxylgruppen und an eine aktive Verbindungsgruppe an der anomeren Position der Kohlenhydratzentraleinheit. Diese neuen Verbindungen sind aktive Kohlenhydrat-enthaltende Schutzreagenzien, Glycodendrimere und verwandte hydrophile Oligomere. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von biologisch aktiven Molekülen, die durch diese Reagenzien modifiziert werden, vorzugsweise zur biotechnologischen Anwendung.
Das neue Biotechnologiezeitalter präsentiert sich mit mehr und mehr biologisch aktiven Makromolekülen, isoliert aus bzw. produziert von verschiedenen Organismen. Darüber hinaus drängen die Pharmazeutika auf Proteinbasis zunehmend in den Arzneimittelmarkt. Viele biotechnologisch hergestellte Pharmazeutika leiden unter den Nachteilen relativ kurzer Halbwertszeit in vivo (Clearance und Immun-vermittelte Inaktivierung) und starke Immunogenität.
Eine Möglichkeit, um die oben beschriebenen Nachteile zu umgehen, ist die chemische Modifikation über die kovalente Bindung von hydrophilen Polymeren an bioaktive Moleküle oder Arzneimittelträger. Es wird ebenfalls beobachtet, dass die Modifikation von Kleinmolekülarzneimitteln mit solchen Polymeren zu einer geringeren Toxizität führt und andere vorteilhafte Wirkungen auf pharmazeutische Eigenschaften des Kleinmolekülsarzneimittels zeigt.
Das häufigste hydrophile Polymer ist Polyethylenglykol, das einfach als „PEG" bezeichnet wird. Ein Grund für seine häufige Anwendung ist die geringe Toxizität des Polymers PEG, was bedeutet, dass es biokompatibel ist. Als ein Beispiel für biotechnologische Anwendung wird das kommerziell verfügbare, aktivierte Polymer PEG an Proteine und Enzyme gebunden. Solche Konjugate haben in vivo eine dramatische Erhöhung der Halbwertszeit, verringerte Toxizität und eine verringerte Rate der Nieren-Clearance gezeigt. Darüber hinaus haben die Konjugate eine erhöhte Solubilität in wässrigen Systemen gezeigt. Eine gute Übersicht über solche Anwendungen wird von N. K. Jain et al., Pharmazie 2002, 57, 5–29 „Pegnology: a review of PEG-ylated systems", gegeben.
Im Falle von Kleinmolekülarzneimitteln ist gezeigt worden, dass Konjugate, die das Chemotherapeutikum Doxorubicin enthalten, eine wesentlich verringerte Toxizität im Vergleich mit unmodifiziertem Doxorubicin zeigen (F. Kratz et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2517–2524).
Heutzutage gibt es viele Verfahren zum kovalenten Modifizieren von Proteinen mit biokompatiblen Polymeren wie PEG oder anderen hydrophilen Polymeren. Die Modifikation von Proteinen hat das Ziel der Verlängerung der Kreislaufzeit bzw. der Vermeidung von Immunogenität oder Toxizität (Zalipsky, S. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157–182).
Wenngleich diese Technologie weit entwickelt ist, bleiben einige wesentliche Nachteile bestehen: Die Modifikation von Biopharmazeutika mit PEG führt in vielen Fällen zu einer dramatischen Abnahme ihrer biologischen Aktivität. Darüber hinaus sind Polymere wie PEG durch einen breiten Bereich verschiedener Molekulargewichte gekennzeichnet (polydispers), was Probleme mit der Reproduzierbarkeit der Herstellung und/oder Modifikation ergibt. In Abhängigkeit von der Qualität des mPEG (MonomethoxyPEG) und dem Aktivierungstyp treten in einigen Fällen ungewünschte Quervernetzungsreaktionen auf.
Zusammengefasst besteht ein großer Bedarf für neue hydrophile Oligomere oder Polymere, die verwendet werden können zur Modifikation von biotechnologischen Produkten (z. B. Proteine, Oberflächen) oder kleinen Arzneimittelmolekülen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Überwindung dieser Nachteile. Das Merkmal, auf welchem die Erfindung basiert, ist die Erzeugung solcher hydrophiler Substanzen, die verwendet werden können zur Modifikation von biotechnologischen Produkten und Kleinmolekülarzneimitteln. Im Hinblick auf den oben beschriebenen Stand der Technik hat die vorliegende Erfindung das Ziel der Bereitstellung von Polymeren mit aktivierten Linkergruppen bzw. Verbindungsgruppen, die mit Amino-funktionalen Gruppen von Proteinen oder Peptiden und anderen funktionalen Gruppen von biotechnologischen Produkten in wässriger Lösung und unter milden Bedingungen reagieren.
Die vorliegende Erfindung liefert aktive Kohlenhydrat-enthaltende Schutzreagenzien, dargestellt durch eine Kohlenhydratzentraleinheit, die gebunden ist an eine Polymerkette an mindestens einer ihrer Hydroxylgruppen und an eine aktivierte Verbindungsgruppe an der anomeren Position (Position 1) der Kohlenhydrat-Zentraleinheit, ein Prozess (Verfahren) zur Synthese dieser Klasse von Verbindungen und ihre Verwendung zum kovalenten Koppeln an funktionale Gruppen biotechnologischer Produkte und Kleinmolekülarzneimittel, wie unten beschrieben. Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung haben eine einzelne aktivierte funktionale Gruppe (z. B. aktiver Ester), die keine Quervernetzungsreaktionen unterstützen wird.
Diese neuen aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Verbindungen sind hydrophile, biokompatible Verbindungen. Sie sind leicht herzustellen und die Eigenschaften ermöglichen einen breiten Anwendungsbereich. Konjugate dieser aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Verbindungen mit biologisch aktiven Substanzen sind geeignet für ausgedehnte Therapien. Darüber hinaus sind die neuen Kohlenhydrat-enthaltenden Verbindungen auch geeignet zu ihrer Verwendung als medizinisches Material, nämlich zur Verabreichung therapeutischer Mengen von Konjugaten biologisch aktiver Verbindungen, die das neue Maskierungsmittel enthalten, z. B. zur Behandlung von viralen oder bakteriellen Infektionen oder zur Krebsbehandlung.
Gemäß der Erfindung werden auch Konjugate der aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzmittel mit biologisch aktiven Verbindungen, wie etwa Proteinen (z. B. humane Wachstumsfaktoren), Enzymen, Liposomen, Antikörpern, Arzneimitteln, Phospholipiden, Lipiden, Nukleosiden, Oligonukleotiden, Mikroorganismen, humanen Zellen und Oberflächen bereitgestellt.
Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzmittel werden durch die allgemeine Formel I
dargestellt, worin eine Glykosid-Zentraleinheit G gebunden ist an eine Polymerkette an mindestens einer der Hydroxylgruppen und an eine aktivierte Verbindungsgruppe an einer anomeren Position (1-Position), die in der Lage ist, leicht mit anderen funktionalen Gruppen zu reagieren und worin
G eine Glykosid-Zentraleinheit ist, die ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid oder Polysaccharid ist, bestehend aus Monosaccharideinheiten, einem Aminozucker oder einem Polyol, R-poly- eine Polymerkette mit einer oder mehreren Wiederholungsmonomereinheiten oder
eine Wiederholungsbaueinheit II ist, die gebunden ist über die Bindungsgruppe an eine weitere Glykosideinheit G
worin P eine Aminoschutzgruppe oder die nächste Wiederholungsbaueinheit oder eine terminale Einheit I ist;
worin
R H, OH ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, O-Alkyl (1 bis 20 C-Atome), Benzyl, Aryl, Acetal, Aldehyd, Alkenyl, Acrylat, Acrylamid, aktives Sulfon, Alkylamin, geschütztes Alkylamin oder Amin, Thiol und geschütztes Thiol, oder ebenfalls ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Monosaccharid, einem Oligo- und Polysaccharid, bestehend aus Monosaccharideinheiten, einem Aminokohlenhydrat oder einem Polyol, und
worin poly ausgewählt ist aus einem Polyalkylenoxid, einem polyoxyethylierten Polyol, einem polyolefinischen Alkohol und einem Polyacrylomorpholin,
X Ausgewählt ist aus -O-, -S-, -NH-, -NHCO-, -CONH-, -NHCO₂-, O₂CNH-, -CSNH- und -NHCS-;
m 1 bis 10 ist, bevorzugt 1 bis 6,
Y ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus (O-Alkyl)₂, -OSO₂CH₂CF₃ (Tresyl), -CO-Q, Maleimid, -O-CO-Nitrophenyl oder -Trichlorphenyl,
-S-Alkyl(C₁ bis C₆), -S-S-Alkyl, -S-Aryl, -S-S-Aryl, -S-Benzyl,
-S-Alkyl(C₁ bis C₆)-OH, -S-Alkyl(C₁ bis C₆)-NH₂,
-S-Alkyl(C₁ bis C₆)-OSO₂CH₂CF₃ und
-S-Alkyl(C₁ bis C₆)-CO₂-Q-,
-SO-Alkenyl, -Halogen(Cl, Br, I),
worin
Q H oder OH ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O-Aryl, O-Benzyl, O-N-Succinimid, O-N-Sulfosuccinimid, O-N-Phthalimid, O-N-Glutarimid, O-N-Tetrahydrophthalimid, -N-Norbornen-2,3-dicarboximid, Hydroxybenzotriazol und Hydroxy-7-azabenzotriazol
und
Z ausgewählt ist aus -O-, -S- oder -NH-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl)-, -N(Aryl)-, -N(Benzyl)-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl-OH)-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl-NH₂)- und -N(Alkenyl)-.
Die Glykosidzentraleinheit ist in der L- oder D-Konfiguration dargestellt und die Konfiguration an der anomeren Position (1-Position) der Glykosidzentraleinheit ist alpha, beta oder ein Gemisch aus beiden.
Gemäß der Erfindung sind die bevorzugten Glykosideinheiten Monosaccharide, wie Aldosen, bevorzugt Glucose; Ketosen, bevorzugt Fructose; Pyranosen, bevorzugt Mannose, Glucose; Furanosen, bevorzugt Ribose und Arabinose. Beispiele spezifischer Oligo- und Polysaccharide, die aus Monosaccharideinheiten bestehen, sind Lactose und Melibiose. Typische Monosaccharide sind ebenfalls Aminozucker, bevorzugt Mannoseamin, Glucoseamin und Lactoseamin.
Bevorzugte Acetalgruppen für R umfassen (CH₃O)₂- und (CH₃-CH₂O)₂-, eine Aldehydgruppe ist OHC-CH₂-O-, eine Alkenylgruppe ist CH₂=CH-CH₂O-, eine Acrylatgruppe ist CH₂=CH-CO₂-, eine Methacrylatgruppe ist CH₂=C(CH₃)-CO₂-, eine Acrylamidgruppe umfasst CH₂=CH-CONH-, eine Aminoalkylgruppe ist H₂N-CH₂-CH₂-, eine geschützte Aminoalkylgruppe umfasst W-NH-CH₂-CH₂-, worin W eine Aminoschutzgruppe, wie Boc, Fmoc und Cbz ist, eine Thioalkylgruppe ist HS-CH₂-CH₂- und eine geschützte Thioalkylgruppe umfasst V-S-CH₂-CH₂-, worin V eine Thiolschutzgruppe ist.
Der Ausdruck „Poly", der hier verwendet wird, betrifft ein Polyalkylenoxid, wie Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole, ein polyoxyalkyliertes Polyol, wie Monomethoxypolyethylenglykole (mPEG) oder oxyethyliertes Triethanolamin, TEA(OE), einen Polyolefinalkohol, wie Polyvinylalkohol.
Polymere, worin die Polymerkette an einer Seite durch eine Methoxygruppe terminiert ist, sind bevorzugt.
Darüber hinaus sind Polymere bevorzugt, worin die Polymerkette ein Polyethylenglykol ist, das durch die allgemeine Struktur: R-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-X- dargestellt wird, worin
R und X wie oben definiert sind und n 0 bis 2000 ist, oder
worin R auch eine sich wiederholende Baueinheit ist, die eine der folgenden Strukturen III oder IV aufweist:
worin n, m, R, X und Z wie oben definiert sind, Alkyl 1 bis 20 C-Atome bedeutet und U ausgewählt ist aus -O-, -S- und -NH-, während in dem erfindungsgemäßen Schutzreagenz die Glycodendrimer-Wiederholungsbaueinheit üblicherweise 4- bis 1000-mal enthalten ist.
Darüber hinaus kann die Polymerkette eine unsubstituierte Kette sein, ausgenommen den Terminus, oder kann auch ein statistisches oder Blockcopolymer oder ein Terpolymer sein.
Besonders bevorzugt sind aktive Schutzreagenzien mit Glucose als die Glycosid-Zentraleinheit, die die folgende Struktur V aufweisen:
worin m, poly, Q, R, X und Z wie oben definiert sind.
Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien (I) der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise hergestellt werden durch eine Alkylierung (Williamson Ethersynthese) oder andere nukleophile Substitutionsreaktionen (z. B. Urethanbildung) zwischen einem Glykosid, das eine Pentenylgruppe an der anomeren Position enthält, und einem Polymer. Die Reaktion wird in Lösung durchgeführt. Die Pentenylgruppe des resultierenden Synthesezwischenproduktes wird in aktive Kohlenhydrat-enthaltende Schutzreagenzien wie in Syntheseschema 1 gezeigt, übergeführt (Fraser-Reid, B.; Journal of the Organic Chemistry 2000, Band 65, S. 958–963).
Die bevorzugten Polymere, die zur Herstellung der aktiven Schutzreagenzien verwendet werden, sind Polyethylenglykole, die kovalent an 4-Penten-1-yl-glycoside gebunden sind.
Die Pentenylgruppe ist eine multifunktionale Gruppe, die in viele verschiedene aktivierte Linker übergeführt werden kann. Diese Polymer-enthaltenden Pentenylglykoside werden ebenfalls als Baueinheiten verwendet, um größere, verzweigte Aggregate (Glycodendrimere oder Teile von diesen) zu bilden. Die verzweigten, aktives Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien reagieren leicht mit Amino-funktionalen Gruppen von Proteinen und Peptiden in wässriger Lösung unter milden Reaktionsbedingungen. Die dendritische Verbindung wird an das Polypeptidgrundgerüst gekoppelt durch Bilden eines Amids, Urethans, Thiourethans, Carbamaten, Ether, Thioether, eines sekundären Amins (reduktive Aminierung, Reaktion mit einer tresylierten oder halogenierten Verbindungseinheit).
Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien gemäß dieser Erfindung müssen kein spezielles Molekulargewicht aufweisen. Ein bevorzugtes Präparat des aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenz hat ein Molekulargewicht zwischen 500 und 60.000, mehr bevorzugt zwischen 800 und 20.000.
Der Vorzug der aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung beruht vorrangig auf der Tatsache, dass Reagenzien mit kleiner Größe monodisperse Verbindungen sind, was ein Vorteil bei der Herstellung von homogenen Schutzreagenzien, Analyse von Konjugaten mit diesen Reagenzien, bei der Reinigung dieser Konjugate und bei der Definition einer Spezifikation hinsichtlich regulatorischer Ziele ist.
Die „regenschirmartig" strukturierten aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Reagenzien, die in dieser Erfindung bereitgestellt werden, haben Schutzeigenschaften bewiesen über die erhöhte Stabilität gegenüber Proteolyse der konjugierten biologisch aktiven Verbindung. Die biologische Aktivität solcher Konjugate wird aufrechterhalten und während der Modifikationsreaktion bzw. Modifikationsreaktion tritt kein Quervernetzen auf. Im Gegensatz hierzu sind ungewünschte Quervernetzungsreaktionen Hauptprobleme wenn herkömmliche aktivierte mPEGs zur Modifikation verwendet werden, da kommerziell erhältliche mPEGs relevante Mengen an Dihydroxypolyethylenglykol enthalten, das aktiviert wird während des Herstellungsverfahrens für mPEGs und dann als ein Quervernetzer wirkt.
Im Hinblick auf die Erfindung sind solche verzweigte Reagenzien wirkungsvoller beim Schutz von Proteinen vor Proteolyse und beim Verringern der Immunogenität.
Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien werden bei der Herstellung von wasserlöslichen und isolierbaren Konjugaten mit mindestens einem biologisch aktiven Molekül, einer Oberfläche oder einer Gesamtzelle verwendet. Das biologisch aktive Molekül wird vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen von Proteinen, Glykoproteinen, Peptiden (z. B. humane Wachstumsfaktoren), Enzymen, Liposomen, Antikörpern, Arzneimitteln, Phospholipiden, Lipiden, Nukleosiden, Oligonukleosiden, Mikroorganismen, humanen Zellen, Farbstoffen und Oberflächen.
In einer bevorzugten Art haben die wasserlöslichen und isolierbaren Konjugate die Strukturen VI oder VII:
worin m, Poly, R, X und Z wie oben definiert sind und die Einheit NH-PEP eine modifizierte Aminofunktion (z. B. eine Lysingruppe) eines biologisch aktiven Moleküls darstellt.
Im Hinblick auf die vorliegende Erfindung werden Konjugate mit den aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien verwendet zum Schützen von biologisch aktiven Verbindungen, zum Erhöhen des Molekulargewichtes dieser biologisch aktiven Verbindungen, wobei Nieren-Clearance verringert wird, um die Bildung von Antikörpern bzw. Antigen-prozessierenden Zellen zu verhindern, und zum Minimieren des proteolytischen Abbaus. Darüber hinaus wird eine solche chemische Modifikation verwendet zum Verbessern der biophysikalischen Eigenschaften hinsichtlich der Solubilität von Arzneimitteln. Die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien werden verwendet zum Erhöhen der Solubilität von hydrophoben aktiven pharmazeutischen Bestandteilen (APIs). Diese speziellen Arten pharmazeutischer Formulierungen vereinfachen die Verabreichung von hydrophoben Arzneimitteln.
Darüber hinaus sind die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien ebenfalls gekennzeichnet durch eine gute Solubilität in organischen Lösungsmitteln, wobei die Modifikation von Bio-Katalysatoren (z. B. Enzymen) mit den neuen Schutzreagenzien die Löslichkeit der modifizierten Bio-Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln erhöht, was eine interessante Anwendung für die technische Verwendung ist.
Darüber hinaus werden die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet zum Modifizieren von Arzneimittelzuführungs- und Target-Systemen (z. B. Liposomen und Antikörper), was einen neuen Anwendungsbereich für diese Technologien eröffnet.
Darüber hinaus sind die aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien in der Lage zum Binden eines biologisch aktiven Moleküls an andere biologisch aktive Moleküle, die gleich oder verschieden sein können, oder zur Bindung eines biologisch aktiven Moleküls an eine Oberfläche.
In einer bevorzugten Art sind die erfindungsgemäßen Reagenzien geeignet für die chemische Modifikation von Enzymen, wie etwa Asparaginase, Glutaminase-Asparaginase (PGA), Glucocerebrosidase, von Cytokinen, wie etwa alpha-Interferon, beta-Interferon 1-b, G-CSF oder von anderen therapeutisch geeigneten Proteinen, wie etwa TNF, humanes Insulin, Antikörpern oder Antikörperfragmenten und Kleinmolekülarzneimitteln, wie etwa Doxorubicin und Paclitaxel.
Die neuen Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien sind besonders geeignet für die chemische Modifikation von pharmazeutisch aktiven Bestandteilen. Die pharmazeutische Zweckmäßigkeit ist gekennzeichnet durch eine signifikante Erhöhung von Proteasestabilität (zum Beispiel) von Konjugaten. Daher wird die Modifikation mit den neuen Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien die Kreislaufzeit in vivo ausdehnen, was für die pharmazeutische Anwendung von vielen biotechnologischen Produkten erforderlich ist.
Die folgenden Beispiele werden angegeben zur Beschreibung der Erfindung, sollen jedoch nicht die Erfindung begrenzen:
Beispiel 1
Synthesen
Beispielhafte Strukturen
In den unten gezeigten Schemata VIII und IX sind die Polyethylenglykolketten kovalent über eine Etherbindung an die Kohlenhydrat-Zentraleinheit gebunden.
n ist definiert als von 0 bis 1000.
In den unten gezeigten Schemata X und XI sind die Polyethylenglykolketten kovalent über eine Carbamatbindung an die Kohlenhydrat-Zentraleinheit gebunden.
wobei n als von 0 bis 1000 definiert ist.

Beispiel 1a Synthese von Verbindung 6
Zu einer Lösung von 1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-β-D-glucopyranose (5 g) in Dichlormethan (20 ml) und 4-Penten-1-ol (2,7 ml) wird BF₃·Et₂O (3,2 ml) bei 20–30°C gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 4 Stunden bei 20–25°C gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, gefolgt von der Zugabe einer NaOH-Lösung (0,5 M, 70 ml), sodass der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf etwa 6 eingestellt wird. Die organische Schicht wird abgetrennt und mit einer Bicarbonatlösung (5%, 50 ml) gewaschen. Verdampfen des organischen Lösungsmittels ergab das rohe glykosylierte Produkt (6 g) als ein gelbes Öl.
Natrium (320 mg), gelöst in Methanol (4 ml) wird zu einer Lösung des rohen Materials (6 g) in Methanol (26 ml) bei 20–25°C gegeben. Kurz nach der Zugabe des Natriummethylats wird ein weißes Präzipitat gebildet. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei 20–25°C gerührt. Anschließend wird die Reaktion gequencht durch die Zugabe von Chlorwasserstoffsäure (1 M) bis der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 5–6 eingestellt ist. Verdampfen des Lösungsmittels und Reinigung des rohen Materials ergab 2 (1,8 g) als ein farbloses Öl. ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 1,50-1,6 (m, 2H, CH₂-Pentenyl), 2,05-2,10 (m, CH₂-Pentenyl), 3,20-4,00 (m), 4,10-4,6 (m), 4,70-5,10 (m, anomeres-H, CH₂=), 5,60-5,75 (m, 1H, =CH-). ¹³C-NMR (62,9 MHz, CDCl₃): δ = 28,52, 29,94, 61,20, 67,73, 69,54, 71,53, 71,96, 74,16, 102,84 (C-1), 115,04, 137,95.
Zu 2 (2,2 g), gelöst in THF (50 ml), wird Natriumhydrid (1,5 g, 60% in Öl) bei 20–25°C gegeben. Die gebildete Suspension wird auf 40°C erwärmt und bei dieser Temperatur für 30 min. gerührt. Nach Kühlen auf 20–25°C wird das Monomethoxytriethylenglycol-p-toluolsulfonat (13,3 g), das zuvor aus dem entsprechenden Alkohol hergestellt worden ist, zugegeben. Das Rühren wird für 24 h bei 20–25°C fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch Zugeben von MeOH/Wasser (5,0 ml) gequencht. Extraktion mit Ethylacetat und Dichlormethan, Verdampfen des organischen Lösungsmittels und abschließende Reinigung durch Blitzchromatographie ergab 3 als farbloses Öl (1,66 g, 85% Ausbeute).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 1,50-1,6 (m), 1,95-2,05 (m), 3,10-4,20 (m, enthält alle OCH₃, β-anomeres-H), 4,80-5,00 (m, CH₂=), 5,60-5,68 (m, 1H, =CH).
¹³C-NMR (62,9 MHz, CDCl₃): δ = 29,10, 30,34, 59,18, 67,62, 68,00-74,00 (überlappende Signale), 78,28, 82,30, 83,00, 85,14, 103,39 (β-C-1), 115,02, 138,30.
ESI-MS m/z: 833,5 [M+H]⁺, 855,5 [M+Na]⁺ (positiv + ESI-Modus, Finnigan AQA)
Zu einer Lösung von NaIO₄ (1,91 g) und RuCl₃·H₂= (17,8 mg) in einem Gemisch aus Dichlormethan/Acetonitril/Wasser (2:2:3, 40 ml) wird 3 (1,8 g) bei 20–25°C zugegeben. Unter Rühren werden 200 μl Eisessig zugegeben. Nach Rühren des Reaktionsgemisches für 2 h wird eine zweite Menge NaIO₄ (1,9 g) zugegeben. Weiteres Rühren für 2 h bei 20–25°C führt die Reaktion zum Abschluss. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und Extraktion mit Dichlormethan (50 ml) ergab das rohe Produkt. Reinigung mit Blitzchromatographie ergab 4 als ein leicht gelbes Öl (1,82 g, 97% Ausbeute). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 1,75-1,90 (m, CH₂), 2,35-2,45 (m, CH₂), 3,10-4,00 (m, enthält alle OCH₃, OCH₂, OCH), 4,15 (d, 1-Hβ, J = 8 Hz).
¹³C-NMR (62,9 MHz, CDCl₃): δ = 24,67, 30,25, 52,68, 58,75-78,61 (überlappende Signale), 82,45, 84,80, 102,73 (beta C-1), 175,95.
Zu einer Lösung von 4 (1,8 g) in Dichlormethan (10 ml) wird DCC (686 mg) und NHS (308 mg) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 15 h bei 20–25°C gerührt. Anschließend wird der präzipitierte Harnstoff abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Reinigung durch Blitzchromatographie ergab den aktiven Ester 6 als leicht gelbes viskoses Öl (1,033 g, 51% Ausbeute). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 1,75-1,90 (m, CH₂), 2,50-2,65 (m, CH₂), 2,70 (s, 2 × CH₂), 3,15-4,00 (m, enthält OCH₃, OCH₂, OCH), 4,15 (d, 1-Hβ, J = 8 Hz). ¹³C-NMR (62,9 MHz, CDCl₃): δ = 24,67, 25,28 (2 × CH₂, NHS), 27,48, 58,67, 66,00-72,20 (überlappende Signale), 74,57, 77,75, 82,34, 84,69, 102,88 (C-1), 168,20, 168,82. ESI-MS m/z: 948 [M+H]⁺, 970 [M+Na]⁺ (positiv + ESI Modus, Finnigan AQA).
Beispiel 1b:
Synthese von Verbindung 7 mit R₁ = -CO₂-Ph
2 (2,0 g, synthetisieert wie in Beispiel 1a beschrieben) wird in einem Gemisch aus THF (25 ml), DBU (1 ml) und Pyridin (7 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird auf 0°C gekühlt. Unter Rühren wird Phenylchlorformiat (4,3 ml) tropfenweise über eine Dauer von 30 min (exotherme Reaktion) zugegeben. Danach wird die Reaktionsmischung für 24 h bei 20–25°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt, gefolgt von der Zugabe von Natriumbicarbonatlösung (5%, 35 ml). Phasentrennung, Lösungsmittelverdampfen und Reinigung durch Blitzchromatographie ergab 7 (6,1 g, das Produkt enthält was Phenol) als viskosen Schaum. ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ = 1,65-1,80 (m, CH₂), 2,00-2,20 (m, CH₂), 3,45-3,55 (m), 3,90-4,10 (m), 4,45-4,55 (m), 4,6-4,70 (m), 4,85-5,45 (m), 5,60-5,75 (m, =CH-), 7,00-7,50 (m, Phenylprotonen, 20H). ¹³C-NMR (62,9 MHz, CDCl₃): δ = 28,58, 29,82 (2 × CH₂), 65,86, 69,58, 71,02, 73,03, 75,62, 77,23, 100,39 (beta C-1), 115,19 (CH₂=), 120,82, 120,95, 121,01, 126,12, 126,22, 126,30, 129,42, 137,63 (=CH-), 150,85, 150,93, 150,97, 152,52, 152,77, 153,19, 153,51.
Beispiel 2
Modifikation von biologisch aktiven Verbindungen
Die folgenden Beispiele werden angegeben zum Beschreiben der Zweckmäßigkeit der vorliegenden Erfindung, sollen die Erfindung jedoch nicht begrenzen:
Allgemeine Verfahren: Die Proteinkonzentration wird durch das Lowry-Verfahren (Lowry et al., 1951) bestimmt. Die Elektrophorese-Versuche (SDS- Page) werden wie von Laemmli (1970) beschrieben unter Verwendung von 12,5% Polyacrylamidgelen durchgeführt, unter Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250. Die Enzyme L-Asparaginase, z. B. aus Escherichia coli und Pseudomonas 7A Glutaminaseasparaginase (PGA) sind Amidohydrolasen, die die Desamidierung der Aminosäuren L-Asparagin bzw. L-Glutamin katalysieren. Während der Reaktion wird Ammoniak freigesetzt, der unter Verwendung des Nessler Reagenz bestimmt werden kann, wie von Roberts, J. (1976) beschrieben. Der Arbeits-pH-Wert für L-Asparaginase ist 8,6 und für PGA 7,2.
Referenzproteine: Eine mit Polyethylenglykol modifizierte L-Asparaginase (PEG-Asparaginase) wurde von Sigma bezogen. Eine Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase, modifiziert mit Polyethylenglykol (PEG-PGA), wurde von der Medical Enzymes AG bereitgestellt. Jede PEG-Kette, die zum Modifizieren dieser Enzyme verwendet wurde, hat ein Molekulargewicht von 5.000 g/Mol.
Beispiel 2a
Herstellung von modifizierter L-Asparaginase (kurz „ASNase"):
Die unten beschriebenen Reaktionen wurden in Eppendorf-Teströhrchen durchgeführt. Zu einer Lösung von L-Asparaginase (ProThera GmbH, 10,4 mg/ml) in Bicarbonatpuffer (0,05 M, pH-Wert 8,5–9) wurde Verbindung 6 (14,4 μl, 0,8 Äq.), gelöst in DMSO (200 mg/ml), zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 20–25°C für 30 min leicht gerührt. Das nichtumgesetzte und hydrolysierte Schutzreagenz (6) wird durch Diafiltration unter Verwendung von Wasser entfernt. Das Ausmaß der Modifikation von L-Asparaginase ist 26% gemäß Bestimmung durch Matrix Assited Laser Desorption Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS; Matrix: Sinapinsäure). Alternativ kann das Ausmaß der Modifikation bestimmt werden durch Trinitrobenzolsulfonattitration der Amino-funktionellen Gruppen, wie von Habeeb (Anal. Biochem. 1966, 14, 328–336) beschrieben.
In einem zweiten Versuch wird L-Asparaginase modifiziert unter Verwendung eines größeren Überschusses des Schutzreagenz 6 (32,3 μl, 1,8 Äq.). Die Reaktion und die Reinigung werden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Modifikation ergab gemäß Bestimmung durch MALDI-MS ein Modifikationsausmaß von 35%.
Jede der modifizierten L-Asparaginase-Proben behielt 95% der enzymatischen Aktivität im Vergleich mit der unmodifizierten L-Asparaginase bei.
1 zeigt die Analyse verschiedener L-Asparaginase-Präparate gemäß SDS-PAGE.
Beispiel 2b
Herstellung von modifizierter Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase (PGA):
Diese Modifikationsreaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen und mit den gleichen Materialien wie für L-Asparaginase (Beispiel 2a) beschrieben, durchgeführt. Die Modifikationsreaktion von PGA unter Verwendung von 0,8 Äq. des Schutzreagenz 6 führte zu einem Modifikationsausmaß von 32% gemäß Bestimmung durch MALDI-MS. Im Falle von modifizierter PGA werden 90% der enzymatischen Aktivität im Vergleich mit der unmodifizierten PGA beibehalten.
Das zweite Präparat wird unter Verwendung von 1,8 Äq. 6 durchgeführt, was ein Modifikationsausmaß von 41% gemäß Bestimmung durch MALDI-MS ergab. Die enzymatische Aktivität von modifizierter PGA wurde auf 85% der Aktivität ohne eine solche Modifikation verringert.
2 zeigt die Analyse von verschiedenen PGA-Präparaten durch SDS-PAGE..
Beispiel 3
In vitro-Assay zum Beweis der Zweckmäßigkeit der vorliegenden Erfindung
Als ein Maß der Zweckmäßigkeit der neuen Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien in pharmazeutischen Anwendungen wurde die Stabilität von modifizierter L-Asparaginase bzw. modifizierter PGA gegenüber der Protease Trypsin im Vergleich mit den unmodifizierten Enzymen untersucht. Modifizierte L-Asparaginase und modifizierte PGA werden wie in Beispiel 2a bzw. Beispiel 2b beschrieben, hergestellt. Zusätzlich wird eine Enzymfraktion, die als „blank" bezeichnet wird, auf dieselbe Art behandelt wie in den Beispielen 2a und 2b beschrieben, jedoch ohne Zugabe von aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien. Die Teströhrchen enthielten 1–2 IU/ml des „blanken", modifizierten bzw. unmodifizierten Enzyms und werden bei 37°C in Tris/Cl-Pufferlösung in der Gegenwart von 0,25 μg/ml Trypsin inkubiert. Die Kontrolle ist nichtmodifiziertes Enzym aus der Mutterenzym-Lösung, inkubiert bei 37°C in Tris/Cl-Pufferlösung in der Abwesenheit von Trypsin. Nach 0, 10, 30, 60 und 90 min wird die Enzymaktivität von einem Aliquot von jedem Teströhrchen und der Kontrolle bestimmt.
Wie in 3 und 4 gezeigt, führt die Inkubation der Enzyme L-Asparaginase bzw. PGA in der Gegenwart von Trypsin zu einem signifikanten Verlust der Enzymaktivität nach 30 bis 90 min. Im Falle von L-Asparaginase kann diese Verringerung der Enzymaktivität vollständig und im Falle von PGA teilweise durch Modifizieren der Enzyme mit aktiven Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenzien, wie gemäß der Erfindung beschrieben, vermieden werden. Letztendlich führt die Modifikation der Enzyme L-Asparaginase und PGA zu einer signifikanten Erhöhung der Stabilität gegenüber einem Abbau durch die Protease Trypsin.
Legende zu den Figuren:
1:
Analyse von verschiedenen L-Asparaginase-Präparaten durch SDS-PAGE. Proteine sind gefärbt mit Coomassie. Modifikationen werden durchgeführt mit L-Asparaginase, die von ProThera bereitgestellt wird. Die Proben sind: Bahn 1) L-Asparaginase (ProThera 2,5 μg), Bahn 2) PEG-L-Asparaginase (Sigma, 5 μg), Bahn 3) rekombinantes Protein-Standard (Amersham Bioscience, RPN 800), Bahn 4) modifizierte L-Asparaginase (0,8 Äq. 6, 2,5 μg) und Bahn 5) modifizierte L-Asparaginase (1,8 Äq. von 6, 2,5 μg).
2:
Analyse von verschiedenen PGA-Präparaten durch SDS-PAGE. Proteine sind gefärbt mit Coomassie. Modifikationen werden mit L-Asparaginase durchgeführt, die von ProThera bereitgestellt wird. Die Proben sind: Bahn 1) PGA Medical Enzymes 2,5 μg, Bahn 2) PEG-PGA Medical Enzymes, 5 μg, Bahn 3) rekombinantes Protein-Standard (Amersham Bioscience, RPN 800), Bahn 4) modifizierte PGA (0,8 Äq. 6, 2,5 μg) und Bahn 5) modifizierte PGA (1,8 Äq. 6, 2,5 μg).
3:
Einfluss der Modifikation von L-Asparaginase mit aktivem Kohlenhydrat-enthaltendem Schutzreagens auf die Stabilität gegenüber Abbau durch Trypsin, gemäß Ableitung aus der verbleibenden Enzymaktivität.
4:
Einfluss der Modifikation von Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase mit aktivem Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagenz auf die Stabilität gegenüber einem Abbau durch Trypsin gemäß Ableitung aus der verbleibenden Enzymaktivität.

Claims

Aktives Kohlenhydrat-enthaltendes Schutzreagens, dargestellt durch eine Kohlenhydrat-Zentraleinheit G, die gebunden ist a. an eine Polymerkette an mindestens einer der Hydroxylgruppen und b. an eine Verbindungseinheit an der Anomerposition (1-Position) und die dargestellt wird durch die allgemeine Formel I
worin G eine Glykosid-Zentraleinheit ist, die ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid oder Polysaccharid ist, bestehend aus Monosaccharideinheiten, einem Aminokohlenhydrat oder einem Polyol, R-poly- eine Polymerkette mit einer oder mehreren Wiederholungsmonomereinheiten oder eine Wiederholungsbaueinheit II ist, die gebunden ist über die Bindungsgruppe an eine weitere Glykosideinheit G
worin P eine Aminoschutzgruppe oder die nächste Wiederholungsbaueinheit oder eine terminale Einheit I ist; worin R H, OH ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, O-Alkyl (Alkyl enthält 1 bis 20 C-Atome), Benzyl, Aryl, Acetal, Aldehyd, Alkenyl, Acrylat, Acrylamid, aktives Sulfon, Alkylamin, geschütztes Alkylamin, Thiol und geschütztes Thiol, oder ebenfalls ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Monosaccharid, einem Oligo- und Polysaccharid, bestehend aus Monosaccharideinheiten, einem Aminokohlenhydrat oder einem Polyol, und worin poly ausgewählt ist aus einem Polyalkylenoxid, einem polyoxyethylierten Polyol, einem polyolefinischen Alkohol und einem Polyacrylomorpholin, X Ausgewählt ist aus -O-, -S-, -NH-, -NHCO-, -CONH-, -NHCO₂-, -O₂CNH-, -CSNH- und -NHCS-; m 1 bis 10 ist, Y ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus (O-Alkyl)₂, -OSO₂CH₂CF₃ (Tresyl), -CO-Q, Maleimid, -O-CO-Nitrophenyl oder -Trichlorphenyl, -S-Alkyl(C₁ bis C₆), -S-S-Alkyl, -S-Aryl, -S-S-Aryl, -S-Benzyl, -S-Alkyl(C₁ bis C₆)-OH, -S-Alkyl (C₁ bis C₆)-NH₂, -S-Alkyl(C₁ bis C₆)-OSO₂CH₂CF₃ und -S-Alkyl(C₁ bis C₆)-CO₂-Q-, -SO-Alkenyl, -Halogen(Cl, Br, I), worin Q H oder OH ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O-Aryl, O-Benzyl, O-N-Succinimid, O-N-Sulfosuccinimid, O-N-Phthalimid, O-N-Glutarimid, O-N-Tetrahydrophthalimid, -N-Norbornen-2,3-dicarboximid, Hydroxybenzotriazol und Hydroxy-7- azabenzotriazol und Z ausgewählt ist aus -O-, -S- oder -NH-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl)-, -N(Aryl)-, -N(Benzyl)-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl-OH)-, -N(C₁- bis C₂₀-Alkyl-NH₂)-.
Reagens nach Anspruch 1, worin die Kohlenhydrat-Zentraleinheit in der L- oder D-Konfiguration dargestellt ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin die Konfiguration an der Anomerposition (1-Position) der Glykosid-Zentraleinheit alpha, beta oder ein Gemisch von beidem ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Monosaccharid eine Aldose, bevorzugt Glucose; eine Ketose, bevorzugt Fructose; eine Pyranose, bevorzugt Mannose, Glucose; eine Furanose, bevorzugt Ribose, Arabinose; ein Oligo- und Polysaccharid, bestehend aus Monsaccharideinheiten, bevorzugt Lactose, Melibiose, und Aminokohlenhydrate, und Aminokohlenhydrat, enthaltend Oligo- bzw. Polysaccharide, bevorzugt Mannoseamin, Glucoseamin, Lactoseamin, ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Polymerkette durch eine Methoxygruppe terminiert ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Polymerkette ein Polyethylenglykol ist, das durch die allgemeine Struktur: R-(CH₂-CH₂-O)n-CH₂-CH₂-X- dargestellt wird, worin R und X eine der oben genannten Bedeutungen haben und n 0 bis 2000 ist.
Reagens nach Anspruch 6, worin R ein Rest mit der Formel II oder eine sich wiederholende Baueinheit ist, die die folgende Struktur aufweist:
worin n, m, R, X und Z die oben genannte Bedeutung haben, U ausgewählt ist aus -O-, -S- und -NH-.
Reagens nach Anspruch 6, worin R eine sich wiederholende Baueinheit ist, die die folgende Struktur:
aufweist, worin m, R und Z die oben genannte Bedeutung haben, Alkyl eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen ist und U ausgewählt ist aus -O-, -S- und -NH-.
Reagens nach Anspruch 7 oder 8, worin die Baueinheit sich 4- bis 1000-mal wiederholt.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Polymerkette mit Ausnahme des Terminus eine unsubstituierte Kette ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Polymerkette ein statistisches oder Blockcopolymer oder ein Terpolymer ist.
Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das die folgende Struktur aufweist:
worin m, poly, Q, R, X und Z eine der oben genannten Bedeutungen haben.
Verfahren zum Herstellen des aktives Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die Konjugationsreaktion zwischen einem Glykosid, das eine Pentenylgruppe an der Anomerposition des Glykosids enthält, und einer aktivierten Polymerkette durchgeführt wird in Lösung, gefolgt von einer Umwandlung der Pentenylgruppe des gewünschten Synthesezwischenprodukts in das aktiviertes Kohlenhydrat-enthaltende Schutzreagens, wie in Formel I gezeigt, und Reinigen des aktivierten Reagens vom Reaktionsgemisch.
Verwendung eines aktives Kohlenhydrat-enthaltenden Schutzreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines wasserlöslichen und isolierbaren Konjugats mit mindestens einem biologisch aktiven Molekül, einer Oberfläche oder einer Gesamtzelle.
Verwendung nach Anspruch 14, worin das mindestens eine biologisch aktive Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Enzymen, Glykoproteinen, Polypeptiden, Arzneimitteln, Farbstoffen, Nucleosiden, Oligonucleotiden, Antikörpern, Lipiden, Liposomen, Phospholipiden, Liposomen, Mikroorganismen, humanen Zellen und Oberflächen.
Verwendung nach Anspruch 15, worin das mindestens eine biologisch aktive Molekül ein Enzym ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Enzym Asparaginase oder Glutaminase-Asparaginase ist.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Verbindung dazu dient ein biologisch aktives Molekül an ein anderes biologisch aktives Molekül zu binden, das gleich oder verschieden sein kann, oder ein biologisch aktives Molekül an eine Oberfläche zu binden.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die wasserlöslichen und isolierbaren Konjugate die Struktur:
aufweisen, worin m, poly, R, X und Z die oben genannte Bedeutung haben und die Einheit NH-PEP einen Aminofunktion-enthaltenden Rest auf einem biologisch aktiven Molekül darstellt.